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CN111094558A - 对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的硫酯酶变体 - Google Patents

对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的硫酯酶变体 Download PDF

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CN111094558A
CN111094558A CN201880035676.0A CN201880035676A CN111094558A CN 111094558 A CN111094558 A CN 111094558A CN 201880035676 A CN201880035676 A CN 201880035676A CN 111094558 A CN111094558 A CN 111094558A
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fatty acid
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A·Z·鲍蒂斯塔
M·S·朴
A·I·拉莫斯-索利斯
B·M·托雷斯达科斯塔
B·贝赫鲁齐安
D·E·特林伯
E·波波瓦
Q·胡
S·B·德卡戴雷
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Genomatica Inc
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Abstract

本公开内容涉及改造的植物酰基‑ACP硫酯酶，其对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性，所述中链脂肪酸衍生物包括例如八碳和十碳脂肪酸和脂肪酸衍生物。本公开内容进一步涉及重组宿主细胞，其包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造的植物酰基‑ACP硫酯酶。本公开内容还涉及降低毒性并改善中链脂肪酸及其衍生物的产生的方法。

Description

对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的硫酯酶变体
相关申请
本申请要求2017年4月3日提交的美国临时专利申请USSN62/481,078的权益，其全部内容通过引用并入本文。
领域
本公开内容涉及可用于产生中链长度的脂肪酸和脂肪酸衍生物的分子工具。因此，本公开内容涉及赋予微生物对中链长度的脂肪酸和脂肪酸衍生物的耐受性的基因。本公开内容进一步涉及新颖的改造的硫酯酶变体和编码它们的多核苷酸，其对于产生中链脂肪酸衍生物(包括例如八碳和十碳脂肪酸和脂肪酸衍生物)具有改善的活性和/或选择性。因此，本公开内容还涉及包含改造的硫酯酶变体的宿主细胞、其编码多核苷酸和相关细胞培养物。本公开内容还包括通过使用表达改造的硫酯酶变体的宿主细胞来产生中链脂肪酸衍生物的方法和生物产生的中链脂肪酸衍生物的组合物。
背景
产生中链脂肪酸(medium-chain fatty acid，MCFA)衍生的产品引起了极大的兴趣。中链脂肪酸和中链脂肪酸衍生物有许多工业应用，例如生物燃料、润滑剂和润滑脂、金属加工液、涂料和粘合剂、化妆品和个人护理、香料、食品和营养品、制药、塑料和橡胶以及化学工业的其他原料。
除了其在工业中的价值外，中链脂肪酸还作为膳食补充剂和营养食品有有价值的应用(参见例如Stig Bengmark(2013)Nutrients 5(1):162–207)。实际上，中链脂肪酸及其衍生物表现出抗微生物特性(参见例如Nobmann等人，International Journal of FoodMicrobiology.2009；128(3):440–445；BW Petschow等人，(1996)Antimicrob.AgentsChemother.40(2):302-306)、抑制体内脂肪蓄积并预防代谢综合征(参见例如Takeuchi H.等人(2008)Asia Pac J Clin Nutr.17 Suppl 1:320-3；Koji Nagao(2010)Pharmacological Research 61:208–212)。Omura Y.，等人(2011)Acupunct ElectrotherRes.36(1-2):19-64)并在临床相关浓度下具有抗癫痫作用(参见例如Chang等人，(2013)Neuropharmacology 2013；69:105–14；Wlaz等人，(2015)Prog NeuropsychopharmacolBiol Psychiatry 2015；57:110–16)。
考虑到许多有用的应用，在过去几年中对中链脂肪酸的需求呈上升趋势就不足为奇了。不幸的是，中链脂肪酸的供应一直与从植物(棕榈油)或从化学合成产生长链游离脂肪酸(FFA)产品相关，其中中等长度的链被产生为肩部，占总脂肪酰基物质的少于20％(参见例如Kostik，V.等人(2013)J.Hyg.Eng.Des.4:112-116)。这使得中链脂肪酸的供应非常易挥发且不稳定。因此，在本领域中需要能够递送这些化合物的可靠、稳定和可再生的供应的方法。
当前中链脂肪酸来源的替代方案是使用生物系统例如微生物发酵来产生。然而，通过生物系统产生游离脂肪酸代表两个主要挑战。首先，它通常依赖于硫酯酶，其作用于宿主生物产生的烷基硫酯分子。对中链烷基硫酯具有活性的可用硫酯酶具有次优的催化活性，或者它们的特异性太宽，对一定范围的烷基硫酯链起作用。其次，中链脂族化合物通常对微生物细胞具有剧毒，从而阻碍了它们的高水平产生。另外，中链酰基化合物的毒性会阻碍高活性硫酯酶的选择和改造。因此，对于提供中链脂肪酸的替代供应的生物系统，需要具有对中链烷基硫酯酶具有更高活性和选择性的改善的硫酯酶并且对中链脂族化合物显示出改善的耐受性的生物系统。
幸运的是，如从下面的公开内容中将清楚的，本发明满足了这些需要和其他需要。
概述
本公开内容的一个方面提供了一种改造的硫酯酶变体，其对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性。因此，在一个实施方案中，本公开内容提供了一种改造的硫酯酶变体，其对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性。在一个实施方案中，权利要求1的改造的硫酯酶变体，其中改造的硫酯酶变体对产生C8脂肪酸衍生物具有改善的活性。在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体具有与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性并且在选自以下的氨基酸位置上具有至少一个取代突变的氨基酸序列：3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321和322。在一个实施方案中，改造的硫酯酶的至少一个取代突变是选自以下的成员：(a)氨基酸位置3的赖氨酸；(b)氨基酸位置4的甲硫氨酸；(c)氨基酸位置6的精氨酸；(d)氨基酸位置14的甘氨酸或精氨酸；(e)氨基酸位置15的亮氨酸或色氨酸；(f)氨基酸位置17的丙氨酸或半胱氨酸；(g)氨基酸位置22的精氨酸；(h)氨基酸位置37的脯氨酸；(i)氨基酸位置44的甘氨酸或异亮氨酸；(j)氨基酸位置45的丝氨酸；(k)氨基酸位置50的色氨酸；(l)氨基酸位置54的精氨酸；(m)氨基酸位置56的赖氨酸或半胱氨酸；(n)氨基酸位置64的精氨酸或脯氨酸；(o)氨基酸位置67的亮氨酸；(p)氨基酸位置73的缬氨酸；(q)氨基酸位置76的苯丙氨酸或亮氨酸或酪氨酸；(r)氨基酸位置91的甲硫氨酸；(s)氨基酸位置99的赖氨酸或脯氨酸；(t)氨基酸位置102的异亮氨酸；(u)氨基酸位置110的亮氨酸；(v)氨基酸位置111的苏氨酸；(w)氨基酸位置114的赖氨酸；(x)氨基酸位置129的缬氨酸；(y)氨基酸位置132的色氨酸；(z)氨基酸位置137的半胱氨酸；(aa)氨基酸位置158的谷氨酰胺；(bb)氨基酸位置162的谷氨酸；(cc)氨基酸位置176的缬氨酸；(dd)氨基酸位置178的脯氨酸；(ee)氨基酸位置185的丙氨酸；(ff)氨基酸位置186的甘氨酸；(gg)氨基酸位置196的缬氨酸；(hh)氨基酸位置197的天冬酰胺；(ii)氨基酸位置198的色氨酸；(jj)氨基酸位置203的精氨酸；(kk)氨基酸位置213的组氨酸或精氨酸；(ll)氨基酸位置217的精氨酸；(mm)氨基酸位置225的亮氨酸；(nn)氨基酸位置227的甘氨酸；(oo)氨基酸位置236的苏氨酸；(pp)氨基酸位置244的甲硫氨酸或精氨酸；(qq)氨基酸位置254的甘氨酸；(rr)氨基酸位置256的半胱氨酸或精氨酸；(ss)氨基酸位置258的苏氨酸或缬氨酸；(tt)氨基酸位置278的赖氨酸或缬氨酸；(uu)氨基酸位置282的丝氨酸或缬氨酸；(vv)氨基酸位置292的苯丙氨酸；(ww)氨基酸位置297的苏氨酸或天冬氨酸或缬氨酸；(xx)氨基酸位置298的缬氨酸或半胱氨酸；(yy)氨基酸位置299的亮氨酸；(zz)氨基酸位置300的赖氨酸或色氨酸或亮氨酸；(aaa)氨基酸位置301的半胱氨酸；(bbb)氨基酸位置302的苏氨酸；(ccc)氨基酸位置316的精氨酸；(ddd)氨基酸位置321的精氨酸；和(eee)氨基酸位置322的赖氨酸。
在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
在一个实施方案中，与具有SEQ ID NO:1的硫酯酶相比，改造的硫酯酶变体具有总体增加的净正电荷。在一个实施方案中，与具有SEQ ID NO:4的硫酯酶变体相比，改造的硫酯酶变体具有总体增加的净正电荷。
在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体选自SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ IDNO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ IDNO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ IDNO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
在一个实施方案中，与SEQ ID NO:15相比，改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:49相比，改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。
在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体在SEQ ID NO:49的氨基酸2至40之间具有截短突变。在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:52、SEQID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
在一个实施方案中，硫酯酶变体对产生C10脂肪酸衍生物具有改善的活性。在一个实施方案中，硫酯酶变体对产生C8脂肪酸衍生物具有改善的活性。
在一个方面，本公开内容提供了一种重组宿主细胞，其包含一个或多个异源基因，所述异源基因编码将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物的生化途径，其中第二脂肪酸衍生物具有比所述第一脂肪酸衍生物更高的最小抑菌浓度(minimun inhibitoryconcentration，MIC)，并且其中第二脂肪酸衍生物的存在增加第一脂肪酸衍生物的MIC。
在一个实施方案中，生化途径包括以下之一：羧酸还原酶，羧酸还原酶和醇脱氢酶，羧酸还原酶和醇-O-乙酰基转移酶，羧酸还原酶，和醇脱氢酶，以及醇O-乙酰基转移酶，酯合酶，酯合酶和脂肪酰基-CoA合成酶，酰基-CoA还原酶，酰基-CoA还原酶和酰基-CoA合成酶，酰基-CoA还原酶和醇O-乙酰基转移酶，酰基-CoA还原酶、醇O-乙酰基转移酶和酰基-CoA合成酶，O-甲基转移酶，酰基ACP还原酶，酰基ACP还原酶和醛脱羰酶，酰基ACP还原酶和醛氧化去甲酰酶，酰基ACP还原酶和醇O-乙酰基转移酶，酰基ACP还原酶、醇-O-乙酰基转移酶和醇脱氢酶，OleA蛋白，OleA、C和D蛋白OleA蛋白和脂肪酰基-CoA合成酶，或OleA、C和D蛋白和脂肪酰基-CoA合成酶。
在一个实施方案中，第一脂肪酸衍生物是脂肪酸，第二脂肪酸衍生物是脂肪酸烷基酯，并且生化途径包括酯合酶和脂肪酰基-CoA合成酶。
在一个实施方案中，脂肪酸烷基酯是脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。
在一个实施方案中，第一脂肪酸衍生物是脂肪醇，第二脂肪酸衍生物是乙酸脂肪醇，并且生化途径包括羧酸还原酶和醇-O-乙酰基转移酶。
在一个实施方案中，第一脂肪酸衍生物和第二脂肪酸衍生物是中链脂肪酸衍生物。
在一个实施方案中，重组宿主细胞还包含改造的硫酯酶变体。
在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：具有与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性并且在选自以下的氨基酸位置上具有至少一个取代突变的氨基酸序列的硫酯酶变体：3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321和322。
在一个实施方案中，至少一个取代突变是选自以下的成员：(a)氨基酸位置3的赖氨酸；(b)氨基酸位置4的甲硫氨酸；(c)氨基酸位置6的精氨酸；(d)氨基酸位置14的甘氨酸或精氨酸；(e)氨基酸位置15的亮氨酸或色氨酸；(f)氨基酸位置17的丙氨酸或半胱氨酸；(g)氨基酸位置22的精氨酸；(h)氨基酸位置37的脯氨酸；(i)氨基酸位置44的甘氨酸或异亮氨酸；(j)氨基酸位置45的丝氨酸；(k)氨基酸位置50的色氨酸；(l)氨基酸位置54的精氨酸；(m)氨基酸位置56的赖氨酸或半胱氨酸；(n)氨基酸位置64的精氨酸或脯氨酸；(o)氨基酸位置67的亮氨酸；(p)氨基酸位置73的缬氨酸；(q)氨基酸位置76的苯丙氨酸或亮氨酸或酪氨酸；(r)氨基酸位置91的甲硫氨酸；(s)氨基酸位置99的赖氨酸或脯氨酸；(t)氨基酸位置102的异亮氨酸；(u)氨基酸位置110的亮氨酸；(v)氨基酸位置111的苏氨酸；(w)氨基酸位置114的赖氨酸；(x)氨基酸位置129的缬氨酸；(y)氨基酸位置132的色氨酸；(z)氨基酸位置137的半胱氨酸；(aa)氨基酸位置158的谷氨酰胺；(bb)氨基酸位置162的谷氨酸；(cc)氨基酸位置176的缬氨酸；(dd)氨基酸位置178的脯氨酸；(ee)氨基酸位置185的丙氨酸；(ff)氨基酸位置186的甘氨酸；(gg)氨基酸位置196的缬氨酸；(hh)氨基酸位置197的天冬酰胺；(ii)氨基酸位置198的色氨酸；(jj)氨基酸位置203的精氨酸；(kk)氨基酸位置213的组氨酸或精氨酸；(ll)氨基酸位置217的精氨酸；(mm)氨基酸位置225的亮氨酸；(nn)氨基酸位置227的甘氨酸；(oo)氨基酸位置236的苏氨酸；(pp)氨基酸位置244的甲硫氨酸或精氨酸；(qq)氨基酸位置254的甘氨酸；(rr)氨基酸位置256的半胱氨酸或精氨酸；(ss)氨基酸位置258的苏氨酸或缬氨酸；(tt)氨基酸位置278的赖氨酸或缬氨酸；(uu)氨基酸位置282的丝氨酸或缬氨酸；(vv)氨基酸位置292的苯丙氨酸；(ww)氨基酸位置297的苏氨酸或天冬氨酸或缬氨酸；(xx)氨基酸位置298的缬氨酸或半胱氨酸；(yy)氨基酸位置299的亮氨酸；(zz)氨基酸位置300的赖氨酸或色氨酸或亮氨酸；(aaa)氨基酸位置301的半胱氨酸；(bbb)氨基酸位置302的苏氨酸；(ccc)氨基酸位置316的精氨酸；(ddd)氨基酸位置321的精氨酸；和(eee)氨基酸位置322的赖氨酸。
在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
在一个实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:4相比，改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
在一个实施方案中，与SEQ ID NO:15相比，改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，其中改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:49相比，改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体在SEQ ID NO:49的氨基酸2至40之间具有截短突变。在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
在另一方面，本公开内容提供了一种以商业效价产生中链脂肪酸衍生物的方法，该方法包括：在适合于产生中链脂肪酸衍生物的条件下，在碳源的存在下培养包含改造的硫酯酶变体的重组宿主细胞，其中所述重组宿主细胞包含一个或多个异源基因，所述异源基因编码将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物的生化途径，并且其中第二脂肪酸衍生物具有比第一脂肪酸衍生物更高的最小抑菌浓度(MIC)，并且其中第二脂肪酸衍生物的存在增加第一脂肪酸衍生物的MIC。
在一个实施方案中，第一脂肪酸衍生物是中链脂肪酸，第二脂肪酸衍生物是中链脂肪酸烷基酯，并且生化途径包括酯合酶和脂肪酰基-CoA合成酶。
在一个实施方案中，脂肪酸烷基酯是中链脂肪酸甲酯或中链脂肪酸乙酯。
在一个实施方案中，第一脂肪酸衍生物是中链脂肪醇，第二脂肪酸衍生物是中链乙酸脂肪醇，并且生化途径包括羧酸还原酶和醇-O-乙酰基转移酶。
在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体具有与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性并且在选自以下的氨基酸位置上具有至少一个取代突变的氨基酸序列：3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321和322。在一个实施方案中，至少一个取代突变是选自以下的成员：(a)氨基酸位置3的赖氨酸；(b)氨基酸位置4的甲硫氨酸；(c)氨基酸位置6的精氨酸；(d)氨基酸位置14的甘氨酸或精氨酸；(e)氨基酸位置15的亮氨酸或色氨酸；(f)氨基酸位置17的丙氨酸或半胱氨酸；(g)氨基酸位置22的精氨酸；(h)氨基酸位置37的脯氨酸；(i)氨基酸位置44的甘氨酸或异亮氨酸；(j)氨基酸位置45的丝氨酸；(k)氨基酸位置50的色氨酸；(l)氨基酸位置54的精氨酸；(m)氨基酸位置56的赖氨酸或半胱氨酸；(n)氨基酸位置64的精氨酸或脯氨酸；(o)氨基酸位置67的亮氨酸；(p)氨基酸位置73的缬氨酸；(q)氨基酸位置76的苯丙氨酸或亮氨酸或酪氨酸；(r)氨基酸位置91的甲硫氨酸；(s)氨基酸位置99的赖氨酸或脯氨酸；(t)氨基酸位置102的异亮氨酸；(u)氨基酸位置110的亮氨酸；(v)氨基酸位置111的苏氨酸；(w)氨基酸位置114的赖氨酸；(x)氨基酸位置129的缬氨酸；(y)氨基酸位置132的色氨酸；(z)氨基酸位置137的半胱氨酸；(aa)氨基酸位置158的谷氨酰胺；(bb)氨基酸位置162的谷氨酸；(cc)氨基酸位置176的缬氨酸；(dd)氨基酸位置178的脯氨酸；(ee)氨基酸位置185的丙氨酸；(ff)氨基酸位置186的甘氨酸；(gg)氨基酸位置196的缬氨酸；(hh)氨基酸位置197的天冬酰胺；(ii)氨基酸位置198的色氨酸；(jj)氨基酸位置203的精氨酸；(kk)氨基酸位置213的组氨酸或精氨酸；(ll)氨基酸位置217的精氨酸；(mm)氨基酸位置225的亮氨酸；(nn)氨基酸位置227的甘氨酸；(oo)氨基酸位置236的苏氨酸；(pp)氨基酸位置244的甲硫氨酸或精氨酸；(qq)氨基酸位置254的甘氨酸；(rr)氨基酸位置256的半胱氨酸或精氨酸；(ss)氨基酸位置258的苏氨酸或缬氨酸；(tt)氨基酸位置278的赖氨酸或缬氨酸；(uu)氨基酸位置282的丝氨酸或缬氨酸；(vv)氨基酸位置292的苯丙氨酸；(ww)氨基酸位置297的苏氨酸或天冬氨酸或缬氨酸；(xx)氨基酸位置298的缬氨酸或半胱氨酸；(yy)氨基酸位置299的亮氨酸；(zz)氨基酸位置300的赖氨酸或色氨酸或亮氨酸；(aaa)氨基酸位置301的半胱氨酸；(bbb)氨基酸位置302的苏氨酸；(ccc)氨基酸位置316的精氨酸；(ddd)氨基酸位置321的精氨酸；和(eee)氨基酸位置322的赖氨酸。
在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ IDNO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQ IDNO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ IDNO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
在一个实施方案中，与SEQ ID NO:1相比，改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。
在一个实施方案中，与SEQ ID NO:4相比，改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ IDNO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ IDNO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
在一个实施方案中，与SEQ ID NO:15相比，改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:47、SEQ IDNO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51。
在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。在一个实施方案中，与SEQ ID NO:49相比，改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体在SEQ ID NO:49的氨基酸2至40之间具有截短突变。在一个实施方案中，改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
在另一方面，本公开内容提供了一种中链脂肪酸衍生物的组合物，其中C8脂肪酸衍生物与C10脂肪酸衍生物的比率(C8/C10)为至少3.6。在一个实施方案中，C8脂肪酸衍生物与C10脂肪酸衍生物的比率为7.7。
附图简要说明
图1示出了不同C8脂族化合物的最小抑菌浓度(MIC)曲线。
图2示出了不同的中链脂族化合物的分配系数(logPwo)。
图3示出了在乙酸辛酯存在下对1-辛醇毒性的保护作用。当暴露于1-辛醇时，暴露5h后大肠杆菌细胞的活力完全丧失。但是，当还以50g/L(对大肠杆菌细胞是无毒的浓度)添加乙酸辛酯时，在存在多达10g/L的1-辛醇的情况下，细胞活力降低不到20％。
图4示出了中链脂肪醇的产生及其乙酰化为乙酸脂肪酯的途径。R：CH3(CH2)n，其中n＝1、2、3、4或5；FFA：游离脂肪酸；FALD：脂肪醛；FALC：脂肪醇；FACE：乙酸脂肪醇酯；ACP：酰基载体蛋白；AAR：酰基-ACP还原酶；ADH：醛/醇脱氢酶；TE：硫酯酶；ACR：酰基-CoA还原酶；CAR：羧酸还原酶；AAT：邻醇乙酰基转移酶。
图5示出了通过醇乙酰转移酶的表达指示中链脂肪醇(FALC)化合物的改善的耐受性和产生的不同措施。图5A示出了产生FALC的菌株(sRG.674)不能在以葡萄糖为碳源的最小盐培养基上生长。相反，在菌株sJN.209中具有邻醇乙酰基转移酶(AAT)表达的相同培养基上，没有生长抑制作用。图5B示出了由产生FALC的菌株(sRG.674)和表达AAT的菌株sJN.209产生的总脂肪种类(FAS)的水平。图5C示出了由产生FALC的菌株(sRG.674)和表达AAT的菌株sJN.209产生的脂肪种类的水平和组成的比较。
图6示出了游离脂肪酸的酯化途径。R：CH3(CH2)n，其中n＝1、2、3、4或5；FFA：游离脂肪酸；FAEE：脂肪酸乙酯；TE：硫酯酶；ES：酯合酶。
图7示出了通过表达中链烷基酯生物合成途径的菌株指示与仅表达中链长度脂肪酸生物合成途径的菌株相比，中链脂肪酸衍生物的的改善的活力和产生的不同措施。菌株sRS.786被改造为表达中链硫酯酶(chFatB2)和仅产生游离脂肪酸(FFA)。菌株Stpay.179与sRS.786是同基因的，并且还表达脂肪酰基-CoA合成酶和酯合酶，并当在培养基中提供短链醇(例如甲醇，乙醇等)时，产生中等长度的脂肪烷基酯。
