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JP6837089B2 - 改善されたアセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ変種 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本願は、2013年9月13日に出願された米国特許仮出願第61/877,418号および2013年10月17日に出願された米国特許仮出願第61/892,242号の恩典を主張する。これらの全開示が参照により本明細書に組み入れられる。
配列表
本願は、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を収録している。ASCIIコピーは2014年9月12日に作成され、LS00050PCT_SL.txtと命名され、サイズが128,259バイトである。
分野
本開示は、脂肪酸誘導体を含むマロニル-CoA由来化合物を産生するためのアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)変種に関する。ACC変種を発現する宿主細胞および関連する細胞培養物がさらに意図される。ACC変種を発現する宿主細胞を用いることによってマロニル-CoA由来化合物を産生する方法も含まれる。
背景
石油は、液体、気体、または固体の形で地中に見られる限られた天然資源である。しかしながら、石油製品は経済的および環境的にかなりのコストをかけて開発される。地中から取り出された原油は天然の形では商業的用途がほとんどない。原油は、様々な長さおよび複雑さの炭化水素、例えば、パラフィン(またはアルカン)、オレフィン(またはアルケン)、アルキン、ナプテン(napthene)(またはシルコアルカン(cylcoalkane))、脂肪族化合物、芳香族化合物などの混合物である。さらに、原油は他の有機化合物(例えば、窒素、酸素、硫黄などを含有する有機化合物)および不純物(例えば、硫黄、塩、酸、金属など)を含有する。ほとんどの石油はエネルギー密度が高く、輸送が容易なために燃料、例えば、交通燃料(例えば、ガソリン、ディーゼル、航空燃料など)、暖房用オイル、液化石油ガスなどに精製される。
石油化学製品を用いて、プラスチック、樹脂、繊維、エラストマー、薬、潤滑剤、またはゲルなどの特殊化学薬品を作ることができる。特殊化学薬品には多くの商業用途がある。石油化学原材料から生産することができる特殊化学薬品の例には、脂肪酸、炭化水素(例えば、長鎖炭化水素、分枝鎖炭化水素、飽和炭化水素、不飽和炭化水素など)、脂肪アルコール、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、ケトン、潤滑剤などが含まれる。脂肪酸は界面活性剤として商業的に使用される。界面活性剤は、例えば洗剤およびセッケンの中に見られる。脂肪酸はまた、燃料、潤滑油、塗料、ラッカー、ろうそく、ショートニング、化粧品、および乳化剤の中の添加物として使用することもできる。さらに、脂肪酸はゴム製品の中の促進活性剤として使用される。脂肪酸はまた、メチルエステル、アミド、アミン、酸塩化物、無水物、ケテン二量体、ペルオキシ酸、およびエステルを生産するための供給材料として使用することもできる。
脂肪エステルには多くの商業用途がある。例えば、代替燃料であるバイオディーゼルはエステル(例えば、脂肪酸メチルエステル（FAME）、脂肪酸エチルエステル（FAEE）など)からなる。一部の低分子量エステルは揮発性であり、芳香剤または着香剤として役立つ芳香がある。さらに、エステルはラッカー、塗料、およびワニス用の溶媒として用いられる。さらに、ワックス、脂肪、および油などの一部の天然物質はエステルからなる。エステルはまた樹脂およびプラスチックの中の柔軟剤、ガソリンおよび油の中の可塑剤、難燃剤、および添加物としても用いられる。さらに、エステルは、重合体、フィルム、布、色素、および薬の製造において使用することができる。
同様に、脂肪アルコールには非常に多くの商業用途がある。例えば、脂肪アルコールおよびその誘導体の全世界における年間売上高は10億米ドルを超える。短鎖脂肪アルコールは化粧品業界および食品業界において乳化剤、軟化剤、および増粘剤として用いられる。脂肪アルコールには両親媒性があるため、パーソナルケア製品および家庭用製品、例えば、洗剤において有用な非イオン界面活性剤として働く。さらに、脂肪アルコールは、ワックス、ゴム、樹脂、薬学的ローション、潤滑油添加剤、布用帯電防止剤および仕上げ剤、可塑剤、化粧品、工業溶剤、ならびに脂肪用溶剤において用いられる。
アセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC)は脂肪酸合成および分解の調節において重要な役割を果たしている。ACCは、最初に関与する脂肪酸生合成段階、すなわち、アセチル-CoAからマロニル-CoAへの不可逆的なカルボキシル化を触媒するビオチン依存性酵素複合体である。ACCは、その2つの触媒活性、すなわち、ビオチンカルボキシラーゼ(BC)およびカルボキシルトランスフェラーゼ(CT)を介してマロニル-CoAを生成する。ほとんどの原核生物において、ACCは、4つのポリペプチド(サブユニット)を含むマルチサブユニット酵素である。これらのポリペプチドは別々の遺伝子によってコードされ、その協調発現は複数の調節段階によって制御される(Cronan et al. (2002) Progress in Lipid Research 41:407-435（非特許文献1）; James et al. (2004) Journal of Biological Chemistry 279(4):2520-2527（非特許文献2）)。ACCの4つのポリペプチドは、ある決まった比で集合して複合体を構築する(Broussard et al. (2013) Structure 21:650-657（非特許文献3）)。さらに具体的には、ACC反応には、4つのタンパク質、すなわち、ビオチンカルボキシラーゼ(BC)、ビオチノイル(またはビオチン)カルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)、およびカルボキシルトランスフェラーゼ(CT)を形成する2つのタンパク質が必要とされる。全ACC反応は、酸不安定性NaH14CO3から耐酸性マロン酸へのATP依存的変換によってアッセイすることができる。細菌ACCサブユニットと植物プラスチドACCサブユニットとの間には類似点と相違点がある。だが植物タンパク質の複雑さにもかかわらず、ACC活性に必須な配列は細菌ホモログと有意な差はない(Cronan et al., 前記（非特許文献1）)。
大腸菌(E.coli)ACCは公知のACC酵素の中で最も不安定であると報告されている。全活性は、4つ全てのサブユニットが高濃度で存在する時だけ測定することができるが、薄いタンパク質溶液中では2つの部分的な反応を測定することができる。安定な複合体はBC複合体およびCTα2β2複合体であると考えられている。完全長BCCPは二量体として精製されており、不安定なBC2-BCCP2複合体の存在を示すヒントがある。他の細菌ACCは大腸菌ACCより安定性が高いように見られ、ヘリコバクター・ピロリ(Helicobacter pylori)およびシュードモナス・シトロネロリス(Pseudomonas citronellolis)の薄い抽出液中ではACC活性を測定することができる。さらに、植物プラスチドACCは大腸菌ACCより安定性が高いように見られる。しかしながら、大腸菌では、インタクトな酵素をさらに精製すると、部分的な反応活性を含む画分を混合することによって回復可能なACC活性が解離および消失する。部分複合体はBC-BCCPおよびCTであり、インタクトな遊離BCCPの証拠も遊離CTβの証拠も無い。このことは、BCCPおよびCTβは溶液中で遊離している時には分解されることを示唆している(Cronan et al., 前記（非特許文献1）)。
accA、accB、accC、およびaccDを含む大腸菌acc遺伝子が特定されたことでACCタンパク質の研究が容易になった。ACCサブユニットBCCPをコードするaccB遺伝子およびCTβをコードするaccD遺伝子を含む脂肪酸合成変異体を単離するために放射線自殺選択(radiation suicide selection)が用いられている。accB変異体の方が広く研究されており、変異G133Sが温度感受性増殖を担っている。この変異はビオチノイルドメイン内での立体衝突をもたらす。この結果として生じた変異タンパク質は高温で容易に変性され、従って、細胞内プロテアーゼ感受性である。変異BCCP株は30℃で増殖された時にBCCP正常レベルの約25パーセントしかないが、増殖および脂肪酸合成の速度は正常である(Cronan et al., 前記（非特許文献1）)。しかしながら、4つ全てのACCタンパク質の濃度を上げることによって、脂肪酸生合成を通る流れをある程度まで改善できることが知られている(Davis et al. (2000) Journal of Biological Chemistry 275(37):28593-28598（非特許文献4）)。反対に、ACPアシル化誘導体で大腸菌ACCを阻害できるが、アシル部分が無いACPではACCを阻害できないことが分かっている(Davies et al. (2001) Journal of Bacteriology 183(4): 1499-1503（非特許文献5）)。
現在、石油から得られている燃料および製品を作り出す代替経路が必要とされている。従って、微生物系は非常に多くのタイプのバイオ燃料および化学薬品を生物生産する可能性を持っている。遺伝子操作された生物(例えば、細菌、酵母、および藻類)から再生可能な燃料および化学薬品を得ることができる。操作された生物が再生可能な燃料および化学製品を合成できるように、天然生合成経路を遺伝学的に変えることができる。さらに、燃料および化学製品を産生するための供給材料として様々な炭素源を利用するように微生物を合わせる、または代謝操作することができる。従って、組換え宿主細胞内で発現された時に高収率のマロニル由来化合物（例えば、脂肪エステル、脂肪アルコール、および他の脂肪酸誘導体、ならびに非脂肪酸化合物）を産生するようにACCを操作することが望ましいであろう。
この分野における進歩にもかかわらず、組換え宿主細胞の発酵を通して燃料および化学薬品を活発に、かつ費用対効果が高く生産するために、遺伝子組換えされた酵素、組換え宿主細胞、方法、および系の改善が依然として必要とされている。本開示は、マロニル由来化合物の収率および力価を増やすACC変種を提供することによって、このニーズに応える。
Cronan et al. (2002) Progress in Lipid Research 41:407-435 James et al. (2004) Journal of Biological Chemistry 279(4):2520-2527 Broussard et al. (2013) Structure 21:650-657 Davis et al. (2000) Journal of Biological Chemistry 275(37):28593-28598 Davies et al. (2001) Journal of Bacteriology 183(4): 1499-1503
概要
本開示の1つの局面は、アミノ酸配列中に少なくとも1つの変異を有する変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)を提供する。特定の1つの局面において、本開示は、アミノ酸配列中に少なくとも1つの変異を含み、SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90を含む以下の配列識別番号のいずれか1つまたは複数からのポリペプチド配列を有する変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)を提供する。1つの態様において、変種BCCPは、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加を細胞に付与する。別の態様において、変種BCCPは、細胞内で発現された時に、改善されたアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)活性を付与し、その結果として、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらし得る。マロニル-CoA由来化合物には、脂肪酸誘導体、例えば、遊離脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体(例えば、ω-ヒドロキシ脂肪酸、ω-ヒドロキシジオール、ω-ヒドロキシFAME、ω-ヒドロキシFAEE)、不飽和脂肪酸誘導体、ならびに、脂肪酸をベースとしない化合物、例えば、フラバノンおよび/またはフラボノイド、ポリケチド、ならびに3-ヒドロキシプロピオン酸が含まれるが、これに限定されない。
本開示の別の局面は、アミノ酸配列中に少なくとも1つの変異を有し、変異がN末端アミノ酸領域にある変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)を提供する。1つの態様において、変異はSEQ ID NO:2のアミノ酸位置2にある。別の態様において、変種BCCPは、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加を細胞に付与する。別の態様において、変種BCCPは、細胞内で発現された時に、改善されたアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)活性を付与し、その結果として、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらし得る。
本開示の別の局面は、アミノ酸配列中に少なくとも1つの変異を有し、SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および/または90より選択される変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)を提供する。1つの態様において、変種BCCPは、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加を細胞に付与する。別の態様において、変種BCCPは、細胞内で発現された時に、改善されたアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)活性を付与し、その結果として、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらし得る。
本開示のさらに別の局面は、変種accB遺伝子またはaccB核酸配列によってコードされる変種BCCPであって、前記核酸配列がSEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、および/または89より選択される、変種BCCPを提供する。
本開示の別の局面は、アミノ酸配列中に少なくとも1つの変異を有する変種BCCPを発現する組換え細胞または組換え微生物を提供する。1つの態様において、前記細胞は宿主細胞である。別の態様において、前記細胞は微生物細胞または微生物宿主細胞である。別の態様において、前記微生物は、微生物細胞または微生物宿主細胞または微生物である。1つの態様において、変異はN末端アミノ酸領域にある。別の態様において、変異はSEQ ID NO:2のアミノ酸位置2にある。別の態様において、変異は置換である。様々な態様において、置換は、アスパラギン酸(D)→アスパラギン(N);またはアスパラギン酸(D)→ヒスチジン(H);またはアスパラギン酸(D)→イソロイシン(I);またはアスパラギン酸(D)→スレオニン(T);またはアスパラギン酸(D)→セリン(S);またはアスパラギン酸(D)→チロシン(Y);またはアスパラギン酸(D)→アルギニン(R);またはアスパラギン酸(D)→ロイシン(L);またはアスパラギン酸(D)→グルタミン(Q);またはアスパラギン酸(D)→グルタミン酸(G)である。別の態様において、変種BCCPは、アスパラギン酸(D)→アスパラギン(N)の置換を含む変異を有するポリペプチドを含むSEQ ID NO:6を有する。別の態様において、変種BCCPは、アスパラギン酸 (D)→ヒスチジン (H)の置換を含む変異を有するポリペプチドを含むSEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:8を有する。別の態様において、変種BCCPは、アスパラギン酸(D)→イソロイシン(I)の置換を含む変異を有するポリペプチドを含むSEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:12を有する。1つの態様において、変種BCCPはアミノ酸配列中に少なくとも1つの変異を有し、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加を組換え細胞に付与する。別の態様において、変種BCCPはアミノ酸配列中に少なくとも1つの変異を有し、改善されたアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)活性を組換え細胞に付与し、その結果として、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらし得る。別の態様において、前記細胞は、野生型微生物と対比もしくは比較することができる組換え微生物または野生型宿主細胞と対比もしくは比較することができる組換え宿主細胞である。別の態様において、前記細胞は自然界にある微生物細胞である。
本開示のさらに別の局面は、炭素源を含有する発酵ブロス中で、変種BCCPを発現する細胞を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法を提供する。マロニル-CoA由来化合物には、脂肪酸誘導体、例えば、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体(例えば、ω-ヒドロキシ脂肪酸、ω-ヒドロキシジオール、ω-ヒドロキシFAME、ω-ヒドロキシFAEE)、不飽和脂肪酸誘導体、ならびに脂肪酸をベースとしない化合物、例えば、フラバノンおよび/またはフラボノイド、ポリケチド、ならびに3-ヒドロキシプロピオン酸が含まれる。1つの態様において、前記細胞は、野生型微生物と対比もしくは比較することができる組換え微生物または野生型宿主細胞と対比もしくは比較することができる組換え宿主細胞である。別の態様において、前記細胞は自然界にある微生物細胞である。
本開示は、BCCPの発現を制御する変種オペロンをさらに意図する。1つの態様において、前記オペロンは、野生型細胞と比較した組換え細胞におけるBCCP発現の変化をもたらす。1つの態様において、前記細胞は、野生型微生物宿主細胞または野生型微生物とそれぞれ比較した、組換え微生物宿主細胞または組換え微生物である。別の態様において、前記オペロンは組換え細胞においてBCCP発現の増加をもたらし、それによって、組換え細胞におけるアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)活性を改善し、その結果として、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらす。1つの局面において、変種オペロンはプロモーターをさらに含む。プロモーターには、異種プロモーター、異種プロモーター変種、および合成プロモーターが含まれるが、これに限定されない。1つの態様において、プロモーターには、遺伝子組換えされたaccBCプロモーター、天然の大腸菌プロモーター、および大腸菌プロモーター変種が含まれる。別の態様において、プロモーターはaccBCプロモーター変種である。別の態様において、プロモーターはT5プロモーターまたはT5プロモーター変種である。1つの態様において、プロモーターはaccBC T5プロモーターである。別の態様において、accBC T5プロモーターは、SEQ ID NO:93、94、95、もしくは96またはそのバリエーションより選択される。
さらに、本開示は、BCCPの発現を制御する変種オペロンを含む組換え微生物または宿主細胞を提供する。1つの態様において、前記オペロンはBCCP発現の変化をもたらす。1つの態様において、前記オペロンは組換え細胞においてBCCP発現の増加をもたらし、それによって、組換え細胞におけるアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)活性を改善し、その結果として、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらす。別の態様において、変種オペロンはプロモーターをさらに含む。
本開示の別の局面は、炭素源を含有する発酵ブロス中で、変種オペロンを発現する微生物または宿主細胞を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法を提供する。1つの態様において、前記細胞は、野生型微生物と対比もしくは比較することができる組換え微生物または野生型宿主細胞と対比もしくは比較することができる組換え宿主細胞である。別の態様において、前記細胞は自然界にある微生物細胞である。マロニル-CoA由来化合物には、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体(例えば、ω-ヒドロキシ脂肪酸、ω-ヒドロキシジオール、ω-ヒドロキシFAME、ω-ヒドロキシFAEE)、不飽和脂肪酸誘導体、ならびに脂肪酸をベースとしない化合物、例えば、フラバノンおよび/またはフラボノイド、ポリケチド、ならびに3-ヒドロキシプロピオン酸が含まれる。
本開示のさらに別の局面は、炭素源を含有する発酵ブロス中で、変種BCCPおよび変種オペロンを発現する宿主細胞を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法を提供する。1つの態様において、前記細胞は、野生型微生物と対比もしくは比較することができる組換え微生物または野生型宿主細胞と対比もしくは比較することができる組換え宿主細胞である。別の態様において、前記細胞は自然界にある微生物細胞である。マロニル-CoA由来化合物には、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体(ω-ヒドロキシ脂肪酸、ω-ヒドロキシジオール、ω-ヒドロキシFAME、ω-ヒドロキシFAEEを含む)、不飽和脂肪酸誘導体、ならびに脂肪酸をベースとしない化合物、例えば、フラバノンおよび/またはフラボノイド、ポリケチド、ならびに3-ヒドロキシプロピオン酸が含まれる。
本開示は、アミノ酸配列中に少なくとも1つの変異を有する変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)を含む微生物をさらに意図する。1つの態様において、変種BCCPのN末端アミノ酸領域に変異がある。別の態様において、変異は置換である。様々な態様において、置換は、アスパラギン酸(D)→アスパラギン(N);またはアスパラギン酸(D)→ヒスチジン(H);またはアスパラギン酸(D)→イソロイシン(I);またはアスパラギン酸(D)→スレオニン(T);またはアスパラギン酸(D)→セリン(S);またはアスパラギン酸(D)→チロシン(Y);またはアスパラギン酸(D)→アルギニン(R);またはアスパラギン酸(D)→ロイシン(L);またはアスパラギン酸(D)→グルタミン(Q);またはアスパラギン酸(D)→グルタミン酸(G)である。別の態様において、変種BCCPは、アスパラギン酸(D)→アスパラギン(N);アスパラギン酸(D)→ヒスチジン(H);アスパラギン酸(D)→イソロイシン(I);アスパラギン酸(D)→スレオニン(T);アスパラギン酸(D)→セリン(S);アスパラギン酸(D)→チロシン(Y);アスパラギン酸(D)→アルギニン(R);アスパラギン酸(D)→ロイシン(L);アスパラギン酸(D)→グルタミン(Q);および/またはアスパラギン酸(D)→グルタミン酸(G)の置換を含む1つまたは複数の変異を有する。別の態様において、変種BCCPは、アスパラギン酸(D)→アスパラギン(N)の置換を含む変異を有するポリペプチドを含むSEQ ID NO:6を有する。別の態様において、変種BCCPは、アスパラギン酸(D)→ヒスチジン(H)の置換を含む変異を有するポリペプチドを含むSEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:8を有する。別の態様において、変種BCCPは、アスパラギン酸(D)→イソロイシン(I)の置換を含む変異を有するポリペプチドを含むSEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:12を有する。別の態様において、変種BCCPの発現はマロニル-CoA由来化合物産生の増加を微生物に付与する。別の態様において、変種BCCPの発現は、改善されたアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)活性を微生物において付与し、その結果として、微生物によるマロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらし得る。マロニル-CoA由来化合物には、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、不飽和脂肪酸誘導体、フラバノン、フラボノイド、ポリケチド、および3-ヒドロキシプロピオン酸が含まれるが、これに限定されない。1つの態様において、マロニル-CoA由来化合物はFAMEまたはFAEEである。別の態様において、マロニル-CoA由来化合物は脂肪アルコールである。別の態様において、微生物は微生物細胞である。さらに別の態様において、微生物細胞は組換え細胞である。微生物細胞の例には、エシェリキア属(Escherichia)、バチルス属(Bacillus)、シアノフィータ属(Cyanophyta)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ザイモモナス属(Zymomonas)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ニューロスポラ属(Neurospora)、フザリウム属(Fusarium)、フミコラ属(Humicola)、リゾムコール属(Rhizomucor)、クリベロミセス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、ムコール属(Mucor)、ミセリオフトラ属(Myceliophtora)、ペニシリウム属(Penicillium)、ファネロカエテ属(Phanerochaete)、ヒラタケ属(Pleurotus)、ホウロクタケ属(Trametes)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ステノトロフォモナス属(Stenotrophamonas)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、およびストレプトミセス属(Streptomyces)に由来する細胞が含まれるが、これに限定されない。1つの態様において、微生物細胞はエシェリキア属に由来する。1つの態様において、微生物細胞は大腸菌に由来する。別の態様において、微生物細胞はシアノバクテリアまたはシアノフィータ属に由来する。別の態様において、微生物細胞は、プロクロロコッカス属(Prochlorococcus)、シネココッカス属(Synechococcus)、シネコシスティス属(Synechocystis)、シアノセイス属(Cyanothece)、およびノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)を含むが、これに限定されない、シアノバクテリアまたはシアノフィータ属に由来する。別の態様において、微生物細胞は、シネココッカス・エロンガタス(Synechococcus elongatus)PCC7942、シネコシスティス属種PCC6803、およびシネココッカス属種PCC7001を含むが、これに限定されない特定のシアノバクテリア種に由来する。
