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KR102159807B1 - 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제 - Google Patents

디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제 Download PDF

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KR102159807B1
KR102159807B1 KR1020177009797A KR20177009797A KR102159807B1 KR 102159807 B1 KR102159807 B1 KR 102159807B1 KR 1020177009797 A KR1020177009797 A KR 1020177009797A KR 20177009797 A KR20177009797 A KR 20177009797A KR 102159807 B1 KR102159807 B1 KR 102159807B1
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아이리 고마츠자키
아츠시 이치야나기
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기꼬만 가부시키가이샤
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Abstract

산소 농도의 영향을 받기 어려운 아마도리아제 및 이를 이용한 HbA1c의 측정 방법과 측정 시약 키트를 제공한다. 코니오카에타(Coniochaeta) 속 등 유래의 아마도리아제의 280위, 267위, 269위, 54위 및 241위로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 치환함으로써 얻어지는 아마도리아제 및 이를 이용한 HbA1c의 측정 방법, 측정 시약 키트 및 센서. 본 발명의 개변 아마도리아제는 옥시다아제 활성이 저감되고 디히드로게나아제 활성이 향상되어 전자 매개자의 이용이 가능해지고, 산소 농도의 영향을 저감시켜 고감도로 HbA1c를 측정할 수 있다.

Description

디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제{Amadoriase having enhanced dehydrogenase activity}
본 발명은 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제, 옥시다아제 활성이 저감된 아마도리아제, 디히드로게나아제 활성이 향상되고 옥시다아제 활성이 저감된 아마도리아제, 그 유전자 및 재조합체 DNA와 상기 아마도리아제의 제조법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 당뇨병 진단용 효소로서, 센서로서, 또한 당뇨병 마커의 측정 키트에 유리하게 이용될 수 있는 아마도리아제에 관한 것이다.
당화 단백질은 글루코오스 등의 알도오스(알데히드기를 잠재적으로 갖는 단당 및 그 유도체)의 알데히드기와 단백질의 아미노기가 비효소적으로 공유결합을 형성하여 아마도리 전이함으로써 생성한 것이다. 단백질의 아미노기로서는 아미노 말단의 α아미노기, 단백질 중의 리신 잔기 측쇄의 ε아미노기를 들 수 있다. 생체 내에서 발생하는 당화 단백질로서는 혈액 중의 헤모글로빈이 당화된 당화 헤모글로빈, 알부민이 당화된 당화 알부민 등이 알려져 있다.
이들 생체 내에서 발생하는 당화 단백질 중에서도 당뇨병의 임상 진단 분야에서 당뇨병 환자의 진단이나 증상 관리를 위한 중요한 혈당 컨트롤 마커로서 당화 헤모글로빈(HbA1c)이 주목받고 있다. 혈액 중의 HbA1c 농도는 과거 일정 기간의 평균 혈당치를 반영하고, 그 측정값은 당뇨병 증상의 진단이나 관리에 있어서 중요한 지표가 된다.
이 HbA1c를 신속하고 간편하게 측정하는 방법으로서 아마도리아제를 이용하는 효소적 방법, 즉 HbA1c를 프로테아제 등으로 분해하고 그 β쇄 아미노 말단에서 유리시킨 α-프럭토실 발릴 히스티딘(이후, 「αFVH」라고 나타냄) 혹은 α-프럭토실 발린(이후, 「αFV」라고 나타냄)을 정량하는 방법이 제안되어 있다(예를 들어, 특허문헌 1~7 참조). 실제로 HbA1c로부터 αFV를 잘라내는 방법에서는 협잡물 등에 의한 영향이 커서 정확한 측정값을 얻지 못한다는 과제가 있고, 보다 정확한 측정값을 얻을 목적으로 특히 현재는 αFVH를 측정하는 방법이 주류가 되어있다.
아마도리아제는 산소의 존재 하에서 이미노2아세트산 혹은 그 유도체(「아마도리 화합물」이라고도 함)를 산화하여 글리옥실산 또는 α-케토알데히드, 아미노산 또는 펩티드 및 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매한다.
아마도리아제는 세균, 효모, 진균으로부터 발견되어 있지만, 특히 HbA1c의 측정에 유용한 αFVH 및/또는 αFV에 대한 효소 활성을 갖는 아마도리아제로서는 예를 들어 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아르트리늄(Arthrinium) 속, 커벌라리아(Curvularia) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 에메리셀라(Emericella) 속, 울로클라디움(Ulocladium) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 아카에토미엘라(Achaetomiella) 속, 아카에토미움(Achaetomium) 속, 티엘라비아(Thielavia) 속, 카에토미움(Chaetomium) 속, 겔라시노스포라(Gelasinospora) 속, 미크로아스커스(Microascus) 속, 렙토스페리아(Leptosphaeria) 속, 오피오볼러스(Ophiobolus) 속, 플레오스포라(Pleospora) 속, 코니오케티듐(Coniochaetidium) 속, 피치아(Pichia) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속, 아스로박터(Arthrobacter) 속 유래의 아마도리아제가 보고되어 있다(예를 들어, 특허문헌 1, 6~15, 비특허문헌 1~11 참조). 또, 상기 보고예 중에서 아마도리아제는 문헌에 따라서는 케토아민 옥시다아제나 프럭토실 아미노산 옥시다아제, 프럭토실 펩티드 옥시다아제, 프럭토실아민 옥시다아제 등의 표현으로 기재되어 있는 경우도 있다.
아마도리아제는 퍼옥시다아제와 공역시켜 발색 기질을 이용함으로써 시료 중의 당화 기질의 측정에 이용할 수 있다. 종래의 아마도리아제는 당화 기질을 산화할 때에 산소 분자에 전자를 전달할 수 있다. 이 활성을 옥시다아제 활성이라고 한다. 효소의 옥시다아제 활성을 저감하고 디히드로게나아제 활성을 증대시키면 산소 분자 대신에 전자 억셉터(전자 매개자(mediator))를 전자 억셉터로서 사용할 수 있다. 산소 분자 대신에 전자 억셉터를 사용함으로써 산소의 영향을 받지 않고 측정을 행할 수 있다.
공지의 문헌 중에 아마도리아제의 디히드로게나아제 활성의 향상에 관한 개시가 보인다: 예를 들어, Phaeosphaeria nodorum 유래 프럭토실 아미노산 옥시다아제의 56위의 아스파라긴을 알라닌으로 치환함으로써 디히드로게나아제 활성에서의 αFV에 대한 Vmax/Km이 2.3배 향상되는 것이 나타나 있다(특허문헌 16 참조). 그러나, 개시되어 있는 변이체는 옥시다아제 활성에서의 αFV에 대한 Vmax/Km도 야생형과 비교하여 1.2배 향상되기 때문에 산소의 영향을 여전히 받는다고 생각된다.
특허문헌 1: 국제공개 제2004/104203호 특허문헌 2: 국제공개 제2005/49857호 특허문헌 3: 일본공개특허 2001-95598호 공보 특허문헌 4: 일본공고특허 평05-33997호 공보 특허문헌 5: 일본공개특허 평11-127895호 공보 특허문헌 6: 국제공개 제97/13872호 특허문헌 7: 일본공개특허 2011-229526호 공보 특허문헌 8: 일본공개특허 2003-235585호 공보 특허문헌 9: 일본공개특허 2004-275013호 공보 특허문헌 10: 일본공개특허 2004-275063호 공보 특허문헌 11: 일본공개특허 2010-35469호 공보 특허문헌 12: 일본공개특허 2010-57474호 공보 특허문헌 13: 국제공개 제2010/41715호 특허문헌 14: 국제공개 제2010/41419호 특허문헌 15: 국제공개 제2011/15325호 특허문헌 16: 일본공표특허 2013-500729호 공보
비특허문헌 1: Biochem. Biophys. Res. Commun. 311, 104-11, 2003 비특허문헌 2: Biotechnol. Bioeng. 106, 358-66, 2010 비특허문헌 3: J. Biosci. Bioeng. 102, 241-3, 2006 비특허문헌 4: Eur. J. Biochem. 242, 499-505, 1996 비특허문헌 5: Arch. Microbiol. 178, 344-50, 2002 비특허문헌 6: Mar. Biotechnol. 6, 625-32, 2004 비특허문헌 7: Biosci. Biotechnol. Biochem. 59, 487-91, 1995 비특허문헌 8: Appl. Microbiol. Biotechnol. 74, 813-819, 2007 비특허문헌 9: Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 1256-61, 2002 비특허문헌 10: Biosci. Biotechnol. Biochem. 66, 2323-29, 2002 비특허문헌 11: Biotechnol. Letters 27, 27-32, 2005
본 발명은 옥시다아제 활성이 저하되고 디히드로게나아제 활성이 증대된 아마도리아제를 제공하는 것을 목적으로 한다. 또한, 본 발명은 활성이 용존 산소 레벨의 영향을 거의 받지 않는 아마도리아제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
효소의 옥시다아제 활성의 저하 및 디히드로게나아제 활성을 부여하기 위한 정보는 거의 개시되지 않은 현재, 본 발명자들은 면밀히 연구를 거듭한 결과, Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제에 대해 특정의 아미노산 잔기의 치환을 도입함으로써 상기 과제를 해결할 수 있음을 발견하여 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하를 포함한다.
[1] 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율(OX/DH)이 개변 전 아마도리아제와 비교하여 저감되어 있는 개변 아마도리아제로서,
(i) 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위, 267위, 269위, 54위 및 241위로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치의 하나 이상의 아미노산이 치환되어 있고 디히드로게나아제 활성을 갖는 아마도리아제,
(ii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위, 267위, 269위, 54위 및 241위에 대응하는 위치 이외의 위치에서의 하나 또는 수개의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고 디히드로게나아제 활성을 갖는 아마도리아제,
(iii) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 그 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 6, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 44, 서열 번호 53 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열과 70% 이상의 서열 동일성을 가지고, 서열 번호 1의 제10위~32위, 36~41위, 49~52위, 54~58위, 63~65위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위의 아미노산 서열로 이루어지는 상동성 영역에서의 아미노산 서열과 상기 아마도리아제의 대응하는 위치의 상동성 영역에서의 아미노산 서열이 90% 이상의 서열 동일성을 가지며 디히드로게나아제 활성을 갖는 아마도리아제, 혹은
(iv) 상기 (i)의 아마도리아제에 있어서, 그 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 6, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 44, 서열 번호 53 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열과 80% 이상의 서열 동일성을 가지며 디히드로게나아제 활성을 갖는 아마도리아제.
[2] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 트레오닌 및 아스파라긴으로 이루어지는 군에서 선택되는 극성 아미노산, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 하전 아미노산, 또는 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신, 트립토판, 발린 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신, 트립토판, 발린 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 54위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴, 알라닌, 글루타민, 히스티딘, 글리신 또는 발린으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 리신, 글루타민산, 아스파라긴, 아르기닌, 아스파라긴산 또는 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있는, 1에 기재된 아마도리아제.
[3] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 히스티딘, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 또는 메티오닌으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신 또는 트립토판으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신 또는 트립토판으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 54위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 글루타민산 또는 리신으로 치환되어 있는, 2에 기재된 아마도리아제.
[4] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 히스티딘, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 또는 메티오닌으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 54위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 글루타민산 또는 리신으로 치환되어 있는, 3에 기재된 아마도리아제.
[5] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민 또는 세린으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민으로 치환되어 있는, 3에 기재된 아마도리아제.
[6] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민 또는 히스티딘으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있는, 3에 기재된 아마도리아제.
[7] 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있거나,
서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있는, 3에 기재된 아마도리아제.
[8] 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율(OX/DH)이 개변 전 아마도리아제(100%)와 비교하여 80% 미만으로 저감되어 있는, 1 내지 7 중 어느 하나에 기재된 아마도리아제.
[9] 상기 아마도리아제가 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아르트리늄(Arthrinium) 속, 커벌라리아(Curvularia) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 에메리셀라(Emericella) 속, 울로클라디움(Ulocladium) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 아카에토미엘라(Achaetomiella) 속, 아카에토미움(Achaetomium) 속, 티엘라비아(Thielavia) 속, 카에토미움(Chaetomium) 속, 겔라시노스포라(Gelasinospora) 속, 미크로아스커스(Microascus) 속, 렙토스페리아(Leptosphaeria) 속, 오피오볼러스(Ophiobolus) 속, 플레오스포라(Pleospora) 속, 코니오케티듐(Coniochaetidium) 속, 피치아(Pichia) 속, 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속 또는 아스로박터(Arthrobacter) 속 유래인, 1 내지 8 중 어느 하나에 기재된 아마도리아제.