菌株sRS.786和Stpay.179在以葡萄糖为碳源的基本盐培养基中生长。另外，在发酵运行过程中进料乙醇，以保持约2g/L的醇浓度。图7A仅产生FFA的菌株(sRS.786)在加入IPTG诱导中链长度的酰基ACP硫酯酶表达后约10小时，停止了生长并葡萄糖消耗。相反，表达酯化途径的菌株Stpay.179在IPTG诱导后能够继续生长。图7B在加入IPTG诱导中链长度的酰基ACP硫酯酶表达后约10小时，菌株sRS.786停止中链脂肪酸种类(FAS)的产生，最终仅产生约5g的C8+C10。相反，菌株Stpay.179在整个发酵运行过程中继续生长并产生FAS，最终产生超过84g/kg的总脂肪酸种类。图7C。表达酯化途径的菌株Stpay.179能够生长并产生效价超过84g/kg的总脂肪酸种类，其中93％为C8-C10 FFA。
图8示出了质粒pIR.108。
图9示出了用于构建实施例6中公开的SEQ ID NO:1的模型的基于结构的序列比对。
图10示出了SEQ ID NO:1的3D结构的最终全长模型。表面残基显示为球和棒。
图11为用于评估各种FatB2截短的溶解度的蛋白印迹(1＝全细胞级分，2＝可溶级分)。
图12示出了在实施例8的条件下培养时，菌株sRG.825和sDH.377的中链长度的乙酸脂肪醇酯产生的特征终产物组成。
图13示出了在实施例11条件下培养时，菌株sAZ918的中链长度的脂肪酸乙酯产生的特征终产物组成。
详述
定义
如本文和所附权利要求书中所使用的，在描述要素的上下文中的单数冠词例如“一个(a)”、“一种(an)”和“该(the)”以及类似指代应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另有说明或与上下文明显矛盾。因此，例如，提及“宿主细胞”包括两个或更多个这样的宿主细胞，提及“核酸序列”包括一个或多个核酸序列，提及“酶”包括一种或多种酶，依此类推。
如本文所用，“约”是本领域普通技术人员所理解的，并且可以根据使用它的上下文而在某种程度上变化。在给定使用术语“约”的上下文中，如果存在对本领域普通技术人员而言不清楚的术语的使用，则“约”将表示特定术语的正负10％。
如本领域的技术人员将理解的，出于任何和所有目的，本文公开的所有范围也涵盖任何和所有可能的子范围及其子范围的组合。此外，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个原子的基团是指具有1、2或3个原子的基团。类似地，具有1-5个原子的基团是指具有1、2、3、4或5个原子的基团，依此类推。
除非另有定义，否则本文中使用的技术和科学术语具有与本领域普通技术人员通常理解的相同含义。具体而言，本公开内容利用重组遗传学、有机化学、发酵和生物化学领域中的常规技术。公开分子生物学和遗传学的通用术语的基础文献包括例如Lackie,Dictionary of Cell and Molecular Biology,Elsevier(2013年第5版)。公开生物化学的通用方法和术语的基础文献包括例如Lehninger Principles of Biochemistry第6版,David L.Nelson and Michael M.Cox eds.W.H.Freeman(2012)。公开发酵的通用方法和术语的基础文献包括例如Principles of Fermentation Technology,第3版，Peter FStanbury,Allan Whitaker and Stephen J Hall.Butterworth-Heinemann(2016)。公开有机化学的通用方法和术语的基本文献包括例如Favre,Henri A.and Powell,WarrenH.Nomenclature of Organic Chemistry.IUPAC Recommendations and Preferred Name2013.Cambridge,UK:The Royal Society of Chemistry,2013；Practical SyntheticOrganic Chemistry:Reactions,Principles,and Techniques,Stephane Caron ed.,JohnWiley and Sons Inc.(2011)；Organic Chemistry,第9版-Francis Carey and RobertGiuliano,McGraw Hill(2013)。
在整个说明书中的序列登录号是从由美国国立卫生研究院维护的NCBI(美国国家生物技术信息中心)提供的数据库(在本文中称为“NCBI登录号”或替代地称为“GenBank登录号”或替代地简称为“登录号”)和从瑞士生物信息学研究所提供的UniProt知识库(UniProtKB)和Swiss-Prot数据库(在本文中称为“UniProtKB登录号”)中获得的。
酶分类(EC)号是由国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会确定的，其描述可在互联网上的IUBMB酶命名网站上获得。EC号根据酶催化的反应对酶进行分类。例如，硫酯酶的酶活性在E.C.3.1.2.1-3.1.2.27和3.1.2.-下分类。具体分类基于不同硫酯酶在不同底物上的活性。
例如，在一些示例性实施方案中，催化C6-C18烷基硫酯例如酰基-酰基载体蛋白硫酯(Acyl-ACP)和酰基辅酶A硫酯(Acyl-CoA)的硫酯键水解的硫酯酶在E.C.3.1.2.-至3.1.2.14下分类。硫酯酶存在于大多数原核生物以及大多数植物和藻类的叶绿体中。从一个物种到下一个物种，大多数原核生物中硫酯酶的功能都是保守的。因此，不同的微生物物种可以执行在E.C.3.1.2.1-3.1.2.27和3.1.2.-下分类的相同的硫酯酶酶促活性。
如本文所用，术语“脂肪酸”是指具有式RCOOH的脂族羧酸，其中R是具有至少4个碳通常约4至约28个碳原子的脂族基团。脂族R基团可以是饱和或不饱和的、支链或直链的。不饱和的“脂肪酸”可以是单不饱和的或多不饱和的。
如本文所用的“脂肪酸”或“多种脂肪酸”是通过脂肪酸生物合成过程，通过脂肪酸β-氧化的逆转而在细胞内产生的，或者它们可以被进料到细胞中。如本领域众所周知的，脂肪酸生物合成通常是丙二酰-CoA依赖性的酰基-ACP合成，而β-氧化的逆转产生酰基-CoA。进料给细胞的脂肪酸被转化为酰基-CoA。
脂肪酸的生物合成和降解在所有生命形式中发生，包括原核生物、单细胞真核生物、高级真核生物和古细菌。本文公开的工具和方法可用于产生中链脂肪酸衍生物，其在任何天然产生烷基硫酯的生物中通过脂肪酸合成、降解或进料中的一种或多种而衍生。
如本文所用，术语“中链脂肪酸”或等同地“中链长度的脂肪酸”是指碳链长度为6至10个碳的脂肪酸。因此，在一些示例性实施方案中，“中链脂肪酸”是碳链长度为六个碳，碳链长度为七个碳，碳链长度为八个碳，碳链长度为九个碳或碳链长度为十个碳的脂肪酸。
如本文所用，术语“脂肪酸衍生物”是指衍生自脂肪酸的产物。因此，“脂肪酸衍生物”包括如上定义的“脂肪酸”和“中链脂肪酸”。通常，“脂肪酸衍生物”包括丙二酰-CoA衍生的化合物，包括酰基-ACP或酰基-ACP衍生物。“脂肪酸衍生物”还包括丙二酰-CoA衍生的化合物，例如酰基-CoA或酰基-CoA衍生物。因此，“脂肪酸衍生物”包括衍生自包括硫酯酶反应的代谢途径的分子/化合物。示例性的脂肪酸衍生物包括脂肪酸，脂肪酸酯(例如蜡，脂肪酸酯，脂肪酸甲酯(FAME)，脂肪酸乙酯(FAEE))，乙酸脂肪醇酯(FACE)，脂肪胺，脂肪醛，脂肪醇，烃(例如烷烃，烯烃等)，酮，末端烯烃，内烯烃，3-羟基脂肪酸衍生物，双官能脂肪酸衍生物(例如ω-羟基脂肪酸，1,3脂肪二醇，α,ω-二醇，α,ω-3-羟基三醇，ω-羟基FAME，ω-OHFAEE等)，以及不饱和脂肪酸衍生物，包括上述每种脂肪酸衍生物的不饱和化合物。
如本文所用，表述“脂肪酸衍生物组合物”是指脂肪酸衍生物的组合物，例如由生物体产生的脂肪酸组合物。“脂肪酸衍生物组合物”可包含单一脂肪酸衍生物种类或可包含脂肪酸衍生物种类的混合物。在一些示例性实施方案中，脂肪酸衍生物的混合物包括多于一种类型的脂肪酸衍生物产物(例如，脂肪酸，脂肪酸酯，脂肪醇，乙酸脂肪醇，脂肪醛，脂肪胺，双官能脂肪酸衍生物等)。在其他示例性实施方案中，脂肪酸衍生物的混合物包括具有不同链长、饱和度和/或支化特性的脂肪酸酯(或另一种脂肪酸衍生物)的混合物。在其他示例性实施方案中，脂肪酸衍生物的混合物主要包含一种类型的脂肪酸衍生物，例如中链脂肪酸衍生物组合物。在其他示例性实施方案中，脂肪酸衍生物的混合物包含多于一种类型的脂肪酸衍生物产物(例如具有不同链长、饱和度和/或支化特性的脂肪酸衍生物)的混合物。在其他示例性实施方案中，脂肪酸衍生物的混合物包含脂肪酸酯和β-羟基酯的混合物。在其他示例性实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包含脂肪醇和脂肪醛的混合物。在其他示例性实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包含FAME和/或FAEE的混合物，特别是中链FAME和/或FAEE的混合物。在其他示例性实施方案中，脂肪酸衍生物组合物包含乙酸脂肪醇酯(FACE)的混合物，特别是中链乙酸脂肪醇酯(FACE)的混合物。
如本文所用，术语“核苷酸”具有其本领域已知的惯常含义。除了指天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体外，术语“核苷酸”涵盖核苷酸类似物和修饰的核苷酸，例如氨基修饰的核苷酸。另外，“核苷酸”包括非天然存在的类似物结构。因此，例如，各自含有碱基的肽核酸的个体单元在本文中可以称为核苷酸。
术语“多核苷酸”是指通常处于磷酸二酯键联的核糖核苷酸(RNA)或脱氧核糖核苷酸(DNA)的聚合物，其可以是单链或双链的，并且可以包含天然和/或非天然和/或改变的核苷酸。术语“多核苷酸”、“核酸序列”和“核苷酸序列”在本文可互换使用，是指任何长度的核苷酸(RNA或DNA)的聚合形式。这些术语是指分子的一级结构，因此包括单链、双链、三链、四链、部分双链、分支、发夹、环状、呈挂锁构型等的多核苷酸。术语等同地包括由核苷酸类似物和修饰的多核苷酸(例如但不限于甲基化和/或加帽的多核苷酸)制成的RNA或DNA的类似物。多核苷酸可以是任何形式，包括但不限于质粒、病毒、染色体、EST、cDNA、mRNA和rRNA，并且可以通过任何已知方法包括合成、重组、离体产生或其组合以及利用本领域已知的任何纯化方法来制备。
如本文所用，术语“多肽”和“蛋白质”可互换使用，是指长度通常为12个或更多个氨基酸的氨基酸残基的聚合物。长度小于12个氨基酸的多肽在本文中称为“肽”。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。术语“重组多肽”是指通过重组技术产生的多肽，其中通常将编码表达的蛋白质的DNA或RNA插入合适的表达载体中，所述合适的表达载体进而用于转化宿主细胞以产生多肽。在一些示例性实施方案中，将编码表达的肽、多肽或蛋白质的DNA或RNA通过同源重组或本领域公知的其他方式插入宿主染色体，并因此用于转化宿主细胞以产生肽或多肽。类似地，术语“重组多核苷酸”或“重组核酸”或“重组DNA”是通过本领域技术人员已知的重组技术产生的(例如参见Sambrook等人，Molecular Cloning--A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press第4版(Cold Spring Harbor,N.Y.2012)或Current Protocols in Molecular Biology第1-3卷,John Wiley&Sons,Inc.(1994-1998)及增刊1-115(1987-2016)中描述的)。
术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以类似于天然存在的氨基酸的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸，以及后来被修饰的那些氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢、羧基、氨基和R基团结合的碳，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这样的类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留与天然氨基酸相同的基本化学结构。天然编码的氨基酸是20种常见氨基酸(丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸，甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，甲硫氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。在一些示例性实施方案中，下表中列出的单字母代码用于指20种常见天然氨基酸的特定成员。单字母氨基酸代码是本领域众所周知的(参见例如Lehninger，同上)。
<u>氨基酸</u> <u>单字母代码</u> <u>氨基酸</u> <u>单字母代码</u>
甘氨酸 G 脯氨酸 P
丙氨酸 A 缬氨酸 V
亮氨酸 L 异亮氨酸 I
甲硫氨酸 M 半胱氨酸 C
苯丙氨酸 F 酪氨酸 Y
色氨酸 W 组氨酸 H
赖氨酸 K 精氨酸 R
谷氨酰胺 Q 天冬酰胺 N
谷氨酸 E 天冬氨酸 D
丝氨酸 S 苏氨酸 T
当提及两个核苷酸或多肽序列时，通过在比较窗口中比较两个最佳比对的序列来确定两个序列之间的“序列同一性百分比”，其中对于两个序列的最佳比对，比较窗口中的多核苷酸序列的部分可与参考序列(不包含添加或缺失)相比包括添加或缺失(即缺口)。“序列同一性百分比”是通过确定两个序列中相同核酸碱基或氨基酸残基出现的位置数以产生匹配的位置数、将匹配的位置数除以比较窗口中的位置总数和将结果乘以100以产生序列同一性百分比来计算的。
因此，在两个或多个核酸序列或肽或多肽的上下文中，表述“同一性百分比”或等同地“序列同一性百分比”是指相同或具有特定百分比的相同核苷酸或氨基酸的两个或更多个序列或子序列(例如，当在比较窗口或指定区域上就最大对应性进行比较和对齐时，约50％的同一性，优选55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)，如例如以默认参数使用BLAST或BLAST 2.0序列比较算法(参见例如Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215(3):403-410)和/或NCBI网站ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)或通过手动比对和目视检查测量的。两个核酸或氨基酸序列之间的序列同一性百分比也可以使用例如已被并入GCG软件包的GAP程序中的Needlemanand Wunsch算法、使用Blossum 62矩阵或PAM250矩阵以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重和1、2、3、4、5或6的长度权重来确定(Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:444-453)。两个核苷酸序列之间的序列同一性百分比也可以使用GCG软件包中的GAP程序、使用NWSgapdna.CMP矩阵和40、50、60、70或80的缺口权重、1、2、3、4、5或6的长度权重来确定。本领域普通技术人员可以执行初始序列同一性计算并相应地调整算法参数。如果从业者不确定应使用哪些参数来确定分子是否在权利要求的同源性限制之内，则可以使用的一组参数是空位罚分为12、空位延伸罚分为4和移码空位罚分为5的Blossum 62评分矩阵。在生物技术领域中已知其他的序列比对方法(参见例如Rosenberg(2005)BMC Bioinformatics 6:278；Altschul等人，(2005)FEBS J.272(20):5101-5109)。
当两个或更多个核酸或氨基酸序列如上所述进行比对和分析并且发现它们在指定区域内具有约50％的同一性，优选55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性时，它们被称为“基本相同”。如果两个核酸序列或多肽序列中的核苷酸或氨基酸残基的序列如上所述就最大对应性进行比对时是相同的，则该两个核酸序列或多肽序列被称为“相同”。该定义也涉及或可以用于测试序列的评估(compliment)。通常在长度为至少约25个氨基酸或核苷酸的区域上或更优选在长度为50-100个氨基酸或核苷酸的区域上或在给定序列的整个长度上计算同一性。
表述“在低严格性、中等严格性、高严格性或非常高严格性条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指南可以在例如Current Protocols in MolecularBiology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中找到。在引用的参考文献中描述了水性和非水性方法，并且可以使用任一种方法。本文提及的特定杂交条件如下：(1)低严格性杂交条件-在约45℃下6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，然后至少在50℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中洗涤两次(对于低严格性条件，洗涤温度可提高至55℃)；(2)中等严格性杂交条件-在约45℃下6X SSC，然后在60℃下在0.2X SSC、0.1％SDS中进行一次或多次洗涤；(3)高严格性杂交条件-在约45℃下6X SSC，然后在65℃下在0.2.X SSC、0.1％SDS中进行一次或多次洗涤；和(4)非常高严格性杂交条件-在65℃下0.5M磷酸钠、7％SDS，然后在65℃下在0.2XSSC、1％SDS在进行一次或多次洗涤。除非另有说明，否则非常高严格性条件(4)是首选条件。
如本文所用，术语“内源的”是指从细胞内产生的物质，例如核酸、蛋白质等。因此，“内源”多核苷酸或多肽是指细胞产生的多核苷酸或多肽。在一些示例性实施方案中，“内源”多肽或多核苷酸由亲代细胞(或宿主细胞)的基因组编码。在其他示例性实施方案中，“内源”多肽或多核苷酸由亲代细胞(或宿主细胞)携带的自主复制质粒编码。在一些示例性实施方案中，“内源”基因是当最初从自然界中分离细胞时存在于细胞中的基因，即，该基因“对细胞是天然的”。在其他示例性实施方案中，“内源”基因已经通过重组技术例如通过改变控制序列和编码序列的关系而改变。因此，在一些示例性实施方案中，“异源”基因对于宿主细胞可以是“内源的”。
相反，“外源”多核苷酸或多肽或其他物质(例如，脂肪酸衍生物、小分子化合物等)是指不是由亲代细胞产生并因此是从细胞外向细胞、细胞培养物或测定添加的多核苷酸或多肽或其他物质。
如本文所用，术语“天然的”是指从自然界分离的核酸、蛋白质、多肽或其片段的形式，或者是无意引入突变的核酸、蛋白质、多肽或其片段的形式。
如本文所用，术语多肽的“片段”是指全长多肽或蛋白质的较短部分，其大小范围为两个氨基酸残基至整个氨基酸序列减去一个氨基酸残基。在本公开内容的某些实施方案中，片段是指多肽或蛋白质的结构域(例如，底物结合结构域或催化结构域)的整个氨基酸序列。
术语“诱变”是指以稳定的方式改变生物体的遗传信息以产生“突变体”或“变体”的过程。蛋白编码核酸序列的诱变以产生突变体核酸序列产生突变体蛋白。诱变还指非编码核酸序列的变化。在一些示例性实施方案中，非编码核酸序列中的突变导致修饰的蛋白质活性。
因此，如本文所用，“突变”是指基因的核酸位置或多肽或蛋白质的氨基酸位置(残基)的永久变化。实际上，在多核苷酸的上下文中，术语“突变”是指对多核苷酸序列的修饰，从而导致相对于对照或参考多核苷酸序列的多核苷酸序列的改变。在一些示例性实施方案中，突变多核苷酸序列是指不改变编码的氨基酸序列的改变，例如，关于出于表达目的的密码子优化。在其他示例性实施方案中，多核苷酸序列中的突变以导致对编码的氨基酸序列进行修饰的方式修饰密码子。因此，与编码对照硫酯酶的多核苷酸相比，编码具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力的改造的硫酯酶变体的多核苷酸将具有至少一个突变。
类似地，在蛋白质的上下文中，术语“突变”或“突变的”是指对氨基酸序列的修饰，从而导致相对于对照或参考蛋白质序列的蛋白质序列的改变。突变可以指一个氨基酸被另一种氨基酸取代，或一个或多个氨基酸残基的插入或缺失。在一些示例性实施方案中，“突变”是用非天然氨基酸或化学修饰的氨基酸残基替代氨基酸。在其他示例性实施方案中，“突变”是序列或子序列中相对于前体序列的截短(例如，缺失或中断)或通过从一端或另一端的缺失而导致的序列的缩短。在其他示例性实施方案中，突变是在蛋白质内或在蛋白质的任一末端添加氨基酸或子序列(例如，在一个区段中的两个或更多个氨基酸，其插入前体蛋白序列中的两个连续氨基酸之间)，从而增加蛋白质的长度(或延长蛋白质)。可以通过本领域普通技术人员已知的许多方法将突变引入多核苷酸，包括例如随机诱变、位点特异性诱变、寡核苷酸定向诱变、基因改组、定向进化技术、组合诱变、化学合成、位点饱和诱变等。
如本文所用，术语“突变体”或等同地“变体”是指包含至少一个突变的多核苷酸序列或多肽序列。因此，与对照硫酯酶相比，具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力的改造的硫酯酶变体在其多肽序列中将具有至少一个突变。
如本文所用，术语“改造的硫酯酶变体”是指与SEQ ID NO:1相比具有至少一个突变的突变体或硫酯酶变体，其中硫酯酶变体对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性。
如本文所用的术语“基因”是指编码RNA产物或蛋白质产物的核酸序列，例如DNA序列，以及影响RNA或蛋白质产物的表达的可操作连接的核酸序列(例如表达控制序列，例如启动子、增强子、核糖体结合位点、翻译控制序列等)。术语“基因产物”是指从特定基因表达的RNA例如tRNA、mRNA和/或蛋白质。
如本文关于基因所用的，术语“表达”或“表达的”是指基因的一种或多种转录和/或翻译产物的产生。在示例性实施方案中，细胞中DNA分子的表达水平是基于细胞内存在的相应mRNA的量或细胞产生的DNA编码的蛋白质的量来确定的。术语“表达的基因”是指转录成信使RNA(mRNA)然后翻译成蛋白质的基因，以及转录成其他类型RNA(例如转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)和调节性RNA(其不翻译成蛋白质))的基因。
细胞或无细胞系统中核酸分子的表达水平受“表达控制序列”或等同地“调控序列”的影响。“表达控制序列”或“调控序列”是本领域已知的，并且包括例如提供多核苷酸序列在宿主细胞中的表达的启动子、增强子、聚腺苷酸化信号、转录终止子、影响RNA稳定性的核苷酸序列、内部核糖体进入位点(IRES)等。在示例性实施方案中，“表达控制序列”与参与转录的细胞蛋白特异性相互作用(参见例如Maniatis等人，Science,236:1237-1245(1987)；Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology,Vol.185,Academic Press,San Diego,Calif.(1990))。在示例性方法中，表达控制序列可操作地连接至多核苷酸序列。“可操作地连接”是指多核苷酸序列和表达控制序列在功能上连接以当适当的分子(例如转录激活蛋白)接触表达控制序列时允许多核苷酸序列表达。在示例性实施方案中，可操作地连接的启动子在转录和翻译的方向方面位于所选的多核苷酸序列的上游。在一些示例性实施方案中，可操作地连接的增强子可以位于所选多核苷酸的上游、内部或下游。
通常，“最小抑制浓度”(MIC)是在过夜孵育后将抑制微生物的可见生长的抗微生物物质的最低浓度。MIC可以在固体生长培养基或肉汤稀释方法的板上测定。例如，为了通过肉汤稀释来鉴定MIC，将相同剂量的细菌培养在含有逐渐降低的药物浓度的液体培养基的孔中。抗生素的最小抑制浓度在没有细菌生长的最后一个孔的浓度与允许细菌生长的下一个较低剂量的浓度之间。如本文所用，表述“最小抑制浓度”或“MIC”是指化合物的浓度，其导致微生物培养物在24小时孵育期内相对于对照的生长减少50％。在一个实施方案中，通过在不同浓度的潜在毒性化合物中培养细胞例如大肠杆菌细胞的培养物，然后测定在存在潜在毒性化合物的情况下在24小时内培养物已发生的生长量来测量潜在毒性化合物例如辛醇的“最小抑制浓度”。在示例性实施方案中，通过测量生长24小时后来自裂解的培养物的总蛋白作为培养物中的细胞总数的量度，来测量培养物的生长。
如本文所用，蛋白质/多肽例如改造的硫酯酶变体的“修饰的活性”或“改变的活性水平”是指蛋白质/多肽的活性在一种或多种特性上相比于合适的对照蛋白例如相应的亲本蛋白或相应的野生型蛋白的特性的差异。因此，在示例性实施方案中，通过测量重组宿主细胞中修饰的蛋白质的活性并将其与在其他方面同基因的宿主细胞中相应的对照蛋白的相同活性的量度进行比较，来确定与相应的对照蛋白相比具有“修饰的活性”的蛋白质的活性的差异。修饰的活性可以是例如蛋白质结构的变化(例如，一级结构的变化，例如蛋白质的核苷酸编码序列的变化，其导致底物特异性的变化、观察到的动力学参数的变化、溶解度的变化等)；蛋白质稳定性的变化(例如蛋白质的增加的或降低的降解)等的结果。在一些示例性实施方案中，具有“修饰的活性”的多肽是本文公开的突变的或改造的TE变体。
在示例性实施方案中，本文公开的多肽具有“修饰的活性”，即例如“改善的活性水平”。如本文所用，表述“改善的活性水平”是指与相应的对照多肽在相同条件下的生物化学和/或生物学功能水平相比，具有更高水平的生物化学或生物学功能(例如DNA结合或酶促活性)的多肽。改善的活性的程度可以为约10％或更多，约20％或更多，约50％或更多，约75％或更多，约100％或更多，约200％或更多，约500％或更多，约1000％或更高，或其中的任何范围。
