KR102181467B1 - 티로신 키나아제 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 티로신 키나아제 활성 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로 본 발명의 조성물은 암세포 사멸효과를 갖고, 암세포에서 나트륨 요오드 공동 수송체(NIS)의 발현을 증가시키며 암세포의 재분화를 유도하여 방사성 요오드(RAI)와 병용하여 투여하면 효과적으로 암세포를 사멸시킬 수 있어 암 치료 용도로 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 방사성 요오드 치료에 저항성을 가진 암 치료에 효과적으로 활용할 수 있어 암 질환의 치료를 위한 항암 보조제로서도 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 티로신 키나아제 저해제를 유효성분으로 포함하는 암 치료용 약학적 조성물 및 항암 보조제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 티로신 키나아제 저해제를 포함하는 조성물은 암세포 사멸 효과를 갖고, 나트륨 요오드 공동 수송체의 발현(NIS)을 증가시켜 방사성 물질의 흡수를 촉진시키므로 방사선 치료 효과를 증가시킨다.
갑상선암은 가장 흔한 내분비계 암으로 최근 발병률이 현저히 증가하고 있다. 특히 여성의 경우 최근 발생률이 급격히 증가하여 갑상선암은 여성에서 가장 많이 발생하는 암이 되었다. WHO에서 정한 병리학적 구별에 따르면 갑상선암은 5가지 유형으로 나뉘는데, 유두암(papillary carcinoma), 여포암(follicular carcinoma), 허들세포암(Hurthle cell neoplasm, 여포 선암종), 역형성암(anaplastic carcinoma, 미분화 갑상선암), 수질암(medullary thyroid carcinoma) 등이 포함된다.
유두암과 여포암과 같은 분화암들은 수술적 치료와 방사성 요오드 치료가 주된 치료이며 10년 생존율이 90% 이상으로 예후가 좋은 편이지만, 역형성암은 드물게 발생하며 악성도가 높은 미분화 갑상선암으로 공격성, 급속한 진행, 불량한 예후 및 높은 사망률을 특징으로 한다. 미분화 갑상선암은 분화된 갑상선암과 달리 요오드 흡수(iodine uptake), 티로글로불린(thyroglobulin) 합성과 같은 갑상선 여포세포(thyroid follicular cell)의 특징을 나타내지 않으며, 요오드 흡수 능력이 감소되어 있으므로 방사성 요오드(radioactive iodine, RAI) 치료에 저항성을 나타낸다. 따라서, 수술, 방사선 요법 및 화학 요법 단독 또는 각 요법을 조합한 미분화 갑상선암의 치료는 환자 생존에 효과를 나타내지 못하므로 신규한 치료 방법의 개발이 절실히 요구된다.
나트륨 요오드 공동 수송체(NIS) 단백질은 세포막 운반체로 13개의 도메인을 가지고 있고, sodium-potassium ATPase에 의하여 생기는 나트륨 이온의 세포막 안팎의 농도 차에 의하여 두 개의 나트륨 양이온(Na2+)과 하나의 요오드 음이온(I-)을 운반한다. 최근에 분자생물학의 발달로 NIS 단백질의 여러 특성이 밝혀지고, NIS 유전자의 클로닝이 가능해짐에 따라, 요오드 섭취의 분자생물학적 기전이 밝혀지고 이를 이용한 기초 실험을 임상의학으로 이행하려는 여러 가지 연구가 진행되고 있다. 나트륨 요오드 공동 수송체(NIS)는 갑상선 호르몬을 합성하기 위해 필요한 요오드를 갑상선 여포 내로 유입하는 수송체로서 방사성 요오드를 투여하면 NIS를 통해 갑상선 세포 내로 유입되어 갑상선 세포를 파괴하므로 방사성 요오드 치료가 갑상선암 환자의 치료방법으로 주로 이용된다. 그러나 최근에는 갑상선암의 치료에 국한하지 않고, NIS를 이용한 방사성핵종 유전자 치료법과 분자유전자 영상법 같은 새로운 응용분야가 전개되고 있다.
한편, 단백질 키나아제는 단백질의 티로신, 세린 및 트레오닌 잔기에 위치하는 하이드록시 그룹의 인산화를 촉매하는 효소로서, 세포의 성장, 분화 및 증식을 유발하는 성장 인자 신호 전달에 중요한 역할을 담당하고 있다. 생체의 항상성 유지를 위해서 생체 내 신호 전달 체계는 켜짐과 꺼짐이 원활하게 균형을 이루어야 한다. 그러나 특정 단백질 키나아제의 돌연변이나 과발현은 정상적인 세포 내 신호 전달체계를 붕괴시켜서 암, 염증, 대사성 질환, 뇌질환 등 다양한 질병을 유발한다. 최근에는 여러 단백질 키나아제 중에서도 특정 키나아제에 대한 선택적 저해활성을 가지는 화합물 개발을 통해 항암제를 개발하고자 하는 연구가 진행되고 있다.
따라서 본 출원의 발명자들은 티로신 키나아제 저해 활성을 갖는 화합물이 암세포를 사멸시키는 효과를 갖고, 암세포에서 나트륨 요오드 공동 수송체(NIS) 발현을 증가시켜 방사성 요오드 흡수를 촉진시키고 암세포의 재분화를 유도하여 방사성 요오드 치료의 효과를 증가시킬 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 티로신 키나아제 저해제 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 티로신 키나아제 저해제 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 질환의 치료에 사용하기 위한 항암 보조제를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 암 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
화학식 1의 화합물은 "5-(5-{4H, 5H, 6H-시클로펜타[b]티오펜-2-일}-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-1-메틸-1,2-디하이드로피리딘-2-온"으로서 티로신 키나아제 억제 활성을 나타내므로 비정상적인 세포 성장에 의해 유발되는 질환, 예를 들면 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서 사용될 수 있고, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 실험을 통해 본 발명의 조성물이 암세포를 사멸시키는 효과를 갖는 것으로 확인되었다.
본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 화학식 1의 화합물은 천연물에서 추출 및 분리하여 얻거나, 통상적인 유기합성 방법으로 제조할 수 있으나 이에 한정하지 않는다.
본 발명에서 "예방"은 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 암 증상을 차단하거나, 암 증상의 억제 또는 지연시키는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 "치료"는 본 발명의 약학적 조성물을 이용하여 암 증상이 호전되거나 이롭게 되는 모든 행위라면 제한없이 포함할 수 있다.
본 발명에서 "약학적으로 허용 가능한 염"이란 양이온과 음이온이 정전기적 인력에 의해 결합하고 있는 물질인 염 중에서도 약제학적으로 사용될 수 있는 형태의 염을 의미하는데, 통상적으로 금속염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염, 염기성 또는 산성 아미노산과의 염 등이 될 수 있다. 예를 들어, 금속염으로는 알칼리 금속염(나트륨염, 칼륨염 등), 알칼리 토금속염(칼슘염, 마그네슘염, 바륨염 등), 알루미늄염 등이 될 수 있고; 유기 염기와의 염으로는 트리에틸아민, 피리딘, 피콜린, 2,6-루티딘, 에탄올아민, 디에탄올아민, 트리에탄올아민, 시클로헥실아민, 디시클로헥실아민, N,N-디벤질에틸렌디아민 등과의 염이 될 수 있으며; 무기산과의 염으로는 염산, 브롬화수소산, 질산, 황산, 인산 등과의 염이 될 수 있고; 유기산과의 염으로는 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 프탈산, 푸마르산, 옥살산, 타르타르산, 말레인산, 시트르산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등과의 염이 될 수 있으며; 염기성 아미노산과의 염으로는 아르기닌, 라이신, 오르니틴 등과의 염이 될 수 있고; 산성 아미노산과의 염으로는 아스파르트산, 글루탐산 등과의 염이 될 수 있다.
본 발명의 조성물로 예방 또는 치료할 수 있는 암은 자궁암, 나팔관암, 난소암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 소장암, 직장암, 식도암, 임파선암, 담낭암, 폐암, 피부암, 신장암, 방광암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 내분비선암, 구강암 및 간암으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 본 발명의 일 구체예에서 상기 암은 갑상선암(thyroid cancer) 또는 유방암(breast cancer)일 수 있다.