[10] 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 4, 서열 번호 5, 서열 번호 6, 서열 번호 7, 서열 번호 8, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 12, 서열 번호 13, 서열 번호 44, 서열 번호 53 또는 서열 번호 67에 나타내는 아미노산 서열을 가지며, 1 내지 7 중 어느 하나에 규정한 아미노산 치환을 갖는, 1 내지 9 중 어느 하나에 기재된 아마도리아제.
[11] 나아가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치에 아미노산 치환 또는 결실을 하나 이상 가지며 디히드로게나아제 활성을 갖는, 1 내지 10 중 어느 하나에 기재된 아마도리아제,
(A) 62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위, 419위, 68위 및 356위,
(B) 262위, 257위, 249위, 253위, 337위, 340위, 232위, 129위, 132위, 133위, 44위, 256위, 231위 및 81위,
(C) 카르복실 말단의 435위, 436위 및 437위의 3아미노산 잔기의 결실.
[12] 나아가 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치의 아미노산의 하나 이상이 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나 결실되어 있고 디히드로게나아제 활성을 갖는, 11에 기재된 아마도리아제,
(A) 62위의 아르기닌에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환,
63위의 류신에 대응하는 위치의 아미노산을 히스티딘 또는 알라닌으로 치환,
102위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신으로 치환
106위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 리신 또는 아르기닌으로 치환,
110위의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산을 류신 또는 티로신으로 치환,
113위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환,
355위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 세린으로 치환,
419위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 리신으로 치환,
68위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 아스파라긴으로 치환,
356위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 트레오닌으로 치환,
(B) 262위의 아스파라긴에 대응하는 위치의 아미노산을 히스티딘으로 치환,
257위의 발린에 대응하는 위치의 아미노산을 시스테인, 세린, 트레오닌으로 치환,
249위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
253위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
337위의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
340위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 프롤린으로 치환,
232위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
129위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
132위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
133위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 메티오닌, 리신, 아르기닌으로 치환,
44위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 프롤린으로 치환,
256위의 글리신에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
231위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
81위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
(C) 435위의 프롤린, 436위의 리신 및 437위의 류신에 대응하는 위치의 카르복실 말단 3아미노산의 결실.
[13] 1 내지 12 중 어느 하나에 기재된 아마도리아제를 포함하는 HbA1c 측정 시약 키트.
[14] 1 내지 12 중 어느 하나에 기재된 아마도리아제를 포함하는 효소 전극.
[15] 14에 기재된 효소 전극을 작용 전극으로서 갖는 효소 센서.
[16] 1 내지 12 중 어느 하나에 기재된 아마도리아제 또는 14에 기재된 효소 전극 혹은 15에 기재된 효소 센서 및 전자 매개자를 이용하는 HbA1c의 측정 방법.
본 명세서는 본원의 우선권 기초가 되는 일본특허출원번호 2014-217405호의 개시 내용을 포함한다.
본 발명에 의하면 산소의 영향을 받기 어렵고 나아가 고감도 측정이 가능한 당뇨병 진단용 효소로서, 또한 당뇨병 마커 측정용 센서에 이용할 수 있는 우수한 아마도리아제 및 이를 코드하는 유전자 등을 제공할 수 있다. 이 아마도리아제를 이용하면 산소 존재 하에서도 보다 정확하게 당화 헤모글로빈의 측정을 행할 수 있다.
도 1은 각종 공지의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 동일성 및 유사 아미노산을 예시하는 도면이다. Co, Et, Py, Ar, Cc, Nv 외에 Cn, Pn, An, En, Ul 및 Pj를 얼라이먼트하였다.
도 2는 도 1의 연속이다.
도 3은 도 2의 연속이다.
도 4는 도 3의 연속이다.
도 5는 도 4의 연속이다.
도 6은 아마도리아제의 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성을 나타낸다. 도 6은 효소 반응을 설명하기 위한 모식도로서 효소의 기질 특이성 등의 특성을 한정하는 것은 아니다.
도 7은 CFP-T7 아마도리아제를 이용한 αFVH의 전기 화학적 측정 결과를 나타낸다.
도 8은 도 7의 연속이다.
도 9는 CFP-T7-280Q 아마도리아제를 이용한 αFVH의 전기 화학적 측정 결과를 나타낸다.
도 10은 도 9의 연속이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 아마도리아제는 당화 단백질이나 당화 펩티드를 기질로 할 수 있다.
(당화 단백질, 헤모글로빈 A1c)
본 발명에서의 당화 단백질이란 비효소적으로 당화된 단백질을 가리킨다. 당화 단백질은 생체 내외를 불문하고 존재하며, 생체 내에 존재하는 예로서는 혈액 중의 당화 헤모글로빈, 당화 알부민 등이 있고, 당화 헤모글로빈 중에서도 헤모글로빈의 β쇄 아미노 말단의 발린이 당화된 당화 헤모글로빈을 특히 헤모글로빈 A1c(HbA1c)라고 한다. 생체 밖에 존재하는 예로서는 단백질이나 펩티드와 당이 공존하는 액상 조미료 등의 음식품이나 수액 등이 있다.
(당화 펩티드, 프럭토실 펩티드)
본 발명에서의 당화 펩티드란 당화 단백질 유래의 비효소적으로 당화된 펩티드를 가리키며, 펩티드가 직접 비효소적으로 당화된 것이나 프로테아제 등에 의해 당화 단백질이 분해된 결과 발생한 것이나 당화 단백질을 구성하는 (폴리)펩티드가 당화된 것이 포함된다. 당화 펩티드를 프럭토실 펩티드라고 표기하는 경우도 있다. 당화 단백질에 있어서 당화를 받는 펩티드측의 아미노기로서는 아미노 말단의 α-아미노기, 펩티드 내부의 리신 잔기 측쇄의 ε-아미노기 등을 들 수 있지만, 본 발명에서의 당화 펩티드란 보다 구체적으로 α-당화 펩티드(α-프럭토실 펩티드)이다. α-당화 펩티드는 N 말단의 α-아미노산이 당화된 당화 단백질로부터 어떠한 수단, 예를 들어 프로테아제에 의한 한정 분해 등에 의해 유리시켜 형성된다. 예를 들어 대상의 당화 단백질이 헤모글로빈 A1c(HbA1c)인 경우, 해당하는 α-당화 펩티드는 N말단이 당화되어 있는 HbA1c의 β쇄로부터 절단되는 당화된 펩티드를 가리킨다. 146잔기의 아미노산에 의해 구성되어 있는 HbA1c의 β쇄도 α-당화 펩티드에 해당한다(αF146P).
어떤 실시형태에서 본 발명의 아마도리아제가 작용하는 측정 물질(기질)은 HbA1c, 보다 구체적으로 HbA1c의 β쇄이다. 별도의 실시형태에서 본 발명의 아마도리아제가 작용하는 측정 물질은 HbA1c의 β쇄로부터 절단되는 α-당화 펩티드, 예를 들어 αFV~αF128P, αFV~αF64P, αFV~αF32P, αFV~αF16P, 예를 들어 αF6P(α-프럭토실 발릴 히스티딜 류실 트레오닐 프롤릴 글루타민산)이다. 별도의 실시형태에서 본 발명의 아마도리아제가 작용하는 측정 물질은 αFVH(α-프럭토실 발릴 히스티딘) 또는 αFV(α-프럭토실 발린)이다.
(아마도리아제)
아마도리아제는 케토아민 옥시다아제, 프럭토실 아미노산 옥시다아제, 프럭토실 펩티드 옥시다아제, 프럭토실아민 옥시다아제 등으로도 칭하며 산소의 존재 하에서 이미노2아세트산 혹은 그 유도체(아마도리 화합물)를 산화하여 글리옥실산 또는 α-케토알데히드, 아미노산 또는 펩티드 및 과산화수소를 생성하는 반응을 촉매하는 효소를 말한다. 아마도리아제는 자연계에 널리 분포되어 있고, 미생물이나 동물 혹은 식물 기원의 효소를 탐색함으로써 얻을 수 있다. 미생물에 있어서 예를 들어 사상균, 효모 혹은 세균 등으로부터 얻을 수 있다.
본 발명의 아마도리아제의 일 태양은 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제 또는 서열 번호 6에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 Curvularia clavata 유래의 아마도리아제에 기초하여 제작된, 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제의 변이체이다.
본 발명의 아마도리아제의 일 태양은 서열 번호 3 또는 서열 번호 44에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에 기초하여 제작된, 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제의 변이체이다.
본 발명의 아마도리아제의 일 태양은 서열 번호 9에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 Phaeosphaeria nodorum 유래의 아마도리아제에 기초하여 제작된, 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제의 변이체이다.
본 발명의 아마도리아제의 일 태양은 서열 번호 10 또는 서열 번호 53에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에 기초하여 제작된, 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제의 변이체이다.
본 발명의 아마도리아제의 일 태양은 서열 번호 11 또는 서열 번호 67에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에 기초하여 제작된, 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제의 변이체이다.
이러한 변이체의 예로서는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 6, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 44, 서열 번호 53 또는 서열 번호 67로 높은 서열 동일성(예를 들어 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상)을 갖는 아미노산 서열을 갖는 아마도리아제 및 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 6, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 44, 서열 번호 53 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열에 있어서 하나 내지 수개의 아미노산이 개변 혹은 변이 또는 결실, 치환, 부가 및/또는 삽입된 아미노산 서열을 갖는 아마도리아제를 들 수 있다.
또, 본 발명의 아마도리아제는 예를 들어 Eupenicillium 속, Pyrenochaeta 속, Arthrinium 속, Curvularia 속, Neocosmospora 속, Cryptococcus 속, Phaeosphaeria 속, Aspergillus 속, Emericella 속, Ulocladium 속, Penicillium 속, Fusarium 속, Achaetomiella 속, Achaetomium 속, Thielavia 속, Chaetomium 속, Gelasinospora 속, Microascus 속, Leptosphaeria 속, Ophiobolus 속, Pleospora 속, Coniochaetidium 속, Pichia 속, Corynebacterium 속, Agrobacterium 속, Arthrobacter 속 등의 생물종에 유래하는 아마도리아제에 기초하여 제작된 것으로도 된다. 이들 중에서도 디히드로게나아제 활성을 가지고, 또한/또는 아미노산 서열이 상기와 같이 서열 번호 1로 높은 서열 동일성을 갖는 것이 바람직하다.
옥시다아제 활성이 저감되고 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제의 변이체(개변체)는 아마도리아제의 아미노산 서열에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 치환하거나 부가하거나 결실시킴으로써 얻을 수 있다.
(디히드로게나아제 활성의 향상/옥시다아제 활성의 저감을 가져오는 치환)
디히드로게나아제 활성의 향상 및/또는 옥시다아제 활성의 저감을 가져오는 아미노산의 치환으로서 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서 이하의 위치의 아미노산에 대응하는 위치의 아미노산의 치환을 들 수 있다.
(1) 280위의 시스테인의 치환, 예를 들어 글루타민, 세린, 트레오닌 및 아스파라긴으로 이루어지는 군에서 선택되는 극성 아미노산, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 하전 아미노산, 또는 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환.
(2) 267위의 페닐알라닌의 치환, 예를 들어 티로신, 류신, 메티오닌, 트립토판, 이소류신, 발린 또는 알라닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 소수성 아미노산 잔기로 치환.
(3) 269위의 페닐알라닌의 치환, 예를 들어 티로신, 류신, 메티오닌, 트립토판, 이소류신, 발린 또는 알라닌으로 이루어지는 군에서 선택되는 소수성 아미노산 잔기로 치환.
(4) 54위의 아스파라긴산의 치환, 예를 들어 아스파라긴, 알라닌, 글루타민, 히스티딘, 글리신 또는 발린으로 치환.
(5) 241위의 티로신의 치환, 예를 들어 글루타민, 리신, 글루타민산, 아스파라긴, 아스파라긴산, 아르기닌 또는 히스티딘으로 치환.