本開示の別の局面は、accBもしくはaccCまたはその組み合わせを含む核酸配列の発現の変化を有する組換え微生物であって、それによって微生物によるマロニル-CoA由来化合物産生の変化をもたらす、組換え微生物を提供する。1つの態様において、発現の変化は発現の増加である。別の態様において、発現の変化は発現の減少である。さらに別の態様において、発現の変化は、核酸配列を発現させる1つまたは複数のプロモーターの変化によるものである。accBの核酸配列はBCCPをコードする。1つの態様において、accBの変種核酸配列は変種BCCPをコードする。1つの態様において、マロニル-CoA由来化合物には、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、不飽和脂肪酸誘導体、フラバノン、フラボノイド、ポリケチド、および3-ヒドロキシプロピオン酸が含まれるが、これに限定されない。1つの態様において、微生物には、エシェリキア属、バチルス属、シアノフィータ属、ラクトバチルス属、ザイモモナス属、ロドコッカス属、シュードモナス属、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フザリウム属、フミコラ属、リゾムコール属、クリベロミセス属、ピキア属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ペニシリウム属、ファネロカエテ属、ヒラタケ属、ホウロクタケ属、クリソスポリウム属、サッカロミセス属、ステノトロフォモナス属、シゾサッカロミセス属、ヤロウイア属、またはストレプトミセス属に由来する微生物が含まれるが、これに限定されない。1つの態様において、微生物細胞はエシェリキア属に由来する。1つの態様において、微生物細胞は大腸菌に由来する。別の態様において、微生物細胞はシアノバクテリアまたはシアノフィータ属に由来する。さらに別の態様では、微生物は、シアノバクテリアまたはシアノフィータ属、プロクロロコッカス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、シアノセイス属、またはノストック・パンクチフォルメに由来する。1つの態様において、微生物は、シネココッカス・エロンガタスPCC7942、シネコシスティス属種PCC6803、またはシネココッカス属種PCC7001からのシアノバクテリア種である。
本開示の別の局面は、ACC変種の発現の変化を有し、脂肪酸生合成タンパク質をさらに発現する微生物または宿主細胞を提供する。1つの態様において、宿主細胞は微生物細胞である。別の態様において、宿主細胞は組換え細胞である。さらに別の態様において、宿主細胞は組換え細菌細胞である。別の態様において、ACC変種は、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)もしくはビオチンカルボキシラーゼ(BC)またはその組み合わせである。1つの態様において、発現の変化は発現の増加または減少である、1つの態様において、発現の変化は発現の増加であり、発現の増加は、微生物細胞が炭素源と共に培養された時にマロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらす。
本開示のある特定の態様において、宿主細胞は、脂肪酸誘導体産生を増やすことができる酵素活性を有する生合成タンパク質をさらに発現してもよい。1つの態様において、酵素活性を有するタンパク質は宿主細胞に元から存在してもよく、その遺伝子がプロモーターまたは他の遺伝子変化を介して過剰発現されてもよい。別の態様において、酵素活性を有するタンパク質は、宿主細胞内で発現された外因性または異種の遺伝子の結果でもよい。このような酵素活性の例には、チオエステラーゼ活性(E.C.3.1.2.*またはE.C.3.1.2.14またはE.C.3.1.1.5)、エステルシンターゼ活性(E.C.2.3.1.75)、アシル-ACPレダクターゼ(AAR)活性(E.C.1.2.1.80)、アルコールデヒドロゲナーゼ活性(E.C.1.1.1.1.)、脂肪アルコールアシル-CoAレダクターゼ(FAR)活性(E.C.1.1.1.*)、カルボン酸レダクターゼ(CAR)活性(EC1.2.99.6)、デカルボニラーゼ(decarbonylase)またはデホルミラーゼ活性、アシル-CoAレダクターゼ活性(E.C.1.2.1.50)、アシル-CoAシンターゼ(FadD)活性(E.C.2.3.1.86)、OleA活性、およびOleBCD活性が含まれるが、これに限定されない。
さらに別の局面において、本開示は、ACC変種の発現の変化を有し、脂肪酸生合成タンパク質をさらに発現する微生物または宿主細胞であって、細胞が炭素源と共に培養された時に、発現の変化がマロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらす発現の増加である、微生物または宿主細胞を提供する。1つの態様において、宿主細胞は微生物細胞である。別の態様において、宿主細胞は組換え細胞である。さらに別の態様において、宿主細胞は組換え細菌細胞である。さらに別の態様では、微生物または宿主細胞は、同じ条件下で野生型細胞と比較または対比することができる組換え細胞である。本明細書において、マロニル-CoA由来化合物には、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、不飽和脂肪酸誘導体、フラバノン、フラボノイド、ポリケチド、および3-ヒドロキシプロピオン酸が含まれるが、これに限定されない。1つの態様において、微生物細胞は、エシェリキア属、バチルス属、シアノフィータ属、ラクトバチルス属、ザイモモナス属、ロドコッカス属、シュードモナス属、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フザリウム属、フミコラ属、リゾムコール属、クリベロミセス属、ピキア属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ペニシリウム属、ファネロカエテ属、ヒラタケ属、ホウロクタケ属、クリソスポリウム属、サッカロミセス属、ステノトロフォモナス属、シゾサッカロミセス属、ヤロウイア属、またはストレプトミセス属の細胞より選択される。
本開示の別の局面は、SEQ ID NO:6を有する変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)を提供する。1つの態様において、変異は、アスパラギン酸(D)からアスパラギン(N)への置換があるN末端アミノ酸領域にあり、置換はアミノ酸位置2にある。別の態様において、変種BCCPは変種accB遺伝子によってコードされ、変種accB遺伝子はSEQ ID NO:5の核酸配列を有する。本開示の別の局面は、SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:8を有する変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)を提供する。1つの態様において、変異は、アスパラギン酸(D)からヒスチジン(H)への置換があるN末端アミノ酸領域にあり、置換はアミノ酸位置2にある。別の態様において、変種BCCPは変種accB遺伝子によってコードされ、変種accB遺伝子は、それぞれ、SEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:7の核酸配列を有する。本開示の別の局面は、SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:12を有する変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)を提供する。1つの態様において、変異は、アスパラギン酸(D)からイソロイシン(I)への置換があるN末端アミノ酸領域にあり、置換はアミノ酸位置2にある。別の態様において、変種BCCPは変種accB遺伝子によってコードされ、変種accB遺伝子は、それぞれ、SEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:11の核酸配列を有する。
様々な態様において、変種BCCPは、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加を組換え細胞に付与し、前記マロニル-CoA由来化合物には、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体の脂肪酸誘導体;または非脂肪酸化合物、例えば、フラバノン、フラボノイド、ポリケチド、および3-ヒドロキシプロピオン酸が含まれる。さらに、本開示は、変種BCCPを含むか、または変種BCCPを発現する組換え微生物を含む。1つの態様において、微生物は、エシェリキア属、バチルス属、シアノフィータ属、ラクトバチルス属、ザイモモナス属、ロドコッカス属、シュードモナス属、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フザリウム属、フミコラ属、リゾムコール属、クリベロミセス属、ピキア属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ペニシリウム属、ファネロカエテ属、ヒラタケ属、ホウロクタケ属、クリソスポリウム属、サッカロミセス属、ステノトロフォモナス属、シゾサッカロミセス属、ヤロウイア属、またはストレプトミセス属の微生物より選択される。
炭素源を含有する発酵ブロス中で、変種BCCPを発現する組換え微生物を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法がさらに意図される。この方法によって産生されるマロニル由来化合物には、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体;または非脂肪酸化合物、例えば、フラバノン、フラボノイド、ポリケチド、および3-ヒドロキシプロピオン酸が含まれる。
[本発明1001]
アミノ酸配列中に少なくとも1つの変異を含み、SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)であって、該変種BCCPの発現が、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加を組換え細胞に付与する、変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)。
[本発明1002]
変異がN末端アミノ酸領域にある、本発明1001の変種BCCP。
[本発明1003]
変異がSEQ ID NO:2のアミノ酸位置2にある、本発明1002の変種BCCP。
[本発明1004]
SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:6を含む、本発明1001の変種BCCP。
[本発明1005]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、本発明1001の変種BCCP。
[本発明1006]
マロニル-CoA由来化合物がFAMEである、本発明1004の変種BCCP。
[本発明1007]
変種accB遺伝子によってコードされる、本発明1001の変種BCCP。
[本発明1008]
変種accB遺伝子が、SEQ ID NO:3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、42、43、45、47、49、50、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、および89からなる群より選択される核酸配列を含む、本発明1007の変種accB遺伝子。
[本発明1009]
本発明1001〜1008のいずれかの変種BCCPを含む、組換え微生物。
[本発明1010]
炭素源を含有する発酵ブロス中で本発明1009の組換え微生物を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法。
[本発明1011]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、本発明1010の方法。
[本発明1012]
マロニル-CoA由来化合物がFAMEである、本発明1011の方法。
[本発明1013]
野生型微生物細胞と比較した組換え微生物細胞におけるBCCP発現の変化をもたらす、BCCPの発現を制御する変種オペロン。
[本発明1014]
対応する野生型微生物細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の改善を組換え微生物細胞に付与する、本発明1013の変種オペロン。
[本発明1015]
異種プロモーター、異種プロモーター変種、合成プロモーター、遺伝子組換えされたaccBCプロモーター、天然の大腸菌(E.coli)プロモーター、および大腸菌プロモーター変種からなる群より選択されるプロモーターをさらに含む、本発明1014の変種オペロン。
[本発明1016]
遺伝子組換えされたaccBCプロモーターがaccBCプロモーター変種である、本発明1015の変種オペロン。
[本発明1017]
異種プロモーターがT5プロモーターまたはT5プロモーター変種である、本発明1015の変種オペロン。
[本発明1018]
T5プロモーター変種が、SEQ ID NO:93、94、95、および96のいずれか1つより選択される、本発明1017の変種オペロン。
[本発明1019]
本発明1013〜1018のいずれかの変種オペロンを含む、組換え微生物。
[本発明1020]
炭素源を含有する発酵ブロス中で本発明1019の組換え微生物を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法。
[本発明1021]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、本発明1020の方法。
[本発明1022]
マロニル-CoA由来化合物がFAMEである、本発明1021の方法。
[本発明1023]
炭素源を含有する発酵ブロス中で、本発明1001の変種BCCPおよび本発明1013の変種オペロンを含む組換え微生物を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法。
[本発明1024]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、本発明1023の方法。
[本発明1025]
マロニル-CoA由来化合物がFAMEである、本発明1024の方法。
[本発明1026]
アミノ酸配列中に少なくとも1つの変異を含む変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)を含む組換え微生物であって、該変種BCCPの発現が、マロニル-CoA由来化合物産生の増加を該組換え微生物に付与し、該変種BCCPがN末端アミノ酸領域に変異を有する、組換え微生物。
[本発明1027]
変種BCCPがSEQ ID NO:6を含む、本発明1026の組換え微生物。
[本発明1028]
変種BCCPがSEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:8を含む、本発明1026の組換え微生物。
[本発明1029]
変種BCCPがSEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:12を含む、本発明1026の組換え微生物。
[本発明1030]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体からなる群より選択される、本発明1026の組換え微生物。
[本発明1031]
マロニル-CoA由来化合物がFAMEである、本発明1030の組換え微生物。
[本発明1032]
組換え微生物細胞である、本発明1030の組換え微生物。
[本発明1033]
組換え微生物細胞が、エシェリキア属(Escherichia)、バチルス属(Bacillus)、シアノフィータ属(Cyanophyta)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ザイモモナス属(Zymomonas)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、アスペルギルス属(Aspergillus)、トリコデルマ属(Trichoderma)、ニューロスポラ属(Neurospora)、フザリウム属(Fusarium)、フミコラ属(Humicola)、リゾムコール属(Rhizomucor)、クリベロミセス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、ムコール属(Mucor)、ミセリオフトラ属(Myceliophtora)、ペニシリウム属(Penicillium)、ファネロカエテ属(Phanerochaete)、ヒラタケ属(Pleurotus)、ホウロクタケ属(Trametes)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、ステノトロフォモナス属(Stenotrophamonas)、シゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、ヤロウイア属(Yarrowia)、およびストレプトミセス属(Streptomyces)からなる群より選択される、本発明1032の組換え微生物。
[本発明1034]
エシェリキア属が大腸菌である、本発明1033の組換え微生物。
[本発明1035]
シアノフィータ属が、プロクロロコッカス属(Prochlorococcus)、シネココッカス属(Synechococcus)、シネコシスティス属(Synechocystis)、シアノセイス属(Cyanothece)、およびノストック・パンクチフォルメ(Nostoc punctiforme)からなる群より選択される、本発明1033の組換え微生物。
[本発明1036]
シアノフィータ属が、シネココッカス・エロンガタス(Synechococcus elongatus)PCC7942、シネコシスティス属種PCC6803、およびシネココッカス属種PCC7001からなる群より選択される、本発明1035の組換え微生物。
[本発明1037]
accBもしくはaccCまたはその組み合わせを含む核酸配列の発現の変化を含む、組換え微生物。
[本発明1038]
発現の変化が発現の増加または減少である、本発明1037の組換え微生物。
[本発明1039]
微生物が炭素源と共に培養された時に、発現の増加がマロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらす、本発明1038の組換え微生物。
[本発明1040]
発現の変化が、前記核酸配列の発現を駆動する1つまたは複数のプロモーターの変化によるものである、本発明1037の組換え微生物。
[本発明1041]
前記核酸配列が、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)もしくはビオチンカルボキシラーゼ(BC)またはその組み合わせをコードする、本発明1037の組換え微生物。
[本発明1042]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体からなる群より選択される、本発明1037の組換え微生物。
[本発明1043]
エシェリキア属、バチルス属、シアノフィータ属、ラクトバチルス属、ザイモモナス属、ロドコッカス属、シュードモナス属、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フザリウム属、フミコラ属、リゾムコール属、クリベロミセス属、ピキア属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ペニシリウム属、ファネロカエテ属、ヒラタケ属、ホウロクタケ属、クリソスポリウム属、サッカロミセス属、ステノトロフォモナス属、シゾサッカロミセス属、ヤロウイア属、およびストレプトミセス属からなる群より選択される、本発明1037の組換え微生物。
[本発明1044]
エシェリキア属が大腸菌である、本発明1043の微生物。
[本発明1045]
シアノフィータ属が、プロクロロコッカス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、シアノセイス属、およびノストック・パンクチフォルメからなる群より選択される、本発明1043の微生物。
[本発明1046]
シアノフィータ属が、シネココッカス・エロンガタスPCC7942、シネコシスティス属種PCC6803、およびシネココッカス属種PCC7001からなる群より選択される、本発明1045の微生物。
[本発明1047]
炭素源を含有する発酵ブロス中で本発明1037の微生物を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法。
[本発明1048]
(i)ACC変種の発現の変化;および
(ii)脂肪酸生合成タンパク質
を含む、組換え微生物細胞。
[本発明1049]
ACC変種が、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)もしくはビオチンカルボキシラーゼ(BC)またはその組み合わせである、本発明1048の組換え微生物細胞。
[本発明1050]
脂肪酸生合成タンパク質が、チオエステラーゼ活性(E.C.3.1.2.*またはE.C.3.1.2.14またはE.C.3.1.1.5)、エステルシンターゼ活性(E.C.2.3.1.75)、アシル-ACPレダクターゼ(AAR)(E.C.1.2.1.80)活性、アルコールデヒドロゲナーゼ活性(E.C.1.1.1.1.)、脂肪アルコールアシル-CoAレダクターゼ(FAR)(E.C.1.1.1.*)活性、カルボン酸レダクターゼ(CAR)(EC1.2.99.6)活性、デカルボニラーゼまたはデホルミラーゼ活性、アシル-CoAレダクターゼ(E.C.1.2.1.50)活性、アシル-CoAシンターゼ(FadD)(E.C.2.3.1.86)活性、OleA活性、およびOleBCD活性からなる群より選択される酵素活性を有する、本発明1048の組換え微生物細胞。
[本発明1051]
発現の変化が発現の増加または減少である、本発明1048の組換え微生物細胞。
[本発明1052]
微生物細胞が炭素源と共に培養された時に、発現の増加がマロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらす、本発明1051の組換え微生物細胞。
[本発明1053]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸誘導体、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体からなる群より選択される、本発明1052の組換え微生物細胞。
[本発明1054]
エシェリキア属、バチルス属、シアノフィータ属、ラクトバチルス属、ザイモモナス属、ロドコッカス属、シュードモナス属、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フザリウム属、フミコラ属、リゾムコール属、クリベロミセス属、ピキア属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ペニシリウム属、ファネロカエテ属、ヒラタケ属、ホウロクタケ属、クリソスポリウム属、サッカロミセス属、ステノトロフォモナス属、シゾサッカロミセス属、ヤロウイア属、およびストレプトミセス属からなる群より選択される、本発明1048の組換え微生物細胞。
[本発明1055]
SEQ ID NO:6を含む、変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)。
[本発明1056]
変異が、アスパラギン酸(D)からアスパラギン(N)への置換を含むN末端アミノ酸領域にある、本発明1055の変種BCCP。
[本発明1057]
置換がアミノ酸位置2にある、本発明1056の変種BCCP。
[本発明1058]
対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加を組換え細胞に付与する、本発明1055の変種BCCP。
[本発明1059]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、本発明1058の変種BCCP。
[本発明1060]
変種accB遺伝子によってコードされる、本発明1055の変種BCCP。
[本発明1061]
変種accB遺伝子がSEQ ID NO:5の核酸配列を含む、本発明1060の変種accB遺伝子。
[本発明1062]
本発明1055〜1061のいずれかの変種BCCPを含む、組換え微生物。
[本発明1063]
炭素源を含有する発酵ブロス中で本発明1055の組換え微生物を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法。
[本発明1064]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、本発明1063の方法。
[本発明1065]
マロニル-CoA由来化合物がFAMEである、本発明1064の方法。
[本発明1066]
SEQ ID NO:4またはSEQ ID NO:8を含む、変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)。
[本発明1067]
変異が、アスパラギン酸(D)からヒスチジン(H)への置換を含むN末端アミノ酸領域にある、本発明1066の変種BCCP。
[本発明1068]
置換がアミノ酸位置2にある、本発明1067の変種BCCP。
[本発明1069]
対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加を組換え細胞に付与する、本発明1066の変種BCCP。
[本発明1070]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、本発明1069の変種BCCP。
[本発明1071]
変種accB遺伝子によってコードされる、本発明1066の変種BCCP。
[本発明1072]
変種accB遺伝子が、それぞれSEQ ID NO:3またはSEQ ID NO:7の核酸配列を含む、本発明1071の変種accB遺伝子。
[本発明1073]
本発明1066〜1072のいずれかの変種BCCPを含む、組換え微生物。
[本発明1074]
炭素源を含有する発酵ブロス中で本発明1055の組換え微生物を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法。
[本発明1075]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、本発明1074の方法。
[本発明1076]
マロニル-CoA由来化合物がFAMEである、本発明1075の方法。
[本発明1077]