본 발명의 목적상 상기 조성물로 예방 또는 치료를 할 수 있는 갑상선암은 제한 없이 포함되며, 본 발명의 일 구체예에서 상기 갑상선암은 미분화 갑상선암(anaplastic thyroid cancer) 또는 분화 갑상선암(differentiated thyroid cancer)일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 조성물은 나트륨 요오드 공동 수송체(sodium iodide symporter;NIS)의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 "나트륨 요오드 공동 수송체(Sodium iodide symporter: NIS)"는 세포막 단백질로 13개의 transmembrane domain을 가지고 있으며, sodium-potassium ATPase에 의하여 생기는 나트륨 이온의 세포막 안팎의 농도 차에 의하여 2개의 나트륨 이온과 한 개의 요오드 이온을 갑상선 세포 내로 이동시키는 역할을 한다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 이때 약제학적으로 허용 가능한 첨가제로는 전분, 젤라틴화 전분, 미결정셀룰로오스, 유당, 포비돈, 콜로이달실리콘디옥사이드, 인산수소칼슘, 락토스, 만니톨, 엿, 아라비아고무, 전호화전분, 옥수수전분, 분말셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 오파드라이, 전분글리콜산나트륨, 카르나우바 납, 합성규산알루미늄, 스테아린산, 스테아린산마그네슘, 스테아린산 알루미늄, 스테아린산칼슘, 백당, 덱스트로스, 소르비톨 및 탈크 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 실제 임상 투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 본 발명의 지용성 폴리페놀 성분이 증가된 생약 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calciumcarbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식을 선택하는 것이 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
구체적으로, 본 발명에 따른 조성물의 유효량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 일반적으로는 체중 1 kg 당 1 ㎎ 내지 200 ㎎, 바람직하게는 10 ㎎ 내지 200 ㎎을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 내지 3회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 투여 경로, 질환의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 일 양상은 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 염을 유효성분으로 포함하는 암 질환의 치료에 사용하기 위한 항암 보조제를 제공한다.
본 출원의 발명자들은 티로신 키나아제 저해제인 상기 화학식 1의 화합물이 나트륨 요오드 공동 수송체(NIS)의 발현을 증가시키는 사실을 발견하고 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo) 실험을 통해 상기 항암 보조제와 방사성 요오드의 병용 투여시 방사성 요오드 흡수를 촉진시켜 암세포 사멸에 효과 있음을 확인하였다.
본 발명에서 "항암 보조제"는 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 제제를 의미한다. 일 예로 농도 의존적인 항암활성을 나타내는 제제를 그 자체로는 항암활성을 나타내지 않은 수준으로 항암제와 함께 사용하는 경우 상기 항암제의 항암효과를 개선, 향상 또는 증대시킬 수 있는 항암 보조제로서 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에서 상기 항암 보조제는 나트륨 요오드 공동 수송체(NIS)의 발현을 증가시키는 것일 수 있다
본 발명의 목적상 상기 항암 보조제로 치료할 수 있는 암 질환은 제한 없이 포함되며, 본 발명의 일 구체예에서 상기 암 질환은 갑상선암 또는 유방암일 수 있고 상기 갑상선암은 미분화 갑상선암(anaplastic thyroid cancer) 또는 분화 갑상선암(differentiated thyroid cancer)일 수 있다.
미분화 갑상선암은 방사성 요오드 치료에 잘 반응하지 않아 방사성 요오드 치료에 저항성을 갖고 있고, 분화 갑상선암에서도 NIS, 갑상선글로불린(thyroglobulin; Tg), 갑상선 과산화효소(thyroid peroxidase; TPO), 갑상선 자극 호르몬 수용체(thyroid-stimulating hormone receptor; TSHR) 등의 갑상선 특이적 유전자 발현이 감소하는 일련의 탈분화 과정을 거쳐 방사성 요오드 치료에 저항성을 갖게 될 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서 상기 항암 보조제는 방사성 요오드 섭취능력이 소실되어 방사성 요오드 치료 저항성을 갖는 갑상선암에 재분화를 유도하여 방사성 요오드 치료의 감수성을 높여주는 것일 수 있다.
상기 항암 보조제의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 항암 보조제는 목적하는 바에 따라 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 내 투여될 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 항암 보조제는 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
또한, 상기 항암 보조제는 항암제의 투여 전, 또는 투여 후에 단독으로 투여될 수 있고, 항암제와 동시에 암 치료를 위한 보조제로서 함께 투여될 수 있다. 본 발명의 항암 보조제를 항암제와 함께 투여하는 경우에는 환자의 상태, 항암제의 투여량, 항암제의 투여기간 등에 따라 항암제와 적절한 비율로 함께 투여될 수 있으며, 구체적으로 항암제 총 중량에 대비하여 0.01 내지 10 배로 투여될 수 있다.
본 발명의 항암 보조제는 다른 항암제, 외과적 수술치료, 항암화학요법, 또는 방사선 치료 등의 다른 항암 치료와 병용하여 이용될 수 있다.
나트륨 요오드 공동 수송체(NIS)는 갑상선 호르몬을 합성하기 위해 필요한 요오드를 갑상선 여포 내로 유입하는 수송체로서 방사성 요오드를 투여하면 NIS를 통해 갑상선 세포 내로 방사성 요오드가 들어가 갑상선 세포를 파괴한다. 이러한 기전을 이용하여 방사성 요오드 치료가 갑상선암 환자의 치료방법으로 이용된다. 최근에는 갑상선암뿐 아니라 NIS가 존재하는 암세포에 방사성 요오드 치료를 적용하고자 하는 시도가 활발하나 NIS의 발현 감소 및 위치 변화 때문에 방사성 요오드 치료에 저항성을 갖는 경우가 있다.
본 발명의 항암 보조제는 NIS의 발현을 증가시켜 방사성 요오드의 섭취를 증가시키고 암세포의 재분화를 유도할 수 있으므로 방사성 요오드와 병용하여 투여시에 방사성 요오드가 세포 내로 섭취되어 암세포를 파괴하여 암 질환 치료에 효과를 보이므로, 본 발명의 일 구체예에서 상기 항암 보조제는 방사성 요오드 치료와 개별, 순차 또는 동시 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학적 조성물은 암세포 사멸 효과를 갖는 바 암 치료 용도로 사용될 수 있고, 본 발명의 일 구체예에 따른 항암 보조제는 암세포에서 나트륨 요오드 공동 수송체(NIS)의 발현을 증가시키고 암세포를 재분화 시키므로 방사성 요오드와 병용 투여하여 효과적으로 암세포를 사멸시킬 수 있어 암 질환 치료 용도로 이용할 수 있고 특히, 방사성 요오드 치료에 저항성을 가진 암 질환의 치료에 효과적으로 활용할 수 있다.
도 1a 내지 도 1c는 NIS 프로모터 활성을 증가시키는 TKI를 스크리닝한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 1a는 세포의 생존능을 의미하는 Rluc의 활성을 나타내고, 도 1b는 NIS 프로모터 활성을 의미하는 Fluc의 활성을 나타내며 도 1c는 선별된 TKI를 투여한 세포와 비히클에서 Rluc 활성으로 정규화된 Fluc 활성을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c 는 NIS 프로모터 활성을 효과적으로 나타내는 TKI 농도 및 처리 시간을 나타낸다. 구체적으로 도 2a는 TKI 농도 및 처리 시간에 따른 Fluc 활성의 패턴을 나타내고, 도 2b는 TKI 농도 및 처리 시간에 따른 Rluc 활성의 패턴을 나타내며 도 2c는 TKI 농도 및 처리 시간에 따른 Rluc 활성으로 정규화된 Fluc 활성을 나타낸다.
도 3은 TKI의 투여에 의한 갑상선 특이적 유전자(NIS, TPO, Tg 및 TSHR) 및 갑상선 전사인자(TTF-1 및 Pax-8)의 상대적인 mRNA 발현양을 나타낸다.
도 4a 내지 4c는 8505C 세포에서 NIS 단백질의 발현양 및 발현 위치를 나타낸다. 구체적으로, 도 4a는 총 단백질 중에서 세포 내 NIS 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과이고, 도 4b 및 도 4c는 각각 세포막 NIS 단백질 및 세포질 NIS 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 유방암 세포에서 NIS 단백질의 발현양을 나타낸다. 도 5a 및 도 5b는 각각 MDA-MB-231 세포 및 MCF-7 세포에서 NIS 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 6은 면역형광 이미징을 통해 세포 내 NIS 발현을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 TKI 투여시 갑상선 요오드 대사 단백질의 변화를 관찰한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 7a는 TKI 투여시 갑상선 특이적 단백질(Tg, TPO, NIS 및 TSHR)에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타내고, 도 7b는 TKI 투여시 갑상선 전사인자(Pax-8 및 TTF-1)에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 8은 MAPK 및 PI3K-AKT 신호전달 경로와 관련된 유전자의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9c는 8505C 세포에서 TKI 투여에 의한 방사성 요오드의 흡수를 평가한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 9a는 TKI 투여에 의해 농도 의존적으로 방사성 요오드의 흡수능력이 현저하게 증가된 결과를 나타내며, 도 9b 및 도 9c 는 각각 12.5μM 및 25μM 의 TKI와 KClO4의 투여에 의한 방사성 요오드의 흡수능력을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 131I 및 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 8505C 세포의 생존율을 나타낸다, 구체적으로 도 10a는 131I 및 12.5μM의 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 8505C 세포의 생존율을 나타내고, 도 10b는 131I 및 25μM의 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 8505C 세포의 생존율을 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 131I 및 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 DNA 손상정도를 나타낸다. 구체적으로 도 11a는 131I 및 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 γH2A.X foci 형성 분석을 수행한 결과를 나타내고, 도 11b는 131I 및 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 γH2A.X에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12d는 생체 내 실험에 의해 TKI 투여시 NIS 프로모터 활성이 증가한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 12a는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서의 Fluc 활성을 나타낸다. 도 12b는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서 Fluc 활성을 정량분석한 결과를 나타낸다. 도 12c는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서의 Rluc 활성을 나타낸다. 도 12d는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서 Rluc 활성으로 정규화한 NIS 프로모터 활성을 정량분석한 결과를 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 종양 조직 내 NIS 발현양이 증가한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 13a는 종양 이종 이식 마우스의 종양 조직에서 NIS 단백질 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타내고, 도 13b는 종양 이종 이식 마우스의 종양 조직에서 NIS의 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14c, 도 15a, 도 15b 및 도 16은 생체 내 실험에 의해 TKI 투여시 131I에 의해 매개된 암 치료 효과를 나타낸다.