본 명세서에서는 편의상 글루타민, 세린, 트레오닌 및 아스파라긴을 극성 아미노산이라고 하는 경우가 있다. 또한, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘을 하전 아미노산이라고 하는 경우가 있다. 또한, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판을 소수성 아미노산이라고 하는 경우가 있다. 또한, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 프롤린을 부피가 큰 아미노산이라고 하는 경우가 있다.
본 발명의 디히드로게나아제 활성이 향상/옥시다아제 활성이 저감된 아마도리아제의 변이체는 상기 아미노산 치환을 적어도 하나 가지고 있으면 되고, 복수의 아미노산 치환을 가지고 있어도 된다. 예를 들어, 상기 아미노산 치환의 1, 2, 3, 4 또는 5를 가지고 있다.
그 중에서도 이하의 아미노산의 위치에 대응하는 아미노산의 치환을 가지고 있는 디히드로게나아제 활성이 향상되고 옥시다아제 활성이 저감된 변이체가 바람직하다.
(1) 280위의 시스테인의 치환, 예를 들어 글루타민, 세린, 히스티딘, 트레오닌, 아스파라긴산, 글루타민산, 메티오닌, 리신, 아르기닌 또는 아스파라긴으로 치환.
(2) 267위의 페닐알라닌의 치환, 예를 들어 티로신, 류신 또는 메티오닌으로 치환.
(3) 269위의 페닐알라닌의 치환, 예를 들어 티로신, 류신 또는 메티오닌으로 치환.
(4) 54위의 아스파라긴산의 치환, 예를 들어 아스파라긴, 알라닌으로 치환.
(5) 241위의 티로신의 치환, 예를 들어 글루타민, 리신 또는 글루타민산으로 치환.
본 발명의 아마도리아제 변이체는 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에 있어서 상기 디히드로게나아제 활성의 향상 및/또는 옥시다아제 활성의 저감을 가져오는 아미노산의 치환을 가질 수 있다. 나아가 본 발명의 아마도리아제 변이체는 이들 치환 아미노산 이외의 위치에서 하나 또는 수개(예를 들어 1~15개, 예를 들어 1~10개, 바람직하게는 1~5개, 더욱 바람직하게는 1~3개, 특히 바람직하게는 1개)의 아미노산이 결실, 삽입, 부가 및/또는 치환되어 있어도 된다. 나아가 본 발명은 상기 디히드로게나아제 활성의 향상 및/또는 옥시다아제 활성의 저감을 가져오는 아미노산의 치환 변이, 기질 특이성 등 디히드로게나아제 활성 향상 이외의 성질을 향상시키는 아미노산의 치환 변이를 가지고, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 상기 치환한 아미노산 이외의 아미노산을 제외한 부분의 아미노산 서열에 대해 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며, 아마도리아제 활성을 가지고, 디히드로게나아제 활성이 개변된 아마도리아제 변이체를 포함한다.
또, 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 아마도리아제는 국제공개 2007/125779호에서 pKK223-3-CFP-T7이라고 부르는 재조합체 플라스미드(기탁 번호: FERM BP-10593)를 보유하는 대장균이 생산하는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제(CFP-T7)로서, 전에 출원인이 발견한 열안정성이 우수한 개변형 아마도리아제이다. 이 CFP-T7은 천연형 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제에 대해 272위, 302위 및 388위에 인위적인 변이를 순차적으로 도입함으로써 획득한 3중 변이체이다.
상기 아미노산 치환에 있어서, 아미노산의 위치는 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 위치를 나타내고 있지만, 다른 생물종 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열에서는 서열 번호 1에 나타나는 아미노산 서열에서의 위치에 대응하는 위치의 아미노산이 치환되어 있다. 「대응하는 위치」의 의미에 대해서는 후술한다.
(추가적인 치환)
(아마도리아제의 기질 특이성을 변화시키는 아미노산 치환에 대해)
본 발명자들은 아마도리아제의 아미노산 잔기를 치환함으로써 그 기질 특이성을 변화시킬 수 있음을 이전에 보고하였다(예를 들어 국제공개 2013/162035호를 참조. 참조에 의해 그 전체내용을 본 명세서에 도입함). 본 발명의 아마도리아제는 경우에 따라 이러한 아미노산 치환을 더 가져도 된다.
아마도리아제의 기질 특이성을 변화시키는 아미노산의 치환으로서 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서 이하의 위치의 아미노산에 대응하는 위치의 아미노산의 치환을 들 수 있다.
(a) 62위의 아르기닌
(b) 63위의 류신
(c) 102위의 글루타민산
(d) 106위의 아스파라긴산
(e) 110위의 글루타민
(f) 113위의 알라닌
(g) 355위의 알라닌
(h) 419위의 알라닌
(i) 68위의 아스파라긴산
(j) 356위의 알라닌
경우에 따라 62위의 아르기닌에 대응하는 위치의 아미노산은 알라닌, 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 (b) 63위의 류신에 대응하는 위치의 아미노산은 히스티딘 또는 알라닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 (c) 102위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산은 리신으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 (d) 106위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산은 알라닌, 리신 또는 아르기닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 (e) 110위의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산은 류신 또는 티로신으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 (f) 113위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산은 리신 또는 아르기닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 (g) 355위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산은 세린으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 (h) 419위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산은 리신으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 (i) 68위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산은 아스파라긴으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 (j) 356위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산은 트레오닌으로 치환되어도 된다.
(아마도리아제의 계면활성제 내성을 향상시키는 아미노산 치환에 대해)
본 발명자들은 아마도리아제의 아미노산 잔기를 치환함으로써 그 계면활성제 내성을 향상시킬 수 있음을 확인하였다. 예를 들어 일본특허출원 2013-221515호 및 PCT/JP2014/071036호 명세서를 참조할 것. 이들 문헌은 참조에 의해 그 전체내용을 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.
아마도리아제의 계면활성제 내성을 향상시키는 아미노산의 치환으로서 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서 이하의 위치의 아미노산에 대응하는 위치의 아미노산의 치환을 들 수 있다.
(i) 262위의 아스파라긴,
(ii) 257위의 발린,
(iii) 249위의 글루타민산
(iv) 253위의 글루타민산,
(v) 337위의 글루타민,
(vi) 340위의 글루타민산,
(vii) 232위의 아스파라긴산,
(viii) 129위의 아스파라긴산,
(ix) 132위의 아스파라긴산,
(x) 133위의 글루타민산,
(xi) 44위의 글루타민산,
(xii) 256위의 글리신,
(xiii) 231위의 글루타민산 및
(xiv) 81위의 글루타민산,
경우에 따라 262위의 아스파라긴에 대응하는 위치의 아미노산은 히스티딘으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 257위의 발린에 대응하는 위치의 아미노산은 시스테인, 세린, 트레오닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 249위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 253위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 337위의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 340위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산은 프롤린으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 232위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 129위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 132위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 133위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산은 알라닌, 메티오닌, 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 44위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산은 프롤린으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 256위의 글리신에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 231위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다.
경우에 따라 81위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산은 리신, 아르기닌으로 치환되어도 된다.
(아마도리아제의 열안정성을 향상시키는 아미노산 결실에 대해)
본 발명자들은 이전에 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기를 결실시킴으로써 그 열안정성을 향상시킬 수 있음을 보고하였다(국제공개 제2013/100006호 명세서를 참조. 참조에 의해 그 전체내용을 본 명세서에 도입함). 어떤 실시형태에 있어서, 본 발명의 아마도리아제는 상기 치환에 더하여 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기를 결실하여도 된다. 본 명세서에서 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기의 결실을 열안정성을 향상시키는 결실이라고 부르는 경우가 있다.
(아마도리아제를 코드하는 유전자의 취득)
이들 아마도리아제를 코드하는 본 발명의 유전자(이하, 단지 「아마도리아제 유전자」라고도 함)를 얻으려면 통상 일반적으로 이용되고 있는 유전자의 클로닝 방법이 이용된다. 예를 들어, 아마도리아제 생산능을 가지는 미생물 균체나 여러 가지 세포로부터 통상의 방법 예를 들어 Current Protocols in Molecular Biology(WILEY Interscience, 1989)에 기재된 방법에 의해 염색체 DNA 또는 mRNA를 추출할 수 있다. 나아가 mRNA를 주형으로 하고 cDNA를 합성할 수 있다. 이와 같이 하여 얻어진 염색체 DNA 또는 cDNA를 이용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리를 제작할 수 있다.
다음으로 상기 아마도리아제의 아미노산 서열에 기초하여 적당한 프로브 DNA를 합성하고, 이를 이용하여 염색체 DNA 또는 cDNA의 라이브러리로부터 아마도리아제 유전자를 선발하는 방법, 혹은 상기 아미노산 서열에 기초하여 적당한 프라이머 DNA를 제작하여 5'RACE법이나 3'RACE법 등의 적당한 폴리메라아제 연쇄 반응(PCR법)에 의해 아마도리아제를 코드하는 목적의 유전자 단편을 포함하는 DNA를 증폭시키고, 이들 DNA 단편을 연결시켜 목적의 아마도리아제 유전자의 전체길이를 포함하는 DNA를 얻을 수 있다.
이와 같이 하여 얻어진 아마도리아제를 코드하는 유전자의 바람직한 일례로서 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제 유전자(일본공개특허 2003-235585호 공보)의 예 등을 들 수 있다.
이들 아마도리아제 유전자는 통상의 방법과 같이 각종 벡터에 연결되어 있는 것이 취급상 바람직하다. 예를 들어, Coniochaeta sp. NISL 9330주 유래의 아마도리아제 유전자를 코드하는 DNA가 pKK223-3 Vector(GE 헬스케어사 제품)에 삽입된 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP(일본공개특허 2003-235585호 공보)를 들 수 있다.
(벡터)
본 발명에서 이용할 수 있는 벡터로서는 상기 플라스미드에 한정되지 않고, 그 이외의 예를 들어 박테리오파지, 코스미드 등의 당업자에게 공지의 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 구체적으로 예를 들어 pBluescriptII SK+(STRATAGENE사 제품) 등이 바람직하다.
(아마도리아제 유전자의 변이 처리)
아마도리아제 유전자의 변이 처리는 기도하는 변이 형태에 따른 공지의 임의의 방법으로 행할 수 있다. 즉, 아마도리아제 유전자 혹은 그 유전자가 도입된 재조합체 DNA와 변이원이 되는 약제를 접촉·작용시키는 방법; 자외선 조사법; 유전자 공학적 수법; 또는 단백질 공학적 수법을 구사하는 방법 등을 널리 이용할 수 있다.
상기 변이 처리에 이용되는 변이원이 되는 약제로서는 예를 들어 히드록실아민, N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘, 아질산, 아황산, 히드라진, 포름산 혹은 5-브로모우라실 등을 들 수 있다.
상기 접촉·작용의 여러 가지 조건은 이용하는 약제의 종류 등에 따른 조건을 채용하는 것이 가능하고, 아마도리아제 유전자에서 현실적으로 원하는 변이를 야기할 수 있는 한 특별히 한정되지 않는다. 통상 바람직하게는 0.5~12M의 상기 약제 농도에서 20~80℃의 반응 온도 하에서 10분간 이상, 바람직하게는 10~180분간 접촉·작용시킴으로써 원하는 변이를 야기 가능하다. 자외선 조사를 행하는 경우에도 상기와 같이 통상의 방법에 따라 행할 수 있다(현대화학, p24~30, 1989년 6월호).
단백질 공학적 수법을 구사하는 방법으로서는 일반적으로 Site-Specific Mutagenesis로서 알려진 수법을 이용할 수 있다. 예를 들어, Kramer법(Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene, 37, 73 (1985)), Eckstein법(Nucleic Acids Res., 13, 8749 (1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986)), Kunkel법(Proc. Natl. Acid. Sci. U.S.A., 82, 488 (1985): Methods Enzymol., 154, 367 (1987)) 등을 들 수 있다. DNA 중의 염기 서열을 변환하는 구체적인 방법으로서는 예를 들어 시판의 키트(Transformer Mutagenesis Kit; Clonetech사, EXOIII/Mung Bean Deletion Kit; Stratagene 제품, Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit; Stratagene 제품 등)의 이용을 들 수 있다.
또한, 일반적인 PCR법(폴리메라아제 체인 리액션, Polymerase Chain Reaction)으로서 알려진 수법을 이용할 수도 있다(Technique, 1, 11(1989)). 또, 상기 유전자 개변법 외에 유기 합성법 또는 효소 합성법에 의해 직접 원하는 개변 아마도리아제 유전자를 합성할 수도 있다.
