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KR102166271B1 - 지방산 유도체들의 개선된 생산 - Google Patents

지방산 유도체들의 개선된 생산 Download PDF

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KR102166271B1
KR102166271B1 KR1020147030467A KR20147030467A KR102166271B1 KR 102166271 B1 KR102166271 B1 KR 102166271B1 KR 1020147030467 A KR1020147030467 A KR 1020147030467A KR 20147030467 A KR20147030467 A KR 20147030467A KR 102166271 B1 KR102166271 B1 KR 102166271B1
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안드레아스 더블유. 셔머
엘리자베스 제이. 클라크
엘리 에스. 그로반
베르나르도 엠. 다 코스타
지하오 흐
케빈 홀덴
노아 헬만
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알이지 라이프 사이언시스, 엘엘씨
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Abstract

본 발명은 지방산 유도체들의 역가, 수율 및/또는 생산률을 개선시키는데 효과적인 균주 변형을 포함하는 재조합 숙주 세포들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 지방산 유도체들 및 이들의 조성물들의 발효 생산을 위하여 재조합 숙주 세포들을 포함하는 세포 배양들에 관한 것이다.

Description

지방산 유도체들의 개선된 생산{IMPROVED PRODUCTION OF FATTY ACID DERIVATIVES}
관련 출원들에 대한 상호 참조
본 출원은 2012년 4월 2일에 출원된 미국 가출원 61/619,324의 이익을 주장하며, 이는 본 명세서에서 전문이 인용참조된다.
서열 목록(SEQUENCE LISTING)
본 출원은 EFS-Web을 통하여 ASCII 포맷으로 제출된 서열 목록을 포함하며, 이는 본 명세서에서 전문이 인용참조된다. 2013년 4월 2일에 작성된 상기 ASCII 복사본(copy)은 LS00042PCT_SL.txt로 파일명을 지정(named)하였고, 크기는 143,098 바이트(bytes)이다.
분야
본 발명은 지방산 유도체들의 역가(titer), 수율 및/또는 생산률(productivity)을 개선시키는데 효과적인 균주 변형(strain modifications)을 포함하는 재조합 숙주 세포들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 지방산 유도체들 및 이들의 조성물들의 발효 생산을 위하여 재조합 숙주 세포들을 포함하는 세포 배양들에 관한 것이다.
지방족 알데히드들, 지방족 알코올들, 탄화수소들(알칸들 및 올레핀들), 지방족 에스테르들(예를 들어, 왁스들, 지방산 에스테르들 또는 지방족 에스테르들), 및 케톤들을 포함하는 지방산 유도체들은 공업용 화학물질 및 연료의 부문에서 중요성을 나타낸다. 이러한 분자들 및 이들의 유도체들은 계면활성제, 윤활제, 가소제, 용제, 유화제, 연화제(emollients), 증점제, 향미제(flavors), 향료(fragrances) 및 연료로서의 이용을 포함하여 다수에 적용된다. 현재, 원유(Crude petroleum)는 석유화학제품(petrochemicals) 및 연료를 생성하기 위한 원료들 중 일차 원료이다. 석유로부터 유래되는 원료들 중 주요한 두 가지 종류는 짧은 사슬형 올레핀들(예를 들어, 에틸렌 및 프로필렌) 및 방향족들(예를 들어, 벤젠 및 자일렌 이성질체들)이다. 이러한 원료들은 원유를 상당한 비용으로 다양한 방법들, 이를 테면 촉매 크래킹, 증기 크래킹(steam cracking) 또는 촉매 개질(catalytic reforming)을 이용하여 크래킹(cracking)함으로써 원유 내의 더 긴 사슬형 탄화수소들로부터 유래된다. 이러한 원료들은 단량체, 용제, 세제 및 접착제와 같은 석유화학제품을 만드는데 사용될 수 있고, 이는 다르게 원유로부터 직접적으로 정제될 수 없다. 결국, 석유화학제품은 플라스틱, 수지, 섬유, 탄성중합체, 약제, 윤활제, 겔 및 이와 유사한 것들과 같은 특수 화합물(specialty chemicals)을 만드는데 사용될 수 있다. 특히, 석유화학 원료들로부터 생산될 수 있는 특수 화합물은 지방산들, 탄화수소들, 지방족 알데히드들, 지방족 알코올들, 에스테르들 및 케톤들을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
예를 들어, 탄화수소들은 많은 상업적인 용도를 갖는다. 이에 따라, 짧은 사슬형 알칸들 및 알켄들은 수송 연료에 사용된다. 긴 사슬형 알켄들은 플라스틱, 윤활제 및 합성 윤활제에 사용된다. 또한, 알켄들은 알코올, 에스테르, 가소제, 계면활성제, 삼차 아민, 석유회수증진제(enhanced oil recovery agents), 지방산, 티올, 알케닐숙신산 무수물, 에폭사이드, 염소화된 알칸, 염소화된 알켄, 왁스, 연료 첨가제 및 항력 흐름 감소제(drag flow reducers)를 생산하기 위한 공급원료(feedstock)로서 사용된다. 유사하게, 에스테르들은 많은 상업적인 용도를 갖는다. 예를 들어, 바이오디젤, 대체 연료는 에스테르들(예를 들어, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 에틸 에스테르 등)로 이루어져 있다. 일부 분자량이 작은 에스테르들은 향료 또는 방향제로서 유용하게 하는 기분 좋은 향기와 함께 휘발한다. 또한, 에스테르들은 래커(lacquers), 페인트 및 바니시(varnishes)를 위한 용제로서 사용된다. 더욱이, 왁스, 지방 및 오일과 같은 일부 자연적으로 발생하는 물질들도 에스테르들로 이루어져 있다. 에스테르들은 수지 및 플라스틱의 연화제, 가소제, 난연제(flame retardants) 및 가솔린 및 오일의 첨가제로서도 사용된다. 또한, 에스테르들은 중합체, 필름(films), 직물, 염료 및 약제의 제조에 사용될 수 있다.
알데히드들은 다수의 특수 화합물을 생산하는데 사용된다. 예를 들어, 알데히드들은 중합체, 수지[예를 들어, 베이클라이트(Bakelite)], 염료, 착향료, 가소제, 향수, 약제 및 다른 화학물질들을 생산하는데 사용되고, 이들 중 일부는 용제, 보존제 또는 소독제로서 사용될 수 있다. 또한, 비타민 및 호르몬으로서 사용되는 화합물과 같은, 어떤 천연 및 합성 화합물들은 알데히드들이다. 더욱이, 많은 당류는 알데히드기들을 함유한다. 지방족 알데히드들은 화학적 또는 효소적 환원에 의해 지방족 알코올들로 전환될 수 있다. 유사하게, 지방족 알코올들도 많은 상업적인 용도를 갖는다. 짧은 사슬형 지방족 알코올들은 유화제, 연화제 및 증점제로서 화장품 산업 및 식품 산업에 사용된다. 이들의 양친매성(amphiphilic) 성질로 인해, 지방족 알코올들은 비이온성 계면활성제처럼 거동하고, 상기 비이온성 계면활성제는 예를 들어 세제와 같은 개인 위생 용품 및 가정 용품에 유용하다. 또한, 지방족 알코올들은 왁스, 검(gums), 수지, 약제학적 연고 및 로션, 윤활유 첨가제, 직물 정전기 방지제 및 가공제, 가소제, 화장품, 공업 용제 및 지방용 용제에 사용된다. 지방성(aliphatic) 알코올들과 같은 지방족 알코올들은 8 내지 22 개의 탄소 원자들의 사슬을 포함한다. 통상적으로, 지방족 알코올들은 짝수의 탄소 원자들 및 말단 탄소에 부착되는 단일 알코올기(-OH)를 갖는다. 일부는 불포화되고, 일부는 분지형이다. 이들은 공업 화학에 널리 사용된다. 자연계에서 대부분의 지방족 알코올들은 왁스로 발견되고, 상기 왁스는 지방족 알코올들 및 지방산들을 갖는 에스테르들이다. 이들은 박테리아, 식물 및 동물에 의해 생산된다. 현재, 지방족 알코올들은 야자유, 팜유(palm oil), 팜 핵유(palm kernel oil), 탤로(tallow) 및 라드(lard)와 같은 천연 원료들로부터 생산되는 지방산들의 촉매 수소화에 의해, 또는 석유화학 공급원료로부터 생산되는 알파-올레핀들의 화학적 수소화에 의해 생산된다. 천연 원료들로부터 유래되는 지방족 알코올들은 다양한 사슬 길이를 갖는다. 지방족 알코올들의 사슬 길이는 중요하고, 특정 적용에 특이적이다. 지방족 알코올들의 알파-올레핀으로의 탈수반응(Dehydration)도 화학적 촉매작용에 의해 완수될 수 있다.
화학 제품 및 연료 제품에 사용하기 위하여 석유를 탐사, 추출, 수송 및 정제하는데 내재하는 어려움 때문에, 본 기술분야에서는 화학 제품 및 연료 제품에 사용하기 위하여 경제적으로 및 효율적으로 생산될 수 있는 대체 원료(alternate source)가 요구된다. 게다가, 석유계 원료들의 연소는 특히 지구에 살고 있는 인구의 증가를 고려하여, 환경에 심각한 위험이 되고 있다. 따라서, 석유를 탐사, 추출, 수송 및 정제함으로써 발생하는 이러한 타입의 환경 훼손을 야기하지 않는 석유 대체물(replacement)이 요구된다.
재생가능한 석유를 생산하기 위한 일 선택은 재생가능한 석유 제품들을 생산하도록 숙주 세포들을 조작(engineering)하는 것이다. 생물학적으로 유래된 연료 및 화학물질은 석유계 원료보다 장점들을 제공한다. 탄화수소(예를 들어, 알칸, 알켄 또는 알킨), 지방족 알코올, 에스테르, 지방산, 지방족 알데히드 및 케톤과 같은 생물학적으로 유래된 화학물질들은 바이오매스에서 원하는 화학 제품으로 직접적으로 전환된다. 그러나, 재생가능한 화학물질 및 연료의 생산을 위한 원료로서 상업적으로 성장 가능한 발효성 당 또는 바이오매스로부터 생물학적으로 유래된 지방산 유도체들의 사용을 위해서, 공정은 생성물의 회수율(recovery) 및 효율적인 전환을 위해 최적화되어야 한다. 생물학적으로 유래된 연료 및 화학물질의 발달은 최근 몇 년간 연구 및 개발에 있어서 하나의 주안점을 가져왔다. 그럼에도 불구하고, 생물학적으로 유래된 연료 및 화학물질이 상업적으로 실행 가능한 선택이 되기 위하여 관련된 공정들 및 생성물들의 개선에 대한 상당한 필요성이 남아있다. 개선이 필요한 영역은 생산 과정의 에너지 효율 및 최종 수득률(product yield)을 포함한다. 본 발명은 이러한 필요성을 다루고 있다.
본 발명의 일 측면에서는 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 숙주 세포를 제공하고, 여기서 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 특이적 효소 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드들의 유전 암호를 지정한다(codes for). 폴리뉴클레오티드 서열은 숙주 세포에 외인성 또는 내인성이다. 이처럼, 본 발명은 하나 이상의 폴리펩티드들을 인코딩(encoding)하는 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 숙주 세포를 제공하고, 여기서 상기 폴리펩티드들은 3-하이드록시데카노일-[acp] 탈수효소(E.C. 4.2.1.60) 활성; β-케토아실-ACP 생성효소 I(E.C. 2.3.1.41) 활성; β-케토아실-ACP 생성효소 Ⅱ(E.C. 2.3.1.179) 활성; [acp] S-말로닐전달효소 {말로닐-CoA-ACP 아실전달효소}(E.C. 2.3.1.39) 활성; 3-옥소아실-{β-케토아실}-ACP 환원효소(E.C. 1.1.1.100) 활성; β-케토아실-ACP 생성효소 Ⅲ(E.C. 2.3.1.180) 활성; 엔오일-ACP 환원효소(NADH)(E.C. 1.3.1.9) 활성; 엔오일-ACP 환원효소(NADPH)(E.C. 1.3.1.10) 활성; 3-하이드록시-아실-[acp] 탈수효소(E.C. 4.2.1.59) 활성; 및 trans-2, cis-3-데세노일-ACP 이성질화효소(E.C. 5.3.3.14) 활성을 포함하는 그룹에서 선택되는 활성을 가지나, 이로 제한되지 않으며, 여기서 폴리뉴클레오티드를 발현시키는데 효과적인 조건들 하에서 탄소 공급원(carbon source)을 함유하는 배지 내에서 배양되는 경우에, 상기 재조합 숙주 세포는 대응하는 야생형 숙주 세포보다 더 높은 역가, 수율 및/또는 생산률로 지방산 유도체 조성물을 생산한다. 관련된 측면에서, 폴리펩티드가 효소 활성의 적어도 하나의 다른 폴리펩티드와 조합하여 발현되는 경우에, 재조합 숙주 세포는 더 높은 역가, 수율 및/또는 생산률로 지방산 유도체 조성물을 생산한다. 또 다른 측면에서, 폴리펩티드가 효소 활성의 적어도 다섯의 다른 폴리펩티드들과 조합하여 발현되는 경우에, 재조합 숙주 세포는 더 높은 역가, 수율 또는 생산률로 지방산 유도체 조성물을 생산한다. 또 다른 측면에서, 효소 활성의 적어도 둘 또는 셋 또는 넷 또는 다섯 또는 여섯 또는 그 이상의 폴리펩티드들과 조합하여 발현되는 경우에, 재조합 숙주 세포는 더 높은 역가, 수율 또는 생산률로 지방산 유도체 조성물을 생산한다. 또 다른 관련된 측면에서, 재조합 숙주 세포는 추가적으로 아실기 운반 단백질(acyl carrier protein: ACP)인 폴리펩티드의 유전 암호를 지정하는 하나 이상의 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열들을 포함한다. ACP는 어느 효소 활성이든 유전 암호를 지정하는 하나 이상의 폴리펩티드들과 조합하여 발현될 수 있고, 여기서 상기 ACP는 적절한 조건들 하에서 배양되는 경우에, 재조합 숙주 세포의 역가, 수율 및/또는 생산률을 더욱 증가시킨다. 또 다른 관련된 측면에서, 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열은 추가적으로 accABCD 활성을 갖는 폴리펩티드(E.C. 6.4.1.2)를 인코딩한다. accABCD는 어느 효소 활성이든 유전 암호를 지정하는 하나 이상의 폴리펩티드들과 조합하여 발현될 수 있고, 여기서 상기 accABCD는 적절한 조건들 하에서 배양되는 경우에, 재조합 숙주 세포의 역가, 수율 및/또는 생산률을 더욱 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 실시예는 하나 이상의 폴리펩티드들을 인코딩하는 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 숙주 세포를 제공하고, 여기서 상기 폴리펩티드들은 trans-2, cis-3-데세노일-ACP 이성질화효소 활성(fabA 또는 fabM); β-케토아실-ACP 생성효소 I(fabB); 말로닐-CoA-ACP 아실전달효소(fabD); β-케토아실-ACP 생성효소 I(fabF 또는 fabB); β-케토아실-ACP 환원효소(fabG); β-케토아실-ACP 생성효소 Ⅲ(fabH); 엔오일-ACP 환원효소(fabI 또는 fabL 또는 fabV 또는 fabK); 및 3-하이드록스-아실-[acp] 탈수효소(fabA 또는 fabZ); trans-2-엔오일-ACP 환원효소 Ⅱ(fabK)을 포함하는 효소 활성을 가지나, 이로 제한되지 않는다. 관련된 측면에서, 폴리펩티드는 fabA, fabB, fabD, fabF, fabG, fabH, fabI, fabL, fabV, fabZ, fabM 및 fabK 및/또는 이들의 조합체들로부터 선택된다. 또 다른 관련된 측면에서, 폴리펩티드는 쥐티푸스균(Salmonella typhimurium)(NP_460041)으로부터의 FabA; 대장균(Escherichia coli)(NP_416826)으로부터의 FabB; 쥐티푸스균(NP_460164)으로부터의 FabD; 쥐티푸스균(NP_460165)으로부터의 FabG; 쥐티푸스균(NP_460163)으로부터의 FabH; 쥐티푸스균(NP_459232)으로부터의 FabZ; 스트렙토코쿠스 무탄스(Streptococcus mutans)(AAN59379)로부터의 FabM; 폐렴구균(Streptococcus pneumoniae)(AAF98273)으로부터의 FabK; 콜레라균(Vibrio cholera)(YP_001217283)으로부터의 FabV; 클로스트리듐 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)(NP_350156)으로부터의 FabF; 바실러스 서브틸러스 아종 서브틸러스 균주(Bacillus subtillis subsp. subtilis str.) 168(NP_389054)로부터의 FabI; 바실러스 서브틸러스 아종 서브틸러스 균주 168(NP_388745)로부터의 FabL; 아시네토박터종(Acinetobacter sp.) ADP1(YP_047630)로부터의 FabI; 마리노박터 아쿠애올레이(Marinobacter aquaeoli) VT8(YP_958813)로부터의 FabI; 로도코코스 오파쿠스(Rhodococcus opacus) B4(YP_002784194)로부터의 FabI; 아시네토박터종 ADP1(YP_046731)로부터의 FabH; 마리노박터 아쿠애올레이 VT8(YP_958649)로부터의 FabH; 및 로도코코스 오파쿠스 B4(YP_00278448)로부터의 FabH 또는 이들의 조합체들로부터 선택된다.
본 발명은 ACP 폴리펩티드를 인코딩하는 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 재조합 숙주 세포를 고려하고, 여기서 ACP 폴리펩티드를 발현시키는데 효과적인 조건들 하에서 탄소 공급원을 함유하는 배지 내에서 배양되는 경우에, 상기 재조합 숙주 세포는 대응하는 야생형 숙주 세포보다 더 높은 역가, 수율 또는 생산률로 지방산 유도체 조성물을 생산한다. 관련된 측면에서, 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열은 추가적으로 포스포판테테이닐(phosphopantetheinyl) 전달효소(E.C. 2.7.8.7) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 본 명세서에서, 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열은 포스포판테테이닐 전달효소(E.C. 2.7.8.7)를 인코딩하는 sfp 유전자 코딩(gene coding)을 포함한다. 관련된 측면에서, 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열은 추가적으로 accABCD 활성(E.C. 6.4.1.2)을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. ACP는 accABCD 및/또는 포스포판테테이닐 전달효소와 조합하여 발현될 수 있고, 여기서 발현된 폴리펩티드들의 어느 조합체든 적절한 조건들 하에서 배양되는 경우에, 추가적으로 재조합 숙주 세포의 역가, 수율 및/또는 생산률의 증가로 이어진다. 또 다른 관련된 측면에서, ACP는 재조합 숙주 세포에서 발현되는 말단 경로 효소(terminal pathway enzyme)로서 동일한 유기체로부터 유래되고, 여기서 말단 효소는 지방산 생합성 경로 중 일부인 여하한의 아실-ACP 종들을 절단(cleave)한다.
본 발명은 트랜스포존(transposon)을 포함하는 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 재조합 숙주 세포를 추가적으로 포괄하고, 여기서 트랜스포존의 yijP 유전자 내로의 삽입은 yijP 유전자 측면에 위치하는(flanking) 제 2 유전자에 영향을 미치며, 상기 제 2 유전자는 상향 또는 하향 조절되는 폴리뉴클레오티드의 유전 암호를 지정하고, 숙주 세포가 폴리펩티드를 발현시키는데 효과적인 조건들 하에서 탄소 공급원을 함유하는 배지 내에서 배양되는 경우에, 상기 상향 또는 하향 조절되는 폴리뉴클레오티드는 지방산 유도체 조성물의 생산에 영향을 미치는 폴리펩티드의 유전 암호를 지정한다. yijP 유전자는 유전자들의 양옆에 위치될 수 있다. 관련된 측면에서, 트랜스포존의 yijP 유전자 내로의 삽입은 yijP 유전자 또는 이의 폴리뉴클레오티드의 불활성화를 야기하고, 이는 yijP 유전자 측면에 위치하는 하나 이상의 유전자들에 영향을 미치며, 여기서 숙주 세포가 폴리펩티드를 발현시키는데 효과적인 조건들 하에서 탄소 공급원을 함유하는 배지 내에서 배양되는 경우에, 상기 측면에 위치하는 유전자 또는 유전자들은 지방산 유도체 조성물의 생산에 영향을 미치는 폴리펩티드의 유전 암호를 지정한다. 일 관련된 측면에서, 측면에 위치하는 유전자는 ppc, yijO, frwD, pflC, pflD 또는 argE를 포함하나 이로 제한되지 않는 폴리뉴클레오티드들을 포함한다.
본 발명의 또 다른 실시예는 포스포에놀피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase: ppc) 폴리펩티드를 인코딩하는 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공하고, 여기서 ppc 폴리펩티드를 발현시키는데 효과적인 조건들 하에서 탄소 공급원을 함유하는 배지 내에서 배양되는 경우에, 상기 재조합 숙주 세포는 대응하는 야생형 숙주 세포보다 더 높은 역가, 수율 또는 생산률로 지방산 유도체 조성물을 생산한다.
계속해서, 본 발명의 또 다른 실시예는 본 명세서에서 (상기에) 제시한 여하한의 재조합 숙주 세포들을 포함하는 세포 배양을 제공한다. 재조합 숙주 세포는 본 명세서에서 (상기에) 제시한 유전자 조작 방법들에 따라서 지방산 유도체 조성물들을 생산하므로 재조합 숙주 세포는 배지에서 배양된다. 관련된 측면에서, 본원 발명의 재조합 숙주 세포들에 의해 생산되는 지방산 유도체 조성물들은 지방산, 지방족 에스테르, 지방족 알코올, 지방족 알데히드, 알칸, 말단 올레핀(terminal olefins), 내부 올레핀(internal olefins) 및 케톤을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 또 다른 관련된 측면에서, 지방산 유도체는 C6, C8, C1O, C12, C13, C14, C15, C16, C17 또는 C18 지방산 유도체이다. 또 다른 관련된 측면에서, 지방산 유도체는 C10:1, C12:1, C14:1, C16:1 또는 C18:1 불포화 지방산 유도체이다. 추가적으로 관련된 측면에서, 지방산 유도체 조성물은 C8, C1O, C12, C14, C16 및 C18 지방산 유도체들 중 하나 이상을 포함한다. 본원 발명의 재조합 숙주 세포들을 함유하는 세포 배양들에 의해 생산되는 지방산 유도체 조성물들은 지방산, 지방족 알데히드, 지방족 알코올, 지방족 에스테르, 알칸, 말단 올레핀, 내부 올레핀 및 케톤을 포함한다. 본 발명은 추가적으로 지방족 알코올의 감소된 단부(reduced end)로부터 탄소 사슬의 C7과 C8 사이 7 위치에 이중 결합을 갖는 지방산 유도체들을 포함하는 지방산 유도체 조성물들; 불포화 지방산 유도체들을 포함하는 지방산 유도체 조성물들; 포화 지방산 유도체들을 포함하는 지방산 유도체 조성물들; 및 분지쇄형 지방산 유도체들을 포함하는 지방산 유도체 조성물들을 포괄한다.
본 발명은 본 명세서에서 제시한 여하한의 재조합 숙주 세포들을 함유하는 세포 배양을 고려하고, 여기서 재조합 숙주 세포들로서 동일한 조건들 하에서 배양되는 경우에, 상기 재조합 숙주 세포들은 대응하는 야생형 숙주 세포들의 역가보다 적어도 약 5 % 더 큰 역가를 갖는다. 본 명세서에서, 재조합 숙주 세포들은 약 1 g/L 내지 약 250 g/L, 그리고 좀 더 구체적으로 약 90 g/L 내지 약 120 g/L의 역가를 갖는다. 관련된 측면에서, 재조합 숙주 세포들은 적어도 약 10 % 내지 약 40 %의 수율을 갖는다. 일 측면에서, 재조합 숙주 세포들은 약 25 %의 수율을 갖는다. 계속해서, 본 명세서에서는 본 명세서에 제시한 여하한의 재조합 숙주 세포들 중 하나를 함유하는 세포 배양을 포괄하고, 여기서 상기 세포 배양의 생산률은 약 0.7 mg/L/hr 내지 약 3 g/L/hr 이상에 이른다.
본 발명의 또 다른 실시예는 재조합 숙주 세포가 특정 배양 조건들 하에서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열들에 의해 인코딩되는 폴리펩티드 서열을 발현시키도록 재조합 숙주 세포를 유전적으로 조작하는 단계를 포함하는, 상기 재조합 숙주 세포를 만드는 방법들을 제공하고, 상기 폴리뉴클레오티드 서열은 특이적 효소 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드들의 유전 암호를 지정한다.
본원 발명은 바람직한 실시예들을 도시하는데 도움이 되는, 첨부된 도면들과 함께 읽을 때에 가장 잘 이해된다. 그러나, 본 발명이 도면들에 개시된 특정 실시예들로 제한되지 않는 것으로 이해한다.
도 1은 재조합 미생물 내에서 지방산 유도체들에 전구체로서 아실 CoA의 생산에 이용하기 위한 예시적인 생합성 경로를 나타낸다. 주기는 말로닐-ACP 및 아세틸-CoA의 축합에 의해 개시된다.
도 2는 예시적인 지방산 생합성 주기를 나타내고, 여기서 말로닐-ACP는 [말로닐-CoA:ACP 아실전달효소(fabD)에 의해 촉진되는] 말로닐-CoA의 말로닐-ACP로의 아실기전이(transacylation)에 의해 생산된다; 이후에 β-케토아실-ACP 생성효소 Ⅲ(fabH)는 아세틸-CoA과 말로닐-ACP의 축합을 개시한다. 신장 주기(Elongation cycle)들은 β-케토아실-ACP 생성효소 I(fabB) 및 β-케토아실-ACP 생성효소 Ⅱ(fabF)에 의해 촉진되는 말로닐-ACP 및 아실-ACP의 축합으로 시작되어 β-케토-아실-ACP를 생산하고, 이후에 상기 β-케토-아실-ACP는 β-케토아실-ACP 환원효소(fabG)에 의해 환원되어 β-하이드록시-아실-ACP를 생산하며, 이는 β-하이드록시아실-ACP 탈수효소(fabA 또는 fabZ)에 의해 trans-2-엔오일-아실-ACP로 탈수된다. 또한, FabA는 trans-2-엔오일-아실-ACP를 cis-3-엔오일-아실-ACP로 이성질화시킬 수 있고, 이는 fabI를 우회할 수 있으며, (전형적으로 C16의 지방족 사슬 길이까지) fabB에 의해 이용되어 β-케토-아실-ACP를 생산할 수 있다. 각각의 주기에서 최종 단계는 trans-2-엔오일-아실-ACP를 아실-ACP로 전환시키는 엔오일-ACP 환원효소(fabI)에 의해 촉진된다. 본 명세서에 설명된 방법들에서, 지방산 합성의 종료는 유리 지방산(free fatty acid: FFA)을 방출하도록 아실-ACP에서 아실기의 티오에스테라아제(thioesterase)를 제거함으로써 일어난다. 티오에스테라아제들(예를 들어, tesA)은 티오에스테르 결합들을 가수분해하고, 이는 술피드릴(sulfydryl) 결합들을 통하여 아실 사슬들 및 ACP 사이에서 일어난다.
도 3은 아세틸-CoA 카르복실라아제(accABCD) 효소 복합체(complex)의 구조 및 작용기(function)를 도시한다. BirA는 accB를 비오틴화(biotinylate)하고, 비오틴 카르복실 운반 단백질은 아세틸-CoA 카르복실라아제 효소 복합체의 일부이다.
도 4는 아실-ACP와 함께 시작하는 지방족 알코올의 생산에 대한 예시적인 생합성 경로의 개요를 나타내고, 여기서 지방족 알데히드의 생산은 아실-ACP 환원효소(AAR) 또는 티오에스테라아제(TE) 및 카르복실산 환원효소(Car)의 효소 활성에 의해 촉진된다. 지방족 알데히드는 (알코올 탈수소효소로도 칭하는) 알데히드 환원효소에 의해 지방족 알코올로 전환된다.
도 5는 아실-ACP와 함께 시작하는 지방족 에스테르의 생산에 대한 두 개의 예시적인 생합성 경로들의 개요를 나타내고, 여기서 지방족 에스테르의 생산은 일-효소 시스템 또는 삼-효소-시스템으로 완수된다.
도 6은 아실-ACP와 함께 시작하는 탄화수소들의 생산에 대한 예시적인 생합성 경로들의 개요를 나타내고; 내부 올레핀의 생산은 OleABCD의 효소 활성에 의해 촉진되며; 알칸의 생산은 알데히드 탈카르보닐효소(aldehyde decarbonylase: ADC)로 지방족 알데히드를 알칸으로의 효소 전환에 의해 촉진되고; 그리고 말단 올레핀의 생산은 탈카르복실효소에 의해 지방산을 말단 올레핀으로의 효소 전환에 의해 촉진된다.
도 7은 대장균(E. coli) MG1655에 의한 지방산 유도체 생산과 비교되는 감쇠된(attenuated)[즉, 결실된] fadE 유전자를 갖는 MG1655 대장균 균주에 의한 지방산 유도체[총 지방 종류(Total Fatty Species)] 생산을 도시한다. 도 7에 나타낸 데이타는 fadE 유전자의 감쇠가 지방산 유도체 생산에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
도 8은 여덟 개의 상이한 C. 글루타미쿰(glutamicum) 아세틸-CoA 카르복실라아제(Acc) 오페론 구조체(construct)들을 발현하는, 대수 기(log phase)에서의 DAM1_i377의 말로닐-CoA 수치(level)들을 나타낸다.
도 9는 ptrc1/3_accDACB-birA±panK 오페론 구조체들을 발현하는 대수 기에서의 대장균 DAM1_i377의 세포 내 짧은 사슬형-CoA 수치들을 나타낸다. accDACB＋birA는 본 명세서에서 accD＋로도 칭한다.
도 10은 C. 글루타미쿰으로부터의 아세틸-CoA 카르복실라아제 복합체의 성분들 및 M. 하이드로카르보노클라스티커스(hydrocarbonoclasticus)로부터의 에스테르 생성효소 9를 발현하는 대장균 균주 DV2의 지방산 메틸 에스테르(FAME) 생산을 나타낸다.
도 11은 pCL 플라스미드 상에서 C. 글루타미쿰으로부터의 accD+ 오페론과 함께 시네코코커스 엘롱가투스(Synechococcus elongatus) PCC7942 AAR을 발현하는 대장균에 의한 지방족 알코올의 생산을 나타낸다. 세 개의(Triplicate) 샘플들은 accD＋ 균주들에 대하여 나타냈다.
도 12a 및 도 12b는 플라스미드 pCL_Ptrc_tesA는 도면들에 나타낸 각각의 iFAB-함유 균주들로 형질전환되고, 발효는 32 ℃(도 12a) 및 37 ℃(도 12b) 둘 모두에서 얻어지도록 유도(induction)로부터 20시간 FA2 배지 내에서 처리되는 경우에, 이중의 플레이트 스크린(plate screen)들로부터 총 지방 종류의 생산(mg/L)에 대한 데이타를 나타낸다.
도 13은 플라스미드 pDS57 및 통합된(integrated) fabHI 오페론들을 갖는 대장균 DAM1의 FAME 생산을 나타낸다. fabH/I 유전자들은 마리노박터 아쿠애올레이 VT8 또는 아시네토박터 베일리(Acinetobacter baylyi) ADP1로부터 유래한다. 이러한 균주들 내에서의 fabH/I 오페론들에 대한 더 많은 세부사항은 표 7을 참조한다.
도 14는 통합된 fabHI 오페론들뿐만 아니라 C. 글루타미쿰 acc 유전자들의 상이한 구성물(configuration)들 및 플라스미드 pDS57을 갖는 대장균 DAM1의 FAME 생산을 나타낸다. 상기 균주들은 로도코코스 오파쿠스 또는 아시네토박터 베일리 ADP1로부터의 fabH/I 유전자들을 함유한다. fabH/I 및 acc 오페론들에 대한 더 많은 세부사항은 표 7을 참조한다.
도 15는 대조구 균주 대장균 DAM1 pDS57와 비교하여 도 13으로부터 선택되는 통합된 fabH/I 유전자들의 균주들을 갖는 두 개의 대장균 DAM1 pDS57 균주들의 FAME 및 FFA 역가들을 나타낸다.
도 16은 iFAB138의 앞쪽에 통합된 cat-loxP-PT5 카세트(cassette)의 도식(diagram)[도 16 a]; 및 PT5_iFAB138 영역의 도식(도 16b)을 포함하는, iFAB138 유전자 자리(locus)의 도식적인 묘사이다.
도 17은 복구된 rph 및 ilvG 유전자들을 갖는 균주 V668이 상기 복구된 유전자들 중 어느 쪽도 갖지 않는 EG149보다 더 높은 수치의 FFA를 생산한다는 것을 나타낸다.
도 18은 균주 LC535의 yijP 유전자[트랜스포존 히트(transposon hit) 68F11] 내에 트랜스포존 카세트 삽입의 도식적인 묘사이다. 상기 트랜스포존 카세트 내부의 프로모터들을 나타내고, 이들은 인접한 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다.
도 19는 다양한 시아노박테리아성(cyanobacterial) 아실기 운반 단백질(ACPs)을 동시에 발현(coexpressing)시키고 시네코코커스 엘롱가투스 아실-ACP 환원효소(AAR)를 발현시키는 대장균 DV2 내에서의 지방족 알코올 생산을 도시한다. ACPs의 공급원(source)에 대한 세부사항은 표 12에 제공된다.
도 20은 시아노박테리아성 아실기 운반 단백질(cACP) 및 B. 서브틸러스 sfp를 동시에 발현시키고 선도가 없는(leaderless) 대장균 티오에스테라아제 'tesA를 발현시키는 대장균 DV2 내에서의 지방산 생산을 도시한다.
개관(General Overview)
적어도 부분적으로, 본 발명은 재조합 숙주 세포 내에서의 다양한 측면의 지방산 생합성 경로의 변형(modification)이 숙주 세포에 의한 지방산 유도체들의 향상된 생산을 용이하게 한다는 발견을 기반으로 한다. 본 발명은 원하는 특성들을 갖는 지방산 유도체들의 조성물들, 및 이들을 생산하는 방법들에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 재조합 숙주 세포들(예를 들어, 미생물들), 재조합 숙주 세포들의 배양물(culture)들, 재조합 숙주 세포들을 만들고 이용하는 방법, 예를 들어 원하는 특성들을 갖는 지방산 유도체들의 발효 생산에 배양된 재조합 숙주 세포들의 이용에 관한 것이다.
좀 더 구체적으로, 원하는 지방산 유도체 조성물[예를 들어, 아실-CoA, 지방산, 지방족 알데히드, 짧은 사슬형 및 긴 사슬형 알코올, 탄화수소, 지방족 알코올, 에스테르(예를 들어, 왁스, 지방산 에스테르 또는 지방족 에스테르), 말단 올레핀, 내부 올레핀 및 케톤]의 생산은 지방산, 지방족 에스테르, 알칸, 알켄, 올레핀 또는 지방족 알코올의 생산, 분해(degradation) 및/또는 분비에 대한 생합성 경로에 관련된 하나 이상의 유전자들의 발현을 변형(modifying)시킴으로써 향상된다. 본 발명은 비-조작된 또는 본래의(native) 숙주 세포들(예를 들어, 대조구 세포들로서 작용하는 야생형 숙주 세포들)에 관하여 향상된 지방산 생합성을 제공하도록 조작된 재조합 숙주 세포들을 제공하고, 이는 예를 들어 균주 개량을 통하여 완수된다. 이처럼, 본 발명은 본 발명의 재조합 숙주 세포들, 방법들 및 조성물들에 유용한 폴리뉴클레오티드들을 식별한다. 일반적으로, 이러한 폴리뉴클레오티드들은 실제 서열(absolute sequence)과 동일할 필요는 없다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 특정 폴리뉴클레오티드 서열이 변화될 수 있고, 인코딩된 폴리펩티드는 활성에 대하여 스크리닝(screened)된다. 전형적으로, 이러한 변화들은 보존성 돌연변이(conservative mutations) 및 잠재성 돌연변이(silent mutations)[예를 들어, 코돈 최적화(codon optimization)]를 포함한다. 유전적으로 조작된 또는 변형된 폴리뉴클레오티드들 및 인코딩된 변형 폴리펩티드(variant polypeptide)들은 본 기술분야에 알려진 방법들을 이용하여, 증가된 촉매 활성, 증가된 안정성 또는 감소된 저해(예를 들어, 감소된 피드백 저해)를 포함하나 이로 제한되지 않는 원하는 작용에 대하여 스크리닝될 수 있다.