SEQ ID NO:10またはSEQ ID NO:12を含む、変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)。
[本発明1078]
変異が、アスパラギン酸(D)からイソロイシン(I)への置換を含むN末端アミノ酸領域にある、本発明1077の変種BCCP。
[本発明1079]
置換がアミノ酸位置2にある、本発明1078の変種BCCP。
[本発明1080]
対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加を組換え細胞に付与する、本発明1077の変種BCCP。
[本発明1081]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、本発明1080の変種BCCP。
[本発明1082]
変種accB遺伝子によってコードされる、本発明1077の変種BCCP。
[本発明1083]
変種accB遺伝子が、それぞれSEQ ID NO:9またはSEQ ID NO:11の核酸配列を含む、本発明1082の変種accB遺伝子。
[本発明1084]
本発明1055〜1061のいずれかの変種BCCPを含む、組換え微生物。
[本発明1085]
炭素源を含有する発酵ブロス中で本発明1077の組換え微生物を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法。
[本発明1086]
マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、本発明1085の方法。
[本発明1087]
マロニル-CoA由来化合物がFAMEである、本発明1086の方法。
本開示は、好ましい態様を例示するのに役立つ添付の図面と一緒に読んだ時に最も良く理解される。しかしながら、本開示は、図面に開示される特定の態様に限定されないことが理解される。
アセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)変種、例えば、変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)が関与する、操作された生化学経路の1つの態様の模式図である。図示したように、BCCPは、細胞内で発現された時に、改善されたアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)活性を付与し得る。これは、マロニル-CoAおよびアシル-ACPの産生の増加につながる可能性があり、次に、例えば、脂肪酸誘導体、例えば、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸、および他の脂肪酸誘導体を含むマロニル-CoA由来化合物の産生の増加につながる可能性がある。 7つの異なる種に由来する7つのBCCPアミノ酸配列のアラインメントを図示する。四角で囲んだ部分は、ほとんどのBCCP種にわたって保存されているモチーフを示す。 アセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)変種、例えば、変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)が関与する、操作された生化学経路の別の態様の模式図である。図示したように、BCCPは、細胞内で発現された時に、改善されたアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)活性を付与し得る。これは、マロニル-CoAおよびアシル-CoAの産生の増加につながる可能性があり、次に、例えば、脂肪酸誘導体、例えば、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、脂肪酸、および他の脂肪酸誘導体を含むマロニル-CoA由来化合物の産生の増加につながる可能性がある。 アセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)変種、例えば、変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)が関与する、操作された生化学経路のいくつかの態様をまとめたものである。示したように、BCCPは、細胞内で発現された時に、改善されたアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)活性を付与し得る。これは、マロニル-CoA、および、ポリケチドと、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)と、フラバノンと、フラボノイドとを含むマロニル-CoA由来化合物の産生の増加、ならびに中間体の増加、例えば、アシル-CoAの増加 (図3も参照されたい)、アシル-ACPの増加 (図1も参照されたい)、およびマロネート(またはマロン酸)の増加につながる可能性がある。中間体の増加は、さらに、最終産物、例えば、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、および他の脂肪酸誘導体を含む脂肪酸誘導体の増加につながる可能性がある。 (accB遺伝子の位置2における)様々なBCCP変種を大腸菌宿主細胞内で発現させた結果であるFAS力価(FAME)を図示したグラフを示す。WTは、野生型ACC複合体の対照である。これらのBCCP変種の一部はFAS力価を5倍を超えて改善した(表1も参照されたい)。
詳細な説明
概略
本開示は、微生物内で発現可能な変種アセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)ポリペプチドまたはACC変種に関する。これらのACC変種は遺伝子が変えられており、脂肪酸誘導体を含むマロニル-CoA由来化合物の産生を増加させるために、改善された酵素活性を付与すると考えられている。本明細書において、本開示は、野生型細胞内の対応するACC活性と比較した、宿主細胞内で発現された時のアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)活性の改善につながり得るポリペプチドおよびタンパク質に関する。これを例示するために、1つのACC遺伝子ならびに1つのACCオペロンに変異を導入することによってACC遺伝子を変えた。これらの変化はいずれも、独立して、宿主細胞内での脂肪酸誘導体産生を増やすことができる。これらの変異は、脂肪酸由来化合物(すなわち、脂肪酸誘導体)、例えば、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪アミン、二官能性脂肪酸誘導体、および脂肪酸をベースとしない化合物、例えば、フラバノンおよびフラボノイド、ポリケチド、ならびに3-ヒドロキシプロピオン酸を含むが、これに限定されないマロニル-CoA由来産物の力価および収率を改善すると予想される。脂肪エステルの例は、脂肪酸メチルエステル(FAME)および脂肪酸エチルエステル(FAEE)である。二官能性脂肪酸誘導体の例には、ω-ヒドロキシ脂肪酸、ω-ヒドロキシジオール、ω-ヒドロキシFAME、およびω-ヒドロキシFAEEが含まれるが、これに限定されない。
マロニル-CoA由来化合物の高収率を生じるためには、完全なACC複合体をコードする4つ全てのACC遺伝子の発現増加が必要なことが明記されている(Davis et al. (2000)前記)。しかしながら、本開示は、たった1つのACC遺伝子における標的指向変異であっても脂肪酸誘導体を含むマロニル-CoA由来化合物の産生を改善することができるという驚くべき発見を明らかにする。例えば、accB遺伝子における標的指向変異および/またはaccBCオペロンにおける標的指向発現変化によって、脂肪エステル産生は630パーセントまで有意に改善した(図5ならびに表1および実施例、下記を参照されたい)。理論に拘束されるものではないが、変種ACCポリペプチドまたはACC変種は、宿主細胞内でのマロニル-CoA由来化合物の高産生につながる改善された酵素活性をACC複合体に直接的または間接的に付与すると考えられている。宿主細胞の比活性は増加し、その結果として、マロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらすと考えられている。このようなマロニル-CoA由来化合物には、脂肪酸誘導体および脂肪酸をベースとしない化合物が含まれる。
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いる場合、単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈によって明らかに別様に規定されている場合を除き、複数形の指示物も含む。したがって、例えば、「1つの宿主細胞」への言及は2つまたはそれを上回るそのような宿主細胞を含み、「1つの脂肪エステル」への言及は1つもしくは複数の脂肪エステル、またはエステルの混合物への言及を含み、「1つの核酸配列」への言及は1つまたは複数の核酸配列を含み、「1つの酵素」への言及は1つまたは複数の酵素を含み、他についても同様である。
配列アクセッション番号は、本記載を通じて、米国国立衛生研究所（National Institutes of Health, U.S.A.）によって管理されているNCBI（National Center for Biotechnology Information）によって提供されるデータベースから（これらは本明細書では「NCBIアクセッション番号」として、または代替的には「GenBankアクセッション番号」もしくは代替的には単に「アクセッション番号」として識別される）、ならびにSwiss Institute of Bioinformaticsによって提供されるUniProt Knowledgebase（UniProtKB）およびSwiss-Protデータベースから（これらは本明細書では「UniProtKBアクセッション番号」として識別される）入手した。
酵素分類（EC）番号は、国際生化学分子生物学連合（International Union of Biochemistry and Molecular Biology）（IUBMB）の命名委員会（Nomenclature Committee）によって確立されており、その記述はWorld Wide WebのIUBMB Enzyme Nomenclatureウェブサイトで入手可能である。EC番号は、それらが触媒する反応に応じて酵素を分類する。例えば、アセチル-CoAカルボキシラーゼ（ACC）酵素活性は、E.C. 6.4.1.2に分類される。ACCは、大多数の原核生物中、ならびに大多数の植物および藻類の葉緑体中に存在する、多サブユニットの酵素複合体である。ACCは、ATPとアセチル-CoAとHCO3-が、ADPとホスフェートとマロニル-CoAになる反応を触媒する。ACCの官能性は、1つの種から別の種へと大多数の原核生物において保存されている。したがって、異なる微生物種が、E.C. 6.4.1.2に分類される同じアセチル-CoAカルボキシラーゼ（ACC）酵素活性を有している可能性がある。
本明細書で用いる場合、「ヌクレオチド」という用語は、複素環塩基、糖、および1つまたは複数のリン酸基からなるポリヌクレオチドのモノマー単位を指す。天然の塩基（グアニン（G）、アデニン（A）、シトシン（C）、チミン（T）およびウラシル（U））は、典型的にはプリンまたはピリミジンの誘導体であるが、天然および非天然の塩基類似体も含まれることが理解されるべきである。天然の糖は、ペントース（五炭糖）デオキシリボース（DNAを形成する）またはリボース（RNAを形成する）であるが、天然および非天然の糖類似体も含まれることが理解されるべきである。核酸は、典型的にはリン酸結合を介して連結して核酸またはポリヌクレオチドを形成するが、多くの他の結合も当技術分野において公知である（例えば、ホスホロチオエート、ボラのホスフェートなど）。
「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド（RNA）またはデオキシリボヌクレオチド（DNA）の重合体を指し、それらは一本鎖でも二本鎖でもよく、非天然または改変ヌクレオチドを含むこともできる。「ポリヌクレオチド」、「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」という用語は、本明細書において、RNAまたはDNAのいずれかである任意の長さの重合型のヌクレオチドを指す目的で互換的に用いられる。これらの用語は分子の一次構造を指しており、それ故、二本鎖および一本鎖のDNA、ならびに二本鎖および一本鎖のRNAを含む。これらの用語は、同等のものとして、メチル化および／またはキャッピングされたポリヌクレオチドなどの、ただしそれらに限定はされないヌクレオチド類似体および修飾ポリヌクレオチドでできたRNAまたはDNAのいずれかの類似体を含む。ポリヌクレオチドは、プラスミド、ウイルス、染色体、EST、cDNA、mRNA、およびrRNAを非限定的に含む、任意の形態にあってよい。
本明細書で用いる場合、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基の重合体を指す目的で互換的に用いられる。「組換えポリペプチド」という用語は、組換え手法によって産生されるポリペプチドを指し、ここでは概して、発現させるタンパク質をコードするDNAまたはRNAを適した発現ベクター中に挿入し、続いてそれを、該ポリペプチドを産生させる目的で宿主細胞を形質転換するために用いる。また、発現させるタンパク質をコードするDNAまたはRNAを、相同組換えまたは当技術分野で周知の他の手段を介して宿主の染色体に挿入することもでき、これもまた該ポリペプチドを産生させる目的で宿主細胞を形質転換するために用いる。同様に、「組換えポリヌクレオチド」または「組換え核酸」または「組換えDNA」という用語は、当業者に公知の組換え手法によって産生される。
本明細書で用いる場合、「ホモログ」および「相同な」という用語は、対応するポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列に対して少なくとも約50パーセント（％）同一である配列を含むポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。好ましくは、相同なポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、対応するアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列に対して少なくとも約80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または少なくとも約99％の相同性を有するポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有する。本明細書で用いる場合、配列「相同性」および配列「同一性」という用語は、互換的に用いられる。
当業者は、2つまたはそれ以上の配列の間の相同性を決定するための方法を熟知しているであろう。手短に述べると、2つの配列間の「相同性」の計算は、以下のように行うことができる。配列を、最適な比較のために整列させる（例えば、最適なアラインメントのために第1および第2のアミノ酸配列または核酸配列の一方または両方にギャップを導入することができ、比較のために非相同配列を無視することができる）。1つの好ましい態様において、比較のために整列させる第1の配列の長さは、第2の配列の長さの少なくとも約30％、好ましくは少なくとも約40％、より好ましくは少なくとも約50％、さらにより好ましくは少なくとも約60％、さらにより好ましくは少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、または約100％である。続いて、第1および第2の配列の対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第1の配列における位置が第2の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占められている場合には、その分子はその位置で同一である。2つの配列間の％相同性は、2つの配列の最適なアラインメントのために導入する必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮に入れた、配列が共通に持つ同一な位置の数の関数である。2つの配列間での配列の比較および％相同性の決定は、BLAST（Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol, 215(3): 403-410）などの数学的アルゴリズムを用いて実現することができる。2つのアミノ酸配列間の％相同性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunschのアルゴリズムを用い、Blossum 62行列またはPAM250行列のいずれか、ならびに16、14、12、10、8、6または4のギャップ加重および1、2、3、4、5または6の長さ加重を用いて決定することもできる（Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol., 48: 444-453）。また、2つのヌクレオチド配列間の％相同性を、GCGソフトウェアパッケージのGAPプログラムを用いNWSgapdna.CMP行列、ならびに40、50、60、70または80のギャップ加重および1、2、3、4、5または6の長さ加重を用いて決定することもできる。当業者は、初期の相同性計算を行い、それに応じてアルゴリズムパラメーターを調整することができる。好ましいパラメーターのセット（および、分子が添付の特許請求の範囲の相同性の限度内にあるか否かを判定するためにどのパラメーターを適用すべきかを実施者が分かっていない場合に用いるべきセット）では、Blossum 62スコアリング行列を、ギャップペナルティ12、ギャップ延長ペナルティ4およびフレームシフトギャップペナルティ5で用いる。配列アラインメントのそのほかの方法は、バイオテクノロジーの技術分野で公知である（例えば、Rosenberg (2005) BMC Bioinformatics, 6: 278；Altschul, et al. (2005) FEBS J., 272(20): 5101-5109を参照されたい）。
「低ストリンジェントな、中ストリンジェントな、高ストリンジェントなまたは超高ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」という用語は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する条件を述べている。ハイブリダイゼーション反応を行うための手引きは、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1 - 6.3.6.に見ることができる。該参考文献には水性および非水性の方法が記載されており、いずれの方法を用いてもよい。本明細書において言及する具体的なハイブリダイゼーション条件は、以下の通りである：(1）低ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件--6×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（SSC）、約45℃の後に、0.2×SSC、0.1％ SDS中、少なくとも50℃で2回洗浄（低ストリンジェントな条件の場合、洗浄の温度は55℃まで上げることができる）；(2）中ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件--6×SSC、約45℃の後に、0.2×SSC、0.1％ SDS中、60℃での1回または複数回の洗浄；(3）高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件--6×SSC、約45℃の後に、0.2.X SSC、0.1％ SDS中、65℃での1回または複数回の洗浄；および (4）超高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件--0.5Mリン酸ナトリウム、7％ SDS、65℃の後に、0.2×SSC、1％ SDS、65℃での1回または複数回の洗浄。別に指定する場合を除き、超高ストリンジェントな条件（4）が好ましい条件である。
「内因性」ポリペプチドとは、親細胞（または宿主細胞）のゲノムによってコードされるポリペプチドを指す。「外因性」ポリペプチドとは、親細胞のゲノムによってはコードされないポリペプチドを指す。変種または変異体ポリペプチドは、外因性ポリペプチドの一例である。したがって、非天然の核酸分子は、細胞に導入されると、該細胞にとって外因性であるとみなされる。天然に存在する核酸分子も、特定の細胞にとっては外因性である場合がある。例えば、細胞Xから単離されたあるコード配列の全体は、そのコード配列が細胞Yに導入されると、たとえXとYが同じ細胞型であったとしても、細胞Yに対しては外因性核酸である。
「過剰発現された」という用語は、ある遺伝子が、その遺伝子の内因性転写速度と比較して高い速度で転写されるようになっていることを意味する。いくつかの例では、過剰発現は、遺伝子の翻訳の速度が、その遺伝子の内因性翻訳速度と比較して上昇していることをさらに含む。過剰発現を検査するための方法は当技術分野において周知であり、例えば、転写されたRNAのレベルをrtPCRを用いて評価すること、およびタンパク質レベルをSDS pageゲル分析を用いて評価することができる。
「異種」という用語は、異なる生物、異なる細胞型、または異なる種に由来することを意味する。本明細書で用いる場合、これは、ある所与の生物に天然では存在しないヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列を指す。例えば、シアノバクテリアにとって生来のものであるポリヌクレオチド配列を大腸菌の宿主細胞に組換え法によって導入することができ、そうするとシアノバクテリア由来のそのポリヌクレオチドはその大腸菌細胞（例えば、組換え細胞）にとって異種となる。また、「異種」という用語を、非生来状態にある組換え宿主細胞に存在するヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列に関連して用いることもできる。例えば、「異種」ヌクレオチド配列、ポリヌクレオチド配列、ポリペプチド配列またはタンパク質配列は、例えば、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ポリペプチドまたはタンパク質の発現レベルまたは配列の改変というように、対応する野生型宿主細胞に天然に存在する野生型配列と対比して改変されていてよい。
本明細書で用いる場合、ポリペプチドの「断片」という用語は、完全長ポリペプチドまたはタンパク質のより短い部分を指し、そのサイズは、2アミノ酸残基から、アミノ酸配列全体から1アミノ酸残基を差し引いたものまでの範囲にわたる。本開示のある態様において、断片とは、ポリペプチドまたはタンパク質のあるドメイン（例えば、基質結合ドメインまたは触媒ドメイン）のアミノ酸配列全体のことを指す。
「変異誘発」という用語は、生物の遺伝情報を安定的な様式で変化させる工程を指す。タンパク質をコードする核酸配列の変異誘発により、変異体タンパク質が生じる。また、変異誘発とは、タンパク質活性の改変をもたらす非コード性核酸配列の変化のことも指す。
「変異」とは、本明細書で用いる場合、遺伝子のある核酸位置、またはポリペプチドもしくはタンパク質のあるアミノ酸位置における永続的変化のことを指す。変異には置換、付加、挿入および欠失が含まれる。例えば、アミノ酸位置における変異とは、1つの種類のアミノ酸が、別の種類のアミノ酸によって置換されることでありうる（例えば、アスパラギン酸（D）はチロシン（Y）によって置換されてよい；リジン（L）はトレオニン（T）によって置換されてよい；など）。そのため、ポリペプチドまたはタンパク質は、1つのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている1つまたは複数の変異を有しうる。例えば、ACCに関連するポリペプチドまたはタンパク質は、そのアミノ酸配列中に1つまたは複数の変異を有しうる。
本明細書で使用する「遺伝子」という用語は、RNA産物またはタンパク質産物をコードする核酸配列、ならびにRNAもしくはタンパク質の発現に影響を及ぼす機能的に連結された核酸配列(例えば、このような配列にはプロモーターもしくはエンハンサー配列が含まれるが、これに限定されない)、またはRNAもしくはタンパク質の発現に影響を及ぼす機能的に連結された核酸配列コード配列(例えば、このような配列にはリボソーム結合部位もしくは翻訳制御配列が含まれるが、これに限定されない)を指す。
発現制御配列は当技術分野において公知であり、例えば、宿主細胞内でポリヌクレオチド配列の発現をもたらす、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、転写ターミネーター、配列内リボソーム進入部位(IRES)などを含む。発現制御配列は、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用する(Maniatis et al., Science, 236: 1237-1245(1987))。例示的な発現制御配列 は、例えば、Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology, Vol.185, Academic Press, San Diego, Calif.(1990)に記載されている。本開示の方法では、発現制御配列はポリヌクレオチド配列に機能的に連結される。「機能的に連結された」とは、適切な分子(例えば、転写活性化因子タンパク質)が発現制御配列に結合した時に遺伝子が発現されるようにポリヌクレオチド配列および発現制御配列が接続されていることを意味する。機能的に連結されたプロモーターは、転写および翻訳の方向に関して、選択されたポリヌクレオチド配列の上流に配置される。機能的に連結されたエンハンサーは、選択されたポリヌクレオチドの上流に配置されてもよく、内部に配置されてもよく、下流に配置されてもよい。
本明細書で使用する「ベクター」という用語は、別の核酸、すなわち、ベクターに連結されているポリヌクレオチド配列を輸送することができる核酸分子を指す。あるタイプの有用なベクターはエピソーム(すなわち、染色体外複製が可能な核酸)である。有用なベクターは、自律複製および/またはベクターに連結されている核酸の発現が可能なベクターである。機能的に連結された遺伝子の発現を管理することができるベクターは本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般的に、組換えDNA法において有用な発現ベクターは、多くの場合、「プラスミド」の形をとることが多い。一般的に、「プラスミド」は、ベクターの形をとって染色体に結合されない環状二本鎖DNAループを指す。「プラスミド」および「ベクター」という用語は、プラスミドがベクターの形で最もよく用いられるので本明細書において同義に用いられる。しかしながら、等価な機能を果たし、かつ後に当技術分野において公知になる、このような他の形の発現ベクターも含まれる。一部の態様において、組換えベクターは、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結されるプロモーターをさらに含む。一部の態様において、プロモーターは、発生により調節されるプロモーター、細胞小器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または細胞特異的プロモーターである。組換えベクターは、典型的には、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結される発現制御配列;ポリヌクレオチド配列に機能的に連結される選択マーカー;ポリヌクレオチド配列に機能的に連結されるマーカー配列;ポリヌクレオチド配列に機能的に連結される精製部分;ポリヌクレオチド配列に機能的に連結される分泌配列;およびポリヌクレオチド配列に機能的に連結される標的指向配列より選択される少なくとも1つの配列を含む。ある特定の態様において、ヌクレオチド配列は宿主細胞のゲノムDNAに安定に組み込まれ、ヌクレオチド配列の発現は調節性プロモーター領域の制御下にある。本明細書に記載の発現ベクターは、宿主細胞内でのポリヌクレオチド配列の発現に適した形をした本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を含む。発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望ましいポリペプチドの発現レベルなどのような要因に依存し得ることが当業者によって理解されるだろう。本明細書に記載のようにポリヌクレオチド配列によってコードされる、融合ポリペプチドを含むポリペプチドを産生するために、本明細書に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。