因此，“改善的活性”可以指多肽的改善的催化活性或改善的催化效率，其中催化效率是指例如通过这种多肽酶催化的反应的反应速率的增加。催化活性/催化效率可以例如通过改善反应的一个或多个动力学参数(测量的或计算的)(例如Vmax(反应可以进行的最大速率)、Km(米氏常数)、kcat(每个酶分子每秒周转的底物分子的数目)等，或此类参数之间的任何比率，例如kcat/Km(酶效率的量度))来改善。因此，可以以任何数量的方式测量多肽的“改善的催化活性”或“改善的催化效率”。例如，“改善的活性”可以测量为效价的增加(浓度：g/L或mg/L或g/Kg)、组成的变化(产生的特定脂肪酸种类/总脂肪酸衍生物(FAS)的量)、分子成分的改善的比率(例如C8/C10含量或C10/C12含量等)或由表达改善的活性的酶的重组细胞产生的产物的FOC(相对对照的倍数，见下文)的增加。
因此，如本文所用的表述“对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性”或“对产生中链长度的脂肪酸衍生物具有改善的活性”或“对产生中链脂族化合物具有改善的活性”或“具有改善的产生中链长度的脂肪酸衍生物的能力”或“具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力”是指多肽/蛋白质的“改善的活性”，例如“改善的催化活性”，其导致在相同条件下与合适的对照多肽/蛋白质相比中链脂肪酸衍生物种类(具有长度为6-10个碳的烷基链的脂肪酸和脂肪酸衍生物)的产生增加。
在一些示例性实施方案中，多肽/蛋白质“对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性”或等同地“具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力”对产生特定链长的中链脂肪酸衍生物具有改善的活性。因此，例如本文所用的表述“对产生C8脂肪酸衍生物具有改善的活性”是指具有“改善的催化活性”或“改善的活性”的多肽/蛋白质，其导致八碳脂肪酸衍生物的产生增加(测量为例如％C8 FAS，增加的C8/C10比率等)。
类似地，在一些示例性实施方案中，多肽/蛋白质“对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性”或等同地“具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力”具有“改善的产生C10脂肪酸衍生物的活性”。因此，这种多肽/蛋白质具有“改善的活性”，其导致十碳脂肪酸衍生物的产生增加(测量为例如％C10 FAS，增加的C10/C12比率等)。
如本文所用，表述“相对对照的倍数”或等同地“FOC”是指包含改造的硫酯酶变体的细胞所测量的特定度量与适当的对照细胞(例如包含不具有改造的变异的对照硫酯酶的同基因宿主细胞)中测量的相同度量的比率。因此，通常，FOC等于变体的度量A/对照的度量A(在一些示例性实施方案中，％C8的FOC意指与合适的对照(例如包含未被改造以包含特定变异的硫酯酶的同基因对照)的％C8相比，由包含改造的硫酯酶变体产生的％C8。因此，在一个示例性实施方案中，具有％C8的FOC为1.1的包含改造的硫酯酶变体的重组细胞表明，与包含对照硫酯酶的同基因对照的％C8相比，包含改造的硫酯酶变体的细胞产生的八碳脂肪酸衍生物的百分比的10％的改善(增加)。
“对照”样品例如“对照”核苷酸序列、“对照”多肽序列、“对照”细胞等或值是指用作参考(通常是已知的参考)的样品，用于与测试样品进行比较。例如，在一个示例性实施方案中，测试样品包含由改造的硫酯酶变体制成的脂肪酸衍生物组合物，而对照样品包含由相应或指定的未修饰/非硫酯酶变体(例如，SEQ ID NO:1)制成的脂肪酸衍生物组合物。本领域技术人员将认识到，可以将对照设计用于评估任意数量的参数。此外，本领域技术人员将理解在给定情况下哪些对照是有价值的，并且将能够基于与对照值的比较来分析数据。
如本文所用，术语“重组”是指遗传修饰的多核苷酸、多肽、细胞、组织或生物。术语“重组”同等地适用于第一代遗传修饰的多核苷酸、多肽、细胞、组织或生物，以及遗传修饰的多核苷酸、多肽、细胞、组织或生物的携带遗传修饰的后代。
当用于指细胞时，术语“重组”表示该细胞已通过引入异源核酸或蛋白质而被修饰或已通过天然核酸或蛋白质的改变而被修饰，或细胞衍生自这样修饰的细胞，并且衍生的细胞包含该修饰。因此，例如，“重组细胞”或等同地“重组宿主细胞”可以被修饰以表达在细胞的天然(非重组)形式中找不到的基因，或者可以被修饰以异常表达天然基因，例如天然基因可以过表达、表达不足或根本不表达。在示例性实施方案中，“重组细胞”或“重组宿主细胞”被改造以表达异源硫酯酶，例如改造的硫酯酶变体，其对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性。重组细胞可以衍生自微生物，例如细菌、病毒或真菌。另外，重组细胞可以衍生自植物或动物细胞。在示例性实施方案中，“重组宿主细胞”或“重组细胞”用于产生一种或多种脂肪酸衍生物，包括但不限于脂肪酸、脂肪酯(例如蜡，脂肪酸酯，脂肪酯，脂肪酸甲酯(FAME)，脂肪酸乙酯(FAEE))、乙酸脂肪醇酯(FAce)、脂肪醇、脂肪醛、烃、脂肪胺、末端烯烃、内烯烃、酮、双功能脂肪酸衍生物(例如ω-羟基脂肪酸，ω-羟基二醇，ω-羟基FAME，ω-羟基FAEE)等。因此，在一些示例性实施方案中，“重组宿主细胞”是“生产宿主”或等同地“生产宿主细胞”。在一些示例性实施方案中，重组细胞包含一种或多种多核苷酸，其各自编码具有脂肪酸生物合成酶活性的多肽，其中当在碳源存在下在有效表达多核苷酸的条件下培养时，重组细胞产生脂肪酸衍生物组合物。
当用于指多核苷酸时，术语“重组”或等同地“异源”表示该多核苷酸已经通过与天然的或天然存在形式的多核苷酸相比而被修饰，或者已经通过与天然存在的多核苷酸的变体相比而被修饰。在一个示例性实施方案中，重组多核苷酸(或重组多核苷酸的拷贝或补体)是已经被人为操纵以不同于其天然存在形式的多核苷酸。因此，在一个示例性实施方案中，重组多核苷酸是天然基因的突变形式或天然基因的天然存在的变体的突变形式，其中所述突变是通过有意的人为操作进行的，例如，通过使用诱变寡核苷酸的饱和诱变、通过使用UV辐照或诱变化学物质等来进行。相对于天然的或天然存在的变体形式的基因，这样的重组多核苷酸可以包含一个或多个点突变、缺失和/或插入。类似地，包含与第二多核苷酸(例如，编码序列)可操作连接的启动子的多核苷酸是“重组”多核苷酸。因此，重组多核苷酸包含自然界中未发现的多核苷酸组合。重组蛋白(如上文讨论的)通常是从重组多核苷酸表达的蛋白，并且重组细胞、组织和生物是包含重组序列(多核苷酸和/或多肽)的那些。
如本文所用，术语“微生物”通常是指微观生物。微生物可以是原核的或真核的。示例性的原核微生物包括例如细菌、古细菌、蓝细菌等。示例性的细菌是大肠杆菌。示例性的真核微生物包括例如酵母、原生动物、藻类等。在示例性实施方案中，“重组微生物”是已被遗传改变并因此表达或包含异源核酸序列和/或异源蛋白质的微生物。
“生产宿主”或等同地“生产宿主细胞”是用于产生产物的细胞。如本文所公开的，“生产宿主”通常被修饰以表达或过表达所选基因，或具有所选基因的减弱的表达。因此，“生产宿主”或“生产宿主细胞”是“重组宿主”或等同地“重组宿主细胞”。生产宿主的非限制性实例包括植物、动物、人、细菌、酵母、蓝细菌、藻类和/或丝状真菌细胞。示例性的“生产宿主”是重组大肠杆菌细胞。
如本文所用，“酰基-ACP”是指在酰基链的羰基碳与酰基载体蛋白(ACP)的磷酸泛酰巯基乙胺基部分的巯基之间形成的酰基硫酯。在一些示例性实施方案中，酰基-ACP是完全饱和的酰基-ACP的合成中的中间体。在其他示例性实施方案中，酰基-ACP是不饱和酰基-ACP的合成中的中间体。在一些示例性实施方案中，酰基-ACP的酰基的碳链具有5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个碳。在其他示例性实施方案中，酰基-ACP的酰基的碳链是中链并且具有6、7、8、9、10、11或12个碳。在其他示例性实施方案中，酰基-ACP的酰基的碳链的长度为8个碳。在其他示例性实施方案中，酰基-ACP的酰基的碳链的长度为10个碳。这些酰基-ACP中的每一个都是酶(例如硫酯酶，例如改造的硫酯酶变体，其将酰基-ACP转化为脂肪酸衍生物)的底物。
如本文所用，表述“脂肪酸衍生物生物合成途径”是指产生脂肪酸衍生物的生化途径。因此，包含“脂肪酸衍生物生物合成途径”的酶在本文中被称为“脂肪酸衍生物生物合成多肽”或等同地“脂肪酸衍生物酶”。如上文所讨论，术语“脂肪酸衍生物”包括衍生自包括硫酯酶反应的生化途径的分子/化合物。因此，硫酯酶(例如，具有硫酯酶活性EC 3.1.1.14的酶)是“脂肪酸衍生物生物合成肽”或等同地“脂肪酸衍生物酶”。除硫酯酶外，脂肪酸衍生物的生物合成途径可包括其他酶，以产生具有所需特性的脂肪酸衍生物。因此，术语“脂肪酸衍生物酶”或等同地“脂肪酸衍生物生物合成多肽”是指共同地和单独地，可以表达或过表达以产生脂肪酸衍生物的酶。“脂肪酸衍生物酶”或等同地“脂肪酸衍生物生物合成多肽”的非限制性实例包括例如脂肪酸合成酶，硫酯酶，酰基-CoA合成酶，酰基-CoA还原酶，酰基ACP还原酶，醇脱氢酶，醇O-酰基转移酶，形成脂肪醇的酰基-CoA还原酶，脂肪酸脱羧酶，脂肪醛脱羰基酶和/或氧化去甲酰基酶，羧酸还原酶，脂肪醇O-乙酰基转移酶，酯合酶等。“脂肪酸衍生物酶”或等同地“脂肪酸衍生物生物合成多肽”将底物转化为脂肪酸衍生物。在示例性实施方案中，用于脂肪酸衍生物酶的合适底物可以是第一脂肪酸衍生物，其被脂肪酸衍生物酶转化为不同的第二脂肪酸衍生物。
如本文所用，术语“培养物”是指包含活细胞的液体培养基。在一个实施方案中，培养物包含在受控条件下在预定培养基中生长的细胞，例如，包含在所选碳源和氮的液体培养基中生长的重组宿主细胞的培养物。“培养”或“培养程序”是指在合适的条件下在液体或固体培养基中生长宿主细胞(例如重组宿主细胞)群体。在某些实施方案中，培养是指底物生物转化为终产物。培养的培养基是众所周知的，并且这种培养基的各个组分可从商业来源获得，例如DifcoTM培养基和BBLTM培养基。在一个非限制性实例中，水性营养培养基是包含氮、盐和碳的复杂来源的“丰富培养基”，例如YP培养基，其包含10g/L的蛋白胨和10g/L的酵母提取物。
如本文所用，术语“效价”是指每单位体积的宿主细胞培养物产生的脂肪酸衍生物例如中链脂肪酸衍生物的量。效价可以指特定脂肪酸衍生物例如中链脂肪酸衍生物或不同链长或不同官能度的脂肪酸衍生物的组合物例如由给定的重组宿主细胞培养物产生的饱和和不饱和中链脂肪酸衍生物的混合物或脂肪酸衍生物组合物的量。
如本文所用，表述“商业效价”或“商业上的效价”是指每单位体积宿主细胞培养物产生的脂肪酸衍生物例如中链脂肪酸衍生物的量，其使得商业产生在经济上可行。通常，商业效价在约10g/L(或等同地10g/Kg)至约200g/L或更高的范围内。因此，商业效价为10g/L或更高，20g/L或更高，30g/L或更高，40g/L或更高，50g/L或更高，60g/L或更高，70g/L或更高，80g/L或更高，90g/L或更高，100g/L或更高，110g/L或更高，120g/L或更高，130g/L或更高，140g/L或更高，150g/L或更高，160g/L或更高，170g/L或更高，180g/L或更高，190g/L或更高，200g/L或更高。
如本文所用，“脂肪酸衍生物的产率”，例如由“宿主细胞”产生的中链脂肪酸衍生物或其他化合物的产率，是指在宿主细胞中将输入碳源转化为产物(即中链脂肪酸衍生物)的效率。因此，表述“脂肪酸衍生物的产率”是指从给定量的碳底物产生的产物的量。产率百分比是理论产率的百分比(在理想条件下合成的产物，没有碳或能量的损失)。因此，产率百分比＝(产物质量/理论收率质量)×100。产率可以指特定的中链脂肪酸衍生物或脂肪酸衍生物的组合。
如本文所用，术语“生产率”是指每单位体积的宿主细胞培养物每单位时间产生的中链脂肪酸衍生物(例如6-碳脂肪酸衍生物，8-碳脂肪酸衍生物，10-碳脂肪酸衍生物等)的量。生产率可以指由给定宿主细胞培养物产生的特定的8和/或10碳脂肪酸衍生物或脂肪酸衍生物的组合或其他化合物。因此，在示例性实施方案中，与表达相应对照硫酯酶或其他合适对照的重组宿主细胞相比，改造的硫酯酶变体在重组宿主细胞例如大肠杆菌中的表达导致8和/或10碳脂肪酸衍生物和/或其他化合物的生产率提高。如本文所用，术语“总脂肪酸种类”和“总脂肪酸产物”和“总脂肪酸衍生物”在本文中可以关于由宿主细胞例如表达改造的硫酯酶变体的宿主细胞产生的脂肪酸衍生物的量(滴定度)互换使用。总脂肪种类等可以通过带有火焰离子化检测器的气相色谱法(GC-FID)进行评估。该相同的术语在提及总脂肪酸衍生物分析时可以用于意指例如总脂肪酯、总脂肪醇、总脂肪醛、总脂肪胺和总游离脂肪酸。具体而言，该相同的术语可以用于意指总脂肪酸甲酯、脂肪酸乙酯或乙酸脂肪醇酯。
如本文所用，术语“碳源”是指适合用作原核或简单真核细胞生长的碳源的底物或化合物。碳源可以是多种形式，包括但不限于聚合物、碳水化合物、酸、醇、醛、酮、氨基酸、肽和气体(例如，CO和CO2)。示例性碳源包括但不限于单糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖；寡糖，例如低聚果糖和低聚半乳糖；多糖，例如淀粉、纤维素、果胶和木聚糖；二糖，例如蔗糖、麦芽糖、纤维二糖和松二糖；纤维素材料及其变体，例如半纤维素、甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；饱和或不饱和脂肪酸，琥珀酸酯，乳酸酯和乙酸酯；醇，例如乙醇、甲醇和甘油，或它们的混合物。碳源也可以是光合作用的产物，例如葡萄糖。在某些实施方案中，碳源是生物质。在其他实施方案中，碳源是葡萄糖。在其他实施方案中，碳源是蔗糖。在其他实施方案中，碳源是甘油。在其他实施方案中，碳源是简单的碳源。在其他实施方案中，碳源是可再生碳源。在其他示例中，碳源是天然气或天然气的成分，例如甲烷、乙烷、丙烷等。
如本文所用，术语“生物质”是指碳源所源自的任何生物材料。在一些实施方案中，将生物质加工成碳源，其适合于生物转化。在其他实施方案中，生物质不需要进一步加工成碳源。碳源可以转化为包含中链脂肪酸衍生物的组合物。
生物质的示例性来源是植物有机物质或植物，例如源自玉米、甘蔗、柳枝、水稻、小麦、硬木、软木、棕榈、大麻等。生物质的另一示例性来源是代谢废物，例如动物有机物质(例如牛粪)。生物质的其他示例性来源包括藻类和其他海洋植物，例如大型藻类和海带。生物质还包括来自工业、农业、林业和家庭的废物，包括但不限于甘油、发酵废物、青贮饲料、稻草、木材、纸浆、污水、垃圾、纤维素城市废物、市政固体废物、油脂化学废物、和剩余的食物(例如肥皂、油和脂肪酸)。术语“生物质”也可以指碳源，例如碳水化合物(例如单糖、二糖或多糖)。
如本文所用，关于产物(例如中链脂肪酸衍生物)的术语“分离的”是指与细胞组分、细胞培养基或化学或合成前体分离的产物。通过本文公开的方法产生的中链脂肪酸衍生物在发酵液以及在细胞质中可以相对不混溶。因此，在示例性实施方案中，中链脂肪酸衍生物在细胞外聚集在有机相中，并因此是“分离的”。
如本文所用，术语“纯化”、“纯化的”或“净化”是指通过例如分离(isolation)或隔离(separation)将分子从其环境中除去或分离。“基本上纯化的”分子相对于其所缔合于的其他成分是至少约60％游离的(例如，至少约65％游离的，至少约70％游离的，至少约75％游离的，至少约80％游离的，至少约85％游离的，至少约90％游离的，至少约95％游离的，至少约96％游离的，至少约97％游离的，至少约98％游离的，至少约99％游离的)。如本文所用，这些术语还指从样品中去除污染物。例如，去除污染物可导致样品中的中链脂肪酸衍生物或其他化合物的百分比增加。例如，当在重组宿主细胞中产生中链脂肪酸衍生物或其他化合物时，中链脂肪酸衍生物或其他化合物可以通过去除宿主细胞生物质或其组分(例如蛋白质、核酸和其他细胞成分)来纯化，只要它们被裂解。纯化后，样品中的丙二酰CoA衍生化合物包括中链脂肪酸衍生物或其他化合物的百分比增加。术语“纯化”、“纯化的”和“净化”是相对术语，其不需要绝对纯度。因此，例如，当在重组宿主细胞中产生中链脂肪酸衍生物时，中链脂肪酸衍生物与其他细胞成分(例如，核酸、多肽、脂质、碳水化合物或其他烃)基本分离。
如本文所用，术语“减弱”是指减弱、减少或减小。例如，可以通过例如修饰多肽结构以降低其活性(例如，通过修饰编码该多肽的核苷酸序列)来减弱多肽的活性。
I.引言
如上所述，对中链脂肪酸(MCFA)衍生物和中链脂肪酸(MCFA)衍生的产物非常感兴趣。MCFA因其许多有利特性而受到重视。实际上，MCFA已发现例如用作表面活性剂、粘合剂、乳化剂、食用油、调味剂、香料、单体、聚合物、天然产物杀虫剂和抗菌剂等的可再生和可生物降解的成分。
由于它们的许多用途，在工业和营养保健应用中对中链脂肪酸衍生物化合物的需求在过去几年中呈上升趋势并且持续增长。然而，不幸的是，中链脂肪酸衍生物的供应很大程度上与从植物或从化学合成产生其他长链游离脂肪酸产品有关；因此，供应非常易挥发且不稳定。
因此，本领域需要能够为MCFA及其衍生物提供稳健而稳定的供应链的材料和方法。幸运的是，本公开内容提供了需要的工具和方法来支持对中链脂肪酸衍生物的稳健、选择性和稳定的供应链，并因此满足了这一需求和其他需求。
II.对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造的硫酯酶变体
A.一般方法
本公开内容利用重组遗传学领域中的常规技术。公开了分子生物学和遗传学中一般方法和术语的基础文献包括例如Sambrook等人，Molecular Cloning,a LaboratoryManual,Cold Spring Harbor Press第4版(Cold Spring Harbor,N.Y.2012)；CurrentProtocols in Molecular Biology第1-3卷,John Wiley&Sons,Inc.(1994-1998)和增刊1-115(1987-2016)。本公开内容还利用生物化学领域的常规技术。公开了生物化学中一般方法和术语的基础文献包括例如Lehninger Principles of Biochemistry第6版,DavidL.Nelson and Michael M.Cox eds.W.H.Freeman(2012)。本公开内容还利用工业发酵中的常规技术。公开了发酵中一般方法和术语的基础文献包括例如Principles ofFermentation Technology,第3版，Peter F.Stanbury,Allan Whitaker and StephenJ.Hall.Butterworth-Heinemann(2016)；Fermentation Microbiology andBiotechnology,第2版,E.M.T.El-Mansi,C.F.A.Bryce,Arnold L.Demain and A.R.Allmaneds.CRC Press(2007)。本公开内容还利用有机化学领域中的常规技术。公开了有机化学中一般方法和术语的基础文献包括例如Practical Synthetic Organic Chemistry:Reactions,Principles,and Techniques,Stephane Caron ed.,John Wiley and SonsInc.(2011)；The Synthetic Organic Chemist's Companion,Michael C.Pirrung,JohnWiley and Sons Inc.(2007)；Organic Chemistry,第9版-Francis Carey and RobertGiuliano,McGraw Hill(2013)。
对于核酸，大小以千碱基(kb)或碱基对(bp)给出。估计值通常来自琼脂糖或丙烯酰胺凝胶电泳、测序的核酸或公开的DNA序列。对于蛋白质，大小以千道尔顿(kDa)或氨基酸残基数给出。根据凝胶电泳、测序的蛋白质、衍生的氨基酸序列或公开的蛋白质序列估算蛋白质的大小。
不可商购获得的寡核苷酸可以例如根据首先由Beaucage&Caruthers,Tetrahedron Letts.22:1859-1862(1981)描述的固相亚磷酰胺三酯方法使用自动合成仪化学合成，如Van Devanter等人,Nucleic Acids Res.12:6159-6168(1984)中描述的。寡核苷酸的纯化例如通过天然的丙烯酰胺凝胶电泳或通过阴离子交换HPLC进行，如Pearson&Reanier,J.Chrom.255:137-149(1983)中描述的。
克隆的基因和合成的寡核苷酸的序列可以在克隆后使用例如Wallace等人，Gene16：21-26(1981)的对双链模板进行测序的链终止方法来验证。
B.硫酯酶
1.一般描述
硫酯酶或硫酯水解酶催化硫酯水解成酸和硫醇。硫酯酶(TE)根据其对不同底物的活性而被分类为EC 3.1.2.1至EC 3.1.2.27，还有许多未分类(EC 3.1.2.-)(参见例如Cantu,D.C.,等人(2010)Protein Science 19:1281-1295)。TE可从多种来源获得。示例性的TE包括植物TE(例如，参见Voelker and Davies,J.Bact.,Vol.,176,No.23,pp.7320-27,1994，美国专利号5,667,997和美国专利号5,455,167)，细菌TE(参见例如美国专利号9,175,234)；蓝细菌TE以及藻类、哺乳动物、昆虫和真菌来源。
具体而言，在EC编号3.1.2.14下分类的酰基-酰基载体蛋白(ACP)硫酯酶(TE)选择性地水解酰基-ACP的硫酯键并释放游离脂肪酸(FFA)和ACP。因此，酰基-ACP硫酯酶在确定脂肪酸衍生物的碳链长度上起着重要作用，该脂肪酸衍生物是由其烷基硫酯的水解产生的。
来自Cuphea hookeriana的FatB2硫酯酶(ChFatB2)是示例性的酰基-ACP硫酯。ChFatB2对中链长度的脂肪酸衍生物具有天然的高选择性。但是，这种植物酶在微生物如工业微生物大肠杆菌中表达时活性较低。如本文详细公开的，在微生物中产生中链长度脂肪酸的能力低是由其低活性、对C8和C10的选择性不足以及溶解性差引起的。
来自Cuphea hookeriana的野生型ChFatB2的多肽/蛋白序列具有GenBank登录号AAC49269(参见例如Dehesh,K.,等人(1996)The Plant Journal 9(2):167-72)。本文公开的ChFatB2多肽的氨基酸序列包含野生型序列，其中除去在野生型蛋白的N-末端包含植物易位前导序列的前88个氨基酸，并用甲硫氨酸(M)代替以促进在细菌的细胞质中酶的活性形式的产生。因此，本文公开为野生型(wt)ChFatB2的野生型ChFatB2硫酯酶的氨基酸序列在下面显示为SEQ ID NO:1：
MLPDWSRLLTAITTVFVKSKRPDMHDRKSKRPDMLVDSFGLESTVQDGLVFRQSFSIRSYEIGTDRTASIETLMNHLQETSLNHCKSTGILLDGFGRTLEMCKRDLIWVVIKMQIKVNRYPAWGDTVEINTRFSRLGKIGMGRDWLISDCNTGEILVRATSAYAMMNQKTRRLSKLPYEVHQEIVPLFVDSPVIEDSDLKVHKFKVKTGDSIQKGLTPGWNDLDVNQHVSNVKYIGWILESMPTEVLETQELCSLALEYRRECGRDSVLESVTAMDPSKVGVRSQYQHLLRLEDGTAIVNGATEWRPKNAGANGAISTGKTSNGNSVS(SEQ ID NO:1)
已知SEQ ID NO:1的活性对饱和的8碳(8:0)和饱和的十碳(10:0)ACP底物具有特异性(参见例如Dehesh,K.,等人(1996)，同上)。然而，不幸的是，SEQ ID NO:1所具有的产生中链长度脂肪酸衍生物的能力不足以大规模产生中链脂肪酸衍生物。因此，响应于对稳定和可靠地供应中链脂肪酸衍生物的需要，在示例性实施方案中，将SEQ ID NO:1改变以产生对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体。
因此，在示例性实施方案中，本公开内容提供了改造的TE变体多肽，其与具有SEQID NO:1的酶相比，对产生中链脂肪酸衍生物(例如中链脂肪酸酯，例如中链脂肪酸甲酯(FAME)和中链脂肪酸乙酯(FAEE)，中链乙酸脂肪醇酯(FACE)，中链脂肪胺，中链脂肪醛，中链脂肪醇，中链烃，中链脂肪酮，中链烷烃，中链末端烯烃，中链内烯烃，中链羟基脂肪酸衍生物，中链双官能脂肪酸衍生物，例如中链脂肪二酸，中链脂肪二醇，不饱和中链脂肪酸衍生物)具有改善的活性。
在一些示例性实施方案中，对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的SEQ IDNO:1的改造的TE变体(例如，SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:46)与非变体/非改造的对照硫酯酶例如SEQ ID NO:1相比，具有增加的净正表面电荷。
2.对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造的硫酯酶变体的测定
在示例性实施方案中，通过测量由包含改造TE变体的细菌菌株(即测试菌株)产生的中链脂肪酸衍生物(例如，游离脂肪酸(FFA)、脂肪酸乙酯、FAEE、脂肪醇(FALC)、乙酸脂肪醇酯(FACe)等)并将这些中链脂肪酸衍生物与由与测试菌株同基因的合适的对照测试菌株(除了其包含的对照TE之外)产生的中链脂肪酸衍生物(例如，FFA、FAEE、FALC、FACE等)的测量值进行比较来鉴定对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体。
在一些示例性实施方案中，测量中链脂肪酸衍生物的总效价并在测试菌株和对照菌株之间进行比较。在一些示例性实施方案中，测量由测试菌株产生的包含特定中链脂肪酸衍生物(例如C8脂肪酸衍生物)的中链脂肪酸衍生物的总效价的百分比，并将其与由与测试菌株同基因的合适的对照菌株(除了其包含的对照TE(例如SEQ ID NO:1)之外)产生的包含特定的中链脂肪酸衍生物的中链脂肪酸衍生物的总效价的百分比进行比较。