본 발명은 효소 분류(Enzyme Classification: EC) 번호에 따라서 본 명세서에 설명된 지방산 생합성 경로들의 다양한 단계들(즉, 반응들)에 관련된 효소 활성들을 식별하고, 이러한 EC 번호들로 분류되는 예시적인 폴리펩티드들(예를 들어, 효소들) 및 이러한 폴리펩티드들을 인코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오티드들을 제공한다. 본 명세서에서 수탁 번호(Accession Numbers) 및/또는 서열 식별 번호(Sequence Identifier Numbers: SEQ ID NOs)로 식별되는 이러한 예시적인 폴리펩티드들 및 폴리뉴클레오티드들은 본 명세서에 설명된 재조합 숙주 세포들을 얻기 위하여 모(parental) 숙주 세포들 내에서의 지방산 경로들을 조작하는데 유용하다. 본 명세서에 설명된 폴리펩티드들 및 폴리뉴클레오티드들은 예시적이며, 이로 제한되지 않는다. 본 명세서에 설명된 예시적인 폴리펩티드들의 동족체(homologue)들의 서열들은 다양한 데이타베이스들[예를 들어, 미국 국립 생물공학 정보센터(NCBI)에 의해 제공되는 rhw Entrez 데이타베이스, 스위스 생물정보학 연구소(Swiss Institute of Bioinformatics)에 의해 제공되는 ExPasy 데이타베이스, 브라운슈바이크 기술대학(Technical University of Braunschweig)에 의해 제공되는 BRENDA 데이타베이스, 및 교토대 및 동경대의 생물정보학 센터(Bioinformatics Center of Kyoto University and University of Tokyo)에 의해 제공되는 KEGG 데이타베이스, 이들 모두는 월드 와이드 웹(World Wide Web)에서 이용가능함]를 통하여 본 기술분야의 당업자들이 이용가능하다.
정의
상세한 설명 및 첨부된 청구항들에 사용되는 바와 같이, 단수형들 "a", "an" 및 "the"은 문맥상 달리 명시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "재조합 숙주 세포"에 대한 언급은 두 개 이상의 이러한 재조합 숙주 세포들을 포함하고, "지방족 알코올"에 대한 언급은 하나 이상의 지방족 알코올들 또는 지방족 알코올들의 혼합물들을 포함하며, "핵산 코딩 서열(nucleic acid coding sequence)"에 대한 언급은 하나 이상의 핵산 코딩 서열들을 포함하고, "효소"에 대한 언급은 하나 이상의 효소들 및 이와 유사한 것들을 포함한다.
수탁 번호: 상세한 설명 전반의 서열 수탁 번호는 (데이타베이스 내에서 "NCBI 수탁 번호" 또는 대안적으로 "GenBank 수탁 번호"로 식별되는) 미국 국립 보건원에 의해 유지되는 NCBI(미국 국립 생물공학 정보센터)에서 제공한 데이타베이스, 및 (데이타베이스 내에서 "UniProtKB 수탁 번호"로 식별되는) 스위스 생물정보학 연구소에서 제공하는 Swiss-Prot 데이타베이스 및 UniProt 지식베이스(UniProtKB)로부터 얻어진다.
효소 분류(EC) 번호: EC 번호는 국제 생화학 및 분자생물학 연합(International Union of Biochemistry and Molecular Biology: IUBMB)의 명명 위원회에 의해서 제정되고, 이의 상세한 설명은 월드 와이드 웹의 IUBMB 효소 명명 웹사이트에서 이용가능하다. EC 번호는 효소들이 촉진시키는 반응에 따라서 효소들을 분류한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "뉴클레오티드"라는 용어는 헤테로사이클릭 염기, 당 및 하나 이상의 인산기들로 이루어진 폴리뉴클레오티드의 단위체 단위를 칭한다. 자연적으로 및 비-자연적으로 발생하는 염기 유사체(analog)들도 포함된다고 이해해야 하지만, 자연적으로 발생하는 염기들[구아닌(G), 아데닌(A), 사이토신(C), 티민(T) 및 우라실(U)]은 전형적으로 퓨린 또는 피리미딘의 유도체들이다. 자연적으로 및 비-자연적으로 발생하는 당 유사체들도 포함된다고 이해해야 하지만, 자연적으로 발생하는 당은 펜토오스(5-탄당)의 (DNA를 형성하는) 디옥시리보오스 또는 (RNA를 형성하는) 리보오스이다. 많은 다른 연결들(예를 들어, 포스포로티오에이트, 보라노포스페이트 및 이와 유사한 것들)이 본 기술분야에 알려져 있으나, 핵산들은 전형적으로 핵산들 또는 폴리뉴클레오티드들을 형성하는 인산 결합들을 통하여 연결된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 리보뉴클레오티드(RNA) 또는 디옥시리보뉴클레오티드(DNA)의 중합체를 칭하고, 이는 외가닥 또는 이중 가닥일 수 있으며, 비-천연 또는 변화된(altered) 뉴클레오티드들을 함유할 수 있다. "폴리뉴클레오티드", "핵산 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"이라는 용어들은 여하한 길이의 뉴클레오티드들의 중합체 형태, RNA 또는 DNA 중 하나를 칭한다. 이러한 용어들은 분자의 일차 구조를 지칭하고, 따라서 이중 가닥 및 외가닥의 DNA, 및 이중 가닥 및 외가닥의 RNA를 포함한다. 상기 용어들은 메틸화된 및/또는 캡핑된(capped) 폴리뉴클레오티드들로 제한되지 않으나, 이들과 같은 변형된 폴리뉴클레오티드들 및 뉴클레오티드 유사체들로부터 만들어지는 RNA 또는 DNA 중 하나의 유사체들을 등가물(equivalent)들로서 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 플라스미드, 바이러스(viral), 염색체(chromosomal), EST, cDNA, mRNA 및 rRNA를 포함하나 이로 제한되지 않는 여하한 형태로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "폴리펩티드" 및 "단백질"이라는 용어들은 아미노산 잔기들의 중합체를 칭하도록 통용되어 사용된다. "재조합 폴리펩티드"라는 용어는 재조합 기술들에 의해 생산된 폴리펩티드를 칭하고, 여기서 일반적으로 발현되는 단백질을 인코딩하는 DNA 또는 RNA는 결국 폴리펩티드를 생산하기 위해 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용되는 적합한 발현 벡터 내로 삽입된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "동족체(homolog)" 및 "상동"이라는 용어들은 대응하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열과 적어도 약 50 % 동일한 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 칭한다. 바람직하게, 상동 폴리뉴클레오티드들 또는 폴리펩티드들은 대응하는 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 약 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 적어도 약 99 % 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열들 또는 아미노산 서열들을 갖는다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 서열 "상동성" 및 서열 "동일성"은 통용되어 사용된다.
본 기술분야의 당업자는 둘 이상의 서열들 간의 상동성을 결정하는 방법들을 잘 알고 있을 것이다. 간단히 말해서, 두 서열들 간의 "상동성"의 계산은 다음과 같이 실시될 수 있다. 상기 서열들은 최적의 비교 목적들을 위하여 정렬된다[예를 들어, 갭(gap)들은 최적의 정렬을 위하여 핵산 서열, 또는 제 1 및 제 2 아미노산 중 하나 또는 둘 모두에 도입될 수 있고, 그리고 비-상동 서열들은 비교 목적을 위해 무시될 수 있다]. 바람직한 실시예에서, 비교 목적을 위하여 정렬되는 제 1 서열의 길이는 제 2 서열의 길이의 적어도 약 30 %, 바람직하게는 적어도 약 40 %, 더욱 바람직하게는 적어도 약 50 %, 훨씬 바람직하게는 적어도 약 60 %, 그리고 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 70 %, 적어도 약 75 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 % 또는 약 100 %이다. 이후에, 제 1 및 제 2 서열들의 대응하는 아미노산 위치들 또는 뉴클레오티드 위치들에서의 아미노산 잔기들 또는 큐글레오티드들이 비교된다. 제 1 서열 내의 위치가 제 2 서열 내의 대응하는 위치로서 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 점유(occupied)되는 경우, 이후에 분자들은 이 위치에서 동일하다. 두 서열들 간의 퍼센트 상동성(percent homology)은 두 서열들의 최적의 정렬을 위하여 도입될 필요가 있는, 갭들의 개수 및 각각의 갭의 길이를 고려하여, 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치들의 개수의 함수이다.
두 서열들 간의 퍼센트 상동성의 결정 및 서열들의 비교는 BLAST와 같은 수학적 알고리즘을 이용하여 완수될 수 있다[Altschul et al., J. Mol. Biol., 215(3):403-410(1990)]. 또한, 두 아미노산 서열들 간의 퍼센트 상동성은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나, 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량(length weight)을 이용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램에 통합되는 Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 사용해 결정될 수 있다[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:444-453 (1970)]. 또한, 두 뉴클레오티드 서열들 간의 퍼센트 상동성은 NWSgapdna.CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 이용하여, GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램을 사용해 결정될 수 있다. 본 기술분야의 당업자는 초기 상동성 계산을 실시할 수 있고, 이에 맞춰 알고리즘 파라미터들을 조절할 수 있다. 바람직한 파라미터들의 세트(set) [그리고 만약 당업자(practitioner)는 분자가 청구항들의 상동성 제한 내에 있는지의 여부를 결정하는데 적용되어야 하는 파라미터들에 대하여 확신이 없다면 사용되어야 하는 파라미터들의 세트]는 12의 갭 페널티(gap penalty), 4의 갭 확장 페널티(gap extend penalty) 및 5의 프레임시프트 갭 페널티(frameshift gap penalty)를 갖는 Blossum 62 스코어링(scoring) 매트릭스이다. 서열 정렬의 추가적인 방법들은 생물공학 분야에 알려져 있다[예를 들어, Rosenberg, BMC Bioinformatics, 6:278(2005); Altschul, et al., FEBS J., 272(20):5101-5109(2005)].
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 덜 엄격한(low stringency), 엄격한(medium stringency), 매우 엄격한(high stringency) 또는 아주 매우 엄격한(very high stringency) 조건들 하에서 교배하다"라는 용어는 교배 및 세정에 대한 조건들을 설명한다. 혼성화 반응(hybridization reaction)들을 실시하기 위한 안내는 olecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.(1989), 6.3.1-6.3.6 내에 현재 프로토콜(Protocol)들에서 찾을 수 있다. 수성(Aqueous) 및 비-수성 방법들은 상기 참고문헌에 설명되어 있고, 상기 방법들 중 하나가 사용될 수 있다. 본 명세서에 언급된 특정한 교배 조건들은 다음과 같다: 1) 덜 엄격한 교배 조건 - 약 45 ℃에서 6X 소듐 클로라이드/소듐 시트레이트(SSC), 이후에 적어도 50 ℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS로 두 번 세정(세정의 온도는 낮은 엄격성의 조건의 경우 55 ℃까지 증가될 수 있음); 2) 엄격한 교배 조건 - 약 45 ℃에서 6X SSC, 이후에 60 ℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS로 한번 이상 세정; 3) 매우 엄격한 교배 조건 - 약 45 ℃에서 6X SSC, 이후에 65 ℃에서 0.2X SSC, 0.1 % SDS로 한번 이상 세정; 및 4) 아주 매우 엄격한 교배 조건 - 65 ℃에서 0.5 M 소듐 포스페이트, 7 % SDS, 이후에 65 ℃에서 0.2X SSC, 1 % SDS로 한번 이상 세정. 달리 명시하지 않는 한, 아주 매우 엄격한 조건(4)이 바람직한 조건이다.
"내인성" 폴리펩티드는 재조합 세포가 조작되거나 또는 유래되는 숙주 세포(예를 들어, 모 미생물 세포)의 게놈(genome)에 의해 인코딩되는 폴리펩티드를 칭한다.
"외인성" 폴리펩티드는 모 미생물 세포의 게놈에 의해 인코딩되지 않는 폴리펩티드를 칭한다. 변형(즉, 변종) 폴리펩티드는 외인성 폴리펩티드의 일 예이다.
일반적으로, "이종(heterologous)"이라는 용어는 상이한 종으로부터 유래되거나, 또는 상이한 유기체로부터 유래되는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 특정한 유기체 내에 자연적으로 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열을 칭한다. 이종 발현은 단백질 또는 폴리펩티드가 보통 상기 단백질을 발현하지 않는 세포에 실험적으로 첨가되는 것을 의미한다. 이처럼, 이종은 도입된 단백질(transferred protein)이 처음에 수용체(recipient)와는 상이한 세포 타입 또는 상이한 종으로부터 유래된다는 사실을 칭한다. 예를 들어, 식물 세포에 내인성 폴리뉴클레오티드 서열은 재조합 방법들에 의해 박테리아성 숙주 세포 내로 도입될 수 있고, 이후에 상기 식물의 폴리뉴클레오티드가 재조합형 박테리아성 숙주 세포 내의 이종 폴리뉴클레오티드이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 폴리펩티드의 "분절(fragment)"이라는 용어는 네 개의 아미노산 잔기 내지 전체 아미노산 서열에서 하나의 아미노산 잔기를 제외한 크기에 이르는 전체 길이의(full-length) 폴리펩티드 또는 단백질의 짧은 부분을 칭한다. 본 발명의 여하한 실시예에서, 분절은 폴리펩티드 또는 단백질의 도메인(domain)[예를 들어, 기질 결합 도메인 또는 촉매 도메인]의 전체 아미노상 서열을 칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "돌연변이 유발(mutagenesis)"이라는 용어는 유기체의 유전 정보를 안정된 방식으로 변화시키는 과정을 칭한다. 단백질 코딩 핵산 서열의 돌연변이 유발은 돌연변이 단백질을 생산한다. 또한, 돌연변이 유발은 변형된 단백질 활성을 야기하는 비-코딩 핵산 서열들의 변화를 칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전자"라는 용어는 RNA 또는 단백질의 발현에 영향을 미치는 작동가능하게 연결된(작동가능하게 연결된) 핵산 서열들[예를 들어, 프로모터 또는 증폭자(enhancer) 서열들을 포함하나 이로 제한되지 않는 이러한 서열들] 또는 RNA 또는 단백질의 발현에 영향을 미치는 서열들을 인코딩하는 작동가능하게 연결된 핵산 서열들[예를 들어, 리보솜 결합 부위들 또는 번역 조절(translational control) 서열들을 포함하나 이로 제한되지 않는 이러한 서열들]뿐만 아니라, RNA 생성물과 단백질 생성물 중 하나를 인코딩하는 핵산 서열들을 칭한다.
발현 조절(Expression control) 서열들은 본 기술분야에 알려져 있고, 예를 들어 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 위하여 제공되는 프로모터, 증폭자, 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 전사 종결자(transcription terminator), 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry sites: IRES) 및 이와 유사한 것들을 포함한다. 발현 조절 서열들은 특히 전사에 관련된 세포성 단백질들과 상호작용을 한다[Maniatis et al., Science, 236:1237-1245(1987)]. 예시적인 발현 조절 서열들은, 예를 들어 Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol. 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)에 설명된다.
본 발명의 방법들에서, 발현 조절 서열은 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 적절한 분자들(예를 들어, 전사 활성화인자 단백질들)이 발현 조절 서열(들)에 결합되는 경우에, 폴리뉴클레오티드 서열 및 발현 조절 서열(들)이 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 "작동가능하게 연결된다"는 것을 의미한다. 작동가능하게 연결된 프로모터들은 전사 및 번역의 방향에 관하여 선택된 폴리뉴클레오티드 서열의 상류(upstream)에 위치된다. 작동가능하게 연결된 증폭자들은 선택된 폴리뉴클레오티드의 상류, 내부(within) 또는 하류(downstream)에 위치될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "벡터"라는 용어는 상기 벡터와 연결되는 또 다른 핵산, 즉 폴리뉴클레오티드 서열을 수송할 수 있는 핵산 분자를 칭한다. 유용한 벡터 중 한 가지 타입은 에피솜(episome)[즉, 염색체외 복제(extra-chromosomal replication)가 가능한 핵산]이다. 유용한 벡터는 벡터와 연결되는 핵산들의 자동 복제 및/또는 발현할 수 있는 벡터이다. 작동가능하게 연결되는 유전자들의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본 명세서에서 "발현 벡터"로 칭한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술들에서 유용한 발현 벡터는 종종 "플라스미드"의 형태인데, 이는 일반적으로 벡터 형태에서 염색체에 결합되지 않는 원형 이중 가닥 DNA 루프(loops)를 칭한다. "플라스미드" 및 "벡터"라는 용어는 본 명세서에서 통용되어 사용되는데, 그 이유는 플라스미드가 벡터의 가장 일반적으로 사용되는 형태이기 때문이다. 그러나, 등가적인 기능들을 수행하고 이후에 본 기술분야에 알려지는 다른 형태들의 발현 벡터도 포함된다. 일부 실시예들에서, 재조합 벡터는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 프로모터는 발달-조절된(developmentally-regulated), 세포소기관(organelle)-특이적, 조직-특이적, 유도적, 구조적 또는 세포-특이적 프로모터이다. 전형적으로, 재조합 벡터는 (a) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게(operatively) 연결된 발현 조절 서열; (b) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 선택 마커; (c) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 마커 서열; (d) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 정제 모이어티(purification moiety); (e) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 분비 서열(secretion sequence); 및 (f) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 표적화 서열(targeting sequence)을 포함하는 서열들 중 적어도 하나의 서열을 포함한다. 여하한 실시예들에서, 뉴클레오티드 서열은 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 안정적으로 통합되고, 상기 뉴클레오티드 서열의 발현은 조절된 프로모터 영역에 의해 제어된다. 본 명세서에 설명된 발현 벡터들은 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 형태의 본 명세서에 설명된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 폴리펩티드의 발현 수준 등과 같은 요인들에 의존할 수 있다는 것을 본 기술분야의 당업자들은 인지할 것이다. 본 명세서에 설명된 발현 벡터들은 본 명세서에 설명되는 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열들에 의해 인코딩되는, 융합 폴리펩티드들을 포함하는 폴리펩티드들을 생산하기 위하여 숙주 세포들에 도입될 수 있다.
원핵생물, 예를 들어 대장균(E. coli)에서 폴리펩티드들을 인코딩하는 유전자의 발현은 대부분 융합 및 비-융합 폴리펩티드들 중 하나의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터들로 수행된다. 융합 벡터들은 그 속에 인코딩된 폴리펩티드에, 일반적으로 재조합 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단에 다수의 아미노산들을 첨가한다. 전형적으로, 이러한 융합 벡터들은 다음의 3가지 목적: (1) 재조합 폴리펩티드의 발현을 증가시키고; (2) 재조합 폴리펩티드의 용해도를 증가시키며; 그리고 (3) 친화성 정제(affinity purification)에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 폴리펩티드의 정제를 돕는 것을 수행한다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 융합 모이어티와 재조합 폴리펩티드의 접합점에 단백분해 절단(proteolytic cleavage) 부위가 도입된다. 이는 융합 폴리펩티드의 정제 이후에 융합 모이어티로부터 재조합 폴리펩티드의 분리를 가능하게 한다. 여하한 실시예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리오파지 T5로부터 유래된 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
여하한 실시예들에서, 숙주 세포는 효모 세포이고, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 효모인 맥주효모균(S. cerevisiae) 내에서의 발현을 위한 벡터들의 예시들은 pYepSec1[Baldari et al., EMBO J., 6:229-234(1987)], pMFa[Kurjan et al., Cell, 30:933-943(1982)], pJRY88[Schultz et al., Gene, 54:113-123(1987)], pYES2(Invitrogen Corp., San Diego, CA) 및 picZ(Invitrogen Corp., San Diego, CA)를 포함한다.
다른 실시예들에서, 숙주 세포는 곤충 세포이고, 발현 벡터는 배큘로바이러스(baculovirus) 발현 벡터이다. 배양된 곤충 세포들 내에서 단백질들의 발현을 위하여 이용가능한 배큘로바이러스 벡터들은, 예를 들어 pAc 계열(series)[(Smith et al., Mol. Cell Biol., 3:2156-2165(1983)] 및 pVL 계열[Lucklow et al., Virology, 170: 31-39(1989)]을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 본 명세서에 설명된 폴리뉴클레오티드 서열들은 포유동물 발현 벡터를 이용하여 포유동물 세포들 내에서 발현될 수 있다. 원핵 및 진핵 세포들 둘 모두에 대한 다른 적합한 발현 시스템들은 본 기술분야에 잘 알려져 있다; 예를 들어, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)를 참조한다.
본 명세서에서 언급된 바와 같이 "대응하는 야생형 숙주 세포"라는 용어는 대조구 세포로서 작용하는 세포를 의미한다. 예를 들어, 만약 재조합 숙주 세포 내의 폴리펩티드가 상향 조절되면, 그러면 동일한 폴리펩티드는 대조구 세포 내에서 낮은 수치로 존재할 것이다. 역으로, 만약 재조합 숙주 세포 내의 폴리펩티드가 하향 조절되면, 그러면 동일한 폴리펩티드는 대조구 세포 내에 높은 수치로 존재할 것이다. 더욱이, "재조합 또는 조작된 숙주 세포"는, 예를 들어 아실-CoA, 지방산, 지방족 알데히드, 짧은 사슬형 및 긴 사슬형 알코올, 탄화수소, 지방족 알코올, 에스테르(예를 들어, 왁스, 지방산 에스테르 또는 지방족 에스테르), 말단 올레핀, 내부 올레핀 및 케톤을 포함하는 하나 이상의 지방산 유도체들을 생산하는데 사용되는 미생물이다. 일부 실시예들에서, 재조합 숙주 세포는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드들을 포함하고, 각각의 폴리뉴클레오티드는 지방산 생합성 효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아실-CoA"는 조효소 A(CoA)의 4'-포스포판테티오닐 잔기(moiety)의 술피드릴기와 알킬 사슬의 카르보닐 탄소 사이에서 형성되는 아실 티오에스테르를 칭하고, 이는 화학식 R-C(O)S-CoA를 가지며, 여기서 R은 적어도 4개의 탄소 원자들을 갖는 여하한 알킬기이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "아실-ACP"는 아실기 운반 단백질(ACP)의 포스포판테테이닐 잔기의 술피드릴기와 알킬 사슬의 카르보닐 탄소 사이에서 형성되는 아실 티오에스테르를 칭한다. 포스포판테테이닐 잔기는 홀로(holo)-아실기 운반 단백질 생성효소(ACPS)인 포스포판테테이닐 전달효소의 작용에 의해 ACP 상의 보존된 세린 잔기에 이후에-번역되도록(post-translationally) 부착된다. 일부 실시예들에서, 아실-ACP는 완전히 포화된 아실-ACP들의 합성에 있어서 중간체이다. 다른 실시예들에서, 아실-ACP는 불포화된 아실-ACP들의 합성에 있어서 중간체이다. 일부 실시예들에서, 탄소 사슬은 약 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 또는 26 개의 탄소들을 가질 것이다. 이러한 아실-ACP들의 각각은 이들을 지방산 유도체들로 전환시키는 효소들에 대한 기질들이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산 유도체"라는 용어는 "지방산" 또는 "지방산 유도체"를 의미하고, 이는 "지방산 또는 이의 유도체"로 칭할 수 있다. "지방산"이란 용어는 화학식 RCOOH를 갖는 카르복실산을 의미한다. R은 지방족기, 바람직하게는 알킬기를 나타낸다. R은 약 4 내지 22 개의 탄소 원자들을 포함할 수 있다. 지방산들은 포화, 단일불포화 또는 다중불포화될 수 있다. "지방산 유도체"는 생산 숙주 유기체의 지방산 생합성 경로의 일부에서 만들어지는 생성물이다. "지방산 유도체들"은 아실-ACP 또는 아실-ACP 유도체들의 일부에서 만들어지는 생성물들을 포함한다. 예를 들어, 예시적인 지방산 유도체들은 아실-CoA, 지방산, 지방족 알데히드, 짧은 사슬형 및 긴 사슬형 알코올, 지방족 알코올, 탄화수소, 에스테르(예를 들어, 왁스, 지방산 에스테르 또는 지방족 에스테르), 말단 올레핀, 내부 올레핀 및 케톤을 포함한다.
본 명세서에서 언급된 바와 같이 "지방산 유도체 조성물"은 재조합 숙주 세포에 의해 생산되고, 전형적으로 지방산 유도체의 혼합물을 포함한다. 일부 경우에, 상기 혼합물은 하나 이상의 생성물(예를 들어, 지방산 및 지방족 알코올, 지방산 및 지방산 에스테르 또는 알칸 및 올레핀)을 포함한다. 다른 경우에, 지방산 유도체 조성물들은 다양한 사슬 길이 및 포화도 또는 분지 특성(branching characteristics)을 갖는 지방족 알코올들 (또는 또 다른 지방산 유도체)의 혼합물을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 지방산 유도체 조성물은 다양한 사슬 길이 및 포화도 또는 분지 특성을 갖는 하나 이상의 타입의 생성물 및 생성물들 둘 모두의 혼합물을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방산 생합성 경로"라는 용어는 지방산들 및 이들의 유도체들을 생산하는 생합성 경로를 의미한다. 지방산 생합성 경로는 원하는 특성들을 갖는 지방산 유도체들을 생산하도록 본 명세서에 설명되는 것을 외에 효소 활성을 갖는 추가적인 효소들 또는 폴리펩티드들을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방족 알데히드"는 카르보닐기(C=O)에 의해 특징되는 화학식 RCHO를 갖는 알데히드를 의미한다. 일부 실시예들에서, 지방족 알데히드는 지방족 알코올로부터 만들어지는 여하한 알데히드이다. 여하한 실시예들에서, R기는 길이가 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 , 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 또는 적어도 19 개의 탄소들이다. 대안적으로 또는 추가적으로, R기는 길이가 20 이하, 19 이하, 18 이하, 17 이하, 16 이하, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하 또는 6 이하의 탄소들이다. 따라서, R기는 상기의 종단점(endpoint)들 중 여하한 두 개로 제한되는(bounded by) R기를 가질 수 있다. 예를 들어, R기는 길이가 6 내지 16 개의 탄소들, 10 내지 14 개의 탄소들, 또는 12 내지 18 개의 탄소들일 수 있다. 일부 실시예들에서, 지방족 알데히드는 C6, C7, C8, C9, C1O, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 또는 C26 지방족 알데히드이다. 여하한 실시예들에서, 지방족 알데히드는 C6, C7, C8, C9, C1O, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17 또는 C18 지방족 알데히드이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방족 알코올"은 화학식 ROH를 가지는 알코올을 의미한다. 일부 실시예들에서, R기는 길이가 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11 , 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18 또는 적어도 19 개의 탄소들이다. 대안적으로 또는 추가적으로, R기는 길이가 20 이하, 19 이하, 18 이하, 17 이하, 16 이하, 15 이하, 14 이하, 13 이하, 12 이하, 11 이하, 10 이하, 9 이하, 8 이하, 7 이하 또는 6 이하의 탄소들이다. 따라서, R기는 상기의 종단점(endpoint)들 중 여하한 두 개로 제한되는 R기를 가질 수 있다. 예를 들어, R기는 길이가 6 내지 16 개의 탄소들, 10 내지 14 개의 탄소들, 또는 12 내지 18 개의 탄소들일 수 있다. 일부 실시예들에서, 지방족 알코올은 C6, C7, C8, C9, C1O, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 또는 C26 지방족 알코올이다. 여하한 실시예들에서, 지방족 알코올은 C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17 또는 C18 지방족 알코올이다.
지방산 유도체, 예를 들어 지방족 알코올의 R기는 직쇄형 또는 분지쇄형일 수 있다. 분지쇄형은 하나 이상의 분지점(point of branching)들을 가질 수 있고, 사이클릭형 분지들을 포함할 수 있다. 일부 실시예들에서, 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올은 C6, C7, C8, C9, C10, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17, C18, C19, C20, C21, C22, C23, C24, C25 또는 C26 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올이다. 특정 실시예들에서, 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올은 C6, C7, C8, C9, C1O, C11, C12, C13, C14, C15, C16, C17 또는 C18 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올이다. 여하한 실시예들에서, 분지형 지방산, 분지형 지방족 알데히드 또는 분지형 지방족 알코올의 하이드록시기는 첫번째(C1) 위치에 존재한다.
여하한 실시예들에서, 분지형 지방산 유도체는 이소(iso)-지방산 유도체, 예를 들어 이소-지방족 알데히드, 이소-지방족 알코올, 또는 안테이소(anteiso)-지방산 유도체, 안테이소-지방족 알데히드 또는 안테이소-지방족 알코올이다. 예시적인 실시예들에서, 분지형 지방산 유도체는 이소-C7:0, 이소-C8:0, 이소-C9:0, 이소-C10:0, 이소-C11:0, 이소-C12:0, 이소-C13:0, 이소-C14:0, 이소-C15:0, 이소-C16:0, 이소-C17:0, 이소-C18:0, 이소-C19:0, 안테이소-C7:0, 안테이소-C8:0, 안테이소-C9:0, 안테이소-C10:0, 안테이소-C11:0, 안테이소-C12:0, 안테이소-C13:0, 안테이소-C14:0, 안테이소-C15:0, 안테이소-C16:0, 안테이소-C17:0, 안테이소-C18:0 및 안테이소-C19:0 분지형 지방족 알코올로부터 선택된다.
분지형 또는 비분지형 지방산 유도체의 R기는 포화되거나 불포화될 수 있다. 만약 불포화된다면, R기는 하나 이상의 불포화 지점들을 가질 수 있다. 일부 실시예들에서, 불포화 지방산 유도체는 단일불포화 지방산 유도체이다. 여하한 실시예들에서, 불포화 지방산 유도체는 C6:1, C7:1, C8:1, C9:1, C10:1, C11:1, C12:1, C13:1, C14:1, C15:1, C16:1, C17:1, C18:1, C19:1, C20:1, C21:1, C22:1, C23:1, C24:1, C25:1 또는 C26:1 불포화 지방산 유도체이다. 여하한 실시예들에서, 불포화 지방산 유도체는 C10:1, C12:1, C14:1, C16:1 또는 C18:1 불포화 지방산 유도체이다. 다른 실시예들에서, 불포화 지방산 유도체는 오메가-7 위치에서 불포화된다. 여하한 실시예들에서, 불포화 지방산 유도체는 cis 이중 결합을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 전형적으로 "클론"이라는 용어는 본질적으로 유전적으로 동일한 단일 공통 선조의 자손인 세포들의 그룹 또는 세포, 예를 들어 단일 박테리아성 세포에서 발생하는 복제된(cloned) 박테리아성 콜로니의 박테리아를 칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "배양"이라는 용어는 생육가능한(viable) 세포들을 포함하는 액체 배지를 칭한다. 일 실시예에서, 배양은 제어된 조건들 하에서 미리 결정된 배양 배지 내에서 번식하는 세포들, 예를 들어 선택된 탄소 공급원 및 질소를 포함하는 액체 배지 내에서 성장하는 재조합 숙주 세포들의 배양물(culture)을 포함한다. "배양하는(culturing)" 또는 "배양(cultivation)"은 액체 또는 고체 배지 내에서 적합한 조건들 하에서 재조합 숙주 세포들의 개체군(population)을 성장시키는 것을 칭한다. 특정 실시예들에서, "배양하는"은 기질의 최종 생성물로의 발효성 생물전환(bioconversion)을 칭한다. 배양 배지는 잘 알려져 있고, 이러한 배양 배지의 각각의 성분들은, 예를 들어 상표 Difco™ 및 BBL™라는 이름의 상용 공급원(commercial source)들로부터 이용가능하다. 비-제한적인 일 실시예에서, 수성 영양소를 함유하는 배지(aqueous nutrient medium)는 질소, 염(salt) 및 탄소의 복합적인 공급원들을 포함하는 "영양이 풍부한 배지(rich medium)", 이를 테면 배지 중 10 g/L의 펩톤 및 10 g/L 효모 추출물을 포함하는 YP 배지이다. 배양에 대하여 숙주 세포는 미국 특허 5,000,000; 5,028,539; 5,424,202; 5,482,846; 5,602,030; WO 2010127318에 설명된 방법들에 따라서 탄소 공급원으로서 셀룰로오스성 물질(cellulosic material)들을 사용하고 효과적으로 탄소를 흡수하도록 추가적으로 조작될 수 있다. 또한, 일부 실시예들에서, 숙주 세포는 수크로오스를 탄소 공급원으로서 사용할 수 있도록 자당 분해효소(invertase)를 발현하도록 조작된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시키는데 효과적인 조건들 하에서"라는 용어는 숙주 세포가 원하는 지방산 유도체를 생산할 수 있게 하는 여하한 조건을 의미한다. 예를 들어, 적합한 조건들은 발효 조건들을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 재조합 숙주 세포 내에서 단백질, 예를 들어 효소의 활성의 "변형된" 또는 "변화된 수준(level)"은 모(parent) 또는 본래의(native) 숙주 세포에 대하여 결정된 활성에 있어서 한 가지 이상의 특성들의 차이를 칭한다. 전형적으로, 활성에 대한 차이는 변형된 활성을 갖는 재조합 숙주 세포와 대응하는 야생형 숙주 세포 사이(예를 들어, 대응하는 야생형 숙주 세포에 대하여 재조합 숙주 세포의 배양물의 비교)에서 결정된다. 예를 들어, 변형된 활성들은 [예를 들어, 단백질을 인코딩하는 DNA 서열들의 증가되거나 감소된 카피 숫자(number of copies), 단백질을 인코딩하는 mRNA 전사체들의 증가되거나 감소된 숫자, 및/또는 mRNA로부터의 단백질의 단백질 번역(protein translation)의 증가되거나 감소된 양의 결과로서] 재조합 숙주 세포에 의해 발현되는 단백질의 변형된 양; 단백질의 구조 변화(예를 들어, 관측되는 동력학적 파라미터들의 변화, 기질 특이성의 변화를 야기하는 단백질 코딩 서열의 변화와 같은 일차 구조의 변화); 및 단백질 안정성의 변화(예를 들어, 단백질의 증가되거나 감소된 분해)의 결과일 수 있다. 일부 실시예들에서, 폴리펩티드는 본 명세서에 설명된 여하한 폴리펩티드들의 변이체 또는 돌연변이체이다. 여하한 실시예들에서, 본 명세서에 설명된 폴리펩티드들에 대한 코딩 서열들은 특정 숙주 세포 내에서의 발현에 최적화된 코돈이다. 예를 들어, 대장균 내에서의 발현에 대하여, 하나 이상의 코돈들은, 예를 들어 Grosjean et al., Gene 18:199-209(1982)에 설명된 바와 같이 최적화될 수 있다.
전형적으로, 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 "조절 서열(regulatory sequences)"이라는 용어는 궁극적으로 단백질의 발현을 제어하는 단백질을 인코딩하는 DNA 서열들에 작동가능하게 연결된, DNA 내의 염기들의 서열을 칭한다. 조절 서열의 예시들은 RNA 프로모터 서열, 전사 인자 결합 서열(transcription factor binding sequences), 전사 종결 서열, [증폭자 요소(enhancer elements)와 같은] 전사의 조절인자(modulators), RNA 안정성에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열, 및 번역 조절 서열[이를 테면, 리보솜 결합 부위(예를 들어, Shine-Dalgarno sequences in prokaryotes or Kozak sequences in eukaryotes), 개시 코돈, 종결 코돈]을 포함하나, 이로 제한되지 않는다.