상기 방법에 의해 얻어지는 아마도리아제 유전자의 DNA 염기 서열의 결정 혹은 확인을 행하는 경우에는 예를 들어 멀티 캐필러리 DNA 해석 시스템 CEQ2000(베크만 쿨터사 제품) 등을 이용함으로써 행할 수 있다.
(형질 전환·형질 도입)
상술한 바와 같이 하여 얻어진 아마도리아제 유전자를 통상의 방법에 의해 박테리오파지, 코스미드 또는 원핵 세포 혹은 진핵 세포의 형질 전환에 이용되는 플라스미드 등의 벡터에 도입하고, 각각의 벡터에 대응하는 숙주를 통상의 방법에 의해 형질 전환 또는 형질 도입을 할 수 있다. 예를 들어, 얻어진 재조합체 DNA를 이용하여 임의의 숙주, 예를 들어 에세리키아 속에 속하는 미생물, 구체예로서는 대장균 K-12주, 바람직하게는 대장균 JM109주, 대장균 DH5α주(모두 다카라 바이오사 제품)나 대장균 B주, 바람직하게는 대장균 BL21주(니폰진사 제품) 등을 형질 전환 또는 이들에 형질 도입하여 각각의 균주를 얻을 수 있다.
(아미노산 서열의 동일성 또는 유사성)
아미노산 서열의 동일성 또는 유사성은 GENETYX Ver.11(제네틱스사 제품)의 맥시멈 매칭이나 서치 호몰로지 등의 프로그램 또는 DNASIS Pro(히타치 솔루션즈사 제품)의 맥시멈 매칭이나 멀티플 얼라이먼트 등의 프로그램에 의해 계산할 수 있다. 아미노산 서열 동일성을 계산하기 위해 2개 이상의 아마도리아제를 얼라이먼트하였을 때에 그 2개 이상의 아마도리아제에서 동일한 아미노산의 위치를 조사할 수 있다. 이러한 정보를 기초로 아미노산 서열 중의 동일 영역을 결정할 수 있다.
또한, 2개 이상의 아마도리아제에서 유사한 아미노산의 위치를 조사할 수도 있다. 예를 들어 CLUSTALW를 이용하여 복수의 아미노산 서열을 얼라이먼트할 수 있고, 이 경우 알고리즘으로서 Blosum62를 사용하여 복수의 아미노산 서열을 얼라이먼트하였을 때에 유사하다고 판단되는 아미노산을 유사 아미노산이라고 부르는 경우가 있다. 본 발명의 변이체에 있어서, 아미노산 치환은 이러한 유사 아미노산 사이의 치환에 의한 것일 수 있다. 이러한 얼라이먼트에 의해 복수의 아미노산 서열에 대해 아미노산 서열이 동일한 영역 및 유사 아미노산에 의해 차지하는 위치를 조사할 수 있다. 이러한 정보를 기초로 아미노산 서열 중의 상동성 영역(보존 영역)을 결정할 수 있다.
본 명세서에서 「상동성 영역」이란 2개 이상의 아마도리아제를 얼라이먼트하였을 때에 어떤 기준이 되는 아마도리아제와 비교 대상의 아마도리아제의 대응하는 위치에서의 아미노산이 동일하거나 유사 아미노산으로 이루어지는 영역으로서, 연속되는 3개 이상, 4개 이상, 5개 이상, 6개 이상, 7개 이상, 8개 이상, 9개 이상 또는 10개 이상의 아미노산으로 이루어지는 영역을 말한다. 예를 들어, 도 1 ~ 도 5에서는 전체길이 아미노산 서열의 서열 동일성이 74% 이상인 아마도리아제를 얼라이먼트하였다. 이 중, 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 제10위~32위는 동일 또는 유사 아미노산으로 이루어지고, 따라서 상동성 영역에 해당한다. 마찬가지로 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 36~41위, 49~52위, 54~58위, 63~65위, 73~75위, 84~86위, 88~90위, 120~122위, 145~150위, 156~162위, 164~170위, 180~182위, 202~205위, 207~211위, 214~224위, 227~230위, 236~241위, 243~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 295~297위, 306~308위, 310~316위, 324~329위, 332~334위, 341~344위, 346~355위, 357~363위, 370~383위, 385~387위, 389~394위, 405~410위 및 423~431위는 상동성 영역에 해당할 수 있다.
바람직하게는 아마도리아제의 상동성 영역은 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 제11위~32위, 36~41위, 50~52위, 54~58위, 84~86위, 88~90위, 145~150위, 157~168위, 202~205위, 207~212위, 215~225위, 236~248위, 258~261위, 266~268위, 270~273위, 275~287위, 347~354위, 357~363위, 370~383위, 385~387위 및 405~410위의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다.
더욱 바람직하게는 아마도리아제의 상동성 영역은 서열 번호 1로 나타나는 Coniochaeta sp. 아마도리아제를 기준으로 하여 제11~18위, 20~32위, 50~52위, 54~58위, 266~268위, 270~273위, 277~286위 및 370~383위의 아미노산 서열로 이루어지는 영역이다.
본 발명의 아마도리아제 변이체는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 6, 서열 번호 9, 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 44, 서열 번호 53 또는 서열 번호 67에 나타나는 아미노산 서열을 갖는 아마도리아제와 얼라이먼트하였을 때에 50% 이상, 예를 들어 60% 이상, 70% 이상, 71% 이상, 72% 이상, 73% 이상, 74% 이상, 75% 이상, 76% 이상, 77% 이상, 78% 이상, 79% 이상, 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상의 전체길이 아미노산 서열 동일성을 가지며 디히드로게나아제 활성을 가진다. 나아가 본 발명의 아마도리아제 변이체의 상동성 영역에서의 아미노산 서열은 서열 번호 1에서의 상동성 영역의 아미노산 서열과 75% 이상, 예를 들어 80% 이상, 81% 이상, 82% 이상, 83% 이상, 84% 이상, 85% 이상, 86% 이상, 87% 이상, 88% 이상, 89% 이상, 90% 이상, 91% 이상, 92% 이상, 93% 이상, 94% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 예를 들어 99% 이상의 서열 동일성을 가진다.
(아미노산에 대응하는 위치의 특정)
「아미노산에 대응하는 위치」란 서열 번호 1에 나타내는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열의 특정 위치의 아미노산에 대응하는 다른 생물종 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 위치를 말한다.
「아미노산에 대응하는 위치」를 특정하는 방법으로서는 예를 들어 리프만 피어슨법 등의 공지의 알고리즘을 이용하여 아미노산 서열을 비교하고, 각 아마도리아제의 아미노산 서열 중에 존재하는 보존 아미노산 잔기에 최대의 동일성을 부여함으로써 행할 수 있다. 아마도리아제의 아미노산 서열을 이러한 방법으로 정렬시킴으로써 아미노산 서열 중에 있는 삽입, 결실에 관계없이 상동 아미노산 잔기의 각 아마도리아제 서열에서의 서열 중의 위치를 결정하는 것이 가능하다. 상동 위치는 3차원 구조 중에서 같은 위치에 존재한다고 생각되며, 대상이 되는 아마도리아제의 특이적 기능에 관해 유사한 효과를 가지는 것을 추정할 수 있다.
도 1, 도 2, 도 3, 도 4, 도 5에 여러 가지 공지의 생물종 유래의 아마도리아제의 서열을 예시한다. 서열 번호 1로 나타나는 아미노산 서열을 최상단에 나타낸다. 도 1 ~ 도 5에 나타나는 각종 서열은 모두 서열 번호 1의 서열과 70% 이상의 동일성을 가지며, 공지의 알고리즘을 이용하여 정렬시켰다. 도면 중에 본 발명의 변이체에서의 변이점을 나타낸다. 도 1, 도 2, 도 3, 도 4, 도 5로부터 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열의 특정 위치의 아미노산에 대응하는 다른 생물종 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열에서의 위치를 알 수 있다. 도 1, 도 2, 도 3, 도 4, 도 5에는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제(서열 번호 1), Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제(서열 번호 3), Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 4), Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 5), Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 6), Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제(서열 번호 7), Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 8), Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 9), Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 10), Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제(서열 번호 11), Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 12) 및 Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제(서열 번호 13)의 아미노산 서열을 나타내고 있다.
(치환 개소에 대응하는 위치)
또, 본 발명에 있어서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 280위의 시스테인에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기(상당하는 위치의 아미노산 잔기)」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 3에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 280위의 시스테인, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 278위의 시스테인, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 280위의 시스테인, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 278위의 시스테인, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 280위의 시스테인, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 280위의 시스테인, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 276위의 시스테인, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 280위의 시스테인, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 280위의 시스테인, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 278위의 시스테인, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 280위의 시스테인이다.
또한, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 267위의 페닐알라닌에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 267위의 페닐알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 3에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 267위의 페닐알라닌, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 265위의 페닐알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 267위의 페닐알라닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 265위의 페닐알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 267위의 페닐알라닌, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 267위의 페닐알라닌, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 263위의 페닐알라닌, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 267위의 페닐알라닌, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 267위의 페닐알라닌, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 265위의 페닐알라닌, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 267위의 페닐알라닌이다.
또한, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 269위의 페닐알라닌에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 269위의 페닐알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 3에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 269위의 페닐알라닌, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 267위의 페닐알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 269위의 페닐알라닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 267위의 페닐알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 269위의 페닐알라닌, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 269위의 페닐알라닌, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 265위의 페닐알라닌, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 269위의 페닐알라닌, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 269위의 이소류신, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 267위의 페닐알라닌, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 269위의 페닐알라닌이다.
또한, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 54위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 54위의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 54위의 아스파라긴산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 54위의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 54위의 아스파라긴산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 54위의 아스파라긴산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 54위의 아스파라긴산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 54위의 아스파라긴산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 54위의 아스파라긴산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 53위의 아스파라긴산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 53위의 아스파라긴산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 54위의 아스파라긴산, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 54위의 아스파라긴산이다.
또, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 241위의 티로신에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 241위의 티로신에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 3에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 241위의 페닐알라닌, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 239위의 티로신, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 241위의 티로신, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 239위의 티로신, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 241위의 티로신, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 241위의 티로신, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 237위의 티로신, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 241위의 페닐알라닌, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 241위의 페닐알라닌, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 239위의 티로신, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 241위의 페닐알라닌이다.
(기질 특이성 개변 변이의 대응 위치)
또, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 62위의 아르기닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 62위의 아르기닌에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 62위의 아르기닌, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 62위의 세린, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 61위의 아르기닌, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 61위의 아르기닌이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 63위의 류신에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 63위의 류신에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 63위의 류신에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 63위의 류신, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 63위의 이소류신, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 62위의 류신이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 102위의 글루타민산에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 102위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 102위의 글루타민산에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 102위의 글루타민산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 102위의 리신, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 101위의 글루타민산이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 106위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 106위의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 106위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 106위의 아스파라긴, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 106위의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 106위의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 106위의 글리신, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 106위의 세린, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 105위의 리신, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 105위의 글리신이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 110위의 글루타민에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 110위의 글루타민에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 110위의 글루타민에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 110위의 리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 110위의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 110위의 글루타민, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 110위의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 110위의 세린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 110위의 글리신, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 109위의 아르기닌, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 109위의 리신이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 113위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 113위의 알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 113위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 113위의 트레오닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 113위의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 113위의 리신, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 112위의 세린, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 113위의 아스파라긴산이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 355위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 355위의 알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 355위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 355위의 알라닌, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 353위의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 356위의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 355위의 세린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 351위의 알라닌이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 419위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 419위의 알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 419위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 419위의 글리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 418위의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 421위의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 420위의 알라닌, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 416위의 세린, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 419위의 세린, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 420위의 알라닌이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 68위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 68위의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 68위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 68위의 아스파라긴산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제 및 Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 67위의 아스파라긴산이다.
또한, 본 발명에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 356위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산이란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 코니오카에타 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 356위의 알라닌에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시켜 특정할 수 있다.
즉, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 356위의 알라닌에 대응하는 위치」의 아미노산은 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 356위의 아스파라긴, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 354위의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 357위의 알라닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 354위의 알라닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 356위의 알라닌, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 356위의 아스파라긴, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 352위의 알라닌, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 356위의 아스파라긴, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 356위의 아스파라긴, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 354위의 알라닌, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 356위의 아스파라긴이다.