도 14a는 131I 및 TKI를 단독 또는 조합으로 투여한 종양 이종 이식 마우스 모델에서 Rluc 활성을 나타내고, 도 14b는 131I 및 TKI를 단독 또는 조합으로 투여한 종양 이종 이식 마우스의 종양 부피를 나타내며. 도 14c는 생체 내 실험 동안 종양 이종 이식 마우스의 체중변화를 나타낸다.
도 15a는 131I 및 TKI를 단독 또는 조합으로 투여한 종양 이종 이식 마우스로부터 분리된 종양 조직을 나타내고, 도 15b는 131I 및 TKI를 단독 또는 조합으로 투여한 종양 이종 이식 마우스로부터 분리된 종양 조직에 대한 평균 무게를 나타낸다.
도 16은 종양 이종 이식 마우스로부터 분리된 종양 조직에서 γH2A.X의 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c 는 NIS 프로모터 활성을 효과적으로 나타내는 TKI 농도 및 처리 시간을 나타낸다. 구체적으로 도 2a는 TKI 농도 및 처리 시간에 따른 Fluc 활성의 패턴을 나타내고, 도 2b는 TKI 농도 및 처리 시간에 따른 Rluc 활성의 패턴을 나타내며 도 2c는 TKI 농도 및 처리 시간에 따른 Rluc 활성으로 정규화된 Fluc 활성을 나타낸다.
도 3은 TKI의 투여에 의한 갑상선 특이적 유전자(NIS, TPO, Tg 및 TSHR) 및 갑상선 전사인자(TTF-1 및 Pax-8)의 상대적인 mRNA 발현양을 나타낸다.
도 4a 내지 4c는 8505C 세포에서 NIS 단백질의 발현양 및 발현 위치를 나타낸다. 구체적으로, 도 4a는 총 단백질 중에서 세포 내 NIS 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과이고, 도 4b 및 도 4c는 각각 세포막 NIS 단백질 및 세포질 NIS 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 5a 및 도 5b는 유방암 세포에서 NIS 단백질의 발현양을 나타낸다. 도 5a 및 도 5b는 각각 MDA-MB-231 세포 및 MCF-7 세포에서 NIS 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 6은 면역형광 이미징을 통해 세포 내 NIS 발현을 관찰한 결과를 나타낸다.
도 7a 및 도 7b는 TKI 투여시 갑상선 요오드 대사 단백질의 변화를 관찰한 결과를 나타낸다. 구체적으로 도 7a는 TKI 투여시 갑상선 특이적 단백질(Tg, TPO, NIS 및 TSHR)에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타내고, 도 7b는 TKI 투여시 갑상선 전사인자(Pax-8 및 TTF-1)에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 8은 MAPK 및 PI3K-AKT 신호전달 경로와 관련된 유전자의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 9a 내지 도 9c는 8505C 세포에서 TKI 투여에 의한 방사성 요오드의 흡수를 평가한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 9a는 TKI 투여에 의해 농도 의존적으로 방사성 요오드의 흡수능력이 현저하게 증가된 결과를 나타내며, 도 9b 및 도 9c 는 각각 12.5μM 및 25μM 의 TKI와 KClO4의 투여에 의한 방사성 요오드의 흡수능력을 나타낸다.
도 10a 및 도 10b는 131I 및 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 8505C 세포의 생존율을 나타낸다, 구체적으로 도 10a는 131I 및 12.5μM의 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 8505C 세포의 생존율을 나타내고, 도 10b는 131I 및 25μM의 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 8505C 세포의 생존율을 나타낸다.
도 11a 및 도 11b는 131I 및 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 DNA 손상정도를 나타낸다. 구체적으로 도 11a는 131I 및 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 γH2A.X foci 형성 분석을 수행한 결과를 나타내고, 도 11b는 131I 및 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 γH2A.X에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 12a 내지 도 12d는 생체 내 실험에 의해 TKI 투여시 NIS 프로모터 활성이 증가한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 12a는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서의 Fluc 활성을 나타낸다. 도 12b는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서 Fluc 활성을 정량분석한 결과를 나타낸다. 도 12c는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서의 Rluc 활성을 나타낸다. 도 12d는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서 Rluc 활성으로 정규화한 NIS 프로모터 활성을 정량분석한 결과를 나타낸다.
도 13a 및 도 13b는 종양 조직 내 NIS 발현양이 증가한 결과를 나타낸다. 구체적으로, 도 13a는 종양 이종 이식 마우스의 종양 조직에서 NIS 단백질 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타내고, 도 13b는 종양 이종 이식 마우스의 종양 조직에서 NIS의 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸다.
도 14a 내지 도 14c, 도 15a, 도 15b 및 도 16은 생체 내 실험에 의해 TKI 투여시 131I에 의해 매개된 암 치료 효과를 나타낸다.
도 14a는 131I 및 TKI를 단독 또는 조합으로 투여한 종양 이종 이식 마우스 모델에서 Rluc 활성을 나타내고, 도 14b는 131I 및 TKI를 단독 또는 조합으로 투여한 종양 이종 이식 마우스의 종양 부피를 나타내며. 도 14c는 생체 내 실험 동안 종양 이종 이식 마우스의 체중변화를 나타낸다.
도 15a는 131I 및 TKI를 단독 또는 조합으로 투여한 종양 이종 이식 마우스로부터 분리된 종양 조직을 나타내고, 도 15b는 131I 및 TKI를 단독 또는 조합으로 투여한 종양 이종 이식 마우스로부터 분리된 종양 조직에 대한 평균 무게를 나타낸다.
도 16은 종양 이종 이식 마우스로부터 분리된 종양 조직에서 γH2A.X의 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. NIS 발현을 증가시키는 물질 선별
<1.1> 세포주와 화학물질
인간 미분화 갑상선암(anaplastic thyroid cancer, ATC) 세포주 8505C는 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen)에서 구입하고, 유방암 세포주 MDA-MB-231 및 MCF-7은 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였다. 8505C 는 10 % 소태아혈청(FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)과 1 % 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)으로 보충된 RPMI(Roswell Park Memorial Institute)-1640 배지(HyClone, Logan, UT, USA)(HyClone)를 이용하여 37 ℃ 및 5 % CO2 조건의 습윤한 배양기(humidified incubator)에서 유지되었다. MDA-MB-231 및 MCF-7 세포는 10 % 소태아혈청(FBS, Gibco, Grand Island, NY, USA)과 1 % 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)으로 보충된 DMEM(Dulbecco's modified eagle medium) 배지(HyClone, Logan, UT, USA)(HyClone)를 이용하여 37 ℃ 및 5 % CO2 조건의 습윤한 배양기(humidified incubator)에서 유지되었다.
실험에 사용한 TKI 라이브러리는 한국 화학 연구원(Korea Research Institute of Chemical Technology; 대한민국)의 한국화합물은행 (http://www.chembank.org/)으로부터 제공받았다.
티로신 키나아제 저해제(TKI)인 "5-(5-{4H, 5H, 6H-시클로펜타[b]티오펜-2-일}-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-1-메틸-1,2-디하이드로피리딘-2-온"을 Enamine(NJ, USA)에서 구입하여 원액(stock solution) 50mM을 DMSO(dimethyl sulfoxide)에 용해시켜 -20 ℃에서 보관하였다.
<1.2>. pNIS-Fluc-TurboFP635-pCMV-Rluc 재조합 벡터 제작
이중 프로모터에 의하여 작동되는 리포터 유전자를 발현하는 pNIS-Fluc-TurboFP635-pCMV-Rluc 재조합 벡터는 pNIS-Fluc-TurboFP635 벡터 및 pcDNA3.1/Hygro(+) 벡터를 이용하여 Cosmo Genetech Co. Ltd.(대한민국)에서 제작하였다. 구체적으로 NIS(sodium iodide symporter) 프로모터의 활성을 증가시키는 물질을 스크리닝(screening)하기 위하여, NIS 프로모터의 하부(시계 방향)에 Firefly-luciferase2(Fluc) 및 TurboFP635을 포함하였다. NIS 프로모터의 다른편(반시계 방향)은 세포 생존능(cell viability)을 확인하기 위하여 CMV 프로모터 및 Renilla-luciferase(Rluc)를 포함하였다. pNIS-Fluc-TurboFP635 벡터는 Dr. Abhijit De(ACTREC, 인도)로부터 제공받았으며, pcDNA3.1/Hygro(+) 벡터는 Invitrogen(미국)에서 구입하였다.