「組換え細胞」および「組換え宿主細胞」という用語は本明細書において同義に用いられ、ACC変種を発現し得る、および/またはマロニル-CoA由来化合物を産生するように組換え細胞の比活性を増加し得る変種オペロンを含む細胞を指す。組換え細胞は、細菌、ウイルス、または菌類などの微生物に由来してもよい。さらに、組換え細胞は植物または動物細胞に由来してもよい。組換え細胞を用いて、脂肪酸、脂肪エステル(例えば、ワックス、脂肪酸エステル、脂肪エステル、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE))、脂肪アルコール、短鎖アルコールおよび長鎖アルコール、脂肪アルデヒド、炭化水素、脂肪アミン、末端オレフィン、内部オレフィン、ケトン、二官能性脂肪酸誘導体(例えば、ω-ヒドロキシ脂肪酸、ω-ヒドロキシジオール、ω-ヒドロキシFAME、ω-ヒドロキシFAEE);ならびに非脂肪酸化合物、例えば、フラバノン、フラボノイド、ポリケチド、および3-ヒドロキシプロピオン酸を含むが、これに限定されない1種類または複数種の脂肪酸誘導体を産生することができる。一部の態様において、組換え細胞は1種類または複数種のポリヌクレオチドを含み、それぞれのポリヌクレオチドは、脂肪酸生合成酵素活性を有するポリペプチドをコードし、組換え細胞は、ポリヌクレオチドを発現するのに有効な条件下で炭素源の存在下で培養された時に脂肪酸誘導体組成物を産生する。
本明細書で使用する「微生物」という用語は、微細な生物を指す。微生物の例は、細菌、ウイルス、または真菌である。1つの態様において、微生物は細菌細胞である。別の態様において、微生物は原核生物または原核細胞である。さらに別の態様において、微生物は酵母細胞などの真菌細胞である。別の態様において、微生物はウイルス細胞である。関連する態様において、「組換え微生物」とは、遺伝子改変されており、外因性かつ/または異種の核酸配列を発現または包含する、微生物である。
本明細書で使用する「アシル-ACP」は、アルキル鎖のカルボニル炭素と、アシルキャリアータンパク質(ACP)のホスホパンテテイニル部分のスルフヒドリル基との間で形成されたアシルチオエステルを指す。ホスホパンテテイニル部分は、ホロ-アシルキャリアータンパク質シンターゼ(ACPS)であるホスホパンテテイニルトランスフェラーゼの働きによってACP上の保存セリン残基に翻訳後に取り付けられる。一部の態様において、アシル-ACPは完全飽和アシル-ACPの合成における中間体である。他の態様において、アシル-ACPは不飽和アシル-ACPの合成における中間体である。一部の態様において、炭素鎖は、約5個、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、16個、17個、18個、19個、20個、21個、22個、23個、24個、25個、または26個の炭素を有する。これらのアシル-ACPはそれぞれ、アシル-ACPを脂肪酸誘導体に変換する酵素の基質である。
「マロニル-CoA由来化合物」という用語は、マロニル-CoAが中間体として機能する、および/または目的の化合物もしくは化学的実体の上流で作られる生化学経路を介して作られる任意の化合物または化学的実体(すなわち、中間体もしくは最終産物)を含む(例えば、図4を参照されたい)。例えば、マロニル-CoA由来化合物には、脂肪酸誘導体、例えば、脂肪酸;脂肪酸メチルエステル(FAME)および/または脂肪酸エチルエステル(FAEE)を含むが、これに限定されない脂肪エステル;脂肪アルコール;脂肪アルデヒド;脂肪アミン;アルカン;オレフィンまたはアルケン;炭化水素;βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、ならびに不飽和脂肪酸誘導体が含まれるが、これに限定されない。さらに、マロニル-CoA由来化合物には、非脂肪酸化合物、例えば、フラバノン、フラボノイド、ポリケチド、マロネート、および3-ヒドロキシプロピオン酸が含まれるが、これに限定されない。
「脂肪酸」という用語は、式RCOOHを有するカルボン酸を意味する。Rは脂肪族基、好ましくはアルキル基を表す。Rは約4〜約22個の炭素原子を含んでもよい。脂肪酸は分枝鎖または直鎖を有してもよく、飽和、一不飽和、または多価不飽和でもよい。
「脂肪酸誘導体」は部分的に、産生宿主生物の脂肪酸生合成経路から作られた産物である。「脂肪酸誘導体」には、アシル-ACPまたはアシル-ACP誘導体を含むマロニル-CoA由来化合物から作られた産物が含まれる。例示的な脂肪酸誘導体には、脂肪酸、脂肪エステル(例えば、ワックス、脂肪酸エステル、脂肪エステル、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE))、脂肪アミン、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、短鎖アルコールおよび長鎖アルコール、炭化水素、ケトン、末端オレフィン、内部オレフィン、ケトン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体(例えば、ω-ヒドロキシ脂肪酸、ω-ヒドロキシジオール、ω-ヒドロキシFAME、ω-OH FAEE)、ならびに不飽和脂肪酸誘導体が含まれる。「脂肪酸誘導体」には、アシル-CoAまたはアシル-CoA誘導体などのマロニル-CoA由来化合物から作られた産物も含まれる。
本明細書において言及される「脂肪酸誘導体組成物」は組換え宿主細胞によって産生され、典型的には脂肪酸誘導体の混合物を含む。場合によっては、前記混合物には、複数のタイプの脂肪酸誘導体産物(例えば、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪アミン、二官能性脂肪酸誘導体など)が含まれる。他の場合では、脂肪酸誘導体組成物は、例えば、鎖の長さ、飽和、および/または分枝特徴が異なる脂肪エステル(または別の脂肪酸誘導体)の混合物を含んでもよい。さらに他の場合では、脂肪酸誘導体組成物は、鎖の長さ、飽和、および/または分枝特徴が異なる複数のタイプの脂肪酸誘導体産物および脂肪酸誘導体の混合物を含んでもよい。さらに他の場合では、脂肪酸誘導体組成物は、例えば、脂肪エステルおよびβヒドロキシエステルの混合物を含んでもよい。さらに他の場合では、脂肪酸誘導体組成物は、例えば、脂肪アルコールおよび脂肪アルデヒドの混合物を含んでもよい。さらに他の場合では、脂肪酸誘導体組成物は、例えば、FAMEおよび/またはFAEEの混合物を含んでもよい。
「変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)」および「ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)変種」という用語は本明細書において同義に用いられ、アミノ酸配列中に1つまたは複数の変異を有するACC変種を指す。一例では、アミノ酸配列は1(すなわち、ATG開始点に基づく最初のメチオニン(M))〜156に及ぶ。このようなBCCP変種は、アミノ酸位置1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、および/または156に1つまたは複数の変異を有してもよい。1つの態様において、変異は、位置1近く〜位置60近くに及ぶN末端アミノ酸領域にある変異を含む。1つの態様において、変異は、アミノ酸位置2(開始コドンの直後)にある変異を含む。
「発現が、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加を組換え細胞に付与する(またはもたらす)」という用語は、アミノ酸配列中に1つまたは複数の変異を有し(すなわち、ACC変種またはACC変異体)、かつ細胞内で発現された時に、ACC変種または変異体を発現しない野生型細胞と比較して細胞においてマロニル-CoA由来化合物産生を改善するACC関連ポリペプチドまたはタンパク質の機能を指す。この用語はまた、細胞内で発現された時に、マロニル-CoA由来化合物産生における細胞の高い比活性をもたらす効果があるACC変種の機能も指す。理論に拘束されるものではないが、これは、細胞内に高いアセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)酵素活性(E.C.6.4.1.2)を直接的または間接的に引き起こした結果でもよい。これは、ACC変種を発現する細胞によって産生されたマロニル-CoA由来化合物の力価および/または収率を、対応する野生型細胞(すなわち、ACC変種を発現しない細胞)によって産生されたマロニル-CoA由来化合物の力価および/または収率と比較することによって測定することができる。当業者は、例えば、ガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出器(GC-FID)などを含む測定方法が容易に利用できることを認めるだろう。ACC変種タンパク質の一例はビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)変種である。ACC変種は、ACC複合体の4つのサブユニットのいずれか1つおよび/または2つに変異を含んでもよい。ACC変種は、4つのサブユニットのいずれか1つおよび/または2つの濃度変化を含んでもよい。細胞がACC変種によって形質転換された時、これがACC変種を発現する細胞(例えば、組換え細胞)である。1つの態様において、ACC変種を発現する細胞によって産生されたマロニル-CoA由来化合物の力価および/または収率は、対応する野生型細胞(すなわち、ACC変種を発現しない対応する細胞)の力価および/または収率の少なくとも2倍である。別の態様において、ACC変種を発現する細胞によって産生されたマロニル-CoA由来化合物の力価および/または収率は、対応する野生型細胞の力価および/または収率の少なくとも約1倍、少なくとも約2倍、少なくとも約3倍、少なくとも約4倍、少なくとも約5倍、少なくとも約6倍、少なくとも約7倍、少なくとも約8倍、少なくとも約9倍、または少なくとも約10倍である。1つの態様において、ACC変種を発現する細胞によって産生されたマロニル-CoA由来化合物の力価および/または収率は、対応する野生型細胞の力価および/または収率より少なくとも約1パーセント、少なくとも約2パーセント、少なくとも約3パーセント、少なくとも約4パーセント、少なくとも約5パーセント、少なくとも約6パーセント、少なくとも約7パーセント、少なくとも約8パーセント、少なくとも約9パーセント、または約10パーセント多い。別の態様において、ACC変種の発現による力価および/または収率は野生型ACC複合体の力価および/または収率より少なくとも約20パーセント〜少なくとも約100パーセント多い。1つの態様において、細胞によって産生されたマロニル-CoA由来化合物の力価および/または収率は、対応する野生型細胞の力価および/または収率より少なくとも約20パーセント、少なくとも約25パーセント、少なくとも約30パーセント、少なくとも約35パーセント、少なくとも約40パーセント、少なくとも約45パーセント、少なくとも約50パーセント、少なくとも約55パーセント、少なくとも約60パーセント、少なくとも約65パーセント、少なくとも約70パーセント、少なくとも約75パーセント、少なくとも約80パーセント、少なくとも約85パーセント、少なくとも約90パーセント、少なくとも約95パーセント、少なくとも約97パーセント、少なくとも約98パーセント、または少なくとも約100パーセント多い。別の態様において、細胞によって産生されたマロニル-CoA由来化合物の力価および/または収率は、対応する野生型細胞の力価および/または収率より少なくとも約200パーセント、少なくとも約250パーセント、少なくとも約300パーセント、少なくとも約350パーセント、少なくとも約400パーセント、少なくとも約450パーセント少なくとも約500パーセント、少なくとも約550パーセント、少なくとも約600パーセント、少なくとも約610、620、630、640、もしくは650パーセント、少なくとも約700パーセント、少なくとも約750パーセント、少なくとも約800パーセント、または少なくとも約850パーセント多い。
本明細書で使用する「脂肪酸生合成経路」という用語は、脂肪酸誘導体を産生する生合成経路を意味する。脂肪酸生合成経路は、望ましい特徴を有する脂肪酸誘導体を産生する、さらなる酵素を含んでもよい。
本明細書で使用する「脂肪エステル」とは、式RCOOR'を有するエステルを意味する。本明細書において言及される脂肪エステルは、脂肪酸から作られる任意のエステル、例えば、脂肪酸エステルでもよい。一部の態様において、R基は、長さが少なくとも5個、少なくとも6個、少なくとも7個、少なくとも8個、少なくとも9個、少なくとも10個、少なくとも11個、少なくとも12個、少なくとも13個、少なくとも14個、少なくとも15個、少なくとも16個、少なくとも17個、少なくとも18個、または少なくとも19個の炭素である。または、もしくはさらに、R基は、長さが20個以下、19個以下、18個以下、17個以下、16個以下、15個以下、14個以下、13個以下、12個以下、11個以下、10個以下、9個以下、8個以下、7個以下、または6個以下の炭素である。従って、R基は、前記終点のいずれか2つによって定められるR基を有してもよい。例えば、R基は、長さが6〜16個の炭素、長さが10〜14個の炭素、または長さが12〜18個の炭素でもよい。一部の態様において、脂肪エステル組成物は、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、およびC26脂肪エステルの1つまたは複数を含む。他の態様において、脂肪エステル組成物は、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、およびC18脂肪エステルの1つまたは複数を含む。さらに他の態様において、脂肪エステル組成物は、C12、C14、C16、およびC18脂肪エステル;C12、C14、およびC16脂肪エステル;C14、C16、およびC18脂肪エステル;またはC12およびC14脂肪エステルを含む。
脂肪酸誘導体、例えば、脂肪エステルのR基は直鎖または分枝鎖でもよい。分枝鎖は複数の分岐点を有してもよく、環式分枝を含んでもよい。一部の態様において、分枝脂肪酸、分枝脂肪アルデヒド、または分枝脂肪エステルは、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、またはC26分枝脂肪酸、分枝脂肪アルデヒド、または分枝脂肪エステルである。特定の態様において、分枝脂肪酸、分枝脂肪アルデヒド、または分枝脂肪エステルは、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、またはC18分枝脂肪酸または分枝脂肪エステルである。本開示の脂肪エステルはA側およびB側を含有すると称され得る。本明細書で使用するエステルの「A側」とは、エステルのカルボン酸酸素に取り付けられている炭素鎖を指す。本明細書で使用するエステルの「B側」とは、エステルの親カルボン酸を含む炭素鎖を指す。脂肪エステルが脂肪酸生合成経路から得られた場合、A側は典型的にはアルコールによって付与され、B側は脂肪酸によって付与される。
脂肪エステルのA側を形成するために任意のアルコールを使用することができる。例えば、アルコールは脂肪酸生合成経路、例えば、本明細書に記載の脂肪酸生合成経路から得られてもよい。または、アルコールは非脂肪酸生合成経路を介して産生されてもよい。さらに、アルコールは外因的に提供されてもよい。例えば、脂肪エステルが生物によって産生される場合、アルコールは発酵ブロス中に供給されてもよい。または、アルコールも産生することができる生物によって脂肪エステルが産生される場合、脂肪酸または酢酸などのカルボン酸が外因的に供給されてもよい。
エステルのA側またはB側を含む炭素鎖は任意の長さでもよい。1つの態様において、エステルのA側は長さが少なくとも約1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、10個、12個、14個、16個、または18個の炭素である。脂肪エステルが脂肪酸メチルエステルである場合、エステルのA側は長さが1個の炭素である。脂肪エステルが脂肪酸エチルエステルである場合、エステルのA側は長さが2個の炭素である。エステルのB側は長さが少なくとも約4個、6個、8個、10個、12個、14個、16個、18個、20個、22個、24個、または26個の炭素でもよい。A側および/またはB側は直鎖または分枝鎖でもよい。分枝鎖は1つまたは複数の分岐点を有してもよい。さらに、分枝鎖は環式分枝を含んでもよい。さらに、A側および/またはB側は飽和または不飽和でもよい。不飽和であれば、A側および/またはB側は1つまたは複数の不飽和点を有してもよい。さらに、本開示に従って産生される脂肪エステルのアルコール基は1(C1)位にある必要はない。1つの態様において、脂肪エステルは生合成により産生される。この態様において、最初に、脂肪酸は「活性化」される。「活性化された」脂肪酸の非限定的な例は、アシル-CoA、アシルACP、およびアシルリン酸である。アシル-CoAは脂肪酸生合成または分解の直接的な産物でもよい。さらに、アシル-CoAは遊離脂肪酸、CoA、およびアデノシンヌクレオチド三リン酸(ATP)から合成されてもよい。アシル-CoAを産生する酵素の一例はアシル-CoAシンターゼである。
ある特定の態様において、分枝脂肪酸誘導体は、イソ-脂肪酸誘導体、例えば、イソ-脂肪エステル、またはアンテイソ(anteiso)-脂肪酸誘導体、例えば、アンテイソ-脂肪エステルである。例示的な態様において、分枝脂肪酸誘導体は、イソ-C7:0、イソ-C8:0、イソ-C9:0、イソ-C10:0、イソ-C11:0、イソ-C12:0、イソ-C13:0、イソ-C14:0、イソ-C15:0、イソ-C16:0、イソ-C17:0、イソ-C18:0、イソ-C19:0、アンテイソ-C7:0、アンテイソ-C8:0、アンテイソ-C9:0、アンテイソ-C10:0、アンテイソ-C11:0、アンテイソ-C12:0、アンテイソ-C13:0、アンテイソ-C14:0、アンテイソ-C15:0、アンテイソ-C16:0、アンテイソ-C17:0、アンテイソ-C18:0、およびアンテイソ-C19:0分枝脂肪エステルより選択される。
分枝脂肪酸誘導体または非分枝脂肪酸誘導体のR基は飽和または不飽和でもよい。不飽和であれば、R基は1つまたは複数の不飽和点を有してもよい。一部の態様において、不飽和脂肪酸誘導体は一不飽和脂肪酸誘導体である。ある特定の態様において、不飽和脂肪酸誘導体は、C6:1、C7:1、C8:1、C9:1、C10:1、C11:1、C12:1、C13:1、C14:1、C15:1、C16:1、C17:1、C18:1、C19:1、C20:1、C21:1、C22:1、C23:1、C24:1、C25:1、またはC26:1不飽和脂肪酸誘導体である。ある特定の態様において、不飽和脂肪酸誘導体は、C10:1、C12:1、C14:1、C16:1、またはC18:1不飽和脂肪酸誘導体である。他の態様において、不飽和脂肪酸誘導体はω-7位において不飽和している。ある特定の態様において、不飽和脂肪酸誘導体はcis二重結合を含む。
本明細書で使用する「クローン」という用語は、典型的には、1個の共通祖先に由来し、かつ1個の共通祖先と本質的に遺伝学的に同一である細胞または細胞群、例えば、1個の細菌細胞から生じたクローン化細菌コロニーの細菌を指す。
本明細書で使用する「培養物」という用語は、典型的には、生細胞を含む液体培地を指す。1つの態様において、培養物は、管理された条件下で、予め決められた培養培地中で複製している細胞、例えば、選択された炭素源および窒素を含む液体培地中で増殖された組換え宿主細胞の培養物を含む。「培養する(culturing)」または「培養(cultivation)」とは、液体培地中または固体培地中で適切な条件下で宿主細胞（例えば組換え宿主細胞）の集団を増殖させることを指す。特定の態様において、培養するとは、基質から最終産物の発酵性生物変換を指す。培養培地は周知であり、このような培養培地の個々の成分は商業的供給業者から入手可能であり、例えば、Difco(商標)培地およびBBL(商標)培地がある。1つの非限定的な例では、水性栄養培地は、窒素、塩、および炭素の複合供給源を含む「リッチ培地」、例えば、このような培地の10g/Lペプトンおよび10g/L酵母エキスを含むYP培地である。
本明細書で使用する、組換え宿主細胞内でのタンパク質、例えば、酵素の活性の「改変された」または「変化したレベル」は、親または天然の宿主細胞と比べて求められた活性の1つまたは複数の特徴の差を指す。典型的に、活性の差は、改変された活性を有する組換え宿主細胞と対応する野生型宿主細胞との間(例えば、組換え宿主細胞の培養物と対応する野生型宿主細胞との比較)で求められる。改変された活性は、例えば、組換え宿主細胞によって発現されたタンパク質の量の改変(例えば、タンパク質をコードするDNA配列のコピー数の増加もしくは減少、タンパク質をコードするmRNA転写物の数の増加もしくは減少、および/またはmRNAからのタンパク質のタンパク質翻訳の量の増加もしくは減少の結果として);タンパク質の構造の変化(例えば、一次構造に対する変化、例えば、基質特異性の変化をもたらす、タンパク質コード配列に対する変化、観察されたキネティックパラメータの変化);ならびにタンパク質安定性の変化(例えば、タンパク質の分解の増加または減少)の結果でもよい。一部の態様において、ポリペプチドは、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかの変異体または変種、例えば、変種BCCPを含む変種ACCである。ある特定の場合において、本明細書に記載のポリペプチドのコード配列は、ある特定の宿主細胞における発現のためにコドン最適化される。例えば、大腸菌における発現の場合、1つまたは複数のコドンを最適化することができる（Grosjean et al., (1982) Gene 18: 199-209)。
本明細書で使用する「制御配列」という用語は、典型的には、タンパク質をコードするDNA配列に機能的に連結され、このタンパク質の発現を最終的に制御するDNA中の塩基配列を指す。制御配列の例には、RNAプロモーター配列、転写因子結合配列、転写終結配列、転写モジュレーター(例えば、エンハンサーエレメント)、RNA安定性に影響を及ぼすヌクレオチド配列、および翻訳制御配列(例えば、リボソーム結合部位(例えば、原核生物におけるシャイン・ダルガノ配列または真核生物におけるコザック配列)、開始コドン、終止コドン)が含まれるが、これに限定されない。本明細書で使用する「ヌクレオチド配列の発現が野生型ヌクレオチド配列と比べて改変される」という句は、内因性ヌクレオチド配列の発現および/もしくは活性または異種ポリペプチドもしくは非天然ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現および/もしくは活性のレベルの上昇もしくは低下を意味する。「変化した発現レベル」および「改変された発現レベル」という用語は同義に用いられ、操作された宿主細胞の中のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または炭化水素が、同じ条件下の対応する野生型細胞の中の濃度と比較して異なる濃度で存在することを意味する。本明細書で使用する、ポリヌクレオチドに関して「発現させる」という用語は、ポリヌクレオチドが機能するようにすることである。ポリペプチド(またはタンパク質)をコードするポリヌクレオチドは発現された時に、そのポリペプチド(またはタンパク質)を産生するように転写および翻訳される。本明細書で使用する「過剰発現させる」という用語は、同じ条件下の対応する野生型細胞の中で通常発現される濃度より高い濃度で細胞内でポリヌクレオチドもしくはポリペプチドを発現させる、またはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの発現を引き起こすことを意味する。
本明細書で使用する「力価」という用語は、宿主細胞培養物の体積単位あたりの産生された脂肪酸誘導体を含むマロニル-CoA由来化合物の量を指す。本明細書に記載の組成物および方法の任意の局面において、脂肪酸誘導体または他の化合物は、約25mg/L、約50mg/L、約75mg/L、約100mg/L、約125mg/L、約150mg/L、約175mg/L、約200mg/L、約225mg/L、約250mg/L、約275mg/L、約300mg/L、約325mg/L、約350mg/L、約375mg/L、約400mg/L、約425mg/L、約450mg/L、約475mg/L、約500mg/L、約525mg/L、約550mg/L、約575mg/L、約600mg/L、約625mg/L、約650mg/L、約675mg/L、約700mg/L、約725mg/L、約750mg/L、約775mg/L、約800mg/L、約825mg/L、約850mg/L、約875mg/L、約900mg/L、約925mg/L、約950mg/L、約975mg/L、約1000mg/L、約1050mg/L、約1075mg/L、約1100mg/L、約1125mg/L、約1150mg/L、約1175mg/L、約1200mg/L、約1225mg/L、約1250mg/L、約1275mg/L、約1300mg/L、約1325mg/L、約1350mg/L、約1375mg/L、約1400mg/L、約1425mg/L、約1450mg/L、約1475mg/L、約1500mg/L、約1525mg/L、約1550mg/L、約1575mg/L、約1600mg/L、約1625mg/L、約1650mg/L、約1675mg/L、約1700mg/L、約1725mg/L、約1750mg/L、約1775mg/L、約1800mg/L、約1825mg/L、約1850mg/L、約1875mg/L、約1900mg/L、約1925mg/L、約1950mg/L、約1975mg/L、約2000mg/L(2g/L)、3g/L、5g/L、10g/L、20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L、90g/L、100g/L、または前述の値のいずれか2つによって定められる範囲の力価で産生される。他の態様において、脂肪酸誘導体または他の化合物は100g/L超、200g/L超、または300g/L超の力価で産生される。本開示の方法に従って組換え宿主細胞によって産生された脂肪酸誘導体または他の化合物の1つの好ましい力価は、5g/L〜200g/L、10g/L〜150g/L、20g/L〜120g/L、および30g/L〜100g/Lである。力価は、所定の組換え宿主細胞培養物によって産生された、ある特定の脂肪酸誘導体または脂肪酸誘導体の組み合わせ、または別の化合物または他の化合物の組み合わせを指すことができる。例えば、大腸菌などの組換え宿主細胞におけるACC変種の発現は、対応する野生型ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞と比較してより高い力価の産生をもたらす。1つの態様において、より高い力価は少なくとも約5g/L〜約200g/Lである。