(계면활성제 내성 향상 변이의 대응 위치)
또, 본 명세서에서 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 44위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 44위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이에 의해 상기 「대응하는 위치의 아미노산 잔기」를 특정하는 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 44위의 리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 44위의 류신, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 43위의 프롤린, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 43위의 프롤린, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 44위의 프롤린, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 44위의 프롤린이다.
또한, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 81위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 81위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 81위의 아스파라긴, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 81위의 글루타민산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 81위의 히스티딘, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 81위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 81위의 아스파라긴, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 81위의 아스파라긴, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 81위의 글루타민산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 80위의 아스파라긴, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 80위의 아스파라긴, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 81위의 글루타민산, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 81위의 아스파라긴이다.
또한, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 133위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 133위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 133위의 글루타민산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 133위의 글루타민산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 133위의 알라닌, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 133위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 133위의 알라닌, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 133위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 131위의 글루타민산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 132위의 글루타민산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 132위의 글루타민산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 133위의 리신, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 133위의 아스파라긴산이다.
또한, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 253위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 253위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 253위의 알라닌, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 251위의 알라닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 253위의 글루타민산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 251위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 253위의 발린, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 253위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 249위의 아르기닌, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 253위의 알라닌, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 253위의 알라닌, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 251위의 글루타민산, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 253위의 글루타민이다.
또, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 256위의 글리신에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 256위의 글리신에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 256위의 아스파라긴, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 254위의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 256위의 글리신, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 254위의 아스파라긴, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 256위의 글리신, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 256위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 252위의 아스파라긴, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 256위의 아스파라긴, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 256위의 아스파라긴, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 254위의 아스파라긴, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 256위의 아스파라긴산이다.
또, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 257위의 발린에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 257위의 발린에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 257위의 발린, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 255위의 트레오닌, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 257위의 시스테인, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 255위의 발린, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 257위의 시스테인, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 257위의 시스테인, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 253위의 세린, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 257위의 트레오닌, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 257위의 트레오닌, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 255위의 발린, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 257위의 발린이다.
나아가, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 262위의 아스파라긴에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 262위의 아스파라긴에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1 ~ 도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 262위의 아스파라긴산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 260위의 아스파라긴, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 262위의 히스티딘, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 260위의 아스파라긴, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 262위의 히스티딘, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 262위의 아스파라긴, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 258위의 아스파라긴, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 262위의 아스파라긴산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 262위의 아스파라긴산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 260위의 아스파라긴, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 262위의 아스파라긴산이다.
또, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 337위의 글루타민에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 337위의 글루타민에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1 ~ 도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 337위의 리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 335위의 리신, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 338위의 글루타민, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 335위의 트레오닌, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 337위의 리신, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 337위의 리신, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 333위의 리신, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 337위의 아스파라긴, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 337위의 아스파라긴, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 335위의 트레오닌, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 337위의 리신이다.
또, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 340위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 340위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 340위의 글루타민산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 338위의 글루타민산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 341위의 글루타민산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 338위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 340위의 프롤린, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 340위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 336위의 리신, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 340위의 글루타민산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 340위의 글루타민산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 338위의 글루타민산, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 340위의 글루타민산이다.
또, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 129위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 129위의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 129위의 글루타민산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 129위의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 129위의 아스파라긴산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 129위의 아스파라긴산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 129위의 아스파라긴산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 129위의 세린, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 127위의 아스파라긴산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 128위의 글루타민산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 128위의 글루타민산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 129위의 아스파라긴산, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 129위의 글루타민산이다.
또, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 132위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 132위의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 132위의 아스파라긴산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 132위의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 130위의 아스파라긴산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 131위의 아스파라긴산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 131위의 아스파라긴산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 132위의 아스파라긴산이다.
또, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 231위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 231위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 231위의 글루타민산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 229위의 글루타민산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 229위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 227위의 히스티딘, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 229위의 글루타민, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 231위의 글루타민산이다.
또, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 232위의 아스파라긴산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 232위의 아스파라긴산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 232위의 아스파라긴산, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 230위의 아스파라긴산, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 232위의 글루타민산, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 230위의 아스파라긴산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 232위의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 232위의 글리신, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 228위의 글루타민산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 232위의 글루타민산, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 232위의 글루타민산, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 230위의 아스파라긴산, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 232위의 아스파라긴산이다.
또, 「서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 249위의 글루타민산에 대응하는 위치」란 확정된 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1의 아마도리아제의 249위의 글루타민산에 대응하는 아미노산을 의미하는 것이다. 이것도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 249위의 리신, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 247위의 리신, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 249위의 히스티딘, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 247위의 글루타민산, Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 249위의 글루타민산, Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 249위의 글루타민산, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 245위의 글루타민산, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 249위의 알라닌, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 249위의 알라닌, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 247위의 세린, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 249위의 글루타민이다.
(열안정성 향상 결실의 대응 위치)
본 명세서에서 「서열 번호 1에 기재된 아마도리아제의 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기에 대응하는 위치」란 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 나타나는 Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제의 아미노산 서열과 비교한 경우에 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 카르복실 말단으로부터 3아미노산 잔기를 의미한다. Coniochaeta 속 유래의 아마도리아제에서 이 위치의 3잔기의 서열은 435위의 프롤린, 436위의 리신 및 437위의 류신으로 이루어지고, 이들에 대응하는 위치의 아미노산 서열도 상기 방법으로 아미노산 서열을 정렬시킨 도 1~도 5에 의해 특정할 수 있다.
즉, Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 435위의 알라닌, 436위의 히스티딘 및 437위의 류신으로 이루어지고, Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 438위의 알라닌, 439위의 리신 및 440위의 류신으로 이루어지고, Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 450위의 히스티딘, 451위의 리신 및 452위의 류신으로 이루어지고, Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 438위의 세린, 439위의 리신 및 440위의 류신으로 이루어지고, Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 435위의 알라닌, 436위의 아스파라긴 및 437위의 류신으로 이루어지고, Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 436위의 알라닌, 437위의 리신 및 438위의 메티오닌으로 이루어지고, Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 436위의 알라닌, 437위의 리신 및 438위의 메티오닌으로 이루어지고, Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 439위의 알라닌, 440위의 리신 및 441위의 류신으로 이루어지고, Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제에서는 카르복실 말단의 3아미노산이 435위의 알라닌, 436위의 리신 및 437위의 류신으로 이루어진다.
(본 발명의 아마도리아제의 생산)
상기와 같이 하여 얻어진 아마도리아제의 생산능을 가지는 균주를 이용하여 그 아마도리아제를 생산하려면 이 균주를 통상의 고체 배양법으로 배양해도 되지만, 가능한 한 액체 배양법을 채용하여 배양하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 균주를 배양하는 배지로서는 예를 들어 효모 엑기스, 트립톤, 펩톤, 고기 엑기스, 옥수수 침지액 혹은 대두 또는 밀기울의 침출액 등의 1종 이상의 질소원에 염화 나트륨, 인산 제1 칼륨, 인산 제2 칼륨, 황산 마그네슘, 염화 마그네슘, 염화 제2철, 황산 제2철 혹은 황산 망간 등의 무기 염류의 1종 이상을 첨가하고, 나아가 필요에 따라 당질 원료, 비타민 등을 적절히 첨가한 것이 이용된다.
또, 배지의 초기 pH는 pH 7~9로 조정하는 것이 적당하다.
또한, 배양은 임의의 조건을 이용할 수 있지만, 예를 들어 20~42℃의 배양 온도, 바람직하게는 30℃ 전후의 배양 온도로 4~24시간, 더욱 바람직하게는 30℃ 전후의 배양 온도로 8~16시간, 통기 교반 심부 배양, 진탕 배양, 정치 배양 등에 의해 실시할 수 있다.
배양 종료 후 그 배양물로부터 아마도리아제를 채취하려면 통상의 효소 채취 수단을 이용하여 얻을 수 있다. 예를 들어, 통상의 방법에 의해 균체를 초음파 파괴 처리, 마쇄 처리 등을 하거나 리소자임 등의 용균 효소를 이용하여 본 효소를 추출하거나 톨루엔 등의 존재 하에서 진탕 혹은 방치하여 용균을 행하게 하여 본 효소를 균체 밖으로 배출시킬 수 있다. 그리고, 이 용액을 여과, 원심분리하여 고형 부분을 제거하고, 필요에 따라 스트렙토마이신 황산염, 프로타민 황산염 혹은 황산 망간 등에 의해 핵산을 제거한 후, 이에 황안, 알코올, 아세톤 등을 첨가하여 분획하고 침전물을 채취하여 아마도리아제의 조효소를 얻는다.
상기 아마도리아제의 조효소로부터 아마도리아제 정제 효소 표품을 얻으려면, 예를 들어 세파덱스, 슈퍼덱스 혹은 울트로겔 등을 이용하는 겔 여과법; 이온 교환체를 이용하는 흡착 용출법; 폴리아크릴아미드겔 등을 이용하는 전기 영동법; 히드록시 아파타이트를 이용하는 흡착 용출법; 자당 밀도 기울기 원심법 등의 침강법; 어피니티 크로마토그래피법; 분자체막 혹은 중공사막 등을 이용하는 분획법 등을 적절히 선택하거나 이들을 조합하여 실시함으로써 정제된 아마도리아제 효소 표품을 얻을 수 있다. 이와 같이 하여 원하는 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제를 얻을 수 있다.
본 발명의 키트에 포함되는 아마도리아제는 Eupenicillium 속, Pyrenochaeta 속, Arthrinium 속, Curvularia 속, Neocosmospora 속, Cryptococcus 속, Phaeosphaeria 속, Aspergillus 속, Emericella 속, Ulocladium 속, Penicillium 속, Fusarium 속, Achaetomiella 속, Achaetomium 속, Thielavia 속, Chaetomium 속, Gelasinospora 속, Microascus 속, Leptosphaeria 속, Ophiobolus 속, Pleospora 속, Coniochaetidium 속, Pichia 속, Corynebacterium 속, Agrobacterium 속, Arthrobacter 속 등에 유래하는 천연 아마도리아제 또는 이들의 변이체일 수 있다. 이러한 변이체는 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열의 280위의 시스테인, 267위의 페닐알라닌, 269위의 페닐알라닌, 54위의 아스파라긴산, 241위의 티로신으로 이루어지는 군에서 선택되는 위치의 아미노산에 대응하는 위치에서 하나 또는 그 이상의 아미노산 치환을 가진다. 당업자라면 예를 들어 후술하는 시험법 등에 의해 어떤 아마도리아제 또는 그 변이체가 본 발명의 키트에 사용 가능한지, 즉 원하는 디히드로게나아제 활성을 가지는지 용이하게 조사할 수 있다.
(본 발명의 아마도리아제에서의 디히드로게나아제 활성의 향상)
상기와 같은 수단으로 얻어지는 본 발명의 아마도리아제는 유전자 개변 등에 의해 그 아미노산 서열에 변이를 발생시킨 결과 개변 전의 것과 비교하여 옥시다아제 활성이 저하되고 또한/또는 디히드로게나아제 활성이 향상되는 것을 특징으로 한다. 구체적으로 개변 전의 것과 비교하여 「디히드로게나아제 활성」에 대한 「 옥시다아제 활성」의 비율이 저감되어 있는 것을 특징으로 한다. 옥시다아제 활성이란 기질을 산화할 때 산소 분자에 전자를 주고받는 활성을 말한다. 디히드로게나아제 활성이란 기질을 산화할 때 하이드라이드(H-)를 전자 억셉터에 주고받는 활성을 말한다.