<1.3> 안정한 세포주(stable cell line) 제작
제조사(Promega)의 Fu-GENE HD 프로토콜에 따라 Fu-GENE HD 용액으로 pNIS-Fluc-TurboFP635-pCMV-Rluc 재조합 벡터를 8505C 세포주에 트렌스펙션하였다. 재조합 벡터와 Fu-GENE HD 용액의 비율은 1:4로 하였으며, 600 ㎍/㎖ 농도의 제니티신(geneticin; AG Scientific)을 이용하여 트렌스펙션된 세포를 선별하였다. 이중 리포터 유전자 시스템을 안정적으로 발현하는 선별된 세포주를 '8505C-PNIS-PCMV'로 명명하였다.
<1.4> 프로모터 활성을 측정하기 위한 생물 발광(bioluminescence)
8505C-PNIS-PCMV 세포를 티로신 키나아제 저해제(tyrosine kinase inhibitor, TKI) 라이브러리에 노출시키고 IVIS Lumina Ⅲ(Perkin-Elmer, Wellesley, MA, USA)를 사용하여 NIS 프로모터 활성 증진 및 세포 생존능을 관찰하기 위해 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
자세한 프로토콜은 다음과 같다. 세포에 D-루시페린(D-luciferin)(150 ㎍/㎖)을 첨가하여 IVIS Lumina Ⅲ(Perkin-Elmer, Wellesley, MA, USA)로 NIS 프로모터 활성을 측정하였다. 세포 수(cell number)에 대한 NIS 프로모터 활성을 정규화(normalization)하기 위하여, 10 ㎍/㎖ 농도의 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)을 첨가하여 Rluc 활성을 측정하고, Fluc 활성을 Rluc 활성으로 나누어 Fluc 활성을 Rluc 활성으로 정규화(normalized)하였다.
<1.5> NIS 프로모터 활성을 증가시키는 티로신 키나아제 저해제(TKI) 선별
NIS(sodium iodide symporter) 프로모터의 활성을 향상시키는 티로신 키나아제 저해제(TKI)를 선별하기 위해, 상기 <1.4>의 방법으로 생물 발광 이미징(bioluminescence imaging, 이하 BLI) 활성의 정량분석을 수행하였다. 세포의 생존능(cell viability)을 나타내는 Rluc 활성 및 NIS 프로모터 활성을 의미하는 Fluc 활성이 BLI에 의해 관찰되었다. 도 1a는 Rluc의 활성을 나타내고, 도 1b는 Fluc의 활성을 나타낸다. 비히클(vehicle)에 비하여 Fluc 활성이 증가 경향을 나타내는 화합물(도 1a 및 도 1b에서 B4에 위치한 화합물)을 선별하였고, 선별된 화합물의 명칭은 "5-(5-{4H, 5H, 6H-시클로펜타[b]티오펜-2-일}-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-1-메틸-1,2-디하이드로피리딘-2-온"으로 확인되었다. 도 1c는 선별된 TKI를 투여한 세포와 비히클에서 Rluc 활성으로 정규화된 Fluc 활성을 나타낸다. 선별된 TKI를 투여한 세포에서 Rluc 활성으로 정규화된 Fluc 활성이 비히클 대비 2.67 배 높았다. 선별된 TKI는 하기 화학식 1의 구조를 가지며 그에 대한 상세한 정보가 표 1에 기재되어 있다.
[화학식 1]
이하, 하기의 실험에서 사용된 "TKI"는 "5-(5-{4H, 5H, 6H-시클로펜타[b]티오펜-2-일}-1,3,4-옥사디아졸-2-일)-1-메틸-1,2-디하이드로피리딘-2-온"를 의미한다.
<1.6> TKI의 투여시 NIS 프로모터 활성이 활발히 나타나는 TKI 농도 및 처리 시간의 선택
NIS 프로모터의 활성을 관찰하기 위해 다양한 시간 및 농도에서 8505C-PNIS-PCMV 세포를 TKI와 함께 배양하였다. 도 2a는 TKI 농도 및 처리 시간에 따른 Fluc 활성의 패턴을 나타낸다. NIS 프로모터의 활성을 의미하는 Fluc 활성은 72시간 TKI 투여 그룹이 다른 시간의 TKI 투여 그룹 대비 증가하였다. TKI 농도가 증가함에 따라 25μM 까지는 Fluc의 활성이 증가하고, 특히 72시간 TKI 투여 그룹에서 6.25μM, 12.5μM, 25μM 농도에서 가장 강한 Fluc 활성을 나타낸다. 그러나 50 μM 농도에서 Fluc 활성이 상당히 감소하였다.
도 2b는 TKI 농도 및 투여 시간에 따른 Rluc 활성의 패턴을 나타낸다. 세포 생존능(cell viability)을 의미하는 Rluc 활성은 TKI 농도가 증가할수록 점점 감소하였다.
세포수에 대하여 NIS 프로모터 활성을 정규화하기 위하여, Fluc 활성을 Rluc 활성으로 나누었다. 도 2c는 TKI 농도 및 처리 시간에 따른 Rluc 활성으로 정규화된 Fluc 활성을 나타낸다. 50μM 농도의 TKI 투여 그룹이 가장 높은 NIS 프로모터 활성을 나타내는 것처럼 보이지만 이는 상대적으로 낮은 Rluc 활성이 반영되었기 때문이다. 그러므로 50μM 을 제외하고 72시간 동안 12.5μM 및 25μM 농도의 TKI 투여 그룹에서 가장 높은 NIS 프로모터 활성을 보였으므로 72시간 동안 12.5μM, 25μM 의 TKI를 투여하여 후속 실험을 진행하였다.
실시예 2. TKI 투여에 의한 갑상선 특이적 유전자 및 갑상선 전사 인자의 mRNA 발현 증가
<2.1> RNA 추출 및 real-time quantitative PCR 분석
8505C 세포를 72시간 동안 12.5μM 및 25μM의 TKI에 노출시켰다. 노출 후, TRIzol 시약(Invitrogen, San Diego, CA, USA)을 사용하여 제조 회사의 지침에 따라 세포로부터 total RNA를 분리하였다. 제조사의 지침에 따라 1㎍의 total RNA를 High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, USA)를 사용하여 CFX96 Touch Real-Time PCR 검출 시스템(Bio-rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA)를 제조사의 지침에 따라 real-time quantitative PCR 분석을 수행하였다. NIS(sodium iodide symporter), TPO(thyroid peroxidase), Tg(thyroglobulin) 및 TSHR(thyroid-stimulating hormone receptor) 프라이머(표 2 참조)는 8505C에 TKI 투여 후 갑상선 특이적 유전자의 mRNA 수준 변화 분석에 사용되었고, TTF-1(thyroid transcription factor-1) 및 Pax-8(paired box gene-8) 프라이머(표 2 참조)는 8505C에 TKI 투여 후 갑상선 전사 인자의 mRNA 수준 변화 분석에 사용되었다. r18s 프라이머(표 2 참조)는 real-time quantitative PCR을 위한 대조군(internal control)으로 사용되었다. real-time quantitative PCR 분석을 위해서 2-△△Ct 방법을 사용하여 표적 유전자의 상대적 발현양을 계산하였다.
<2.2>
8505C 세포에서 TKI 투여에 의한 갑상선 특이적 유전자 및 갑상선 전사인자의 mRNA 발현 증가
NIS를 포함하는 갑상선 특이적 유전자 및 갑상선 전사인자는 방사성 요오드(RAI)를 모으고 유지하는데 중요하기 때문에, 8505C 세포에서 이러한 유전자 발현에 TKI가 미치는 영향을 살펴보았다. 도 3은 TKI의 투여(12.5μM 및 25μM)에 의한 갑상선 특이적 유전자(NIS, TPO, Tg 및 TSHR) 및 갑상선 전사인자(TTF-1 및 Pax-8)의 상대적인 mRNA 발현양을 나타낸다.
TKI 투여시 NIS mRNA 발현이 비히클에 비해 상당히 증가하고, 특히 25μM의 TKI 투여시 비히클에 비해 13.11 배 증가하였고 12.5μM의 TKI 투여시 비히클에 비해 2.02 배 증가하였다. 더욱이, 25μM의 TKI 투여에 의해 갑상선 특이적 유전자로서 TPO, Tg 및 TSHR의 유전자 발현양이 비히클에 비해 각각 10.08 ± 3.15, 19.08 ± 2.75 및 12.39 ± 1.99 배 증가하였다. 또한 25μM의 TKI 투여에 의해 갑상선 전사인자로서 TTF-1 및 Pax-8의 mRNA 발현양은 비히클에 비해 각각 2.59 ± 0.24 및 12.1 ± 4.10 배 증가하였다.