"발현의 변화된 수준" 및 "발현의 변형된 수준"이라는 용어들은 통용되어 사용되고, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 탄화수소가 동일한 조건들 하에서 대응하는 야생형 세포 내에서의 이들의 농도와 비교하여 조작된 숙주 세포 내에서 상이한 농도로 존재한다는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "역가"라는 용어는 숙주 세포 배양의 단위 부피 당 생성된 지방산 유도체의 질량을 칭한다. 본 명세서에 설명된 조성물들 및 방법들의 여하한 측면에서, 지방산 유도체는 약 25 mg/L, 약 50 mg/L, 약 75 mg/L, 약 100 mg/L, 약 125 mg/L, 약 150 mg/L, 약 175 mg/L, 약 200 mg/L, 약 225 mg/L, 약 250 mg/L, 약 275 mg/L, 약 300 mg/L, 약 325 mg/L, 약 350 mg/L, 약 375 mg/L, 약 400 mg/L, 약 425 mg/L, 약 450 mg/L, 약 475 mg/L, 약 500 mg/L, 약 525 mg/L, 약 550 mg/L, 약 575 mg/L, 약 600 mg/L, 약 625 mg/L, 약 650 mg/L, 약 675 mg/L, 약 700 mg/L, 약 725 mg/L, 약 750 mg/L, 약 775 mg/L, 약 800 mg/L, 약 825 mg/L, 약 850 mg/L, 약 875 mg/L, 약 900 mg/L, 약 925 mg/L, 약 950 mg/L, 약 975 mg/L, 약 1000 mg/L, 약 1050 mg/L, 약 1075 mg/L, 약 1100 mg/L, 약 1125 mg/L, 약 1150 mg/L, 약 1175 mg/L, 약 1200 mg/L, 약 1225 mg/L, 약 1250 mg/L, 약 1275 mg/L, 약 1300 mg/L, 약 1325 mg/L, 약 1350 mg/L, 약 1375 mg/L, 약 1400 mg/L, 약 1425 mg/L, 약 1450 mg/L, 약 1475 mg/L, 약 1500 mg/L, 약 1525 mg/L, 약 1550 mg/L, 약 1575 mg/L, 약 1600 mg/L, 약 1625 mg/L, 약 1650 mg/L, 약 1675 mg/L, 약 1700 mg/L, 약 1725 mg/L, 약 1750 mg/L, 약 1775 mg/L, 약 1800 mg/L, 약 1825 mg/L, 약 1850 mg/L, 약 1875 mg/L, 약 1900 mg/L, 약 1925 mg/L, 약 1950 mg/L, 약 1975 mg/L, 약 2000 mg/L(2 g/L), 3 g/L, 5 g/L, 1O g/L, 20 g/L, 30 g/L, 40 g/L, 50 g/L, 60 g/L, 70 g/L, 80 g/L, 90 g/L, 1OO g/L 또는 상기 값들 중 여하한 두 개의 값들로 제한되는 범위의 역가로 생산된다. 다른 실시예들에서, 지방산 유도체는 1OO g/L 초과, 200 g/L 초과, 300 g/L 초과 또는 그 이상, 이를 테면 500 g/L, 700 g/L, 1000 g/L, 1200 g/L, 1500 g/L 또는 2000 g/L의 역가로 생산된다. 본 발명의 방법들에 따라서 재조합 숙주 세포에 의해 생산되는 지방산 유도체의 바람직한 역가는 5 g/L 내지 200g/L, 1O g/L 내지 150 g/L, 20 g/L 내지 120 g/L, 및 30 g/L 내지 1OO g/L이다. 일 실시예에서, 본 발명의 방법들에 따라서 재조합 숙주 세포에 의해 생산되는 지방산 유도체의 역가는 약 1 g/L 내지 약 250 g/L이고 더욱 바람직하게는 90 g/L 내지 약 120 g/L이다. 역가는 주어진 재조합 숙주 세포 배양에 의해 생산되는 특정 지방산 유도체 또는 지방산 유도체들의 조합물을 칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "숙주 세포에 의해 생산되는 지방산 유도체의 수율"은 숙주 세포 내에서 투입된(input) 탄소 공급원이 생성물(즉, 지방족 알코올 또는 지방족 알데히드)로 전환되는 효율을 칭한다. 본 발명의 방법들에 따라서 지방산 유도체들을 생산하도록 조작된 숙주 세포들은 적어도 3 %, 적어도 4 %, 적어도 5 %, 적어도 6 %, 적어도 7 %, 적어도 8 %, 적어도 9 %, 적어도 10 %, 적어도 11 %, 적어도 12 %, 적어도 13 %, 적어도 14 %, 적어도 15 %, 적어도 16 %, 적어도 17 %, 적어도 18 %, 적어도 19 %, 적어도 20 %, 적어도 21 %, 적어도 22 %, 적어도 23 %, 적어도 24 %, 적어도 25 %, 적어도 26 %, 적어도 27 %, 적어도 28 %, 적어도 29 % 또는 적어도 30 %, 또는 상기 값들 중 여하한 두 개의 값들로 제한되는 범위의 수율을 갖는다. 다른 실시예들에서, 지방산 유도체 또는 유도체들은 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 또는 그 이상을 초과하는 수율로 생산된다. 대안적으로 또는 추가적으로, 수율은 약 30 % 이하, 약 27 % 이하, 약 25 % 이하 또는 약 22 % 이하이다. 따라서, 수율은 상기 종단점(endpoint)들 중 여하한 두 개 값들로 제한될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법들에 따라서 재조합 숙주 세포에 의해서 생산되는 지방산 유도체 또는 유도체들의 수율은 5 % 내지 15 %, 10 % 내지 25 %, 10 % 내지 22 %, 15 % 내지 27 %, 18 % 내지 22 %, 20 % 내지 28 %, 또는 20 % 내지 30 %일 수 있다. 특정 실시예에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생산되는 지방산 유도체 또는 유도체들의 수율은 약 10 % 내지 40 %이다. 또 다른 특정 실시예에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생산되는 지방산 유도체 또는 유도체들의 수율은 약 25 %이다. 수율은 주어진 재조합 숙주 세포 배양에 의해 생산되는 특정 지방산 유도체 또는 지방산 유도체들의 조합물로 칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생산률"이라는 용어는 숙주 세포 세양의 단위 부피 당 단위 시간 당 생산된 지방산 유도체 또는 유도체들의 질량을 칭한다. 본 발명에 설명된 조성물들 및 방법들의 여하한 측면에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 지방산 유도체 또는 유도체들의 생산률은 100 mg/L/hour, 적어도 200 mg/L/hour, 적어도 300 mg/L/hour, 적어도 400 mg/L/hour, 적어도 500 mg/L/hour, 적어도 600 mg/L/hour, 적어도 700 mg/L/hour, 적어도 800 mg/L/hour, 적어도 900 mg/L/hour, 적어도 1000 mg/L/hour, 적어도 1100 mg/L/hour, 적어도 1200 mg/L/hour, 적어도 1300 mg/L/hour, 적어도 1400 mg/L/hour, 적어도 1500 mg/L/hour, 적어도 1600 mg/L/hour, 적어도 1700 mg/L/hour, 적어도 1800 mg/L/hour, 적어도 1900 mg/L/hour, 적어도 2000 mg/L/hour, 적어도 2100 mg/L/hour, 적어도 2200 mg/L/hour, 적어도 2300 mg/L/hour, 적어도 2400 mg/L/hour 또는 적어도 2500 mg/L/hour이다. 예를 들어, 본 발명의 방법들에 따라서 재조합 숙주 세포에 의해 생산된 지방산 유도체 또는 유도체들의 생산률은 500 mg/L/hour 내지 2500 mg/L/hour, 또는 700 mg/L/hour 내지 2000 mg/L/hour일 수 있다. 일 특정 실시예에서, 생산률은 0.7 mg/L/h 내지 약 3 g/L/h이다. 생산률은 주어진 재조합 숙주 세포 배양에 의해 생산되는 특정 지방산 유도체 또는 지방산 유도체들의 조합물로 칭할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "총 지방 종류" 및 "총 지방산 생성물"이라는 용어는, 국제 특허 출원 공개 WO 2008/119082에 설명된 바와 같이 GC-FID에 의해 평가되는 바와 같이, 지방족 알코올, 지방족 알데히드 및 지방산의 양과 관련하여 본 명세서에서 통용되어 사용될 수 있다. 동일한 용어들은 지방족 에스테르 분석과 관련 있는 경우에 지방족 에스테르 및 유리 지방산을 의미하는 것으로 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "글루코오스 이용률"이라는 용어는 그램/리터/시간(g/L/hr)으로 보고되는, 단위 시간 당 배양에 사용되는 글루코오스의 양을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "탄소 공급원"이라는 용어는 원핵 또는 단순한 진핵 세포 성장을 위한 탄소 공급원으로서 사용되는데 적합한 화합물 또는 기질을 칭한다. 탄소 공급원은 중합체, 탄수화물, 산(acid), 알코올, 알데히드, 케톤, 아미노산, 펩티드 및 기체(예를 들어, CO 및 CO2)를 포함하나 이로 제한되지 않는 다양한 형태로 존재할 수 있다. 예시적인 탄소 공급원은 글루코오스, 프럭토오스, 만노오스, 갈락토오스, 자일로오스 및 아라비노오스와 같은 단당류; 프럭토-올리고당 및 갈락토-올리고당과 같은 올리고당류; 녹말, 셀룰로오스, 펙틴 및 자일란과 같은 다당류; 수크로오스, 말토오스, 셀로비오스 및 투라노오스(turanose)와 같은 이당류; 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 메틸 셀룰로오스 및 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스와 같은 셀룰로오스 물질 및 변이체들; 숙시네이트, 락테이트 및 아세테이트와 같은 포화 또는 불포화 지방산류; 에탄올, 메탄올 및 글리세롤과 같은 알코올류, 또는 이들의 혼합물들을 포함한다. 또한, 탄소 공급원은 글루코오스와 같은, 광합성의 산물일 수 있다. 여하한의 바람직한 실시예들에서, 탄소 공급원은 바이오매스이다. 다른 바람직한 실시예들에서, 탄소 공급원은 수크로오스이다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "바이오매스"라는 용어는 탄소 공급원으로부터 유래되는 여하한 생물학적 물질을 칭한다. 일부 실시예들에서, 바이오매스는 탄소 공급원으로 처리(process)되고, 이는 생물전환에 적합하다. 다른 실시예들에서, 바이오매스는 탄소 공급원으로의 처리를 더 요구하지 않는다. 탄소 공급원은 바이오연료로 전환될 수 있다. 예시적인 바이오매스의 공급원은 옥수수, 사탕수수 또는 스위치그래스 (switchgrass)와 같은 식물성 물질 또는 식물(vegetation)이다. 또 다른 예시적인 바이오매스의 공급원은 동물성 물질[예를 들어, 우분(cow manure)]과 같은 신진대사 노폐물(metabolic waste products)이다. 추가 예시적인 바이오매스의 공급원은 조류 및 여타 수산 식물을 포함한다. 또한, 바이오매스는 발효 찌꺼기, 목초(ensilage), 짚, 재목, 오수(sewage), 쓰레기, 셀룰로오스성 대도시 폐기물(cellulosic urban waste) 및 남은 음식들(food leftovers)을 포함하나 이로 제한되지 않는 공업, 농업, 임업 및 가정으로부터의 폐기물(waste products)을 포함한다. 또한, "바이오매스"라는 용어는 탄수화물(예를 들어, 단당류, 이당류 또는 다당류)들과 같은, 탄소 공급원들을 칭한다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, (지방산 및 이의 유도체와 같은) 생성물들에 대하여 "분리된"이라는 용어는 세포 성분(cellular components), 세포 배양 배지, 또는 화학적 또는 합성 전구체로부터 분리되는 생성물들을 칭한다. 본 명세서에 설명된 방법들에 의해 생산되는 지방산 및 이의 유도체는 세포질뿐만 아니라 발효액(발효액) 내에서 상대적으로 혼합되지 않을 수 있다. 따라서, 지방산 및 이의 유도체는 세포 내 또는 세포 외의 유기상(organic phase)에 수집될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "정제한다", "정제된" 또는 "정제"라는 용어들은, 예를 들어 분리(isolation) 또는 구분(separation)에 의해 주변 환경으로부터 분자의 이동(removal) 또는 분리를 의미한다. "실질적으로 정제된" 분자는 결합되는 다른 성분들로부터 적어도 약 60 %(예를 들어, 적어도 약 70 %, 적어도 약 75 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 %, 적어도 약 97 %, 적어도 약 99 %) 유리된다(free). 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 또한 이러한 용어들은 샘플로부터 오염물질들의 제거를 칭한다. 예를 들어, 오염물질들의 제거는 샘플 내에서 지방족 유도체들의 비율(percentage)의 증가를 유발할 수 있다. 예를 들어, 지방산 유도체가 재조합 숙주 세포에서 생산되는 경우에, 상기 지방산 유도체는 숙주 세포 단백질의 제거에 의해 정제될 수 있다. 정제 후, 샘플 내에서 지방산 유도체의 비율이 증가된다. "정제한다", "정제된" 및 "정제"라는 용어들은 절대 순도(absolute purity)를 요구하지 않는 상대적인 용어들이다. 따라서, 예를 들어 지방산 유도체가 재조합 숙주 세포에서 생산되는 경우에, 정제된 지방산 유도체는 다른 세포 성분(예를 들어, 핵산, 폴리펩티드, 지질, 탄수화물 또는 기타 탄화수소)로부터 실질적으로 분리되는 지방산 유도체이다.
균주 개량
높은 역가, 수율 및/또는 생산률의 지방산 유도체들을 발생시키기 위하여, 생산 숙주 세포에 다수의 변형들 가해졌다. FadR는 지방산 분해 및 지방산 생합성 경로들에 관련된 주요한 조절 인자이다[Cronan et al ., Mol . Microbiol ., 29(4):937-943(1998)]. 대장균 ACS 효소인 FadD 및 지방산 수송 단백질인 FadL은 지방산 흡수 시스템의 구성요소들이다. FadL는 지방산의 박테리아성 세포로의 수송을 매개(mediate)하고, FadD는 아실-CoA 에스테르의 형성을 매개한다. 다른 탄소 공급원이 이용가능하지 않는 경우, 외인성 지방산이 박테리아에 의해 흡수(taken up)되고, 아실-CoA 에스테르로 전환되며, 이는 전사 인자인 FadR에 결합할 수 있고, 지방산 수송(FadL), 활성화(FadD) 및 β-산화(FadA, FadB, FadE 및 FadH)에 책임이 있는 단백질들을 인코딩하는 fad 유전자들의 발현을 저하(depress)시킬 수 있다. 대안적인 탄소 공급원을 이용가능한 경우, 박테리아는 아실-ACP로서 지방산을 합성하고, 이는 β-산화에 대한 기질이 아니라, 인지질 합성에 사용된다. 따라서, 아실-CoA 및 아실-ACP 둘 모두는 상이한 최종 생성물을 야기할 수 있는 지방산들의 독립적인 공급원들이다[Caviglia et al ., J. Biol . Chem ., 279(12):1163-1169(2004)].
대장균과 같은 숙주 세포에서 지방산 생합성을 제한시킬 수 있는 인자들에 관하여 본 기술분야에는 상충하는 공론(speculation)들이 존재한다. 한가지의 의견은 지방산 생합성을 위한 주된 전구체들, 예를 들어 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA의 제한이 지방산 유도체들 합성의 감소를 야기할 수 있다는 것이다. 지방산 생합성을 통해 플럭스(flux)를 증가시키는 한가지 접근법은 상기 지방산 생합성 경로에 대한 다양한 효소들을 조작(manipulate)하는 것이다(도 1 및 도 2 참조). 실시예 3은 대장균 숙주 세포의 염색체 내로의 통합(integration) 및 말로닐-CoA의 아실-ACPs로의 전환을 위한 생합성 경로에 대한 효소들을 인코딩하는 fab 오페론들의 구성(construction)을 나타내는 연구들을 설명한다. 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 이는 지방산 생합성의 플럭스를 증가시킬 수 있다. 지방산 생합성(fab) 경로 및 아세틸-CoA 카르복실라아제(acc) 복합체를 통하여 아세틸-CoA로부터의 아실-ACPs의 공급은, 지방산 유도체 생산 속도를 제한할 수 있는 또 다른 단계이다(도 3 참조). 실시예 2는, 이러한 유전자 변형들이 대장균에서 아세틸-CoA 및 말로닐-CoA의 생산 증가로 이어질 수 있다는 것을 증명하는 대장균 코리네박테리움 글루타 미쿰(Corynebacterium glutamicum) accABCD (±birA)의 최적화된 버전(version)의 과발현 영향을 나타낸다.
또 다른 접근법에서, 대장균 숙주 세포 내에서의 rph 및 ilvG 유전자들의 돌연변이는 더 많은(higher) 유리 지방산(FFA) 생산을 야기하는 것으로 나타났고, 이는 실시예 4에 나타낸 바와 같이 고급(higher) 지방족 알코올의 생산으로 번역된다. 또 다른 접근법에서, 트랜스포존 돌연변이 유발 및 고속-대량 스크리닝(high-throughput screening)은 역가 또는 수율을 증가시키는 유익한 돌연변이들을 찾기 위하여 실시된다. 실시예 5에 나타낸 바와 같이, yijP 유전자 내의 트랜스포존 삽입은 진탕 플라스크(shake flask) 및 유가 배양식 발효(fed-batch fermentations)에서 지방족 알코올 수율을 개선시킬 수 있다.
재조합 숙주 세포에 의한 지방산 유도체의 발생( Generation)
본원 발명은 본 명세서에 설명되는 지방산 생합성 경로들에 이용하는데 적합한 활성을 갖는 수많은 폴리펩티드(즉, 효소)의 예시들을 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 총체적으로 본 명세서에서 "지방산 생합성 폴리펩티드" 또는 "지방산 생합성 효소"로 칭한다. 본 발명의 재조합 숙주 세포에 사용하기에 적합한 지방산 경로의 폴리펩티드의 비-제한적인 예시들이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시예들에서, 본 발명은 지방산 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한 재조합 숙주 세포를 포함한다. 작동가능하게 연결된 조절 서열들 및 지방산 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열은, 재조합 숙주 세포들의 염색체에 통합될 수 있거나, 상기 재조합 숙주 세포에 내재하는 하나 이상의 플라스미드 발현 시스템들에 편입(incorporated)될 수 있거나, 또는 둘 모두 가능하다. 일 실시예에서, 지방산 생합성 폴리뉴클레오티드 서열은 조작되는 재조합 숙주 세포의 모 숙주 세포(즉, 대조구 세포)에 내생적인 폴리펩티드를 인코딩한다. 일부 이러한 내인성 폴리펩티드들은 재조합 숙주 세포에서 과발현된다. 또 다른 실시예에서, 지방산 생합성 폴리뉴클레오티드 서열은 외인성 또는 이종 폴리펩티드를 인코딩한다. 다시 말해서, 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 폴리펩티드는 모 숙주 세포에 외생적이다. 또 다른 실시예에서, 유전적으로 변형된 숙주 세포는 폴리펩티드(단백질)를 인코딩하는 유전자를 과발현시키고, 상기 폴리펩티드(단백질)은 상기 숙주 세포가 지방산 생합성 효소의 기질, 즉 지방족 아실-티오에스테르 기질을 생산하는 속도를 증가시킨다. 여하한 실시예들에서, 발현되는 유전자에 의해 인코딩된 효소는 직접적으로 지방산 생합성에 관련된다. 이러한 재조합 숙주 세포들은 하나 이상의 지방산 생합성 폴리펩티드들(즉, 지방산 생합성에 관련된 효소들)을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하도록 추가적으로 조작될 수 있다. 이러한 폴리펩티드의 예시들은, 재조합 숙주 세포가 지방산을 합성하는, 티오에스테라아제 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 지방족 알데히드 및 지방족 알코올을 합성하는, 티오에스테라아제 활성 및 카르복실산 환원효소(CAR) 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 지방족 알코올을 합성하는, 티오에스테라아제 활성, 카르복실산 환원효소 활성 및 알코올 탈수소효소 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 지방족 알데히드 및 지방족 알코올을 합성하는, 아실-CoA 환원효소(AAR) 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 지방족 알코올을 합성하는, 아실-CoA 환원효소(AAR) 활성 및 알코올 탈수소효소 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 지방족 알코올을 합성하는, 지방족 알코올 형성 아실-CoA 환원효소(fatty alcohol forming acyl-CoA reductase: FAR) 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 알칸을 합성하는, 티오에스테라아제 활성, 카르복실산 환원효소 활성 및 알데히드 탈카르보닐효소 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 알칸을 합성하는, 아실-CoA 환원효소 활성 및 알데히드 탈카르보닐효소 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 지방족 에스테르를 합성하는(예를 들어, 1 효소 시스템; 도 5 참조), 에스테르 생성효소 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 지방족 에스테르를 합성하는(예를 들어, 3 효소 시스템; 도 5 참조), 티오에스테라아제 활성, 아실-CoA 생성효소 활성 및 에스테르 생성효소 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 지방성(aliphatic) 케톤을 합성하는, OleA 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 내부 올레핀을 합성하는, OleABCD 활성을 갖거나; 또는 재조합 숙주 세포가 말단 올레핀을 합성하는, 티오에스테라아제 활성 및 탈카르복실효소 활성을 갖거나; 또는 이들의 조합된 활성들(combinations)을 갖는 폴리펩티드들 또는 단백질들이다. 일부 실시예들에서, 지방산 생합성 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 적어도 하나의 폴리펩티드는 외인성 (또는 이종) 폴리펩티드[예를 들어, 모 숙주 세포와 다른 유기체에서 유래하는 폴리펩티드, 또는 모 미생물 세포에 고유한(native) 폴리펩티드의 변이체] 또는 내인성 폴리펩티드(즉, 모 숙주 세포에 고유한 폴리펩티드)이고, 여기서 상기 내인성 폴리펩티드는 재조합 숙주 세포에서 과발현된다.
하기의 표 1은 특정 지방산 유도체들의 생산을 용이하게 하기 위하여 재조합 숙주 세포들 내에서 발현될 수 있는 예시적인 단백질들의 목록을 제공한다.
표 1: 유전자 명칭( Gene Designations )
Figure 112014104242619-pct00001
Figure 112014104242619-pct00002
Figure 112014104242619-pct00003
Figure 112014104242619-pct00004
Figure 112014104242619-pct00005
Figure 112014104242619-pct00006
지방산의 생산
재조합 숙주 세포는, 예를 들어 EC 3.1.1.5 또는 EC 3.1.2.-(예를 들어, EC 3.1.2.14)의 효소 분류 번호(Enzyme Commission number)를 갖는 티오에스테라아제를 인코딩하는 오픈 리딩 프레임과 함께, 재조합 숙주 세포에서 단백질 발현을 용이하게 하는 작동가능하게 연결된 조절 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열들을 포함할 수 있다. 재조합 숙주 세포에서, 서열 및/또는 조절 서열의 유전 암호를 지정하는 오픈 리딩 프레임은 티오에스테라아제를 인코딩하는 대응하는 야생형 유전자에 관하여 변형된다. 재조합 숙주 세포 내의 티오에스테라아제의 활성은 대응하는 숙주 세포 내의 대응하는 야생형 유전자에서 발현하는 티오에스테라아제의 활성에 관하여 변형된다. 일부 실시예들에서, 지방산을 포함하는 지방산 유도체 조성물은 티오에스테라아제를 발현시키는데 효과적인 조건들 하에서 탄소 공급원의 존재 하에서 재조합 세포를 배양시킴으로써 생산된다. 관련된 실시예들에서, 재조합 숙주 세포는 티오에스테라아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 다른 지방산 생합성 효소 활성들을 갖는 폴리펩티드들을 인코딩하는 하나 이상의 추가적인 폴리뉴클레오티드들을 포함한다. 이러한 일부 실시예에서, 티오에스테라아제의 작용에 의해 생산되는 지방산은 상이한 지방산 생합성 효소 활성을 갖는 하나 이상의 효소들에 의해 또 다른 지방산 유도체, 이를 테면 예를 들어 지방족 에스테르, 지방족 알데히드, 지방족 알코올 또는 탄화수소로 전환된다.
이로부터 만들어지는 지방산 또는 지방산 유도체의 사슬 길이는 특정 티오에스테라아제의 발현을 변형시킴으로써 선택될 수 있다. 티오에스테라아제는 생산되는 지방산 유도체들의 사슬 길이에 영향을 끼칠 수 있다. 지방산 유도체 기질의 사슬 길이는 선택되는 티오에스테라아제(EC 3.1.2.14 또는 EC 3.1.1.5)의 발현을 변형시킴으로써 선택될 수 있다. 그러므로, 숙주 세포는 바람직한 지방산 유도체 기질의 생산을 증가시키기 위하여 하나 이상의 선택되는 티오에스테라아제들을 발현시키거나, 과발현시키거나, 발현을 감쇠시키거나, 또는 발현시키지 않도록 조작될 수 있다. 예를 들어, C10 지방산은 C10 지방산을 생산하는데 적합성(preference)을 갖는 티오에스테라아제를 발현시키고, C10 지방산 이외의 지방산을 생산하는데 적합성을 갖는 티오에스테라아제(예를 들어, C14 지방산을 생산하는데 적합한 티오에스테라아제)를 감쇠시킴으로써, 생산될 수 있다. 이는 10의 탄소 사슬 길이를 갖는 지방산의 상대적으로 균일한 개체군(population)을 산출한다. 다른 실시예들에서, C14 지방산은 비-C14 지방산을 생산하는 내인성 티오에스테라아제를 감쇠시키고, C14-ACP를 이용하는 티오에스테라아제를 발현시킴으로써, 생산될 수 있다. 일부 경우들에서, C12 지방산은 C12-ACP를 이용하는 티오에스테라아제를 발현시키고, 비-C12 지방산을 생산하는 티오에스테라아제를 감쇠시킴으로써, 생산될 수 있다. 예를 들어, C12 지방산은 C12 지방산을 생산하는데 적합성을 갖는 티오에스테라아제를 발현시키고, C12 지방산 이외의 지방산을 생산하는데 적합성을 갖는 티오에스테라아제를 감쇠시킴으로써, 생산될 수 있다. 이는 12의 탄소 사슬 길이를 갖는 지방산의 상대적으로 균일한 개체군을 산출한다. 지방산 유도체들은 세포 외에서 생산되는 실질적으로 모든 지방산 유도체들을 포함하는 배양 배지에서 회수(recovered)된다. 재조합 숙주 세포에 의해 생산되는 지방산 유도체 조성물은 지방산 유도체 조성물의 성분들의 포화도 및 사슬 길이뿐만 아니라 특정 지방산 유도체들의 분포를 결정하기 위하여, 본 기술분야에 알려진 방법들, 예를 들어 GC-FID를 사용하여 분석될 수 있다. 아세틸-CoA, 말로닐-CoA 및 지방산 과생산은, 예를 들어 세포 용해 후 방사성 전구물질, HPLC 또는 GC-MS를 사용함으로써, 본 기술분야에 알려진 방법들을 사용하여 검증될 수 있다. 지방산 경로에 이용하기 위하여 이들을 인코딩하는 티오에스테라아제 및 폴리뉴클레오티드의 추가적인 비-제한적 예시들은 PCT 공개 출원 No. WO 2010/075483에 제공되고, 특히 이는 본 명세서에서 인용참조된다.
지방족 알데히드의 생산
일 실시예에서, 재조합 숙주 세포는 지방족 알데히드를 생산한다. 일부 실시예들에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생산되는 지방산은 지방족 알데히드로 전환된다. 일부 실시예들에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생산되는 지방족 알데히드는 이후에 지방족 알코올 또는 탄화수소로 전환된다. 일부 실시예들에서, 알데히드 환원효소와 같은 본래의(native) (내인성) 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는 숙주 세포(예를 들어, 대장균) 내에 존재하고, 지방족 알데히드를 지방족 알코올로 전환시키는데 효과적이다. 다른 실시예들에서, 본래의 (내인성) 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는 과발현된다. 다른 실시예들에서, 외인성 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는 재조합 숙주 세포 내로 도입되어, 발현 또는 과발현된다. 본래의 또는 재조합 숙주 세포는 지방족 알데히드 생합성 활성을 갖는 효소(예를 들어, 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드 또는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드 또는 효소)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 지방족 알데히드 생합성 효소가 숙주 세포에서 발현 또는 과발현되는 경우에, 지방족 알데히드가 생산된다. 전형적으로, 지방족 알데히드를 생산하도록 조작된 재조합 숙주 세포는 지방족 알데히드의 일부를 지방족 알코올로 전환시킬 것이다. 일부 실시예들에서, 지방족 알데히드는 카르복실산 환원효소(CAR) 활성과 같은 지방족 알데히드 생합성 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 숙주 세포 내에서 발현 또는 과발현시킴으로써 생산된다. CarB는 예시적인 카르복실산 환원효소이다. 본 발명을 실시함에 있어서, 카르복실산 환원효소 폴리펩티드를 인코딩하는 유전자는 숙주 세포 내에서 발현 또는 과발현될 수 있다. 일부 실시예들에서, CarB 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7의 아미노산 서열을 갖는다. 다른 실시예들에서, CarB 폴리펩티드는 SEQ ID NO: 7의 변이체 또는 돌연변이체이다. 이들을 인코딩하는 카르복실산 환원효소(CAR) 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 예시들은 FadD9(EC 6.2.1.-, UniProtKB Q50631, GenBank NP_217106, SEQ ID NO: 34), CarA(GenBank ABK75684), CarB(GenBank YP889972; SEQ ID NO: 33) 및 PCT 공개 No. WO 2010/042664 및 미국 특허 No. 8,097,439에 기재된 관련된 폴리펩티드들을 포함하나 이로 제한되지 않으며, 상기 PCT와 미국 특허는 특히 본 명세서에서 인용참조된다. 일부 실시예들에서, 재조합 숙주 세포는 티오에스테라아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 지방족 알데히드는 아실-ACP 환원효소(AAR) 활성을 갖는 폴리펩티드와 같은, 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 숙주 세포 내에서 발현 또는 과발현시킴으로써 생산된다. 재조합 숙주 세포 내에서의 아실-ACP 환원효소 발현은 지방족 알데히드 및 지방족 알코올의 생산을 야기한다(도 4 참조). 재조합 숙주 세포(예를 들어, 대장균) 내에 존재하는 본래의 (내인성) 알데히드 환원효소는 지방족 알데히드를 지방족 알코올로 전환시킬 수 있다. 예시적인 아실-ACP 환원효소 폴리펩티드들은 PCT 공개 Nos. WO 2009/140695 및 WO 2009/140696에 개시되고, 특히 이 둘 모두 본 명세서에서 인용참조된다. 지방족 알데히드를 포함하는 조성물(지방족 알데히드 조성물)는 지방족 알데히드 생합성 효소를 발현시키는데 효과적인 조건들 하에서 탄소 공급원의 존재 하에서 숙주 세포를 배양시킴으로써 생산된다. 일부 실시예들에서, 지방족 알데히드 조성물은 지방족 알데히드 및 지방족 알코올을 포함한다. 전형적으로, 지방족 알데히드 조성물은 재조합 숙주 세포의 세포 외 환경, 즉 세포 배양 배지에서 회수된다.
지방족 알코올의 생산
일부 실시예들에서, 재조합 숙주 세포는 지방족 알코올 생합성 활성을 갖는 폴리펩티드(효소)[지방족 알코올 생합성 폴리펩티드 또는 지방족 알코올 생합성 효소]를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 재조합 숙주 세포에 의해서 생산되는 지방족 알코올을 포함한다. 지방족 알코올을 포함하는 조성물(지방족 알코올 조성물)은 지방족 알코올 생합성 효소를 발현시키는데 효과적인 조건들 하에서 탄소 공급원의 존재 하에서 재조합 숙주 세포를 배양시킴으로써 생산될 수 있다. 일부 실시예들에서, 지방족 알코올 조성물은 지방족 알코올을 포함하나, 지방족 알코올 조성물은 다른 지방산 유도체들을 포함할 수 있다. 전형적으로, 지방족 알코올 조성물은 재조합 숙주 세포의 세포 외 환경, 즉 세포 배양 배지에서 회수된다. 한가지 접근법에서, 재조합 숙주 세포는 아실-ACP의 유리 지방산(FFAs)으로의 전환을 촉진시키는 티오에스테라아제, 및 유리 지방산을 지방족 알데히드로 전환시키는 카르복실산 환원효소(CAR)를 발현시킴으로써 지방족 알코올을 생산하도록 조작된다. 숙주 세포(예를 들어, 대장균) 내에 존재하는 본래의 (내인성) 알데히드 환원효소는 지방족 알데히드를 지방족 알코올로 전환시킬 수 있다. 일부 실시예들에서, 숙주 세포 내에 존재하는 알데히드 환원효소와 같은 본래의 (내인성) 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는, 지방족 알데히드를 지방족 알코올로 전환시키는데 충분할 수 있다. 그러나, 다른 실시예들에서, 본래의 (내인성) 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는 과발현되고, 또 다른 실시예들에서, 외인성 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드는 재조합 숙주 세포 내로 도입되어, 발현 또는 과발현된다. 일부 실시예들에서, 지방족 알코올은 지방족 알데히드를 지방족 알코올을 전환시키는 지방족 알코올 생합성 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 숙주 세포 내에서 발현 또는 과발현시킴으로써 생산된다. 예를 들어, 알코올 탈수소효소(알데히드 환원효소, 예를 들어, EC 1.1.1.1)는 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 알코올 탈수소효소는 지방족 알데히드의 알코올(예를 들어, 지방족 알코올)로의 전환을 촉진시킬 수 있는 폴리펩티드를 칭한다. 본 기술분야의 당업자는 여하한 알코올 탈수소효소들이 또한 다른 반응들을 촉진시킬 수 있고, 이러한 비-특이적 알코올 탈수소효소들도 알코올 탈수소효소에 포괄된다는 것을 인식할 것이다. 본 발명에 따라서 유용한 알코올 탈수소효소 폴리펩티드의 예시들은 아시네토박터종 M-1(SEQ ID NO: 3)의 AlrA 또는 AlrAadp1(SEQ ID NO: 4)과 같은 AlrA 동족체들; 그리고 YjgB(AAC77226)(SEQ ID NO: 5), DkgA(NP_417485), DkgB(NP_414743), YdjL(AAC74846), YdjJ(NP_416288), AdhP(NP_415995), YhdH(NP_417719), YahK(NP_414859), YphC(AAC75598), YqhD(446856) 및 YbbO[AAC73595.1]와 같은 내인성 대장균 알코올 탈수소효소들을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 추가적인 예시들은 국제 특허 출원 공개 Nos. WO 2007/136762, WO 2008/119082 및 WO 2010/062480에 기재되고, 이들의 각각은 특히 본 명세서에서 인용참조된다. 여하한 실시예들에서, 지방족 알코올 생합성 폴리펩티드는 알데히드 환원효소 또는 알코올 탈수소효소 활성(EC 1.1.1.1)을 갖는다.
또 다른 접근법에서, 지방족 아실-티오에스테르 기질(예를 들어, 지방족 아실-CoA 또는 지방족 아실-ACP)을 지방족 알코올로 전환시키는 지방족 알코올 형성 아실-CoA 환원효소 또는 지방족 아실 환원효소(FARs)를 발현시킴으로써 지방족 알코올을 생산하도록 조작된다. 일부 실시예들에서, 지방족 알코올은 재조합 숙주 세포 내에서 지방족 알코올 형성 아실-CoA 환원효소(FAR) 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 발현 또는 과발현시킴으로써 생산된다. 본 실시예에 따라서 유용한 FAR 폴리펩티드의 예시들은 PCT 공개 WO 2010/062480에 기재되고, 이는 특히 본 명세서에서 인용참조된다. 지방족 알코올은 지방족 아실-ACP 및 지방족 아실-CoA 중간체들을 이용하는 아실-CoA 의존적 경로, 및 지방족 아실-CoA 중간체가 아닌 지방족 아실-ACP 중간체들을 이용하는 아실-CoA 독립적 경로를 거쳐 생산될 수 있다. 특정 실시예들에서, 과발현된 유전자에 의해 인코딩되는 효소는 지방산 생성효소, 아실-ACP 티오에스테라아제, 지방족 아실-CoA 생성효소 및 아세틸-CoA 카르복실라아제로부터 선택된다. 일부 실시예들에서, 과발현된 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 숙주 세포에 내인성이다. 다른 실시예들에서, 과발현된 유전자에 의해 인코딩되는 단백질은 숙주 세포와 이종이다. 또한, 지방족 알코올은 다양한 아실-ACP 또는 아실-CoA 분자들을 대응하는 일차 알코올들로 환원시킬수 있는 효소들에 의해 자연적으로 만들어진다. 또한, 미국 특허 공개 Nos. 20100105963 및 20110206630, 그리고 미국 특허 No. 8097439를 참조하며, 이들은 특히 본 명세서에서 인용참조된다. 재조합 숙주 세포에 의해 지방족 알코올의 생산을 증가시키기 위한 전략들은, 생산 숙주 내의 상이한 유기체들로부터 외인성 지방산 생합성 유전자들의 발현 및/또는 본래의 지방산 생합성 유전자들의 과발현에 의해 지방족 알코올 생합성이 증가된 결과로 지방산 생합성 경로를 통한 증가된 플럭스를 포함한다.