本明細書で使用する「宿主細胞によって産生された脂肪酸誘導体または他の化合物を含むマロニル-CoA由来化合物の収率」とは、宿主細胞内で投入炭素源が産物(すなわち、脂肪酸誘導体および/または他の化合物を含むマロニル-CoA由来化合物)に変換される効率を指す。本開示の方法に従って脂肪酸誘導体を含むマロニル-CoA由来化合物を産生するように操作された宿主細胞の収率は、少なくとも約3％、少なくとも約4％、少なくとも約5％、少なくとも約6％、少なくとも約7％、少なくとも約8％、少なくとも約9％、少なくとも約10％、少なくとも約11％、少なくとも約12％、少なくとも約13％、少なくとも約14％、少なくとも約15％、少なくとも約16％、少なくとも約17％、少なくとも約18％、少なくとも約19％、少なくとも約20％、少なくとも約21％、少なくとも約22％、少なくとも約23％、少なくとも約24％、少なくとも約25％、少なくとも約26％、少なくとも約27％、少なくとも約28％、少なくとも約29％、もしくは少なくとも約30％、または前述の値のいずれか2つによって定められる範囲である。他の態様において、脂肪酸誘導体または他の化合物は、約30％超、約35％超、約40％超、約45％超、約50％超、約55％超、約60％超、約65％超、約70％超、約75％超、約80％超、約85％超、約90％超、100％超、200％超、250％超、300％超、350％超、400％超、450％超、500％超、550％超、600％超、650％超、700％超、750％超、またはそれより高い収率で産生される。または、もしくはさらに、収率は約30％以下、約27％以下、約25％以下、または約22％以下である。別の態様において、収率は約50％以下、約45％以下、または約35％以下である。別の態様において、収率は約95％以下、または90％以下、または85％以下、または80％以下、または75％以下、または70％以下、または65％以下、または60％以下、または55％以下、または50％以下である。従って、収率は前記終点のいずれか2つによって定められてもよい。例えば、本開示の方法に従って組換え宿主細胞によって産生された脂肪酸誘導体を含むマロニル-CoA由来化合物の収率は、約5％〜約15％、約10％〜約25％、約10％〜約22％、約15％〜約27％、約18％〜約22％、約20％〜約28％、約20％〜約30％、約30％〜約40％、約40％〜約50％、約50％〜約60％、約60％〜約70％、約70％〜約80％、約80％〜約90％、約90％〜約100％、約100％〜約200％、約200％〜約300％、約300％〜約400％、約400％〜約500％、約500％〜約600％、約600％〜約700％、または約700％〜約800％でもよい。収率は、所定の組換え宿主細胞培養物によって産生された、脂肪酸誘導体もしくは脂肪酸誘導体の組み合わせまたは別の化合物もしくは化合物の別の組み合わせを含む、ある特定のマロニル-CoA由来化合物を指すことができる。1つの態様において、大腸菌などの組換え宿主細胞におけるACC変種の発現は、対応する野生型ポリペプチドを発現する宿主細胞と比較してより高い収率の、例えば脂肪エステルなどの脂肪酸誘導体を含むマロニル-CoA由来化合物の産生をもたらす。1つの態様において、より高い収率は理論収率の約10％〜約800％である。
本明細書で使用する「生産性」という用語は、宿主細胞培養物の体積単位あたりの単位時間あたりの産生された脂肪酸誘導体または別の化合物を含むマロニル-CoA由来化合物の量を指す。本明細書に記載の組成物および方法の任意の局面において、組換え宿主細胞によって産生された脂肪酸誘導体または他の化合物を含むマロニル-CoA由来化合物の生産性は、(細胞量に応じて)少なくとも100mg/L/時間、少なくとも200mg/L/時間、少なくとも300mg/L/時間、少なくとも400mg/L/時間、少なくとも500mg/L/時間、少なくとも600mg/L/時間、少なくとも700mg/L/時間、少なくとも800mg/L/時間、少なくとも900mg/L/時間、少なくとも1000mg/L/時間、少なくとも1100mg/L/時間、少なくとも1200mg/L/時間、少なくとも1300mg/L/時間、少なくとも1400mg/L/時間、少なくとも1500mg/L/時間、少なくとも1600mg/L/時間、少なくとも1700mg/L/時間、少なくとも1800mg/L/時間、少なくとも1900mg/L/時間、少なくとも2000mg/L/時間、少なくとも2100mg/L/時間、少なくとも2200mg/L/時間、少なくとも2300mg/L/時間、少なくとも2400mg/L/時間、2500mg/L/時間であるか、または10g/L/時間程度の高さである。例えば、本開示の方法に従って組換え宿主細胞によって産生された脂肪酸誘導体または他の化合物を含むマロニル-CoA由来化合物の生産性は500mg/L/時間〜2500mg/L/時間または700mg/L/時間〜2000mg/L/時間であり得る。生産性は、所定の宿主細胞培養物によって産生された、脂肪酸誘導体または脂肪酸誘導体の組み合わせまたは他の化合物を含むある特定のマロニル-CoA由来化合物を指すことができる。例えば、大腸菌などの組換え宿主細胞におけるACC変種の発現は、対応する野生型ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞と比較してより高い生産性の、脂肪酸誘導体または他の化合物を含むマロニル-CoA由来化合物の産生をもたらす。1つの態様において、高い生産性は、約0.3g/L/hから約3g/L/hまで、約10g/L/hまで、約100g/L/hまで、約1000g/L/hまでの範囲にわたる。
本明細書で使用する「全脂肪酸種」および「全脂肪酸産物」および「脂肪酸誘導体」という用語は、GC-FIDによって評価された時に、ACC変種を発現する宿主細胞によって産生され得る脂肪酸誘導体の量に関して本明細書において同義に用いられることがある。脂肪酸誘導体分析について言及する時に、例えば脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪アミン、および遊離脂肪酸を意味するために同じ用語が用いられることがある。
本明細書で使用する「グルコース利用率」という用語は、グラム/リットル/時間(g/L/hr)で報告される、単位時間あたりの培養物が使用したグルコースの量を意味する。
本明細書で使用する「炭素源」という用語は、原核生物細胞または単純真核細胞の増殖のための炭素源として使用するのに適した基質または化合物を指す。炭素源は、重合体、糖質、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチド、および気体(例えば、COおよびCO2)を含むが、これに限定されない様々な形をとってもよい。例示的な炭素源には、単糖、例えば、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、キシロース、およびアラビノース;オリゴ糖、例えば、フルクト-オリゴ糖およびガラクト-オリゴ糖;多糖、例えば、デンプン、セルロース、ペクチン、およびキシラン;二糖、例えば、スクロース、マルトース、セロビオース、およびツラノース;セルロース材料および変種、例えば、ヘミセルロース、メチルセルロース、およびナトリウムカルボキシメチルセルロース;飽和脂肪酸または不飽和脂肪酸、コハク酸塩、乳酸塩、および酢酸塩;アルコール、例えば、エタノール、メタノール、およびグリセロール、またはその混合物が含まれるが、これに限定されない。炭素源はまたグルコースなどの光合成産物でもよい。ある特定の態様において、炭素源はバイオマスである。他の態様において、炭素源はグルコースである。他の態様において、炭素源はスクロースである。他の態様において、炭素源はグリセロールである。他の態様において、炭素源は単純な炭素源である。他の態様において、炭素源は再生可能な炭素源である。
本明細書で使用する「バイオマス」という用語は、炭素源を得るのに使用した任意の生物学的材料を指す。一部の態様において、バイオマスは、生物変換に適した炭素源に処理される。他の態様において、バイオマスは、炭素源へのさらなる処理を必要としない。炭素源は、脂肪エステルを含む組成物に変換することができる。脂肪エステルは、界面活性剤、重合体、フィルム、布、色素、薬、芳香剤および着香剤、ラッカー、塗料、ワニス、樹脂およびプラスチックの中の柔軟剤、ガソリンおよび油の中の可塑剤、難燃剤、および添加物を含むが、これに限定されない多数の製品において有用である。
バイオマスの例示的な供給源は、植物物体または植物、例えば、トウモロコシ、サトウキビ、またはスイッチグラスである。バイオマスの別の例示的な供給源は、代謝廃棄物、例えば、動物物体(例えば、牛ふん肥料)である。バイオマスのさらに例示的な供給源には藻類および他の海洋植物が含まれる。バイオマスにはまた、グリセロール、発酵廃棄物、生牧草、わら、木材、下水、ごみ、セルロース性都市廃棄物、および残飯(例えば、セッケン、油、および脂肪酸)を含むが、これに限定されない工業、農業、林業、および家庭からの廃棄物が含まれる。「バイオマス」という用語はまた炭素源、例えば、糖質(例えば、単糖、二糖、または多糖)を指すことがある。
産物(例えば、脂肪酸誘導体)に関して本明細書で使用する「単離された」という用語は、細胞成分、細胞培養培地、または化学前駆体もしくは合成前駆体から分離された産物を指す。本明細書に記載の方法によって産生された脂肪酸誘導体は発酵ブロスならびに細胞質に比較的混合しない場合がある。従って、脂肪酸誘導体は細胞内または細胞外で有機相中に集まる場合がある。
本明細書で使用する「精製する」、「精製された」、または「精製」という用語は、例えば、単離または分離によって、分子が分子環境から取り出される、または単離されることを意味する。「実質的に精製された」分子は、その分子に関連する他の成分の少なくとも約60％を含まない(例えば、少なくとも約70％を含まない、少なくとも約75％を含まない、少なくとも約85％を含まない、少なくとも約90％を含まない、少なくとも約95％を含まない、少なくとも約97％を含まない、少なくとも約99％を含まない)。本明細書で使用する、これらの用語はまた、試料から汚染物質が除去されることも指す。例えば、汚染物質が除去されると、試料中の脂肪酸誘導体または他の化合物を含むマロニル-CoA由来化合物のパーセンテージを増やすことができる。例えば、脂肪酸誘導体または他の化合物を含むマロニル-CoA由来化合物が組換え宿主細胞内で産生された時に、該脂肪酸誘導体または他の化合物を含む該マロニル-CoA由来化合物を宿主細胞タンパク質の除去によって精製することができる。精製後に、試料中の脂肪酸誘導体または他の化合物を含むマロニル-CoA由来化合物のパーセンテージは上昇する。「精製する」、「精製された」、および「精製」という用語は、絶対的な純度を必要としない相対的な用語である。従って、例えば、（脂肪酸誘導体または他の化合物を含む）マロニル-CoA由来化合物が組換え宿主細胞内で産生された時に、（精製された脂肪酸誘導体または他の化合物を含む）マロニル-CoA由来化合物は、他の細胞の成分(例えば、核酸、ポリペプチド、脂質、糖質、または他の炭化水素)から実質的に分離された（脂肪酸誘導体または他の化合物を含む）マロニル-CoA由来化合物である。
本明細書で使用する、「減弱させる」という用語は、弱める、低下させる、または減らすことを意味する。例えば、ポリペプチドの活性を低下させるようにポリペプチドを改変することによって(例えば、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を改変することによって)ポリペプチドを減弱させることができる。
アセチル-CoAカルボキシラーゼ(ACC)変種
脂肪酸シンターゼ(FAS)は、アシル鎖の開始および伸長を触媒するポリペプチドの一群を示す(Marrakchi et al. (2002) Biochemical Society 30: 1050-1055)。アシルキャリアータンパク質(ACP)とFAS経路内の酵素は、産生される脂肪酸の長さ、飽和の程度、および分枝を制御する。FAS経路に含まれる酵素には、ACC、FabD、FabH、FabG、FabA、FabZ、FabI、FabK、FabL、FabM、FabB、およびFabFが含まれるが、これに限定されない。望ましい産物に応じて、任意で、これらの遺伝子の1つまたは複数が組換え宿主細胞内で減弱させられてもよく、過剰発現されてもよい(例えば、米国特許第8,658,404号;同第8,597,922号;同第8,535,916号;同第8,530,221号;同第8,372,610号;同第8,323,924号;同第8,313,934号;同第8,283,143号;同第8,268,599号;同第8,183,028号;同第8,110,670号;同第8,110,093号;および同第8,097,439を参照されたい)。
ACC酵素(E.C.6.4.1.2.)は、最初に関与する脂肪酸生合成段階であるアセチル-CoAからマロニル-CoAへのカルボキシル化を触媒する。従って、ACC酵素は、脂肪酸、脂肪酸誘導体、および他の非脂肪酸化合物を生合成するためのマロニル-CoA基質を供給する(例えば、図4を参照されたい)。ACC酵素はほとんどの生物において発見され、全原核生物の大半において、ならびにほとんどの植物および藻類の葉緑体内でマルチサブユニット酵素として現れる。原核生物ACC酵素またはACC酵素複合体は、ある決まった比で集合して複合体を構築する4つの異なる遺伝子(すなわち、accA、accB、accC、およびaccD)によってコードされる4つの異なるタンパク質を含む(Broussard et al. (2013) 前記)。遺伝子accBおよびaccCは、それぞれ、ACCサブユニットであるビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)およびビオチンカルボキシラーゼ(BC)をコードする。本開示は、驚いたことに、脂肪酸の流れを増やし、脂肪酸誘導体、例えば、脂肪酸メチルエステル(FAME)を含むマロニル-CoA由来化合物の力価および/または収率を高めるにはACC遺伝子のうちのたった1つまたは2つ(例えば、accB、accC)の変異で十分であることを示す。本開示は、accB遺伝子コード領域にある変異が有益であり、accB遺伝子およびaccC遺伝子の発現を同時に変えることも有益であることを示す。大腸菌では、accB遺伝子およびaccC遺伝子は染色体のオペロン内で隣接して見出される。本明細書において開示されたACC変種は、ACC酵素活性の増加を、他のACCサブユニット遺伝子およびポリペプチドを既に含んでいる細胞に付与するのに十分な、4つのACC遺伝子のうちの1つまたは2つの変異または発現の変化を含む。
従って、本開示は、とりわけ、細胞内で発現された時にマロニル-CoA由来化合物の高力価および/または高収率をもたらすACC変種;このようなACC変種およびその機能的断片のポリペプチド配列;ACC変種ポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド;ACC変種ポリペプチドをコードする核酸を含む組換え微生物;ACC変種ポリペプチドを発現することができる微生物;このような微生物の培養物;脂肪酸誘導体および非脂肪酸化合物を含むマロニル-CoA由来化合物を産生するためのプロセス;ならびに結果として生じた組成物に関する。特に、ACC変種ポリペプチドおよびこれらのポリペプチドを発現する微生物ならびに関連方法が本明細書において提供される。ACC変種の例は、表1および表3(下記)に示したBCCP変種である。
accBの大腸菌野生型核酸配列をSEQ ID NO:1に示した。(SEQ ID NO:1のaccBによってコードされる)BCCPの対応する大腸菌野生型アミノ酸配列をSEQ ID NO:2に示した。SEQ ID NO:2は、本開示を例示するために、改善されたACC変種ポリペプチドを作製するためのテンプレートとして使用した(実施例1、下記を参照されたい)。好ましいACC変種は、SEQ ID NO:2の野生型大腸菌のアミノ酸配列と少なくとも約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、または約99％の配列同一性を有する。ATGの後ろにある最初のアミノ酸をアミノ酸「2」と指定した。
1つの局面において、本開示は、ACC変種ポリペプチドまたはACC変種およびこれらをコードするヌクレオチド配列を提供する。異なるアミノ酸位置(または残基)に様々な変異があると、様々な脂肪酸誘導体の産生、例えば、脂肪酸メチルエステル(FAME)の産生が増加する。例えば、標的指向部位飽和変異誘発などの技法を用いて、どの位置および変異が最大の改善をもたらすのかを確かめることができる。
野生型accB遺伝子は、位置2に、アスパラギン酸またはアスパルテート(Asp、D)をコードするGATコドンを含有する。1つの態様では、SEQ ID NO:2の野生型accB遺伝子内のアミノ酸位置2を変異させることでFAME産生が改善したことが分かる。これらの変種ACCポリペプチド(すなわち、変異accB遺伝子によってコードされる)は野生型ACCと比べて脂肪エステル産生を増やすことができる。以下の表1は、accB位置2について最も良い変種をまとめたものを示す。当業者は、エステル産生の増加が、マロニル-CoA由来化合物、例えば、脂肪酸誘導体の産生を増加させる能力について変種ACCポリペプチドを試験する一手法であることを認めるだろう。例示のためだけに、(他の脂肪酸誘導体の産生、例えば、脂肪アルコール産生または脂肪アルデヒド産生または脂肪酸産生などではなく)脂肪エステル産生が用いられ、本開示を限定することが意図されない。当業者は、本開示の開示に従い、かつ本明細書において開示され、かつ当業者に一般的に利用可能な方法およびプロトコールを使用することによってマロニル-CoAに由来する他の化合物も増やすことができることを認めるだろう。
（表１）FAME産生が増加したaccB変種
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変異位置に応じて、所定の位置における1つまたは複数のアミノ酸変化は脂肪酸誘導体産生の増加ならびに非脂肪酸化合物産生の増加を生じさせる。1つの態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化は脂肪酸産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化は、脂肪酸メチルエステル(FAME)および/または脂肪酸エチルエステル(FAEE)を含むが、これに限定されない脂肪エステルの産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化は脂肪アルデヒド産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化は脂肪アルコール産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化は脂肪アミン産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化は炭化水素産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化はアルカン産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化はアルケンまたはオレフィンの産生を増加させる。さらに別の態様では、1つまたは複数のアミノ酸変化は、ヒドロキシ脂肪酸および/または二酸を含むが、これに限定されない二官能性脂肪酸の産生を増加させる。さらに別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化は二官能性脂肪アルコール産生を増加させる。さらに別の態様では、1つまたは複数のアミノ酸変化は二官能性脂肪エステルおよび/または脂肪アミンの産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化はβ-ヒドロキシ脂肪酸由来化合物の産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化は不飽和脂肪酸由来化合物の産生を増加させる。さらに別の態様では、1つまたは複数のアミノ酸変化はフラバノンおよび/またはフラボノイドの産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化はポリケチド産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化は3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)産生を増加させる。別の態様において、1つまたは複数のアミノ酸変化はマロン酸またはマロネートの産生を増加させる。
従って、所定の位置における1つまたは複数のアミノ酸変化の組み合わせが、脂肪酸誘導体および/もしくは遊離脂肪酸の産生ならびに/または脂肪酸をベースとしない化合物、例えば、フラバノンおよび/もしくはフラボノイド、ポリケチド、マロネート、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)などを増加させ得る。脂肪酸誘導体の産生に及ぼすそれぞれ個々のアミノ酸変化の影響は、脂肪酸誘導体産生または非脂肪酸化合物産生に及ぼす他の個々のアミノ酸変化の影響に相加的でもよく、相加的でなくてもよい。一部の態様において、所定の位置における1つまたは複数のアミノ酸変化の組み合わせは脂肪酸誘導体産生を増加させる。従って、所定の位置における1つまたは複数のアミノ酸変化は脂肪酸誘導体産生を増やすことができる。同様に、所定の位置における1つまたは複数のアミノ酸変化は非脂肪酸化合物を増やすことができる。
上記の表1に示したACC変種に加えて、accB遺伝子のエラープローン(error prone)ライブラリーを構築し、テンプレートとしてSEQ ID NO:1を用いてスクリーニングした。1つまたは複数の変異を導入することによって、さらなるaccB変種を特定した(実施例1、表3、下記を参照されたい)。従って、accBコード領域に、FAME力価を増加させる63個の有益な変異(表1および表3を参照されたい)を特定した。特に、アミノ酸位置1近く〜位置60近くのN末端アミノ酸領域に多数の変異が発見された。
1つの局面において、本開示は、SEQ ID NO:2と少なくとも約50％の配列同一性を有するACC変種ポリペプチドに関する。一部の態様において、変種ACCポリペプチドは、SEQ ID NO:2の野生型ACC配列と少なくとも約50％(例えば、約48％〜約52％）、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも76％、少なくとも約77％、少なくとも約78％、少なくとも約79％、少なくとも約80％、少なくとも約81％、少なくとも約82％、少なくとも約83％、少なくとも約84％、少なくとも約85％、少なくとも約86％、少なくとも約87％、少なくとも約88％、少なくとも約89％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも99％の配列同一性を示し、本明細書に記載のように有用な特徴および/または特性をもたらす1つまたは複数の置換も含む。本開示の1つの局面において、改善された特徴を有するACC変種ポリペプチドはSEQ ID NO:6と約100％の配列同一性を有する。本開示の別の局面において、ACC変種ポリペプチドは、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、およびSEQ ID NO:90を含むがこれに限定されないSEQ ID NOのいずれか1つと、約100％の配列同一性を有する。
関連する局面において、ACC変種ポリペプチドは、SEQ ID NO:5と100％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。別の関連する局面において、ACC変種ポリペプチドは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:89を含むがこれに限定されないSEQ ID NOのいずれか1つと、約100％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされる。
別の局面において、本開示は、SEQ ID NO:6と少なくとも約50％の配列同一性を有する、改善されたACC活性を有するACC変種ポリペプチドに関する。一部の態様において、ACC変種ポリペプチドは、SEQ ID NO:6のACC変種配列と少なくとも約50％(例えば、約48％〜約52％）、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも76％、少なくとも約77％、少なくとも約78％、少なくとも約79％、少なくとも約80％、少なくとも約81％、少なくとも約82％、少なくとも約83％、少なくとも約84％、少なくとも約85％、少なくとも約86％、少なくとも約87％、少なくとも約88％、少なくとも約89％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも99％の配列同一性を有し、本明細書に記載のように改善された特徴および/または特性をもたらす1つまたは複数の置換も含む。別の局面において、本開示は、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、およびSEQ ID NO:90を含むがこれに限定されないSEQ ID NOのいずれか1つと少なくとも約50％の配列同一性を有する、ACC変種ポリペプチドに関する。一部の態様において、ACC変種ポリペプチドは、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、およびSEQ ID NO:90を含むがこれに限定されないSEQ ID NOのいずれか1つのACC配列と少なくとも約50％(例えば、約48％〜約52％）、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも76％、少なくとも約77％、少なくとも約78％、少なくとも約79％、少なくとも約80％、少なくとも約81％、少なくとも約82％、少なくとも約83％、少なくとも約84％、少なくとも約85％、少なくとも約86％、少なくとも約87％、少なくとも約88％、少なくとも約89％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも99％の配列同一性を有し、本明細書に記載のように改善された特徴および/または特性をもたらす1つまたは複数の置換も含む。