따라서 TKI 투여에 의해 NIS를 포함한 갑상선 특이적 유전자 및 갑상선 전사인자의 mRNA 발현양이 증가된 것을 확인하여 TKI에 의해 암세포의 재분화가 유도된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3. TKI 투여시 세포 내 NIS 단백질(endogenous NIS protein) 발현 증가 및 위치(localization)
<3.1> 단백질 추출
8505C, MDA-MB-231 및 MCF-7 세포를 적절한 농도(12.5μM 및 25μM)의 TKI와 함께 72시간 동안 배양하였다. 72시간동안 TKI 투여 후, 총 단백질을 분리하기 위하여 세포 펠렛(pellet)을 수집하고, 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일 키트(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)를 함유하는 RIPA(radioimmunoprecipitation assay) 완충용액(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)에 용해시켰다. 용해된 세포를 시간 간격을 가볍게 두고 3 회 볼텍싱(vortexing)하고 4 ℃에서 13,000Хg로 원심분리 하였다.
Mem-PER™ Plus 키트(Thermo scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 제조 회사의 지침에 따라 수용성 단백질 분획(soluble protein fraction)으로부터 막 단백질(membrane protein) 및 세포질 단백질(cytoplasm protein)을 추출하였다. 간략하게, 세포 펠렛을 냉각된 세포 세척 용액으로 세척하고 300Хg에서 5 분 동안 2 회 원심분리하였다. 상층액을 버린 후, 세포 펠렛을 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일 키트를 함유하는 투과성 완충액(permeabilization buffer)으로 투여하였다. 균질 세포 현탁액(homogeneous cell suspension)을 얻기 위해 세포 펠렛을 볼텍싱하고 4 ℃에서 10 분간 지속적으로 혼합하여 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포 펠렛을 원심분리하고 세포질 단백질을 포함하는 상층액을 분리하였다. 나머지 펠렛을 프로테아제 및 포스파타아제 억제제 칵테일 키트가 포함된 가용화 완충액(solubilization buffer)으로 10 분 동안 4 ℃에서 지속적으로 혼합해주며 투여하였다. 300Хg에서 5 분간 원심분리한 후, 막 단백질을 새로운 튜브로 옮겼다. 단백질 샘플은 BCA(bicinchoninic acid) 단백질 분석 키트(Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)를 사용하여 정량하였다.
종양 조직으로부터의 웨스턴 블롯 분석을 위해, 동결된 종양 조직을 연마하고 제조사의 지침에 따라 단백질을 분리하기 위해 T-PER 조직 단백질 추출 시약(Thermo Scientific)을 사용 하였다.
<3.2> 웨스턴 블롯
상기 <3.1>의 방법으로 추출된 동량의 단백질을 10 % SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)에 로딩하고 PVDF 멤브레인(Millipore, Billerica, MA, USA)으로 트랜스퍼 하였다. 멤브레인을 Tween-20 가 포함된 TBS(TBS-T)에서 1 시간 동안 3 % BSA(Bovine serum albumin)로 블록킹하고, 1 % BSA 에서 각각의 1차 항체로 4 ℃에서 하룻밤 동안 접촉시켰다. TBS-T로 3 회 세척한 후, 멤브레인을 실온에서 1 시간 동안 HRP(horseradish peroxidase)-결합 2 차 항체와 접촉시켰다. 멤브레인을 TBS-T로 3 회 세척하고 신호를 ECL(enhanced chemiluminescence) 검출 시약(GE Healthcare Life Sciences, Pittsburgh, PA, USA)을 사용하여 시각화하였다. 제조사의 지침에 따라 Fusion FX chemiluminescence analyzer system(Vilber lourmat, Marne-la-Vallιe, France)을 사용하여 밴드를 검출하였다. 실험에 사용된 1차 항체 목록은 표 3에 기재하였다. HRP-결합 2차 항체는 항-마우스(Cell Signaling) 및 항-래빗(Cell Signaling)을 이용하였다.
<3.3> 8505C 세포에서 세포 내 NIS 단백질(endogenous NIS protein) 발현 증가 및 위치(localization)
TKI 투여에 의하여 8505C 세포 내 NIS 단백질(endogenous NIS protein)의 발현양 및 그의 위치가 변화하는지 여부를 <3.2>의 방법으로 웨스턴 블롯을 통하여 확인하였다.
도 4a는 총 단백질 중에서 세포 내 NIS 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 도 4a에 나타난 바와 같이 12.5μM 및 25μM의 TKI 투여시 각각 비히클 대비 1.21 ± 1.54 배 및 1.52 ± 0.09 배 정도 세포 내 NIS 단백질의 발현양이 증가한 것을 알 수 있다.
세포막의 NIS 발현이 요오드 섭취에 중요한 역할을 하기 때문에 NIS 단백질이 발현되는 위치가 세포막(cell membrane)인지 세포질(cytoplasm)인지 확인하였다. 도 4b 및 도 4c는 각각 세포막 NIS 단백질 및 세포질 NIS 단백질의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 도 4b 및 4c에 나타난 바와 같이 NIS 발현양은 세포막 및 세포질에서 모두 증가하는 패턴을 보이고, 특히 세포질 NIS 단백질과 달리 세포막 NIS 단백질 발현양은 25μM의 TKI 투여시 1.96 배까지 상당히 증가한다.
<3.4> 유방암 세포에서 NIS 단백질(endogenous NIS protein) 발현 증가
유방암 세포인 MDA-MB-231 및 MCF-7에서 TKI 투여에 의하여 NIS 단백질(endogenous NIS protein)의 발현양이 변화하는지 여부를 <3.2>의 방법으로 웨스턴 블롯을 하여 측정하였다.
도 5a 및 도 5b는 각각 MDA-MB-231 세포 및 MCF-7 세포에서 NIS 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 도 5a 및 5b에서 나타나는 바와 같이 MDA-MB-231 세포 및 MCF-7 세포 모두에서 TKI 투여에 의해 농도 의존적으로 NIS 단백질 양이 증가한 것을 확인할 수 있었다. 웨스턴 블롯 정량 분석 결과, MDA-MB-231 세포에서 NIS 단백질의 발현은 비히클 그룹에 비해 12.5μM에서는 1.17 배, 25μM 농도 처리 그룹에서는 1.73 배까지 증가하였다. 또한 MCF-7 세포에서는 비히클 그룹에 비해 12.5μM 농도 처리 그룹에서는 1.56 배, 25μM 처리 그룹에서는 2.67 배까지 증진하는 패턴을 확인 하였다.
실시예 4. NIS 발현 분석을 위한 면역형광 이미징(Immunofluorescence imaging)
<4.1> 면역형광 이미징(Immunofluorescence imaging)
37 ℃, 5 % CO2의 습윤한 분위기에서 4-웰 챔버 슬라이드(4-well chamber slide)에서 24 시간 동안 8505C 세포를 인큐베이션(2.5x104)하였다. NIS 면역형광 이미징을 위해, 25μM TKI에 추가로 72시간 동안 8505C 세포를 노출시켰다. 그 후, -20℃의 온도에서 10분간 메탄올로 세포를 고정시키고 10분간 PBS로 3회 세척하였다. 그런 다음 세포를 90초 동안 0.3 % Triton X-100으로 인큐베이션 하여 투과성(permeabilized)으로 만든 다음 10분 동안 PBS로 3 회 세척하였다. 1시간 동안 PBS의 3 % BSA로 세포를 블록킹하고 항-NIS(Abcam, Cambridge, UK) 1차 항체 (1:50)와 함께 밤새도록 4 ℃에서 인큐베이션 하였다. 1차 항체 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 10분간 3회 세척하고 Alexa-Fluor 488-접합 2차 항체(Thermo Fisher Scientific)로 1시간 동안 100:1 의 희석 비율로 접촉시켰다. 세포를 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 포함하는 Vecta mounting medium를 사용하여 커버 슬립에 마운트 하고, 공초점 레이저 현미경(confocal laser microscopy)(Zeiss, LSM 5 exciter, Germany)에 의해 NIS 염색이 관찰되었다.
<4.2> 면역형광 이미징을 통한 NIS 발현 관찰
도 6은 면역형광 이미징을 통해 세포 내 NIS 발현을 관찰한 결과를 나타낸다. 8505C 세포에 TKI를 25μM 투여한 그룹의 경우, 비히클 대비 세포질 또는 세포막에서 세포 내 NIS 단백질의 활발한 발현이 관찰되고 이 결과는 TKI 투여가 세포 내 NIS 발현을 다시 유도하는 것을 의미한다.
더욱이 <3.3>의 웨스턴 블롯 결과와 상기의 면역형광 이미징의 결과를 종합해 볼 때 TKI 투여에 의해, 세포질 NIS 단백질 보다는 세포막 NIS 단백질의 발현 증가 정도가 더 큰 것을 알 수 있었다.
실시예 5. TKI 투여시 갑상선 특이적 단백질 및 갑상선 전사인자의 단백질 발현 증가
상기 <2.2>에서 전술된 바와 같이 8505C 세포의 경우, 갑상선 특이적 유전자 및 갑상선 전사인자 모두의 mRNA 발현양을 유의하게 증가시켰다. 다음으로 8505C 세포에서 요오드의 섭취를 다루는 중요 단백질의 발현양의 변화를 측정하기 위해 상기 <3.2>의 방법으로 8505C 세포에 72시간동안 TKI를 투여(12.5μM 및 25μM)하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 도 7a는 TKI 투여시 갑상선 특이적 단백질로서 Tg, TPO, NIS 및 TSHR 에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 또한 도 7b는 TKI 투여시 갑상선 전사인자로서 Pax-8 및 TTF-1 단백질에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다.