在示例性实施方案中，具有火焰离子化检测的气相色谱法(GC-FID)用于测定中链脂肪酸衍生物。GC-FID在本领域中是已知的(参见例如Adlard,E.R.；Handley,Alan J.(2001).Gas chromatographic techniques and applications.London:SheffieldAcademic)。但是，可以使用任何合适的定量和分析方法，例如质谱(MS)、气相色谱-质谱(GC-MS)、液相色谱-质谱(LC-MS)、薄层色谱(TLC)等。
C.制备改造的硫酯酶变体的方法
改造TE变体可以通过本领域已知的任何方法制备(参见例如Current Protocolsin Molecular Biology，同上)。因此，在示例性实施方案中，将诱变用于制备编码改造的TE变体的多核苷酸序列，然后可以针对产生中链脂肪酸衍生物的改善的活性对其进行筛选。在其他示例性实施方案中，可通过化学合成多核苷酸序列来制备编码改造TE变体的多核苷酸序列，然后可以针对产生中链脂肪酸衍生物的改善的活性对其进行筛选(参见例如M.H.Caruthers等人，(1987)Methods in Enzymology第154卷，287-313页；Beaucage,S.L.and Iyer,R.P.(1992)Tetrahedron 48(12):2223-2311)。
诱变方法是本领域众所周知的。用于制备对中链脂肪酸衍生物的产生具有改善的活性的改造TE变体的示例性诱变技术包括例如位点饱和诱变(参见例如ChronopoulouEG1,Labrou NE.Curr.Protoc.Protein Sci.2011Feb；Chapter 26:Unit 26.6,John Wileyand Sons,Inc；Steffens,D.L.and Williams.,J.G.K(2007)J Biomol Tech.18(3):147-149；Siloto,R.M.P and Weselake,R.J.(2012)Biocatalysis and AgriculturalBiotechnology 1(3):181-189)。
用于制备对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体的另一种示例性诱变技术包括转移PCR(tPCR)，参见例如Erijman A.等人，(2011)J.Struct.Biol.175(2):171-7。
其他示例性诱变技术包括例如易错聚合酶链反应(PCR)(参见例如Leung等人，(1989)Technique 1:11-15；和Caldwell等人，(1992)PCR Methods Applic.2:28-33)。
用于制备对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体的另一种示例性诱变技术包括使用寡核苷酸定向诱变(参见例如Reidhaar-Olson等人，(1988)Science241:53-57)以在任何克隆的目标DNA中产生位点特异性突变。
然后，将由任何合成或诱变方法(例如上文描述的那些)产生的诱变的多核苷酸克隆到合适的载体中，并如上所述评估由诱变的多核苷酸编码的受影响多肽的活性。
本领域普通技术人员将认识到，本文公开的方案和程序可以被修改，并且这样的修改是根据本公开内容的变型。例如，当以某种顺序描述方法步骤时，可以修改步骤的顺序和/或并行或顺序地执行步骤的顺序。
III.宿主细胞和宿主细胞培养物
鉴于本公开内容，本领域普通技术人员将理解，本文考虑的任何实施方案可以用可以通过引入编码公开的改造TE变体的一种或多种核酸序列进行遗传修饰的任何宿主细胞或微生物来实践。因此，本文公开的重组微生物充当宿主细胞并包含一种或多种多核苷酸序列，其包含编码对中链脂肪酸衍生物的产生具有改善的活性的改造的TE变体多肽的开放阅读框，以及促进改造TE变体多肽在宿主细胞中的表达的可操作地连接的调节序列。
提供合适的宿主细胞的示例性微生物包括但不限于来自以下属的细胞：埃希氏菌属(Escherichia)，芽孢杆菌属(Bacillus)，乳杆菌属(Lactobacillus)，发酵单胞菌属(Zymomonas)，红球菌属(Rhodococcus)，假单胞菌属(Pseudomonas)，曲霉属(Aspergillus)，木霉属(Trichoderma)，神经孢菌属(Neurospora)，镰刀菌属(Fusarium)，腐质霉菌(Humicola)，根瘤菌属(Rhizomucor)，克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)，毕赤酵母属(Pichia)，毛霉菌属(Mucor)，食丝菌属(Myceliophtora)，海杆菌属(Marinobacter)，青霉菌属(Penicillium)，白腐真菌属(Phanerochaete)，侧耳属(Pleurotus)，栓菌属(Trametes)，金小孢子属(Chrysosporium)，酵母菌属(Saccharomyces)，狭长平胞属(Stenotrophomonas)，裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)，子囊菌酵母属(Yarrowia)或链霉菌属(Streptomyces)。在一些示例性实施方案中，宿主细胞是革兰氏阳性细菌细胞。在其他示例性实施方案中，宿主细胞是革兰氏阴性细菌细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。在其他示例性实施方案中，宿主细胞是迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)细胞，短芽孢杆菌(Bacillus brevis)细胞，嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)细胞，地衣芽孢杆菌(Bacillus lichenoformis)细胞，嗜碱芽孢杆菌(Bacillus alkalophilus)细胞，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)细胞，圆环芽孢杆菌(Bacillus circulans)细胞，短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)细胞，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)细胞，克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)细胞，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)细胞或解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)细胞。
在其他示例性实施方案中，宿主细胞是康氏木霉(Trichoderma koningii)细胞，绿色木霉(Trichoderma viride)细胞，里氏木霉(Trichoderma reesei)细胞，长支木霉(Trichoderma longibrachiatum)细胞，泡盛曲霉(Aspergillus awamori)细胞，熏蒸曲霉(Aspergillus fumigates)细胞，富油曲霉(Aspergillus foetidus)细胞，构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞，黑曲霉(构巢曲霉)细胞，米曲霉(Aspergillus oryzae)细胞，特异腐质霉(Humicola insolens)细胞，疏绵状毛腐质霉(Humicola lanuginose)细胞，不透明红球菌(Rhodococcus opacus)细胞，米氏根瘤菌(Rhizomucor miehei)细胞或米氏毛霉菌(Mucor michei)细胞。在其他示例性的其他实施方案中，宿主细胞是青紫链霉菌(Streptomyces lividans)细胞或粘链链霉菌(Streptomyces murinus)细胞。在其他实施方案中，宿主细胞是放线菌(Actinomycetes)细胞。在一些示例性实施方案中，宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞。
在其他示例性实施方案中，宿主细胞是来自以下的细胞：真核植物、藻类、蓝藻菌、绿硫细菌、绿色非硫细菌、紫色硫细菌、紫色非硫细菌、极端微生物、酵母、真菌、其改造的生物或合成的生物。在一些示例性实施方案中，宿主细胞是来自以下的细胞：拟南芥(Arabidopsis thaliana)，Panicum virgatums，芒草(Miscanthus giganteus)，玉米(Zeamays)，botryococcuse braunii，Chalamydomonas reinhardtii，Dunaliela salina，Thermosynechococcus elongatus，Synechococcus elongatus，聚球藻属的种(Synechococcus sp.)，集胞藻属的种(Synechocystis sp.)，绿硫菌(Chlorobiumtepidum)，Chloroflexus auranticus，Chromatiumm vinosum，深红螺菌(Rhodospirillumrubrum)，荚膜红杆菌(Rhodobacter capsulatus)，帕氏红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalusris)，杨氏梭菌(Clostridium ljungdahlii)，热纤梭菌(Clostridiuthermocellum)或产黄青霉(Pencillium chrysogenum)。在一些其他示例性实施方案中，宿主细胞来自毕赤酵母(Pichia pastories)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)，裂殖酵母菌丝(Schizosaccharomyces pombe)，荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)或运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)。在另外的示例性实施方案中，宿主细胞是来自以下的细胞：聚球藻属的种PCC 7002、聚球藻属的种PCC 7942或聚球藻属的种PCC 6803。在一些示例性实施方案中，宿主细胞是CHO细胞，COS细胞，VERO细胞，BHK细胞，HeLa细胞，Cv1细胞，MDCK细胞，293细胞，3T3细胞或PC12细胞。在一些示例性实施方案中，宿主细胞是大肠杆菌细胞。在一些示例性实施方案中，大肠杆菌细胞是菌株B、菌株C、菌株K或菌株W的大肠杆菌细胞。
在一些示例性实施方案中，取决于宿主细胞中存在哪些其他异源酶和哪些天然酶促途径，宿主细胞包含可以从一个宿主细胞到另一宿主细胞可互换使用的任选的遗传操作和改变。在一个示例性实施方案中，宿主细胞任选地包含fadE和/或fhuA缺失。在其他示例性实施方案中，任选地操作宿主细胞以具有产生超过200mg/L的脂肪酸衍生物，超过1000mg/L的脂肪酸衍生物，超过1200mg/L的脂肪酸衍生物，超过1700mg/L的脂肪酸衍生物，超过2000mg/L的脂肪酸衍生物或超过3000mg/L的脂肪酸衍生物的能力。上述任选操作的菌株可用于鉴定和表征有用的具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力的改造TE变体，以及用于在表达具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力的改造TE变体时选择性产生中链脂肪酸衍生物。
如以下将在本文中详细讨论的，在一些示例性实施方案中，用于表达改造TE变体多肽的宿主细胞或宿主微生物还表达具有酶活性的基因，其可以增加一种或多种特定脂肪酸衍生物(例如脂肪酯，脂肪醇，乙酸脂肪醇酯，脂肪酸甲酯，脂肪酸乙酯，脂肪胺，脂肪醛，双官能脂肪酸衍生物，二酸，烷烃，链烯烃或烯烃，酮等)的产生。
例如，entD基因编码磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶。过量表达天然大肠杆菌entD(磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶)是对表达羧酸还原酶(例如CarB)的细胞进行的可选遗传修饰，因为它使得能够改善CarB从apo-CarB到holo-CarB的活化，从而允许改善通过holo-CarB将游离脂肪酸转化为脂肪醛，然后可以通过脂肪醛还原酶将其转化为脂肪醇，参见例如美国专利9,340,801。
在示例性实施方案中，用于表达改造TE变体多肽的宿主细胞或宿主微生物进一步表达用于脂肪酯产生的酯合酶活性(E.C.2.3.1.75)。在另一个示例性实施方案中，宿主细胞具有酰基-ACP还原酶(AAR)(E.C.1.2.1.80)活性和/或醇脱氢酶活性(E.C.1.1.1.1.)和/或脂肪醇酰基-CoA还原酶(FAR)(E.C.1.1.1.*)活性和/或羧酸还原酶(CAR)(EC 1.2.99.6)活性用于产生脂肪醇。在另一个示例性实施方案中，宿主细胞具有酰基-ACP还原酶(AAR)(E.C.1.2.1.80)活性用于产生脂肪醛。在另一个示例性实施方案中，宿主细胞具有酰基-ACP还原酶(AAR)(E.C.1.2.1.80)活性和脱羰基酶或脂肪醛氧化去甲酰基化活性用于产生烷烃和烯烃。在另一个示例性实施方案中，宿主细胞具有酰基-CoA还原酶(E.C.1.2.1.50)活性和酰基-CoA合成酶(FadD)(E.C.2.3.1.86)活性，用于产生脂肪醇。在另一个示例性实施方案中，宿主细胞具有酯合酶活性(E.C.2.3.1.75)和酰基-CoA合成酶(FadD)(E.C.2.3.1.86)活性用于产生脂肪酯。在另一个示例性实施方案中，宿主细胞具有用于产生酮的OleA活性。在另一个示例性实施方案中，宿主细胞具有用于产生内烯烃的OleBCD活性。在另一个示例性实施方案中，宿主细胞具有用于产生脂肪醇的酰基-ACP还原酶(AAR)(E.C.1.2.1.80)活性和醇脱氢酶活性(E.C.1.1.1.1.)。在另一个示例性实施方案中，宿主细胞具有用于制备末端烯烃的脱羧酶活性。微生物和微生物细胞中酶活性的表达例如由以下美国专利教导：9,133,406；9,340,801；9,200,299；9,068,201；8,999,686；8,658,404；8,597,922；8,535,916；8,530,221；8,372,610；8,323,924；8,313,934；8,283,143；8,268,599；8,183,028；8,110,670；8,110,093；和8,097,439。
在一些示例性实施方案中，用于表达改造TE变体多肽的宿主细胞或微生物包含某些天然酶活性，其被上调或过表达以产生一种或多种特定的脂肪酸衍生物，例如脂肪酯，脂肪酸甲酯，脂肪酸乙酯，脂肪醇，乙酸脂肪醇酯，脂肪胺，脂肪酰胺，脂肪醛，双官能脂肪酸衍生物，二酸等。
在一些示例性实施方案中，重组宿主细胞产生中链脂肪酯，例如中链脂肪酸甲酯(FAME)或中链脂肪酸乙酯(FAEE)，中链乙酸脂肪醇酯(FACE)，中链脂肪醇(FALC)，中链脂肪胺，中链脂肪醛，中链双功能脂肪酸衍生物，中链二酸，中链烷烃，中链烯烃等。
通常从培养基中回收和/或从宿主细胞中分离出中链脂肪酸衍生物。在一个示例性实施方案中，从培养基(细胞外)回收脂肪酸衍生物。在另一个示例性实施方案中，宿主细胞(细胞内)分离脂肪酸衍生物。在另一个示例性实施方案中，从培养基中回收并从宿主细胞中分离脂肪酸衍生物或非脂肪酸化合物。
宿主细胞产生的脂肪酸衍生物组合物可以使用本领域已知的方法(例如，具有火焰离子化检测的气相色谱法(GC-FID))进行分析，以便确定特定脂肪酸衍生物的分布以及脂肪酸衍生物组合物的组分的链长和饱和度。类似地，可以通过本领域众所周知的方法分析其他化合物。
IV.制备重组宿主细胞和培养物的方法
本领域已知的任何方法可用于改造宿主细胞以产生脂肪酸衍生物和/或脂肪酸衍生物组合物或其他化合物。示例性方法包括例如使用载体例如表达载体，其包含编码突变的或改造的TE变体的多核苷酸序列和/或编码其他脂肪酸衍生物生物合成途径多肽的多核苷酸序列，如本文所公开。本领域技术人员将理解，多种病毒和非病毒载体可用于本文公开的方法中。
在一些示例性实施方案中，通过重组载体将编码突变的或改造的TE变体的多核苷酸(或基因)序列提供给宿主细胞，所述重组载体包含与编码突变的或改造的TE变体的多核苷酸序列可操作连接的启动子。在一些示例性实施方案中，启动子是发育调节的、细胞器特异性的、组织特异性的、诱导型的、组成型的或细胞特异性的启动子。在一些示例性实施方案中，可通过添加乳糖或异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来诱导启动子。
一旦已经制备并分离了编码突变的或改造的TE变体的多核苷酸序列和/或编码其他脂肪酸衍生物生物合成途径多肽的多核苷酸序列，则可以使用多种方法来构建表达盒、载体和其他DNA构建体。包含编码突变的或改造的TE变体的多核苷酸序列和/或编码其他脂肪酸生物合成途径多肽的多核苷酸序列的表达盒可以以多种方式构建。本领域技术人员充分了解表达构建体/载体上必须存在以成功地在宿主细胞中转化、选择和繁殖该表达构建体的遗传元件。用于操纵多核苷酸序列(例如编码突变或改造的TE变体的那些)的技术例如将核酸序列亚克隆到表达载体中、标记探针、DNA杂交等通常描述于例如Sambrook等人，同上；Current Protocols in Molecular Biology，同上。
包含与异源DNA序列例如启动子序列连接的编码突变或改造TE变体的多核苷酸序列(例如，SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:46等)和/或编码其他脂肪酸生物合成途径多肽的多核苷酸序列的DNA构建体可被插入到各种载体中。在一些示例性实施方案中，选择的载体是可用于转化细菌例如大肠杆菌的表达载体。表达载体可以是质粒、病毒、粘粒、人工染色体、核酸片段等。通过使用本领域技术人员众所周知的重组DNA技术可以容易地构建这样的载体(参见例如Sambrook等人，同上)。然后可以将包含编码突变的或改造的TE变体的多核苷酸序列的表达载体转染/转化到靶宿主细胞中。然后基于合适的标记基因的存在，通过本领域众所周知的方法选择成功转化的细胞。
本领域技术人员可获得许多用于细菌和其他微生物的稳定转化/转染的重组载体(参见例如Sambrook等人，同上)。本领域技术人员可以容易地选择合适的载体。在一个示例性实施方案中，将已知的载体用于产生包含编码突变的或改造的TE变体的多核苷酸序列的表达构建体。
通常，转化载体包含可操作地连接至例如启动子序列和选择标记的编码一种或多种突变或改造TE变体的一种或多种多核苷酸序列和/或编码其他脂肪酸衍生物生物合成途径多肽的多核苷酸序列。此类转化载体通常还适当地包括转录起始起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或聚腺苷酸化信号。
因此，除了编码突变或改造TE变体的多核苷酸序列和/或编码其他脂肪酸衍生物生物合成途径多肽的多核苷酸序列之外，如本文所公开制备的表达构建体还可以包含其他元件。在示例性实施方案中，包含编码突变的或改造的TE变体的多核苷酸序列和/或编码其他脂肪酸衍生物生物合成途径多肽的多核苷酸序列的表达构建体还包含增强子序列，从而可以增强异源蛋白的表达。如本领域中已知的，增强子通常在转录开始的5'处发现，它们通常可以以正向或反向取向插入到编码序列的5'或3'处。
如上所述，转化/表达载体通常包含可选择和/或可筛选的标记基因，以允许容易地鉴定转化体。示例性的选择标记基因包括但不限于编码抗生素抗性(例如，对卡那霉素、氨苄青霉素等的抗性)的那些。示例性的可筛选的标记包括例如在重组蛋白的C-末端引入的六氨基酸组氨酸标签。
在示例性实施方案中，将可选择或可筛选的标记基因用作特定目的基因或在特定目的基因以外使用，以提供或增强鉴定转化体的能力。许多可选择的标记基因是本领域已知的(参见例如Sambrook等人，同上)。
在一些示例性实施方案中，表达载体还包含与表达的异源核酸的编码序列连接的序列，其在翻译后从初始翻译产物中去除。在一个示例性实施方案中，翻译后去除的序列促进运输蛋白质进入或通过细胞内或细胞外膜，从而促进运输蛋白质进入细胞内部和/或外部的区室。在一个示例性实施方案中，翻译后去除的序列保护新生蛋白质免受细胞内蛋白水解降解。在一个示例性实施方案中，编码上游的和与选择的编码序列在阅读框中的前导肽序列的核酸片段用于在宿主细胞中重组表达编码序列。
在另一个示例性实施方案中，表达构建体包含细菌复制起点，例如ColE1起点。在另一个示例性实施方案中，表达构建体/载体包含细菌选择标记，例如氨苄青霉素、四环素、潮霉素、新霉素或氯霉素抗性基因。
如本领域众所周知的，表达构建体通常包含限制性核酸内切酶位点以促进载体构建。示例性限制性核酸内切酶识别位点包括但不限于例如限制性核酸内切酶NotI、AatII、SacII、PmeI、HindIII、PstI、EcoRI和BamHI的识别位点。
包含可操作地连接至异源DNA序列(例如启动子序列，标记序列；纯化部分；与多核苷酸序列可操作地偶联的分泌序列；靶向序列等)的编码突变的或改造的TE变体的多核苷酸序列和/或编码其他脂肪酸衍生物生物合成途径多肽的多核苷酸序列的DNA构建体用于转化细胞并产生重组宿主细胞，其对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性。在上面的第III部分中详细讨论了用包含编码突变的或改造的TE变体的多核苷酸序列的表达构建体转化的示例性宿主细胞。
本领域技术人员容易选择适当的转化技术。本领域技术人员可用的示例性转化/转染方法包括例如电穿孔、氯化钙转化等，这些方法是本领域技术人员众所周知的(参见例如Sambrook，同上)。因此，可以将包含编码蛋白质的开放阅读框和可操作地连接的调节序列的多核苷酸序列整合到重组宿主细胞的染色体中、掺入驻留在重组宿主细胞中的一个或多个质粒表达系统中或两者结合。
本文公开的表达载体通常包含适合于在宿主细胞中表达多核苷酸序列的形式的编码突变的或改造的TE变体的多核苷酸序列和/或编码脂肪酸衍生物生物合成途径多肽的多核苷酸序列。如本领域技术人员将理解的，表达载体的设计可取决于诸如以下的因素，例如，待转化的宿主细胞的选择、所需多肽的表达水平等。
V.评估重组宿主细胞
在示例性实施方案中，改造TE变体多肽的活性通过培养重组宿主细胞并测量由重组宿主细胞产生的例如脂肪酸衍生物组合物(例如中链脂肪酯，中链脂肪醇，中链脂肪醛等)或其他化合物的特征来测定。在示例性实施方案中，分析了脂肪酸衍生物或其他化合物的组成、效价、产率和/或生产率。
可使用常规方法测定改造TE变体多肽及其片段的对产生中链脂肪酸衍生物的改善的活性(参见例如下文的实施例4)。
IV.来源于重组宿主细胞的产物
增加重组宿主细胞的中链脂肪酸衍生物的产生的策略包括通过例如从生产宿主中的相同或不同的生物过表达天然脂肪酸生物合成基因和/或表达异源脂肪酸生物合成基因来增加通过脂肪酸生物合成途径的通量。
因此，在示例性实施方案中，对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的重组宿主细胞被改造以包含除改造TE变体之外的编码一种或多种“脂肪酸衍生物生物合成多肽”或等同地“脂肪酸衍生物酶”的一种或多种多核苷酸序列。将脂肪酸衍生物生物合成途径代谢改造以使用微生物将生物质衍生的糖转化为所需产物来产生脂肪酸衍生物化合物(例如脂肪酸酯、烷烃、烯烃、脂肪酮、脂肪醇、乙酸脂肪醇酯等)是本领域已知的，参见例如美国专利号9,133,406；9,340,801；9,200,299；9,068,201；8,999,686；8,658,404；8,597,922；8,535,916；8,530,221；8,372,610；8,323,924；8,313,934；8,283,143；8,268,599；8,183,028；8,110,670；8,110,093；和8,097,439。可以在工业规模的生物反应器中培养代谢改造的菌株，并使用传统的化学和生物化学工程技术纯化所得产物。
如本领域中众所周知的，硫酯酶催化烷基硫酯水解成游离脂肪酸(FFA)。因此，硫酯酶在确定脂肪酸和脂肪酸衍生物的酰基链长度的分布中起作用(参见例如Dehesh(1996)，同上，PNAS(1995)92(23):10639-10643)。因此，对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的重组宿主细胞通常包含改造TE变体，其对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性(例如，SEQ ID NO:3，以及在表7中所示的那些)。在一些示例性实施方案中，与不包含改造的TE变体的合适的对照宿主细胞(例如具有对照硫酯酶(例如SEQ ID NO:1)而不是改造的TE变体的同基因对照宿主细胞)相比，此类重组宿主细胞提供增加量的中链脂肪酸衍生物，例如中链脂肪醇、中链脂肪酸、FAEE、FAME、FACE等。
因此，在一些实施方案中，通过在有效表达硫酯酶的条件下在碳源存在下培养包含改造TE变体的重组宿主细胞来产生包含脂肪酸的脂肪酸衍生物组合物。
在一些实施方案中，在细胞外产生通过在有效表达TE的条件下培养包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体的重组宿主细胞产生的基本上所有脂肪酸衍生物。因此，在一些示例性实施方案中，从培养基中回收产生的脂肪酸衍生物。在一些示例性实施方案中，使用本领域已知的任何合适的方法，例如GC FID，对回收的脂肪酸衍生物组合物进行分析，以确定和定量特定脂肪酸衍生物的分布以及脂肪酸衍生物组合物的组分的链长和饱和度。