別の局面において、本開示は、SEQ ID NO:5のACC変種配列と少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも76％、少なくとも約77％、少なくとも約78％、少なくとも約79％、少なくとも約80％、少なくとも約81％、少なくとも約82％、少なくとも約83％、少なくとも約84％、少なくとも約85％、少なくとも約86％、少なくとも約87％、少なくとも約88％、少なくとも約89％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むACC変種ポリペプチドに関する。一部の態様において、核酸配列は、本明細書に記載のように改善された特徴および/または特性をもたらす1つまたは複数の置換を含むACC変種をコードする。他の態様において、変種ACC核酸配列は大腸菌などの生物に由来する。別の局面において、本開示は、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:89を含むがこれに限定されないSEQ ID NOのいずれか1つのACC変種配列と、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも76％、少なくとも約77％、少なくとも約78％、少なくとも約79％、少なくとも約80％、少なくとも約81％、少なくとも約82％、少なくとも約83％、少なくとも約84％、少なくとも約85％、少なくとも約86％、少なくとも約87％、少なくとも約88％、少なくとも約89％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも99％の配列同一性を有する核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含むACC変種ポリペプチドに関する。一部の態様において、核酸配列は、本明細書に記載のように改善された特徴および/または特性をもたらす1つまたは複数の置換を含むACC変種をコードする。他の態様において、ACC変種核酸配列は大腸菌などの生物に由来する。
別の局面において、本開示は、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:83、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:87、およびSEQ ID NO:89を含むがこれに限定されないSEQ ID NOのいずれか1つに対応する核酸の実質的に全長にわたってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によってコードされるアミノ酸配列を含むACC変種ポリペプチドに関する。一部の態様において、核酸配列は、大腸菌などの生物に由来するACC変種核酸配列をコードする。関連する局面において、本開示は、SEQ ID NO:1と少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも76％、少なくとも約77％、少なくとも約78％、少なくとも約79％、少なくとも約80％、少なくとも約81％、少なくとも約82％、少なくとも約83％、少なくとも約84％、少なくとも約85％、少なくとも約86％、少なくとも約87％、少なくとも約88％、少なくとも約89％、少なくとも約90％、少なくとも約91％、少なくとも約92％、少なくとも約93％、少なくとも約94％、少なくとも約95％、少なくとも約96％、少なくとも約97％、少なくとも約98％、または少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列によってコードされるACC変種を提供し、本明細書に開示された1つまたは複数の置換を含む。
本開示は、accB遺伝子のみのコード領域の変異が有益であるが(前記)、accBおよびaccC両遺伝子の同時発現変化も有益であることを示す。大腸菌では、accB遺伝子およびaccC遺伝子は染色体のオペロン内で隣接して見出される。従って、accBCオペロンの発現ライブラリーを構築し、野生型accBCプロモーターよりACC活性が改善した変種かどうかスクリーニングした(すなわち、細胞内でのマロニル-CoA由来化合物産生の増加によって測定した)。表2(前記)は、以下に示したaccBC T5プロモーター配列(下線の領域はプロモーターの-35および-10の位置を示す)に基づく、最も良い変種のまとめを示す。
大腸菌野生型accBCプロモーター(PaccBC)領域のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:91):
Figure 0006837089
バクテリオファージT5プロモーター(PT5)のヌクレオチド配列(SEQ ID NO:92):
Figure 0006837089
（表２）FAME産生が増加したaccBC T5プロモーター変種
Figure 0006837089
ライブラリーは、天然accBCプロモーター領域を、ランダム変異を導入するように縮重ヌクレオチドを通常含有する任意の適切なプロモーターライブラリー(例えば、ハイブリッドプロモーター、人工プロモーターまたは合成プロモーター、異なる生物に由来するプロモーター、同じ生物にある異なる遺伝子に由来するプロモーター、市販のプロモーターなど)と交換するプライマーを用いて構築することができる。ある特定の態様において、プロモーターは、発生により調節されるプロモーター、細胞小器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または細胞特異的プロモーターである。全ての適切なプロモーターが本明細書において意図される。他の態様において、プロモーターを異なる大腸菌プロモーターまたは異種プロモーターと交換する、天然プロモーターを変異させる、accBおよびaccCのリボソーム結合部位(RBS)を別々にまたは一緒に変異させる、accBCプロモーターとaccB遺伝子との間にある非翻訳領域(UTR)を変える、染色体内で、またはプラスミド上でaccBCオペロンを重複させる、染色体accBCオペロンを、プラスミドによってコードされるオペロンと交換する、accBCプロモーター領域に結合する転写因子を操作することを含むが、これに限定されない当業者に公知の非常に多くの技法を用いてaccBCオペロンの発現を変えることができる。1つの例示的な態様では、バクテリオファージT5プロモーターが用いられる。1つの態様では、PCR法を用いてプロモーターライブラリーを適切なホモロジー領域につなぎ合わせることができ、次いで、細菌染色体に組み込んで(実施例2を参照されたい)、天然のaccBCプロモーターと取り替えることができる。実施例2(下記)に示したように発現ライブラリーをスクリーニングすることができる。
ACC変種の改善された特性
例示的なモデルとして大腸菌内での発現を用いて、他の遺伝子を過剰発現させる必要なく高いパーセントのマロニル-CoA由来化合物、例えば、FAMEを産生するように、変異誘発を介して野生型BCCP(SEQ ID NO:1および2)を遺伝学的に変えた(実施例1、下記を参照されたい)。accBCオペロンを遺伝学的に変えることによって同じことを成し遂げた(実施例2、下記を参照されたい)。従って、野生型BCCPの変種は大腸菌などの組換え宿主細胞内で発現された時に、望ましい産物の高い力価および収率をもたらす。すなわち、野生型BCCPの変種は、宿主細胞(すなわち、組換え細胞)内で発現された時に、(ACC変種を発現しない)野生型宿主細胞と比較してより多い量のマロニル-CoA由来化合物、例えば、脂肪酸誘導体を産生する。野生型ACCは天然タンパク質複合体であり、通常、その活性のために、ビオチンカルボキシラーゼ(BC)、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)、およびカルボキシルトランスフェラーゼ(CT)を形成する2つのタンパク質を含む4つ全てのタンパク質を必要とする。しかしながら、本開示の変種BCCPは、マロニル-CoA由来化合物の産生を増やす能力を細胞に付与するように見える。理論に拘束されるものではないが、これは、天然ACCを発現する細胞にACC活性増加を直接的または間接的に付与する変種BCCPの直接的な結果であり得ることが意図される。例えば、BCCP変種ポリペプチドは、宿主細胞内で発現された時に、野生型細胞と比較して約100％〜約650％のFAMEを産生した(表1、前記、および表3、下記を参照されたい)。これは、観察されたFAME力価が、野生型細胞によって通常産生されるFAME力価の650％まで及んだことを意味する。別の例では、accBCオペロンにおける変化が、宿主細胞内で発現された場合に野生型細胞と比較して約200％〜約350％のFAME力価を産生する、変種BCCPポリペプチドにつながる(表2、前記を参照されたい)。
1つの態様において、ACC変種ポリペプチドは、野生型ACC酵素と比較して、増加した量の脂肪エステル、例えば、脂肪酸メチルエステル(FAME)および脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アミン、脂肪アルデヒド、脂肪アルコール、短鎖アルコールおよび長鎖アルコール、炭化水素、ケトン、アルカン、末端オレフィン、内部オレフィン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、ならびに不飽和脂肪酸誘導体を含むが、これに限定されない脂肪酸誘導体を産生すると予想される。別の態様において、ACC変種ポリペプチドは、野生型ACC酵素と比較して、増加した量の脂肪酸をベースとしない化合物(例えば、フラバノンおよびフラボノイド、ポリケチド、3-ヒドロキシプロピオン酸、マロネートなど)を産生すると予想される。当業者は、ACC変種によって産生することができる最終産物が、マロニル-CoAのアップレギュレーションによって影響を受ける様々な生化学経路に応じて、脂肪酸誘導体および非脂肪酸化合物を含むいくつかの化合物クラスを含むと認めるだろう。図4は、可能性のある化合物の非網羅的な例を示す。
ACC変種を作る方法
本開示の方法の実施では、スクリーニング用の組換え宿主細胞の一群を調製するために変異誘発が用いられる。典型的には、組換え宿主細胞は、ACC変種ポリペプチドのオープンリーディングフレーム、例えば、変種accB遺伝子と、機能的に連結された制御配列、および/または機能的に連結された変種accBCプロモーターを有するaccB遺伝子を含む1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む。本開示の方法の実施において有用な、変種BCCPポリペプチドを含む変種ACCポリペプチドの非常に多くの例が本明細書において説明される。本開示の方法の実施において有用な制御配列の例も本明細書において説明される。このようなポリヌクレオチド配列の変異誘発は、遺伝子工学的技法、例えば、部位特異的変異誘発、ランダム化学変異誘発、エキソヌクレアーゼIII欠失法、または標準的なクローニング法を用いて行うことができる。または、ポリヌクレオチド配列中の変異は化学合成または改変手順を用いて作り出すことができる。当業者は、本明細書において用いられるプロトコールおよび手順が変更可能であり、このような変更が本開示のバリエーションに従うと認めるだろう。例えば、方法の工程がある特定の順序で説明された時、工程の順序づけは変更することができる、および/または同時にもしくは連続して行うことができる。
変異誘発法は当技術分野において周知であり、例えば、以下を含む。エラープローンPCR（Leung et al. (1989) Technique 1: 11-15;およびCaldwell et al. (1992) PCR Methods Applic. 2:28-33）では、PCRは、PCR産物の全長に沿って高い点変異率が得られるようにDNAポリメラーゼのコピー忠実度が低い条件下で行われる。簡単に述べると、このような手順では、PCR産物の全長に沿って高い点変異率を実現するために、変異誘発しようとするポリヌクレオチドを、PCRプライマー、反応緩衝液、MgCl2、MnCl2、Taqポリメラーゼ、および適切な濃度のdNTPと混合する。例えば、反応は、20fmoleの変異誘発しようとする核酸、30pmoleの各PCRプライマー、50mM KCl、10mM Tris HCl(pH8.3)、ならびに0.01％ゼラチン、7mM MgCl2、0.5mM MnCl2、5ユニットのTaqポリメラーゼ、0.2mM dGTP、0.2mM dATP、1mM dCTP、および1mM dTTPを含む反応緩衝液を用いて行うことができる。PCRは、94℃1分、45℃1分、および72℃1分の30サイクルで行うことができる。これらのパラメータは適宜変更できることが理解されるだろう。次いで、変異誘発ポリヌクレオチドをクローニングして適切なベクターに入れ、変異誘発ポリヌクレオチドによってコードされる影響を受けたポリペプチドの活性を評価する。変異誘発はまた、関心対象の任意のクローニングDNAに部位特異的変異を作製するためにオリゴヌクレオチド指定変異誘発（Reidhaar-Olson et al. (1988) Science 241 :53-57）を用いて行うこともできる。簡単に述べると、このような手順では、クローニングDNAに導入しようとする1つまたは複数の変異を有する複数の二本鎖オリゴヌクレオチドを合成および集合して、変異誘発しようとするクローニングDNAにする。変異誘発DNAを含有するクローンを回収し、影響を受けたポリペプチドの活性を評価する。ポリヌクレオチド配列変種を作製するための別の変異誘発法はアセンブリ(assembly)PCRである。アセンブリPCRは、小さなDNA断片の混合物からPCR産物を構築することを伴う。ある反応の産物が別の反応の産物をプライミングして、多数の異なるPCR反応が同じバイアル中で同時に行われる。アセンブリPCRは、例えば、米国特許第5,965,408号に記載されている。ポリヌクレオチド配列変種を作製するためのさらに別の変異誘発法は、セクシャル(sexual)PCR変異誘発（Stemmer (1994) PNAS, USA 91: 10747-10751）である。セクシャルPCR変異誘発では、強制的な相同組換えが、配列相同性に基づくDNA分子のランダム断片化の結果として、異なるが非常に関連性のあるDNA配列のDNA分子間でインビトロで発生する。この後に、PCR反応におけるプライマー伸長によってクロスオーバーが固定される。
インビボ変異誘発によって、ACC変種を作り出すこともできる。一部の態様において、DNA修復経路の1つまたは複数に変異を有する細菌株、例えば、大腸菌株の中でポリヌクレオチド配列を増殖させることによって核酸配列中にランダム変異を生じさせる。このような「ミューテーター(mutator)」株のランダム変異率は野生型株のランダム変異率より高い。これらの株の1つにおいてDNA配列を増殖させると最終的にDNAにランダム変異が生じる。インビボ変異誘発に使用するのに適したミューテーター株は、例えば、PCT国際公報番号WO91/16427に記載されている。
カセット変異誘発を用いて、ACC変種を作製することもできる。カセット変異誘発では、二本鎖DNA分子の小さな領域が、開始ポリヌクレオチド配列と異なる合成オリゴヌクレオチド「カセット」で置換される。このオリゴヌクレオチドは、多くの場合、開始ポリヌクレオチド配列の完全および/または部分的にランダム化されたバージョンを含有する。カセット変異誘発には多くの用途、例えば、カセット変異誘発による変異体タンパク質の調製（Richards, J. H. (1986) Nature 323:187; Ecker et al. (1987) J. Biol. Chem. 262:3524-3527）;個々のコドンを挿入または置換するためのコドンカセット変異誘発（Kegler-Ebo et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22(9): 1593-1599）;制御配列(例えば、リボソーム結合部位)を含む非コードポリヌクレオチド配列のランダム化による変種ポリヌクレオチド配列の調製(例えば、Barrick et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22(7): 1287-1295; Wilson et al. (1994) Biotechniques 17:944-953を参照されたい)がある。
再帰的アンサンブル変異誘発(recursive ensemble mutagenesis)（Arkin et al. (1992) PNAS, USA 89:7811-7815）を用いてポリヌクレオチド配列変種を作製することもできる。再帰的アンサンブル変異誘発は、アミノ酸配列が異なるメンバーを有する表現型的に関連する変異体の多様な集団を作製するために開発されたタンパク質工学(すなわち、タンパク質変異誘発)用のアルゴリズムである。この方法では、連続した回のコンビナトリアルカセット変異誘発を制御するためにフィードバック機構が用いられる。ACCのポリヌクレオチド配列変種を作製するために、指数関数的アンサンブル変異誘発（Delegrave et al. (1993) Biotech. Res. 11: 1548-1552）も使用することができる。指数関数的アンサンブル変異誘発は、高いパーセンテージのユニークかつ機能的な変異体を含むコンビナトリアルライブラリーを作製するためのプロセスであり、それぞれの変化した位置にある、機能的タンパク質につながるアミノ酸を特定するために小さな残基グループが同時にランダム化される。ランダム変異誘発および部位特異的変異誘発も使用することができる（Arnold (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:450-455）。
さらに、標準的なインビボ変異誘発法を使用することができる。例えば、ACCポリペプチドのオープンリーディングフレームを含む1つまたは複数のポリヌクレオチド配列ならびに機能的に連結された制御配列を含む宿主細胞を放射線(例えば、UV光もしくはX線)への曝露または化学薬品(例えば、エチル化剤、アルキル化剤、もしくは核酸類似体)への曝露を介して変異誘発することができる。一部の宿主細胞タイプ、例えば、細菌、酵母、および植物では、インビボ変異誘発のために転位エレメントも使用することができる。
ACC関連ポリペプチドをコードする1つまたは複数のポリヌクレオチド配列が変異誘発されると、一般的に、改変および改善された生物学的機能を示すACCポリペプチド産物が発現される。例えば、accBを含む1つまたは複数のポリヌクレオチド配列が変異誘発されると、一般的に、改変および改善された生物学的機能、例えば、向上したACC活性を示すBCCPポリペプチド産物が発現される。BCCPをコードするオープンリーディングフレームおよび機能的に連結された制御配列を含む1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を変異誘発することによって組換え微生物の一群を調製した場合、結果として生じた変異誘発されたポリヌクレオチド配列から発現されたタンパク質は、向上したACC生物学的機能を示す。従って、変異accBポリヌクレオチドを発現するのに有効な条件下で組換え微生物が培養されると、マロニル-CoA由来化合物、例えば、脂肪酸誘導体もしくは他の化合物の改善された収率、および/または(鎖の長さ、飽和などの点で)脂肪酸誘導体もしくは他の化合物の改変された混合物を含む改善されたその組成物が観察される。
ホットスポット
本開示はまた、少なくとも部分的に、変種BCCPポリペプチドを含む変種ACCポリペプチド間で、ある特定の構造的に保存されている「ホットスポット」が特定されたことに基づいている。ホットスポットは、FAMEなどの脂肪酸誘導体の高力価または非脂肪酸化合物の高力価につながる多数の変異が観察された領域である。特に、このような領域は変種BCCPポリペプチドにおいて認められる。すなわち、ホットスポットは、(例えば、最も多い数の変異を示した)アミノ酸位置1〜アミノ酸位置60近くのN末端アミノ酸領域において観察された。
モチーフ
本開示はまた、少なくとも部分的に、変種BCCPポリペプチドを含む変種ACCポリペプチド間で、ある特定の構造的に保存されているモチーフが特定されたことに基づいている。ビオチンプロテインリガーゼ(EC6.3.4.15)はホロカルボキシラーゼシンセターゼとも知られ、ビオチン補欠分子族と、ACCのBCCPサブユニット特定のリジンとの共有結合を触媒する。BCCP型タンパク質にはビオチン結合部位に保存モチーフがある。このモチーフには、ビオチン化リジン残基であるK(リジン)が含まれる。様々な細菌種のBCCPポリペプチドには、この保存モチーフがある。このことは、この領域に何らかの変異があると機能が低下する可能性があることを示唆している。このモチーフのコンセンサス配列を以下に示した。Kはビオチン化リジンである。
(L/I/V)E(A/V)MK(M/L)
図2は、大腸菌(SEQ ID NO:97(一部); SEQ ID NO:2(全体); アクセッション番号NP_417721)、ラクトバチルス・ブレビス(Lactobacillus brevis)(SEQ ID NO:98(一部); SEQ ID NO:104(全体); アクセッション番号WP_011667655)、ステノトロフォモナス・マルトフィリア(Stenotrophomonas maltophilia)(SEQ ID NO:99(一部); SEQ ID NO:105(全体); アクセッション番号AIL09846)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)(SEQ ID NO:100(一部); SEQ ID NO:106(全体); アクセッション番号AE016246_3)、枯草菌(Bacillius subtilis)(SEQ ID NO:101(一部); SEQ ID NO:107(全体); アクセッション番号NP_390315)、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)(SEQ ID NO:102(一部); SEQ ID NO:108(全体); アクセッション番号WP_011013826)、およびサッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)(SEQ ID NO:103(一部); SEQ ID NO:109(全体);アクセッション番号AAA20073)を含む7つの異なる細菌種に由来するBCCPアミノ酸配列の一部のアラインメントを示す。全アミノ酸配列同一性が約10％パーセント〜約66％パーセントであるのにもかかわらず、このモチーフは7つ全ての種にわたって保存されている(図2の四角で囲んだ部分を参照されたい)。例えば、ラクトバチルス・ブレビスに由来するBCCPは大腸菌と比較して28％の同一性を示した。ステノトロフォモナス・マルトフィリアに由来するBCCPは大腸菌と比較して55％の同一性を示した。シュードモナス・プチダに由来するBCCPは大腸菌と比較して66％の同一性を示した。枯草菌に由来するBCCPは大腸菌と比較して40％の同一性を示した。コリネバクテリウム・グルタミクムおよびサッカロミセス・セレビシエに由来するBCCPは大腸菌と比較して10％の同一性を示した。これにより、多岐にわたる種でさえ、このモチーフは保存されていることが裏付けられた。しかしながら、場合によっては、BCCPポリペプチドは様々な種にわたって約85％同一性〜約100％同一性の高いアミノ酸配列同一性を有する。例えば、エシェリキア・アルベルチ(Escherichia alberti)に由来するBCCPは大腸菌と約98％同一である。シゲラ・フレックスネリに由来するBCCPは大腸菌と約93％同一である。クレブシエラ・ニューモニア(Klebsiella pneumonia)は大腸菌と約85％同一である。
宿主細胞および宿主細胞培養物
本開示を考慮すれば、本明細書において意図される態様はいずれも、1種類または複数種のACC変種をコードする1つまたは複数の核酸配列の導入を介して遺伝子組換えすることができる任意の宿主細胞または微生物を用いて実施され得ることが理解されるはずである。従って、本開示の組換え微生物は宿主細胞として機能し、改善された/増加したACC活性および/または改善された/増加したマロニル-CoA由来化合物産生を付与する変種ACCポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームと、宿主細胞内でのACCポリペプチド発現を容易にする機能的に連結された制御配列を含む1つまたは複数のポリヌクレオチド配列を含む。1つの態様において、改善された/増加したACC活性および/または改善された/増加したマロニル-CoA由来化合物産生を付与するポリペプチドはBCCPの変種または変異体である。別の態様において、改善された/増加したACC活性および/または改善された/増加したマロニル-CoA由来化合物産生を付与するポリペプチドは、accBCオペロンの発現の変化に起因する、改善されたBCCPもしくは他の改善されたACCポリペプチドまたはその組み合わせである。本開示の組換え宿主細胞内で、オープンリーディングフレームコード配列および/または制御配列は、BCCPポリペプチドの対応する野生型コード配列と比べて改変されてもよい。変種BCCPを含む変種ACCポリペプチドを発現するのに有効な条件下で炭素源の存在下で、ACC変種を発現する宿主細胞(すなわち、組換え宿主細胞)を培養することによって脂肪酸誘導体組成物が産生される(図1および図3を参照されたい)。変異体または変種ACCポリペプチドが発現されると、脂肪酸、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪アルデヒド、二官能性脂肪酸誘導体、二酸、炭化水素、ケトン、アルカン、アルケンもしくはオレフィン、および/またはこれらに類するものの収率が増加した脂肪酸誘導体組成物が産生される。1つの態様において、変異体または変種ACCポリペプチド、例えば、変種BCCPポリペプチドが発現されると、FAMEおよび/またはFAEEを含む脂肪エステル組成物の収率が増加する。非脂肪酸化合物は、変種BCCPを含む変種ACCポリペプチドを発現するのに有効な条件下で炭素源の存在下で、ACC変種を発現する宿主細胞(すなわち、組換え宿主細胞)を培養することによって産生される(図4を参照されたい)。変異体または変種ACCポリペプチドが発現すると、ポリケチド、フラバノン、フラボノイド、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、マロネートなどを含む、高収率の非脂肪酸化合物が産生される(図4を参照されたい)。
本開示の宿主細胞または微生物には、酵素活性に対する特定の変異の効率を試験するために、遺伝子変化を含むように遺伝子操作された宿主株または宿主細胞(すなわち、組換え細胞または組換え微生物)が含まれる。元々の宿主細胞にどのような天然酵素経路が存在するかに合わせて、様々な任意の遺伝子操作および遺伝子変化を宿主細胞に区別なく使用することができる。1つの態様において、ACC変種を試験するために宿主株を使用することができる。発酵成分、炭素源(例えば、供給材料)、温度、圧力、低い培養汚染条件、および酸素濃度を含む培養条件を含むが、これに限定されない特定の変数および培養環境を試験するために、宿主株は多数の遺伝子変化を含んでもよい。