에스테르의 생산
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방족 에스테르"이라는 용어는 에스테르에 관하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 언급된 바와 같이 지방족 에스테르는 지방산으로부터 만들어지는 여하한 에스테르, 예를 들어 지방산 에스테르일 수 있다. 일부 실시예들에서, 지방족 에스테르는 A 측(side) 및 B 측을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 에스테르의 "A 측"은 에스테르의 카르복실레이트 산소에 부착되는 탄소 사슬을 칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 에스테르의 "B 측"은 에스테르의 모(parent) 카르복실레이트를 포함하는 탄소 사슬을 칭한다. 지방족 에스테르가 지방산 생합성 경로에서 유래되는 실시예들에서, 알코올은 A 측에 기여하고, 지방산은 B 측에 기여한다. 여하한 알코올은 지방족 에스테르의 A 측을 형성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 알코올은 지방산 생합성 경로로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 알코올은 비-지방산 생합성 경로를 통하여 생산될 수 있다. 게다가, 알코올은 외인성으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 지방족 에스테르가 유기체에 의해 생산되는 경우에, 알코올은 발효액에 공급될 수 있다. 대안적으로, 알코올도 생산할 수 있는 유기체에 의해 지방족 에스테르가 생산되는 경우에, 지방산 또는 아세트산과 같은 카르복실산은 외인성으로 공급될 수 있다. A 측 또는 B 측을 포함하는 탄소 사슬은 여하한 길이를 가질 수 있다. 일 실시예에서, 에스테르의 A 측은 길이가 적어도 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16 또는 18 개의 탄소들이다. 지방족 에스테르가 지방산 메틸 에스테르인 경우, 에스테르의 A 측은 길이가 1 개의 탄소이다. 지방족 에스테르가 지방산 에틸 에스테르인 경우, 에스테르의 A 측은 길이가 2 개의 탄소들이다. 에스테르의 B 측은 길이가 적어도 약 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24 또는 26 개의 탄소들이다. A 측 및/또는 B 측은 직쇄형 또는 분지쇄형일 수 있다. 분지쇄형은 하나 이상의 분지점(point of branching)들을 가질 수 있다. 또한, 분지쇄형은 사이클릭형 분지들을 포함할 수 있다. 더욱이, A 측 및/또는 B 측은 포화 또는 불포화될 수 있다. 만약 불포화된다면, A 측 및/또는 B 측은 하나 이상의 불포화 지점들을 가질 수 있다. 일 실시예에서, 지방족 에스테르는 생합성으로 생산된다. 이 실시예에서, 첫번째 지방산은 활성화된다. "활성화된" 지방산의 비-제한적인 예시들은 아실-CoA, 아실 ACP 및 아실 포스페이트이다. 아실-CoA는 지방산 생합성 또는 분해의 직접적인 생성물일 수 있다. 또한, 아실-CoA는 유리 지방산, CoA 및 아데노신 뉴클레오티드 트리포스페이트(adenosine nucleotide triphosphate: ATP)로부터 합성될 수 있다. 아실-CoA를 생산하는 효소의 예시는 아실-CoA 생성효소이다. 일부 실시예들에서, 재조합 숙주 세포는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 에스테르 생성효소 활성을 갖는 효소(에스테르 생성효소 폴리펩티드 또는 에스테르 생성효소)를 포함한다.
지방족 에스테르는 재조합 숙주 세포 내에서 발현 또는 과발현되는 에스테르 생성효소 폴리펩티드에 의해 촉진되는 반응에 의해 생산된다. 일부 실시예들에서, 지방족 에스테르를 포함하는 조성물은 에스테르 생성효소를 발현시키는데 효과적인 조건들 하에서 탄소 공급원의 존재 하에서 재조합 세포를 배양시킴으로써 생산된다. 일부 실시예들에서, 지방족 에스테르 조성물은 세포 배양물(culture)에서 회수된다. 예를 들어, 에스테르 생성효소 폴리펩티드는 EC 2.3.1.75로 분류된 에스테르 생성효소 폴리펩티드; 또는 티오에스테라아제, 에스테르 생성효소, 아실-CoA:알코올 아실전달효소, 아실전달효소 또는 지방족 아실-CoA:지방족 알코올 아실전달효소을 포함하나 이로 제한되지 않는, 아실-티오에스테르의 지방족 에스테르로의 전환을 촉진시키는 다른 여하한 폴리펩티드를 포함한다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는 호호바(Simmondsia chinensis), 아시네토박터종 균주 ADP, 알카니보락스 보르쿠멘시스(Alcanivorax borkumensis), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 펀디박터 자덴시스(Fundibacter jadensis), 애기장대(Arabidopsis thaliana) 또는 알카리제니스 유트로푸스(Alkaligenes eutrophus)로부터의 2기능성(bifunctional) 에스테르 생성효소/아실-CoA:디아실글리세롤 아실전달효소, 왁스/dgat를 인코딩할 수 있다. 특정 실시예에서, 에스테르 생성효소 폴리펩티드는 아시네토박터종 디아실글리세롤 O-아실전달효소(wax-dgaT; UniProtKB Q8GGG1, GenBank AAO17391) 또는 호호바 왁스 생성효소(UniProtKB Q9XGY6, GenBank AAD38041)이다. 또 다른 실시예에서, 에스테르 생성효소 폴리펩티드는, 예를 들어 ES9[마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스(Marinobacter hydrocarbonoclasticus) DSM 8798로부터의 왁스 에스테르 생성효소, UniProtKB A3RE51(SEQ ID NO: 6)]; 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스 DSM8789의 ES8(GenBank 수탁 번호 ABO21021; SEQ ID NO:7); ws2 유전자에 의해 인코딩되는, GenBank ABO21021; 또는 ES376(마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스 DSM 8798로부터 유래되는 또 다른 왁스 에스테르 생성효소, UniProtKB A3RE50, GenBank ABO21020, ws1 유전자에 의해 인코딩됨)이다. 특정 실시예에서, 에스테르 생성효소 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 재조합 숙주 세포에서 과발현된다. 일부 실시예들에서, 지방산 에스테르는 세 개의 지방산 생합성 효소들: 티오에스테라아제 효소, 아실-CoA 합성효소(fadD) 효소 및 에스테르 생성효소의 효소를 발현하도록 조작된 재조합 숙주 세포에 의해 생산된다(예를 들어, 3 효소 시스템; 도 5 참조). 다른 실시예들에서, 지방산 에스테르는 하나의 지방산 생합성 효소, 에스테르 생성효소의 효소를 발현하도록 조작된 재조합 숙주 세포에 의해 생산된다(예를 들어, 1 효소 시스템; 도 5 참조). 이러한 실시예들에서 사용하기에 적합한 이들을 인코딩하는 에스테르 생성효소 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드의 비-제한적인 예시들은 PCT 공개 Nos. WO 2007/136762 및 WO 2008/119082, 그리고 WO 2011/038134(3 효소 시스템) 및 WO 2011/038132(1 효소 시스템)에 기재된 것들을 포함하고, 이들의 각각은 특히 본 명세서에서 인용참조된다. 재조합 숙주 세포는 상기 숙주 세포의 세포 외 환경에서 왁스 에스테르, 또는 지방산 메틸 에스테르, 지방산 에틸 에스테르와 같은 지방족 에스테르를 생산할 수 있다.
탄화수소의 생산
적어도 부분적으로, 본 발명의 이러한 측면은, 재조합 숙주 세포 내에서 탄화수소 생합성 폴리펩티드, 예를 들어 탈카르보닐효소, 및 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드, 예를 들어 아실-ACP 환원효소 폴리펩티드(EC 6.4.1.2)의 발현 정도(level)를 변화시키는 것(altering)이 재조합 숙주 세포에 의한 탄화수소의 생산 증대를 용이하게 한다는 발견을 기반으로 한다. 일 실시예에서, 재조합 숙주 세포는 알칸 또는 알켄(예를 들어, 말단 올레핀 또는 내부 올레핀)과 같은 탄화수소, 또는 케톤을 생산한다. 일부 실시예들에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생산되는 지방족 알데히드는 탈카르보닐화(decarbonylation)에 의해, 탄소 원자를 제거함으로써 전환되어 탄화수소를 형성한다. 다른 실시예들에서, 재조합 숙주 세포에 의해 생산되는 지방산은 탈카르복실화(decarboxylation)에 의해, 탄소 원자를 제거함으로써 전환되어 말단 올레핀을 형성한다. 일부 실시예들에서, 아실-ACP 중간체는 탈카르복실화에 의해, 탄소 원자를 제거함으로써 전환되어 내부 올레핀 또는 케톤을 형성한다(도 6 참조). 일부 실시예들에서, 재조합 숙주 세포는 탄화수소 생합성 활성을 갖는 폴리펩티드(효소)[탄화수소 생합성 폴리펩티드 또는 탄화수소 생합성 효소]를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 탄화수소는 재조합 숙주 세포 내에서 탄화수소 생합성 효소의 발현 또는 과발현에 의해 생산된다. 같이 지방산 대사의 중간체들을 알칸들과 알켄들로 전환시키는, 아실-아실기 운반 단백질 환원효소(AAR) 및 알데히드 탈카르보닐효소(ADC)로 이루어진 시아노박테리아로부터의 알칸 생합성 경로는, 탄화수소의 생산을 위하여 재조합 숙주 세포를 조작하는데 사용된다(도 6). 시아노박테리아 내에서 포화된 아실-ACP가 알칸으로 전환되는 경로에 대하여 두 가지 반응들 중 두번째 반응은 알려지지 않은 조성물의 2핵의 금속성 보조인자(binuclear metal cofactor)를 갖는 페리틴-형(ferritin-like) 단백질인, 효소인 알데히드 탈카르보닐효소(ADC)에 의해, 지방족 알데히드 중간체의 C1-C2 결합의 절단(scission)을 수반한다. 일부 실시예들에서, 탄화수소는 알데히드 탈카르보닐효소(ADC) 활성과 같은 탄화수소 생합성 활성을 갖는 폴리펩티드(예를 들어, EC 4.1.99.5)를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 숙주 세포 내에서 발현 또는 과발현시킴으로써 생산된다. 이 실시예에 따라서 유용한 알데히드 탈카르보닐효소를 인코딩하는 예시적인 폴리뉴클레오티드들은 PCT 공개 Nos. WO 2008/119082 및 WO2009/140695에 기재된 것들을 포함하나 이로 제한되지 않고, 이들은 특히 본 명세서에서 인용참조되며, 이들의 서열들을 하기의 표 2에 나타낸다. 일부 실시예들에서, 재조합 숙주 세포는 지방족 알데히드 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다. 일부 실시예들에서, 재조합 숙주 세포는 아실-ACP 환원효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다. 예를 들어, 하기의 표 2를 참조한다.
표 2: 예시적인 탄화수소 생합성 폴리뉴클레오티드들 및 폴리펩티드들
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일부 실시예들에서, 조성물은 아실-CoA 환원효소 및 탈카르보닐효소 폴리뉴클레오티드를 발현시키는데 효과적인 조건들 하에서 탄소 공급원의 존재 하에서 재조합 세포를 배양시킴으로써 생산된다. 일부 실시예들에서, 탄화수소 조성물은 포화 및 불포화 탄화수소들을 포함한다. 그러나, 탄화수소 조성물은 다른 지방산 유도체들을 포함할 수 있다. 전형적으로, 탄화수소 조성물은 재조합 숙주 세포의 세포 외 환경, 즉 세포 배양 배지에서 회수된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 알칸은 탄소(C)와 수소(H)만으로 이루어진 포화 탄화수소 또는 화합물을 칭하며, 상기 원자들은 단일 결합으로 서로 연결된다(즉, 이는 포화 화합물임). 올레핀 및 알켄은 적어도 하나의 탄소와 탄소의 이중 결합을 함유하는 탄화수소를 칭한다(즉, 이들은 불포화 화합물임). 말단 올레핀, α-올레핀, 말단 알켄 및 1-알켄은 화학식 CxH2x을 갖는 α-올레핀 또는 알켄과 관련된 동일한 화합물들을 칭하고, 일차 위치 또는 알파 위치에 이중 결합의 위치 및 탄화수소 사슬의 선형성(linearity)에 의해 유사한 분자식을 갖는 다른 올레핀들과 구별된다. 일부 실시예들에서, 말단 올레핀은 예를 들어 PCT 공개 No. WO 2009/085278에 기재된 바와 같이, 탈카르복실효소 활성을 갖는 폴리펩티드와 같은 탄화수소 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 숙주 세포 내에서 발현 또는 과발현시킴으로써 생산되며, 상기 PCT는 특히 본 명세서에서 인용참조된다. 일부 실시예들에서, 재조합 숙주 세포는 티오에스테라아제를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 더 포함한다. 다른 실시예들에서, 케톤은 예를 들어 PCT 공개 No. WO 2008/147781에 기재된 바와 같이, OleA 활성을 갖는 폴리펩티드와 같은 탄화수소 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 숙주 세포 내에서 발현 또는 과발현시킴으로써 생산되며, 상기 PCT는 특히 본 명세서에서 인용참조된다. 관련된 실시예들에서, 내부 올레핀은 예를 들어 PCT 공개 No. WO 2008/147781에 기재된 바와 같이, OleA 활성을 갖는 폴리펩티드와 함께 OleCD 또는 OleBCD 활성을 갖는 폴리펩티드와 같은, 탄화수소 생합성 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 재조합 숙주 세포 내에서 발현 또는 과발현시킴으로써 생산되며, 상기 PCT는 특히 본 명세서에서 인용참조된다.
재조합 숙주 세포 및 세포 배양
재조합 숙주 세포에 의해 지방산 유도체의 생산을 증가시키기 위한 전략들은, 생산 숙주 내의 상이한 유기체들로부터 외인성 지방산 생합성 유전자들의 발현 및 본래의 지방산 생합성 유전자들의 과발현에 의해 지방산 생합성 경로를 통한 증가된 플럭스를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 재조합 숙주 세포 또는 조작된 숙주 세포는, 유전적 구성(genetic makeup)이 대응하는 야생형 숙주 세포에 대하여, 예를 들어 새로운 유전적 요소(genetic element)들의 의도적인 도입(deliberate introduction) 및/또는 숙주 세포 내에 본래 존재하는 유전적 요소들의 의도적인 변형에 의해 변화된 숙주 세포를 칭한다. 또한, 이러한 재조합 숙주 세포의 오프스프링(offspring)은 이러한 새로운 및/또는 변형된 유전적 요소들을 함유한다. 본 명세서에 설명된 본 발명의 여하한 측면들에서, 숙주 세포는 식물 세포, 곤충 세포, 균류 세포[예를 들어, 칸다디아 균(Candida sp.)과 같은 곰팡이, 사카로미세스 균(Saccharomyces sp.)과 같은 출아 효모(budding yeast)], 조류 세포(algal cell) 및 박테리아성 세포로 이루어진 그룹에서 선택될 수 있다. 바람직한 일 실시예에서, 재조합 숙주 세포는 재조합 미생물이다. 미생물인 숙주 세포의 예시들은 에스체리키아(Escherichia) 속, 바실러스(Bacillus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 자이모모나스(Zymomonas) 속, 로도코코스(Rhodococcus) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 아스페르길러스(Aspergillus) 속, 트리코더마(Trichoderma) 속, 뉴로스포라(Neurospora) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 후미콜라(Humicola) 속, 리조무코(Rhizomucor) 속, 클루이베로마이세스(Kluyveromyces) 속, 피치아(Pichia) 속, 무코(Mucor) 속, 미셀리오프토라(Myceliophtora) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 파네로차에테(Phanerochaete) 속, 느타리(Pleurotus) 속, 트라메테스(Trametes) 속, 크리소스포리움(Chrysosporium) 속, 사카로마이세스(Saccharomyces) 속, 스테노트로파모나스(Stenotrophamonas) 속, 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces) 속, 야로위아(Yarrowia) 속 또는 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속으로부터의 세포들을 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 일부 실시예들에서, 숙주 세포는 그람-양성(Gram-positive) 박테리아성 세포이다. 여타 실시예들에서, 숙주 세포는 그람-음성(Gram-negative) 박테리아성 세포이다. 일부 실시예들에서, 숙주 세포는 대장균 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 바실러스 렌투스(Bacillus lentus) 세포, 바실러스 브레비스(Bacillus brevis) 세포, 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus) 세포, 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis) 세포, 바실러스 알칼로필루스(Bacillus alkalophilus) 세포, 바실러스 코아굴란스(Bacillus coagulans) 세포, 바실러스 키르쿨란스(Bacillus circulans) 세포, 바실러스 푸밀리스(Bacillus pumilis) 세포, 바실러스 튜링기엔시스(Bacillus thuringiensis) 세포, 바실러스 클라우시(Bacillus clausii) 세포, 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium) 세포, 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis) 세포 또는 바실러스 아밀로리퀴파시엔스(Bacillus amyloliquefaciens) 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 트리코더마 코닌기(Trichoderma koningii) 세포, 트리코더마 비리데(Trichoderma viride) 세포, 트리코더마 르에세이(Trichoderma reesei) 세포, 트리코더마 롱기브라키아텀(Trichoderma longibrachiatum) 세포, 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori) 세포, 아스페르길러스 푸미가테스(Aspergillus fumigates) 세포, 아스페르길러스 포에티두스(Aspergillus foetidus) 세포, 아스페르길러스 니둘란스(Aspergillus nidulans) 세포, 아스페르길러스 니게르(Aspergillus niger) 세포, 아스페르길러스 오리재(Aspergillus oryzae) 세포, 후미콜라 인솔렌스(Humicola insolens) 세포, 후미콜라 라누기노세(Humicola lanuginose) 세포, 로도코코스 오파쿠스(Rhodococcus opacus) 세포, 리조무코 미에헤이(Rhizomucor miehei) 세포 또는 무코 미에헤이(Mucor michei) 세포이다. 또 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 스트렙토마이세스 리비단스(Streptomyces lividans) 세포 또는 스트렙토마이세스 무리누스(Streptomyces murinus) 세포이다. 또 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 방선균(Actinomycetes) 세포이다. 일부 실시예들에서, 숙주 세포는 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae) 세포이다. 다른 실시예들에서, 숙주 세포는 진핵 식물(eukaryotic plant), 조류, 남세균(cyanobacterium), 녹색-황 세균, 녹색 비-황(green non-sulfur) 세균, 자색 황세균, 자색 비-황 세균, 극한성 생물(extremophile), 효모, 균류, 이들의 조작된 유기체 또는 합성 유기체로부터의 세포이다. 일부 실시예들에서, 숙주 세포는 광 의존성이거나 탄소를 고정시킨다. 일부 실시예들에서, 숙주 세포는 독립영양적 활성을 갖는다. 일부 실시예들에서, 숙주 세포는 빛의 존재 하에서와 같이, 광독립영양적 활성(photoautotrophic activity)을 갖는다. 일부 실시예들에서, 숙주 세포는 빛의 부재 하에서 종속영양적 또는 혼합영양적이다. 여하한 실시예들에서, 숙주 세포는 애기장대(Avabidopsis thaliana), 파니쿰 비르가툼(Panicum virgatum), 미스캔더스 기간테우스(Miscanthus giganteus), 제아 메이즈(Zea mays), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcuse braunii), 클라미도모나스 레인하드티(Chlamydomonas reinhardtii), 두나리엘라 살리나(Dunaliela salina), 시네코코커스 종(Synechococcus Sp.) PCC 7002, 시네코코거스 종 PCC 7942, 시네코시스티스 종(Synechocystis Sp.) PCC 6803, 써모시네코코커스 엘롱게이트(Thermosynechococcus elongates) BP-1, 클로로비움 테피듐(Chlorobium tepidum), 클로로프렉서스 아우란티쿠스(Chloroflexus auranticus), 크로마티움 비노슘(Chromatiumm vinosum), 로도스피리윰 루브륨(Rhodospirillum rubrum), 로도박터 캡슐라투스(Rhodobacter capsulatus), 로도슈도모나스 파루스리스(Rhodopseudomonas palusris), 클로스트리디움 융달리(Clostridium ljungdahlii), 클로스트리디우써모셀룸(Clostridiuthermocellum), 페니실리움 크리소게눔(Penicillium chrysogenum), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 맥주효모균(Saccharomyces cerevisiae), 스키조사카로마이세스 포롬브(Schizosaccharomyces pombe), 슈도모나스 플루오르슨스(Pseudomonas fluorescens) 또는 자이모모나스 모빌리스(Zymomonas mobilis)로부터의 세포이다.
재조합 숙주 세포에 의한 지방산 유도체 조성물의 생산
매우 다양한 지방산 유도체들은 본 명세서에 설명된 바와 같이 균주 개량을 포함하는 재조합 숙주 세포에 의해 생산될 수 있고, 지방산, 아실-CoA, 지방족 알데히드, 짧은 사슬형 및 긴 사슬형 알코올, 탄화수소(예를 들어, 알칸, 알켄, 또는 말단 올레핀 또는 내부 올레핀과 같은 올레핀), 지방족 알코올, 에스테르[예를 들어, 왁스 에스테르, 지방산 에스테르(예를 들어, 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르)] 및 케톤을 포함하나 이로 제한되지 않는다. 본원 발명의 일부 실시예들에서, 특정 조성물 내의 지방산 유도체들의 더 높은 역가는 대응하는 야생형 숙주 세포의 대조 배양(control culture)에 의해 생산되는 동일한 지방산 유도체의 역가에 관하여 재조합 숙주 세포 배양에 의해 생산되는 특정 타입의 지방산 유도체(예를 들어, 지방족 알코올, 지방산 에스테르 또는 탄화수소)의 더 높은 역가이다. 이런 경우에, 지방산 유도체 조성물은 예를 들어, 다양한 사슬 길이 및 포화도 또는 분지 특성을 갖는 지방족 알코올들의 혼합물을 포함할 수 있다. 본원 발명의 다른 실시예들에서, 특정 조성물들 내의 지방산 유도체들의 더 높은 역가는 대응하는 야생형 숙주 세포의 대조 배양(control culture)에 의해 생산되는 동일한 지방산 유도체의 역가에 관하여 상이한 지방산 유도체들(예를 들어, 지방족 알데히드 및 알코올, 또는 지방산 및 에스테르)의 조합물의 더 높은 역가이다.
숙주 세포의 조작
일부 실시예들에서, 폴리뉴클레오티드 (또는 유전자) 서열은 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 재조합 벡터를 거쳐 숙주 세포에 제공된다. 여하한 실시예들에서, 프로모터는 발달-조절된(developmentally-regulated), 세포소기관(organelle)-특이적, 조직-특이적, 유도적, 구조적 또는 세포-특이적 프로모터이다. 일부 실시예들에서, 재조합 벡터는 (a) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게(operatively) 연결된 발현 조절 서열; (b) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 선택 마커; (c) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 마커 서열; (d) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 정제 모이어티(purification moiety); (e) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 분비 서열; 및 (f) 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 표적화 서열(targeting sequence)을 포함하나 이로 제한되지 않는 서열들 중 적어도 하나의 서열을 포함한다. 본 명세서에 설명된 발현 벡터들은 숙주 세포 내에서 폴리뉴클레오티드 서열의 발현에 적합한 형태의 본 명세서에 설명된 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 발현 벡터의 설계는 형질전환되는 숙주 세포의 선택, 원하는 폴리펩티드의 발현 수준 등과 같은 이러한 요인들에 의존할 수 있다는 것을 본 기술분야의 당업자들은 인지할 것이다. 본 명세서에 설명된 발현 벡터들은 본 명세서에 설명되는 바와 같이 폴리뉴클레오티드 서열들에 의해 인코딩되는, 융합 폴리펩티드들을 포함하는 폴리펩티드들을 생산하기 위하여 숙주 세포들에 도입될 수 있다. 원핵생물, 예를 들어 대장균(E. coli)에서 폴리펩티드들을 인코딩하는 유전자의 발현은 대부분 융합 및 비-융합 폴리펩티드들 중 하나의 발현을 지시하는 구성적 또는 유도성 프로모터를 함유하는 벡터들로 수행된다. 융합 벡터들은 그 속에 인코딩된 폴리펩티드에, 일반적으로 재조합 폴리펩티드의 아미노 또는 카르복시 말단에 다수의 아미노산들을 첨가한다. 전형적으로, 이러한 융합 벡터들은 다음의 3가지 목적: (1) 재조합 폴리펩티드의 발현을 증가시키고; (2) 재조합 폴리펩티드의 용해도를 증가시키며; 그리고 (3) 친화성 정제(affinity purification)에서 리간드로서 작용함으로써 재조합 폴리펩티드의 정제를 돕는 것을 수행한다. 종종, 융합 발현 벡터에서, 융합 모이어티와 재조합 폴리펩티드의 접합점에 단백분해 절단(proteolytic cleavage) 부위가 도입된다. 이는 융합 폴리펩티드의 정제 이후에 융합 모이어티로부터 재조합 폴리펩티드의 분리를 가능하게 한다. 이러한 효소들 및 이의 동족 인식 서열(cognate recognition sequence)들의 예시들은 Xa 인자(Factor Xa), 트롬빈 및 엔테로키나아제(enterokinase)를 포함한다. 예시적인 융합 발현 벡터는 pGEX[Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ; Smith et al., Gene, 67:31-40(1988)], pMAL(New England Biolabs, Beverly, MA) 및 pRITS(Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, N.J.)를 포함하고, 이들은 표적 재조합 폴리펩티드에 각각, 글루타티온 S-전달효소(glutathione S-transferase: GST), 말토오스 E 결합 단백질 또는 단백질 A를 융합시킨다. 유도성, 비-융합 대장균 발현 벡터의 예시들은 pTrc[Amann et al., Gene(1988) 69:301-315] 및 pET 11d[Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990) 60-89]를 포함한다. pTrc 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 하이브리드 trp-lac 융합 프로모터로부터의 숙주 RNA 중합효소 전사에 의존한다. pET 11d 벡터로부터의 표적 유전자 발현은 동시에 발현되는 바이러스 RNA 중합효소(T7 gn1)에 의해 매개되는 T7 gn10-lac 융합 프로모터로부터의 전사에 의존한다. 이러한 바이러스 중합효소는 lacUV 5 프로모터의 전사 제어 하에서 T7 gn1 유전자를 보유하는 내재성 λ 프로파지(resident λ prophage)로부터 숙주 균주들 BL21(DE3) 또는 HMS174(DE3)에 의해 공급된다. 원핵 세포 및 진핵 세포 모두에 적합한 발현 시스템들은 본 기술분야에 잘 알려져 있고; 예를 들어, Sambrook et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition, Cold Spring Harbor Laboratory(1989)를 참조한다. 유도성, 비-융합 대장균 발현 벡터의 예시들은 pTrc[Amann et al., Gene 69:301-315(1988)] 및 pET 11d[Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA, pp.60-89(1990)]를 포함한다. 여하한 실시예들에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 서열은 박테리오파지 T5로부터 유래된 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 일 실시예에서, 숙주 세포는 효모 세포이다. 일 실시예에서, 발현 벡터는 효모 발현 벡터이다. 벡터들은 외래(foreign) 핵산(예를 들어, DNA)을 숙주 세포 내로 도입하기 위하여 본 기술분야에서 인정되는 다양한 기술들을 통해 원핵 세포 또는 진핵 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 숙주 세포를 형질전환 또는 형질감염(transfecting)시키는데 적합한 방법들은 Sambrook et al.(supra)에서 찾아볼 수 있다. 박테리아 세포들의 안정한 형질전환을 위하여, 사용되는 발현 벡터 및 형질전환 기술에 따라, 소량(small fraction)의 세포들만 발현 벡터를 흡수하고 복제하는 것으로 알려져 있다. 이러한 형질전환체들을 확인하고 선택하기 위하여, 선택가능한 마커(예를 들어, 항생제에 대한 내성)를 인코딩하는 유전자가 목적 유전자와 함께 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 선택가능한 마커들은 암피실린, 카나마이신, 클로람페니콜 또는 테트라사이클린과 같은 약물들에 대한 내성을 제공하는 것들이 포함하나, 이로 제한되지 않는다. 선택가능한 마커를 인코딩하는 핵산들은 본 명세서에서 설명되는 폴리펩티드를 인코딩하는 벡터와 동일한 벡터로 숙주 세포 내로 도입되거나, 별개의 벡터로 도입될 수 있다. 도입된 핵산에 의해 안정적으로 형질감염된 세포들은 적절하게 선택된 약물의 존재 하에서 성장에 의해 확인될 수 있다.
숙주 세포
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 조작된 또는 재조합 숙주 세포는 추가적으로 본 명세서에 설명되는 바와 같은 지방산 유도체 조성물을 생산하는데 사용되는 세포이다. 숙주 세포 내에서 하나 이상의 폴리뉴클레오티드들 또는 폴리펩티드들의 발현이 동일한 조건들 하에서 대응하는 야생형 숙주 세포(예를 들어, 대조구 세포) 내에서의 이들의 발현과 비교하여 변화 또는 변형되면, 숙주 세포는 조작된 숙주 세포 또는 재조합 숙주 세포로 칭한다. 본 명세서에 설명되는 본 발명의 여하한 측면들에서, 숙주 세포는 진핵 식물(eukaryotic plant), 조류, 남세균(cyanobacterium), 녹색-황 세균, 녹색 비-황(green non-sulfur) 세균, 자색 황세균, 자색 비-황 세균, 극한성 생물(extremophile), 효모, 균류, 이들의 조작된 유기체 또는 합성 유기체로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 일부 실시예들에서, 숙주 세포는 광 의존성이거나 탄소를 고정시킨다. 일부 실시예들에서, 숙주 세포는 독립영양적 활성을 갖는다. 본 명세서에 설명되는 바와 같이, 다양한 숙주 세포들이 지방산 유도체들을 생산하는데 사용될 수 있다.
돌연변이체 또는 변이체
일부 실시예들에서, 폴리펩티드는 본 명세서에서 설명되는 여하한 폴리펩티드들의 돌연변이체 또는 변이체이다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같은 돌연변이체 및 변이체라는 용어는 적어도 하나의 아미노산에 의해 야생형 폴리펩티드와 상이한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 칭한다. 예를 들어, 돌연변이체는 하기의 보존성 아미노산 치환체들 중에서 하나 이상을 포함한다: 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신과 같은 지방성(aliphatic) 아미노산의 또 다른 지방성(aliphatic) 아미노산으로의 대체물(replacement); 세린의 트레오닌으로의 대체물; 트레오닌의 세린으로의 대체물; 아스파르트산 및 글루탐산과 같은 산성 잔기의 또 다른 산성 잔기로의 대체물; 아스파라긴 및 글루타민과 같은 아미드기를 보유하는 잔기의 아미드기를 보유하는 또 다른 잔기로의 대체물; 리신 및 아르기닌과 같은 염기성 잔기의 또 다른 염기성 잔기로의 교환물(exchange); 그리고 페닐알라닌 및 티로신과 같은 방향족 잔기의 또 다른 방향족 잔기로의 대체물. 일부 실시예들에서, 돌연변이형 폴리펩티드는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 또는 그 이상의 아미노산 치환들, 부가들, 삽입들 또는 결실들을 갖는다. 폴리펩티드의 바함직한 분절들 또는 돌연변이체들은 대응하는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 기능(예를 들어, 효소 활성) 중 일부 또는 전부를 유지한다. 일부 실시예들에서, 분절 또는 돌연변이체는 대응하는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 기능 중 적어도 75 %, 적어도 80 %, 적어도 90 %, 적어도 95 % 또는 적어도 98 % 또는 그 이상을 유지한다. 다른 실시예들에서, 분절 또는 돌연변이체는 대응하는 야생형 폴리펩티드의 생물학적 기능의 약 100 %를 유지한다. 아미노산 잔기들이 생물학적 활성에 영향을 미치지 않고 치환, 삽입 또는 제거(deleted)될 수 있는지를 결정하기 위한 지침(Guidance)은, 본 기술분야에 잘 알려져 있는 컴퓨터 프로그램, 예를 들어 LASERGENETM 소프트웨어(DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 알아낼 수 있다. 또 다른 실시예들에서, 분절 또는 돌연변이체는 대응하는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 증가된 생물학적 기능을 나타낸다. 예를 들어, 분절 또는 돌연변이체는 대응하는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 효소 활성에 있어서 적어도 10 %, 적어도 25 %, 적어도 50 %, 적어도 75 % 또는 적어도 90 % 개선을 나타낼 수 있다. 다른 실시예들에서, 분절 또는 돌연변이체는 대응하는 야생형 폴리펩티드와 비교하여 효소 활성에 있어서 적어도 100 %(예를 들어, 적어도 200 % 또는 적어도 500 %) 개선을 나타낸다. 본 명세서에서 설명되는 폴리펩티드는 폴리펩티드 기능에 실질적인 영향을 주지 않는 추가적인 보존성 또는 비-필수 아미노산 치환들을 가질 수 있는 것으로 이해된다. 특정 치환이 허용되는지(즉, 카르복실산 환원효소 활성과 같은 원하는 생물학적 기능에 부정적인 영향을 주지 않는지)의 여부는 Bowie et al.[Science, 247:1306-1310(1990)]에 기재된 바와 같이 결정될 수 있다. 보존성 아미노산 치환은 아미노산 잔기가 유사한 측쇄(side chain)를 가지는 아미노산 잔기로 대체되는 것이다. 유사한 측쇄들을 가지는 아미노산 잔기의 집단(Family)들은 본 기술분야에서 정의되었다. 이러한 집단들은 염기성 측쇄들을 갖는 아미노산류(예를 들어, 리신, 아르기닌, 히스티딘), 산성 측쇄들을 갖는 아미노산류(예를 들어, 아스파르트산, 글루탐산), 하전되지 않은(uncharged) 극성 측쇄들을 갖는 아미노산류(예를 들어, 글리신, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 티로신, 시스테인), 비극성 측쇄들을 갖는 아미노산류(예를 들어, 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판), 베타-분지형 측쇄들을 갖는 아미노산류(예를 들어, 트레오닌, 발린, 이소류신) 및 방향족 측쇄들을 갖는 아미노산류(예를 들어, 티로신, 페닐알라닌, 트립토판, 히스티딘)를 포함한다.