在其他实施方案中，重组宿主细胞包含编码对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的突变的或改造的TE变体的多核苷酸序列，以及编码具有其他脂肪酸衍生物生物合成酶活性的多肽的一种或多种其他多核苷酸。因此，在一些实施方案中，通过改造TE变体的作用产生的第一中链脂肪酸衍生物(例如，中链脂肪酸、中链脂肪醇等)被一种或多种脂酸衍生物生物合成酶转化为第二脂肪酸衍生物，例如中链脂肪酸酯、中链脂肪醛、中链乙酸脂肪醇酯、烃，例如直链烷烃、直链烯烃等。
表1提供了可以在重组宿主细胞中除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体以外表达以促进中链脂肪酸衍生物的产生的示例性脂肪酸衍生物生物合成多肽的列表。
表1.脂肪酸衍生物酶的基因命名
Figure BDA0002294805570000501
Figure BDA0002294805570000511
Figure BDA0002294805570000521
Figure BDA0002294805570000531
Figure BDA0002294805570000541
中链脂肪酸衍生物的产生
如上所述，与不包含改造TE变体的合适的对照宿主细胞例如具有对照TE的同基因对照宿主细胞(例如SEQ ID NO:1)相比，包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体的重组宿主细胞产生增加的量的中链脂肪酸衍生物。
在下文详细讨论的其他示例性实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含另外的脂肪酸衍生物生物合成多肽，其有助于产生特定类型的脂肪酸衍生物。
脂肪醛的产生
在一些示例性实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含羧酸还原酶(“CAR”)活性，因此，重组宿主细胞合成脂肪醛和脂肪醇，参见例如9,340,801。
因此，在一些示例性实施方案中，通过在重组宿主细胞中表达或过表达编码具有脂肪醛生物合成活性例如羧酸还原酶(CAR)活性的多肽的多核苷酸来产生脂肪醛。示例性羧酸还原酶(CAR)多肽和编码它们的多核苷酸包括例如FadD9(EC 6.2.1.-,UniProtKBQ50631,GenBank NP_217106)，CarA(GenBank ABK75684)，CarB(GenBank YP889972)和例如在美国专利号8,097,439和美国专利号9,340,801中公开的相关多肽。
在一些示例性实施方案中，重组宿主细胞产生的脂肪醛然后被转化为脂肪醇或烃。因此，在一些示例性实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含酰基-CoA还原酶(“FAR”或“ACR”)活性，因此重组宿主细胞合成脂肪醛和脂肪醇(参见例如美国专利号8,658,404，美国专利号8,268,599，美国专利申请公开2015/0361454)。
在一些实施方案中，重组宿主细胞产生的脂肪醛通过天然或异源脂肪醇生物合成多肽例如醛还原酶或醇脱氢酶的活性而转化为脂肪醇(参见例如美国专利申请公开2011/0250663)。因此，在一些示例性实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含醛还原酶活性或等同地醇脱氢酶活性(EC1.1.1.1)，和因此，重组宿主细胞合成脂肪醇。示例性的脂肪醇生物合成基因包括但不限于例如醇脱氢酶，例如不动杆菌属的种M-1的AlrA或AlrA同源物；以及内源性大肠杆菌醇脱氢酶，例如DkgA(NP.sub.--417485)，DkgB(NP.sub.--414743)，YjgB，(AAC77226)，YdjL(AAC74846)，YdjJ(NP.sub.--416288)，AdhP(NP.sub.--415995)，YhdH(NP.sub.--417719)，YahK(NP.sub.--414859)，YphC(AAC75598)和YqhD(Q46856)。
脂肪胺的产生
在一些示例性实施方案中，将包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体并且产生脂肪醛(例如，如本文上文所公开)的重组宿主细胞进一步修饰以包含具有氨基转移酶或胺脱氢酶活性的异源生物合成酶，其将脂肪醛转化为脂肪胺(参见例如PCT公开号WO 2015/085271)。
脂肪醇的产生
在一些示例性实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含编码具有脂肪醇生物合成活性的多肽的多核苷酸，因此，通过重组宿主细胞产生脂肪醇。因此，在示例性实施方案中，通过在碳源存在下，在有效表达改造TE变体的条件下培养重组宿主细胞来产生包含中链脂肪醇，例如包含辛醇的组合物，所述改造TE变体对产生中链脂肪酸衍生物和脂肪醇生物合成酶具有改善的活性。
因此，在一些示例性实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含羧酸还原酶(CAR)活性和醇脱氢酶活性，因此，重组宿主细胞合成中链脂肪醇，例如辛醇(参见例如美国专利9,340,801)。
在一些示例性实施方案中，天然脂肪醛生物合成多肽(例如存在于宿主细胞中的醛还原酶/醇脱氢酶)将中链脂肪醛转化为中链脂肪醇。在其他示例性实施方案中，天然脂肪醛还原酶/醇脱氢酶被过表达以将中链脂肪醛转化为中链脂肪醇。在其他示例性实施方案中，将异源醛还原酶/醇脱氢酶引入重组宿主细胞中并表达或过表达以将中链脂肪醛转化为中链脂肪醇。可用于将中链脂肪醛转化为中链脂肪醇的示例性醛还原酶/醇脱氢酶多肽在上文和国际专利申请公开号WO 2007/136762；WO 2010/062480；美国专利8,110,670；美国专利9,068,201中公开。
在一些示例性实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含编码具有羧酸还原酶(EC 6.2.1.3或EC 1.2.1.42)活性的多肽的异源多核苷酸，使得重组宿主细胞在具有简单碳源的发酵液中生长时可产生1,3脂肪二醇。在其他示例性实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含编码具有羧酸还原酶(EC 6.2.1.3或EC 1.2.1.42)活性的多肽的异源多核苷酸和编码具有乙醇脱氢酶(EC 1.1.1)活性的多肽的异源多核苷酸，其中重组宿主细胞在具有简单碳源的发酵液中生长时产生1,3脂肪二醇，例如中链1,3脂肪二醇(参见例如WO 2016/011430)。
乙酸脂肪醇酯的产生
在一些实施方案中，细胞中产生的或在一些实施方案中进料到细胞中的脂肪醇被重组细胞进一步处理以提供乙酸脂肪醇酯(FACE)。在示例性实施方案中，醇O-乙酰基转移酶(EC 2.8.1.14)酶将脂肪醇加工成乙酸脂肪醇酯(FACE)，参见例如Gabriel M Rodriguez等人(2014)Nature Chemical Biology 10,259-265；Jyun-Liang Lin and Ian Wheeldon(2014)PLoS One.2014；9(8):PMCID:PMC4122449。
示例性的醇0-乙酰基转移酶是酵母Aft1，例如，GenBank登录号AY242062；GenBank登录号AY242063，参见例如Kevin J.Verstrepen K.J.等人(2003)Appl EnvironMicrobiol.2003年9月；69(9):5228-5237。
在一个示例性实施方案中，包含具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力的改造TE变体的重组宿主细胞进一步包含足以产生脂肪醛和脂肪醇的羧酸还原酶活性(EC1.2.99.6)，并进一步包含脂肪醇O-乙酰基转移酶活性，其将脂肪醇转化为乙酸脂肪醇酯。
在另一个示例性实施方案中，包含具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力的改造TE变体的重组宿主细胞进一步包含羧酸还原酶活性(EC 1.2.99.6)，其导致产生第一脂肪酸衍生物，并且还具有将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物的脂肪醇O-乙酰基转移酶活性，其中第二脂肪酸衍生物的MIC高于第一脂肪酸衍生物。
在另一个示例性实施方案中，包含具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力的改造TE变体的重组宿主细胞进一步包含羧酸还原酶活性(EC 1.2.99.6)，其导致产生第一脂肪酸衍生物，并且还具有将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物的脂肪醇O-乙酰基转移酶活性，其中第二脂肪酸衍生物的LogP高于第一脂肪酸衍生物。
在另一个示例性实施方案中，包含具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力的改造TE变体的重组宿主细胞进一步包含羧酸还原酶活性(EC 1.2.99.6)，其导致产生第一脂肪酸衍生物，并且进一步包含脂肪醇O-乙酰基转移酶活性，其将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物，其中在存在第二脂肪酸衍生物的情况下，导致第一脂肪酸衍生物的MIC升高。
在另一个示例性实施方案中，包含具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的能力的改造TE变体的重组宿主细胞进一步包含羧酸还原酶活性(EC 1.2.99.6)，其导致产生第一脂肪酸衍生物，并且还具有将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物的脂肪醇O-乙酰基转移酶活性，其中第二脂肪酸衍生物的毒性比第一脂肪酸衍生物低。
脂肪酯的产生
在一些实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体以外，重组宿主细胞还包含编码具有脂肪酯生物合成活性的多肽的多核苷酸，因此，中链脂肪酯由重组宿主细胞产生。
如本文所用，术语“脂肪酯”或等同地“脂肪酸酯”是指由脂肪酸制成的任何酯。在示例性实施方案中，脂肪酯包含“A侧”和“B侧”。如本文所用，酯的“A侧”是指连接至酯的羧酸氧的碳链。如本文所用，酯的“B侧”是指包含酯的母体羧酸酯的碳链。在脂肪酯衍生自脂肪酸衍生物生物合成途径的实施方案中，A侧由醇贡献，而B侧由脂肪酸或烷基硫酯贡献。
任何醇可用于形成脂肪酯的A侧。在示例性实施方案中，醇来源于脂肪酸衍生物生物合成途径。在其他示例性实施方案中，通过非脂肪酸衍生物生物合成途径产生醇，例如，醇是外源提供的，例如，在发酵液中供应醇。
包含A侧或B侧的碳链可以具有任何长度。然而，在示例性实施方案中，其中包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体的脂肪酸衍生物生物合成途径提供脂肪酸酯的A侧和/或B侧，A侧和/或B侧是中链脂肪酸衍生物，因此具有6、7、8、9或10个碳的碳链长度。因此，在一个示例性实施方案中，包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体的脂肪酸衍生物生物合成途径提供酯的A侧，因此脂肪酯的A侧的长度为6、7、8、9或10个碳。在其他示例性实施方案中，包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体的脂肪酸衍生物生物合成途径提供酯的B侧，因此脂肪酯的B侧长度为6、7、8、9或10个碳。
在一个示例性实施方案中，脂肪酯是脂肪酸甲酯，例如辛酸甲酯，其中B侧由脂肪酸生物合成途径提供，所述脂肪酸生物合成途径包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体，并且酯的A侧的长度为1个碳。因此，在一个示例性实施方案中，脂肪酸酯是辛酸甲酯。在一个示例性实施方案中，通过脂肪酸O-甲基转移酶(FAMT)(EC 2.1.1.15)酶的作用提供A侧(参见例如Applied and Environmental Microbiology 77(22):8052-8061)。
在另一个示例性实施方案中，脂肪酸酯是脂肪酸乙酯，其中B侧由脂肪酸生物合成途径提供，所述脂肪酸生物合成途径包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体，并且酯的A侧的长度为2个碳。
在一个示例性实施方案中，A侧是直链的。在另一个示例性实施方案中，A侧是支链的。在一个示例性实施例中，B侧是直链的。在另一个示例性实施方案中，B侧是支链的。支链可以具有一个或多个分支点。在一个示例性实施方案中，A侧是饱和的。在另一个示例性实施方案中，A侧是不饱和的。在一个示例性实施方案中，B侧是饱和的。在另一个示例性实施方案中，B侧是不饱和的。
在示例性实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含编码具有酯合酶活性(EC 3.1.1.67)的多肽的多核苷酸。酯合酶是本领域已知的，参见例如国际专利申请公开WO 2011/038134。
在一些示例性实施方案中，由重组宿主细胞产生脂肪酸酯，所述重组宿主细胞包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体，以及酰基-CoA合成酶(fadD)酶和酯合酶(参见例如国际专利申请公开WO/2011/038134；国际专利申请公开WO2007/136762；美国专利8,110,670)。
在一个示例性实施方案中，包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体的重组宿主细胞还具有足以产生脂肪酯(例如FAME或FAEE)的酯合酶活性(EC3.1.1.67)。
在另一个实施方案中，包含具有改善的活性的改造TE变体(其导致产生第一脂肪酸衍生物)的重组宿主细胞还具有将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物的酯合酶活性。
在另一个实施方案中，包含具有改善的活性的改造TE变体(其导致产生第一脂肪酸衍生物)的重组宿主细胞还具有将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物的酯合酶活性，其中第二脂肪酸衍生物具有比第一脂肪酸衍生物更高的MIC。
在另一个实施方案中，包含具有改善的活性的改造TE变体(其导致产生第一脂肪酸衍生物)的重组宿主细胞还具有将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物的酯合酶活性，其中第二脂肪酸衍生物具有比第一脂肪酸衍生物更高的分配系数(LogP)。
在另一个实施方案中，包含具有改善的活性的改造TE变体的重组宿主细胞，其导致产生第一脂肪酸衍生物，其还具有酯合酶活性，该酯合酶活性将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物，其中第二脂肪酸衍生物的存在导致第一脂肪酸衍生物的MIC增加。
在另一个实施方案中，包含具有改善的活性的改造TE变体(其导致产生第一脂肪酸衍生物)的重组宿主细胞还具有将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物的酯合酶活性，其中第二脂肪酸衍生物的毒性比第一脂肪酸衍生物低。
烃类的产生
在一些实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含编码具有脂肪醛生物合成活性的多肽(例如酰基-ACP还原酶多肽(EC 6.4.1.2))的多核苷酸和编码具有烃生物合成活性的多肽(例如脱羰酶(EC4.1.99.5)，氧化甲酰化酶或脂肪酸脱羧酶)的多核苷酸，因此，重组宿主细胞显示出增强的烃类产生能力(参见例如美国专利申请公开2011/0124071)。因此，在示例性实施方案中，包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体的重组宿主细胞产生烃，例如烷烃或烯烃(例如末端烯烃或内烯烃)或酮。
在一些示例性实施方案中，通过包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体的重组宿主细胞产生脂肪醛通过脱羰转化，从而除去碳原子，以形成烃(参见例如美国专利8,110,670和WO 2009/140695)。
在其他示例性实施方案中，重组宿主细胞产生的脂肪酸通过脱羧转化，从而除去碳原子以形成末端烯烃。因此，在一些示例性实施方案中，除了表达对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组细胞还表达或过表达编码烃生物合成多肽(例如具有脱羧酶活性的多肽)的多核苷酸，如例如在美国专利8,597,922中公开的。
在其他示例性实施方案中，烷基硫酯中间体通过酶促脱羧缩合反应转化以形成内烯烃或酮。因此，在一些示例性实施方案中，除了表达对中链脂肪酸衍生物的产生具有改善的活性的改造TE变体，重组细胞还表达或过表达编码烃生物合成多肽(例如具有OleA活性的多肽)的多核苷酸，从而产生酮(参见例如美国专利9,200,299)。在其他示例性实施方案中，除了表达对中链脂肪酸衍生物的产生具有改善的活性的改造TE变体，重组细胞还一起表达或过表达编码烃生物合成多肽例如OleCD或OleBCD以及具有OleA活性的多肽的多核苷酸，从而产生内烯烃(参见例如美国专利9,200,299)。
一些示例性的烃生物合成多肽显示在下表2中。
表2.示例性的烃生物合成多核苷酸和多肽。
Figure BDA0002294805570000621
Omega(ω)-羟基化脂肪酸衍生物的产生
在一些实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含编码具有ω-羟基化酶活性(EC 1.14.15.3)的多肽的多核苷酸。在示例性实施方案中，修饰的ω-羟基化酶具有修饰的细胞色素P450单加氧酶(P450)的酶活性，并在体内有效催化烃链的w-位的羟基化。因此，当在来自可再生原料的碳源存在下在发酵液中生长时，重组微生物在体内产生中链ω-羟基化(ω-羟基化)脂肪酸衍生物(参见例如PCT申请公开WO 2014/201474)。
在其他示例性实施方案中，除了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体之外，重组宿主细胞还包含编码烷烃羟基化酶(例如alkA、CYP153A-还原酶或CYP153A-还原酶杂合融合多肽变体)的多核苷酸(参见例如WO 2015/195697)，使得重组宿主细胞在有效表达烷烃羟基化酶例如AlkA、CYP153或CYP153A-还原酶杂合融合多肽变体和对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的改造TE变体的条件下在含有碳源的培养基中培养时产生ω-羟基化的(ω-羟基化)和双功能脂肪酸衍生物及其组合物，包括ω-羟基化的脂肪酸，ω-羟基化的脂肪酸酯，α,ω-二酸，α,ω-二酯，α,ω-二醇和由其衍生的化学物质，例如大内酯和大环酮。
V.重组宿主细胞的培养和发酵
如本文所用，发酵广义上是指通过重组宿主细胞将有机材料转化为靶物质。例如，这包括通过在包含碳源的培养基中繁殖重组宿主细胞的培养物通过重组宿主细胞将碳源转化为脂肪酸衍生物，例如中链脂肪酸、中链脂肪酸酯、中链脂肪醇、中链乙酸脂肪醇等。允许产生靶物质例如脂肪酸、脂肪酯、脂肪醇、乙酸脂肪醇等的条件是允许宿主细胞产生期望产物例如脂肪酸衍生物组合物的任何条件。合适的条件包括，例如，典型的发酵条件，参见例如Principles of Fermentation Technology,第3版(2016)同上；FermentationMicrobiology and Biotechnology,第2版(2007)同上。
发酵条件可以包括本领域众所周知的许多参数，包括但不限于温度范围、pH水平、通气水平、进料速率和培养基组成。这些条件中的每一个单独地或组合地允许宿主细胞生长。发酵可以是需氧的、厌氧的或其变体(例如微需氧)。示例性的培养基包括肉汤(液体)或凝胶(固体)。通常，培养基包含可以被宿主细胞直接代谢的碳源(例如，来自可再生原料的简单碳源)。另外，可在培养基中使用酶以促进运动(例如淀粉或纤维素解聚为可发酵的糖)和随后碳源的新陈代谢以产生中链脂肪酸衍生物。
对于小规模生产，改造以产生中链脂肪酸衍生物组合物的宿主细胞可以分批生长，例如约100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、1mL、5mL、10mL、15mL、25mL、50mL、75mL、100mL、500mL、1L、2L、5L或10L；发酵并诱导以表达所需的多核苷酸序列，例如编码具有特定酶活性(例如，硫酯酶(TE)，羧酸还原酶(CAR)，醇脱氢酶(ADH)，脂肪酰基-CoA/ACP还原酶(FAR)，酰基-CoA还原酶(ACR)，乙酰基-CoA羧化酶(ACC)和/或酰基ACP/CoA还原酶(AAR)的酶促活性)的多肽的多核苷酸。对于大规模生产，改造宿主细胞可以在具有约10L、100L、1000L、10,000L、100,000L、1,000,000L或更大的体积批次的培养物中生长；发酵，并诱导以表达任何所需的多核苷酸序列。
本文公开的脂肪酸衍生物组合物通常可以在重组宿主细胞培养物的细胞外环境中发现，并且可以容易地从培养基中分离出来。中链脂肪酸衍生物，例如中链脂肪酸、中链脂肪酸酯、中链脂肪醛、中链脂肪酮、中链脂肪醇、中链乙酸脂肪醇等，可以由重组宿主细胞分泌，运输到重组宿主细胞培养物的细胞外环境或被动转移到细胞外环境中。可以使用本领域已知的常规方法，包括但不限于离心，从重组宿主细胞培养物中分离出中链脂肪酸衍生物组合物。
适合用作生产宿主细胞的示例性微生物包括例如细菌、蓝细菌、酵母、藻类、丝状真菌等。为了产生脂肪酸衍生物组合物，将生产宿主细胞(或等同地，宿主细胞)改造成包含相对于非改造或天然宿主细胞被修饰的脂肪酸生物合成途径，例如，如上文所讨论并且如例如在美国专利申请公开2015/0064782中公开的那样被改造。经过改造以包含修饰的脂肪酸生物合成途径的生产宿主能够有效地将葡萄糖或其他可再生原料转化为脂肪酸衍生物。已经建立了用于产生各种化合物的高密度发酵的方案和程序(参见例如美国专利号8,372,610；8,323,924；8,313,934；8,283,143；8,268,599；8,183,028；8,110,670；8,110,093；和8,097,439)。
在一些示例性实施方案中，在包含约20g/L至约900g/L的碳源(例如简单碳源)初始浓度的培养基(例如发酵培养基)中培养生产宿主细胞。在其他实施方案中，培养基包含的碳源的初始浓度为约2g/L至约10g/L；约10g/L至约20g/L；约20g/L至约30g/L；约30g/L至约40g/L；或约40g/L至约50g/L。在一些实施方案中，可以在发酵过程中监测培养基中可用碳源的水平。在一些实施方案中，该方法进一步包括当培养基中的初始碳源的水平小于约0.5g/L时，向培养基中添加补充碳源。
在一些示例性实施方案中，当培养基中碳源的水平小于约0.4g/L、小于约0.3g/L、小于约0.2g/L或小于约0.1g/L时，向培养基中添加补充碳源。在一些实施方案中，添加补充碳源以维持约1g/L至约25g/L的碳源水平。在一些实施方案中，添加补充碳源以维持约2g/L或更高(例如，约2g/L或更高，约3g/L或更高，约4g/L或更高)的碳源水平。在某些实施方案中，添加补充碳源以维持约5g/L或更少(例如，约5g/L或更少，约4g/L或更少，约3g/L或更少)的碳源水平。在一些实施方案中，添加补充碳源以维持约2g/L至约5g/L、约5g/L至约10g/L或约10g/L至约25g/L的碳源水平。
在一个示例性实施方案中，用于发酵的碳源来源于可再生原料。在一些实施方案中，碳源是葡萄糖。在其他实施方案中，碳源是甘油。其他可能的碳源包括但不限于果糖，甘露糖，半乳糖，木糖，阿拉伯糖，淀粉，纤维素，半纤维素，果胶，木聚糖，蔗糖，麦芽糖，纤维二糖，松二糖，乙酸，乙烷，乙醇，甲烷，甲醇，甲酸和一氧化碳；纤维素材料及其变体，例如半纤维素，甲基纤维素和羧甲基纤维素钠；饱和或不饱和脂肪酸，琥珀酸酯，乳酸酯和乙酸酯；醇，例如乙醇，甲醇和甘油，或它们的混合物。在一个实施方案中，碳源来自玉米，甘蔗，高粱，甜菜，柳枝稷，青贮饲料，稻草，木材，纸浆，污水，垃圾，城市纤维素废料，烟道气，合成气或二氧化碳。简单碳源也可以是光合作用的产物，例如葡萄糖或蔗糖。在一个实施方案中，碳源来源于废品，例如甘油、烟道气或合成气；或来自有机材料例如生物质的改造；或来自天然气或甲烷，或来自将这些材料改造为合成气；或来自通过光合作用固定的二氧化碳，例如，中链脂肪酸衍生物可通过光合作用地生长的重组蓝细菌或藻类并使用CO2作为碳源来产生。在一些示例性实施方案中，碳源源自生物质。生物量的示例性来源是植物有机物质或植物，例如玉米、甘蔗或柳枝。生物质的另一示例性来源是代谢废物，例如动物有机物质(例如牛粪)。生物质的其他示例性来源包括藻类和其他海洋植物。生物质还包括来自工业、农业、林业和家庭的废物，包括但不限于发酵废物，青贮饲料，秸秆，木材，污水，垃圾，纤维素城市废物，市政固体废物和食物残渣。