1つの態様において、BD64と呼ぶ宿主株が用いられる。BD64は、任意のfadEおよびfhuA欠失を含む大腸菌株MG1655をベースとする。アシル-CoAデヒドロゲナーゼ(FadE)は脂肪酸を代謝するのに重要な酵素である。アシル-CoAデヒドロゲナーゼ(FadE)は、脂肪酸(アシル-CoA)の長鎖を分解してアセチル-CoA分子にするプロセスである、脂肪酸利用における2番目の段階(β酸化)を触媒する。さらに具体的には、細菌における脂肪酸分解β酸化サイクルの2番目の段階は、FadEによって触媒されるアシル-CoAから2-エノイル-CoAへの酸化である。大腸菌がFadEを欠いている時、炭素源として脂肪酸上で増殖することができないが、酢酸上で増殖することができる。どの鎖の長さの脂肪酸も利用できないことは、fadE株の報告された表現型、すなわち、FadE機能が破壊されたfadE変異株と一致している。エステルシンターゼによって全てのアシル-CoAが脂肪エステルに効率的に変換できるように、この経路の中間体であるアシル-CoAが細胞に蓄積することができることを確実なものにするために、任意でfadE遺伝子をノックアウトまたは減弱させることができる。しかしながら、fadE減弱は、炭素源として糖が用いられる場合には任意である。なぜなら、このような条件下ではFadE発現は抑制される可能性が高く、従って、FadEは少量でしか存在せず、アシル-CoA基質においてエステルシンターゼと効率的に競合できない可能性があるからである。FadEはカタボライトリプレッションにより抑制される。大腸菌および他の多くの微生物は脂肪酸より糖を消費する方を好む。そのため、両供給源とも利用可能な場合、fadレギュロンを抑制することで糖が最初に消費される(D. Clark, J Bacteriol. (1981) 148(2):521-6)を参照されたい)。さらに、糖が存在しないとFadE発現が誘導される。fadレギュロンによって発現されるタンパク質(FadEを含む)はアップレギュレートされ、アシル-CoAにおいて効率的に競合するので、アシル-CoA中間体はβ酸化経路から失われる可能性がある。従って、fadE遺伝子をノックアウトまたは減弱させることが有益な場合がある。多くの炭素源は糖をベースとしているので、FadEを減弱させることは任意である。遺伝子fhuAは、大腸菌の外膜にあるエネルギー共役輸送体(energy-coupled transporter)および受容体であるTonAタンパク質をコードする(V. Braun (2009) J Bacteriol. 191(11):3431-3436)。この欠失は任意である。fhuAが欠失されると細胞はファージ攻撃に対する耐性が高くなり、これは、ある特定の発酵条件において有益な場合がある。従って、発酵作業中に潜在的な汚染を受ける可能性が高い宿主細胞においてfhuAを欠失させることが望ましい場合がある。
宿主株BD64(前記)はまた、以下の遺伝子:大腸菌に由来するfadR、ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)に由来するfabA(NP_460041)、ネズミチフス菌に由来するfabD(NP_460164)、ネズミチフス菌に由来するfabG(NP_460165)、ネズミチフス菌に由来するfabH(NP_460163)、ビブリオ・コレラ(Vibrio cholera)に由来するfabV(Vibrio cholera)(YP_001217283)、およびクロストリジウム・アセトブチリカム(Clostridium acetobutylicum)に由来するfabF(NP_350156)の1つまたは複数の任意の過剰発現も含む。脂肪酸生合成における酵素および制御因子をコードする、これらの遺伝子の1つまたは複数の過剰発現は、様々な培養条件下で脂肪酸誘導体化合物の力価をさらに高めるのに役立つことができる。
別の態様において、脂肪酸誘導体を産生するための例示的な宿主細胞として野生型大腸菌株MG1655またはW3110が用いられる。同様に、これらの宿主細胞は、様々な培養条件下で脂肪酸誘導体化合物の力価を増やすことができる1種類または複数種の生合成遺伝子(すなわち、脂肪酸生合成の酵素および制御因子をコードする)の任意の過剰発現を提供する。遺伝子変化には、大腸菌に由来するfadR、ネズミチフス菌に由来するfabA(NP_460041)、ネズミチフス菌に由来するfabD(NP_460164)、ネズミチフス菌に由来するfabG(NP_460165)、ネズミチフス菌に由来するfabH(NP_460163)、ビブリオ・コレラに由来するfabV(YP_001217283)、およびクロストリジウム・アセトブチリカムに由来するfabF(NP_350156)が含まれる。
一部の態様において、変種ACCポリペプチドを発現するのに用いられる宿主細胞または微生物は、1つまたは複数の特定の脂肪酸誘導体、例えば、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪アルデヒド、二官能性脂肪酸誘導体、二酸など(図1および図3を参照されたい)ならびにアルカン、アルケンまたはオレフィン、およびケトンの産生を増やすことができる、ある特定の酵素活性を含む遺伝子をさらに発現する。1つの態様において、宿主細胞は、脂肪酸を産生するために、チオエステラーゼ遺伝子を過剰発現させることによって増やすことができる、チオエステラーゼ活性(E.C.3.1.2.*またはE.C.3.1.2.14またはE.C.3.1.1.5)を有する。別の態様において、宿主細胞は、脂肪エステルを産生するためにエステルシンターゼ活性(E.C.2.3.1.75)を有する。別の態様において、宿主細胞は、脂肪アルコールを産生するために、アシル-ACPレダクターゼ(AAR)(E.C.1.2.1.80)活性および/またはアルコールデヒドロゲナーゼ活性(E.C.1.1.1.1.)および/または脂肪アルコールアシル-CoAレダクターゼ(FAR)(E.C.1.1.1.*)活性および/またはカルボン酸レダクターゼ(CAR)(EC1.2.99.6)活性を有する。別の態様において、宿主細胞は、脂肪アルデヒドを産生するためにアシル-ACPレダクターゼ(AAR)(E.C.1.2.1.80)活性を有する。別の態様において、宿主細胞は、アルカンおよびアルケンを産生するためにアシル-ACPレダクターゼ(AAR)(E.C.1.2.1.80)活性およびデカルボニラーゼ活性を有する。別の態様において、宿主細胞は、脂肪アルコールを産生するために、アシル-CoAレダクターゼ(E.C.1.2.1.50)活性、アシル-CoAシンターゼ(FadD)(E.C.2.3.1.86)活性、およびチオエステラーゼ(E.C.3.1.2*またはE.C.3.1.2.14またはE.C.3.1.1.5)活性を有する。別の態様において、宿主細胞は、脂肪エステルを産生するために、エステルシンターゼ活性(E.C.2.3.1.75)、アシル-CoAシンターゼ(FadD)(E.C.2.3.1.86)活性、およびチオエステラーゼ(E.C.3.1.2.*またはE.C.3.1.2.14またはE.C.3.1.1.5)活性を有する。別の態様において、宿主細胞は、ケトンを産生するためにOleA活性を有する。別の態様において、宿主細胞は、内部オレフィンを産生するためにOleBCD活性を有する。別の態様において、宿主細胞は、脂肪アルコールを産生するために、アシル-ACPレダクターゼ(AAR)(E.C.1.2.1.80)活性およびアルコールデヒドロゲナーゼ活性(E.C.1.1.1.1.)を有する。別の態様において、宿主細胞は、末端オレフィンを作るために、チオエステラーゼ(E.C.3.1.2.*またはE.C.3.1.2.14またはE.C.3.1.1.5)活性およびデカルボキシラーゼ活性を有する。微生物および微生物細胞における酵素活性の発現は、参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第8,097,439号;同第8,110,093号;同第8,110,670号;同第8,183,028号;同第8,268,599号;同第8,283,143号;同第8,232,924号;同第8,372,610号;および同8,530,221第によって開示される。
他の態様において、変種ACCポリペプチドを発現するために用いられる宿主細胞または微生物は、1種類または複数種の特定の脂肪酸誘導体、例えば、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪アルデヒド、二官能性脂肪酸誘導体、二酸など(図1を参照されたい)を産生するために、アップレギュレートまたは過剰発現されるある特定の天然酵素活性を含む。1つの態様において、宿主細胞は、脂肪酸を産生するために、チオエステラーゼ遺伝子を過剰発現させることによって増やすことができる天然チオエステラーゼ(E.C.3.1.2.*またはE.C.3.1.2.14またはE.C.3.1.1.5)活性を有する。
本開示は、変種BCCPポリペプチド配列を含む変種ACCポリペプチド配列を発現する宿主株または微生物を含む。宿主細胞内で発現された時に、高力価の、脂肪エステルを含む脂肪酸誘導体をもたらす変種BCCPポリペプチド配列の例には、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:80、SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:88、およびSEQ ID NO:90が含まれるが、これに限定されない。
組換え宿主細胞は、脂肪エステル、例えば、脂肪酸メチルエステル(FAME)もしくは脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、脂肪アルデヒド、二官能性脂肪酸誘導体、二酸、アルカン、オレフィン、炭化水素など;または非脂肪酸化合物、例えば、フラバノン、フラボノイド、ポリケチド、マロネート、もしくは3-ヒドロキシプロピオン酸を産生し得る。脂肪酸誘導体または他の化合物は典型的には培養培地から回収される、および/または宿主細胞から単離される。1つの態様において、脂肪酸誘導体または他の化合物は培養培地(細胞外)から回収される。別の態様において、脂肪酸誘導体または他の化合物は宿主細胞(細胞内)から単離される。別の態様において、脂肪酸誘導体または他の化合物は培養培地から回収され、宿主細胞から単離される。特定の脂肪酸誘導体の分布ならびに脂肪酸誘導体組成物の成分の鎖の長さおよび飽和の程度を確かめるために、当技術分野において公知の方法、例えば、GC-FIDを用いて、宿主細胞によって産生された脂肪酸誘導体組成物を分析することができる。同様に、当技術分野において周知の方法によって他の化合物を分析することができる。
微生物として機能する宿主細胞の例には、エシェリキア属、バチルス属、ラクトバチルス属、ザイモモナス属、ロドコッカス属、シュードモナス属、アスペルギルス属、トリコデルマ属、ニューロスポラ属、フザリウム属、フミコラ属、リゾムコール属、クリベロミセス属、ピキア属、ムコール属、ミセリオフトラ属、ペニシリウム属、ファネロカエテ属、ヒラタケ属、ホウロクタケ属、クリソスポリウム属、サッカロミセス属、ステノトロフォモナス属、シゾサッカロミセス属、ヤロウイア属、またはストレプトミセス属に由来する細胞が非限定的に含まれる。いくつかの態様において、宿主細胞はグラム陽性細菌細胞である。他の態様において、宿主細胞はグラム陰性細菌細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は大腸菌細胞である。他の態様において、他の態様において、宿主細胞は、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）細胞、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）細胞、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）細胞、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus lichenoformis）細胞、バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）細胞、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）細胞、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）細胞、バチルス・プミルス（Bacillus pumilis）細胞、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）細胞、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）細胞、バチルス・メガテリウム（Bacillus megaterium）細胞、バチルス・サブティリス（Bacillus subtilis）細胞、またはバチルス・アミロリクエファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）細胞である。
さらに他の態様において、宿主細胞は、トリコデルマ・コニンギ（Trichoderma koningii）細胞、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）細胞、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）細胞、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）細胞、アスペルギルス・アワモリ（Aspergillus awamori）細胞、アスペルギルス・フミガータス（Aspergillus fumigates）細胞、アスペルギルス・フェチダス（Aspergillus foetidus）細胞、アスペルギルス・ニディランス（Aspergillus nidulans）細胞、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）細胞、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）細胞、ヒューミコラ・インソレンス（Humicola insolens）細胞、ヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginose）細胞、ロドコッカス・オパクス（Rhodococcus opacus）細胞、リゾムコール・ミエヘイ（Rhizomucor miehei）細胞、またはムコール・ミエヘイ（Mucor michei）細胞である。さらに他の態様において、宿主細胞は、ストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）細胞またはストレプトミセス・ムリヌス（Streptomyces murinus）細胞である。さらに他の態様において、宿主細胞はアクチノミセス（Actinomycetes）細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞はサッカロミセス・セレビシエ細胞である。
他の態様において、宿主細胞は、真核植物、藻類、ラン色細菌、緑色硫黄細菌、緑色非硫黄細菌、紅色硫黄細菌、紅色非硫黄細菌、好極限性細菌、酵母、真菌、それらの遺伝子操作された生物、または合成生物に由来する細胞である。いくつかの態様において、宿主細胞は、光依存性であるかまたは炭素を固定する。いくつかの態様において、宿主細胞は独立栄養活性を有する。
いくつかの態様において、宿主細胞は、光の存在下などにおいて光独立栄養活性を有する。いくつかの態様において、宿主細胞は、光の非存在下において従属栄養性または混合栄養性である。ある態様において、宿主細胞は、アラビドプシス・タリアナ（Arabidopsis thaliana）、パニカム・ウィルガツム（Panicum virgatum）、ミスカンサス・ギガンテス（Miscanthus giganteus）、トウモロコシ（Zea mays）、ボツリオコッカス・ブラウニー（Botryococcuse braunii）、クラミドモナス・レインハルディ（Chlamydomonas reinhardtii）、ドナリエナ・サリナ（Dunaliela salina）、シネココッカス（Synechococcus）属種PCC 7002、シネココッカス属種PCC 7942、シネコシスティス（Synechocystis）属種PCC 6803、サーモシネココッカス・エロンガタス（Thermosynechococcus elongates）BP-1、クロロビウム・テピダム（Chlorobium tepidum）、クロロフレクサス・オウランティアカス（Chlorojlexus auranticus）、クロマチウム・ビノサム（Chromatiumm vinosum）、ロドスピリラム・ラブラム（Rhodospirillum rubrum）、ロドバクター・カプスラータ（Rhodobacter capsulatus）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palusris）、クロストリジウム・リュングダーリイ（Clostridium ljungdahlii）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、シュードモナス・フルオレセンス（Pseudomonas fluorescens）、またはザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）に由来する細胞である。
1つの態様において、微生物細胞は、プロクロロコッカス属、シネココッカス属、シネコシスティス属、シアノセイス属、およびノストック・パンクチフォルメを非限定的に含むシアノバクテリアに由来する。もう1つの態様において、微生物細胞は、シネココッカス・エロンガタスPCC7942、シネコシスティス属種PCC6803、およびシネココッカス属種PCC7001を非限定的に含む、特定のシアノバクテリア種に由来する。
組換え宿主細胞および培養物を作る方法
当技術分野において周知の様々な方法を用いて、脂肪酸誘導体および/もしくは脂肪酸誘導体組成物または他の化合物を産生するように宿主細胞を操作することができる。前記方法は、本明細書に記載のように、変異体または変種BCCPを含む変異体または変種ACCをコードする核酸を含むベクター、好ましくは、発現ベクターの使用を含んでもよい。当業者であれば、本明細書に記載の方法において様々なウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを使用できることを理解するだろう。
本開示の一部の態様において、ある特定の組成物中の比較的高い力価の化合物、例えば脂肪酸エステルは、対応する野生型宿主細胞の対照培養物によって産生された同じ脂肪酸エステルまたは脂肪酸エステルの組み合わせの力価と比べてより高い力価の、組換え宿主細胞培養物によって産生された、ある特定のタイプの脂肪酸エステルまたは脂肪酸エステルの組み合わせである。他の態様において、他の脂肪酸誘導体または非脂肪酸化合物が、類似の様式で、組換え宿主細胞培養物によって産生される。一部の態様において、変異体または変種accBポリヌクレオチド(または遺伝子)配列を含む変異体または変種ACCポリヌクレオチド(または遺伝子)配列は、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結されるプロモーターを含む組換えベクターを経由して宿主細胞に提供される。ある特定の態様において、プロモーターは、発生により調節されるプロモーター、細胞小器官特異的プロモーター、組織特異的プロモーター、誘導性プロモーター、構成的プロモーター、または細胞特異的プロモーターである。組換えベクターは、典型的には、ポリヌクレオチド配列に機能的に連結される発現制御配列;ポリヌクレオチド配列に機能的に連結される選択マーカー;ポリヌクレオチド配列に機能的に連結されるマーカー配列;ポリヌクレオチド配列に機能的に連結される精製部分;ポリヌクレオチド配列に機能的に連結される分泌配列;およびポリヌクレオチド配列に機能的に連結される標的指向配列より選択される少なくとも1つの配列を含む。タンパク質をコードするオープンリーディングフレームおよび機能的に連結される制御配列を含むポリヌクレオチド配列は組換え宿主細胞の染色体に組み込まれてもよく、組換え宿主細胞に存在する1つまたは複数のプラスミド発現系に組み込まれてもよく、その両方でもよい。
本明細書に記載の発現ベクターは、宿主細胞内でのポリヌクレオチド配列発現に適した形で本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を含む。発現ベクターの設計は、形質転換しようとする宿主細胞の選択、望ましいポリペプチドの発現レベルなどのような要因に依存し得ることが当業者により理解されるだろう。本明細書に記載のようにポリヌクレオチド配列によってコードされる、融合ポリペプチドを含むポリペプチドを産生するために、本明細書に記載の発現ベクターを宿主細胞に導入することができる。原核生物、例えば、大腸菌におけるポリペプチドをコードする遺伝子の発現は、ほとんどの場合、融合ポリペプチドまたは非融合ポリペプチドの発現を管理する構成的プロモーターまたは誘導性プロモーターを含有するベクターを用いて行われる。原核生物および真核細胞の両方に適した発現系は当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al., 「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, (1989)を参照されたい。ある特定の態様において、本開示のポリヌクレオチド配列は、バクテリオファージT5に由来するプロモーターに機能的に連結される。1つの態様において、宿主細胞は酵母細胞である。この態様において、発現ベクターは酵母発現ベクターである。外来核酸(例えば、DNA)を宿主細胞を導入するための当技術分野において認められている様々な技法を介して、ベクターを原核生物または真核細胞に導入することができる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、例えば、Sambrook et al. (前記)に見られる。
細菌細胞の安定形質転換のために、使用される発現ベクターおよび形質転換法に応じて、ごくわずかな細胞が発現ベクターを吸収および複製することが公知である。これらの形質転換体を特定および選択するために、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性)をコードする遺伝子を関心対象の遺伝子と一緒に宿主細胞に導入することができる。選択マーカーには、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、またはテトラサイクリンなどがあるが、これに限定されない薬物に対する耐性を付与する選択マーカーが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、本明細書に記載のポリペプチドをコードする核酸と同じベクターにのせて宿主細胞に導入されてもよく、別個のベクターにのせて導入されてもよい。導入された核酸によって安定に形質転換された細胞は、適切な選択薬物の存在下での増殖によって特定することができる。
組換え宿主細胞の培養および発酵
本明細書で使用する「発酵」という用語は、炭素源を含む培地中で組換え宿主細胞培養物を増殖させることによる、宿主細胞による有機材料から標的物質への変換、例えば、組換え宿主細胞による炭素源から脂肪酸またはその誘導体への変換を大まかに指す。本明細書で使用する「産生を許容する条件」という用語は、宿主細胞がマロニル-CoA由来化合物、例えば脂肪酸誘導体および他の非脂肪酸化合物などの望ましい産物を産生するのを可能にする任意の条件を意味する。同様に、「ベクターのポリヌクレオチド配列が発現される条件」という用語は、宿主細胞がポリペプチドを合成するのを可能にする任意の条件を意味する。適切な条件には、例えば、発酵条件が含まれる。発酵条件は、温度範囲、エアレーション速度、供給速度、および培地組成を含むが、これに限定されない多くのパラメータを含んでもよい。これらの条件はそれぞれ、個々におよび組み合わせて、宿主細胞が増殖するのを可能にする。発酵は、好気性、嫌気性、またはそのバリエーション(例えば、微好気性)でもよい。例示的な培養培地にはブロスまたはゲルが含まれる。一般的に、培地は、宿主細胞が直接代謝することができる炭素源を含む。さらに、炭素源の動態化(例えば、デンプンまたはセルロースから発酵性糖への解重合)およびその後の代謝を容易にするために培地中に酵素を使用することができる。
小規模生産の場合、操作された宿主細胞を、例えば、約100μL、200μL、300μL、400μL、500μL、1mL、5mL、10mL、15mL、25mL、50mL、75mL、100mL、500mL、1L、2L、5L、または10Lのバッチで増殖させ、発酵させ、望ましいポリヌクレオチド配列、例えば、ACC変種ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を発現するように誘導することができる。大規模生産の場合、操作された宿主細胞を、約10L、100L、1000L、10,000L、100,000L、1,000,000Lまたはそれより多い体積バッチを有する培養中で増殖させ、発酵させ、望ましいポリヌクレオチド配列を発現するように誘導することができる。本明細書に記載の脂肪酸誘導体組成物または他の化合物は、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境に認められ得、培養培地から容易に単離することができる。脂肪酸誘導体は組換え宿主細胞によって分泌され得、細胞外環境に輸送され得、組換え宿主細胞培養物の細胞外環境に受動的に移動され得る。1つの態様において、脂肪エステル組成物は、当技術分野において公知の日常的な方法を用いて組換え宿主細胞培養物から単離され得る。任意の非脂肪酸化合物が、細胞外または細胞内で産生され得る。
組換え宿主細胞のスクリーニング
本開示の1つの態様において、変異体または変種ACCポリペプチドの活性は、組換え宿主細胞(1つまたは複数の変異誘発または変種ACCポリヌクレオチド配列を含む)を培養し、その後に、組換え宿主細胞によって産生された、例えば、脂肪酸誘導体組成物または他の化合物の特徴、例えば、脂肪酸誘導体または他の化合物の力価、収率、および生産性を特定するためにスクリーニングすることによって決定される。別の態様において、変異体または変種ACCポリペプチドの活性は、(1つまたは複数の変異誘発または変種ACCポリヌクレオチド配列を含む)組換え宿主細胞を培養し、その後に、組換え宿主細胞によって産生された、例えば、脂肪酸誘導体組成物（例えば、脂肪エステル、脂肪アルコール、脂肪アルデヒドなど）または他の化合物の特徴、例えば、脂肪酸誘導体または他の化合物の力価、収率、および生産性を特定するためにスクリーニングすることによって決定される。変異体もしくは変種ACCポリペプチドまたは変異体もしくは変種BCCPポリペプチドおよびその断片は、日常的な方法を用いて、改善されたACC活性、および/またはマロニル-CoA由来化合物の改善された/上昇した生産性についてアッセイすることができる。例えば、変異体もしくは変種ACCポリペプチドもしくはBCCPポリペプチドまたはその断片は、ポリペプチドが機能できる条件下で基質(例えば、アシル-CoA、アシル-ACP、遊離脂肪酸、アルコール)と接触される。1つの態様において、基質のレベルの低下または脂肪エステルもしくは脂肪エステル組成物のレベルの上昇を測定して、ACC活性を決定することができる。脂肪アルコール、脂肪アルデヒド、脂肪アミン、および他の脂肪酸誘導体、ならびに他の化合物の産生についても同様である。
組換え宿主細胞に由来する産物
本明細書で使用する「現代炭素比(fraction of modem carbon)」すなわちfMは、米国立標準技術研究所(National Institute of Standards and Technology)(NIST)標準物質(Standard Reference Materials)(SRM 4990Bおよび4990C、それぞれ、シュウ酸標準HOxIおよびHOxIIと知られる、によって定義されたものと同じ意味を有する。基本的定義は、HOxIの14C/12C同位体比(AD1950を基準とする)の0.95倍に関するものである。これは、減衰補正した産業革命前の木材にほぼ相当する。現在の生物圏(植物材料)の場合、fMは約1.1である。