센서를 이용한 당화 헤모글로빈의 측정에 있어서 산소의 영향을 저감하려면 옥시다아제 활성이 낮은 것이 바람직하다. 한편, 기질과의 반응성의 관점에서는 디히드로게나아제 활성이 높은 것이 바람직하다. 이 양자를 고려하면 전자 매개자를 사용하는 당화 헤모글로빈 측정에서는 아마도리아제의 옥시다아제 활성(OX)과 디히드로게나아제 활성(DH)의 비 OX/DH가 낮은 것이 바람직하고, 또한 아마도리아제의 옥시다아제 활성(OX)이 낮고 디히드로게나아제 활성(DH)이 높은 것이 바람직하다. 그래서, 본 명세서에서는 편의상 아마도리아제의 특성을 옥시다아제 활성에 대한 디히드로게나아제 활성의 비율을 나타내는 DH/OX 또는 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율 OX/DH를 이용하여 표현하는 경우가 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 개변 전의 것과 비교하여 디히드로게나아제 활성이 증대되어 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 개변 전의 것과 비교하여 옥시다아제 활성이 저감되어 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 개변 전의 것과 비교하여 디히드로게나아제 활성과 옥시다아제 활성의 비 OX/DH가 낮다(DH/OX 비가 높다). 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 개변 전의 것과 비교하여 디히드로게나아제 활성이 증대되어 있을 뿐만 아니라 나아가 옥시다아제 활성이 저감되어 있다. 구체적으로 본 발명의 개변 아마도리아제에서의 옥시다아제 활성에 대한 디히드로게나아제 활성의 비율을 나타내는 DH/OX는 개변 전(1.0배)에 대해 1.3배 이상, 2배 이상, 3배 이상, 4배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 30배 이상, 40배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 300배 이상, 400배 이상, 예를 들어 450배 이상 증대되어 있는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 개변 아마도리아제에서의 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율을 나타내는 OX/DH는 개변 전(100%)과 비교하여 90% 미만, 80% 미만, 75% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 30% 미만, 20% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 2% 미만, 1% 미만, 0.5% 미만, 예를 들어 0.2% 미만으로 저감되는 것이 바람직하다.
디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율은 공지의 아마도리아제의 측정법을 이용하여 임의의 조건 하에서 측정하여 개변 전의 것과 비교할 수 있다. 예를 들어, pH 7.0에서 1mM의 어떤 당화 기질, 예를 들어 αFV를 첨가하여 측정한 옥시다아제 활성을 1mM의 상기 당화 기질, 예를 들어 αFV를 첨가하여 측정한 디히드로게나아제 활성으로 나눈 비율로서 구함으로써 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율을 산출하고, 이를 개변 전의 것과 개변 후의 것으로 비교할 수 있다.
(하이 스루풋 스크리닝)
나아가 아마도리아제는 기능성 아마도리아제 변이체를 취득하기 위해 하이 스루풋 스크리닝에 제공할 수 있다. 예를 들어 변이 도입한 아마도리아제 유전자를 갖는 형질 전환 또는 형질 도입주의 라이브러리를 제작하고, 이를 마이크로타이터 플레이트에 기초한 하이 스루풋 스크리닝에 제공해도 되고, 또는 액적형 마이크로 유체에 기초한 초하이 스루풋 스크리닝에 제공해도 된다. 예로서는 베리언트를 코드하는 변이 유전자의 콤비나트 리얼 라이브러리를 구축하고, 다음으로 파지 디스플레이(예를 들어 Chem. Rev. 105(11): 4056-72, 2005), 이스트 디스플레이(예를 들어 Comb Chem High Throughput Screen. 2008; 11(2): 127-34), 박테리알 디스플레이(예를 들어 Curr Opin Struct Biol 17: 474-80, 2007) 등을 이용하여 변이 아마도리아제의 큰 집단을 스크리닝하는 방법을 들 수 있다. 또한, Agresti et al, "Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed evolution" Proceedings of the National Academy of Sciences 107(9): 4004-4009(Mar, 2010)를 참조할 것. 아마도리아제 베리언트의 스크리닝에 사용할 수 있는 초하이 스루풋 스크리닝 수법에 대한 이 문헌의 기재를 참조에 의해 본 명세서에 도입한다. 예를 들어 에러 프론 PCR법에 의해 라이브러리를 구축할 수 있다. 또한, 포화 돌연변이 유발을 이용하여 본 명세서에 기재된 위치 또는 이에 대응하는 위치를 표적으로서 변이 도입하여 라이브러리를 구축해도 된다. 라이브러리를 이용하여 전기 컴피턴트 EBY-100 세포 등의 적당한 세포를 형질 전환하여 약 10의 7승의 변이체를 취득할 수 있다. 이 라이브러리에서 형질 전환한 효모 세포를 다음으로 셀 소팅에 제공할 수 있다. 표준 소프트 리소그래피법을 이용하여 제작한 폴리디메톡실실록산(PDMS) 마이크로 유체 디바이스를 이용해도 된다. 플로우 포커스 디바이스를 이용하여 단분산의 액적을 형성할 수 있다. 개별적인 변이체를 함유하여 형성된 액적을 적당한 소팅 디바이스에 제공할 수 있다. 세포를 선별할 때에는 디히드로게나아제 활성의 유무를 이용할 수 있다. 변이 도입과 선별은 복수회 반복해도 된다.
(아마도리아제 활성의 측정 방법)
아마도리아제의 활성은 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성이 있고, 여러 가지 방법을 이용함으로써 측정할 수 있다. 일례로서 이하에 본 발명에서 이용하는 아마도리아제 활성의 측정 방법에 대해 설명한다.
(아마도리아제의 옥시다아제 활성의 측정 방법)
본 발명에서의 아마도리아제의 옥시다아제 활성의 측정 방법으로서는 효소의 반응에 의해 생성되는 과산화수소량을 측정하는 방법이나 효소 반응에 의해 소비하는 산소량을 측정하는 방법 등을 주요 측정 방법으로서 들 수 있다. 이하에 일례로서 과산화수소량을 측정하는 방법에 대해 나타낸다.
이하, 본 발명에서의 아마도리아제의 옥시다아제 활성 측정에는 언급이 없는 한 프럭토실 발린을 기질로서 이용한다. 또, 어떤 실시형태에 있어서 효소역가는 프럭토실 발린을 기질로 하여 측정하였을 때 1분간 1μmol의 과산화수소를 생성하는 효소량을 1U라고 정의할 수 있다. 프럭토실 발린 등의 당화 아미노산 및 프럭토실 발릴 히스티딘 등의 당화 펩티드는 사카우에 등의 방법에 기초하여 합성, 정제할 수 있다(일본공개특허 2001-95598호 참조). 또, 이는 측정 방법의 설명을 위한 편의로서 본 발명에 이용하는 아마도리아제의 기질 특이성은 프럭토실 발린에 전혀 한정되는 것은 아니다.
A. 시약의 조제
(1) 시약 1: POD-4-AA 용액
4.0kU의 퍼옥시다아제(기꼬만사 제품), 100mg의 4-아미노안티피린(도쿄 화성공업사 제품)을 0.1M의 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)에 용해하여 1L에 정용(定容)한다.
(2) 시약 2: TOOS 용액
500mg의 TOOS(N-에틸-N-(2-히드록시-3-술포프로필)-m-톨루이딘나트륨, 도진 화학사 제품)를 이온 교환수에 용해하여 100ml에 정용한다.
(3) 시약 3: 기질 용액(30mM; 종농도 1mM)
프럭토실 발린 83mg을 이온 교환수에 용해하여 10ml에 정용한다.
B. 측정법
2.7ml의 시약 1, 100μl의 시약 2 및 100μl의 시약 3을 혼화하여 37℃에서 5분간 예비 가온한다. 그 후, 효소액을 100μl 가하여 잘 섞은 후, 분광 광도계(U-3010, 히타치 하이테크놀로지즈사 제품)에 의해 555nm에서의 흡광도를 측정한다. 측정값은 555nm에서의 1분 후부터 3분 후의 1분당 흡광도 변화로 한다. 또, 대조액은 100μl의 시약 3 대신에 100μl의 이온 교환수를 가하는 것 이외에는 상기와 같이 조제한다. 37℃, 1분당 생성되는 과산화수소의 마이크로 몰수를 효소액 중의 활성 단위(U)로 하고, 하기 식에 따라 산출한다.
활성(U/ml)={(ΔAs-ΔA0)×3.0×df}÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs: 반응액의 1분당 흡광도 변화
ΔA0: 대조액의 1분당 흡광도 변화
39.2: 반응에 의해 생성되는 퀴논이민 색소의 밀리몰 흡광 계수(mM-1·cm-1)
0.5: 1mol의 과산화수소에 의해 생성되는 퀴논이민 색소의 mol수
df: 희석 계수.
(아마도리아제의 디히드로게나아제 활성의 측정 방법)
본 발명에서의 아마도리아제의 디히드로게나아제 활성의 측정 방법으로서는 산소 이외의 전자 매개자를 전자 억셉터로서 이용하여 산화형 전자 매개자의 소비량을 측정하는 방법이나 효소 반응에 의해 얻어진 포르마잔 색소의 생성량을 측정하는 방법 등을 주요 측정 방법으로서 들 수 있다. 이하, 일례로서 포르마잔 색소의 생성량을 측정하는 방법에 대해 나타낸다.
이하, 본 발명에서의 아마도리아제의 디히드로게나아제 활성 측정에는 언급이 없는 한 프럭토실 발린을 기질로서 이용한다. 또, 효소역가는 프럭토실 발린을 기질로 하여 측정하였을 때 1분간 1μmol의 포르마잔 색소를 생성하는 효소량을 1U라고 정의한다.
C. 시약의 조제
(4) 시약 4: WST-3 용액
700mg의 WST-3(2-(4-Iodophenyl)-3-(2,4-dinitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium, monosodium salt, 도진 화학사 제품)을 이온 교환수(pH 7.0)에 용해하여 100mL에 정용한다.
(5) 시약 5: 메톡시 PMS(mPMS) 용액
50mg의 mPMS(1-Methoxy-5-methylphenazinium methylsulfate, 도진 화학사 제품)를 이온 교환수에 용해하여 10ml에 정용한다.
D. 측정법
541μl의 95mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)에 150μl의 시약 4, 9μl의 시약 5 및 25μl의 효소액을 혼화하여 37℃에서 5분간 예비 가온한다. 그 후, 시약 3을 25μl 가하여 잘 섞은 후, 분광 광도계(U-3010, 히타치 하이테크놀로지즈사 제품)에 의해 433nm에서의 흡광도를 측정한다. 측정값은 433nm에서의 1분 후부터 2분 후의 1분당 흡광도 변화로 한다. 또, 대조액은 25μl의 시약 3 대신에 25μl의 이온 교환수를 가하는 것 이외에는 상기와 같이 조제한다. 37℃, 1분당 생성되는 WST-3의 포르마잔 색소의 마이크로 몰수를 효소액 중의 활성 단위(U)로 하고, 하기 식에 따라 산출한다.
활성(U/ml)={(ΔAs-ΔA0)×0.75×df}÷(31×0.025)
ΔAs: 반응액의 1분당 흡광도 변화
ΔA0: 대조액의 1분당 흡광도 변화
31: 반응에 의해 생성되는 WST-3의 포르마잔 색소의 밀리몰 흡광 계수(mM-1·cm-1)
df: 희석 계수.
(측정 시약 키트, 센서)
어떤 실시형태에 있어서, 본 발명은 디히드로게나아제 활성이 향상된 본 발명의 아마도리아제를 포함하는 HbA1c 측정 키트 및 HbA1c 측정 장치를 제공한다. 이 키트 또는 장치는 경우에 따라 전자 매개자를 포함해도 된다.
어떤 실시형태에 있어서 본 발명은 디히드로게나아제 활성이 향상된 본 발명의 아마도리아제를 포함하는 고정된 효소 전극을 제공한다. 어떤 실시형태에 있어서, 디히드로게나아제 활성이 향상된 본 발명의 아마도리아제는 효소 전극에 도포, 흡착 또는 고정화되어 있어도 된다. 별도의 실시형태에서는 전자 매개자도 전극에 도포, 흡착 또는 고정화되어도 된다. 전극으로서는 탄소 전극, 백금, 금, 은, 니켈, 팔라듐 등의 금속 전극 등을 이용할 수 있다. 탄소 전극의 경우 재료로서 열분해 그래파이트 카본(PG), 글라시 카본(GC), 카본 페이스트, 플라스틱 폼드 카본(PFC) 등을 들 수 있다. 측정 시스템은 2전극계이어도 되고 3전극계이어도 되며, 예를 들어 작용 전극 상에 효소를 고정할 수 있다. 참조 전극으로서는 표준 수소 전극, 가역 수소 전극, 은-염화 은 전극(Ag/AgCl), 팔라듐·수소 전극, 포화 칼로멜 전극 등을 들 수 있고, 안정성이나 재현성의 관점에서 Ag/AgCl을 이용하는 것이 바람직하다.