在一些示例性实施方案中，以约0.5g/L至约40g/L的浓度产生脂肪酸衍生物，例如中链脂肪酸、中链脂肪酸酯、中链脂肪醇等。在一些实施方案中，以约1g/L或更高(例如，约1g/L或更高，约10g/L或更高，约20g/L或更高，约50g/L或更高，约100g/L或更高)的浓度产生脂肪酸衍生物。在一些实施方案中，以约1g/L至约170g/L，约1g/L至约10g/L，约40g/L至约170g/L，约100g/L至约170g/L，约10g/L至约100g/L，约1g/L至约40g/L，约40g/L至约100g/L，或约1g/L至约100g/L的浓度产生脂肪酸衍生物。
在其他示例性实施方案中，以约25mg/L、约50mg/L、约75mg/L、约100mg/L、约125mg/L、约150mg/L、约175mg/L、约200mg/L、约225mg/L、约250mg/L、约275mg/L、约300mg/L、约325mg/L、约350mg/L、约375mg/L、约400mg/L、约425mg/L、约450mg/L、约475mg/L、约500mg/L、约525mg/L、约550mg/L、约575mg/L、约600mg/L、约625mg/L、约650mg/L、约675mg/L、约700mg/L、约725mg/L、约750mg/L、约775mg/L、约800mg/L、约825mg/L、约850mg/L、约875mg/L、约900mg/L、约925mg/L、约950mg/L、约975mg/L、约1000mg/L、约1050mg/L、约1075mg/L、约1100mg/L、约1125mg/L、约1150mg/L、约1175mg/L、约1200mg/L、约1225mg/L、约1250mg/L、约1275mg/L、约1300mg/L、约1325mg/L、约1350mg/L、约1375mg/L、约1400mg/L、约1425mg/L、约1450mg/L、约1475mg/L、约1500mg/L、约1525mg/L、约1550mg/L、约1575mg/L、约1600mg/L、约1625mg/L、约1650mg/L、约1675mg/L、约1700mg/L、约1725mg/L、约1750mg/L、约1775mg/L、约1800mg/L、约1825mg/L、约1850mg/L、约1875mg/L、约1900mg/L、约1925mg/L、约1950mg/L、约1975mg/L、约2000mg/L(2g/L)、3g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L或上述任意两个值所限定的范围的效价产生脂肪酸衍生物，例如中链脂肪酸衍生物。在其他实施方案中，以大于100g/L，大于200g/L或大于300g/L的效价产生脂肪酸衍生物或其他化合物。在示例性实施方案中，重组宿主细胞根据本文公开的方法产生的脂肪酸衍生物或其他化合物的效价为5g/L至200g/L，10g/L至150g/L，20g/L至120g/L和30g/L至100g/L。效价可以指由给定的重组宿主细胞培养物产生的特定的脂肪酸衍生物或脂肪酸衍生物的组合或另一种化合物或其他化合物的组合。在示例性实施方案中，与表达相应野生型多肽的重组宿主细胞相比，改造TE变体在重组宿主细胞例如大肠杆菌中的表达导致产生更高的效价。在一个实施方案中，更高的效价在至少约5g/L至约200g/L的范围内。
在其他示例性实施方案中，根据本公开内容的方法，经改造以产生脂肪酸衍生物例如中链脂肪酸衍生物的宿主细胞具有至少1％、至少2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约6％、至少约7％、至少约8％、至少约9％、至少约10％、至少约11％、至少约12％、至少约13％、至少约14％、至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％、至少约20％、至少约21％、至少约22％、至少约23％、至少约24％、至少约25％、至少约26％、至少约27％、至少约28％、至少约29％或至少约30％或由前述值中的任何两个所界定的范围的产率。在其他实施方案中，以大于约30％，大于约35％，大于约40％，大于约45％，大于约50％，大于约55％，大于约60％，大于约65％，大于约70％，大于约75％，大于约80％，大于约85％，大于约90％的产率产生一种脂肪酸衍生物或多种脂肪酸衍生物或其他化合物。替代地或另外，产率为约30％或更少，约27％或更少，约25％或更少，或约22％或更少。在另一个实施方案中，产率为约50％或更少，约45％或更少，或约35％或更少。在另一个实施方案中，产率为约95％或更少，或90％或更少，或85％或更少，或80％或更少，或75％或更少，或70％或更少，或65％或更少，或60％或更少，或55％或更少，或50％或更少。因此，产率可以受到以上任意两个端点的限制。例如，重组宿主细胞根据本文公开的方法产生的中链脂肪酸衍生物例如8和/或10碳脂肪酸衍生物的产率可以为约5％至约15％、约10％至约25％、约10％至约22％、约15％至约27％、约18％至约22％、约20％至约28％、约20％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％、约100％至约200％、约200％至约300％、约300％至约400％、约400％至约500％、约500％至约600％、约600％至约700％或约700％至约800％。产率可以指特定的中链脂肪酸衍生物或脂肪酸衍生物的组合。在一个实施方案中，较高的产率为理论产率的约10％至约800％。另外，产率也将取决于所使用的原料。
在一些示例性实施方案中，根据本公开内容的方法，被改造以产生脂肪酸衍生物例如中链脂肪酸衍生物的宿主细胞的生产率为至少100mg/L/小时、至少200mg/L/小时、至少300mg/L/小时、至少400mg/L/小时、至少500mg/L/小时、至少600mg/L/小时、至少700mg/L/小时、至少800mg/L/小时、至少900mg/L/小时、至少1000mg/L/小时、至少1100mg/L/小时、至少1200mg/L/小时、至少1300mg/L/小时、至少1400mg/L/小时、至少1500mg/L/小时、至少1600mg/L/小时、至少1700mg/L/小时、至少1800mg/L/小时、至少1900mg/L/小时、至少2000mg/L/小时、至少2100mg/L/小时、至少2200mg/L/小时、至少2300mg/L/小时、至少2400mg/L/小时、2500mg/L/小时或高达10g/L/小时(取决于细胞量)。例如，根据本公开内容的方法，由重组宿主细胞产生的包括一种或多种脂肪酸衍生物或其他化合物的丙二酰CoA衍生的化合物的生产率可以为500mg/L/小时至2500mg/L/小时，或700mg/L/小时至2000mg/L/小时。生产率可以指由给定宿主细胞培养物产生的特定的8和/或10碳脂肪酸衍生物或脂肪酸衍生物或其他化合物的组合。例如，与表达相应野生型多肽的重组宿主细胞相比，改造TE变体在重组宿主细胞例如大肠杆菌中的表达导致8和/或10碳脂肪酸衍生物或其他化合物的生产率提高。在示例性实施方案中，较高的生产率为约0.3g/L/h至约3g/L/h至约10g/L/h至约100g/L/h至约1000g/L/h。
VI.分离
通常通过本领域已知的方法从发酵液中分离出生物产物，例如包含如上所述的中链脂肪酸衍生物的组合物，其利用如上所述的重组宿主细胞产生。在一个示例性实施方案中，通过重力沉降、离心或倾析从发酵液中分离上文讨论的利用重组宿主细胞产生的包含如本文所公开的中链脂肪酸衍生物的组合物。
VII.中链脂肪酸衍生物的组合物和制剂
生物产物，例如包含如上详细讨论的利用重组宿主细胞产生的中链脂肪酸和中链脂肪酸衍生物的组合物，是由可再生来源(例如，来源于可再生原料的简单碳源)产生的，以及因此，是物质的新组合物。这些新的生物产物可以根据双碳同位素指纹图谱或14C年代测定与来源于石油化学碳的有机化合物区分开。另外，生物来源的碳的特定来源(例如，葡萄糖相对于甘油)可以通过本领域已知的方法通过双碳同位素指纹法确定(参见例如美国专利号7,169,588，WO2016/011430A1等。)。
此外，如下所示，生物产物的组合物定义了由生物体产生的天然脂肪酸衍生物的独特组合物。这些中链脂肪酸衍生物含量很高的独特组合物提供了这些有价值的中链长度产物的新颖和独特的来源。
提供以下实施例以举例说明，但不限制本发明。
实施例
以下具体实施例旨在举例说明本公开内容，并且不应被解释为限制权利要求的范围。
实施例1
以下实施例示出了相对于在未经修饰的中链长度的脂肪酸衍生物化合物的存在下生长的微生物所经历的毒性，对中链长度的脂肪酸衍生物化合物的化学修饰降低了微生物经历的对中链脂肪酸衍生物化合物的毒性。
如本文上文所讨论的，使用生物学系统(例如微生物细胞的发酵)产生中链长度的脂肪酸衍生物化合物是选择性产生中链长度的脂肪酸/脂族化合物的理想途径。不幸的是，一种或多种中链脂肪酸衍生物化合物可能对微生物细胞具有高毒性，并且这种毒性是通过发酵以商业规模产生中链长度脂肪酸衍生物化合物的障碍。
在此实施例中，通过确定每个化合物的最小抑制浓度(MIC)(足以杀死50％的培养物的化合物的浓度)来评估仅在修饰或未修饰上不同的相关化合物的毒性。具有较低毒性(即相对较高的MIC)的化合物更易于通过发酵产生。
大肠杆菌(E.coli)细胞培养物在不同浓度的这些化合物中生长，并且其生长通过在生长24小时后测量来自裂解培养物的总蛋白作为培养物中细胞的总数的量度来确定。
具体而言，大肠杆菌细胞培养物在辛醇、辛酸、辛酸甲酯和辛酸乙酯的存在下生长。结果示于图1。
如在图1中可以看到的，中链酸辛酸和中链醇辛醇的MIC为1-5g/L。相反，这些中链醇和酸的酯(乙酸辛酯和辛酸甲酯，辛酸乙酯(未显示))的MIC是相应的未修饰的醇和酸的10-100倍。因此，与未修饰的化合物相比，大肠杆菌可以耐受10-100倍更高浓度的化学修饰的化合物。
因此，以上实施例证明了可以通过工业发酵方法产生和耐受高浓度的中链脂族醇和酸的酯。此外，上述实施例表明，通过修饰与毒性分子相关的一个或多个官能团或通过稍微增加其分子量，可以显著降低给定链长的脂族化合物的毒性。
实施例2
以下实施例示出了中链脂肪酸衍生物化合物的毒性与分配系数(LogP)的相关性。
如实施例1所示，中链脂肪醇的酯和中链脂肪酸的酯的毒性比相应的中链脂肪醇和中链脂肪酸的毒性更低(具有更高的MIC)。
许多水溶性化合物具有低分配系数(LogP)。LogP是化合物在水和辛醇之间分配的量度(参见例如。微生物例如大肠杆菌可以产生并耐受具有低LogP的化合物，例如乙酸、乳酸、丙酮酸、1,3丙二醇、氨基酸等。因此，可以得出结论，疏水性较低(或等同地亲水性更高)并因此LogP较低的化合物的毒性较低。为了评估是否如此，我们测量了在图1中公开的化合物(即，辛醇、辛酸、乙酸辛酯和辛酸甲酯)的logP。
令人惊讶的是，如图2所示，对于中链脂族化合物，作为LogP函数的毒性与预期相反。即，logP低的化合物辛醇和辛酸具有高毒性(即低MIC)。logP高的乙酸辛酯、辛酸甲酯和辛酸乙酯具有较低的毒性(高MIC)。
因此，此实施例表明，将具有低LogP的有毒中链脂族化合物修饰为具有较高logPwo的化合物是降低对工业微生物例如大肠杆菌有毒的中链脂族化合物的毒性的有用方法。
实施例3
以下实施例示出了催化毒性中链脂族化合物转化为其毒性较低的衍生物的新的生化途径的表达使微生物能够耐受产生毒性化合物的途径并产生高水平的其衍生物。
如以上在实施例1和2中所讨论的，中链脂肪酸衍生物化合物例如脂肪醇和脂肪酸对宿主细胞有毒，但是它们的稍高的分子量和高logP的衍生物没有毒性。因此，我们认为我们可以通过在体内将毒性较高化合物生化地转化为毒性较低化合物来在微生物中产生毒性较高化合物而不杀死细胞。然后可以以高水平产生和耐受毒性较低的化合物。这些毒性较低的化合物一旦产生，就可以分离并直接使用，或可以分离并化学转化回至毒性较高的化合物。
如下所示，改造细胞以修饰有毒的中链脂肪酸衍生物的官能团，例如通过用短链酸或醇进行酯化，消除了细胞对非酯化的化合物的毒性反应，并使改造的细胞能够在大量产生毒性化合物的生化途径的表达下存活。这使得新颖且选择性的方法能够以远高于其抑制水平的浓度产生这些中链长度的脂肪酸衍生物。
此外，通过酯化修饰中链脂肪酸和/或中链脂肪醇以提供酯化的中链脂肪酸和/或酯化的中链脂肪醇通过充当提取剂进一步降低了中链中间体在生物合成途径中的毒性。
酯化的中链脂肪酸衍生物作为提取剂
在图3中，显示了旨在测试乙酸辛酯的存在是否可以保护细胞免受1-辛醇毒性影响的实验结果。从图3可以清楚地看出，在暴露于0.5克/升(g/L)的浓度的1-辛醇5小时后，大肠杆菌细胞的活力完全丧失。然而，有趣的是，当还以50g/L(对大肠杆菌细胞无毒的浓度)添加乙酸辛酯时，当细胞暴露于0.5g/L浓度的1-辛醇和甚至暴露于1g/L浓度的1-辛醇时，细胞活力维持在对照水平的100％。为，中。当细胞暴露于浓度为10g/L的1-辛醇(远远超出1-辛醇的MIC观察值)时，活力降低了不到20％。
通过表达脂肪醇乙酰基转移酶改造对中链脂肪醇的耐受性
如上所讨论和所示的，中链(C6-C10)脂肪醇的微生物产生受到其毒性的限制。为了确定提高这些中链脂肪酸衍生物化合物的耐受性的遗传和生物化学机制，已经做出了巨大的努力(例如，参见Lennen and Pflefer,2013；Royce等人,2015；Tan,等人,2016；Tan,等人,2017)。然而，直到现在，还没有发现能够产生商业效价(例如，浓度为约10g/l至200g/l或更高)的溶液。
在实施例1中，我们证明了当添加至培养基中时，中链乙酸脂肪醇的毒性低于相应的中链长度的脂肪醇。在下面描述的实验中，我们证明了在细胞内产生中链长度脂肪醇的途径的表达具有细胞毒性，从而导致不良细胞生长和这些细胞的中链醇产生的限制。我们进一步表明，当该同一菌株被进一步改造以表达将中链醇转化为乙酸醇酯的生化途径时，细胞生长良好并产生大量的乙酸脂肪醇。因此，在细胞中合成的中链长度的脂肪醇向其乙酸醇的生化转化消除了中间体中链脂肪醇的毒性，并允许高水平产生乙酸脂肪醇。这进一步证明了编码中链长度的醇-O-乙酰基转移酶的基因赋予对细胞内产生的中链脂肪醇的抗性(图4)。
可以将细胞改造以通过多种生化途径产生脂肪醇(参见例如图4)。这些生物化学途径包括但不限于包含以下的途径，硫酯酶(TE)(参见例如PCT/US1998/011697，美国专利9,765,368，PCT/US2010/04049)，其水解细胞中的脂肪酸硫酯以产生脂肪酸，羧酸还原酶，其催化将脂肪酸ATP和NAD(P)H还原为脂肪醛，以及醇脱氢酶，其催化将脂肪醛NAD(P)H依赖性还原为脂肪醇(注意，大多数细胞在细胞中具有足够的醇脱氢酶活性以催化该反应，但是这些或类似酶的过表达可以确保脂肪醛不会积累，例如参见WO2010/062480)。可以被改造以产生脂肪醇的其他途径包括脂肪酰基还原酶，其催化将脂肪酰基硫酯还原(参见例如Kim等人，2015)为脂肪醛。
脂肪醇的乙酰化可以例如通过表达醇-O-乙酰基转移酶(EC2.3.1.84)来实现，该酶催化醇的乙酰辅酶A(CoA)依赖性乙酰化(图4)。醇乙酰基转移酶(AAT)是多种多样的，并且合适的AAT可以选自植物AAT家族(例如草莓SAAT或FaAAT2，矮牵牛PhcFATB2等)、酵母ATF(酿酒酵母ATF1)(例如参见PCT/US2014/053587)等。作为非限制性实例，在此我们显示了在经过改造以产生脂肪醇的大肠杆菌细胞中表达酿酒酵母ATF1的效果。
为了确定表达乙酰化途径是否有益，将表达中链脂肪醇生物合成途径的菌株的活力与表达ATF(其将(有毒的)将中链脂肪醇转化为乙酸脂肪醇(毒性较低))的同基因菌株的活力进行了比较。在该评估中，菌株sRG.674产生脂肪醇种类，其中产生的总脂肪种类(FAS)的85至90％是链长为8或10个碳的(C8+C10脂肪醇(C8+C10 FALC))。菌株sJN.209与sRG.674是同基因的，除了在表达脂肪醇(FALC)途径的质粒中添加了酿酒酵母atf1基因之外。
表3：产生中链脂肪醇(FALC)或乙酸脂肪醇酯(FACE)的菌株。
菌株名称 描述 表达的途径酶
sRG.674 FALC生产者 改造的硫酯酶变体,CarB,AlrA
sJN.209 FACE生产者 改造的硫酯酶变体,CarB,AlrA,ATF1
如实施例9和10中所述，菌株sRG.674和sJN.209在5L生物反应器中生长，使用最小的盐培养基以葡萄糖作为最大消耗速率的碳源进料(图5)。甚至在加入IPTG(诱导FALC途径的表达和中链化合物的产生)之前，产生FALC的菌株(sRG.674)都无法生长(图5A)。不受理论的束缚，据信产生FALC的菌株不能生长可能是由于参与中链FALC合成的酶的组成型低水平表达以及抑制浓度的C8和C10 FALC的早期产生。相比之下，在菌株sJN.209中表达AAT时，未观察到这种生长抑制作用，而是观察到完整的72小时发酵过程中的完全生长和乙酸脂肪醇酯(FACE)的产生。
所产生的脂肪种类的水平和组成的比较(图5B和图5C)进一步证明了乙酰基转移酶基因使得能够通过将脂肪醇转化为毒性较低的乙酸脂肪醇来在细胞中瞬时但高水平地产生中链长度的脂肪醇的强大能力。
对中链游离脂肪酸的耐受的改造
类似于中链脂肪醇，中链游离脂肪酸对微生物细胞有毒(参见例如图1)。在这里，我们表明，通过为细胞提供将游离脂肪酸转化为毒性较低的烷基酯(例如脂肪酸甲基(FAME)或乙基酯(FAEE))的能力，可以大大改善此类化合物的产生。
中链FFA的酯化可通过表达脂肪酰基-CoA合成酶(例如来自大肠杆菌的FadD)(其催化辅酶A(CoA)和三磷酸腺苷(ATP)依赖性合成酰基-辅酶A(酰基-CoA))和酯合酶(其催化硫酯的醇解反应)例如酰基-CoA(脂肪酰基-CoA合成酶的产物或β-氧化或反向β-氧化途径的中间体)来实现(图6)。
中链FFA的酯化也可以通过表达中链长度的选择性酯合酶(其催化中链长度的酰基ACP(也是烷基硫酯)的直接醇解)(例如实例？)来实现。
表达酯合成途径的益处通过与还表达酰基-CoA合成酶和酯合酶同基因菌株比较活力和由改造以表达对产生中链长度的脂肪酸衍生物具有改善的活性的硫酯酶的菌株产生的中链脂肪酸衍生物而得到证明。
菌株sRS.786被改造以表达中链长度的硫酯酶(SEQ ID NO:49)，并产生主要为C8和C10 FFA的FFA(图7C)。Stpay.179菌株与sRS.786是同基因的，但还表达脂肪酰基-CoA合成酶和酯合酶。当在培养基中提供短链醇如甲醇、乙醇等时，Stpay.179产生中等长度的脂肪烷基酯(图7C)。
表4.产生中链脂肪酸(FFA)或脂肪烷基酯的菌株
Figure BDA0002294805570000751
如以下实施例11和12所述，菌株sRS.786和Stpay.179在5L生物反应器中分批培养，使用以14/g/h的速度进料的葡萄糖作为碳源的最小盐培养基。另外，在发酵过程中加入乙醇(图7)或甲醇(未显示)，以保持约2g/L的醇浓度。
仅产生FFA(sRS.786)的菌株在添加IPTG以诱导中链长度的酰基-ACP硫酯酶(SEQID NO:49)表达后约10小时停止生长和葡萄糖消耗，并产生约5g的C8+C10 FFA。相反，表达酯化途径的Stpay.179菌株能够生长并产生超过84g/kg的总脂肪酸种类的效价，其中93％为C8-C10 FFA(图7B和图7C)。当使用乙醇或甲醇作为补充酯合成的醇时，观察到相似的结果。
这些数据证明，催化毒性的细胞内中链游离脂肪酸转化为毒性较低的烷基酯(例如脂肪酸甲基或脂肪酸乙基酯)的酯合成途径的表达使得能够高水平产生中链长度的脂肪酸衍生物。这些数据进一步表明，酯合成途径的表达通过消除其毒性使中链长度的选择性硫酯酶的高水平表达成为可能。
实施例4
以下实施例示出了改造的硫酯酶变体，其含有单个氨基酸取代并且对于产生中链长度的脂肪酸衍生物具有改善的活性和/或选择性。
使用生物技术产生中链(C6至C10)长度的脂肪酸衍生物当前部分地受到可用的硫酯酶(TE)的活性和选择性的限制。可用的最具活性和选择性的TE之一是Cuphaehookeriana硫酯酶chFatB2，一种具有SEQ ID NO:1所述氨基酸序列的酶。
然而，不幸的是，自然界中发现的这种酶具有许多限制。它在微生物中难以表达为可溶性蛋白，其比活性低，并且相对于C8硫酯而言，其对C10硫酯的水解更具选择性。为了产生具有改善的活性、选择性和溶解度的新TE，我们进行了充分的改造工作，以鉴定SEQ IDNO:1中的可能导致对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的新型改造TE变体的氨基酸取代。这样的对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的TE变体可以通过改善的催化活性、改善的选择性和/或改善的溶解度中的任何一种或多种获得对产生中链脂肪酸衍生物的改善的活性。
SEQ ID NO:1具有328个氨基酸(6560个可能的单氨基酸变体)，并且没有报道的可以支持合理的酶改造努力的三维晶体结构。我们首先进行了鉴定和改造SEQ ID NO:1中的单一突变的工作，该突变将导致与亲本序列SEQ ID NO:1相比表现出酶活性和/或中链长度选择性的显著提高的改造TE变体。
为了评估此类突变，在大肠杆菌中表达编码具有选定的单个氨基酸取代的新型改造TE的基因，并在支持TE依赖性脂肪酸衍生物产生的条件下使其生长。然后，定量该菌株产生的中链脂肪酸衍生物的量和组成，并将其与相同的对照菌株(除了其表达具有SEQ IDNO:1的酶的)产生的中链脂肪酸衍生物的量和组成进行比较。
不天然产生游离脂肪酸的大肠杆菌在被改造以表达异源TE时可以产生游离脂肪酸，并且这些脂肪酸的量和组成与表达的TE的活性和选择性直接相关(参见例如Yuan等人，(1995)同上；国际专利申请公开WO2007136762；国际专利申请公开WO2008119082)。
如以上在实施例1-3中所讨论的，中链长度的脂肪酸和中链长度的脂肪醇的产生对微生物例如大肠杆菌有毒。为了确保用于评估改造的TE的宿主大肠杆菌能够耐受产生潜在毒性水平的中链长度脂肪酸的改造的TE，还对使用的大肠杆菌改造以表达能够通过影响脂肪酸转化为乙酸脂肪醇增加细胞对中链长度的脂肪酸的耐受性的基因，使得由改造细胞产生的乙酸脂肪醇的水平和组成与所表达的TE的活性和选择性直接相关。
对照评估菌株的产生
合成了编码SEQ ID NO:1的多肽的基因以在大肠杆菌中最佳翻译，并该基因显示为SEQ ID NO:60。将该基因克隆到赋予对卡那霉素的抗性的基于pACYC的质粒(Genbank登录号X06403)中，使得该基因处于Ptrc启动子的转录控制下(参见例如Camsund等人，Journal of Biological Engineering 2014，8:4)，该启动子在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下被诱导。将得到的质粒pIR.108(图8)转化到源自MG1655的大肠杆菌，该大肠杆菌经改造以过表达来自染色体的基因EntD(参见例如国际专利申请公开WO2010062480)并具有Ptrc控制的操纵子，其表达基因carB、alrA和aftA1，其在上面的实施例3中描述并一起影响游离脂肪酸(FFA)向乙酸脂肪醇(FACE)的生化转化。
为了确保可以有效地测试具有高活性和特异性的改造TE，使用了几个对照评估菌株，其各自具有不同的脂肪酸衍生物产生能力，即它们被改造以支持通过脂肪酸途径的不同水平的碳通量(表5)。此外，在某些情况下，使用对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的新型改造TE变体作为对照TE来代替SEQ ID NO:1，以鉴定高活性的改良改造TE变体。例如，将具有单个氨基酸取代的TE与在经改造以具有中等脂肪酸通量的菌株中表达的SEQ IDNO:1进行比较。一旦开发出新型的高活性TE变体，在中等脂肪酸通量菌株中表达的SEQ IDNO:1就不再足以用作对照。取而代之的是，将具有多个氨基酸取代并在具有高脂肪酸容量的菌株中表达的新型高活性改造TE变体用作对照。我们总共使用了五个不同的TE和菌株来支持对新型改造TE变体的评估，以确保可以最佳地定量和鉴定每个TE变体的性能改善。表5中显示了具有产生脂肪酸衍生物的各种能力的对照基础菌株的列表。表6显示了对照TE相对于野生型序列(SEQ ID NO:1)的性能。
表5具有产生脂肪酸衍生物的不同能力的对照基础菌株的描述
Figure BDA0002294805570000781
*下文“定量改造TE变体的相对性能”中所述的HTP筛选中FAS效价(mg/L)范围取决于每种菌株中改造的烷基硫酯的通量水平。
表6对照改造的硫酯酶变体及其相对于野生型序列(SEQ ID NO:1)的性能。
Figure BDA0002294805570000782
与SEQ ID NO:1相比具有改善的活性的改造TE的鉴定。
表7中所述的表达改造TE的菌株均在导致影响中链脂肪酸的产生的编码其独特改造TE的基因和影响那些中链脂肪酸向中链乙酸脂肪醇的转化的编码CarB、AlrA和Aft1的基因的表达的条件下生长。提取、定量所得的脂肪酸衍产生物，然后与由在相同条件下生长的表达SEQ ID NO:1(表6)的对照评估菌株1产生的脂肪酸衍生物产物进行比较。生长和所得脂肪酸衍生物的分析的详细方法如下所述。
表7描述了改造的TE，其对以下方面具有改善的性能：(1)活性，即由培养物产生的总脂肪酸衍生产物；(2)C8选择性，即由培养物产生的总FAS的％C8 FAS；以及(3)C8相比C10产物的选择性(％C8 FAS/％C10 FAS)，其中性能报告为相对于对照的倍数(FOC)。表7中所示的单个突变体是相对于SEQ ID NO:1的。因此，例如，P3K表示在SEQ ID NO:1的氨基酸位置3处的取代突变(脯氨酸至赖氨酸)。
表7具有改善的产生总FAS、总FAS的％C8 FAS和/或％C8 FAS/％C10 FAS的能力的改造的硫酯酶变体。FOC：相对于对照的倍数。
Figure BDA0002294805570000791
Figure BDA0002294805570000801
Figure BDA0002294805570000811
Figure BDA0002294805570000821
定量改造TE变体的相对性能