변이체들은 자연적으로 발생되거나 실험관 내에서(in vitro) 생성될 수 있다. 특히, 이러한 변이체들은 특정부위 돌연변이 유발(site directed mutagenesis), 무작위 화학적 돌연변이 유발(random chemical mutagenesis), 핵산말단가수분해효소(Exonuclease) Ⅲ 결실 절차들 또는 표준 클로닝 기술들과 같은 유전 공학 기술들을 사용하여 생성될 수 있다. 대안적으로, 이러한 변이체들, 분절들, 유사체들 또는 유도체들은 화학적 합성 또는 변형 절차들을 사용하여 생성될 수 있다. 변이체들의 제조 방법들은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 상기 방법들은 산업적 또는 실험적 적용들에 있어서 이들의 가치를 증대시키는 특성들을 가지는 폴리펩티드들을 인코딩하는 핵산들을 산출하기 위하여, 자연 분리물들(natural isolates)로부터 얻어진 핵산 서열들을 변형시키는 절차들이 포함된다. 이러한 절차들에서, 자연 분리물들로부터 얻어진 서열에 관하여 하나 이상의 뉴클레오티드 차이를 갖는 다수의 변이체 서열들이 산출되고 특성화된다. 전형적으로, 이러한 뉴클레오티드 차이는 자연 분리물들로부터의 핵산들에 의해 인코딩되는 폴리펩티드들에 관하여 아미노산 변화들을 야기한다. 예를 들어, 변이체들은 무작위 및 특정부위 돌연변이 유발을 사용함으로써 제조될 수 있다. 무작위 및 특정부위 돌연변이 유발은, 예를 들어 Arnold, Curr. Opin. Biotech., 4:450-455(1993)에 기재되어 있다. 무작위 돌연변이 유발은 오류 빈발(error prone) PCR을 사용하여 달성될 수 있다[Leung et al., Technique 1:11-15(1989); 및 Caldwell et al., PCR Methods Applic., 2:28-33(1992) 참조]. 오류 빈발 PCR에서, PCR은 DNA 중합효소의 복사 정확도(copying fidelity)가 낮은 조건 하에 수행되고, 높은 비율의 점 돌연변이(point mutation)가 PCR 생성물의 전장(entire length)을 따라서 얻어진다. 간단히 말해, 이러한 절차들에서, 돌연변이 유발되는 핵산들(예를 들어, 카르복실릭 환원효소 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)은 PCR 생성물의 전장을 따라서 높은 비율의 점 돌연변이를 달성하기 위하여 PCR 프라이머들, 반응 완충액, MgCl2, MnCl2, Taq 중합효소 및 적절한 농도의 dNTP들과 혼합된다. 예를 들어, 반응이 20 fmole의 돌연변이 유발되는 핵산, 30 pmole의 각각의 PCR 프라이머, 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl(pH 8.3) 및 0.01 % 젤라틴을 포함하는 반응 완충액, 7 mM MgCl2, 0.5 mM MnCl2, 5 단위(unit)의 Taq 중합효소, 0.2 mM dGTP, 0.2 mM dATP, 1 mM dCTP, 그리고 1 mM dTTP를 사용하여 수행될 수 있다. PCR은 94 ℃에서 1분, 45 ℃에서 1분, 그리고 72 ℃에서 1분의 30회 주기 동안 수행될 수 있다. 그러나, 이러한 파라미터들은 적절하게 변화될 수 있는 것으로 인지될 것이다. 이후에, 돌연변이 유발된 핵산들은 적절한 벡터 내로 클로닝되고, 상기 돌연변이 유발된 핵산들에 의해 인코딩되는 폴리펩티드들의 활성이 평가된다. 특정부위 돌연변이 유발은 여하한 클로닝되는 목적 DNA에서 부위-특이적인 돌연변이들을 발생시키는 올리고뉴클레오티드 지향된 돌연변이 유발을 사용하여 달성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 돌연변이 유발은, 예를 들어 Reidhaar-Olson et al., Science, 241:53-57(1988)에 기재된다. 간단히 말해서, 이러한 절차들에서 클로닝된 DNA 내로 도입되는 하나 이상의 돌연변이들을 보유하는 복수의 이중 가닥 올리고뉴클레오티드들이 합성되고, 돌연변이 유발되는 클로닝된 DNA(예를 들어, CAR 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열) 내로 삽입된다. 돌연변이 유발된 DNA를 함유하는 클론들은 회수되고, 이들이 인코딩하는 폴리펩티드들의 활성이 평가된다. 변이체들을 발생시키기 위한 또 다른 방법은 조립(assembly) PCR이다. 조립 PCR은 소형 DNA 분절들의 혼합물로부터 PCR 생성물의 조립을 포함한다. 다수의 상이한 PCR 반응들이 동일한 바이알 내에서 병행하여 발생하는데, 한 반응의 생성물들이 또 다른 반응의 생성물들을 기폭시킨다. 예를 들어, 조립 PCR은 미국 특허 5,965,408에 기재된다. 변이체들을 발생시키는 또 다른 방법은 유성(sexual) PCR 돌연변이 유발이다. 유성 PCR 돌연변이 유발에서, 강제된 상동성 재조합(forced homologous recombination)은 서열 상동성을 기반으로 하는 DNA 분자의 무작위 분절화(random fragmentation)의 결과로써, 실험관 내에서 상이하지만 고도로 관련된 DNA 서열들의 DNA 분자들 사이에서 발생한다. 그 이후에, PCR 반응에서 프라이머 신장에 의한 교차(crossover)의 고정이 수행된다. 유성 PCR 돌연변이 유발은, 예를 들어 Stemmer, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 91:10747-10751(1994)에 기재된다. 또한, 변이체들은 생체 내에서 돌연변이 유발에 의해 생성될 수 있다. 일부 실시예들에서, 핵산 서열 내의 무작위 돌연변이는 하나 이상의 DNA 복원 경로(repair pathway)들에서 돌연변이들을 수송(carry)하는 박테리아 균주, 이를 테면 대장균 균주에서 서열을 증식시킴으로써 발생된다. 이러한 "돌연변이 유발 유전자(mutator)" 균주들은 야생-형 균주에서보다 높은 무작위 돌연변이율을 갖는다. 궁극적으로, 이러한 균주들 중의 한 가지에서 DNA 서열(예를 들어, CAR 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열)의 증식은 DNA 내에서 무작위 돌연변이들을 발생시킬 것이다. 생체 내에서의 돌연변이 유발에 사용하기 적합한 돌연변이 유발 유전자 균주들은, 예를 들어 국제 특허 출원 공개 No. WO 1991/16427에 기재된다. 또한, 변이체들은 카세트 돌연변이 유발(cassette mutagenesis)을 사용하여 발생될 수 있다. 카세트 돌연변이 유발에서, 이중 가닥 DNA 분자의 작은 영역이 본래의 서열과 상이한 합성 올리고뉴클레오티드 "카세트"로 대체된다. 종종, 상기 올리고뉴클레오티드는 완전하게 및/또는 부분적으로 무작위화된 본래의 서열을 포함한다. 또한, 순환 앙상블 돌연변이 유발(Recursive ensemble mutagenesis)은 변이체들을 발생시키는데 사용될 수 있다. 순환 앙상블 돌연변이 유발은 아미노산 서열과 상이하고 표현형적으로 관련된 돌연변이체들의 다양한 개체군들을 생산하기 위하여 개발된, 단백질 조작(즉, 단백질 돌연변이 유발)을 위한 알고리즘이다. 이러한 방법은 조합 카세트 돌연변이 유발의 연속 라운드들(successive rounds)을 제어하기 위하여 피드백 기전을 사용한다. 순환 앙상블 돌연변이 유발은, 예를 들어 Arkin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 89:7811-7815(1992)에 기재된다. 일부 실시예들에서, 변이체들은 지수 앙상블(exponential ensemble) 돌연변이 유발을 사용하여 생성된다. 지수 앙상블 돌연변이 유발은 높은 비율의 독특한 기능성 돌연변이체들을 포함하는 조합 라이브러리들(combinatorial libraries)을 발생시키기 위한 과정이며, 여기서 잔기들의 작은 기들은 기능성 단백질들을 야기하는 각각의 변화된 위치에서 아미노산을 확인하기 위하여 동시에 무작위화 된다. 지수 앙상블 돌연변이 유발은, 예를 들어 Delegrave et al., Biotech. Res, 11:1548-1552(1993)에 기재된다. 일부 실시예들에서, 변이체들은 재편성 절차(shuffling procedure)들을 사용하여 생성되며, 여기서 별개의 폴리펩티드들을 인코딩하는 복수의 핵산들의 일부분들이, 예를 들어 미국 특허 5,965,408 및 5,939,250에 개시된 바와 같이 키메라 폴리펩티드들을 인코딩하는 키메라 핵산 서열들과 함께 융합된다. 삽입 돌연변이 유발(Insertional mutagenesis)은 하나 이상의 염기들의 삽입에 의한 DNA의 돌연변이 유발이다. 삽입 돌연변이는 자연적으로 발생할 수 있거나, 바이러스 또는 트랜스포존에 의해 매개될 수 있거나, 또는 실험실에서 연구 목적을 위하여, 예를 들어 트랜스포존 돌연변이 유발에 의해 인공적으로 생성시킬 수 있다. 외인성 DNA가 숙주의 DNA 내로 통합되는 경우, 여하한의 계속되는 돌연변이의 중대도(severity)는 전적으로 DNA가 삽입되는 숙주의 게놈 내의 위치에 달려있다. 예를 들어, 트랜스포존이 필수 유전자의 중간, 프로모터 영역, 또는 리프레서(repressor) 또는 증폭자 영역(enhancer region) 내에 삽입된다면, 상당한 영향이 분명 있을 수 있다. 트랜스포존 돌연변이 유발 및 고속-대량 스크리닝은 지방산 유도체 또는 유도체들의 역가 또는 수율을 증가시키는 유익한 돌연변이들을 찾아내기 위하여 실시된다.
배양 재조합 숙주 세포 및 세포 배양/발효
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "발효"라는 용어는 광범위하게 숙주 세포에 의한 유기 물질의 표적 물질(target substance)로의 전환, 예를 들어 탄소 공급원을 포함하는 배지 내에서 재조합 숙주 세포의 배양물(culture)을 증식시킴으로써 재조합 숙주 세포에 의한 탄소 공급원의 지방산 또는 이의 유도체들로의 전환을 칭한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "생산을 위하여 허용되는 조건들"이라는 용어는 숙주 세포가 원하는 생성물, 이를 테면 지방산 또는 지방산 유도체를 생산하도록 하는 여하한 조건들을 의미한다. 유사하게, "벡터의 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되는 조건들"이라는 용어는 숙주 세포가 폴리펩티드를 합성하도록 하는 여하한 조건들을 의미한다. 예를 들어, 적합한 조건들은 발효 조건들을 포함한다. 발효 조건들은 온도 범위들, 통기 수준들 및 배지 조성과 같은 많은 파라미터들을 포함할 수 있다. 이러한 조건들의 각각은 개별적으로 그리고 조합적으로, 숙주 세포가 성장할 수 있도록 한다. 발효는 호기성, 혐기성 또는 [미-호기성(micro-aerobic)과 같은] 이의 변화(variation)일 수 있다. 예시적인 배양 배지는 액체 배지(broths) 또는 겔(gels)을 포함한다. 일반적으로, 배지는 숙주 세포에 의해 직접적으로 대사작용될 수 있는 탄소 공급원을 포함한다. 또한, 효소들은 탄소 공급원의 기동(mobilization)[예를 들어, 전분 또는 셀룰로오스의 발효가능 당들로의 해중합반응(depolymerization)] 및 차후 신진대사를 촉진시키기 위하여 배지에서 사용될 수 있다. 소규모 생산의 경우에, 조작된 숙주 세포들은 예를 들어, 약 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L, 5 L 또는 10 L의 배치(batchs)에서 성장될 수 있고; 발효될 수 있으며; 원하는 폴리뉴클레오티드 서열, 이를 테면 CAR 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시키도록 유도될 수 있다. 대규모 생산의 경우에, 조작된 숙주 세포들은 약 10 L, 100 L, 1000 L, 10,000 L, 100,000 L 및 1,000,000 L 또는 그 이상의 배치(batchs)에서 성장될 수 있고; 발효될 수 있으며; 원하는 폴리뉴클레오티드 서열을 발현시키도록 유도될 수 있다. 대안적으로, 대규모의 유가 배양식 발효가 실시될 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 지방산 유도체 조성물들은 재조합 숙주 세포 배양의 세포 외 환경에서 발견되고, 배양 배지로부터 손쉽게 분리될 수 있다. 지방산 유도체는 재조합 숙주 세포에 의해 분비될 수 있고, 세포 외 환경으로 수송될 수 있거나 또는 수동적으로 재조합 숙주 세포 배양의 세포 외 환경으로 전달될 수 있다. 지방산 유도체는 본 기술분야에 알려진 정례적인(routine) 방법들을 사용하여 재조합 숙주 세포 배양물(culture)로부터 분리된다.
재조합 숙주 세포로부터 유래되는 생성물들
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "현대 탄소(modern carbon)의 분율" 또는 fM은 각각, 옥살산 기준 HOxI 및 HOxⅡ로 알려져 있는, 미국 국립표준기술연구소(National Institute of Standards and Technology: NIST) 표준 참고 물질들(Standard Reference Materials: SRMs) 4990B 및 4990C에 의해 정의된 바와 동일한 의미를 갖는다. 이러한 기초적인 정의는 (AD 1950을 기준으로) 0.95 배의 14C/12C 동위원소 비율 HOxI에 관한 것이다. 이는 붕괴-보정된 산업혁명-전 목재에 거의 동등하다. 현재 생존 생물권(living biosphere)[식물 물질]의 경우에, fM은 대략 1.1이다. 본 명세서의 지방산 생합성 경로를 사용하여 생물학적으로 생산되는 유기 화합물들, 특히 생산되는 지방산 유도체들을 포함하는 바이오생산물들(Bioproducts)[예를 들어, 본원 발명에 따라서 생산되는 지방산 유도체들]은, 재생가능한 공급원들로부터 생산되지 않으며, 이로써, 새로운 물질의 조성물이다. 이러한 새로운 바이오생산물들은 이중 탄소-동위원소 지문기술(dual carbon-isotopic fingerprinting) 또는 14C 연대측정(dating)을 기초로 석유화학의 탄소로부터 유래되는 유기 화합물들과 구별될 수 있다. 부가적으로, 생물자원 탄소(biosourced carbon)의 특이적인 공급원(예를 들어, 글루코오스 대 글리세롤)은 이중 탄소-동위원소 지문기술에 의해 결정될 수 있다(본 명세서에 인용참조되는 미국 특허 No. 7,169,588 참조). 유기 화합물들을 기반으로 하는 석유로부터 바이오생산물을 구별하는 능력은 거래 중에(in commerce) 이러한 물질들을 추적하는데 유익하다. 예를 들어, 생물학적 기반의 탄소 동위원소 프로필들 및 석유 기반의 탄소 동위원소 프로필들 모두를 포함하는 유기 화합물들 또는 화학제품들은 석유 기반 물질들로만 만들어진 유기 화합물들 및 화학제품들과 구별될 수 있다. 따라서, 본 명세서의 바이오생산물들은 이들의 독특한 탄소 동위원소 프로필을 기반으로 하여 거래 중에 후속되거나 추적될 수 있다. 바이오생산물들은 각각의 샘플에서 안정한 탄소 동위원소 비율(13C/12C)을 비교함으로써 유기 화합물들을 기반으로 하는 석유와 구별될 수 있다. 주어진 바이오생산물의 13C/12C 비율은 이산화탄소가 고정된 시간에서 대기 중의 이산화탄소에 대한 13C/12C 비율의 결과이다. 또한, 이는 정확한 대사작용 경로를 반영한다. 국부적인 변이들도 발생한다. 석유, C3 식물들[활엽(the broadleaf)], C4 식물들[목초(the grasses)] 및 해양의 탄산염(marine carbonate)들 모두는 13C/12C 및 대응하는 δ13C 수치들에서 상당한 차이들을 나타낸다. 더욱이, C3 및 C4 식물들의 지질 물질은 대사작용 경로의 결과로서 동일한 식물들의 탄수화물 성분들로부터 유래된 재료들에 비하여 상이하게 분석한다. 측정의 정확도 내에서, 13C은 동위원소 분별 효과들로 인하여 큰 변화들을 나타내며, 바이오생성물들에 대한 이의 가장 중요한 점은 광합성 메카니즘이다. 식물에서 탄소 동위원소 비율에 있어서 차이의 주요한 원인은 식물에서 광합성 탄소 대사작용의 경로, 특히 일차 카르복실화(primary carboxylation)[즉, 대기 중 CO2의 초기 고정] 동안 발생하는 반응에서의 차이들과 밀접하게 관련된다. 식생(vegetation)의 두 가지 종류들은 "C3" [또는 캘빈-벤슨(Calvin-Benson)] 생합성 회로를 병합하는 것들 및 "C4" [또는 해치-슬랙(Hatch-Slack)] 생합성 회로를 병합하는 것들이다. C3 식물들에서, 일차 CO2 고정 또는 카르복실화 반응은 효소인 리불로오스-1,5-디포스페이트 카르복실라아제를 포함하고, 첫번째의 안정한 생성물은 3-탄소 화합물이다. 경목(hardwood)들 및 침엽수(conifer)들과 같은 C3 식물들은 온대 기후 지역들에서 우세하다. C4 식물들에서, 또 다른 효소인 포스포엔올-피루베이트 카르복실라아제를 포함하는 부가적인 카르복실화 반응은 일차 카르복실화 반응이다. 첫번째의 안정한 탄소 화합물은 이후에 탈카르복실화되는 4-탄소산(carbon acid)이다. 따라서, 방출된 CO2는 C3 회로에 의해 재고정된다. C4 식물의 예시들은 열대형 목초(tropical grass)들, 옥수수 및 사탕수수이다. C4 식물들 및 C3 식물들 모두는 13C/12C 동위원소 비율의 범위를 나타내나, 전형적인 수치들은 C4 식물들에 대하여 mil 당 약 -7 내지 약 -13이며, C3 식물들에 대하여 mil 당 약 -19 내지 약 -27이다[예를 들어, Stuiver et al., Radiocarbon 19:355(1977) 참조]. 석탄 및 석유는 일반적으로 이의 후자 범위에서 떨어져 있다. 13C 측정 척도(measurement scale)는 본래 Pee Dee Belemnite(PDB) 석회암에 의해 제로 세트(zero set)로 정의되며, 여기서 수치들은 이러한 재료로부터 천 분의 일 편차로 주어진다. "δ13C" 수치는 천 분의 일[퍼밀(per mil)], 약어로는 ‰로 표현되고, 하기와 같이 계산된다:
Figure 112014104242619-pct00008
PDB 표준 물질(RM)이 고갈되고 있으므로, 일련의 대안적인 RM들이 IAEA, USGS, NIST 및 다른 선택된 국제 동위원소 실험실들과 협력하여 개발되고 있다. PDB로부터 퍼밀(per mil) 편차들에 대한 표기는 δ13C이다. 측정은 질량 44, 45 및 46의 분자 이온들에 대한 매우 정확한 신뢰성 있는 비율의 질량 분석기[high precision stable ratio mass spectrometry](IRMS)에 의해 CO2 상에서 이뤄진다. 본 명세서에서 설명되는 조성물들은 본 명세서에서 설명되는 여하한 방법들에 의해 생산되는 바이오생성물들, 예를 들어 지방족 알데히드 및 알코올 생성물들을 포함한다. 특히, 바이오생성물은 약 -28 이상, 약 -27 이상, -20 이상, -18 이상, -15 이상, -13 이상, -10 이상, 또는 -8 이상의 δ13C를 가질 수 있다. 예를 들어, 바이오생성물은 약 -30 내지 약 -15, 약 -27 내지 약 -19, 약 -25 내지 약 -21, 약 -15 내지 약 -5, 약 -13 내지 약 -7, 또는 약 -13 내지 약 -10의 δ13C를 가질 수 있다. 다른 예시들에서, 바이오생성물은 약 -10, -11, -12 또는 -12.3의 δ13C를 가질 수 있다. 또한, 본 명세서의 상세한 설명에 따라서 생성되는 바이오생성물들은 각각의 화합물에서 14C의 양을 비교함으로써 유기 화합물들을 기반으로 하는 석유와 구별될 수 있다. 14C는 핵의 반감기가 5730년이므로, "더 오래된(older)" 탄소를 함유하는 석유 기반 연료는 "최근의(newer)" 탄소를 함유하는 바이오생성물과 구별될 수 있다[예를 들어, Currie, "Source Apportionment of Atmospheric Particles", Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., 1 of Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series(Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992) 참조]. 방사성 탄소 연대측정법(radiocarbon dating)에서 기본적인 가정은 대기 중에 14C 농도의 항상성(constancy)이 생물(living organism)들 내에 14C의 항상성에 이르게 한다는 것이다. 그러나, 1950년 이후부터의 대기권의 핵실험 및 1850년 이후부터의 화석 연료의 연소로 인하여, 14C는 제 2의, 지구화학적인 시간 특성을 얻었다. 대기 중 CO2, 및 그에 따른 생물권(living biosphere)에 있어서 이의 농도는 1960년대 중반의 핵실험의 정점(peak)에 대략 두 배였다. 이후에, 대략 7 내지 10년간의 "반-감기" 이완(relaxation "half-life")을 가지는, 약 1.2×10-12의 정상-상태의 우주기원(대기) 기준 동위원소 비율(14C/12C)로 서서히 되돌아 온다[이런 후자의 반감기는 문자 그대로 취해지는 것이 아니라; 오히려 핵무기 시대(nuclear age)의 시작 이후로 대기 및 생물권 중에 14C의 변화를 추적하기 위하여 자세한 대기권 핵 투입/붕괴의 기능(atmospheric nuclear input/decay function)을 사용해야 한다]. 이는 최근의 생물권 탄소에 대한 매년의 연대측정(annual dating)의 전망을 제공하는 후자의 생물권 14C 시간 특성이다. 14C는 "현대 탄소의 분율"(fM)의 단위로 주어지는 결과들을 갖는, 가속기 질량 분광 분석(accelerator mass spectrometry: AMS)에 의해 측정될 수 있다. fM은 미국표준기술연구소(NIST)의 표준 기준 물질들(SRMs) 4990B 및 4990C에 의해 정의된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "현대 탄소의 분율" 또는 "fM"은 각각 옥살산 기준 HOxI 및 HOxⅡ로 알려진, 미국표준기술연구소(NIST)의 표준 기준 물질들(SRMs) 4990B 및 4990C에 의해 정의되는 바와 같은 동일한 의미를 갖는다. 기초적인 정의는 (AD 1950을 기준으로) 0.95 배의 14C/12C 동위원소 비율 HOxI에 관한 것이다. 이는 감소-수정된(decay-corrected) 산업 혁명 이전의 목재와 거의 동등하다. 현재의 생물권(식물 재료)에 대한, fM은 대략 1.1이다. 본 명세서에서 설명되는 조성물들은 적어도 약 1 이상의 fM14C를 가질 수 있는 바이오생성물들을 포함한다. 예를 들어, 바이오생성물은 적어도 약 1.01의 fM14C, 약 1 내지 약 1.5의 fM14C, 약 1.04 내지 약 1.18의 fM14C, 또는 약 1.111 내지 약 1.124의 fM14C을 가질 수 있다.
14C의 또 다른 측정은 현대 탄소의 퍼센트(pMC)로 알려져 있다. 14C 연대를 사용하는 고고학자 또는 지질학자에 경우, AD 1950년은 "측정의 기점 연도(zero years old)"와 같다. 또한, 이는 100 pMC로 나타낸다. 대기 중의 "핵무기 탄소(Bomb carbon)"는 열-핵무기들의 정점인 1963년에 정상 수준에 거의 두 배에 달하였다. 대기권 내에서 이의 분포는, 핵무기 탄소의 등장 이후에, AD 1950년 이후로 살아 있는 식물들 및 동물들에 대하여 100 pMC보다 더 큰 수치들을 나타내는 것으로 추정되고 있다. 107.5 pMC에 가까운 오늘날의 수치는 시간이 지나면서 점차 감소하고 있다. 이는 옥수수와 같은 신선한 바이오매스 재료는 107.5 pMC에 가까운 14C 특징(signature)을 부여하는 것을 의미한다. 석유 기반 화합물들은 0의 pMC 수치를 가질 것이다. 현대 탄소와 화석 탄소의 결합은 현대 pMC 함유량(content)의 희석을 야기할 것이다. 107.5 pMC가 현대 바이오매스 재료들의 14C 함유량을 나타내며 0 pMC가 석유 기반 생성물들의 14C 함유량을 나타낸다고 가정함으로써, 재료에 대한 측정된 pMC 수치는 두 개의 성분 타입에 대한 비율을 반영할 것이다. 예를 들어, 오늘날의 콩으로부터 100 % 유래된 재료는 107.5 pMC에 가까운 방사성 탄소 특징을 제공할 것이다. 만약 재료가 석유 기반 생성물로 50 % 희석되었다면, 이는 대략 54 pMC의 방사성 탄소 특징을 제공할 것이다. 생물학적 기반의 탄소 함유량은 107.5 pMC와 같으면 "100 %"이고, 0 pMC와 같으면 "0 %"라고 지정함으로써 유래된다. 예를 들어, 99 pMC로 측정된 샘플은 93 %의 동등한 생물학적 기반의 탄소 함유량을 제공할 것이다. 이 수치는 생물학적 기반의 탄소 결과를 의미하며, 현대의 생물학적 재료 또는 석유 기반 재료로부터 유래되는 분석된 재료 내에서 모든 성분들을 추측하는 것으로 해석된다. 본 명세서에서 설명되는 바이오생성물은 적어도 약 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98, 99 또는 100의 pMC를 가질 수 있다. 다른 예시들에서, 본 명세서에서 설명되는 지방산 유도체는 약 50 내지 약 100; 약 60 내지 약 100; 약 70 내지 약 100; 약 80 내지 약 100; 약 85 내지 약 100; 약 87 내지 약 98; 또는 약 90 내지 약 95의 pMC를 가질 수 있다. 또 다른 예시들에서, 본 명세서에서 설명되는 지방산 유도체는 약 90, 91, 92, 93, 94 또는 94.2의 pMC를 가질 수 있다.
재조합 숙주 세포에 의해 생산되는 지방산 유도체 조성물들의 스크리닝
발현을 가능하게 할 만큼 조건들이 충분한 지를 결정하기 위하여, 숙주 세포는, 예를 들어 약 4, 8, 12, 24, 36 또는 48시간 동안 배양될 수 있다. 배양 동안 및/또는 배양 이후, 샘플이 얻어지고 조건들이 발현을 가능하게 하는지를 결정하기 위하여 분석될 수 있다. 예를 들어, 샘플 또는 숙주 세포들이 성장된 배지 내의 숙주 세포들은 원하는 생성물의 존재에 대하여 테스트될 수 있다. 생성물의 존재에 대하여 테스트하는 경우, 이를 테면 TLC, HPLC, GC/FID, GC/MS, LC/MS, MS가 사용될 수 있지만 이들로 제한되지 않는 분석법(assays)이 사용될 수 있다. 재조합 숙주 세포 배양물(cultures)은 "총 지방 종류"에 대하여 GC/FID 분석법을 사용하여, 96 홈 플레이트 수준(well plate level), 1 리터 및 5 리터 탱크 수준(tank level) 및 1000 L 파일럿 플랜트(pilot plant)에서 스크리닝된다.
지방산 유도체 조성물의 이용( Utility)
지방산은 긴 지방성 꼬리(aliphatic tail)[사슬]을 갖는 카르복실산이며, 이는 포화 또는 불포화된다. 대부분 자연적으로 발생하는 지방산은 4 내지 28 개의 짝수 개의 탄소 원자들의 사슬을 갖는다. 지방산은 대개 트리글리세리드로부터 유래된다. 이들이 다른 분자에 부착되지 않는 경우, 이들은 "유리" 지방산으로 알려져 있다. 지방산은 대개 글리세롤의 제거와 함께, 트리글리세리드의 가수분해에 의해 산업적으로 생산된다. 팜유(palm oil), 콩기름(soybean oil), 유채유(rapeseed oil), 야자유 및 해바라기유는 현재 지방산의 가장 흔한 공급원이다. 이러한 공급원들로부터 유래되는 대부분의 지방산은 식제품(human food product)에 사용된다. 야자유 및 팜 핵유는 주로 12 및 14 개의 탄소 지방산으로 이루어진다. 특히, 이들은 화장품뿐만 아니라 세제 및 세정제용 계면활성제에 추가적으로 처리하는데 적합하다. 탤로(tallow)와 같은 동물성 지방뿐만 아니라, 팜유, 콩기름, 유채유 및 해바라기유는 주로 윤활제 및 중합체 적용물(polymer applications)에 대한 원료로서 사용되는 긴 사슬형 지방산(예를 들어, 포화 및 불포화 C18)을 함유한다. 생태학적 및 독성학적 연구들은 재생가능한 자원을 기반으로 하는 지방산 유래 생성물들이 석유 기반 물질보다 더 유리한 성질들을 가짐을 시사한다. 지방족 알데히드는 많은 특수 화합물을 생산하는데 사용된다. 예를 들어, 알데히드는 중합체, 수지(예를 들어, 베이클라이트), 염료, 착향료, 가소제, 향수, 약제 및 다른 화학물질들을 생산하는데 사용되고, 이들 중 일부는 용제, 보존제 또는 소독제로 사용될 수 있다. 또한, 비타민 및 호르몬과 같은 어떤 천연 및 합성 화합물들은 알데히드들이고, 많은 당류는 알데히드기들을 함유한다. 지방족 알데히드들은 화학적 또는 효소적 환원에 의해 지방족 알코올들로 전환될 수 있다. 지방족 알코올들은 많은 상업적 용도들을 갖는다. 지방족 알코올들 및 이들의 유도체들의 전 세계적인 연간 판매액은 10억 달러를 초과한다. 짧은 사슬형 지방족 알코올들은 유화제, 연화제 및 증점제로서 화장품 산업 및 식품 산업에 사용된다. 이들의 양친매성(amphiphilic) 성질로 인해, 지방족 알코올들은 비이온성 계면활성제처럼 거동하고, 상기 비이온성 계면활성제는 예를 들어 세제와 같은 개인 위생 용품 및 가정 용품에 유용하다. 또한, 지방족 알코올들은 왁스, 검(gums), 수지, 약제학적 연고 및 로션, 윤활유 첨가제, 직물 정전기 방지제 및 가공제, 가소제, 화장품, 공업 용제 및 지방용 용제에 사용된다. 또한, 본 발명은 본 명세서에서 설명되는 여하한 방법들에 의해 생산되는 지방족 알코올을 포함하는 계면활성제 조성물 또는 세제 조성물을 제공한다. 본 기술분야의 당업자는 계면활성제 또는 세제 조성물의 의도하는 목적에 따라서, 상이한 지방족 알코올들을 생산하고 사용할 수 있다. 예를 들어, 본 명세서에서 설명되는 지방족 알코올들이 계면활성제 또는 세제 생산을 위하여 공급원료로서 사용되는 경우에, 본 기술분야의 당업자는 지방족 알코올 공급원료의 특성들이 생산되는 계면활성제 또는 세제 조성물의 특성들에 영향을 미칠 것이라는 점을 인식할 것이다. 따라서, 계면활성제 또는 세제 조성물의 특성들은 공급원료로서 사용되는 특정 지방족 알코올들을 생산함으로써 선택될 수 있다. 본 명세서에서 설명되는 지방족 알코올 기반의 계면활성제 및/또는 세제 조성물은 본 기술분야에 잘 알려진 다른 계면활성제 및/또는 세제와 혼합될 수 있다. 일부 실시예들에서, 혼합물은 지방족 알코올의 중량 당 적어도 약 10 %, 적어도 약 15 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 60 % 또는 상기 값들 중 여하한 두 개의 값들로 제한되는 범위를 포함할 수 있다. 다른 예시들에서, 계면활성제 또는 세제 조성물은 길이가 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 또는 22 개의 탄소들인 탄소 사슬을 포함하는 지방족 알코올의 중량 당 적어도 약 5 %, 적어도 약 10 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 % 또는 상기 값들 중 여하한 두 개의 값들로 제한되는 범위를 포함하도록 만들어질 수 있다. 또한, 이러한 계면활성제 또는 세제 조성물은 마이크로에멀젼(microemulsion)과 같은 적어도 하나의 첨가제 또는 식물성유(plant oils) 또는 석유와 같은 비-미생물적인 원료(non-microbial sources)로부터의 계면활성제 또는 세제를 포함할 수 있고, 이는 지방족 알코올의 중량 당 적어도 약 5 %, 적어도 약 10 %, 적어도 약 15 %, 적어도 약 20 %, 적어도 약 30 %, 적어도 약 40 %, 적어도 약 50 %, 적어도 약 60 %, 적어도 약 70 %, 적어도 약 80 %, 적어도 약 85 %, 적어도 약 90 %, 적어도 약 95 % 또는 상기 값들 중 여하한 두 개의 값들로 제한되는 범위의 양으로 존재할 수 있다. 에스테르들은 많은 상업적 용도들을 갖는다. 예를 들어, 바이오디젤과 같은 대체 연료는 에스테르(예를 들어, 지방산 메틸 에스테르, 지방산 에틸 에스테르 등)으로 이루어진다. 일부 분자량이 작은 에스테르들은 향료 또는 방향제로서 유용하게 하는 기분 좋은 향기와 함께 휘발한다. 또한, 에스테르들은 래커(lacquers), 페인트 및 바니시(varnishes)를 위한 용제로서 사용된다. 더욱이, 왁스, 지방 및 오일과 같은 일부 자연적으로 발생하는 물질들도 에스테르들로 이루어져 있다. 에스테르들은 수지의 연화제, 가소제, 난연제(flame retardants), 및 가솔린 및 오일의 첨가제로서도 사용된다. 또한, 에스테르들은 중합체, 필름(films), 직물, 염료 및 약제의 제조에 사용될 수 있다. 탄화수소들은 많은 상업적 용도들을 갖는다. 예를 들어, 짧은 사슬형 알칸들은 연료로 사용된다. 긴 사슬형 알칸들(예를 들어, 5 내지 16 개의 탄소들)은 수송 연료(예를 들어, 가솔린, 디젤 또는 항공 연료)로 사용된다. 16 개 이상의 탄소 원자들을 갖는 알칸들은 연료유(fuel oil) 및 윤활유의 중요한 성분이다. 예를 들어, 실온에서 고체인 더 긴 알칸들도 파라핀 왁스로 사용될 수 있다. 또한, 긴 사슬형 알칸들은 상업적으로 가치가 큰 짧은 사슬형 탄화수소들을 생산하기 위하여 크래킹될 수 있다. 짧은 사슬형 알칸들과 같이, 짧은 사슬형 알켄들은 수송 연료에 사용된다. 긴 사슬형 알켄들은 플라스틱, 윤활제 및 합성 윤활제에 사용된다. 또한, 알켄들은 알코올, 에스테르, 가소제, 계면활성제, 삼차 아민, 석유회수증진제, 지방산, 티올, 알케닐숙신산 무수물, 에폭사이드, 염소화된 알칸, 염소화된 알켄, 왁스, 연료 첨가제 및 항력 흐름 감소제를 생산하기 위한 공급원료로서 사용된다. 케톤들은 상업적으로 용제로서 사용된다. 예를 들어, 아세톤은 용제로 흔히 사용되나, 중합체를 만드는데 원료이기도 하다. 케톤은 래커, 페인트, 폭발물, 향수 및 직물 생산공정에도 사용된다. 또한, 케톤은 알코올, 알켄, 알칸, 이민 및 에나민을 생산하는데 사용된다. 전형적으로, 윤활제는 올레핀, 특히 폴리올레핀 및 알파-올레핀으로 이루어진다. 윤활제는 원유로부터 정제되거나 또는 원유로부터 정제된 원료를 사용하여 제조될 수 있다. 원유로부터 이러한 특수 화합물을 얻는 것은 다량의 에너지뿐만 아니라 상당한 재정적인 투자를 필요로 한다. 또한, 흔히 작은 단량체를 생산하기 위하여 원유의 긴 사슬형 탄화수소를 크래킹하므로 비효율적인 과정이다. 이후에, 이러한 단량체는 더욱 복합적인 특수 화합물을 제조하기 위하여 원료로서 사용된다. 본 발명은 추가적으로 하기의 실시예들로 설명된다. 예시들은 설명의 목적으로만 제공된다. 이들은 어떤 식으로든 본 발명의 범위 또는 내용을 제한하는 것으로 구성되지 않는다.
실시예들
실시예 1
생산 숙주 변형 - 아실- CoA 탈수소효소의 감쇠
이 실시예는 지방산 분해 효소의 발현이 감쇠되는, 유전적으로 조작된 숙주 세포의 구조(construction)를 설명한다.
대장균 MG1655(대장균 K 균주)의 fadE 유전자는 하기의 변형과 함께, Datsenlco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6640-6645(2000)에 기재된 Lambda Red(Red-Driven Integration로도 알려짐) 시스템을 사용하여 결실되었다:
하기의 두 개의 프라이머들은 fadE 결실을 일으키는데 사용되었다:
Figure 112014104242619-pct00009
Del-fadE-F 및 Del-fadE-R 프라이머들은 PCR에 의해 (상기의 Datsenko et al.,에 기재된) 플라스미드 pKD13로부터 카나마이신 저항성(kanamycin resistance: KmR) 카세트를 증폭시키는데 사용되었다. 이후에, PCR 생성물은 사전에 3 내지 4 시간 동안 아라비노오스로 유도되는 (상기의 Datsenko et al.,에 기재된) pKD46을 함유하는 전기 적격(electrocompetent) 대장균 MG1655 세포들을 형질전환시키는데 사용되었다. 37 ℃에서 이화대사물 억제(catabolite repression)를 포함하는 가장 최적화된 배양액(super optimal broth with catabolite repression: SOC) 배지 내에서 3 시간 동안 성장 이후, 세포들은 50 ㎍/mL의 카나마이신을 함유하는 Luria agar 플레이트 상에 평판배양(plated)되었다. 저항성 콜로니(Resistant colony)들이 식별되었고, 37 ℃에서 하룻밤 배양된 후 분리되었다. fadE 유전자의 파괴(Disruption)는 대장균 fadE 유전자 측면에 위치하도록 제작된, fadE-L2 및 fadE-R1 프라이머들을 사용하여 PCR 증폭에 의해 확인되었다.
fadE 결실 확인 프라이머들은:
Figure 112014104242619-pct00010
이다.
fadE 결실을 확인한 후, 단일 콜로니가 상기의 Datsenko et al.,에 기재된 바와 같은 pCP20 플라스미드를 사용하여 KmR 마커를 제거하는데 사용되었다. fadE 유전자가 결실되고 KmR 마커가 제거된 결과적으로 얻어진(resulting) MG1655 대장균 균주는 대장균 MG1655 ΔfadE 또는 대장균 MG 1655 D1이다. fadE 유전자가 결실된 MG1655 대장균 균주에 의한 지방산 유도체(총 지방 종류) 생산은 대장균 MG1655에 의한 지방산 유도체 생산과 비교되었다. fadE 유전자의 결실은 지방산 유도체 생산에 영향을 미치지 않았다(도 7). 다수의 예시적인 숙주 세포 균주들은 본 명세서에 설명되었고, 이의 예시들은 하기 표 3에 기재된다.
표 3: 대장균 균주들의 유전적 특성
Figure 112014104242619-pct00011
플라스미드들: pDG109, pLC56 및 pV171.1 모두는 carB 및 tesA의 다양한 발현을 갖는 pCL_Ptrc_carB_tesA_alrA_fabB_fadR 오페론이다. iFAB138은 SEQ ID NO:19이다.