효소는 가교, 투석막에 의한 피복, 고분자 매트릭스에의 봉입, 광가교성 폴리머의 사용, 전기 전도성 폴리머의 사용, 산화/환원 폴리머의 사용 등에 의해 전극에 고정할 수 있다. 또한, 효소를 전자 매개자와 함께 폴리머 중에 고정 혹은 전극 상에 흡착 고정해도 되고, 이들 수법을 조합해도 된다.
본 발명의 아마도리아제는 포텐쇼스탯이나 갈바노스탯 등을 이용함으로써 여러 가지 전기 화학적인 측정 수법에 적용할 수 있다. 전기 화학적 측정법으로서는 암페로메트리, 포텐쇼메트리, 쿨로메트리 등의 다양한 수법을 들 수 있다. 예를 들어 암페로메트리법에 의해, 환원된 매개자가 인가 전압에 의해 산화될 때에 발생하는 전류값을 측정함으로써 시료 중의 당화 기질의 농도를 산출할 수 있다. 인가 전압은 매개자나 장치의 설정에도 따르지만, 예를 들어 -1000 ~ +1000mV(v.s. Ag/AgCl) 등으로 할 수 있다.
당화 기질(예를 들어 αFVH)의 농도 측정은 예를 들어 이하와 같이 하여 행할 수 있다. 항온 셀에 완충액을 넣고 일정 온도로 유지한다. 매개자로서는 페리시안화 칼륨, 페나진 메토설페이트 등을 이용할 수 있다. 작용 전극으로서 본 발명의 개변형 아마도리아제를 고정화한 전극을 이용하고, 대극(對極)(예를 들어 백금 전극) 및 참조 전극(예를 들어 Ag/AgCl 전극)을 이용한다. 카본 전극에 일정한 전압을 인가하여 전류가 정상이 된 후, 당화 기질(예를 들어 αFVH)을 포함하는 시료를 더하여 전류의 증가를 측정한다. 표준 농도의 당화 기질(예를 들어 αFVH) 용액에 의해 제작한 캘리브레이션 커브에 따라 시료 중의 당화 기질(αFVH) 농도를 계산할 수 있다.
나아가 측정에 필요한 용액량을 저감하기 위해 인쇄 전극을 이용할 수도 있다. 이 경우, 전극은 절연 기판 상에 형성되어 이루어지는 것이 바람직하다. 구체적으로 포토리소그래피 기술이나 스크린 인쇄, 그라비아 인쇄, 플렉소 인쇄 등의 인쇄 기술에 의해 전극이 기판 상에 형성되는 것이 바람직하다. 또한, 절연 기판의 소재로서는 실리콘, 유리, 세라믹, 폴리염화비닐, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르 등을 들 수 있지만, 각종 용매나 약품에 대한 내성이 강한 것을 이용하는 것이 보다 바람직하다.
어떤 실시형태에 있어서 본 발명은 상기 효소 전극을 포함하는 센서를 제공한다.
별도의 실시형태에서는 본 발명의 효소 전극을 이용하여 시료 중의 아마도리 화합물의 농도를 효소 반응에 의해 발생하는 전류를 측정함으로써 결정할 수 있다. 일례로서 효소 전극을 작용 전극으로 하고, 이를 대극 및 참조 전극과 함께 사용한다. 대극은 예를 들어 백금 전극으로 할 수 있고, 참조 전극은 예를 들어 Ag/AgCl 전극으로 할 수 있다. 온도를 일정하게 유지하고, 전극을 매개자를 포함하는 완충액 중에 삽입한다. 작용 전극에 전압을 인가하여 시료를 첨가 후, 전류의 변화를 측정한다.
본 발명의 측정 방법, 키트, 장치 및 센서에 이용하는 매개자(인공 전자 매개자, 인공 전자 억셉터, 전자 매개자라고도 함)는 디히드로게나아제 활성이 향상된 본 발명의 아마도리아제로부터 전자를 받을 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 매개자로서는 퀴논류, 페나진류, 비올로겐류, 시토크롬류, 페녹사진류, 페노티아진류, 페리시안화물, 예를 들어 페리시안화 칼륨, 페레독신류, 페로센, 오스뮴 착체 및 그 유도체 등을 들 수 있고, 페나진 화합물로서는 예를 들어 PMS, 메톡시 PMS를 들 수 있지만 이에 한정되지 않는다.
어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 디히드로게나아제 활성이 향상되어 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 옥시다아제 활성이 저감되어 있다. 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 옥시다아제 활성/디히드로게나아제 활성비(OX/DH비)가 저하되어 있다. 또한 어떤 실시형태에 있어서 본 발명의 개변 아마도리아제는 디히드로게나아제 활성이 향상되고 옥시다아제 활성이 저감되어 있다. 이러한 본 발명의 개변 아마도리아제가 촉매하는 효소 반응은 산소의 영향을 받지 않거나 거의 받지 않거나 받기 어렵다. 본 발명의 개변 아마도리아제는 종래의 아마도리아제와 같은 용도로 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 아마도리아제는 시료 중의 당화 기질 농도의 측정에 사용할 수 있고, 이는 예를 들어 당뇨병 진단에 도움이 될 수 있다. 또한, 본 발명의 아마도리아제는 효소 전극으로서 사용할 수 있다. 이는 여러 가지 전기 화학적 측정에 이용할 수 있다. 또한, 본 발명의 아마도리아제는 효소 센서로서 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 아마도리아제는 당뇨병 마커의 측정 키트에 이용할 수 있다. 단, 이는 예시이며, 본 발명의 개변 아마도리아제의 용도는 이에 한정되지 않는다.
[실시예 1]
(디히드로게나아제 활성 향상형 변이에 대해)
(1) 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA의 조제
CFP-T7 유전자(서열 번호 2)를 포함하는 재조합체 플라스미드를 갖는 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7)주(국제공개 2007/125779호 참조)를 LB-amp 배지[1%(W/V) 박토트립톤, 0.5%(W/V) 펩톤, 0.5%(W/V) NaCl, 50μg/ml Ampicilin] 2.5ml에 접종하고 37℃에서 20시간 진탕 배양하여 배양물을 얻었다.
이 배양물을 7,000rpm으로 5분간 원심분리함으로써 집균하여 균체를 얻었다. 다음으로 이 균체로부터 QIAGEN tip-100(키아겐사 제품)을 이용하여 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7을 추출하고 정제하여 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7의 DNA 2.5μg을 얻었다.
(2) 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA의 부위 특이적 개변 조작
얻어진 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하여 서열 번호 14, 15의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 이하의 조건으로 PCR 반응을 행하였다.
즉, 10×KOD-Plus- 완충액을 5μl, dNTP가 각 2mM이 되도록 조제된 dNTPs 혼합 용액을 5μl, 25mM의 MgSO4 용액을 2μl, 주형이 되는 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 50ng, 상기 합성 올리고 뉴클레오티드를 각각 15pmol, KOD-Plus-를 1Unit 가하여 멸균수에 의해 전체량을 50μl로 하였다. 조제한 반응액을 서멀 사이클러(에펜도르프사 제품)를 이용하여 94℃에서 2분간 인큐베이트하고, 이어서 「94℃, 15초」-「50℃, 30초」-「68℃, 6분」의 사이클을 30회 반복하였다.
반응액의 일부를 1.0% 아가로스 겔로 전기 영동하여 약 6,000bp의 DNA가 특이적으로 증폭되어 있는 것을 확인하였다. 이렇게 하여 얻어진 DNA를 제한 효소 DpnI(NEW ENGLAND BIOLABS사 제품)로 처리하고, 잔존하고 있는 주형 DNA를 절단한 후, 대장균 JM109를 형질 전환하여 LB-amp 한천 배지에 전개하였다. 생육한 콜로니를 LB-amp 배지에 접종하여 진탕 배양하고, 상기 (1)과 동일한 방법으로 플라스미드 DNA를 단리하였다. 이 플라스미드 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열을 멀티 캐필러리 DNA 해석 시스템 Applied Biosystems 3130xl 제네틱 애널라이저(Life Technologies사 제품)를 이용하여 결정하고, 그 결과 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 글루타민으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-280Q)를 얻었다.
동일한 순서로 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인을 세린으로 치환하기 위해 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하여 서열 번호 15, 16의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 상기와 같은 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 아마도리아제를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 세린으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-280S)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 15, 17의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 아스파라긴산으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-280D)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 15, 18의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 글루타민산으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-280E)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 15, 19의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 메티오닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-280M)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 15, 20의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 리신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-280K)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 15, 21의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 아르기닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-280R)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 15, 22의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 발린으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-280V)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 15, 23의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 아스파라긴으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-280N)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 24, 25의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 267위의 페닐알라닌이 티로신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-267Y)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 26, 27의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 269위의 페닐알라닌이 티로신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-269Y)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 28, 29의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 54위의 아스파라긴산이 아스파라긴으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-54N)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 29, 30의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 54위의 아스파라긴산이 알라닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-54A)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 31, 32의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 241위의 티로신이 글루타민산으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-241E)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 32, 33의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 241위의 티로신이 글루타민으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-241Q)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 32, 34의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 241위의 티로신이 리신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-241K)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 35, 36의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 히스티딘으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-280H)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 35, 37의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 트레오닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-280T)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 38, 39의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응, DpnI 처리를 행한 후, DpnI 처리 완료된 DNA를 2μl, Ligation high ver.2(토요 방적사 제품)를 5μl, 5U/μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 1μl 가하여 멸균수에 의해 전체량을 15μl로 하여 16℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 이용하여 대장균 JM109를 형질 전환하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 267위의 페닐알라닌이 류신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-267L)를 보유하는 대장균 JM109주를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 38, 40의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응, DpnI 처리를 행한 후, DpnI 처리 완료된 DNA를 2μl, Ligation high ver.2(토요 방적사 제품)를 5μl, 5U/μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 1μl 가하여 멸균수에 의해 전체량을 15μl로 하여 16℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 이용하여 대장균 JM109를 형질 전환하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 267위의 페닐알라닌이 메티오닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-267M)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 41, 42의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응, DpnI 처리를 행한 후, DpnI 처리 완료된 DNA를 2μl, Ligation high ver.2(토요 방적사 제품)를 5μl, 5U/μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 1μl 가하여 멸균수에 의해 전체량을 15μl로 하여 16℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 이용하여 대장균 JM109를 형질 전환하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 269위의 페닐알라닌이 류신으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-269L)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CFP-T7 DNA를 주형으로 하고, 단 서열 번호 41, 43의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응, DpnI 처리를 행한 후, DpnI 처리 완료된 DNA를 2μl, Ligation high ver.2(토요 방적사 제품)를 5μl, 5U/μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 1μl 가하여 멸균수에 의해 전체량을 15μl로 하여 16℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 이용하여 대장균 JM109를 형질 전환하여 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열의 269위의 페닐알라닌이 메티오닌으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CFP-T7-269M)를 얻었다.
PCR 반응, 형질 전환 및 염기 서열 결정은 모두 상기와 같이 행하였다.
(3) 각종 개변형 아마도리아제의 생산
상기 순서에 의해 얻어진 상기 재조합체 플라스미드를 보유하는 각각의 대장균 JM109주를 0.1mM의 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 3ml에서 30℃에서 16시간 배양하였다. 그 후, 각 균체를 pH 7.0의 0.01M 인산 완충액으로 세정, 초음파 파쇄, 15,000rpm으로 10분간 원심분리하여 각 조효소액 1.5ml를 조제하였다.
(4) 각종 개변형 아마도리아제의 옥시다아제 활성 및 디히드로게나아제 활성 평가
이와 같이 하여 조제한 각 조효소액을 샘플로 하고, 상기 옥시다아제 활성 측정법 및 디히드로게나아제 활성 측정법에 따라 각종 개변형 아마도리아제의 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 평가를 행하였다. 결과의 일례를 표 1에 나타낸다.