生物学的に産生された有機化合物、特に、本明細書に記載の脂肪酸生合成経路を用いて産生された脂肪エステル組成物を含むバイオプロダクト(例えば、本開示に従って産生された脂肪酸誘導体組成物または非脂肪酸組成物)は再生可能な炭素源から産生されており、従って、新たな組成物である。これらの新たなバイオプロダクトは、二重炭素同位体フィンガープリント法(dual carbon-isotopic fingerprinting)または14C年代測定法に基づいて石油化学炭素に由来する有機化合物と区別することができる。さらに、二重炭素同位体フィンガープリント法(例えば、米国特許第7,169,588号を参照されたい)によって、生物由来炭素の特定の供給源(例えば、グルコース対グリセロール)を確認することができる。バイオプロダクトと石油に基づく有機化合物を区別できることは、商業において、これらの材料の追跡する際に有益である。例えば、生物に基づく炭素同位体プロファイルおよび石油に基づく炭素同位体プロファイルの両方を含む有機化合物または化学薬品は石油に基づく材料のみで作られた有機化合物および化学薬品と区別される場合がある。従って、本明細書中のバイオプロダクトは、商業において、ユニークな炭素同位体プロファイルに基づいて追う、または追跡することができる。バイオプロダクトは、各試料中の安定炭素同位体比(13C/12C)を比較することによって石油に基づく有機化合物と区別することができる。所定のバイオプロダクト中の13C/12C比は、二酸化炭素が固定された時の大気二酸化炭素中の13C/12C比の結果である。これは正確な代謝経路も反映している。地域によるばらつきも発生する。石油、C3植物(広葉)、C4植物(イネ科草本)、および海成炭酸塩は全て13C/12Cの有意な差および対応するδ13C値を示す。C4植物およびC3植物はいずれも、ある範囲の13C/12C同位体比を示すが、典型的な値はC4植物については約-7〜約-13パーミルであり、C3植物については約-19〜約-27パーミルである(例えば、Stuiver et al., Radiocarbon 19:355(1977)を参照されたい)。一般的に、石炭および石油は後者の範囲内におさまる。
δ13C(‰)=[(13C/12C)試料-(13C/12C)標準]/(13C/12C)標準×1000
IAEA、USGS、NIST、および他の選ばれた国際同位体研究所と協力して一連の代替RMが開発されている。PDBからのパーミル逸脱の表記はδ13Cである。質量44、45、および46の分子イオンに対する高精度安定比質量分析法(high precision stable ratio mass spectrometry)(IRMS)によってCO2を測定する。本明細書に記載の組成物には、本明細書に記載の任意の方法によって産生された脂肪エステル組成物および産物が含まれる。具体的には、脂肪エステル組成物または産物のδ13Cは約-28以上、約-27以上、-20以上、-18以上、-15以上、-13以上、-10以上、または-8以上であり得る。例えば、脂肪エステル組成物または産物のδ13Cは約-30〜約-15、約-27〜約-19、約-25〜約-21、約-15〜約-5、約-13〜約-7、または約-13〜約-10であり得る。他の場合では、脂肪エステル組成物または産物のδ13Cは約-10、-11、-12、または-12.3であり得る。本明細書中の本開示に従って産生された脂肪エステル組成物および産物は、各化合物中の14C量を比較することによって石油に基づく有機化合物と区別することもできる。14Cの核半減期は5730年であるので、「年代の古い」炭素を含有する石油に基づく燃料は「年代の新しい」炭素を含有する脂肪エステル組成物およびバイオプロダクトと区別することができる(例えば、Currie, 「Source Apportionment of Atmospheric Particles」, Characterization of Environmental Particles, J. Buffle and H. P. van Leeuwen, Eds., 1 of Vol. I of the IUPAC Environmental Analytical Chemistry Series (Lewis Publishers, Inc.) 3-74, (1992)を参照されたい)。
放射性炭素年代測定法における基本前提は、大気中の14C濃度が不変であることにより生体中の14Cが不変であるということである。しかしながら、1950年以降の大気圏核実験および1850年以降の化石燃料の燃焼によって、14Cの地球化学的時間特性(geochemical time characteristic)は異なるものになった。大気CO2、従って、生物圏中の14C濃度は1960年代半ばの核実験のピーク時にはほぼ2倍になった。それ以降は、14C濃度は概算緩和「半減期」7〜10年で定常状態の宇宙線生成(大気中)ベースライン同位体比(14C/12C)である約1.2x10-12に徐々に戻りつつある(この半減期は文字通りに解釈してはならない；もっと正確に言うと、核時代が始まってからの大気中および生物圏における14C変動を追跡するためには、詳細な大気核投入/壊変関数(atmospheric nuclear input/decay function)を用いなければならない)。最近の生物圏炭素の年代測定の可能性を示唆するのが、この後者の生物圏14C時間特性である。14Cは加速器質量分析(AMS)によって測定することができ、その結果は「現代炭素比」(fM)という単位で示される。本明細書に記載の脂肪エステル組成物および産物には、少なくとも約1のfM14Cを有し得るバイオプロダクトが含まれる。例えば、本開示のバイオプロダクトは、少なくとも約1.01のfM14C、約1〜約1.5のfM14C、約1.04〜約1.18のfM14C、または約1.111〜約1.124のfM14Cを有し得る。
14Cの別の測定法は現代炭素パーセント(pMC)として知られる。14C年代を使用する考古学者または地質学者にとってAD1950は「0年」に等しい。これはまた100pMCに相当する。大気中の「核実験起源の炭素(bomb carbon)」は1963年の熱核兵器のピーク時には正常値のほぼ2倍に達した。14C大気中分布は14Cが出現してから概算されており、AD1950以降から生きている植物および動物については100pMCを上回る値を示す。14Cは時間が経つにつれて徐々に減少しており、現在の値は約107.5pMCである。このことは、トウモロコシなどの新鮮なバイオマス材料の14Cシグネチャが約107.5pMCであることを意味する。石油に基づく化合物のpMC値は0である。化石炭素と現在の炭素(present day carbon)が組み合わされると、現在のpMC含有率は希釈される。107.5pMCが現在のバイオマス材料の14C含有率に相当し、0pMCが石油に基づく製品の14C含有率に相当すると考えることによって、この材料のpMC測定値は2種類の成分タイプの比率を反映している。例えば、現在のダイズに100％由来する材料の放射性炭素シグネチャは約107.5pMCになるだろう。この材料を石油に基づく製品で50％に希釈したら、その放射性炭素シグネチャは約54pMCになるだろう。生物に基づく炭素含有率は、「100％」を107.5pMCに対応させ、「0％」を0pMCに対応させることによって得られる。例えば、99pMCと測定された試料の対応する生物に基づく炭素含有率は93％である。この値は、生物に基づく炭素の結果の平均と呼ばれ、現在の生物学的材料または石油に基づく材料のいずれかから生じた分析材料の中にある全成分を想定する。本明細書に記載のように1種類または複数種類の脂肪エステルを含むバイオプロダクトのpMCは少なくとも約50、60、70、75、80、85、90、95、96、97、98、99、または100になり得る。他の場合では、本明細書に記載の脂肪エステル組成物のpMCは約50〜約100;約60〜約100;約70〜約100;約80〜約100;約85〜約100;約87〜約98;または約90〜約95になり得る。さらに他の場合において、本明細書に記載の脂肪エステル組成物のpMCは約90、91、92、93、94、または94.2になり得る。
脂肪エステル組成物
脂肪エステルの例には、脂肪酸エステル、例えば、FAEEおよびFAMEを含む短鎖アルコールに由来する脂肪酸エステルおよび長鎖脂肪アルコールに由来する脂肪酸エステルが含まれる。産生された脂肪エステルおよび/または脂肪エステル組成物は個々に、または適切な組み合わせで、バイオ燃料(例えば、バイオディーゼル)、工業化学薬品、あるいはバイオ燃料もしくは工業化学薬品の成分またはバイオ燃料もしくは工業化学薬品のための供給材料として使用することができる。一部の局面において、本開示は、例えば、FAEE、FAME、および/または長鎖アルコールの他の脂肪酸エステル誘導体を含む1種類または複数種類の脂肪酸エステルを含む脂肪エステル組成物を産生する方法に関する。関連する局面において、前記方法は、FAME、FAEE、脂肪酸プロピルエステル、脂肪酸イソプロピルエステル、脂肪酸ブチルエステル、モノグリセリド、脂肪酸イソブチルエステル、脂肪酸2-ブチルエステル、および脂肪酸tert-ブチルエステルなどを含むが、これに限定されない脂肪エステルおよび脂肪エステル組成物を作るのに適した遺伝子操作された産生宿主を含む。
エステルには多くの商業用途がある。例えば、代替燃料であるバイオディーゼルはエステル(例えば、脂肪酸メチルエステル、脂肪酸エチルエステルなど)からなる。一部の低分子量エステルは揮発性であり、芳香剤または着香剤として役立つ芳香がある。さらに、エステルはラッカー、塗料、およびワニス用の溶媒として用いられる。さらに、ワックス、脂肪、および油などの一部の天然物質はエステルからなる。エステルはまた樹脂およびプラスチックの中の柔軟剤、ガソリンおよび油の中の可塑剤、難燃剤、および添加物としても用いられる。さらに、エステルは、重合体、フィルム、布、色素、および薬の製造において使用することができる。
一般的に、脂肪エステルまたは脂肪エステル組成物は宿主細胞の細胞外環境から単離される。一部の態様において、脂肪エステルまたは脂肪エステル組成物は部分的または完全に宿主細胞から自発的に分泌される。別の態様では、脂肪酸エステルまたは脂肪エステル組成物は任意で1種類または複数種の輸送タンパク質の助けを借りて細胞外環境に輸送される。さらに他の態様において、脂肪エステルまたは脂肪エステル組成物は細胞外環境に受動的に輸送される。
脂肪アルコール組成物
脂肪アルコールの例には、飽和、不飽和、直鎖、および分枝鎖の脂肪アルコールが含まれる。産生された脂肪アルコールおよび/または脂肪アルコール組成物は、洗剤、工業化学物質、または工業化学物質の成分もしくは工業化学物質用の供給材料として個々に、または適切な組み合わせで使用することができる。一部の局面では、本開示は、例えば、短鎖脂肪アルコールおよび長鎖脂肪アルコールを含む1種類または複数種の脂肪アルコールを含む脂肪アルコール組成物を産生する方法に関する。関連する局面において、前記方法は、脂肪アルコールおよび脂肪アルコール組成物を作るのに適した産生宿主を含む。
前記方法は、C6〜C26脂肪アルコールを含む脂肪アルコールを産生することができる。一部の態様において、脂肪アルコールには、C6、C7、C8、C9、C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19、C20、C21、C22、C23、C24、C25、および/またはC26脂肪アルコールが含まれる。ある特定の態様において、脂肪アルコールは、1-デカノール、1-ドデカノール、1-ミリスチルアルコール、1-ヘキサデカノール、オクタデセノール、テトラデセノール、またはヘキサデセノールである。他の態様において、脂肪アルコールには直鎖脂肪アルコールが含まれる。他の態様において、脂肪アルコールには分枝鎖脂肪アルコールが含まれる。さらに他の態様では、脂肪アルコールは環式部分を含む。一部の態様において、脂肪アルコールは不飽和脂肪アルコールである。他の態様において、脂肪アルコールは一不飽和脂肪アルコールである。さらに他の態様では、脂肪アルコールは飽和脂肪アルコールである。別の局面において、本発明は、本明細書に記載の任意の方法もしくは任意の微生物によって産生された脂肪アルコール、または本明細書に記載の任意の方法もしくは任意の微生物によって産生された脂肪アルコールを含む界面活性剤を特徴とする。一部の態様において、脂肪アルコールのδ13Cは約-15.4以上である。ある特定の態様において、脂肪アルコールのδ13Cは約-15.4〜約-10.9または約-13.92〜約-13.84である。一部の態様において、脂肪アルコールのfM 14Cは少なくとも約1.003である。ある特定の態様において、脂肪アルコールのfM 14Cは少なくとも約1.01または少なくとも約1.5である。一部の態様において、脂肪アルコールのfM 14Cは約1.111〜約1.124である。
脂肪アルコールには多くの商業用途がある。短鎖脂肪アルコールは化粧品業界および食品業界において乳化剤、軟化剤、および増粘剤として用いられる。脂肪アルコールには両親媒性があるため、洗剤として有用な非イオン界面活性剤として働く。さらに、脂肪アルコールは、ワックス、ゴム、樹脂、薬学的ローション、潤滑油添加剤、布用帯電防止剤および仕上げ剤、可塑剤、化粧品、工業溶剤、ならびに脂肪用溶剤において用いられる。
一般的に、脂肪アルコールまたは脂肪アルコール組成物は宿主細胞の細胞外環境から単離される。一部の態様において、脂肪アルコールまたは脂肪アルコール組成物は部分的または完全に宿主細胞から自発的に分泌される。別の態様では、脂肪アルコールまたは脂肪アルコール組成物は任意で1種類または複数種の輸送タンパク質の助けを借りて細胞外環境に輸送される。さらに他の態様において、脂肪アルコールまたは脂肪アルコール組成物は細胞外環境に受動的に輸送される。
以下の特定の実施例は本開示を例示することを目的とし、添付の特許請求の範囲を限定すると解釈してはならない。
本発見を例示するために、FAME産生改善のために天然大腸菌ACC酵素を改善するように、すなわち、高い力価および収率を実現するように2つの異なる方法を開発した。4つ全ての大腸菌ACC遺伝子の発現を増加させることで脂肪酸産生を改善できることが文献において知られていたが、accB遺伝子における標的指向変異およびaccBCオペロンにおける標的指向発現の変化によってFAME産生を改善できると判明したことは驚くべきことであった。
プロトコール:
1. accBCのための株構築
accBCを発現させるために、BD64(前記)と呼ぶ産生宿主株を使用した。accBC発現を試験するために、産生宿主株はいくつかの遺伝子操作を含んだ。accBCオペロンを含む染色体領域を改変した。ACC相補系(complementation system)の存在下で遺伝子操作を行った。10mMのマロネートを補い、同時に、リゾビウム・トリフォリ(Rhizobium trifolii)に由来する2種類のマロネート利用遺伝子matBおよびmatCを低コピープラスミドから発現させた。これらの遺伝子は、標準的な操作法を用いてpKD46組込みプラスミド内の構成的プロモーターの後ろにクローニングした。選択プレートに10mMマロネートが含まれていたこと以外は、accBCオペロンをノックアウトした(Datsenko et al. (2000) Proceedings of the National Academy of Sciences 97(12):6640-6645を参照されたい)。選択プレートにマロネートが無かったこと以外は同じ手順を用いて、改変したaccBCオペロンを組み込んだ。
2. accBのための株構築
accBを発現させるために、BD64(前記)と呼ぶ産生宿主株を使用した。accBC構築(前記)に使用した同じ戦略を用いて、accB遺伝子を含む染色体領域を改変した。
3. ACC FAME産生アッセイ
大腸菌ACC酵素活性に対する変化をFAME産生系を用いてアッセイした。望ましいACC変異を含むBD64株(前記)を、pKEV13と呼ぶエステルシンターゼ(ES)プラスミドで形質転換した。プラスミドpKEV13は、市販のpTrcプロモーター(Life Technologies)およびマリノバクター・ハイドロカルボノクラスティカス(Marinobacter hydrocarbonoclasticus)ATCC 49840由来エステルシンターゼ遺伝子をプラスミドpCL1920(Lerner et al. (1990) Nucleic acids research 18(15):4631.)にクローニングすることによって構築した。下記で詳述する標準的な手順に従って株を発酵させ、抽出し、FAME産生を測定した。
発酵を以下の通りに行った;96ウェルプレート中で増殖しているLB培養物から、LB培養物30μLを用いてFA2P培地270μLに接種した。次いで、これを、振盪しているインキュベーターに入れて32℃で約16時間インキュベートした。一晩種(seed)30μLを用いて、2％メタノールおよび1mM IPTGを含有するFA4P培地300μLに接種した。FA2P培地およびFA4P培地はいずれも、(それぞれ)0.2g/Lまたは0.4g/Lのリン酸塩を含有する改良したM9最小培地である。FA2P培地中およびFA4P培地中の炭素源は50g/Lグルコースである。培養物を、振盪しているインキュベーターに入れて32℃で24時間インキュベートし、次いで、下記で詳述した標準的な抽出プロトコールに従って抽出した。
抽出を以下の通りに行った;抽出しようとする各ウェルに、1M HCl 40μL、次いで、内部標準として500mg/L C11-FAMEを含む酢酸ブチル300μLを添加した。96ウェルプレートをプレートシーラー(ALPS-300; Abgene, ThermoScientific, Rockford, IL)を用いてヒートシールし、MixMate(Eppendorf, Hamburg, Germany)を用いて2000rpmで15分間振盪した。振盪後、水層および有機層を分離するために、プレートを4500rpmで室温で10分間、遠心分離した (Allegra X-15R, ローターSX4750A, Beckman Coulter, Brea, CA)。有機層50μLを96ウェルプレート(96ウェルプレート, ポリプロピレン, Corning, Amsterdam, The Netherlands)に移した。プレートをヒートシールし、次いで、ガスクロマトグラフィー水素炎イオン化検出器(GC-FID)によって評価するまで-20℃で保管した。
抽出およびFAME定量を以下の通りに行った;試料1uLを、水素炎イオン化検出器(FID)を備えたTrace GC Ultra(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)の中にあるUFMカラム(カタログ番号: UFMC00001010401, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)に注入した。C8〜C18 FAMEを検出し、C12〜C18 β-OH FAMEを定量するように機器を設定した。
実施例1:accB変異によってFAME産生が増加する
accB遺伝子のエラープローンライブラリーを構築し、野生型遺伝子を上回る改善を示した変種があるかどうかスクリーニングした。以下の表3は最も良い変種をまとめたものを示す。accB遺伝子のエラープローンライブラリーを市販のキット(Genemorph II, Agilent Technologies)を用いて構築した。accB遺伝子を、SOE PCR法を用いて適切なホモロジー領域につなぎ合わせ、プロトコール1に記載のようにライブラリーを大腸菌染色体に組み込んで、天然大腸菌accBと取り替えた。プロトコール2に従ってエラープローンライブラリーをスクリーニングした。
（表３）FAME産生用のaccB変種
Figure 0006837089
表3の縦列は、変種の元々のウェル位置、対照を上回るFAME力価改善、ならびに各変種におけるアミノ酸変化およびDNAコドン変化を示す。表3の結果から、アミノ酸位置2にある変異によって力価が最大に増加し得ることが示唆された。ウェル5A02は正常ACC活性の435％の力価増加を示した。
次に、個々の位置および変異のどれが最大の改善をもたらすかを確かめるために標的指向部位飽和変異誘発を行った。実際に、accBの(開始コドン直後にある)位置2が変異するとFAME力価が最大に増加することが確かめられた。野生型accBは、位置2に、アスパラギン酸(Asp、D)をコードするGATコドンを含む。表1(前記)は、accB位置2について最も良い変種をまとめたものを示す。2番目のaccB位置に縮重塩基NNNを含むオリゴヌクレオチドプライマーを用いて部位飽和ライブラリーを構築した。accB遺伝子を、SOE PCR法を用いて適切なホモロジー領域につなぎ合わせ、プロトコール1に記載のようにライブラリーを大腸菌染色体に組み込んで、天然大腸菌accBと取り替えた。プロトコール2に従ってエラープローンライブラリーをスクリーニングした。表1(前記)から分かるように、変異体D2Hでは正常ACC活性の630％までの力価増加が観察された。図5は、これらの発見をさらに反映し、FAS力価をmg/Lで示したグラフを示す。さらに具体的には、この図は、大腸菌宿主細胞内で(accB遺伝子の位置2における)様々なBCCP変種を発現した結果としてFAS力価(FAME)を図示する。WTは野生型ACC複合体の対照である。これらのBCCP変種の一部はFAS力価を5倍を超えて改善した(表1も参照されたい)。この発見は、BCCP変種が脂肪酸誘導体産生の点でACC複合体全体より優れていたので驚くべきことであった。同じアミノ酸置換をコードする異なるコドンを試験し、この効果は同じであることが示された。このことから、マロニル由来化合物、この場合では脂肪酸誘導体を増やした効果はBCCPのアミノ酸変化と相関関係があることが裏付けられた。
実施例2:accBCオペロン発現を改変するとFAME産生が増加する
accBCオペロンの発現ライブラリーを構築し、野生型accBCプロモーターを上回る改善を示した変種があるかどうかスクリーニングした。表2(前記)は最も良い変種をまとめたものを示す。このライブラリーは、天然accBCプロモーター領域を、ランダム変異を導入するように縮重ヌクレオチドを含有するバクテリオファージT5プロモーターライブラリーと交換するプライマーを用いて構築した。T5プロモーターライブラリーを、SOE PCR法を用いて適切なホモロジー領域につなぎ合わせ、プロトコール1に記載のようにライブラリーを大腸菌染色体に組み込んで、天然大腸菌accBCプロモーターと取り替えた。プロトコール2に従って発現ライブラリーをスクリーニングした。表2(前記)から分かるように、変種プロモーターを用いて正常ACC活性の315％までの増加力価が観察された。
実施例3:accBおよびaccBCを操作することによって、いかなるマロニル-CoA由来化合物の産生も改善される
accB変異(実施例1)およびaccBC発現の変化(実施例2)を用いて、マロニル-CoAに由来するいかなる産物の力価および収率も増やすことができる。標準的な遺伝子操作法を用いて、実施例1の特定の変異を任意の微生物株に導入することができる。実施例2に従って、または標準的な遺伝子操作法を用いて当業者に公知の他の方法を介して、任意の細菌または酵母においてaccBCの発現を改変することができる。accBCのオペロン構造は高度に保存されており、多くの細菌および他の微生物において見出される。これにより、いくつかの異なる生物において同じ技法を使用することができる。マロニル-CoAに由来する化合物は非常に多く、脂肪酸、脂肪酸エステル(FAME、FAEEなど)、脂肪アルコール、脂肪アミン、二官能性脂肪酸(ヒドロキシ、二酸)、二官能性脂肪アルコール、二官能性脂肪エステル、二官能性脂肪アミン、β-ヒドロキシ脂肪酸由来化合物、不飽和脂肪酸由来化合物、ならびに脂肪酸をベースとしないフラバノンおよびフラボノイド、ポリケチド、ならびに3-ヒドロキシプロピオン酸を含む。
当業者に明らかなように、本開示の精神および範囲から逸脱することなく上記の局面および態様の様々な変更および変化を加えることができる。このような変更および変化は本開示の範囲内である。

Claims (16)

  1. 野生型微生物細胞と比較した組換え微生物細胞におけるBCCP発現の増加をもたらし、SEQ ID NO:93、94、95、および96のいずれか1つより選択されるT5プロモーター変種を含む、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質（BCCP）の発現を制御する変種オペロン。
  2. 対応する野生型微生物細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の改善を組換え微生物細胞に付与する、請求項1記載の変種オペロン。
  3. 請求項1または2記載の変種オペロンを含む、エシェリキア属(Escherichia)由来組換え微生物。
  4. 炭素源を含有する発酵ブロス中で請求項3記載の組換え微生物を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法。
  5. 炭素源を含有する発酵ブロス中で、以下を含むエシェリキア属由来組換え微生物を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法：
    (a)SEQ ID NO:4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、および90からなる群より選択されるポリペプチド配列を含む、変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)であって、該変種BCCPの発現が、対応する野生型細胞と比較したマロニル-CoA由来化合物産生の増加を組換え細胞に付与する、変種ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP);および
    (b)請求項1または2記載の変種オペロン。
  6. accBもしくはaccCまたはその組み合わせを含む核酸配列の発現の増加を含む、エシェリキア属由来組換え微生物であって、該発現の増加が、該核酸配列の発現を駆動するT5プロモーター変種によるものであり、該T5プロモーター変種がSEQ ID NO:93、94、95、および96のいずれか1つより選択される、組換え微生物。
  7. 発現の増加が、微生物が炭素源と共に培養された時に、マロニル-CoA由来化合物産生の増加をもたらす発現の増加である、請求項6記載の組換え微生物。
  8. 前記核酸配列が、ビオチンカルボキシルキャリアータンパク質(BCCP)もしくはビオチンカルボキシラーゼ(BC)またはその組み合わせをコードする、請求項6または7記載の組換え微生物。
  9. エシェリキア属が大腸菌である、請求項6〜8のいずれか一項記載の組換え微生物。
  10. マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、請求項2記載の変種オペロン。
  11. マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、請求項4または5記載の方法。
  12. マロニル-CoA由来化合物が、脂肪酸、脂肪酸メチルエステル(FAME)、脂肪酸エチルエステル(FAEE)、脂肪アルコール、脂肪アミン、βヒドロキシ脂肪酸誘導体、二官能性脂肪酸誘導体、および不飽和脂肪酸誘導体のいずれか1つの脂肪酸誘導体を含む、請求項7〜9のいずれか一項記載の組換え微生物。
  13. マロニル-CoA由来化合物がFAMEである、請求項10記載の変種オペロン。
  14. マロニル-CoA由来化合物がFAMEである、請求項11記載の方法。
  15. マロニル-CoA由来化合物がFAMEである、請求項12記載の組換え微生物。
  16. 炭素源を含有する発酵ブロス中で請求項6〜9、12、および15のいずれか一項記載の微生物を培養する工程を含む、マロニル-CoA由来化合物を産生する方法。
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