실시예 2
아세틸 CoA 카르복실라아제 매개되는 - 지방산 합성 경로를 통한 플럭스( Flux ) 증가
지방족 에스테르 생산:
지방산 생합성의 주요한 전구체들은 말로닐-CoA 및 아세틸-CoA이다(도 1). 이러한 전구체들은 대장균 내에서 지방산 생합성의 속도를 제한다는 것으로 제안된다. 이 실시예에서, 합성 acc 오페론들[코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum) accABCD (±birA)]은 과발현되었고, 대장균 내에서 아세틸-CoA 및 말로닐 CoA 생산 증가로 이어졌다. 한가지 접근법에서, 말로닐-CoA 수치를 증가시키기 위하여, 코리네박테리움 글루타미쿰(C. 글루타미쿰)로부터의 아세틸-CoA 카르복실라아제 효소 복합체는 대장균 내에서 과발현되었다. 아세틸-CoA 카르복실라아제(acc)는 네 개의 개별적인 서브유닛(subunit)들인 accA, accB, accC 및 accD로 이루어진다(도 3). C. 글루타미쿰 acc의 이점은 두 개의 서브유닛들이 각각 accCB 및 accDA인 융합 단백질로 발현된다는 점이고, 이는 이의 균형적인 발현을 용이하게 한다. 추가적으로, accB 서브유닛을 비오틴화시키는 C. 글루타미쿰 birA(도 3)가 과발현되었다. 예시적인 C. 글루타미쿰 birA DNA 서열들은 EQ ID NO: 55 및 SEQ ID NO: 56으로 나타낸다. C. 글루타미쿰 birA 단백질 서열은 SEQ ID NO: 57로 나타낸다.
C. 글루타미쿰 acc 유전자들의 합성 오페론들은 OP80(본 명세서에 인용참조되는 WO 2008/119082 참조)의 방식을 따라 Ptrc1-accDACB, Ptrc3-accDACB, Ptrc1-accCBDA 및 Ptrc3-CBDA으로 클로닝되었다. Ptrc1 및 Ptrc3은 보통 사용되는 Ptrc 프로모터의 유도체이고, 이는 표적 유전자들의 전사를 감쇠시킨다. 본래의 서열들은 이들이 유리한 코돈 사용(accCB의 Arg6에 대한 코돈만 변화)을 나타내므로 염색체의 DNA로부터 증폭된다는 점에 주목한다. C. 글 루타미쿰 birA 유전자는 최적화된 코돈이고, 유전자 합성에 의해 얻어진다. 이는 네 개의 모든 오페론 구조체들 내의 acc 유전자들의 클로닝된 하류(downstream)이다. 하기에, 오페론 구성물(configuration) accDACB를 accD-로, 그리고 오페론 구성물 accDACB+birA를 accD+로 칭한다. 결과적으로 얻어진 플라스미드들은 대장균 DAM1_i377로 형질전환되고, 이는 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스로부터의 에스테르 생성효소 9(ES9)[SEQ ID NO: 6] 및 대장균으로부터의 아실-CoA 합성효소 fadD 및 선도가 없는(leaderless) 티오에스테라아제 'tesA의 통합된 카피(integrated copy)들(i)을 함유한다. 모든 유전자들은 Ptrc 프로모터들에 의해 제어된다. 균주들은 진탕 플라스크(shake flask) 내 (하기에 설명되는) 5NBT 배지 내에서 성장되었고, 하기에 설명되는 짧은 사슬형-CoA 분석법(assay)을 사용하여 말로닐-CoA에 대하여 분석되었다. 도 8은 6 개의 C. 글루타미쿰 acc±birA 구조체들이 대장균 내에서의 기능(functionality)을 입증하는 대수 기(logarithmic phase)에서 말로닐-CoA의 높아진 수치를 나타내는 것을 보여준다. birA의 동시 발현(coexpression)이 특히 Ptrc3-accDACB-birA 오페론 구성물을 함유하는 플라스미드(플라스미드 pAS119.50D; SEQ ID NO: 62)에 의해 ptrc1/3_accDACB 균주들 내에서 말로닐-CoA 수치를 더 증가시킨다는 점에 주목하였다.
panK와 acc-birA 과발현의 조합 효과를 테스트하기 위하여, 최적화된 panK 유전자는 ptrc1/3_accDACB-birA의 birA 하류에(downstream) 클로닝되었다. 판토테네이트 키나아제(Pantothenate kinase) panK (또는 CoaA)는 많은 반응들, 예를 들어 아세틸-CoA 카르복실라아제의 기질인 아세틸-CoA의 형성에 관련된 필수적인 보조인자인 조효소 A의 생합성의 첫번째 단계를 촉진시킨다. 결과적으로 얻어진 플라스미드들은 DAM1_i377로 형질전환되었고, 진탕 플라스크 내 5NBT(+TVS1) 배지 내에서 성장되었으며, 균주들은 하기에 설명되는 방법을 사용하여 짧은 사슬형-CoAs에 대하여 분석되었다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 대수 기(log phase)에서의 panK 동시 발현은 말로닐-CoA 수치 및 아세틸-CoA 수치도 더 증가시켜, panK가 말로닐-CoA 수치를 더 증가시킬 수 있다는 것을 입증하였다. 지방족 에스테르 생산 중 아세틸-CoA 카르복실라아제 효소 복합체의 동시 발현 영향은 또 다른 대장균 생산 숙주 내에서 acc 유전자 유무에 따라서 에스테르 생성효소 9(SEQ ID NO: 6)를 발현시킴으로써 평가되었다. 좀 더 구체적으로, 플라스미드들 OP80(벡터 대조구), (ES9를 포함하는) pDS57, (ES9 및 accDACB를 포함하는) pDS57-accD- 또는 [ES9 및 accDACB-birA(SEQ ID NO: 63)를 포함하는] pDS57-accD+는 대장균 균주 DV2로 형질전환되었고, 대응하는 형질전환체들은 100 mg/L의 스펙티노마이신으로 보충된 LB 플레이트들 상에서 선택되었다.
각각의 플라스미드의 두 개의 형질전환체들은 독립적으로 100 mg/L의 스펙티노마이신으로 보충된 LB 배지 내에 주입(inoculated)되었고, 32 ℃에서 5 내지 8 시간 동안 성장되었다. 배양물들은 하기의 조성물을 포함하는 최소 배지에 30 배 희석되었다: 0.5 g/L NaCl, 1 mM MgS04×7 H2O, 0.1 mM CaCl2, 2 g/L NH4Cl, 3 g/L KH2PO4, 6 g/L Na2HPO4, 1 mg/L 티아민, lx 미량 금속(trace metal) 용액, 10 mg/L 구연산 철, 100 mM Bis-Tris(pH 7.0), 30 g/L 글루코오스 및 100 mg/L 스펙티노마이신. 32 ℃에서 하룻밤 성장한 후에, 배양물들은 2 g/L NH4Cl 대신에 1 g/L NH4Cl을 함유하고 1 mM IPTG 및 2 %(v/v) 메탄올로 보충된 배지라는 것 이외에는 동일한 조성물을 갖는 네 개의(in quadruplicate) 최소 배지에 10 배 희석되었다. 이후에, 결과적으로 얻어진 배양물들은 진탕기(shaker) 내에서 32 ℃에서 성장되었다. 지방산 메틸 에스테르(FAMEs)의 생산은 불꽃 이온화 검출기가 달린 가스 크로마토그래피(GC-FID)에 의해 분석되었다. 샘플들은 1:1 vol/vol 비율의 부틸 아세테이트로 추출되었다. 소용돌이가 일도록 흔들어(vortexing) 준 후에, 샘플들은 원심분리되었고, 유기상(organic phase)이 가스 크로마토그래피(GC)에 의해 분석되었다. 분석 조건들은 하기와 같다: 기구: Trace GC Ultra, 불꽃 이온화 검출기(FID)가 달린 Thermo Electron Corporation 사의 검출기; 컬럼(column): Thermo Electron Corporation 사의 DB-1(1 % 디페닐 실록산; 99 % 디메틸 실록산) CO1 UFM 1/0.1/5 01 DET, 상(phase) pH 5, FT: 0.4 ㎛, 길이 5 m, id: 0.1 mm; 주입 조건(inlet conditions): 250 ℃[비분취(splitless)], 75 mL/m의 분류(split flow)를 갖는 샘플 농도에 따라 사용되는 3.8 m 1/25 분취 방법(split method); 운반 기체(carrier gas), 유량(flow rate): 헬륨, 3.0 mL/m; 블록 온도(block temperature): 330 ℃; 오븐 온도: 0.5 m까지 50 ℃로 유지, 100 ℃/m 내지 330 ℃, 0.5 m까지 330 ℃로 유지; 검출기 온도: 300 ℃; 주입 부피: 2 ㎕; 작동 시간(run time)/유량: 6.3 m/3.0 mL/m(비분취 방법), 3.8 m/1.5 mL/m(1/25 분취 방법), 3.04 m/1.2 mL/m(1/50 분취 방법). 생산되는 FAMEs는 도 10에 나타낸다. 대장균 DV2 내에서 스스로 ES9의 발현은 대조구 DV2 OP80보다 많은 FAME 생산으로 이어졌다. C. 글루타미쿰 아세틸-CoA 카르복실라아제 복합체의 동시 발현은 FAMEs의 대략 1.5 배 증가로 이어졌고, C. 글루타미쿰 비오틴 단백질 리가아제(ligase)의 추가적인 동시 발현은 FAMEs의 대략 5 배 증가로 이어졌다. 이러한 결과들은 증가된 말로닐-CoA의 공급이 대장균 내에서 지방산 생합성 절차(machinery) 중의 중간체들을 지방산 메틸 에스테르들로 전환시키는 ES9의 능력을 향상시키는 것을 시사한다.
짧은 사슬형-CoA 분석법: 15 ml 팔콘 튜브(falcon tube)들은 내부 표준물질(internal standard)로서 크로토닐-CoA를 포함하는 0.467 ml의 10 % TCA를 포함하여 준비되었고, 2 ml의 실리콘유로 덮어씌워졌다. 튜브들은 얼음으로 차게하였고, 1 ml OD600 = 31.2와 같은 발효액이 실리콘유의 위에 조심스럽게 놓여졌다. 샘플들이 네 번의 4 분 주기 동안 11,400 g로 4 ℃에서 원심분리되었다. 각각의 샘플에 대하여, TCA/세포 추출물의 400 ml 부분 표본(aliquot)들을 옮겨, (CHCl3 내의) 1 ml 옥틸아민으로 중화하기 위하여 새로운 에펜도르프 튜브 (Eppendorf tube)에 위치되었다. 소용돌이가 일도록 흔들어(vortexing) 준 후에, 샘플들은 30 초 동안 13,000 g로 원심분리되었다. 200 ml의 최상층은 0.2 um PTFE 실린지 필터(syringe filter)를 사용하여 여과되었고, 이후에 LC-MS/MS 분석을 거친다.
실험에 사용된 배지에 대한 설명:
Figure 112014104242619-pct00012
1000 배 농축된 미량(Trace) 비타민 용액
0.06 g/L 리보플라빈
6 g/L 나이아신(Niacin)
5.4 g/L 판토텐산
1.4 g/L 피리독신
0.06 g/L 비오틴
0.01 g/L 엽산(Folic acid)
1000 배 농축된 미량 금속 용액
2 mL/L 농축된 염산
0.5 g/L 붕산
1.9 g/L 황산동(cupric sulfate), 5수화물(pentahydrate), USP
1 g/L 무수 염화 아연(zinc chloride anhydrous)
2 g/L 소듐 몰리브데네이트 무수물(sodium molybdenate dehydrate)
2 g/L 염화 칼슘 무수물
지방족 알코올 생산:
지방족 알코올 생산 중 아세틸-CoA 카르복실라아제 효소 복합체의 동시 발현 영향은 대장균 DV2 내에서 acc 유전자 유무에 따라서 시네코코커스 엘롱가투스로부터의 아실-ACP 환원효소(AAR)[SEQ ID NO: 38]를 발현시킴으로써 평가되었다. accD+ 오페론 구성물은 에스테르 생성효소와 동시에 발현되는 경우에 가장 좋은 결과들을 주는 것으로 선택되었다(이전 실시예 참조). accDABC-birA 오페론은 주입 기술(Infusion technology)[Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA]를 사용하여 pLS9-185(pCL1920 유도체) 내의 aar 유전자의 하류에 클로닝되었다. 결과적으로 얻어진 플라스미드는 대장균 균주 DV2로 형질전환되었고, 대응하는 형질전환체들은 100 mg/L의 스펙티노마이신으로 보충된 LB 플레이트들 상에서 선택되었다. 생산된 지방족 알코올들은 도 11에 나타낸다. AAR과 accD+의 동시 발현은 대조구인 AAR(pLS9-185) 만과 비교하여 지방족 알코올 역가의 약 1.5 배 증가로 이어졌다. 데이타는 재현가능하였다(3 개의 샘플들이 나타냄). 이러한 결과들은 말로닐-CoA 수치 증가가 아실-ACP 환원효소가 사용되는 경우에 향상된 지방산 생산으로 이어진다는 것을 입증한다. 또한, 실시예 3은 전체 fab 오페론들과 함께 acc 유전자들의 공동 발현을 설명한다.
실시예 3
iFABs - 지방산 합성 경로를 통한 플럭스 증가
지방산 유도체 생산:
재조합 숙주 세포 내에서 지방산 합성 경로를 통한 플럭스를 증가시키시 위한 전략은 대장균 내에서 상이한 유기체들로부터 외인성 지방산 생합성 유전자들의 발현 및 본래의 대장균 지방산 생합성 유전자들의 과발현 둘 모두를 포함한다. 이 연구에서, 상이한 유기체들로부터의 지방산 생합성 유전자들은 lacUV5 프로모터의 제어 하에서 대장균 DV2의 게놈에 조합되었고(표 3), IS5-11 부위 내로 통합되었다. iFABs 130-145를 함유하는 16 개의 균주들이 평가되었다. iFABs 130-145의 상세한 구조는 표 4 및 표 5에 나타낸다.
표 4: iFABs 130-145에 사용되는 상이한 종으로부터의 성분
Figure 112014104242619-pct00013
각각의 "iFAB"는 다음과 같은 순서의 다양한 fab 유전자들을 포함한다: 1) 엔오일-ACP 환원효소(BS_fabI, BS_FabL, Vc_FabV 또는 Ec_FabI); 2) b-케토아실-ACP 합성효소 Ⅲ(St_fabH); 3) 말로닐-CoA-ACP 아실전달효소(St_fabD); 4) b-케토아실-ACP 환원효소(St_fabG); 5) 3-하이드록시-아실-ACP 탈수효소(St_fabA 또는 St_fabZ); 6) b-케토아실-ACP 합성효소 Ⅱ(Cac_fabF). St_fabA는 또한 trans-2, cis-3-데세노일-ACP 이성질화효소 활성을 가지고, Cac_fabF는 b-케토아실-ACP 합성효소 Ⅱ 활성 및 b-케토아실-ACP 합성효소 Ⅰ활성을 갖는다는 점에 주목한다[Zhu et al., BMC Microbiology 9:119(2009)]. iFABs 130-145의 특정 조성에 대하여, 하기의 표 5를 참조한다.
표 5: iFABs 130-145의 조성
Figure 112014104242619-pct00014
플라스미드 pCL_Ptrc_tesA는 각각의 균주들로 형질전환되었고, 발효는 32 ℃ 및 37 ℃ 둘 모두에서 얻어지도록 유도(induction)로부터 20시간 FA2 배지 내에서 처리되었다. 이중의 플레이트 스크린으로부터 총 지방 종류의 생산에 대한 데이타는 도 12a 및 도 12b에 나타낸다. 이러한 스크린으로부터, 가장 좋은 구조체는 iFAB 138을 포함하는 DV2로 결정되었다. EG 149의 게놈 내의 iFAB 138의 서열은 SEQ ID NO: 19로 나타낸다.
지방족 에스테르 생산:
모든 합성 fab 오페론은 대장균 염색체 내로 통합되었고, 대장균 DAM1 pDS57 내에서의 발현에 의해 증가된 FAME 생산에 대하여 평가되었다. 또한, 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터의 네 개의 합성 acc 오페론들이 동시에 발현되었고, 개선된 FAME 생산률에 대하여 평가되었다. 몇몇 균주들에서는 더 빠른 속도 및 더 높은 역가로 생산된 FAMEs를 얻었다. 16 개의 상이한 iFAB 오페론들(표 5)은 lacUV5 프로머터의 제어 하에 두었고, 대장균 DAM1의 IS5-11 부위 내로 통합되었다. 이러한 균주들은 DAM1 ifab130 내지 145로 명명하였다. 이들은 FAME 생산의 평가를 위하여 (에스테르 생성효소 377을 함유하는) pDS57 또는 acc 오페론들의 상이한 버전(version)들을 동시에 발현시키는 pDS57(상기 참조) 중 어느 하나로 형질전환되었다. 예시적인 플라스미드들이 표 6에 기재된다.
표 6: ( 코리네박테리움 글루타미쿰 으로부터의) 합성 acc 오페론들 및 ( 마리노박터 하이드로카보노클라스티쿠스 로부터의) 에스테르 생성효소 ES9를 함유하는 플라스미드들
Figure 112014104242619-pct00015
DAM1 ifab 균주들은 32 ℃의 발효기(fermenters), 진탕 플라스크(5NBT 배지)[상기의 배지 설명을 참조] 및 96-홈 플레이트(4NBT 배지) 내에서 분석되었다. 가장 좋은 결과는 96-홈 플레이트 및 진탕 플라스크에서 얻어졌고, 여기서 pDS57-acc-birA 플라스미드를 포함하는 몇몇 DAM1 ifab 균주들은 더 높은 FAME 역가를 나타냈다. 특히, pDS57-accDACB-birA를 포함하는 DAM1 ifab131, ifab135, ifab137, ifab138 및 ifab143은 20 내지 40 % 개선된 역가를 나타내었고, 이는 이러한 균주들 내에서 지방산 경로를 통하여 더 높은 플럭스가 달성되어, 더 나은 생성물 형성 속도를 야기한다는 것을 나타낸다(이러한 결과들은 몇몇 독립적인 실험들에서 재현가능하였다).
지방산 메틸 에스테르(FAME) 생산에서 fabH 및 fabI 과발현의 효과:
재조합 숙주 세포 내에서 지방산 합성 경로를 통한 플럭스를 증가시키시 위한 전략은 본래의 지방산 생합성 유전자들의 과발현 및 이종 지방산 생합성 유전자들의 발현 둘 모두를 포함한다. FabH 및 fabI는 피드백 억제를 나타내는 두 개의 지방산 생합성 효소들이다[Heath and Rock, JBC 271:1833-1836(1996)]. 연구는 FabH 및 FabI가 FAME 생산 속도를 제한하는지의 여부를 결정하기 위하여 실시되었다. (대장균, B. 서브틸러스, 아시네토박터 베일리 ADP1, 마리노박터 아쿠애올레이 VT8 및 로도코코스 오파쿠스로부터의) FabH 및 fabI 동족체들은 합성 오페론으로서 과발현되었고, 대장균 DAM1 pDS57[좋은 FAME 생산자(producer)로 관찰되는 균주]에서 평가되었다. 한가지 접근법에서, fabHfabI 오페론들은 왁스(A. 베일리, M. 아쿠애올레) 또는 트리아실글리세리드(R. 오파쿠스)를 축적하는 유기체들로 구성되었고, 대장균 DAM1 pDS57의 염색체 내로 통합되었다. 관련된 접근법에서, C. 글루타미쿰으로부터의 합성 acc 오페론들은 (상기 실시예 2에 설명된 바와 같이) 동시에 발현되었다. 11 개의 상이한 fabHI 오페론들은 표 7에 요약된 바와 같이 (실험관 내에 집합되어) 구성되었다. fabHI 오페론들은 IPTG 유도 lacUV5 프로머터의 제어 하에 두었고, 대장균 DAM1의 IS5-11 부위 내로 통합되었다. 이러한 균주들은 하기의 표에 나타낸 바와 같이 명명되었다. 이들은 FAME 생산의 평가를 위하여 (에스테르 생성효소 377을 함유하는) pDS57 또는 acc 오페론들의 상이한 버전(version)들을 동시에 발현시키는 pDS57 중 어느 하나로 형질전환되었다.
표 7: 통합된 fabHI 오페론들의 유전자형
Figure 112014104242619-pct00016
Bs: 바실러스 서브틸러스; Ec: 대장균; ADP1: 아시네토박터종 ADP1; VT8: 마 리노박터 아쿠애올레이 VT8; Ro: 로도코코스 오파쿠스 B4
DAM1 ifabHI 균주들은 32 ℃의 발효기, 진탕 플라스크(5NBT 배지) 및 96-홈 플레이트(4NBT 배지) 내에서 분석되었다. 진탕 플라스크에서, pDS57 플라스미드를 운반하는 다수의 ifabHI 균주들이 대조구 DAM1 pDS57균주보다 더욱 많이 수행되어, 10 내지 15 % 더 높은 FAME 역가에 도달하였다(도 13). ifabHI 균주들이 pDS57-acc-birA 플라스미드들로 형질전환되는 경우에 FAME 역가에 대한 추가적인 증가가 얻어졌고, 특히 FAME 역가에 대한 50 % 증가는 균주 StEP156(DAM1 IS5-11::lacUV5(ecRBS)ADP1fabH (ecRBS)ADP1fabI pDS57-accDACB-birA)에서 관찰되었다[도 14].
ifabHI를 포함하는 균주들 중 일부는 발효기에 유입(run)되었고, 여기서 FAME 역가, 특정 생산률 및 수율의 증가도 관찰되었으며(도 15), 이는 이러한 균주들 내에서 지방산 경로를 통하여 더 높은 플럭스가 달성되어, 더 나은 생성물 형성 속도를 야기한다는 것을 나타낸다. 특히, stEP129(DAM1 5-11::UV5(ecRBS)ADP1fabH (ecRBS)ADP1fabI pDS57)는 몇몇의 독립적인 발효 진행(fermentation runs)에 있어서 더 높은 FAME 역가 및 수율을 나타냈다. fabH와 fabI의 다른 조합물들이 유사한 효과를 얻기 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에서 FAME를 예시로 들었으나, 지방산 생합성 유전자들을 변화시키기 위한 이 접근법은 여하한 지방산 유도체의 생산을 증가시키는데 유용한 접근법이다.
지방산 메틸 에스테르( FAME ) 생산에서 오페론 FAB 138의 앞쪽에 강력한 프로모터( strong promoter )의 삽입 효과:
iFAB 138의 lacUV5 프로모터는 mRNA 분석에 의해 확인되는 바와 같이, iFAB 138의 더 높은 수준의 발현으로 이어지는 T5 프로모터(SEQ ID NO : 2)로 대체되었다. T5 프로모터로부터의 iFAB138의 발현은 지방족 에스테르의 더 높은 역가, 수율 및 생산률을 야기하였다. 균주 shu.002(표 3)는 iFAB138 오페론의 발현을 제어하는 T5 프로모터(SEQ ID NO: 19)를 함유한다는 것을 제외하면 균주 BD64(표 3)와 동질 유전자형(isogenic)이다.
표 8: iT5 _138 카세트를 발생시키고 새로운 균주들 내에 이의 삽입을 확인하기 위하여 사용되는 프라이머들
Figure 112014104242619-pct00017
프라이머들 DG405 및 DG406(표 8)은 각각의 PCR 생성물의 말단에 50bp의 상동성을 첨가하는 T5 프로모터 카세트 및 cat-loxP를 증폭시키는데 사용되었고, 이는 iFAB138 오페론의 발현을 조절하는 lacUV5 프로모터를 대체하는 여하한 균주 내로 통합될 수 있도록 한다. cat-loxP-T5 프로모터는 BD64/pKD46 균주로 형질전환되었다. 형질전환체들은 37 ℃에서 하룻밤 LB＋클로람페니콜 플레이트에서 회수되었고, 새로운 LB＋클로람페니콜 플레이트에 패치(patched)되었으며, 플라이머들 DG422 및 DG423을 사용하여 콜로니 PCR에 의해 확인되었다. 플라스미드 pJW168[Palmeros et al ., Gene 247:255-264(2000)]은 균주 BD64 i-cat-loxP-T5_138로 형질전환되었고, 32 ℃ LB＋카르베니실린 플레이트에서 선택되었다. cat 마커를 제거하기 위하여, cre-재조합효소(recombinase)의 발현은 IPTG에 의해 유도되었다. 플라스미드 pJW168은 42 ℃에서 배양물들을 성장시킴으로써 제거되었다. 콜로니들은 pJW168의 소실(loss) 및 cat 마커의 제거를 확인하기 위하여 각각 LB＋클로람페니콜 및 LB＋카르베니실린 상에 패치되었다. 콜로니는 양성 대조구로서 LB에도 패치되었고, 패치된 모든 플레이트들은 32 ℃에서 배양되었다. cat 마커의 제거는 프라이머들 DG422 및 DG423을 사용하여 콜로니 PCR에 의해 확인되었다. 결과적으로 얻어진 PCR 생성물은 프라이머들 EG744, EG749 및 oTREE047과 함께 시퀀싱(sequencing)함으로써 확인되었고, 균주는 shu.002라고 칭하였다. 도 16은 iFAB138 유전자 자리(locus)를 나타낸다: FAB 138의 앞쪽에 통합된 cat-loxP-PT5 카세트의 도해(도 16a) 및 PT5_iFAB138 영역의 도해(도 16b). 통합 부위(integration site)에 상동성을 갖는 iFAB138의 앞쪽에 통합된 cat-loxP-T5 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 1로 나타내고, 통합 부위에 상동성을 갖는 iT5_FAB138 프로모터의 서열은 SEQ ID NO: 2로 나타낸다. 지방산 플럭스의 증가로 이어질 수 있는 다수의 조건들이 존재한다. 이 실시예에서, 지방산 플럭스의 증가는 오페론 iFAB138의 프로모터 강도(promoter strength)를 변화시킴으로써 달성되었다. T5 프로모터로부터의 iFAB138의 발현은 유익하였음에도 불구하고, 이러한 프로모터 변화가 yijP::Tn5 카세트의 삽입과 병행되는 경우에, 지방산 에스테르들 및 다른 지방산 유도체들의 역가, 수율 및 생산율에 있어서 추가적인 개선들이 관찰되었다(데이타는 나타내지 않음).
실시예 4
rph 및 ilvG 돌연변이를 회복( Repairing )시킴으로써 유리 지방산( FFA ) 생성물의 양 증가
ilvG 및 rph 돌연변이는 이러한 균주 내에서 수정(corrected)되어, 더 많은 FFA 생산이 야기되었다. 균주들 EG149 및 V668(표 3)은 pCL_Ptrc_tesA로 형질전환되었다. pCL_Ptrc_tesA를 포함하는 균주들 EG149 및 V668의 FFA 생산을 비교하기 위하여 40 시간 동안 FA2 배지 내에서 32 ℃에서 발효가 진행되었다. rph 및 ilvG 돌연변이의 수정은 pCL_Ptrc_tesA를 포함하는 염기성(base) 균주의 FFA 생산에 있어서 116 % 증가를 야기하였다. 도 17에 나타낸 바와 같이, V668/pCL_Ptrc_tesA는 EG149/pCL_Ptrc_tesA 대조구보다 더 많은 FFA를 생산하였다. FFA는 LS9 생성물들의 전구체이므로, 더 많은 FFA 생산은 새로운 균주가 더 높은 수치(higher levels)로 LS9 생성물을 생산할 수 있다는 좋은 지표이다.
실시예 5: 트랜스포존 돌연변이 유발 - yijP 에 의한 지방산 유도체들의 생산 증가
지방족 알코올 생산:
대장균에 의해 생산되는 지방족 알코올의 역가, 수율, 생산률을 개선시키기 위하여, 트랜스포존 돌연변이 유발 및 고속-대량 스크리닝이 실시되었고, 유익한 돌연변이들이 시퀀싱되었다. yijP 균주 내 트랜스포존 삽입은 진탕 플라스크 및 유가 배양식 발효 둘 모두에서 균주의 지방족 알코올 수율을 개선시킨 것으로 나타났다. SL313 균주는 지방족 알코올을 생산한다. 이러한 균주의 유전자형은 표 3에 제공된다. 이후에, 지방족 알코올의 생산을 측정하기 위하여 트랜스포존 클론들은 고속-대량 스크리닝을 거친다. 간단히 말해, 콜로니들은 LB를 함유하는 깊은-홈(deep-well) 플레이트에서 골라내었고, 하룻밤 성장시켰으며, 새로운 LB 내에 주입(inoculated)되었고 3시간 동안 성장시켰으며, 새로운 FA2.1 배지 내에 주입되었고, 16시간 동안 성장시켰으며, 이후에 부틸 아세테이트를 사용하여 추출되었다. 미정제 추출물은 BSTFA(N,O-bis[트리메틸실릴]트리플루오로아세트아미드)로 유도체화(derivatized)되었고, GC/FID를 사용하여 분석되었다. pDG109 플라스미드의 선택을 유지하기 위하여 모든 배지에 스펙티노마이신(lOO mg/L)이 포함되었다. 대조구 균주 SL313처럼 유사한 총 지방 종류를 생산하나, 대조구보다 더 높은 퍼센트로 지방족 알코올 종류를 갖고 더 낮은 퍼센트로 유리 지방산을 갖는 클론들을 선택함으로써 히트(Hit)들이 선택되었다. 균주 68F11이 히트(hit)로서 식별되었고, FA2.1 배지를 사용하여 진탕 플라스크 발효에서 입증되었다. 대조구 균주 SL313와 트랜스포존 히트(hit) 68F11의 비교는, 두 균주 모두 유사한 역가의 총 지방 종류를 생산하나, 68F11은 대조구보다 더 높은 퍼센트로 지방족 알코올 종류를 생산한다는 것을 나타내었다. LC535로 명명한, 히트(hit) 68F11의 단일 콜로니는 트랜스포존 삽입의 위치를 확인하기 위하여 시퀀싱되었다. 간단히 말해, 게놈 DNA는 제조자의 지시에 따라서 ZR Fungal/Bacterial DNA MiniPrep™(Zymo Research Corporation, Irvine, CA) 키트(Kit)를 사용하여 10 mL 하룻밤이 지난(overnight) LB 배양물로부터 정제되었다. 정제된 게놈 DNA는 하기의 트랜스포존 내부의 프라이머들을 사용하여 트랜스포존 밖에서 시퀀싱되었다:
Figure 112014104242619-pct00018
균주 LC535는 yijP 유전자 내에 트랜스포존 삽입을 갖도록 결정되었다(도 18). yijP는 기능이 불분명한 보존된 내부 막 단백질(conserved inner membrane protein)을 인코딩한다. yijP 유전자는 오페론 내에 존재하고, 포스포에놀피루브산 카르복실라아제를 인코딩하는 ppc 유전자, 및 알려지지 않은 기능의 예상되는 DNA-결합 전사 제어인자(predicted DNA-binding transcriptional regulator)를 인코딩하는 yijO 유전자와 함께 동시에 전사(co-transcribed)된다. 아마도, 트랜스포존 내부의 프로모터들은 yijP, ppc 및 yijO의 전사 시기(timing) 및 수준(level)에 영향을 미치고, 인접한 유전자들 frwD, pflC, pfld 및 argE에도 영향을 미칠 수 있다. 트랜스포존 카세트 내부의 프로모터들은 도 18에 나타내고, 인접한 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있다. 균주 LC535는 두 개의 상이한 날짜로 유가 배양식 발효에서 평가되었다. 두 발효 모두에서 LC535가 대조구 SL313보다 더 높은 수율을 갖는 지방족 알코올을 생산하였고, 탄소 투입량(carbon input)에 근거하여 1.3 내지 1.9 % 절대 수율(absolute yield)이 개선되었다는 점이 입증되었다. yijP 트랜스포존 카세트는 추가적으로 상이한 균주 V940에서 평가되었고, 이는 균주 SL313보다 더 높은 수율로 지방족 알코올을 생산한다. yijP::Tn5-cat 카세트는 하기의 프라이머들을 사용하여 균주 LC535로부터 증폭되었다:
Figure 112014104242619-pct00019
선형 DNA는 균주 SL571 내로 전기천공(electroporated)되었고, lambda red 재조합 시스템을 사용하여 염색체 내로 통합되었다. 콜로니들은 트랜스포존 영역의 바깥쪽에서 하기의 프라이머들을 사용하여 스크리닝되었다:
Figure 112014104242619-pct00020
결점 없는(correct) yijP 트랜스포존 카세트를 포함하는 콜로니는 균주 D851을 생산하도록 생산 플라스미드 pV171.1로 형질전환되었다. D851은 yijP 트랜스포존 카세트를 함유하지 않는 균주 V940와 대조하여 진탕 플라스크 발효에서 테스트되었다. 이 발효의 결과는 yijP 트랜스포존 카세트가 V940 균주와 비교하여 D851 균주에 의해 더 높은 퍼센트의 지방족 알코올 생산을 부여하고, V940 대조구 균주처럼 유사한 역가의 총 지방 종류를 생산하는 것으로 나타났다. 균주 D851은 두 개의 상이한 날짜로 유가 배양식 발효에서 평가되었다. 이러한 발효들에 대한 데이타는 표 9에 나타냈고, 상기 표 9는 5-리터의 유가 배양식 발효에 있어서, yijP::Tn5-cat 트랜스포존 삽입을 갖는 균주들이 총 지방 종류("FAS") 수율의 증가 및 퍼센트 지방족 알코올("FALC")의 증가를 갖는다는 것을 분명히 보여준다. "총 지방 종류" 및 "총 지방산 생성물"이라는 용어들은 국제 특허 출원 공개 WO 2008/119082에 기재된 바와 같이 GC-FID에 의해 평가되는, 지방족 알코올, 지방족 알데히드 및 유리 지방산의 양과 관련하여 본 명세서에서 통용되어 사용될 수 있다. 상기 동일한 용어들은 지방족 에스테르 분석에 대하여 언급하는 경우에 지방족 에스테르 및 유리 지방산을 의미하는 것으로 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, "지방족 에스테르"라는 용어는 베타 하이드록시 에스테르를 포함한다.
표 9: FAS 및 FALC 의 역가 및 수율에 대한 yijP 트랜스포존 삽입의 효과
Figure 112014104242619-pct00021
탱크 발효법( Tank Fermentation Method ):
탱크 내에서의 지방산 및 지방산 유도체들의 생산을 평가하기 위하여, 원하는 균주의 글리세롤 바이알(glycerol vial)은 진탕 플라스크 내에 20 mL LB＋스펙티노마이신을 주입하기 위하여 사용되었고, 대략 여섯 시간 동안 32 ℃에서 배양되었다. 4 mL의 LB 배양물은 125 mL의 적은 PFA 접종 배지(Low PFA Seed Media)[하기]에 주입하기 위하여 사용되었고, 이후에 32 ℃ 진탕기에서 하룻밤 배양되었다. 50 mL의 하룻밤이 지난 배양물은 1 L의 탱크 배지에 주입하기 위하여 사용되었다. 탱크는 16 g/L/hr 글루코오스의 최대 공급량(maximum feed rate)을 가지며 pH 조절(stat) 조건 하에서 pH 7.2 및 30.5 ℃으로 작동되었다.
표 10: 적은 PFA 접종 배지(Low PFA Seed Media):
Figure 112014104242619-pct00022
표 11: 탱크 배지
Figure 112014104242619-pct00023
추가적인 연구들은 yijP 트랜스포존 삽입을 갖는 균주들 내에서의 FAS 및 FALC의 역가 및 수율의 개선이 포스포에놀피루브산 카르복실라아제(ppc)의 활성 감소로 인한 것이라는 것을 시사한다. ppc 효소 분석(assay)은 이 가설을 검증하기 위하여 하기의 균주들로 실험관 내에서 실시되었다.