도 7a 및 도 7b에서 나타난 것과 같이 갑상선 특이적 단백질 및 갑상선 전사인자는 TKI 농도 의존적으로 단백질 수준에서의 발현이 증가되었으므로 TKI에 의해 암세포의 재분화가 유도된 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6. NIS 발현을 유도하는 신호전달 경로(signaling pathway) 조사.
세포 내 NIS 발현을 증가시키는 신호전달 경로를 확인하였다. 이전의 연구는 세포 내 NIS 발현 및 갑상선암 종양 형성과 MAPK(mitogen-activated protein kinase) 및 PI3K-AKT 신호전달 경로가 연관이 있다는 것을 증명하였다. 따라서 MAPK 및 PI3K-AKT 신호전달 경로 모두에 초점을 맞추어 신호전달 경로를 정의하기 위하여 상기 <3.2>의 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 도 8은 MAPK 및 PI3K-AKT 신호전달 경로와 관련된 유전자의 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 도 8의 결과와 같이 TKI 투여는 양쪽 신호전달 경로의 하위에 영향을 미치는 것으로 확인되었다. 그러나 Erk의 인산화는 Akt의 인산화보다 더 저해되는 것을 확인할 수 있었다. 8505C 세포주가 BRAFv600E 돌연변이를 갖고 있기 때문에 BRAF의 인산화도 시험하였다. BRAF의 인산화 또한 TKI 투여에 의해 감소되었으므로 결과적으로 TKI 투여에 의한 세포 내 NIS 발현의 재유도는 PI3K-AKT보다 MAPK 신호전달 경로와 더 연관이 있는 것을 알 수 있다.
실시예 7. TKI 투여 후 NIS에 의한 방사성 요오드(radioactive iodine, 이하 RAI)의 축적 측정
<7.1> 세포 내
125
I 흡수 능력 분석(
In vitro
125
I uptake assay)
8505C 세포를 24-웰 플레이트에 분주(5 Х 104)하고 37℃ 및 5% CO2의 조건에서 12.5μM 또는 25μM 농도의 TKI를 처리하여 RPMI(Roswell Park Memorial Institute)-1640 배지(HyClone, Logan, UT, USA)(HyClone) 에서 72시간 동안 배양하였다. 배양 후, 배지를 제거하고, 8505C 세포를 bHBSS(0.5 % BSA를 포함하는 따뜻한 Hank's balanced salt solution)으로 세척하였다. 습윤한 배양기에서 세포를 500 ㎕ bHBSS, 3.7kBq carrier-free 125I (Perkin-Elmer, Waltham, MA, USA) 및 10μM/L 요오드화 나트륨(NaI, specific activity of 740MBq/mM) 과 37℃ 에서 30 분 동안 배양하였다. 125I 첨가 전에 요오드 수송체의 경쟁적 억제제로서 과염소산 칼륨(KClO4) 50μM을 8505C 세포에 30 분간 투여하였다. 배양 후, 세포를 냉각된 bHBSS로 2 회 세척하고, 500 ㎕의 RIPA 완충액으로 용해시켰다. Cobra Ⅱ gamma-counter(Canberra Packard, Canada)로 방사능을 측정하고, BCA 단백질 분석 키트로 측정한 총 단백질 양과 대비하여 125I 흡수 능력을 정규화하고, 결과를 cpm/㎍로 나타내었다.
<7.2> TKI 투여 후 NIS에 의한 방사성 요오드(radioactive iodine, 이하 RAI) 의 축적 측정
TKI 투여 후 NIS에 의한 방사성 요오드(RAI) 축적이 회복되는 것을 시험하기 위해 8505C 세포에서 상기 <7.1>의 방법으로 125I 흡수 능력을 분석하였다. 도 9a는 TKI 투여에 의해 농도 의존적 방식으로 RAI 축적능력이 현저하게 증가된 결과를 나타낸다. 12.5μM 및 25μM 의 TKI 투여는 비히클 대비 각각 1.72 배 및 2.54 배 RAI 섭취를 증가시켰다. 또한 요오드 운반의 경쟁적 억제제인 염소산 칼륨(KClO4)을 이용하여 RAI 섭취와 기능적 NIS 발현간의 상관관계를 밝히고자 하였다. 도 9b 및 도 9c 는 각각 12.5μM 및 25μM 의 TKI 투여와 KClO4의 투여에 의한 RAI의 흡수능력을 나타낸다. 8505C 세포에서 12.5μM 및 25μM 농도로 TKI를 단독으로 투여하면 RAI 축적을 증가시켰지만 KCIO4의 투여에 의해 요오드 흡수가 차단되었다.
상기의 결과와 같이 TKI 투여는 RAI 축적을 향상시키고 KCIO4는 RAI 섭취를 방해하여 RAI 축적을 완전히 차단하므로 TKI가 NIS를 통해서 RAI의 증가에 직접적으로 영향을 미치는 것을 확인하였다.
실시예 8. TKI 투여에 의한
131
I 매개된 세포 독성 효과(cytotoxicity effect)의 개선
<8.1> 시험관 내
131
I 콜로니 형성 분석(
In vitro
131
I Clonogenic assay)
8505C 세포를 6-웰 플레이트에 분주(1 Х 105) 하고 12.5μM 또는 25μM 농도의 TKI를 처리한 RPMI(Roswell Park Memorial Institute)-1640 배지(HyClone, Logan, UT, USA)(HyClone)에서 72시간 동안 배양하였다. 그 후에, 배지를 제거하고 세포를 bHBSS(0.5 % BSA를 포함하는 따뜻한 Hank's balanced salt solution)로 2회 세척한 다음, 30μM NaI를 포함하는 50μCi/㎖ 131I(KIRAMS, Seoul, Korea)의 존재 또는 부존재 하에서 세포를 37℃에서 7시간 동안 배양하였다. 배양 후, 세포를 bHBSS로 2회 세척하고, 트립신을 투여한 후, 새로운 6-웰 플레이트에 1,000 세포/웰의 밀도로 재분주하였다. 세포를 5 % CO2에서 37 ℃에서 10 일 동안 배양하여 콜로니 형성을 가능하게 하였다. 10일차에, 배지를 제거하고 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 그런 다음 6-웰 플레이트의 각 콜로니를 1:7 부피비의 아세트산:메탄올을 포함하는 고정 완충액으로 고정시켰다. 고정된 콜로니를 0.05 % 크리스탈 바이올렛으로 1 시간 동안 염색하고 수돗물(tap water)에 담가 크리스탈 바이올렛을 세척하였다. 세포수가 50개 이상인 콜로니를 계수하여, 콜로니 형성율(Plating efficiency) 및 생존율(survival Fraction, %)은 하기와 같은 수학식을 이용하여 계산하였다.
[수학식 1]
콜로니 형성율(Plating efficiency: PE, %) = (계수된 콜로니의 수/분주된 세포의 수) x 100
[수학식 2]
생존율(Surviving fraction: SF, %) = (PE of treated cells/ 비히클의 PE) x 100
<8.2> 8505C 세포에서 TKI 투여에 의한
131
I 매개된 세포 독성 효과의 개선
세포 내 NIS 발현을 통해 방사성 요오드(RAI)와의 결합능력(avidity)이 개선되는지 여부와 131I 및 TKI의 병용 투여시 미분화 갑상선암 세포(8505C 세포)에 대한 치료 효능을 평가하였다. 도 10a는 131I 및 12.5μM의 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 8505C 세포의 생존율을 나타내고, 도 10b는 131I 및 25μM의 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 8505C 세포의 생존율을 나타낸다. 비히클 및 131I, 12.5μM TKI, 25μM TKI 단독으로 투여한 그룹의 생존율(survival Fraction, %) 은 각각 100 ± 13.08 %, 71.98 ± 3.68 %, 77.94 ± 8.17 % 및 77.60 ± 8.77 %이었다. 또한, 131I 와 12.5μM 의 TKI의 조합을 투여하면 세포의 생존율이 상당이 감소하여 대략 52.52±3.94 %이다(도 10a). 또한 131I와 25μM 의 TKI의 조합을 투여하면 32.95±2.27 %의 세포 생존율을 나타낸다(도 10b).
따라서 이러한 결과를 통해, 131I 또는 TKI를 단독으로 투여시 암세포 사멸의 효과가 있고, 131I 와 TKI를 병용하여 투여하는 것이 NIS 재유도 및 RAI의 섭취를 개선하여 갑상선암 치료에 효과있는 것을 확인하였다.
실시예 9.
131
I 와 TKI의 투여시 DNA 손상 측정
TKI와 131I에 의한 암세포 사멸 효과를 확인하기 위하여 γH2A.X foci 형성 분석을 통해 8505C 세포에 TKI 및 131I 를 단독 또는 조합으로 투여시 DNA의 손상을 관찰하였다.