为了定量每个改造TE变体的性能，在支持TE、CarB、AlrA和Atf1表达的条件下培养表达变体的细胞的培养物，并通过具有火焰离子化检测的气相色谱法(GC/FID)提取和定量所得的脂肪酸衍生物，如下文所述。
确定所得脂肪酸衍生物(脂肪酸、脂肪醇和乙酸脂肪醇)的组成和量，然后与表达对照TE的对照评估菌株在相同条件下产生的脂肪酸衍生物进行比较。简而言之，将每种菌株的单个菌落接种到96孔板的孔中，该孔含有200μL的Luria Bertani肉汤，所述肉汤含有合适的抗生素。在96深孔板中，用40μL的这种培养物接种360μL的相同培养基，然后将其在32℃下摇动4小时。在最终的96深孔板中，将40μL的这种培养物接种到360μL的生产培养基中(表8)。用60μL十六烷覆盖这些培养物，在32℃摇动2小时，添加IPTG(至1mM)以诱导TE、CarB、AlrA和Atf1的表达，并继续摇动另外20小时，之后将培养物如下面所描述的进行评估。
表8生产培养基
Figure BDA0002294805570000831
脂肪酸衍生物(FAS)样品制备和定量
向每个孔中加入400μL乙酸丁酯(包含500mg/L十一烷作为内部分析标准)，将板加热密封，以2000rpm摇动15分钟，在室温以4500rpm离心10分钟，并将100μL的顶部有机层转移到含有100μL N,O-双(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)的96孔板中(参见例如Stalling DL,等人，Biochemical and Biophysical Research Communications.1968May23；31(4):616-22)。将板密封并通过具有火焰离子化检测器的气相色谱法(GC-FID)进行评估。
每个板中包括对照评估菌株作为表达改造TE变体的菌株的“内部板对照”。为了确定改造TE变体的相对性能，定量脂肪酸衍生物(由表达的TE和下游转化酶CarB、AlrA和Atf1的作用产生的产物：脂肪酸、脂肪醛、脂肪醇和乙酸脂肪醇)的总量和特定的脂肪酸衍生物(例如特定的链长，即C8或C10)，然后将其与来自同一平板的对照评估菌株的相同参数进行比较，并报告为相对于对照的倍数(FOC)。例如，通过将突变体A的提取物中鉴定出的所有脂肪酸种类的总效价相加，并除以内部对照评估菌株的总FAS效价，来确定突变体A的总FAS效价FOC。相对于对照具有改善的活性的改造TE变体对于报告的参数显示出大于1.0的FOC。突变体A的总C8FAS FOC是通过将突变体A的提取物中鉴定出的所有具有C8链长的脂肪酸种类的总浓度相加并除以对内部对照评估菌株鉴定出的所有具有C8链长的脂肪酸种类的总浓度来确定。对于包含单个氨基酸取代的改造的硫酯酶变体，用于鉴定命中的主要指标如下：a)改善的总FAS FOC，b)改善的总FAS的％C8 FAS FOC，和/或c)改善的％C8/％C10。
表7(上文)中所示的突变令人惊讶地鉴定为具有显著a)改善总FAS FOC的能力；b)改善总FAS的％C8 FAS FOC的能力。因此，含有表7中列举的突变的改造硫酯酶(TE)变体代表了对产生脂肪酸衍生物具有改善的活性的新型改造TE变体。具体而言，表7中所示的改造TE变体代表了对产生C8和/或C10脂肪酸衍生物具有改善的活性的新型TE变体。
实施例5
改造TE变体以包含多个氨基酸取代，其产生了对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的新TE。所述变体相对于天然硫酯酶(SEQ ID NO:1)和相对于具有单个氨基酸取代的改造TE变体(实施例4，表7)具有改善的活性和选择性。
类似于实施例4，合成了编码具有多个氨基酸取代的改造TE变体的基因，并将其克隆到在IPTG存在下生长时影响其表达的表达载体中。将它们转化到源自MG1655的大肠杆菌菌株中，该菌株被改造以过表达来自染色体的EntD基因(参见例如WO2010062480)并具有Ptrc控制的操纵子，其表达基因carB、alrA和aftA1，其在上面的实施例3中描述并一起影响游离脂肪酸(FFA)向乙酸脂肪醇(FACE)的生化转化。将具有多个氨基酸取代的改造TE与除了表达TE以外相同的特定对照评估菌株进行比较。
表7列出了具有多个氨基酸取代并且显示出与列出的对照评估菌株和TE相比对产生中链脂肪酸衍生物(FAS)的改善的活性和对产生中链长度脂肪酸衍生物(SEQ ID NO:2至SEQ ID NO:15)的改善的选择性。因此，每种新的改造TE、它们的个体突变以及它们独特的突变组合是产生中链长度脂肪酸衍生物的有用工具，因为新的改造TE是对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的硫酯酶。
实施例6
以下实施例示出了改造的TE变体，其具有增加的表面电荷和对产生中链长度的脂肪酸衍生物的改善的活性。三维建模用于改造对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的硫酯酶变体/突变体。
在一些实施方案中，当在大肠杆菌中过表达时，SEQ ID NO:1似乎是有毒的。不受理论的束缚，据信SEQ ID NO:1在细胞中可能不稳定或容易以高浓度聚集。因此，为了减少蛋白质的潜在毒性，计算地构建了三维模型，并用于改造对SEQ ID NO:1的表面改变。
在此实施例中，通过模板化其他酰基-ACP硫酯酶的X射线晶体结构来计算地构建SEQ ID NO:1的三维分子模型。基于该模型，鉴定了预计会改变净表面电荷的SEQ ID NO:1酶的特定残基。具体而言，带负电荷的残基(Asp或Glu)在酶表面突变为带正电荷的残基(Arg或His)，从而使净表面电荷从+15变为+25。如表7所示，得到的具有增加的表面电荷的改造TE变体产生较高百分比的C8脂肪酸衍生物。因此，改造TE变体具有改善的产生中链脂肪酸衍生物的活性。
SEQ ID NO:1硫酯酶的3-D建模。由于SEQ ID NO:1的实验性3D结构不可用，因此如以下步骤1-5中所述，通过计算构建了该酶的基于同源性的3D模型。
(1)已知结构的同源硫酯酶的鉴定
蛋白质数据库(PDB)是生物大分子结构数据的唯一全球档案库(参见Berman,H.M.等人,Nucl.Acids Res.(2000)28(1):235-242)。PDB蛋白数据库可从rcsb.org/pdb/home/home.do的万维网上获得。PDB数据库用于鉴定硫酯酶的三个已解析的X射线晶体结构。具体而言，鉴定出的硫酯酶的三个已解析的结构是：1)具有蛋白质数据库鉴定号(PDB ID：2ESS)的来自多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)的酰基-ACP硫酯酶，来自植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)的油酰硫酯酶(PDB ID：2OWN)，和3)来自Spirosoma linguale的酰基-ACP硫酯酶(PDB ID：4GAK)。这些总体上显示与SEQ ID NO:1约25％的序列同一性的结构被用作模板。
(2)查询序列与模板结构的比对
将在PDB中鉴定的硫酯酶的三个已解析的3D结构(2ESS、2OWN和4GAK)及其序列用可在万维网：prodata.swmed.edu/promals3d/promals3d.php上找到的PROMALS3D多序列和结构比对服务器进行比对(参见例如J.Pei and N.V.Grishin(2007)Bioinformatics.23(7):802-808；J.Pei等人,(2008)Nucl.Acids Res.36(7):2295-2300)。在比对2ESS、2OWN和4GAK的序列和结构后，使用MMFFT版本7(参见例如Katoh,K.,等人，(2013)Mol.Biol.Evol.Apr；30(4):772-780)将SEQ ID NO:1的查询序列比对到基于现有结构的序列比对中。该软件可从万维网：mafft.cbrc.jp/alignment/software上获得。SEQ ID NO:1与在PDB中鉴定的酰基-ACP硫酯酶(2ESS、2OWN和4GAK)的比对如图9所示。
(3)建立SEQ ID NO:1硫酯酶的同源3D结构模型
通过MODELLER软件(参见例如B.Webb,A.Sali.Comparative Protein StructureModeling Using Modeller.Current Protocols in Bioinformatics,John Wiley&Sons,Inc.,5.6.1-5.6.32,2014)使用所有三个模板2ESS、2OWN和4GAK以及上述步骤2中所述的基于结构的比对建立了氨基酸37至310的同源性模型。通过MODELLER内置的优化模式进行进一步的结构优化。使用VTFM优化和MD优化模块对所有默认参数进行优化。有关MODELLER软件和下载的信息，可从万维网：salilab.org/modeller获得。
(4)建立N-末端和C-末端结构域的从头开始(ab initio)模型
如图9所示，在这些实验中使用的SEQ ID NO:1硫酯酶具有不包含在模板X射线晶体结构中的N-末端和C-末端残基(N-末端有36个氨基酸，C-末端有18个氨基酸)。因此，没有合适的模板来为这些部分建立基于同源性的模型。因此，对于N-末端和C-末端通过ROBETTA服务器(参见例如Kim,D.E.,等人，(2004)Nucleic Acids Res.Jul 1；32(Web Serverissue):W526-W531；可在万维网：robetta.org上获得)构建从头开始模型(参见例如J.Lee等人，(2009)Ab Initio Protein Structure Prediction第3-25页，于From ProteinStructure to Function with Bioinformatics,D.J.Rigden(ed.)Springer)。
(5)建立SEQ ID NO:1硫酯酶和改造TE变体的全长模型
使用以下三个模板：主要部分同源性模型、N-末端从头开始模型和C-末端从头开始模型，使用MODELLER软件制作全长模型。
与野生型对照相比，具有氨基酸取代P3K、L176V、D196V、K203R、V282S(SEQ ID NO:4)的改良的改造TE变体证明了产生中链长度脂肪酸衍生物的改善的能力(实施例5，表7)。因此，通过实际上取代5个变异残基并再次用MODELLER内置的精制模式进行结构精制，将SEQ ID NO:1的模型重塑为SEQ ID NO:4。然后基于最终模型定义表面残基(图10)。
创建具有模拟表面电荷的增加的改造TE变体。
基于上述SEQ ID NO:4的3D结构模型，对十二个天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)残基进行建模以使SEQ ID NO:4的表面带负电荷。然后合成编码具有这12个残基的各种正负取代的改造TE变体的基因，并如实施例4和5中所述评估与对照TE(SEQ ID NO:4)相比，中链长度脂肪酸衍生物的改善的产生。
表7描述了一组改造TE变体(SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:46)，其具有与SEQ IDNO:4相比导致模拟表面电荷增加的氨基酸取代，并且对产生中链长度的脂肪酸衍生物具有改善的活性。因此，表7中以SEQ ID NO:16至SEQ ID NO:46列出的TE是用于产生中链长度脂肪酸衍生物的新型改造TE变体。此外，具有增加了模拟表面电荷的氨基酸取代的改造的变体TE可用于与不具有模拟表面电荷的改造增加的TE相比改善中链长度脂肪酸衍生物的产生。
创建包含具有增加的模拟表面电荷的多个改造突变和增加对产生中链长度脂肪 酸衍生物的活性和/或选择性的多个改造突变的新型硫酯酶。
将如上所述通过3-D建模鉴定出的预计会增加硫酯酶表面电荷以及导致中链长度脂肪酸衍生物的改善的生产的氨基酸取代(表7)与相对于其相应对照对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性(实施例6，表7)并具有SEQ ID NO:15的改造TE变体组合。
类似于实施例5，合成了编码具有多个氨基酸取代的改造TE变体的基因，并将其克隆到表达载体中，该表达载体在IPTG存在下生长时影响其表达。将它们转化到源自MG1655的大肠杆菌菌株中，该菌株被改造以过表达来自染色体的EntD(参见例如国际专利申请公开WO2010062480)并具有Ptrc控制的操纵子，其表达基因carB、alrA和aftA1，其在上面的实施例3中描述并一起影响游离脂肪酸(FFA)向乙酸脂肪醇(FACE)的生化转化。将具有多个氨基酸取代的改造的TE与对照评估菌株(其中唯一的区别是表达的TE是对照TE SEQ ID NO:15)进行比较。表7描述了衍生自此实施例的一组改造TE变体(SEQ ID NO:47至SEQ ID NO:51)，其相对于对照(SEQ ID NO:15)对产生脂肪酸衍生物具有改善的活性。表7中列出的TE是可用于产生中链长度的脂肪酸衍生物的新型改造TE变体，因为它们是对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的硫酯酶。
实施例7
以下实施例示出了改造TE变体，其具有N-末端截短、增加的溶解度和改善的产生中链长度脂肪酸衍生物的活性。
植物FatB样硫酯酶具有介导其从内质网向质体转移的信号肽。已知这些酶包含在信号肽加工后保留的N端疏水区。该区域被认为与硫酯酶与类囊体膜的缔合有关。当在诸如大肠杆菌的微生物中表达时，野生型(SEQ ID NO:1)和上述新型改造TE变体是不溶的，并且在细胞裂解和离心后与膜沉淀物缔合。低的酶溶解度表明许多酶可能与膜缔合，或者折叠不良且无活性。
为了产生对产生中链长度的脂肪酸衍生物具有改善的溶解度和活性的新的改造TE变体，将具有SEQ ID NO:49的多肽改造成在氨基酸2至40之间具有截短，该区域被建模为包含关键的疏水残基，其怀疑可能是造成该酶不良溶解性的原因。然后将这些改造TE变体的溶解度和活性与相同氨基酸序列和在氨基酸2和40之间没有截短的对照TE比较来进行评估。
评估在氨基酸2和40之间具有截短的改造TE变体的溶解度。
合成编码在SEQ ID NO:49的氨基酸2至40之间具有缺失的改造TE变体的基因，并在Ptrc启动子的控制下将其克隆到基于中等拷贝pACYC的表达质粒(Gen Bank登录号X06403)中。然后将这些质粒转化到大肠杆菌中，并与携带指导对照TE(SEQ ID NO:49)表达的质粒的相同菌株相比，评估它们指导溶解度增加的TE变体的表达的能力。表达在氨基酸2和40之间具有截短的改造TE变体的菌株与表达对照TE(SEQ ID NO:49)的菌株之间的唯一区别是表达的TE的序列。如实施例4中所述，将所得的表达对照和截短的TE的菌株各自在导致表达TE的基因的表达的条件下在96孔板中生长。通过离心收集细胞，并将其重悬浮于50μL的含有25mM NaCl、5mM EDTA和1mg/mL溶菌酶的50mM Tris-HCl(pH7.8)中。将样品在25℃、1500rpm下孵育。20分钟后，将10μl DNase I的1mg/mL溶液和10μL的1M MgSO4添加到每个样品中。然后将样品以1500rpm再摇动20分钟。将所得的全细胞裂解液(WCL)以4500rpm离心10分钟，以将不溶级分(沉淀)与可溶级分(上清)分离。
使用针对TE的C-末端的抗体的蛋白质印迹来追踪在WCL的可溶级分中对照和改造TE截短变体的存在。如图11所示，对照多肽(具有SEQ ID NO:49的硫酯酶)在WCL中可见(表明它在宿主细胞中表达)，但是在可溶级分中不存在，表明低溶解度。相比之下，在WCL和可溶级分中都发现了改造的截短的TE变体，其中TE变体全都显示在可溶级分中存在的TE变体的明显的增加。
这表明当在微生物中表达时不溶的植物FatB样硫酯酶例如SEQ ID NO:1的溶解度可以通过表达在酶的N-末端截短的改造变体来提高。它进一步表明，与没有这种截短的TE例如对照TE(SEQ ID NO:49)相比，改造的截短的变体在大肠杆菌中表达时具有增加的溶解度。
生长和脂肪酸衍生物的产生。
溶解性差的中链长度TE的溶解度增加应导致细胞中存在更具活性的中链长度的TE，从而导致中链脂肪酸产量增加。
为了评估改造TE截短变体的相对活性，将每种酶克隆到载体中，使得该基因处于Ptrc启动子的转录控制下(Camsund等人，同上)，该启动子在异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的存在下被诱导，如实施例4中所述。将这些转化到源自MG1655的大肠杆菌基础菌株中，该菌株经过改造以过表达来自染色体的基因EntD，并具有Ptrc控制的操纵子，其表达基因carB、alrA和aftA1(其在上面的实施例3中描述)用于游离脂肪酸(FFA)向乙酸脂肪醇(FACE)的生化转化。改造的基础大肠杆菌被设计为对产生脂肪酸衍生物具有很高的能力，以适应这些更易溶解的改造TE变体的预期高活性。
将每种改造的截短的硫酯酶的性能与表达对照TE(SEQ ID NO:49)的对照评估菌株进行比较。表达改造的截短的TE变体的评估菌株与表达对照TE的对照评估菌株(SEQ IDNO:49)之间的唯一区别是编码表达的TE的基因的序列。使每个菌株生长以产生中链乙酸脂肪醇酯，并且如实施例4中所述提取和定量所得的中链脂肪酸衍生产物。
如实施例4中所述，通过将所得的脂肪酸衍生物产物与由对照评估菌株(表达SEQID NO:49)产生的脂肪酸衍生物产物进行比较，来评估每个改造的截短的TE变体的活性。
表7列出了具有改善的(1)溶解度(图11)和(2)产生中链脂肪酸衍生物的活性的性能的改造的截短的TE变体(SEQ ID NO:52至SEQ ID NO:59)，其中性能报告为相对于内部对照的倍数(FOC)。因此，截短的突变体是对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的硫酯酶变体。
为了进一步证明具有增加的溶解度的改造的截短的TE变体的改善的活性，如实施例9中所述，将表达SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56的菌株在5L生物反应器中生长，并与在相同条件下生长的表达TE SEQ ID NO:49的对照评估菌株进行比较。表9描述了在72h时间点的报告为相对于对照的倍数(FOC)的这些菌株的性能。SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:56在此更大的规模上均显示出改善的活性(FAS FOC)和选择性(％C8 FAS和％C8/％C10 FOC)。
表9改造的截短的TE变体当在5L生物反应器中生长时显示出对产生中链长度脂肪酸衍生物改善的体内活性。
Figure BDA0002294805570000911
实施例8
下面的实施例示出了可用于使用对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的遗传修饰的微生物来产生脂肪酸衍生物的方法。通过该方法产生的脂肪酸衍生物的组合物包括但不限于中链脂肪酸、中链脂肪醇、中链乙酸脂肪醇酯(FACE)、中链脂肪酸甲酯(FAME)、中链脂肪酸乙酯(FAEE)以及其他中链脂肪酸酯。
种子培养扩增的产生。
所选改造大肠杆菌菌株的冷冻细胞库小瓶用于在含有适当抗生素的125mL带挡板的摇瓶中接种20mL LB肉汤。将此摇瓶在32℃的轨道摇床上孵育约6个小时，然后将1.25mL的肉汤(1％v/v)转移至125mL的最小过夜种子培养基(2g/L NH4Cl,0.5g/L NaCl,0.3g/LKH2PO4,1mM MgSO4,0.1mM CaCl2，20g/L葡萄糖，1mL/L微量矿物质溶液(2g/L ZnCl2·4H2O,2g/L CaCl2·6H2O,2g/L Na2MoO4·2H2O,1.9g/L CuSO4·5H2O,0.5g/L H3BO3和10mL/L浓HCl)，10mg/L柠檬酸铁，100mM Bis-Tris缓冲液(pH 7.0)和适当的抗生素)中，将其在500mL带挡板的锥形摇瓶中摇动，并在摇床上于32℃孵育过夜。
生物反应器培养方案。
将上述的75mL(5％v/v)的过夜种子培养物用于接种5L Biostat Aplus生物反应器(Sartorius BBI)，该反应器最初包含1.5L的无菌生物反应器发酵培养基。该培养基包含2g/L的KH2PO4，0.5g/L的(NH4)2SO4，2.2g/L的MgSO4七水合物，10g/L的无菌过滤葡萄糖，80mg/L的柠檬酸铁，1mL/L的上述微量矿物质溶液，0.25mL/L的维生素溶液(0.42g/L的核黄素，5.4g/L的泛酸，6g/L的烟酸，1.4g/L的吡多辛，0.06g/L生物素，0.04g/L的叶酸)，1g/L的NaCl，1g/L的柠檬酸，140mg/L的CaCl2二水合物，10mg/L的ZnCl2和适当的抗生素。使用28％w/v的氨水将培养物的pH值保持在6.9至7.2，取决于特定产品，培养温度保持在33至35℃，通气速率保持在0.75lpm(0.5v/v/m)，以及溶解氧张力保持在30％的饱和度，并且利用级联至DO控制器的搅拌回路和氧气补充。通过自动添加基于硅酮乳剂的消泡剂(Dow Corning1430)来控制起泡。
当初始培养基中的葡萄糖被完全耗尽时(接种后约7小时)，起始包含约50％w/w葡萄糖(600g/L)的营养物进料，并使用DOstat控制器策略按需以10g/L/h的速率进料(每次进料持续一小时)。通过添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1mM来诱导涉及产生中链脂肪酸衍生物的基因。生物反应器运行在发酵时间过去约72小时后结束。在整个发酵过程中将发酵液的样品装罐。
肉汤成分分析。
使用常规GC-FID在一次运行中提取并分离存在于发酵液样品中的脂肪酸衍生物。为此，将0.5mL的每个均质发酵液样品等分到15mL falcon管中。记录样品的质量，并将5.0mL乙酸丁酯和500ppm内标物(C11 FAME或C9/C11/C15 FALC)添加到肉汤中以实现10倍提取。将样品在2500rpm下机械摇动30分钟，并在25℃下以4500rpm离心10分钟。将50μl提取物(顶层)转移到GC小瓶中，并用50μL BSTFA w/10％TCMS衍生化，然后涡旋振荡约15秒。然后，使用10m×180μm×0.2μm的Agilent DB1柱在常规GC-FID系统中运行样品，以分离提取的样品中存在的所有脂肪酸衍生物。每种脂肪酸衍生物的浓度以g/Kg表示。
实施例9
以下实施例示出了可用于使用对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的遗传修饰的微生物产生中链乙酸脂肪醇酯的方法。通过该方法产生的脂肪酸衍生物的组合物可以包括具有6至12个碳的酰基链的中链脂肪酸、中链脂肪醇和中链乙酸脂肪醇酯(FACE)。如实施例8所述，在5L生物反应器中产生中链乙酸脂肪醇酯。
在此实施例中，使用了源自MG1655的大肠杆菌菌株，其被改造以过表达来自染色体的EntD基因，并且具有很高的产生中链脂肪酸衍生物的能力。这些菌株含有对产生中链脂肪酸具有改善的活性的改造硫酯酶，以及操纵子，其表达基因carB、alrA和aftA1(其在上面的实施例3中描述)用于游离脂肪酸(FFA)向乙酸脂肪醇(FACE)的生化转化。具有SEQ IDNO:9的改造硫酯酶在菌株sRG.825中表达，而具有SEQ ID NO:49的改造硫酯酶在菌株sDH.377中表达。编码改造硫酯酶、carB、alrA和aftA1的基因均处于诱导型(Ptrc)启动子的转录控制下，该启动子通过在发酵时间过去约24小时向生物反应器中添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来激活。生物反应器运行在发酵时间过去约72小时结束，如以上实施例8中所述收集并进行分析发酵液。结果示于表10和图12中。
表10.对产生中链乙酸脂肪醇或脂肪酸烷基酯进行改造的代表性菌株产生的总脂肪酸种类(FAS)浓度。
菌株 总FAS(g/Kg) 肉汤中的脂肪酸衍生物
sRG.825 65 中链乙酸脂肪醇酯
sDH.377 60 中链乙酸脂肪醇酯
sAZ918 60 中链脂肪酸乙酯
实施例10
以下实施例示出了可用于使用具有改善的产生脂肪酸衍生物的能力的遗传修饰的微生物产生中链脂肪醇的方法。通过该方法产生的脂肪酸衍生物的组合物可以包括具有6至12个碳的酰基链的脂肪酸、脂肪醛和脂肪醇。如实施例8中所述，使用改造以过表达来自染色体的基因EntD并含有中链硫酯酶以及表达基因carB和alrA的操纵子用于将游离脂肪酸(FFA)生化转化为脂肪醇(FALC)的大肠杆菌菌株，在5L生物反应器中产生中链脂肪醇。编码硫酯酶、carB和alrA的基因均处于诱导型(Ptrc)启动子的转录控制下，该启动子通过在发酵时间过去约7小时后向生物反应器中添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来激活。中链脂肪醇对大肠杆菌有剧毒，因此在达到抑制浓度(1g/L以下，参见实施例3)后不久，这些化合物在5L生物反应器中的产生过程中的积累停止生长和产生。
实施例11
以下实施例示出了使用包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的硫酯酶变体的遗传修饰的微生物来产生中链脂肪酸烷基酯的方法。通过该方法产生的脂肪酸衍生物的组合物可包括具有6至12个碳原子的酰基链的中链脂肪酸、中链脂肪酸甲酯(FAME)和/或中链脂肪酸乙酯(FAEE)。
此实施例示出了使用源自MG1655的大肠杆菌菌株(sAZ918)产生脂肪酸乙酯(FAEE)，该菌株经过改造以具有很高的产生中链脂肪酸衍生物的能力。该菌株包含对产生中链脂肪酸具有改善的活性的改造硫酯酶(SEQ ID NO:49)，以及表达酰基-CoA合成酶和酯合酶的操纵子(实施例3中所述)用于将游离脂肪酸(FFA)生化转化为脂肪酸烷基酯(FAME或FAEE)。改造的硫酯酶、酰基-CoA合成酶和酯合酶均处于诱导型(Ptrc)启动子的转录控制下，该启动子通过添加异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来激活。