Figure 112014104242619-pct00024
Ppc 활성은 (상기에 설명된) FA2.3 배지 내에서 표준 진탕 플라스크 프로토콜(standard shake flask protocol)을 사용하여 진탕 플라스크 발효에서 성장된 세포들에 대하여 측정되었다. 대략 5 mL의 세포들이 원심분리되었고, 세포 페이스트(cell paste)는 프로테아제 억제인자 칵테일 용액(protease inhibitor cocktail solution)을 포함하는 BugBuster 단백질 추출제(Protein Extraction Reagent)[Novagen 사] 내에 현탁되었다. 세포 현탁액(cell suspension)은 20 분 동안 진탕기로 가볍게 진탕하면서 배양되었다. 불용성 세포 파괴물(cell debris)은 4 ℃에서 20 분 동안 16,000 xg로 원심분리한 후, 뒤이어 상청액(supernatant)을 새로운 튜브에 옮김으로써 제거되었다. 세포 용해물(cell lysate)에 대한 Ppc 활성은 하기의 반응 혼합물을 사용하여 시트르산 합성효소(citrate synthase)와 함께 커플링 반응에 의해 결정되었다: 0.4 mM 아세틸-CoA, 10 mM 포스포에놀피루브산염(phosphoenolpyruvate), 0.5 mM 모노브로모바이메인(monobromobimane), 5 mM MgCl2, 10 mM NaHCO3 및 100 mM Tris-HCl(pH 8.0) 내의 돼지 심장(porcine heart)으로부터의 10 단위(units) 시트르산 합성효소. 아세틸-CoA 및 옥살로아세테이트를 사용하여 시트르산 합성효소에 의한 반응에서의 CoA 형성은 모노브로모바이메인에 의한 CoA의 형광성 유도화(fluorescent derivatization)를 이용하여 광도 측정으로 모니터링되었다. Ppc 분석 결과들은 yijP::Tn5-cat 트랜스포존 카세트가 야생형 세포들과 비교하여 세포 내에서의 Ppc 활성을 2.7 배 감소시켰다는 것을 나타냈다. ppc 결실이 있는 세포들은 잘 자라지 않았고, 활성은 야생형 세포들보다 10 배 더 낮았다. 또한, 결과들은 지방족 알코올 생산의 가장 높은 수율이 야생형 수준보다 더 낮은 Ppc 발현 수준을 필요로 한다는 것은 나타낸다. 또한, 단백질 유전 정보 데이타(Proteomics data)는 yijP::Tn5-cat 트랜스포존 카세트가 있고 없는 두 개의 균주들 내에서의 Ppc 단백질의 존재율(abundance)을 평가하기 위하여 수집되었다. 단백질 샘플들은 (상기에 설명된) 표준 지방족 알코올 생산 조건들 하에서 생물반응기(bioreactors) 내에서 성장된 균주 V940 및 D851로부터 수집되었다. 샘플들은 두 개의 상이한 시점: 32 시간 및 48 시간에서 취해졌고, 분석을 위하여 준비되었다.
샘플 수집 및 단백질 분리는 다음과 같이 실시되었다:
20 ml의 발효액은 각각의 시점에서 각각의 생물반응기로부터 수집되었다. 샘플들은 얼음처럼 차가운 PBS로 퀀칭(quenched)되었고, 4 ℃에서 원심분리(4500 rpm/10 분)에 의해 수확되었다. 세포 펠렛(Cell pellet)은 얼음처럼 차가운 PBS로 세척되었고, 한번 더 원심분리되었으며, 추가 과정을 위하여 -80 ℃에 저장되었다.
전체 단백질 추출은 프렌치 프레스 프로토콜(French press protocol)을 사용하여 실시되었다. 간단히 말해, 세포 펠렛들은 7 ml의 얼음처럼 차가운 PBS 내에 재현탁되었고, 박테리아의 완전한 용해를 확실하게 하기 위하여 두 번 2000 psi로 프렌치 프레스(French pressed)되었다. 샘플들은 단백질 분획(fraction)으로부터 비-용해된 세포들과 세포 파괴물을 분리시키기 위하여 4 ℃에서 10000 rpm로 20 분 동안 원심분리되었다. 투명한 용해물의 전체 단백질 농도는 BCA 단백질 분석제(Protein Assay Reagent)를 사용하여 결정되었다. 샘플들은 2 mg 단백질/ml 농도로 희석되었고, -80 ℃로 냉동되었다.
샘플들은 적절한 완충액에 재현탁되었고, 하룻밤 동안 37 ℃에서 트립신화(trypsinized)되었으며, 동결건조되었다. 분절된 단백질 샘플들은 30 분 동안 실온에서 동위원소 농축된 메틸피페라진 아세트산으로 표지(labeled)되었다. 표지된 샘플들은 양이온 교환 액체 크로마토그래피를 사용하여 분리되었고, 이온 트랩형 질량 분석기(ion trap mass spectrometer)를 사용하여 질량 분광학적 분석(mass spectroscopy analysis)을 거쳤다. 원 데이타(Raw data)는 배경 제거(background subtraction) 및 바이어스 보정(bias correction)을 사용하여 정규화되었다.
단백질 유전 정보 데이타는 32 시간 및 48 시간에서의 V940과 비교하는 경우에 D851 균주 내의 Ppc 단백질의 상대적인 존재율에 대하여 상당한 감소를 나타냈다. D851은 32 시간에서의 V940의 Ppc 수치의 약 15 % 및 48 시간에서의 V940의 Ppc 수치의 약 35 %를 가졌다. 이러한 데이타는 yijP::Tn5-cat 트랜스포존 카세트가 세포 내의 Ppc 존재율에 대하여 상당한 감소를 야기한다는 것을 나타낸다. 이는 yijP::Tn5-cat 트랜스포존 히트(hit)를 포함하는(harboring) 균주들에 의한 지방족 알코올 생산에 대하여 관찰된 이점들이 Ppc 단백질 양의 감소로 인한 것이라는 점을 시사한다.
이러한 결과들은 ppc 활성을 변화시키는 것이 지방산 유도체들의 수율을 개선시킬 수 있다는 것을 시사한다. ppc 유전자의 발현을 변화시키는 다수의 방식이 존재하고, yijP 트랜스포존 삽입은 이를 달성하기 위한 한 가지 방식이다. 이론에 얽매이고 싶지는 않지만, 포스포에놀피루브산 카르복실라아제 활성을 감소시키는 효과가 TCA 회로를 통한 탄소의 이동(flow)을 제한하는 것이면, 이는 TCA 회로에 관련된 여하한 효소들의 활성을 감소시킴으로써 TCA 회로를 느리게 하거나 또는 시트르산 합성효소(gltA)의 활성을 감소시킴으로써 유사한 결과들을 얻을 수 있다.
실시예 6
아실기 운반 단백질(ACP) 매개된 지방족 알코올 생산 - 지방산 합성 경로를 통한 플럭스 증가
대장균 이외에 공급원들로부터의 말단 경로 효소들이 지방족 아실-ACPs를 생성물로 전환시키기 위하여 이종 숙수로서 대장균에서 발현되는 경우에, 대장균 지방족 아실-ACPs에 대하여 재조합 경로 효소의 인식, 친화성 및/또는 전환(turnover)에 대한 제한이 존재할 수 있다. ACP 단백질이 모든 유기체들에서 어느 정도로 전환되긴 하지만, 이들의 일차 서열(primary sequence)이 상당히 상이할 수 있다는 점에 주목한다. 이 가설을 테스트하기 위하여, 몇몇 시아노박테리아로부터의 acp 유전자들이 pCL1920 유도체인, pLS9-185 내에 존재하는 시네코코커스 엘롱가투스 PCC7942 아실-ACP 환원효소(AAR)의 하류에 클로닝되었다. 또한, 광범위한 기질 특이성을 갖는 포스포판테테이닐 전달효소를 인코딩하는 바실러스 서브틸러스로부터의 sfp 유전자(수탁 번호 X63158; SEQ ID NO: 53)는, 각각의 acp 유전자들의 하류에 클로닝되었다. 이 효소는 불활성 apo-ACP의 활성 홀로(holo)-ACP로의 전환에 관련된다. 구성되는 플라스미드들은 표 12에 기재된다.
표 12: S. 엘롱가투스 PCC7942 AAR의 하류에 B. 서브틸러스 sfp를 포함하는 및 포함하지 않는 시아노박테리아성 ACP를 동시에 발현시키는 플라스미드들
Figure 112014104242619-pct00025
모든 acp 유전자들은 주입 기술(Infusion technology)[Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA]를 사용하여 pLS9-185 내의 aar 유전자의 하류에 가까운 EcoRI 부위 내로 합성 RBS와 함께 클로닝되었다. EcoRI 부위는 acp 유전자의 하류에 재구성되었다. 유사하게, B. 서브틸러스 sfp 유전자는 합성 RBS와 함께 상기 EcoRI 부위 내로 주입 클로닝(InFusion cloned)되었다. 모든 플라스미드들은 대장균 MG1655 DV2(표 3)로 형질전환되었다. 이러한 실험들의 대조구는 AAR 단독(pLS9-185) 발현이다. 표준 진탕 플라스크 발효 실험들의 결과들은 도 19에 나타낸다. 지방족 알코올 역가의 상당한 개선은 플라스미드들 pDS171S, pDS172S, pDS168 및 pDS169를 함유하는 균주들에서 관찰되었고, 이러한 경우에 아마 이종의 말단 경로 효소에 의해 아실-ACPs의 인식, 친화성 및/또는 전환을 촉진하므로, ACP 과발현이 지방족 알코올 생산에 유익할 수 있다는 것을 입증한다(sfp의 유무 및 ACPs의 공급원에 대해서는 표 12를 참조).
지방산 생산:
ACP의 과발현이 또한 유리 지방산 생산을 증가시키는지의 여부를 평가하기 위하여, sfp를 포함하는 일 시아노박테리아성 ACP 유전자가 pDS171s로부터 증폭되었고, pCL 벡터로 'tesA의 하류에 클로닝되었다. 결과적으로 얻어진 오페론은 Ptrc3 프로모터의 제어 하에 있었고, Ptrc 야생형 프로모터보다 약간 더 낮은 전사 수준을 제공했다. 구조체(construct)는 대장균 DV2 내로 클로닝되었고, 지방산 생산에 대하여 평가되었다. 대조구 균주는 동일한 플라스미드를 함유였으나, 시아노박테리아성 ACP 및 B. 서브틸러스 sfp는 포함하지 않았다. 표준 마이크로티터 플레이트(microtiter plate) 발효 실험에 대한 결과들은 도 20에 나타낸다. 지방산 역가의 상당한 개선은 이종 ACP를 동시에 발현시키는 균주에서 관찰되었고, 이러한 경우에 아마 지방산 생합성 경로를 통한 플럭스를 증가시키므로, ACP 과발현이 지방산 생산에 유익할 수 있다는 것을 입증한다.
SEQUENCE LISTING <110> LS9, INC. <120> PRODUCTION OF FATTY ACID DERIVATIVES <130> LS00042PCT <140> <141> <150> 61/619,324 <151> 2012-04-02 <160> 64 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1232 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 1 ttgtccatct ttatataatt tgggggtagg gtgttcttta tgtaaaaaaa acgttttagg 60 atgcatatgg cggccgcata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tctagagttg 120 catgcctgca ggtccgctta ttatcactta ttcaggcgta gcaaccaggc gtttaagggc 180 accaataact gccttaaaaa aattacgccc cgccctgcca ctcatcgcag tactgttgta 240 attcattaag cattctgccg acatggaagc catcacaaac ggcatgatga acctgaatcg 300 ccagcggcat cagcaccttg tcgccttgcg tataatattt gcccatggtg aaaacggggg 360 cgaagaagtt gtccatattg gccacgttta aatcaaaact ggtgaaactc acccagggat 420 tggctgagac gaaaaacata ttctcaataa accctttagg gaaataggcc aggttttcac 480 cgtaacacgc cacatcttgc gaatatatgt gtagaaactg ccggaaatcg tcgtggtatt 540 cactccagag cgatgaaaac gtttcagttt gctcatggaa aacggtgtaa caagggtgaa 600 cactatccca tatcaccagc tcaccgtctt tcattgccat acggaattcc ggatgagcat 660 tcatcaggcg ggcaagaatg tgaataaagg ccggataaaa cttgtgctta tttttcttta 720 cggtctttaa aaaggccgta atatccagct gaacggtctg gttataggta cattgagcaa 780 ctgactgaaa tgcctcaaaa tgttctttac gatgccattg ggatatatca acggtggtat 840 atccagtgat ttttttctcc attttagctt ccttagctcc tgaaaatctc gataactcaa 900 aaaatacgcc cggtagtgat cttatttcat tatggtgaaa gttggaacct cttacgtgcc 960 gatcaacgtc tcattttcgc caaaagttgg cccagggctt cccggtatca acagggacac 1020 caggatttat ttattctgcg aagtgatctt ccgtcacagg tatttattcg actctagata 1080 acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tggatccagc ttatcgatac cgtcaaacaa 1140 atcataaaaa atttatttgc tttcaggaaa atttttctgt ataatagatt caattgcgat 1200 gacgacgaac acgcacctgc aggaggagac ca 1232 <210> 2 <211> 232 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> source <223> /note="Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide" <400> 2 ttgtccatct ttatataatt tgggggtagg gtgttcttta tgtaaaaaaa acgttttagg 60 atgcatatgg cggccgcata acttcgtata gcatacatta tacgaagtta tggatccagc 120 ttatcgatac cgtcaaacaa atcataaaaa atttatttgc tttcaggaaa atttttctgt 180 ataatagatt caattgcgat gacgacgaac acgcacctgc aggaggagac ca 232 <210> 3 <211> 340 <212> PRT <213> Acinetobacter sp. <400> 3 Met Ser Asn His Gln Ile Arg Ala Tyr Ala Ala Met Gln Ala Gly Glu 1 5 10 15 Gln Val Val Pro Tyr Gln Phe Asp Ala Gly Glu Leu Lys Ala His Gln 20 25 30 Val Glu Val Lys Val Glu Tyr Cys Gly Leu Cys His Ser Asp Leu Ser 35 40 45 Val Ile Asn Asn Glu Trp Gln Ser Ser Val Tyr Pro Ala Val Ala Gly 50 55 60 His Glu Ile Ile Gly Thr Ile Ile Ala Leu Gly Ser Glu Ala Lys Gly 65 70 75 80 Leu Lys Leu Gly Gln Arg Val Gly Ile Gly Trp Thr Ala Glu Thr Cys 85 90 95 Gln Ala Cys Asp Pro Cys Ile Gly Gly Asn Gln Val Leu Cys Thr Gly 100 105 110 Glu Lys Lys Ala Thr Ile Ile Gly His Ala Gly Gly Phe Ala Asp Lys 115 120 125 Val Arg Ala Gly Trp Gln Trp Val Ile Pro Leu Pro Asp Asp Leu Asp 130 135 140 Pro Glu Ser Ala Gly Pro Leu Leu Cys Gly Gly Ile Thr 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Mycobacterium tuberculosis <400> 34 Met Ser Ile Asn Asp Gln Arg Leu Thr Arg Arg Val Glu Asp Leu Tyr 1 5 10 15 Ala Ser Asp Ala Gln Phe Ala Ala Ala Ser Pro Asn Glu Ala Ile Thr 20 25 30 Gln Ala Ile Asp Gln Pro Gly Val Ala Leu Pro Gln Leu Ile Arg Met 35 40 45 Val Met Glu Gly Tyr Ala Asp Arg Pro Ala Leu Gly Gln Arg Ala Leu 50 55 60 Arg Phe Val Thr Asp Pro Asp Ser Gly Arg Thr Met Val Glu Leu Leu 65 70 75 80 Pro Arg Phe Glu Thr Ile Thr Tyr Arg Glu Leu Trp Ala Arg Ala Gly 85 90 95 Thr Leu Ala Thr Ala Leu Ser Ala Glu Pro Ala Ile Arg Pro Gly Asp 100 105 110 Arg Val Cys Val Leu Gly Phe Asn Ser Val Asp Tyr Thr Thr Ile Asp 115 120 125 Ile Ala Leu Ile Arg Leu Gly Ala Val Ser Val Pro Leu Gln Thr Ser 130 135 140 Ala Pro Val Thr Gly Leu Arg Pro Ile Val Thr Glu Thr Glu Pro Thr 145 150 155 160 Met Ile Ala Thr Ser Ile Asp Asn Leu Gly Asp Ala Val Glu Val Leu 165 170 175 Ala Gly His Ala Pro Ala Arg Leu Val Val Phe Asp Tyr His Gly Lys 180 185 190 Val Asp Thr His Arg Glu Ala Val Glu Ala Ala Arg Ala Arg Leu Ala 195 200 205 Gly Ser Val Thr Ile Asp Thr Leu Ala Glu Leu Ile Glu Arg Gly Arg 210 215 220 Ala Leu Pro Ala Thr Pro Ile Ala Asp Ser Ala Asp Asp Ala Leu Ala 225 230 235 240 Leu Leu Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ala Pro Lys Gly Ala Met 245 250 255 Tyr Arg Glu Ser Gln Val Met Ser Phe Trp Arg Lys Ser Ser Gly Trp 260 265 270 Phe Glu Pro Ser Gly Tyr Pro Ser Ile Thr Leu Asn Phe Met Pro Met 275 280 285 Ser His Val Gly Gly Arg Gln Val Leu Tyr Gly Thr Leu Ser Asn Gly 290 295 300 Gly Thr Ala Tyr Phe Val Ala Lys Ser Asp Leu Ser Thr Leu Phe Glu 305 310 315 320 Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu Leu Cys Phe Val Pro Arg Ile 325 330 335 Trp Asp Met Val Phe Ala Glu Phe His Ser Glu Val Asp Arg Arg Leu 340 345 350 Val Asp Gly Ala Asp Arg Ala Ala Leu Glu Ala Gln Val Lys Ala Glu 355 360 365 Leu Arg Glu Asn Val Leu Gly Gly Arg Phe Val Met Ala Leu Thr Gly 370 375 380 Ser Ala Pro Ile Ser Ala Glu Met Thr Ala Trp Val Glu Ser Leu Leu 385 390 395 400 Ala Asp Val His Leu Val Glu Gly Tyr Gly Ser Thr Glu Ala Gly 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820 825 830 Leu Gly Ala Gly Arg Leu Glu Val Leu Ala Gly Asp Lys Gly Glu Ala 835 840 845 Asp Leu Gly Leu Asp Arg Val Thr Trp Gln Arg Leu Ala Asp Thr Val 850 855 860 Asp Leu Ile Val Asp Pro Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr 865 870 875 880 Ser Gln Leu Phe Gly Pro Asn Ala Ala Gly Thr Ala Glu Leu Leu Arg 885 890 895 Leu Ala Leu Thr Gly Lys Arg Lys Pro Tyr Ile Tyr Thr Ser Thr Ile 900 905 910 Ala Val Gly Glu Gln Ile Pro Pro Glu Ala Phe Thr Glu Asp Ala Asp 915 920 925 Ile Arg Ala Ile Ser Pro Thr Arg Arg Ile Asp Asp Ser Tyr Ala Asn 930 935 940 Gly Tyr Ala Asn Ser Lys Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala 945 950 955 960 His Glu Gln Cys Gly Leu Pro Val Thr Val Phe Arg Cys Asp Met Ile 965 970 975 Leu Ala Asp Thr Ser Tyr Thr Gly Gln Leu Asn Leu Pro Asp Met Phe 980 985 990 Thr Arg Leu Met Leu Ser Leu Ala Ala Thr Gly Ile Ala Pro Gly Ser 995 1000 1005 Phe Tyr Glu Leu Asp Ala His Gly Asn Arg Gln Arg Ala His Tyr 1010 1015 1020 Asp Gly Leu Pro Val Glu Phe Val Ala Glu Ala Ile Cys Thr Leu 1025 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tcctgacatg 240 ggttttgccc agaaattttt cgagcgcttg cacgagaact tcaaagcggc ggctgcggaa 300 ggcaaggtcg tcacctgcct actgattcaa tcgctaatca tcgagtgctt tgcgatcgcg 360 gcttacaaca tctacatccc agtggcggat gcttttgccc gcaaaatcac ggagggggtc 420 gtgcgcgacg aatacctgca ccgcaacttc ggtgaagagt ggctgaaggc gaattttgat 480 gcttccaaag ccgaactgga agaagccaat cgtcagaacc tgcccttggt ttggctaatg 540 ctcaacgaag tggccgatga tgctcgcgaa ctcgggatgg agcgtgagtc gctcgtcgag 600 gactttatga ttgcctacgg tgaagctctg gaaaacatcg gcttcacaac gcgcgaaatc 660 atgcgtatgt ccgcctatgg ccttgcggcc gtttga 696 <210> 36 <211> 231 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 36 Met Pro Gln Leu Glu Ala Ser Leu Glu Leu Asp Phe Gln Ser Glu Ser 1 5 10 15 Tyr Lys Asp Ala Tyr Ser Arg Ile Asn Ala Ile Val Ile Glu Gly Glu 20 25 30 Gln Glu Ala Phe Asp Asn Tyr Asn Arg Leu Ala Glu Met Leu Pro Asp 35 40 45 Gln Arg Asp Glu Leu His Lys Leu Ala Lys Met Glu Gln Arg His Met 50 55 60 Lys Gly Phe Met Ala Cys Gly Lys Asn Leu Ser Val Thr Pro Asp Met 65 70 75 80 Gly Phe Ala Gln Lys Phe Phe Glu Arg Leu His Glu Asn Phe Lys Ala 85 90 95 Ala Ala Ala Glu Gly Lys Val Val Thr Cys Leu Leu Ile Gln Ser Leu 100 105 110 Ile Ile Glu Cys Phe Ala Ile Ala Ala Tyr Asn Ile Tyr Ile Pro Val 115 120 125 Ala Asp Ala Phe Ala Arg Lys Ile Thr Glu Gly Val Val Arg Asp Glu 130 135 140 Tyr Leu His Arg Asn Phe Gly Glu Glu Trp Leu Lys Ala Asn Phe Asp 145 150 155 160 Ala Ser Lys Ala Glu Leu Glu Glu Ala Asn Arg Gln Asn Leu Pro Leu 165 170 175 Val Trp Leu Met Leu Asn Glu Val Ala Asp Asp Ala Arg Glu Leu Gly 180 185 190 Met Glu Arg Glu Ser Leu Val Glu Asp Phe Met Ile Ala Tyr Gly Glu 195 200 205 Ala Leu Glu Asn Ile Gly Phe Thr Thr Arg Glu Ile Met Arg Met Ser 210 215 220 Ala Tyr Gly Leu Ala Ala Val 225 230 <210> 37 <211> 1029 <212> DNA <213> Synechococcus elongatus <400> 37 atggcattcg gtcttatcgg tcatctcacc agtttggagc aggcccgcga cgtttctcgc 60 aggatgggct acgacgaata cgccgatcaa ggattggagt tttggagtag cgctcctcct 120 caaatcgttg atgaaatcac agtcaccagt gccacaggca aggtgattca cggtcgctac 180 atcgaatcgt gtttcttgcc ggaaatgctg gcggcgcgcc gcttcaaaac agccacgcgc 240 aaagttctca atgccatgtc ccatgcccaa aaacacggca tcgacatctc ggccttgggg 300 ggctttacct cgattatttt cgagaatttc gatttggcca gtttgcggca agtgcgcgac 360 actaccttgg agtttgaacg gttcaccacc ggcaatactc acacggccta cgtaatctgt 420 agacaggtgg aagccgctgc taaaacgctg ggcatcgaca ttacccaagc gacagtagcg 480 gttgtcggcg cgactggcga tatcggtagc gctgtctgcc gctggctcga cctcaaactg 540 ggtgtcggtg atttgatcct gacggcgcgc aatcaggagc gtttggataa cctgcaggct 600 gaactcggcc ggggcaagat tctgcccttg gaagccgctc tgccggaagc tgactttatc 660 gtgtgggtcg ccagtatgcc tcagggcgta gtgatcgacc cagcaaccct gaagcaaccc 720 tgcgtcctaa tcgacggggg ctaccccaaa aacttgggca gcaaagtcca aggtgagggc 780 atctatgtcc tcaatggcgg ggtagttgaa cattgcttcg acatcgactg gcagatcatg 840 tccgctgcag agatggcgcg gcccgagcgc cagatgtttg cctgctttgc cgaggcgatg 900 ctcttggaat ttgaaggctg gcatactaac ttctcctggg gccgcaacca aatcacgatc 960 gagaagatgg aagcgatcgg tgaggcatcg gtgcgccacg gcttccaacc cttggcattg 1020 gcaatttga 1029 <210> 38 <211> 342 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 38 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Leu Thr Ser Leu Glu Gln Ala Arg 1 5 10 15 Asp Val Ser Arg Arg Met Gly Tyr Asp Glu Tyr Ala Asp Gln Gly Leu 20 25 30 Glu Phe Trp Ser Ser Ala Pro Pro Gln Ile Val Asp Glu Ile Thr Val 35 40 45 Thr Ser Ala Thr Gly Lys Val Ile His Gly Arg Tyr Ile Glu Ser Cys 50 55 60 Phe Leu Pro Glu Met Leu Ala Ala Arg Arg Phe Lys Thr Ala Thr Arg 65 70 75 80 Lys Val Leu Asn Ala Met Ser His Ala Gln Lys His Gly Ile Asp Ile 85 90 95 Ser Ala Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asp Leu 100 105 110 Ala Ser Leu Arg Gln Val Arg Asp Thr Thr Leu Glu Phe Glu Arg Phe 115 120 125 Thr Thr Gly Asn Thr His Thr Ala Tyr Val Ile Cys Arg Gln Val Glu 130 135 140 Ala Ala Ala Lys Thr Leu Gly Ile Asp Ile Thr Gln Ala Thr Val Ala 145 150 155 160 Val Val Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu 165 170 175 Asp Leu Lys Leu Gly Val Gly Asp Leu Ile Leu Thr Ala Arg Asn Gln 180 185 190 Glu Arg Leu Asp Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Arg Gly Lys Ile Leu 195 200 205 Pro Leu Glu Ala Ala Leu Pro Glu Ala Asp Phe Ile Val Trp Val Ala 210 215 220 Ser Met Pro Gln Gly Val Val Ile Asp Pro Ala Thr Leu Lys Gln Pro 225 230 235 240 Cys Val Leu Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Gly Ser Lys Val 245 250 255 Gln Gly Glu Gly Ile Tyr Val Leu Asn Gly Gly Val Val Glu His Cys 260 265 270 Phe Asp Ile Asp Trp Gln Ile Met Ser Ala Ala Glu Met Ala Arg Pro 275 280 285 Glu Arg Gln Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Leu Leu Glu Phe 290 295 300 Glu Gly Trp His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Gln Ile Thr Ile 305 310 315 320 Glu Lys Met Glu Ala Ile Gly Glu Ala Ser Val Arg His Gly Phe Gln 325 330 335 Pro Leu Ala Leu Ala Ile 340 <210> 39 <211> 717 <212> DNA <213> Prochlorococcus mariunus <400> 39 atgcaaacac tcgaatctaa taaaaaaact aatctagaaa attctattga tttacccgat 60 tttactactg attcttacaa agacgcttat agcaggataa atgcaatagt tattgaaggt 120 gaacaagagg ctcatgataa ttacatttcc ttagcaacat taattcctaa cgaattagaa 180 gagttaacta aattagcgaa aatggagctt aagcacaaaa gaggctttac tgcatgtgga 240 agaaatctag gtgttcaagc tgacatgatt tttgctaaag aattcttttc caaattacat 300 ggtaattttc aggttgcgtt atctaatggc aagacaacta catgcctatt aatacaggca 360 attttaattg aagcttttgc tatatccgcg tatcacgttt acataagagt tgctgatcct 420 ttcgcgaaaa aaattaccca aggtgttgtt aaagatgaat atcttcattt aaattatgga 480 caagaatggc taaaagaaaa tttagcgact tgtaaagatg agctaatgga agcaaataag 540 gttaaccttc cattaatcaa gaagatgtta gatcaagtct cggaagatgc ttcagtacta 600 gctatggata gggaagaatt aatggaagaa ttcatgattg cctatcagga cactctcctt 660 gaaataggtt tagataatag agaaattgca agaatggcaa tggctgctat agtttaa 717 <210> 40 <211> 238 <212> PRT <213> Prochlorococcus mariunus <400> 40 Met Gln Thr Leu Glu Ser Asn Lys Lys Thr Asn Leu Glu Asn Ser Ile 1 5 10 15 Asp Leu Pro Asp Phe Thr Thr Asp Ser Tyr Lys Asp Ala Tyr Ser Arg 20 25 30 Ile Asn Ala Ile Val Ile Glu Gly Glu Gln Glu Ala His Asp Asn Tyr 35 40 45 Ile Ser Leu Ala Thr Leu Ile Pro Asn Glu Leu Glu Glu Leu Thr Lys 50 55 60 Leu Ala Lys Met Glu Leu Lys His Lys Arg Gly Phe Thr Ala 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aaaatgtaga ggttaaaagt gctataggta tatcaattga aggttcttat 180 attgattcat gtttcgttcc tgaaatgctt tcaagattta aaacggcaag aagaaaagta 240 ttaaatgcaa tggaattagc tcaaaaaaaa ggtattaata ttaccgcttt gggggggttc 300 acttctatca tctttgaaaa ttttaatctc cttcaacata agcagattag aaacacttca 360 ctagagtggg aaaggtttac aactggtaat actcatactg cgtgggttat ttgcaggcaa 420 ttagagatga atgctcctaa aataggtatt gatcttaaaa gcgcaacagt tgctgtagtt 480 ggtgctactg gagatatagg cagtgctgtt tgtcgatggt taatcaataa aacaggtatt 540 ggggaacttc ttttggtagc taggcaaaag gaacccttgg attctttgca aaaggaatta 600 gatggtggaa ctatcaaaaa tctagatgaa gcattgcctg aagcagatat tgttgtatgg 660 gtagcaagta tgccaaagac aatggaaatc gatgctaata atcttaaaca accatgttta 720 atgattgatg gaggttatcc aaagaatcta gatgaaaaat ttcaaggaaa taatatacat 780 gttgtaaaag gaggtatagt aagattcttc aatgatatag gttggaatat gatggaacta 840 gctgaaatgc aaaatcccca gagagaaatg tttgcatgct ttgcagaagc aatgatttta 900 gaatttgaaa aatgtcatac aaactttagc tggggaagaa ataatatatc tctcgagaaa 960 atggagttta ttggagctgc ttctgtaaag catggcttct ctgcaattgg cctagataag 1020 catccaaaag tactagcagt ttga 1044 <210> 42 <211> 347 <212> PRT <213> Prochlorococcus mariunus <400> 42 Met Ala Phe Gly Leu Ile Gly His Ser Thr Ser Phe Glu Asp Ala Lys 1 5 10 15 Arg Lys Ala Ser Leu Leu Gly Phe Asp His Ile Ala Asp Gly Asp Leu 20 25 30 Asp Val Trp Cys Thr Ala Pro Pro Gln Leu Val Glu Asn Val Glu Val 35 40 45 Lys Ser Ala Ile Gly Ile Ser Ile Glu Gly Ser Tyr Ile Asp Ser Cys 50 55 60 Phe Val Pro Glu Met Leu Ser Arg Phe Lys Thr Ala Arg Arg Lys Val 65 70 75 80 Leu Asn Ala Met Glu Leu Ala Gln Lys Lys Gly Ile Asn Ile Thr Ala 85 90 95 Leu Gly Gly Phe Thr Ser Ile Ile Phe Glu Asn Phe Asn Leu Leu Gln 100 105 110 His Lys Gln Ile Arg Asn Thr Ser Leu Glu Trp Glu Arg Phe Thr Thr 115 120 125 Gly Asn Thr His Thr Ala Trp Val Ile Cys Arg Gln Leu Glu Met Asn 130 135 140 Ala Pro Lys Ile Gly Ile Asp Leu Lys Ser Ala Thr Val Ala Val Val 145 150 155 160 Gly Ala Thr Gly Asp Ile Gly Ser Ala Val Cys Arg Trp Leu Ile Asn 165 170 175 Lys Thr Gly Ile Gly Glu Leu Leu Leu Val Ala Arg Gln Lys Glu Pro 180 185 190 Leu Asp Ser Leu Gln Lys Glu Leu Asp Gly Gly Thr Ile Lys Asn Leu 195 200 205 Asp Glu Ala Leu Pro Glu Ala Asp Ile Val Val Trp Val Ala Ser Met 210 215 220 Pro Lys Thr Met Glu Ile Asp Ala Asn Asn Leu Lys Gln Pro Cys Leu 225 230 235 240 Met Ile Asp Gly Gly Tyr Pro Lys Asn Leu Asp Glu Lys Phe Gln Gly 245 250 255 Asn Asn Ile His Val Val Lys Gly Gly Ile Val Arg Phe Phe Asn Asp 260 265 270 Ile Gly Trp Asn Met Met Glu Leu Ala Glu Met Gln Asn Pro Gln Arg 275 280 285 Glu Met Phe Ala Cys Phe Ala Glu Ala Met Ile Leu Glu Phe Glu Lys 290 295 300 Cys His Thr Asn Phe Ser Trp Gly Arg Asn Asn Ile Ser Leu Glu Lys 305 310 315 320 Met Glu Phe Ile Gly Ala Ala Ser Val Lys His Gly Phe Ser Ala Ile 325 330 335 Gly Leu Asp Lys His Pro Lys Val Leu Ala Val 340 345 <210> 43 <211> 255 <212> DNA <213> Nostoc punctiforme <400> 43 atgagccaaa cggaactttt tgaaaaggtc aagaaaatcg tcatcgaaca actgagtgtt 60 gaagatgctt ccaaaatcac tccacaagct aagtttatgg aagatttagg agctgattcc 120 ctggatactg ttgaactcgt gatggctttg gaagaagaat ttgatatcga aattcccgac 180 gaagctgccg agcagattgt atcggttcaa gacgcagtag attacatcaa taacaaagtt 240 gctgcatcag cttaa 255 <210> 44 <211> 84 <212> PRT <213> Nostoc punctiforme <400> 44 Met Ser Gln Thr Glu Leu Phe Glu Lys Val Lys Lys Ile Val Ile Glu 1 5 10 15 Gln Leu Ser Val Glu Asp Ala Ser Lys Ile Thr Pro Gln Ala Lys Phe 20 25 30 Met Glu Asp Leu Gly Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met 35 40 45 Ala Leu Glu Glu Glu Phe Asp Ile Glu Ile Pro Asp Glu Ala Ala Glu 50 55 60 Gln Ile Val Ser Val Gln Asp Ala Val Asp Tyr Ile Asn Asn Lys Val 65 70 75 80 Ala Ala Ser Ala <210> 45 <211> 234 <212> DNA <213> Synechocystis sp. <400> 45 atgaatcagg aaatttttga aaaagtaaaa aaaatcgtcg tggaacagtt ggaagtggat 60 cctgacaaag tgacccccga tgccaccttt gccgaagatt taggggctga ttccctcgat 120 acagtggaat tggtcatggc cctggaagaa gagtttgata ttgaaattcc cgatgaagtg 180 gcggaaacca ttgataccgt gggcaaagcc gttgagcata tcgaaagtaa ataa 234 <210> 46 <211> 77 <212> PRT <213> Synechocystis sp. <400> 46 Met Asn Gln Glu Ile Phe Glu Lys Val Lys Lys Ile Val Val Glu Gln 1 5 10 15 Leu Glu Val Asp Pro Asp Lys Val Thr Pro Asp Ala Thr Phe Ala Glu 20 25 30 Asp Leu Gly Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met Ala Leu 35 40 45 Glu Glu Glu Phe Asp Ile Glu Ile Pro Asp Glu Val Ala Glu Thr Ile 50 55 60 Asp Thr Val Gly Lys Ala Val Glu His Ile Glu Ser Lys 65 70 75 <210> 47 <211> 243 <212> DNA <213> Prochlorococcus marinus <400> 47 atgtcacaag aagaaatcct tcaaaaagta tgctctattg tttctgagca actaagtgtt 60 gaatcagccg aagtaaaatc tgattcaaac tttcaaaatg atttaggtgc agactcccta 120 gacaccgtag agctagttat ggctcttgaa gaagcatttg atatcgagat acctgatgaa 180 gcagctgaag gtatcgcaac agtaggagat gctgttaaat tcatcgaaga aaaaaaaggt 240 taa 243 <210> 48 <211> 80 <212> PRT <213> Prochlorococcus marinus <400> 48 Met Ser Gln Glu Glu Ile Leu Gln Lys Val Cys Ser Ile Val Ser Glu 1 5 10 15 Gln Leu Ser Val Glu Ser Ala Glu Val Lys Ser Asp Ser Asn Phe Gln 20 25 30 Asn Asp Leu Gly Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met Ala 35 40 45 Leu Glu Glu Ala Phe Asp Ile Glu Ile Pro Asp Glu Ala Ala Glu Gly 50 55 60 Ile Ala Thr Val Gly Asp Ala Val Lys Phe Ile Glu Glu Lys Lys Gly 65 70 75 80 <210> 49 <211> 243 <212> DNA <213> Synechococcus elongatus <400> 49 atgagccaag aagacatctt cagcaaagtc aaagacattg tggctgagca gctgagtgtg 60 gatgtggctg aagtcaagcc agaatccagc ttccaaaacg atctgggagc ggactcgctg 120 gacaccgtgg aactggtgat ggctctggaa gaggctttcg atatcgaaat ccccgatgaa 180 gccgctgaag gcattgcgac cgttcaagac gccgtcgatt tcatcgctag caaagctgcc 240 tag 243 <210> 50 <211> 80 <212> PRT <213> Synechococcus elongatus <400> 50 Met Ser Gln Glu Asp Ile Phe Ser Lys Val Lys Asp Ile Val Ala Glu 1 5 10 15 Gln Leu Ser Val Asp Val Ala Glu Val Lys Pro Glu Ser Ser Phe Gln 