<9.1> γH2A.X foci 형성 분석을 위한 면역형광 이미징(Immunofluorescence imaging)
8505C 세포를 37 ℃, 5 % CO2의 습윤한 분위기에서 4-웰 챔버 슬라이드에서 24 시간 동안 배양(2.5x104)하였다. γH2A.X foci 형성 분석을 위한 면역형광 이미징을 위해, 8505C 세포를 25μM TKI 및 131I 단독 또는 조합으로 투여하였고, 조합으로 투여시에는 TKI를 투여하고 72시간 후 131I가 투여되었다. 배양 후, -20℃의 온도에서 10분간 메탄올로 세포를 고정시키고 10분간 PBS로 3회 세척하였다. 그 후, 세포를 90초 동안 0.3 % Triton X-100으로 배양하여 투과성(permeabilized)으로 만든 다음 10분 동안 PBS로 3회 세척하였다. 1시간 동안 PBS의 3 % BSA로 세포를 블록킹하고 항-NIS(Abcam, Cambridge, UK) 1차 항체(1:50)와 함께 밤새도록 4 ℃에서 인큐베이션하였다. 1차 항체 인큐베이션 후, 세포를 PBS로 10분간 3회 헹구고 Alexa-Fluor 488-접합 2차 항체(Thermo Fisher Scientific)로 1시간 동안 100:1의 희석 비율로 접촉시켰다.
γH2A.X foci의 경우, Dylight 488(Abcam, Cambridge, UK)과 접합된 항-γH2A.X를 사용하여 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. 세포를 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindole; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)를 포함하는 Vecta mounting medium를 사용하여 커버 슬립에 마운트 하고, 공초점 레이저 현미경(confocal laser microscopy)(Zeiss, LSM 5 exciter, Germany)에 의해 NIS 염색이 관찰되었다.
<9.2> 8505C 세포에서
131
I 와 TKI의 투여시 DNA 손상 측정
<9.1>의 방법의 면역형광 이미징을 통해 γH2A.X foci 형성 분석을 관찰하여 131I 및 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 DNA 손상에 대해 분석하였다. 도 11a는 131I 및 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 γH2A.X foci 형성 분석을 수행한 결과를 나타낸다. 도 11a에서 나타나는 바와 같이 γH2A.X foci의 형성이 비히클 대비 TKI 및 131I의 단독 투여 그룹에서 증가하였다. 또한 131I 및 TKI의 조합으로 투여한 그룹에서 131I 및 TKI 단독으로 투여한 그룹보다 상당히 많은 γH2A.X foci의 수를 증가시켰다.
도 11b는 131I 및 TKI 단독 또는 조합으로 투여시 γH2A.X에 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 상기의 면역형광 이미징을 통한 γH2A.X foci 형성 분석 결과와 동일하게 131I 및 TKI의 조합으로 투여한 그룹에서 131I 및 TKI 단독으로 투여한 그룹보다 γH2A.X의 단백질 발현양이 증가된 것을 확인할 수 있었다.
상기의 결과로부터 131I 또는 TKI를 단독으로 투여한 것이 암세포 사멸의 효과를 나타내고, 131I 와 TKI를 병용하여 투여한 것이 암세포 사멸에 상승적인 효과를 나타내는 것을 알 수 있다.
실시예 10. 생체 내(in vivo)에서 TKI 투여에 의한 세포 내 NIS 발현의 증가
<10.1> 종양 이종 이식 마우스 모델(tumor xenograft mice model)의 제작
암컷 5 주 Balb/c 누드 마우스는 Hamamatsu(Shizuoka, Japan)에서 구입 하였다. 마우스는 일주일 동안 병원균이 없는 조건하에서 유지하여 실험 조건에 적응시키고, 동물을 실온(20 내지 25℃) 및 40 내지 70 % 상대 습도의 조건에서 사육하였다. 종양 이종 이식 마우스 모델을 제작하기 위해 8505C-PNIS-PCMV 세포 (5Х106)를 매트리겔(Corning, Bedford, MA, USA)과 1:1의 부피비로 혼합하고 마우스 오른쪽 옆구리 부위의 피하에 주사하였다. 마우스의 평균 종양 크기가 50 mm3에 도달하면 생체 내(in vivo) 실험이 시작되었다.
<10.2> 생체 내 생물 발광 이미징(
In vivo
bioluminescence imaging, 이하 BLI)
마우스를 비히클 그룹(vehicle group)과 100 ㎎/㎏ TKI 투여 그룹(각 그룹마다, n = 5)의 마우스에 대해 NIS 프로모터의 활성이 증가되었는지 여부를 관찰하였다. 마우스에 100 mg/kg TKI를 매일 복강 내(intraperitoneal) 주사에 의해 7 일 동안 매일 투여하고, 처음 TKI를 투여한 날을 기준(0일)으로 하여 TKI 투여 동안 -1(투여 전), 3, 5, 7 일차에 관찰 하였다. Rluc 활성을 관찰하기 위해, 15 ㎍/㎖의 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)을 정맥 주사(intravenous(i.v.) injection)로 투여하고 IVIS Lumina Ⅲ를 사용하여 영상을 찍었다. Rluc 활성과 유사하게, Fluc 활성은 150 ㎍/㎖의 d-루시페린(d-luciferin)을 복강 내 주사(intraperitoneal(i.p) injection)로 투여하여 수행되고 IVIS Lumina Ⅲ에 의해 관찰되었다.
<10.3> 면역조직화학 염색(Immunohistochemistry)
면역조직화학 염색을 위해, 종양을 4% 포르말린으로 하룻밤 동안 고정시켰다. 그런 다음, 표본을 파라핀에 포매(embed)하고, 4 ㎛ 두께로 섹션(section)하여 슬라이드 위에 마운트(mount)하였다. 표본 섹션 슬라이드에서 파라핀을 제거하고, 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)(H&E)으로 염색하였다. NIS(Thermo Fisher Scientific; 1:200 희석) 및 γH2A.X (Abcam; 1:200 희석) 항체를 사용하였다.
<10.4> 생체 내(in vivo)에서 TKI투여에 의한 NIS프로모터 활성의 증가
TKI 투여 후 NIS 프로모터 활성의 변화를 관찰하기 위해 상기 <10.2>의 방법으로 -1, 3, 5 및 7일차에 Fluc 활성에 대한 BLI 이미지를 수집하였다. 도 12a는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서의 Fluc 활성에 대한 BLI 이미지를 나타낸다. 도 12a에서 나타나는 바와 같이 TKI 투여 그룹은 Fluc 활성을 활발하게(robustly) 증가시킨다. 도 12b는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서 Fluc 활성에 대한 정량분석한 결과를 나타낸다. 정량분석을 통해 TKI 투여 그룹에서 FLuc 활성이 유의미하게 증가하였음을 확인하였다. TKI 투여 그룹에서 -1, 3, 5, 및 7일차에 각각 1.00 ± 0.00, 3.95 ± 2.76, 4.92 ± 2.16 및 8.83 ± 5.05의 NIS 프로모터 활성을 보여주고 비히클 그룹에서 -1, 3, 5, 및 7일차에 각각 상대적으로 1.00 ± 0.00, 1.55 ± 1.27, 2.28 ± 1.29 및 2.11 ± 1.15의 NIS프로모터 활성을 보여준다. TKI 투여 그룹은 5 및 7일차에 비히클 그룹보다 2배 및 7일차에는 NIS프로모터 활성이 8배 증가하였다.
그러나 이러한 정량분석에는 종양 크기가 반영되지 않았으므로 Rluc 활성을 관찰하여 TKI 투여 후 종양 크기를 정규화하였다. 도 12c는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서의 Rluc 활성에 대한 BLI 이미지를 나타낸다. 도 12c에 나타난 바와 같이, 비히클과 TKI 투여 그룹 모두 Rluc 활성의 증가를 나타내었다. 도 12d는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클과 TKI 투여 그룹에서 Rluc활성으로 Fluc 활성을 정규화하여 정량분석한 결과를 나타낸다. -1, 3, 5 및 7일차 사이에서 비히클에서 NIS 프로모터의 활성이 증가되었어도, 통계적으로 유의미한 증가를 보이지 않았다. 비히클 그룹과 비교하여 TKI 투여 그룹은 유의미한 NIS 프로모터 활성증가를 보여준다. 가장 높은 Fluc 활성을 보인 7일차에 비히클 그룹은 -1일과 비교하여 1.56 ± 0.88 배의 NIS프로모터 활성의 증가를 나타냈으나 TKI 투여 그룹은 -1일차 대비 7일차에 3.22 ± 0.97 배 NIS 프로모터 활성이 증가한 것을 확인할 수 있었다.
<10.5> TKI투여에 의한 세포 내 NIS 발현의 증가
상기 <3.2>의 방법에 의한 웨스턴 블롯 분석을 통해 TKI 투여 후 7일차에 희생된 마우스로부터 유래된 종양 조직에서 세포 내 NIS 단백질 발현을 확인하였다. 도 13a는 종양 이종 이식 마우스로부터 유래된 종양 조직에서 NIS 단백질 대한 웨스턴 블롯 결과를 나타낸다. 도 13a의 결과와 같이 마우스의 종양 조직에서도 TKI 투여에 의해 세포 내 NIS 발현이 재유도되는 것을 확인할 수 있었다.