如实施例8中所述在5L生物反应器中进行中链脂肪酸乙酯的产生，但是向营养物进料中添加乙醇。用种子培养物接种5L生物反应器后，在初始培养基中的葡萄糖完全耗尽(接种后约7小时)起始包含47.5％w/w葡萄糖和50mL/L乙醇的营养物进料，并使用pHstat控制器策略以10g/LL/h的速率按需进料(每次进料持续一小时)。一旦达到1200rpm搅拌速度的参数值，将最小搅拌速度将固定为1200rpm，以防止生物膜覆盖溶氧探头并导致错误的低信号读数。如果残留浓度降至10g/L以下，则向培养物中添加额外的乙醇。通过添加IPTG至终浓度1mM，在发酵时间过去约24小时后诱导该菌株的辛酸乙酯产生途径。生物反应器运行在发酵时间过去约72小时后结束。如上文实施例8中所述收集并分析发酵液。
结果显示在图13中。
实施例12
下面的实施例示出了使用包含对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性的硫酯酶变体的遗传修饰的微生物来产生中链脂肪酸的方法。通过该方法产生的脂肪酸的组合物包括具有6至12个碳的酰基链的中链脂肪酸。在此实施例中，如实施例8所述，使用改造以在通过在发酵时间过去约13小时后向生物反应器中加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)来活化的诱导型(Ptrc)启动子的转录控制下过表达中链硫酯酶的大肠杆菌菌株，在5L生物反应器中产生中链脂肪酸。中链脂肪酸对大肠杆菌具有高毒性，因此在达到抑制浓度(5g/L以下，参见实施例3)后不久，这些化合物在5L生物反应器中的产生过程中的积累停止生长和产生。
附录A：序列
SEQ ID NO:1
Figure BDA0002294805570000961
SEQ ID NO:2
Figure BDA0002294805570000962
SEQ ID NO:3
Figure BDA0002294805570000963
SEQ ID NO:4
Figure BDA0002294805570000964
SEQ ID NO:5
Figure BDA0002294805570000965
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SEQ ID NO:6
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SEQ ID NO:11
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Figure BDA0002294805570000982
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SEQ ID NO:19
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Figure BDA0002294805570001006
SEQ ID NO:31
Figure BDA0002294805570001007
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SEQ ID NO:32
Figure BDA0002294805570001012
SEQ ID NO:33
Figure BDA0002294805570001013
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Figure BDA0002294805570001014
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Figure BDA0002294805570001015
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Figure BDA0002294805570001016
SEQ ID NO:37
Figure BDA0002294805570001017
SEQ ID NO:38
Figure BDA0002294805570001018
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SEQ ID NO:39
Figure BDA0002294805570001022
SEQ ID NO:40
Figure BDA0002294805570001023
SEQ ID NO:41
Figure BDA0002294805570001024
SEQ ID NO:42
Figure BDA0002294805570001025
SEQ ID NO:43
Figure BDA0002294805570001026
SEQ ID NO:44
Figure BDA0002294805570001027
SEQ ID NO:45
Figure BDA0002294805570001031
SEQ ID NO:46
Figure BDA0002294805570001032
SEQ ID NO:47
Figure BDA0002294805570001033
SEQ ID NO:48
Figure BDA0002294805570001034
SEQ ID NO:49
Figure BDA0002294805570001035
SEQ ID NO:50
Figure BDA0002294805570001036
SEQ ID NO:51
Figure BDA0002294805570001037
Figure BDA0002294805570001041
SEQ ID NO:52
Figure BDA0002294805570001042
SEQ ID NO:53
Figure BDA0002294805570001043
SEQ ID NO:54
Figure BDA0002294805570001044
SEQ ID NO:55
Figure BDA0002294805570001045
SEQ ID NO:56
Figure BDA0002294805570001046
SEQ ID NO:57
Figure BDA0002294805570001047
SEQ ID NO:58
Figure BDA0002294805570001051
SEQ ID NO:59
Figure BDA0002294805570001052
SEQ ID NO:60
Figure BDA0002294805570001053
对本领域的技术人员显而易见的是，在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下，可以对以上方面和实施方案进行各种修改和变化。

Claims (52)

1.一种改造的硫酯酶变体，其对产生中链脂肪酸衍生物具有改善的活性。
2.权利要求1的改造的硫酯酶变体，其中所述改造的硫酯酶变体对产生C8脂肪酸衍生物具有改善的活性。
3.权利要求1的改造的硫酯酶变体，其中所述改造的硫酯酶变体具有与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性并且在选自以下的氨基酸位置上具有至少一个取代突变的氨基酸序列：3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321和322。
4.权利要求3的改造的硫酯酶变体，其中所述至少一个取代突变是选自以下的成员：(a)氨基酸位置3的赖氨酸；(b)氨基酸位置4的甲硫氨酸；(c)氨基酸位置6的精氨酸；(d)氨基酸位置14的甘氨酸或精氨酸；(e)氨基酸位置15的亮氨酸或色氨酸；(f)氨基酸位置17的丙氨酸或半胱氨酸；(g)氨基酸位置22的精氨酸；(h)氨基酸位置37的脯氨酸；(i)氨基酸位置44的甘氨酸或异亮氨酸；(j)氨基酸位置45的丝氨酸；(k)氨基酸位置50的色氨酸；(l)氨基酸位置54的精氨酸；(m)氨基酸位置56的赖氨酸或半胱氨酸；(n)氨基酸位置64的精氨酸或脯氨酸；(o)氨基酸位置67的亮氨酸；(p)氨基酸位置73的缬氨酸；(q)氨基酸位置76的苯丙氨酸或亮氨酸或酪氨酸；(r)氨基酸位置91的甲硫氨酸；(s)氨基酸位置99的赖氨酸或脯氨酸；(t)氨基酸位置102的异亮氨酸；(u)氨基酸位置110的亮氨酸；(v)氨基酸位置111的苏氨酸；(w)氨基酸位置114的赖氨酸；(x)氨基酸位置129的缬氨酸；(y)氨基酸位置132的色氨酸；(z)氨基酸位置137的半胱氨酸；(aa)氨基酸位置158的谷氨酰胺；(bb)氨基酸位置162的谷氨酸；(cc)氨基酸位置176的缬氨酸；(dd)氨基酸位置178的脯氨酸；(ee)氨基酸位置185的丙氨酸；(ff)氨基酸位置186的甘氨酸；(gg)氨基酸位置196的缬氨酸；(hh)氨基酸位置197的天冬酰胺；(ii)氨基酸位置198的色氨酸；(jj)氨基酸位置203的精氨酸；(kk)氨基酸位置213的组氨酸或精氨酸；(ll)氨基酸位置217的精氨酸；(mm)氨基酸位置225的亮氨酸；(nn)氨基酸位置227的甘氨酸；(oo)氨基酸位置236的苏氨酸；(pp)氨基酸位置244的甲硫氨酸或精氨酸；(qq)氨基酸位置254的甘氨酸；(rr)氨基酸位置256的半胱氨酸或精氨酸；(ss)氨基酸位置258的苏氨酸或缬氨酸；(tt)氨基酸位置278的赖氨酸或缬氨酸；(uu)氨基酸位置282的丝氨酸或缬氨酸；(vv)氨基酸位置292的苯丙氨酸；(ww)氨基酸位置297的苏氨酸或天冬氨酸或缬氨酸；(xx)氨基酸位置298的缬氨酸或半胱氨酸；(yy)氨基酸位置299的亮氨酸；(zz)氨基酸位置300的赖氨酸或色氨酸或亮氨酸；(aaa)氨基酸位置301的半胱氨酸；(bbb)氨基酸位置302的苏氨酸；(ccc)氨基酸位置316的精氨酸；(ddd)氨基酸位置321的精氨酸；和(eee)氨基酸位置322的赖氨酸。
5.权利要求4的改造的硫酯酶变体，其中所述的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
6.权利要求5的改造的硫酯酶变体，其中与具有SEQ ID NO:1的硫酯酶相比，所述改造的硫酯酶变体具有总体增加的净正电荷。
7.权利要求6的改造的硫酯酶变体，其中与具有SEQ ID NO:4的硫酯酶变体相比，所述改造的硫酯酶变体具有总体增加的净正电荷。
8.权利要求7的改造的硫酯酶变体，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQID NO:46。
9.权利要求6的改造的硫酯酶变体，其中与SEQ ID NO:15相比，所述改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。
10.权利要求9的改造的硫酯酶变体，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51。
11.权利要求5的改造的硫酯酶变体，其中所述改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。
12.权利要求11的改造的硫酯酶变体，其中与SEQ ID NO:49相比，所述改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。
13.权利要求12的改造的硫酯酶变体，其中所述改造的硫酯酶变体在SEQ ID NO:49的氨基酸2至40之间具有截短突变。
14.权利要求16的改造的硫酯酶变体，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
15.权利要求1的硫酯酶变体，其中所述硫酯酶变体对产生C10脂肪酸衍生物具有改善的活性。
16.一种重组宿主细胞，其包含一个或多个异源基因，所述异源基因编码将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物的生化途径，其中
所述第二脂肪酸衍生物具有比所述第一脂肪酸衍生物更高的最小抑菌浓度(MIC)，并且
其中
所述第二脂肪酸衍生物的存在增加所述第一脂肪酸衍生物的MIC。
17.权利要求16的重组宿主细胞，其中所述生化途径包括以下之一：
a.羧酸还原酶，
b.羧酸还原酶和醇脱氢酶，
c.羧酸还原酶和醇-O-乙酰基转移酶，
d.羧酸还原酶，和醇脱氢酶，以及醇O-乙酰基转移酶，
e.酯合酶，
f.酯合酶和脂肪酰基-CoA合成酶，
g.酰基-CoA还原酶，
h.酰基-CoA还原酶和酰基-CoA合成酶，
i.酰基-CoA还原酶和醇O-乙酰基转移酶，
j.酰基-CoA还原酶、醇O-乙酰基转移酶和酰基-CoA合成酶，
k.O-甲基转移酶，
l.酰基ACP还原酶，
m.酰基ACP还原酶和醛脱羰酶，
n.酰基ACP还原酶和醛氧化去甲酰酶，
o.酰基ACP还原酶和醇O-乙酰基转移酶，
p.酰基ACP还原酶、醇-O-乙酰基转移酶和醇脱氢酶，
q.OleA蛋白，
r.OleA、C和D蛋白
s.OleA蛋白和脂肪酰基-CoA合成酶，或
t.OleA、C和D蛋白和脂肪酰基-CoA合成酶。
18.权利要求17的重组宿主细胞
其中
所述第一脂肪酸衍生物是脂肪酸，和所述第二脂肪酸衍生物是脂肪酸烷基酯，并且
其中
所述生化途径包括酯合酶和脂肪酰基-CoA合成酶。
19.权利要求18的重组宿主细胞，
其中
所述脂肪酸烷基酯是脂肪酸甲酯或脂肪酸乙酯。
20.权利要求17的重组宿主细胞。
其中
所述第一脂肪酸衍生物是脂肪醇，和所述第二脂肪酸衍生物是乙酸脂肪醇，并且
其中
所述生化途径包括羧酸还原酶和醇-O-乙酰基转移酶。
21.权利要求16的重组宿主细胞，
其中
所述第一脂肪酸衍生物和所述第二脂肪酸衍生物是中链脂肪酸衍生物。
22.权利要求16的重组宿主细胞，
其中
所述重组细胞还包含改造的硫酯酶变体。
23.根据权利要求23所述的重组宿主细胞，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：具有与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性并且在选自以下的氨基酸位置上具有至少一个取代突变的氨基酸序列的硫酯酶变体：3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321和322。
24.权利要求22的重组细胞，其中所述至少一个取代突变是选自以下的成员：(a)氨基酸位置3的赖氨酸；(b)氨基酸位置4的甲硫氨酸；(c)氨基酸位置6的精氨酸；(d)氨基酸位置14的甘氨酸或精氨酸；(e)氨基酸位置15的亮氨酸或色氨酸；(f)氨基酸位置17的丙氨酸或半胱氨酸；(g)氨基酸位置22的精氨酸；(h)氨基酸位置37的脯氨酸；(i)氨基酸位置44的甘氨酸或异亮氨酸；(j)氨基酸位置45的丝氨酸；(k)氨基酸位置50的色氨酸；(l)氨基酸位置54的精氨酸；(m)氨基酸位置56的赖氨酸或半胱氨酸；(n)氨基酸位置64的精氨酸或脯氨酸；(o)氨基酸位置67的亮氨酸；(p)氨基酸位置73的缬氨酸；(q)氨基酸位置76的苯丙氨酸或亮氨酸或酪氨酸；(r)氨基酸位置91的甲硫氨酸；(s)氨基酸位置99的赖氨酸或脯氨酸；(t)氨基酸位置102的异亮氨酸；(u)氨基酸位置110的亮氨酸；(v)氨基酸位置111的苏氨酸；(w)氨基酸位置114的赖氨酸；(x)氨基酸位置129的缬氨酸；(y)氨基酸位置132的色氨酸；(z)氨基酸位置137的半胱氨酸；(aa)氨基酸位置158的谷氨酰胺；(bb)氨基酸位置162的谷氨酸；(cc)氨基酸位置176的缬氨酸；(dd)氨基酸位置178的脯氨酸；(ee)氨基酸位置185的丙氨酸；(ff)氨基酸位置186的甘氨酸；(gg)氨基酸位置196的缬氨酸；(hh)氨基酸位置197的天冬酰胺；(ii)氨基酸位置198的色氨酸；(jj)氨基酸位置203的精氨酸；(kk)氨基酸位置213的组氨酸或精氨酸；(ll)氨基酸位置217的精氨酸；(mm)氨基酸位置225的亮氨酸；(nn)氨基酸位置227的甘氨酸；(oo)氨基酸位置236的苏氨酸；(pp)氨基酸位置244的甲硫氨酸或精氨酸；(qq)氨基酸位置254的甘氨酸；(rr)氨基酸位置256的半胱氨酸或精氨酸；(ss)氨基酸位置258的苏氨酸或缬氨酸；(tt)氨基酸位置278的赖氨酸或缬氨酸；(uu)氨基酸位置282的丝氨酸或缬氨酸；(vv)氨基酸位置292的苯丙氨酸；(ww)氨基酸位置297的苏氨酸或天冬氨酸或缬氨酸；(xx)氨基酸位置298的缬氨酸或半胱氨酸；(yy)氨基酸位置299的亮氨酸；(zz)氨基酸位置300的赖氨酸或色氨酸或亮氨酸；(aaa)氨基酸位置301的半胱氨酸；(bbb)氨基酸位置302的苏氨酸；(ccc)氨基酸位置316的精氨酸；(ddd)氨基酸位置321的精氨酸；和(eee)氨基酸位置322的赖氨酸。
25.权利要求23的重组宿主细胞，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ IDNO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ IDNO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ IDNO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ IDNO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
26.权利要求24的重组宿主细胞，其中与SEQ ID NO:1相比，所述改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。
27.权利要求25的重组宿主细胞，其中与SEQ ID NO:4相比，所述改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。
28.权利要求26的重组宿主细胞，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
29.权利要求25的重组宿主细胞，其中与SEQ ID NO:15相比，所述改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。
30.权利要求28的重组宿主细胞，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51。
31.权利要求24的重组宿主细胞，其中所述改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。
32.权利要求30的重组宿主细胞，其中与SEQ ID NO:49相比，所述改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。
33.权利要求31的重组宿主细胞，其中所述改造的硫酯酶变体在SEQ ID NO:49的氨基酸2至40之间具有截短突变。
34.权利要求32的重组宿主细胞，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQID NO:58和SEQ ID NO:59。
35.一种以商业效价产生中链脂肪酸衍生物的方法，所述方法包括：在适合于产生中链脂肪酸衍生物的条件下，在碳源的存在下培养包含改造的硫酯酶变体的重组宿主细胞，
其中
所述重组宿主细胞包含一个或多个异源基因，所述异源基因编码将第一脂肪酸衍生物转化为第二脂肪酸衍生物的生化途径，并且
其中
所述第二脂肪酸衍生物具有比所述第一脂肪酸衍生物更高的最小抑菌浓度(MIC)，并且
其中
所述第二脂肪酸衍生物的存在增加所述第一脂肪酸衍生物的MIC。
36.权利要求34的方法，
其中
所述第一脂肪酸衍生物是中链脂肪酸，和所述第二脂肪酸衍生物是中链脂肪酸烷基酯，并且
其中
所述生化途径包括酯合酶和脂肪酰基-CoA合成酶。
37.权利要求35的方法，
其中
所述脂肪酸烷基酯是中链脂肪酸甲酯或中链脂肪酸乙酯。
38.权利要求35的方法，
其中
所述第一脂肪酸衍生物是中链脂肪醇，所述第二脂肪酸衍生物是中链乙酸脂肪醇，并且
其中
所述生化途径包括羧酸还原酶和醇-O-乙酰基转移酶。
39.权利要求34的方法，其中所述改造的硫酯酶变体具有与SEQ ID NO:1具有至少90％的序列同一性并且在选自以下的氨基酸位置上具有至少一个取代突变的氨基酸序列：3、4、6、14、15、17、22、37、44、45、50、54、56、64、67、73、76、91、99、102、110、111、114、129、132、137、158、162、165、176、178、185、186、196、197、198、203、213、217、225、227、236、244、254、256、258、278、282、292、297、298、299、300、301、302、316、321和322。
40.权利要求36的方法，其中所述至少一个取代突变是选自以下的成员：(a)氨基酸位置3的赖氨酸；(b)氨基酸位置4的甲硫氨酸；(c)氨基酸位置6的精氨酸；(d)氨基酸位置14的甘氨酸或精氨酸；(e)氨基酸位置15的亮氨酸或色氨酸；(f)氨基酸位置17的丙氨酸或半胱氨酸；(g)氨基酸位置22的精氨酸；(h)氨基酸位置37的脯氨酸；(i)氨基酸位置44的甘氨酸或异亮氨酸；(j)氨基酸位置45的丝氨酸；(k)氨基酸位置50的色氨酸；(l)氨基酸位置54的精氨酸；(m)氨基酸位置56的赖氨酸或半胱氨酸；(n)氨基酸位置64的精氨酸或脯氨酸；(o)氨基酸位置67的亮氨酸；(p)氨基酸位置73的缬氨酸；(q)氨基酸位置76的苯丙氨酸或亮氨酸或酪氨酸；(r)氨基酸位置91的甲硫氨酸；(s)氨基酸位置99的赖氨酸或脯氨酸；(t)氨基酸位置102的异亮氨酸；(u)氨基酸位置110的亮氨酸；(v)氨基酸位置111的苏氨酸；(w)氨基酸位置114的赖氨酸；(x)氨基酸位置129的缬氨酸；(y)氨基酸位置132的色氨酸；(z)氨基酸位置137的半胱氨酸；(aa)氨基酸位置158的谷氨酰胺；(bb)氨基酸位置162的谷氨酸；(cc)氨基酸位置176的缬氨酸；(dd)氨基酸位置178的脯氨酸；(ee)氨基酸位置185的丙氨酸；(ff)氨基酸位置186的甘氨酸；(gg)氨基酸位置196的缬氨酸；(hh)氨基酸位置197的天冬酰胺；(ii)氨基酸位置198的色氨酸；(jj)氨基酸位置203的精氨酸；(kk)氨基酸位置213的组氨酸或精氨酸；(ll)氨基酸位置217的精氨酸；(mm)氨基酸位置225的亮氨酸；(nn)氨基酸位置227的甘氨酸；(oo)氨基酸位置236的苏氨酸；(pp)氨基酸位置244的甲硫氨酸或精氨酸；(qq)氨基酸位置254的甘氨酸；(rr)氨基酸位置256的半胱氨酸或精氨酸；(ss)氨基酸位置258的苏氨酸或缬氨酸；(tt)氨基酸位置278的赖氨酸或缬氨酸；(uu)氨基酸位置282的丝氨酸或缬氨酸；(vv)氨基酸位置292的苯丙氨酸；(ww)氨基酸位置297的苏氨酸或天冬氨酸或缬氨酸；(xx)氨基酸位置298的缬氨酸或半胱氨酸；(yy)氨基酸位置299的亮氨酸；(zz)氨基酸位置300的赖氨酸或色氨酸或亮氨酸；(aaa)氨基酸位置301的半胱氨酸；(bbb)氨基酸位置302的苏氨酸；(ccc)氨基酸位置316的精氨酸；(ddd)氨基酸位置321的精氨酸；和(eee)氨基酸位置322的赖氨酸。
41.权利要求37的方法，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50、SEQID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQID NO:57、SEQ ID NO:58和SEQ ID NO:59。
42.权利要求38的方法，其中与SEQ ID NO:1相比，所述改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。
43.权利要求39的方法，其中与SEQ ID NO:4相比，所述改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。
44.权利要求40的方法，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ IDNO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ IDNO:41、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45和SEQ ID NO:46。
45.权利要求39的方法，其中与SEQ ID NO:15相比，所述改造的硫酯酶变体具有增加的正表面电荷。
46.权利要求42的方法，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:50和SEQ ID NO:51。
47.权利要求38的方法，其中所述改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。
48.权利要求44的方法，其中与SEQ ID NO:49相比，所述改造的硫酯酶变体具有改善的溶解度。
49.权利要求45的方法，其中所述改造的硫酯酶变体在SEQ ID NO:49的氨基酸2至40之间具有截短突变。
50.权利要求46的方法，其中所述改造的硫酯酶变体是选自以下的成员：SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ IDNO:58和SEQ ID NO:59。
51.一种中链脂肪酸衍生物的组合物，其中C8脂肪酸衍生物与C10脂肪酸衍生物的比率(C8/C10)为至少3.6。
52.权利要求48的组合物，其中C8脂肪酸衍生物与C10脂肪酸衍生物的比率为7.7。
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