20 25 30 Asn Asp Leu Gly Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met Ala 35 40 45 Leu Glu Glu Ala Phe Asp Ile Glu Ile Pro Asp Glu Ala Ala Glu Gly 50 55 60 Ile Ala Thr Val Gln Asp Ala Val Asp Phe Ile Ala Ser Lys Ala Ala 65 70 75 80 <210> 51 <211> 255 <212> DNA <213> Nostoc sp. <400> 51 atgagccaat cagaaacttt tgaaaaagtc aaaaaaattg ttatcgaaca actaagtgtg 60 gagaaccctg acacagtaac tccagaagct agttttgcca acgatttaca ggctgattcc 120 ctcgatacag tagaactagt aatggctttg gaagaagaat ttgatatcga aattcccgat 180 gaagccgcag agaaaattac cactgttcaa gaagcggtgg attacatcaa taaccaagtt 240 gccgcatcag cttaa 255 <210> 52 <211> 84 <212> PRT <213> Nostoc sp. <400> 52 Met Ser Gln Ser Glu Thr Phe Glu Lys Val Lys Lys Ile Val Ile Glu 1 5 10 15 Gln Leu Ser Val Glu Asn Pro Asp Thr Val Thr Pro Glu Ala Ser Phe 20 25 30 Ala Asn Asp Leu Gln Ala Asp Ser Leu Asp Thr Val Glu Leu Val Met 35 40 45 Ala Leu Glu Glu Glu Phe Asp Ile Glu Ile Pro Asp Glu Ala Ala Glu 50 55 60 Lys Ile Thr Thr Val Gln Glu Ala Val Asp Tyr Ile Asn Asn Gln Val 65 70 75 80 Ala Ala Ser Ala <210> 53 <211> 675 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 53 atgaagattt acggaattta tatggaccgc ccgctttcac aggaagaaaa tgaacggttc 60 atgactttca tatcacctga aaaacgggag aaatgccgga gattttatca taaagaagat 120 gctcaccgca ccctgctggg agatgtgctc gttcgctcag tcataagcag gcagtatcag 180 ttggacaaat ccgatatccg ctttagcacg caggaatacg ggaagccgtg catccctgat 240 cttcccgacg ctcatttcaa catttctcac tccggccgct gggtcattgg tgcgtttgat 300 tcacagccga tcggcataga tatcgaaaaa acgaaaccga tcagccttga gatcgccaag 360 cgcttctttt caaaaacaga gtacagcgac cttttagcaa aagacaagga cgagcagaca 420 gactattttt atcatctatg gtcaatgaaa gaaagcttta tcaaacagga aggcaaaggc 480 ttatcgcttc cgcttgattc cttttcagtg cgcctgcatc aggacggaca agtatccatt 540 gagcttccgg acagccattc cccatgctat atcaaaacgt atgaggtcga tcccggctac 600 aaaatggctg tatgcgccgc acaccctgat ttccccgagg atatcacaat ggtctcgtac 660 gaagagcttt tataa 675 <210> 54 <211> 224 <212> PRT <213> Bacillus subtilis <400> 54 Met Lys Ile Tyr Gly Ile Tyr Met Asp Arg Pro Leu Ser Gln Glu Glu 1 5 10 15 Asn Glu Arg Phe Met Thr Phe Ile Ser Pro Glu Lys Arg Glu Lys Cys 20 25 30 Arg Arg Phe Tyr His Lys Glu Asp Ala His Arg Thr Leu Leu Gly Asp 35 40 45 Val Leu Val Arg Ser Val Ile Ser Arg Gln Tyr Gln Leu Asp Lys Ser 50 55 60 Asp Ile Arg Phe Ser Thr Gln Glu Tyr Gly Lys Pro Cys Ile Pro Asp 65 70 75 80 Leu Pro Asp Ala His Phe Asn Ile Ser His Ser Gly Arg Trp Val Ile 85 90 95 Gly Ala Phe Asp Ser Gln Pro Ile Gly Ile Asp Ile Glu Lys Thr Lys 100 105 110 Pro Ile Ser Leu Glu Ile Ala Lys Arg Phe Phe Ser Lys Thr Glu Tyr 115 120 125 Ser Asp Leu Leu Ala Lys Asp Lys Asp Glu Gln Thr Asp Tyr Phe Tyr 130 135 140 His Leu Trp Ser Met Lys Glu Ser Phe Ile Lys Gln Glu Gly Lys Gly 145 150 155 160 Leu Ser Leu Pro Leu Asp Ser Phe Ser Val Arg Leu His Gln Asp Gly 165 170 175 Gln Val Ser Ile Glu Leu Pro Asp Ser His Ser Pro Cys Tyr Ile Lys 180 185 190 Thr Tyr Glu Val Asp Pro Gly Tyr Lys Met Ala Val Cys Ala Ala His 195 200 205 Pro Asp Phe Pro Glu Asp Ile Thr Met Val Ser Tyr Glu Glu Leu Leu 210 215 220 <210> 55 <211> 867 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 55 ttgggcgtgt cgcccttaaa gcgcgctttt cgacgcgacc ccactacatt ggcttccatg 60 aacgttgaca tttcacgatc cagagagccg ctaaacgttg agctcctgaa ggaaaaattg 120 ctccaaaacg gtgactttgg ccaggtcatt tacgaaaaag tgacaggctc cactaatgct 180 gacttgctgg cacttgcagg ttctggcgct ccaaactgga cggtgaaaac tgtcgagttt 240 caagatcatg cgcgtgggcg actcggccgc ccgtggtctg cccctgaggg ttcccaaaca 300 atcgtgtctg tgctcgttca actatctatt gatcaagtgg accggattgg cactattcca 360 ctcgcggcgg gactcgctgt catggatgcg ttgaatgacc tcggtgtgga aggtgccgga 420 ctgaaatggc ccaacgatgt tcaaatccac ggcaagaaac tctgcggcat cctggtggaa 480 gccaccggct ttgattccac cccaacagtt gtcatcggtt ggggcactaa tatcagcctg 540 actaaagagg agcttcctgt tcctcatgca acttccctcg cattggaagg tgttgaagtc 600 gacagaacca cattccttat taatatgctc acacatctgc atactcgact ggaccagtgg 660 cagggtccaa gtgtggattg gctcgatgat taccgtgcgg tatgttccag tattggccaa 720 gatgttcgag tgcttctacc tggggataaa gaactcttag gtgaagcgat cggtgtcgcg 780 actggcggag aaattcgtgt tcgcgatgct tcgggcaccg ttcacaccct caacgccggt 840 gaaattacgc accttcgcct gcagtaa 867 <210> 56 <211> 810 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 56 atgaatgttg acattagccg ctctcgtgaa ccgttgaacg tggaactgtt gaaagaaaaa 60 ctgctgcaga acggtgattt cggtcaagtg atctacgaga aggtcaccgg ctctaccaat 120 gcggacctgc tggctctggc gggcagcggc gctccaaact ggaccgtcaa gactgttgaa 180 tttcaggacc acgcccgtgg ccgtctgggt cgtccgtgga gcgcaccgga gggttcccaa 240 accatcgtca gcgttctggt ccaactgagc attgatcagg tggaccgtat tggtacgatc 300 ccgctggccg caggcttggc tgttatggat gcgctgaatg atctgggcgt ggagggtgca 360 ggcctgaaat ggccgaacga tgttcagatc cacggtaaga agttgtgcgg tattctggtt 420 gaagcaaccg gcttcgactc cactccgacc gtggttatcg gttggggtac gaatatctcg 480 ttgacgaaag aagagctgcc ggtcccgcac gcgaccagcc tggccctgga gggtgttgaa 540 gttgaccgta cgacgttcct gattaacatg ctgacccatc tgcatacccg tctggatcag 600 tggcagggtc cgtctgtgga ctggctggat gactatcgcg cggtttgtag cagcattggc 660 caagatgtgc gtgtcctgct gcctggtgac aaagagctgc tgggcgaggc gattggcgtg 720 gcgaccggtg gtgagatccg tgtgcgcgac gccagcggca cggtccacac gctgaatgcg 780 ggtgaaatca cgcatctgcg tttgcaataa 810 <210> 57 <211> 269 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 57 Met Asn Val Asp Ile Ser Arg Ser Arg Glu Pro Leu Asn Val Glu Leu 1 5 10 15 Leu Lys Glu Lys Leu Leu Gln Asn 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cccggcttga ggccatgtat 3300 ccggtatcgc taatcgctca cggcggcgcc ctgaacatca cctgcctgag ctatgccgga 3360 tcgctgaatt tcggttttac cggctgtcgg gatacgctgc cgagcatgca gaaactggcg 3420 gtttataccg gtgaagctct ggatgagctg gaatcgctga ttctgccacc caagaagcgc 3480 gcccgaaccc gcaagtaact cgaggaggaa aactaaatga ccatttcctc acctttgatt 3540 gacgtcgcca accttccaga catcaacacc actgccggca agatcgccga ccttaaggct 3600 cgccgcgcgg aagcccattt ccccatgggt gaaaaggcag tagagaaggt ccacgctgct 3660 ggacgcctca ctgcccgtga gcgcttggat tacttactcg atgagggctc cttcatcgag 3720 accgatcagc tggctcgcca ccgcaccacc gctttcggcc tgggcgctaa gcgtcctgca 3780 accgacggca tcgtgaccgg ctggggcacc attgatggac gcgaagtctg catcttctcg 3840 caggacggca ccgtattcgg tggcgcgctt ggtgaggtgt acggcgaaaa gatgatcaag 3900 atcatggagc tggcaatcga caccggccgc ccattgatcg gtctttacga aggcgctggc 3960 gctcgtattc aggacggcgc tgtctccctg gacttcattt cccagacctt ctaccaaaac 4020 attcaggctt ctggcgttat cccacagatc tccgtcatca tgggcgcatg tgcaggtggc 4080 aacgcttacg gcccagctct gaccgacttc gtggtcatgg tggacaagac ctccaagatg 4140 ttcgttaccg gcccagacgt gatcaagacc gtcaccggcg aggaaatcac ccaggaagag 4200 cttggcggag caaccaccca catggtgacc gctggtaact cccactacac cgctgcgacc 4260 gatgaggaag cactggattg ggtacaggac ctggtgtcct tcctcccatc caacaatcgc 4320 tcctacgcac cgatggaaga cttcgacgag gaagaaggcg gcgttgaaga aaacatcacc 4380 gctgacgatc tgaagctcga cgagatcatc ccagattccg cgaccgttcc ttacgacgtc 4440 cgcgatgtca tcgaatgcct caccgacgat ggcgaatacc tggaaatcca ggcagaccgc 4500 gcagaaaacg ttgttattgc attcggccgc atcgaaggcc agtccgttgg ctttgttgcc 4560 aaccagccaa cccagttcgc tggctgcctg gacatcgact cctctgagaa ggcagctcgc 4620 ttcgtccgca cctgcgacgc gttcaacatc ccaatcgtca tgcttgtcga cgtccccggc 4680 ttcctcccag gcgcaggcca ggagtacggt ggcattctgc gtcgtggcgc aaagctgctc 4740 tacgcatacg gcgaagcaac cgttccaaag atcaccgtca ccatgcgtaa ggcttacggc 4800 ggagcgtact gcgtgatggg ttccaagggc ttgggctctg acatcaacct tgcatggcca 4860 accgcacaga tcgccgtcat gggcgctgct ggcgcagttg gattcatcta ccgcaaggag 4920 ctcatggcag ctgatgccaa gggcctcgat accgtagctc tggctaagtc cttcgagcgc 4980 gagtatgaag accacatgct caacccgtac cacgctgcag aacgtggcct gatcgacgcc 5040 gtgatcctgc caagcgaaac ccgcggacag atttcccgca accttcgcct gctcaagcac 5100 aagaacgtca ctcgccctgc tcgcaagcac ggcaacatgc cactgtaagg aggaaaacta 5160 aatgtcagtc gagactcgca agatcaccaa ggttcttgtc gctaaccgtg gtgagattgc 5220 aatccgcgtg ttccgtgcag ctcgagatga aggcatcgga tctgtcgccg tctacgcaga 5280 gccagatgca gatgcaccat tcgtgtcata tgcagacgag gcttttgccc tcggtggcca 5340 aacatccgct gagtcctacc ttgtcattga caagatcatc gatgcggccc gcaagtccgg 5400 cgccgacgcc atccaccccg gctacggctt cctcgcagaa aacgctgact tcgcagaagc 5460 agtcatcaac gaaggcctga tctggattgg accttcacct gagtccatcc gctccctcgg 5520 cgacaaggtc accgctcgcc acatcgcaga taccgccaag gctccaatgg ctcctggcac 5580 caaggaacca gtaaaagacg cagcagaagt tgtggctttc gctgaagaat tcggtctccc 5640 aatcgccatc aaggcagctt tcggtggcgg cggacgtggc atgaaggttg cctacaagat 5700 ggaagaagtc gctgacctct tcgagtccgc aacccgtgaa gcaaccgcag cgttcggccg 5760 cggcgagtgc ttcgtggagc gctacctgga caaggcacgc cacgttgagg ctcaggtcat 5820 cgccgataag cacggcaacg ttgttgtcgc cggaacccgt gactgctccc tgcagcgccg 5880 tttccagaag ctcgtcgaag aagcaccagc accattcctc accgatgacc agcgcgagcg 5940 tctccactcc tccgcgaagg ctatctgtaa ggaagctggc tactacggtg caggcaccgt 6000 tgagtacctc gttggctccg acggcctgat ctccttcctc gaggtcaaca cccgcctcca 6060 ggtggaacac ccagtcaccg aagagaccac cggcatcgac ctggtccgcg aaatgttccg 6120 catcgcagaa ggccacgagc tctccatcaa ggaagatcca gctccacgcg gccacgcatt 6180 cgagttccgc atcaacggcg aagacgctgg ctccaacttc atgcctgcac caggcaagat 6240 caccagctac cgcgagccac agggcccagg cgtccgcatg gactccggtg tcgttgaagg 6300 ttccgaaatc tccggacagt tcgactccat gctggcaaag ctgatcgttt ggggcgacac 6360 ccgcgagcag gctctccagc gctcccgccg tgcacttgca gagtacgttg tcgagggcat 6420 gccaaccgtt atcccattcc accagcacat cgtggaaaac ccagcattcg tgggcaacga 6480 cgaaggcttc gagatctaca ccaagtggat cgaagaggtt tgggataacc caatcgcacc 6540 ttacgttgac gcttccgagc tcgacgaaga tgaggacaag accccagcac agaaggttgt 6600 tgtggagatc aacggccgtc gcgttgaggt tgcactccca ggcgatctgg cactcggtgg 6660 caccgctggt cctaagaaga aggccaagaa gcgtcgcgca ggtggtgcaa aggctggcgt 6720 atccggcgat gcagtggcag ctccaatgca gggcactgtc atcaaggtca acgtcgaaga 6780 aggcgctgaa gtcaacgaag gcgacaccgt tgttgtcctc gaggctatga agatggaaaa 6840 ccctgtgaag gctcataagt ccggaaccgt aaccggcctt actgtcgctg caggcgaggg 6900 tgtcaacaag ggcgttgttc tcctcgagat caagtaatct agaggaggaa aactaaatga 6960 atgttgacat tagccgctct cgtgaaccgt tgaacgtgga actgttgaaa gaaaaactgc 7020 tgcagaacgg tgatttcggt caagtgatct acgagaaggt caccggctct accaatgcgg 7080 acctgctggc tctggcgggc agcggcgctc caaactggac cgtcaagact gttgaatttc 7140 aggaccacgc ccgtggccgt ctgggtcgtc cgtggagcgc accggagggt tcccaaacca 7200 tcgtcagcgt tctggtccaa ctgagcattg atcaggtgga ccgtattggt acgatcccgc 7260 tggccgcagg cttggctgtt atggatgcgc tgaatgatct gggcgtggag ggtgcaggcc 7320 tgaaatggcc gaacgatgtt cagatccacg gtaagaagtt gtgcggtatt ctggttgaag 7380 caaccggctt cgactccact ccgaccgtgg ttatcggttg gggtacgaat atctcgttga 7440 cgaaagaaga gctgccggtc ccgcacgcga ccagcctggc cctggagggt gttgaagttg 7500 accgtacgac gttcctgatt aacatgctga cccatctgca tacccgtctg gatcagtggc 7560 agggtccgtc tgtggactgg ctggatgact atcgcgcggt ttgtagcagc attggccaag 7620 atgtgcgtgt cctgctgcct ggtgacaaag agctgctggg cgaggcgatt ggcgtggcga 7680 ccggtggtga gatccgtgtg cgcgacgcca gcggcacggt ccacacgctg aatgcgggtg 7740 aaatcacgca tctgcgtttg caataagttt aaacggtctc cagcttggct gttttggcgg 7800 atgagagaag attttcagcc tgatacagat taaatcagaa cgcagaagcg gtctgataaa 7860 acagaatttg cctggcggca gtagcgcggt ggtcccacct gaccccatgc cgaactcaga 7920 agtgaaacgc cgtagcgccg atggtagtgt ggggtctccc catgcgagag tagggaactg 7980 ccaggcatca aataaaacga aaggctcagt cgaaagactg ggcctttcgt tttatctgtt 8040 gtttgtcggt gaacgctctc ctgacgcctg atgcggtatt ttctccttac gcatctgtgc 8100 ggtatttcac accgcatatg gtgcactctc agtacaatct gctctgatgc cgcatagtta 8160 agccagcccc gacacccgcc aacacccgct gacgagctta gtaaagccct cgctagattt 8220 taatgcggat gttgcgatta cttcgccaac tattgcgata acaagaaaaa gccagccttt 8280 catgatatat ctcccaattt gtgtagggct tattatgcac gcttaaaaat aataaaagca 8340 gacttgacct gatagtttgg ctgtgagcaa ttatgtgctt agtgcatcta acgcttgagt 8400 taagccgcgc cgcgaagcgg cgtcggcttg aacgaattgt tagacattat ttgccgacta 8460 ccttggtgat ctcgcctttc acgtagtgga caaattcttc caactgatct gcgcgcgagg 8520 ccaagcgatc ttcttcttgt ccaagataag cctgtctagc ttcaagtatg acgggctgat 8580 actgggccgg caggcgctcc attgcccagt cggcagcgac atccttcggc gcgattttgc 8640 cggttactgc gctgtaccaa atgcgggaca acgtaagcac tacatttcgc tcatcgccag 8700 cccagtcggg cggcgagttc catagcgtta aggtttcatt tagcgcctca aatagatcct 8760 gttcaggaac cggatcaaag agttcctccg ccgctggacc taccaaggca acgctatgtt 8820 ctcttgcttt tgtcagcaag atagccagat caatgtcgat cgtggctggc tcgaagatac 8880 ctgcaagaat gtcattgcgc tgccattctc caaattgcag ttcgcgctta gctggataac 8940 gccacggaat gatgtcgtcg tgcacaacaa tggtgacttc tacagcgcgg agaatctcgc 9000 tctctccagg ggaagccgaa gtttccaaaa ggtcgttgat caaagctcgc cgcgttgttt 9060 catcaagcct tacggtcacc gtaaccagca aatcaatatc actgtgtggc ttcaggccgc 9120 catccactgc ggagccgtac aaatgtacgg ccagcaacgt cggttcgaga tggcgctcga 9180 tgacgccaac tacctctgat agttgagtcg atacttcggc gatcaccgct tccctcatga 9240 tgtttaactt tgttttaggg cgactgccct gctgcgtaac atcgttgctg ctccataaca 9300 tcaaacatcg acccacggcg taacgcgctt gctgcttgga tgcccgaggc atagactgta 9360 ccccaaaaaa acagtcataa caagccatga aaaccgccac tgcgccgtta ccaccgctgc 9420 gttcggtcaa ggttctggac cagttgcgtg agcgcatacg ctacttgcat tacagcttac 9480 gaaccgaaca ggcttatgtc cactgggttc gtgccttcat ccgtttccac ggtgtgcgtc 9540 acccggcaac cttgggcagc agcgaagtcg aggcatttct gtcctggctg gcgaacgagc 9600 gcaaggtttc ggtctccacg catcgtcagg cattggcggc cttgctgttc ttctacggca 9660 aggtgctgtg cacggatctg ccctggcttc aggagatcgg aagacctcgg ccgtcgcggc 9720 gcttgccggt ggtgctgacc ccggatgaag tggttcgcat cctcggtttt ctggaaggcg 9780 agcatcgttt gttcgcccag cttctgtatg gaacgggcat gcggatcagt gagggtttgc 9840 aactgcgggt caaggatctg gatttcgatc acggcacgat catcgtgcgg gagggcaagg 9900 gctccaagga tcgggccttg atgttacccg agagcttggc acccagcctg cgcgagcagg 9960 ggaattaatt cccacgggtt ttgctgcccg caaacgggct gttctggtgt tgctagtttg 10020 ttatcagaat cgcagatccg gcttcagccg gtttgccggc tgaaagcgct atttcttcca 10080 gaattgccat gattttttcc ccacgggagg cgtcactggc tcccgtgttg tcggcagctt 10140 tgattcgata agcagcatcg cctgtttcag gctgtctatg tgtgactgtt gagctgtaac 10200 aagttgtctc aggtgttcaa tttcatgttc tagttgcttt gttttactgg tttcacctgt 10260 tctattaggt gttacatgct gttcatctgt tacattgtcg atctgttcat ggtgaacagc 10320 tttgaatgca ccaaaaactc gtaaaagctc tgatgtatct atctttttta caccgttttc 10380 atctgtgcat atggacagtt ttccctttga tatgtaacgg tgaacagttg ttctactttt 10440 gtttgttagt cttgatgctt cactgataga tacaagagcc ataagaacct cagatccttc 10500 cgtatttagc cagtatgttc tctagtgtgg ttcgttgttt ttgcgtgagc catgagaacg 10560 aaccattgag atcatactta ctttgcatgt cactcaaaaa ttttgcctca aaactggtga 10620 gctgaatttt tgcagttaaa gcatcgtgta gtgtttttct tagtccgtta tgtaggtagg 10680 aatctgatgt aatggttgtt ggtattttgt caccattcat ttttatctgg ttgttctcaa 10740 gttcggttac gagatccatt tgtctatcta gttcaacttg gaaaatcaac gtatcagtcg 10800 ggcggcctcg cttatcaacc accaatttca tattgctgta agtgtttaaa tctttactta 10860 ttggtttcaa aacccattgg ttaagccttt taaactcatg gtagttattt tcaagcatta 10920 acatgaactt aaattcatca aggctaatct ctatatttgc cttgtgagtt ttcttttgtg 10980 ttagttcttt taataaccac tcataaatcc tcatagagta tttgttttca aaagacttaa 11040 catgttccag attatatttt atgaattttt ttaactggaa aagataaggc aatatctctt 11100 cactaaaaac taattctaat ttttcgcttg agaacttggc atagtttgtc cactggaaaa 11160 tctcaaagcc tttaaccaaa ggattcctga tttccacagt tctcgtcatc agctctctgg 11220 ttgctttagc taatacacca taagcatttt ccctactgat gttcatcatc tgagcgtatt 11280 ggttataagt gaacgatacc gtccgttctt tccttgtagg gttttcaatc gtggggttga 11340 gtagtgccac acagcataaa attagcttgg tttcatgctc cgttaagtca tagcgactaa 11400 tcgctagttc atttgctttg aaaacaacta attcagacat acatctcaat tggtctaggt 11460 gattttaat 11469 <210> 64 <211> 1173 <212> PRT <213> Mycobacterium smegmatis <400> 64 Met Thr Ser Asp Val His Asp Ala Thr Asp Gly Val Thr Glu Thr Ala 1 5 10 15 Leu Asp Asp Glu Gln Ser Thr Arg Arg Ile Ala Glu Leu Tyr Ala Thr 20 25 30 Asp Pro Glu Phe Ala Ala Ala Ala Pro Leu Pro Ala Val Val Asp Ala 35 40 45 Ala His Lys Pro Gly Leu Arg Leu Ala Glu Ile Leu Gln Thr Leu Phe 50 55 60 Thr Gly Tyr Gly Asp Arg Pro Ala Leu Gly Tyr Arg Ala Arg Glu Leu 65 70 75 80 Ala Thr Asp Glu Gly Gly Arg Thr Val Thr Arg Leu Leu Pro Arg Phe 85 90 95 Asp Thr Leu Thr Tyr Ala Gln Val Trp Ser Arg Val Gln Ala Val Ala 100 105 110 Ala Ala Leu Arg His Asn Phe Ala Gln Pro Ile Tyr Pro Gly Asp Ala 115 120 125 Val Ala Thr Ile Gly Phe Ala Ser Pro Asp Tyr Leu Thr Leu Asp Leu 130 135 140 Val Cys Ala Tyr Leu Gly Leu Val Ser Val Pro Leu Gln His Asn Ala 145 150 155 160 Pro Val Ser Arg Leu Ala Pro Ile Leu Ala Glu Val Glu Pro Arg Ile 165 170 175 Leu Thr Val Ser Ala Glu Tyr Leu Asp Leu Ala Val Glu Ser Val Arg 180 185 190 Asp Val Asn Ser Val Ser Gln Leu Val Val Phe Asp His His Pro Glu 195 200 205 Val Asp Asp His Arg Asp Ala Leu Ala Arg Ala Arg Glu Gln Leu Ala 210 215 220 Gly Lys Gly Ile Ala Val Thr Thr Leu Asp Ala Ile Ala Asp Glu Gly 225 230 235 240 Ala Gly Leu Pro Ala Glu Pro Ile Tyr Thr Ala Asp His Asp Gln Arg 245 250 255 Leu Ala Met Ile Leu Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Gly Ala Pro Lys Gly 260 265 270 Ala Met Tyr Thr Glu Ala Met Val Ala Arg Leu Trp Thr Met Ser Phe 275 280 285 Ile Thr Gly Asp Pro Thr Pro Val Ile Asn Val Asn Phe Met Pro Leu 290 295 300 Asn His Leu Gly Gly Arg Ile Pro Ile Ser Thr Ala Val Gln Asn Gly 305 310 315 320 Gly Thr Ser Tyr Phe Val Pro Glu Ser Asp Met Ser Thr Leu Phe Glu 325 330 335 Asp Leu Ala Leu Val Arg Pro Thr Glu Leu Gly Leu Val Pro Arg Val 340 345 350 Ala Asp Met Leu Tyr Gln His His Leu Ala Thr Val Asp Arg Leu Val 355 360 365 Thr Gln Gly Ala Asp Glu Leu Thr Ala Glu Lys Gln Ala Gly Ala Glu 370 375 380 Leu Arg Glu Gln Val Leu Gly Gly Arg Val Ile Thr Gly Phe Val Ser 385 390 395 400 Thr Ala Pro Leu Ala Ala Glu Met Arg Ala Phe Leu Asp Ile Thr Leu 405 410 415 Gly Ala His Ile Val Asp Gly Tyr Gly Leu Thr Glu Thr Gly Ala Val 420 425 430 Thr Arg Asp Gly Val Ile Val Arg Pro Pro Val Ile Asp Tyr Lys Leu 435 440 445 Ile Asp Val Pro Glu Leu Gly Tyr Phe Ser Thr Asp Lys Pro Tyr Pro 450 455 460 Arg Gly Glu Leu Leu Val Arg Ser Gln Thr Leu Thr Pro Gly Tyr Tyr 465 470 475 480 Lys Arg Pro Glu Val Thr Ala Ser Val Phe Asp Arg Asp Gly Tyr Tyr 485 490 495 His Thr Gly Asp Val Met Ala Glu Thr Ala Pro Asp His Leu Val Tyr 500 505 510 Val Asp Arg Arg Asn Asn Val Leu Lys Leu Ala Gln Gly Glu Phe Val 515 520 525 Ala Val Ala Asn Leu Glu Ala Val Phe Ser Gly Ala Ala Leu Val Arg 530 535 540 Gln Ile Phe Val Tyr Gly Asn Ser Glu Arg Ser Phe Leu Leu Ala Val 545 550 555 560 Val Val Pro Thr Pro Glu Ala Leu Glu Gln Tyr Asp Pro Ala Ala Leu 565 570 575 Lys Ala Ala Leu Ala Asp Ser Leu Gln Arg Thr Ala Arg Asp Ala Glu 580 585 590 Leu Gln Ser Tyr Glu Val Pro Ala Asp Phe Ile Val Glu Thr Glu Pro 595 600 605 Phe Ser Ala Ala Asn Gly Leu Leu Ser Gly Val Gly Lys Leu Leu Arg 610 615 620 Pro Asn Leu Lys Asp Arg Tyr Gly Gln Arg Leu Glu Gln Met Tyr Ala 625 630 635 640 Asp Ile Ala Ala Thr Gln Ala Asn Gln Leu Arg Glu Leu Arg Arg Ala 645 650 655 Ala Ala Thr Gln Pro Val Ile Asp Thr Leu Thr Gln Ala Ala Ala Thr 660 665 670 Ile Leu Gly Thr Gly Ser Glu Val Ala Ser Asp Ala His Phe Thr Asp 675 680 685 Leu Gly Gly Asp Ser Leu Ser Ala Leu Thr Leu Ser Asn Leu Leu Ser 690 695 700 Asp Phe Phe Gly Phe Glu Val Pro Val Gly Thr Ile Val Asn Pro Ala 705 710 715 720 Thr Asn Leu Ala Gln Leu Ala Gln His Ile Glu Ala Gln Arg Thr Ala 725 730 735 Gly Asp Arg Arg Pro Ser Phe Thr Thr Val His Gly Ala Asp Ala Thr 740 745 750 Glu Ile Arg Ala Ser Glu Leu Thr Leu Asp Lys Phe Ile Asp Ala Glu 755 760 765 Thr Leu Arg Ala Ala Pro Gly Leu Pro Lys Val Thr Thr Glu Pro Arg 770 775 780 Thr Val Leu Leu Ser Gly Ala Asn Gly Trp Leu Gly Arg Phe Leu Thr 785 790 795 800 Leu Gln Trp Leu Glu Arg Leu Ala Pro Val Gly Gly Thr Leu Ile Thr 805 810 815 Ile Val Arg Gly Arg Asp Asp Ala Ala Ala Arg Ala Arg Leu Thr Gln 820 825 830 Ala Tyr Asp Thr Asp Pro Glu Leu Ser Arg Arg Phe Ala Glu Leu Ala 835 840 845 Asp Arg His Leu Arg Val Val Ala Gly Asp Ile Gly Asp Pro Asn Leu 850 855 860 Gly Leu Thr Pro Glu Ile Trp His Arg Leu Ala Ala Glu Val Asp Leu 865 870 875 880 Val Val His Pro Ala Ala Leu Val Asn His Val Leu Pro Tyr Arg Gln 885 890 895 Leu Phe Gly Pro Asn Val Val Gly Thr Ala Glu Val Ile Lys Leu Ala 900 905 910 Leu Thr Glu Arg Ile Lys Pro Val Thr Tyr Leu Ser Thr Val Ser Val 915 920 925 Ala Met Gly Ile Pro Asp Phe Glu Glu Asp Gly Asp Ile Arg Thr Val 930 935 940 Ser Pro Val Arg Pro Leu Asp Gly Gly Tyr Ala Asn Gly Tyr Gly Asn 945 950 955 960 Ser Lys Trp Ala Gly Glu Val Leu Leu Arg Glu Ala His Asp Leu Cys 965 970 975 Gly Leu Pro Val Ala Thr Phe Arg Ser Asp Met Ile Leu Ala His Pro 980 985 990 Arg Tyr Arg Gly Gln Val Asn Val Pro Asp Met Phe Thr Arg Leu Leu 995 1000 1005 Leu Ser Leu Leu Ile Thr Gly Val Ala Pro Arg Ser Phe Tyr Ile 1010 1015 1020 Gly Asp Gly Glu Arg Pro Arg Ala His Tyr Pro Gly Leu Thr Val 1025 1030 1035 Asp Phe Val Ala Glu Ala Val Thr Thr Leu Gly Ala Gln Gln Arg 1040 1045 1050 Glu Gly Tyr Val Ser Tyr Asp Val Met Asn Pro His Asp Asp Gly 1055 1060 1065 Ile Ser Leu Asp Val Phe Val Asp Trp Leu Ile Arg Ala Gly His 1070 1075 1080 Pro Ile Asp Arg Val Asp Asp Tyr Asp Asp Trp Val Arg Arg Phe 1085 1090 1095 Glu Thr Ala Leu Thr Ala Leu Pro Glu Lys Arg Arg Ala Gln Thr 1100 1105 1110 Val Leu Pro Leu Leu His Ala Phe Arg Ala Pro Gln Ala Pro Leu 1115 1120 1125 Arg Gly Ala Pro Glu Pro Thr Glu Val Phe His Ala Ala Val Arg 1130 1135 1140 Thr Ala Lys Val Gly Pro Gly Asp Ile Pro His Leu Asp Glu Ala 1145 1150 1155 Leu Ile Asp Lys Tyr Ile Arg Asp Leu Arg Glu Phe Gly Leu Ile 1160 1165 1170

Claims (51)

  1. 포스포에놀피루브산 카르복실라아제(phosphoenolpyruvate carboxylase: ppc) 폴리펩티드를 인코딩하는 감소된 수의 mRNA 전사체들을 포함하는 재조합 박테리아성 숙주 세포에 있어서,
    여기서 상기 재조합 박테리아성 숙주 세포는 yijP 유전자 내로의 트랜스포존 삽입을 포함하고, yijP 유전자는 ppc 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 측면에 위치(flanked)하고, 트랜스포존 삽입은 ppc 폴리펩티드의 활성을 감소시키며,
    탄소 공급원을 함유하는 배지 내에서 배양되는 경우에, 상기 재조합 박테리아성 숙주 세포는 대응하는 야생형 숙주 세포보다 더 높은 역가, 수율 또는 생산률로 지방산 유도체 조성물을 생산하는, 재조합 박테리아성 숙주 세포.
  2. 제 1 항의 재조합 박테리아성 숙주 세포를 포함하는 세포 배양물.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 배지는 지방산 유도체 조성물을 포함하는, 세포 배양물.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체 조성물은 지방산, 지방족 에스테르, 지방족 알코올, 지방족 알데히드, 알칸, 말단 올레핀, 내부 올레핀 및 케톤으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 지방산 유도체를 포함하는, 세포 배양물.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체는
    a) C6, C8, C1O, C12, C13, C14, C15, C16, C17 또는 C18 지방산 유도체, 또는
    b) C10:1, C12:1, C14:1, C16:1 또는 C18:1 불포화 지방산 유도체인, 세포 배양물.
  6. 제 3 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체 조성물은
    a) C8, C1O, C12, C14, C16 및 C18 지방산 유도체들 중 하나 이상,
    b) 지방산,
    c) 지방족 알데히드,
    d) 지방족 알코올,
    e) 지방족 에스테르,
    f) 알칸,
    g) 말단 올레핀,
    h) 내부 올레핀, 또는
    i) 케톤을 포함하는, 세포 배양물.
  7. 제 3 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체 조성물은 지방족 알코올의 환원된 말단(reduced end)으로부터 C7과 C8 사이 탄소 사슬의 위치 7(position 7)에 이중 결합을 갖는 지방산 유도체들을 포함하는, 세포 배양물.
  8. 제 3 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체 조성물은 불포화 지방산 유도체들을 포함하는, 세포 배양물.
  9. 제 3 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체 조성물은 포화 지방산 유도체들을 포함하는, 세포 배양물.
  10. 제 3 항에 있어서,
    상기 지방산 유도체 조성물은 분지 쇄형(branched chain) 지방산 유도체들을 포함하는, 세포 배양물.
  11. 제 2 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아성 숙주 세포는, 상기 재조합 박테리아성 숙주 세포와 동일한 조건들 하에서 배양되는 경우에 상기 대응하는 야생형 숙주 세포들의 역가보다 적어도 5 % 더 큰 역가를 갖는, 세포 배양물.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아성 숙주 세포는 1 g/L 내지 70 g/L의 역가를 갖는, 세포 배양물.
  13. 삭제
  14. 제 2 항에 있어서,
    상기 재조합 박테리아성 숙주 세포는 적어도 10 % 내지 40 %인 수율을 갖는, 세포 배양물.
  15. 제 2 항에 있어서,
    상기 생산률은 0.7 mg/L/hr 내지 3 g/L/hr의 범위인, 세포 배양물.
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