상기 <10.3>의 방법으로 마우스의 종양 조직을 이용하여 면역조직화학 염색을 수행하였다. 도 13b는 종양 이종 이식 마우스의 종양 조직에서 NIS의 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸다. 도 13a에 나타난 바와 같이 100 ㎎/㎏의 TKI를 투여한 마우스의 종양 조직에서 NIS 발현양이 비히클 그룹에 비해 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 11. 마우스에 대한
131
I 및 TKI의 투여에 의한 치료 효과
<11.1> 종양 이종 이식 마우스 모델에서 Rluc 활성에 대한 생물 발광 이미징
연속 생물 발광 이미징(serial bioluminescence imaging)을 통해 TKI 및 131I의 단독 또는 조합에 의한 치료 효과를 평가하기 위해, 종양 이종 이식 마우스를 ① 비히클 그룹(0일차부터 7일차 동안 매일 TKI가 포함되지 않은 용매 투여), ② 131I 투여 그룹(0일차부터 7일차 동안 매일 TKI가 포함되지 않은 용매 투여 및 7일차에 정맥 내 주사에 의한 1mCi Na-131I 투여), ③ TKI 투여 그룹(0일차부터 7일차 동안 매일 복강 내 주사에 의한 100 mg/kg 농도로 TKI 투여) 및 ④ 131I 및 TKI 병용 투여 그룹(0일차부터 7일차 동안 매일 복강 내 주사에 의해 100 mg/kg 농도로 TKI 투여 후에 7일차에 정맥 내 주사에 의해 1mCi Na-131I을 투여)으로 구분하였다. Rluc 활성은 131I 또는 TKI 투여 후 0, 3 및 6일차(병용 투여 그룹에서는 131I 투여 후 0, 3, 6일차)에 마우스에 15 ㎍/㎖ 의 h-코엘렌테라진(h-coelenterazine)을 주사하여 관찰하고 IVIS Lumina Ⅲ로 이미지화하였다. 마우스를 이소푸루란(Isofluorane) (Forane, ChongWae Co., Seoul, Korea)으로 마취시키고 비강 콘(nasal cone)을 통한 연속적인 2.5 % 이소푸루란(isofluorane)투여와 함께 이미징 챔버에 두었다.
도 14a는 종양 이종 이식 마우스 모델에서 비히클, 131I 및 TKI 투여에 대한 Rluc 활성을 나타낸다. 비히클, 131I 및 TKI 단독 투여 그룹은 6일차까지 Rluc 활성의 지속적인 증가를 나타내지만 131I 및 TKI의 병용 투여 그룹은 Rluc 활성의 증가를 상당히 억제한다.
<11.2> 종양 부피, 마우스의 무게 및 종양 무게 측정
종양 이종 이식 마우스를 ① 비히클 그룹(0일차부터 7일차 동안 매일 TKI가 포함되지 않은 용매 투여), ② 131I 투여 그룹(0일차부터 7일차 동안 매일 TKI가 포함되지 않은 용매 투여 및 7일차에 정맥 내 주사에 의한 1mCi Na-131I 투여), ③ TKI 투여 그룹(0일차부터 7일차 동안 매일 복강 내 주사에 의한 100 mg/kg 농도로 TKI 투여) 및 ④ 131I 및 TKI 병용 투여 그룹(0일차부터 7일차 동안 매일 복강 내 주사에 의해 100 mg/kg 농도로 TKI 투여 후에 7일차에 정맥 내 주사에 의해 1mCi Na-131I을 투여)으로 구분하여 종양 부피, 마우스의 무게 및 종양 무게를 측정하였다.
TKI(또는 TKI가 포함되지 않은 용매)를 처음 투여한 날을 기준(0일차)으로 -1(TKI 또는 용매 투여전), 6, 10, 14 일차에 종양의 길이 및 너비를 캘리퍼로 측정하고 하기 수학식 3을 이용하여 종양 부피(mm3)를 계산하였다.
[수학식 3]
부피(V) = 0.5 x 길이 x 너비2
도 14b는 TKI(또는 TKI가 포함되지 않은 용매)를 처음 투여한 날을 기준(0일차)으로 -1(TKI 또는 용매 투여전), 6, 10 및 14 일차에 측정한 종양 부피를 나타낸다. 도 14b에 나타나는 결과와 같이 131I 및 TKI의 병용 투여 그룹이 다른 그룹에 비해 종양의 성장을 상당히 억제한다는 것을 보여준다.
도 14c는 생체 내 실험 동안 종양 이종 이식 마우스의 체중변화를 나타낸다. 생체 내 실험 과정 동안 부작용이 있을 수 있으나 도 14c에 나타난 결과와 같이 각 그룹간에 마우스의 체중이 변하지 않았으며 이로부터 모든 그룹에서 131I 및 TKI 투여에 대한 부작용이 없는 것을 알 수 있다.
마우스 생체 내 실험 종료시에 경추 탈구(cervical vertebrae dislocation) 의해 마우스를 희생시켰다. TKI 투여 후 14일차에 종양을 수집하여 이미지화하고 종양 무게를 측정 하였다.
도 15a는 종양 이종 이식 마우스로부터 분리된 종양 조직을 나타낸다. 도 15a에 나타난 바와 같이 131I 및 TKI 병용 투여 그룹의 종양크기는 다른 그룹보다 상당히 작았다. 도 15b는 종양 조직에 대한 평균 무게를 나타낸다. 도 15b에 나타난 평균 종양 무게로부터 131I 및 TKI 병용 투여 그룹의 종양이 2배 이상의 성장이 억제된 것을 확인하였다. 이 결과로부터 131I 및 TKI의 병용 투여시 종양 성장이 유의하게 억제됨을 알 수 있었다.
<11.3> 종양 조직에서 γH2A.X 의 면역조직화학 염색
① 비히클 그룹(0일차부터 7일차 동안 매일 TKI가 포함되지 않은 용매 투여), ② 131I 투여 그룹 (0일차부터 7일차 동안 매일 TKI가 포함되지 않은 용매 투여 및 7일차에 정맥 내 주사에 의한 1mCi Na-131I 투여), ③ TKI 투여 그룹(복강 내 주사에 의한 100 mg/kg 농도로 7일 동안 매일 TKI 투여) 및 ④ 131I 및 TKI 병용 투여 그룹의 마우스로부터 분리된 종양조직에서 상기 <10.3>의 방법으로 γH2A.X 의 면역조직 화학 염색을 수행하였다. 도 16은 종양 이종 이식 마우스로부터 분리된 종양 조직에서 γH2A.X의 면역조직화학 염색을 수행한 결과를 나타낸다. 도 16에 나타난 바와 같이 131I 및 TKI 병용 투여 그룹 에서 DNA 손상정도가 상당히 증가된 것을 확인할 수 있으므로 131I 및 TKI의 병용 투여시 종양 성장이 유의하게 억제됨을 알 수 있다.
통계 분석
모든 실험 결과는 평균±표준편차(means±SD)로 표시하고, 2개 그룹의 결과를 GraphPad Prism 5 software version 5.01(GraphPad Software, Inc. USA)을 이용하여 Student's t-test 방법으로 통계 분석하였다. p 값이 0.05보다 작은 경우 통계적으로 유의성이 있는 것으로 판단하였으며, 에러 바(Error bars)는 표준 편차(standard deviation, SD)를 나타낸다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation
<120> Pharmaceutical Composition For Treating Cancer Comprising
Tyrosine Kinase Inhibitor
<130> PN180163
<160> 14
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> NIS_Forward
<400> 1
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<213> Artificial Sequence
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<400> 2
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
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<213> Artificial Sequence
<220>
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ggaactacga cggtatctga tc 22
Claims (9)
- 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 갑상선암 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
[화학식 1]
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 갑상선암은 미분화 갑상선암(anaplastic thyroid cancer) 또는 분화 갑상선암(differentiated thyroid cancer)인 것인 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 나트륨 요오드 공동 수송체(sodium iodide symporter;NIS)의 발현을 증가시키는 것인 조성물.
- 하기 화학식 1의 화합물 또는 그의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 갑상선암 치료에 사용하기 위한 항암 보조제.
[화학식 1]
- 청구항 5에 있어서, 상기 항암 보조제는 나트륨 요오드 공동 수송체(sodium iodide symporter;NIS)의 발현을 증가시키는 것인 항암 보조제.
- 삭제
- 청구항 5에 있어서, 상기 갑상선암은 미분화 갑상선암(anaplastic thyroid cancer) 또는 분화 갑상선암(differentiated thyroid cancer)인 것인 항암 보조제.
- 청구항 5에 있어서, 상기 항암 보조제는 방사성 요오드 치료와 개별, 순차 또는 동시 사용되는 것인 항암 보조제.
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-
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Legal Events
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