표 1에서, CFP-T7은 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7)주 유래의 아마도리아제를 나타낸다. 또, 본 실시예에서는 대장균 JM109(pKK223-3-CFP-T7)주 유래의 아마도리아제인 CFP-T7을 변이 원효소로 하였기 때문에, 표 중에 기재된 「아미노산 변이」의 기재에는 CFP-T7에 이미 도입 완료된 각종 변이점은 포함하지 않는다. 표 중, 옥시다아제 활성(%)과 디히드로게나아제 활성(%)은 원효소 CFP-T7의 옥시다아제 활성(U/mL)을 100으로 한 경우의 퍼센티지로 나타낸다. 또한, 표 중 OX/DH(%)는 원효소 CFP-T7의 OX/DH비를 100으로 한 경우의 퍼센티지를 나타낸다.
플라스미드 아미노산
변이		 사용 올리고 뉴클레오티드
서열번호		 옥시
다아제 활성
(%)		 디히드로게나아제 활성
(%)		 OX/DH OX/DH
(%)
pKK223-3-CFP-T7 없음 없음 100.00 3.84 26.0 100.00
pKK223-3-CFP-T7-280Q C280Q 14, 15 0.69 12.05 0.057 0.22
pKK223-3-CFP-T7-280S C280S 15, 16 50.00 16.88 3.00 11.54
pKK223-3-CFP-T7-280D C280D 15, 17 0.19 0.07 2.80 10.77
pKK223-3-CFP-T7-280E C280E 15, 18 0.82 0.57 1.40 5.38
pKK223-3-CFP-T7-280M C280M 15, 19 1.96 1.25 1.60 6.15
pKK223-3-CFP-T7-280K C280K 15, 20 0.16 0.07 2.40 9.23
pKK223-3-CFP-T7-280R C280R 15, 21 0.19 0.05 3.70 14.23
pKK223-3-CFP-T7-280V C280V 15, 22 11.52 0.36 32.0 123.08
pKK223-3-CFP-T7-280N C280N 15, 23 0.65 0.21 3.20 12.31
pKK223-3-CFP-T7-280H C280H 41, 42 0.42 1.25 0.33 1.27
pKK223-3-CFP-T7-280T C280T 41, 43 27.41 2.5 11.0 42.31
pKK223-3-CFP-T7-267Y F267Y 24, 25 20.54 7.95 2.60 10.00
pKK223-3-CFP-T7-267L F267L 35, 36 4.02 9.64 0.41 1.58
pKK223-3-CFP-T7-267M F267M 35, 37 5.54 18.13 0.31 1.19
pKK223-3-CFP-T7-269Y F269Y 26, 27 15.54 5.54 2.80 10.77
pKK223-3-CFP-T7-269L F269L 38, 39 9.38 25.54 0.37 1.42
pKK223-3-CFP-T7-269M F269M 38, 40 20.98 24.20 0.87 3.35
pKK223-3-CFP-T7-54N D54N 28, 29 0.93 0.59 1.60 6.15
pKK223-3-CFP-T7-54A D54A 29, 30 2.14 1.61 1.30 5.00
pKK223-3-CFP-T7-241E Y241E 31, 32 3.84 0.64 6.00 23.08
pKK223-3-CFP-T7-241Q Y241Q 32, 33 76.52 7.95 9.60 36.92
pKK223-3-CFP-T7-241K Y241K 32, 34 205.36 10.89 19.0 73.08
표 1에 나타내는 바와 같이 본 실시예의 조건 하에서는 CFP-T7의 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율 OX/DH는 26.0이 되고, 산소의 영향을 강하게 받는 것을 알 수 있었다. 이에 반해 부위 특이적 변이 도입에 의해 얻어진 22의 변이체 중에서 C280V를 제외한 모든 변이체, 즉 CFP-T7의 280위의 시스테인이 글루타민, 세린, 아스파라긴산, 글루타민산, 메티오닌, 리신, 아르기닌, 아스파라긴, 히스티딘, 트레오닌으로, 267위의 페닐알라닌이 티로신, 류신, 메티오닌으로, 269위의 페닐알라닌이 티로신, 류신, 메티오닌으로, 54위의 아스파라긴산이 아스파라긴, 알라닌으로, 241위의 티로신이 글루타민산, 글루타민, 리신으로 각각 변이한 아마도리아제에서는 OX/DH가 모두 19 이하까지 개선되고, 현저한 것으로는 10 이하까지 개선되고, 보다 현저한 것으로는 6 이하까지 개선되고, 더욱 현저한 것으로는 3.7 이하까지 개선되었다. 특히, C280Q, C280S, F267Y, F267L, F267M, F269Y, F269L, F269M, Y241Q에 대해서는 CFP-T7과 비교하여 디히드로게나아제 활성이 향상되어 있음에도 불구하고 옥시다아제 활성이 저감되어 있는 것이 나타났다. 따라서, 이들 각 변이점이 아마도리아제의 디히드로게나아제 활성을 향상시키는 변이점인 것이 나타났다.
280위에 대해서는 글루타민, 세린, 아스파라긴으로의 치환에 의해 양호한 결과가 얻어진 점에서 마찬가지로 극성 아미노산 잔기인 트레오닌으로의 치환에 의해 동일한 결과가 얻어진다고 생각되며, 이는 상기와 같이 확인되었다.
또한, 280위에 대해서는 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌으로의 치환에 의해 양호한 결과가 얻어진 점에서 마찬가지로 하전 아미노산 잔기인 히스티딘으로의 치환에 의해 동일한 결과가 얻어진다고 생각되며, 이는 상기와 같이 확인되었다.
또한, 280위에 대해서는 메티오닌으로의 치환에 의해 양호한 결과가 얻어진 점에서 마찬가지로 부피가 큰 아미노산인 페닐알라닌, 티로신, 트립토판이나 나아가서는 프롤린으로의 치환에 의해 동일한 결과가 얻어진다고 생각된다.
267위 및 269위에 대해서는 티로신, 메티오닌, 류신으로의 치환에 의해 양호한 결과가 얻어진 점에서 마찬가지로 소수성 아미노산 잔기인 이소류신, 트립토판, 나아가서는 발린이나 알라닌으로의 치환에 의해 동일한 결과가 얻어진다고 생각된다.
54위에 대해서는 아스파라긴으로의 치환에 의해 양호한 결과가 얻어진 점에서 마찬가지로 극성 아미노산 잔기인 글루타민으로의 치환에 의해 동일한 결과가 얻어진다고 생각된다. 또한, 극성 아미노산 잔기로의 치환에 의해 양호한 결과가 얻어진 점에서 하전 아미노산인 히스티딘으로의 치환에 의해 동일한 결과가 얻어진다고 생각된다.
또한, 54위에 대해서는 알라닌으로의 치환에 의해 양호한 결과가 얻어진 점에서 마찬가지로 비극성이고 측쇄의 비교적 작은 글리신 및 발린으로의 치환에 의해 동일한 결과가 얻어진다고 생각된다.
241위에 대해서는 글루타민으로의 치환에 의해 양호한 결과가 얻어진 점에서 마찬가지로 극성 아미노산 잔기인 아스파라긴으로의 치환에 의해 동일한 결과가 얻어진다고 생각된다.
또한, 241위에 대해서는 리신, 글루타민산으로의 치환에 의해 양호한 결과가 얻어진 점에서 마찬가지로 하전 아미노산 잔기인 아르기닌, 아스파라긴산 및 히스티딘으로의 치환에 의해 동일한 결과가 얻어진다고 생각된다.
[실시예 2]
(CFP-T7, CFP-T7-280Q의 정제)
실시예 1에서 얻은 CFP-T7 및 CFP-T7-280Q의 조효소를 이용하여 조제한 조효소액을 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 평형화한 4ml의 Q Sepharose Fast Flow 수지(GE 헬스케어사 제품)에 흡착시키고, 다음으로 80ml의 이 완충액으로 수지를 세정하고, 이어서 100mM NaCl을 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 8.0)으로 수지에 흡착되어 있던 단백질을 용출시켜 아마도리아제 활성을 나타내는 분획을 회수하였다.
얻어진 아마도리아제 활성을 나타내는 분획을 Amicon Ultra-15, 30K NMWL(밀리포어사 제품)로 농축하였다. 그 후, 150mM NaCl을 포함하는 20mM 인산 칼륨 완충액(pH 7.0)으로 평형화한 HiLoad 26/60 Superdex 200pg(GE 헬스케어사 제품)에 어플라이하고, 이 완충액으로 용출시켜 아마도리아제 활성을 나타내는 분획을 회수하고 야생형 및 개변형 아마도리아제의 정제 표품을 얻었다. 얻어진 정제 표품은 SDS-PAGE에 의한 분석에 의해 단일 밴드까지 정제되어 있는 것을 확인하였다.
(옥시다아제 활성 및 디히드로게나아제 활성 평가)
상기와 같이 하여 얻은 정제 효소 CFP-T7 및 CFP-T7-280Q의 옥시다아제 활성, 디히드로게나아제 활성을 평가하였다. 실시예 1에 준한 옥시다아제 활성 및 디히드로게나아제 활성 측정 방법에 따라 평가를 행하였다. 단, 이용한 기질은 30mM의 αFVH이며, 측정에 이용한 효소의 280nm의 흡광도가 1당의 효소 활성값(U/A280)을 산출하였다. 결과의 일례를 표 2에 나타낸다. 표 중 OX/DH(%)는 원효소 CFP-T7의 OX/DH비를 100으로 한 경우의 퍼센티지를 나타낸다.
플라스미드 옥시다아제 활성
(U/A280)		 디히드로게나아제 활성
(U/A280)		 OX/DH OX/DH
(%)
pKK223-3-CFP-T7 6.24 0.63 9.90 100.00
pKK223-3-CFP-T7-C280Q 0.03 0.84 0.037 0.37
표 2로부터 본 실시예의 조건 하에서는 CFP-T7의 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 비율 OX/DH는 9.9가 되고, αFVH의 측정에서도 산소의 영향을 강하게 받는 것을 알 수 있었다. 이에 반해, CFP-T7-280Q의 OX/DH는 0.037이 되고 대폭으로 개선되었다. 본 발명인 C280Q 변이체는 옥시다아제 활성을 208배 저하시키고 디히드로게나아제 활성을 1.3배 향상시켰다. 즉, 산소의 영향을 거의 받지 않고 αFVH를 측정할 수 있다고 할 수 있다.
[실시예 3](각종 아마도리아제의 부위 특이적 개변 조작)
(재조합체 플라스미드 pUTE100K'-EFP-T5 DNA의 조제)
서열 번호 44는 Eupenicillium terrenum 유래 프럭토실 펩티드 옥시다아제(EFP-T5)의 개변형 효소의 아미노산 서열로서, 서열 번호 44의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 45)를 삽입한 재조합체 플라스미드 pUTE100K'-EFP-T5를 보유하는 대장균에 의해 생산할 수 있다(국제공개 제2007/125779호 공보 참조). pUTE100K'-EFP-T5를 보유하는 대장균 JM109주를 「실시예 1 (1) 재조합체 플라스미드 pK223-3-CFP-T7 DNA의 조제」에 기재된 방법에 따라 배양하고 pUTE100K'-EFP-T5를 추출, 정제하였다.
(Eupenicillium terrenum 유래 프럭토실 펩티드 옥시다아제 유전자에의 점변이 도입)
EFP-T5에 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율을 개선하는 변이를 도입하기 위해 재조합체 플라스미드 pUTE100K'-EFP-T5를 주형으로 하고 서열 번호 46, 47의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 EFP-T5 변이체를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 44에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 글루타민으로 치환된 EFP-T5 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pUTE100K'-EFP-T5-280Q)를 얻었다.
마찬가지로 재조합체 플라스미드 pUTE100K'-EFP-T5를 주형으로 하고, 단 서열 번호 35, 36의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 44에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 세린으로 치환된 개변형 아마도리아제를 코드하는 재조합체 플라스미드(pUTE100K'-EFP-T5-280S)를 얻었다.
(재조합체 플라스미드 pET22b-PnFX DNA의 조제)
서열 번호 9는 Phaeosphaeria nodorum 유래 프럭토실 펩티드 옥시다아제(PnFX)의 아미노산 서열로서, 서열 번호 9의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 49)를 삽입한 재조합체 플라스미드 pET22b-PnFX를 보유하는 대장균에 의해 생산할 수 있다(국제공개 제2013/162035호 공보 참조). pET22b-PnFX를 보유하는 대장균 JM109주를 「실시예 1 (1) 재조합체 플라스미드 pK223-3-CFP-T7 DNA의 조제」에 기재된 방법에 따라 배양하고 pET22b-PnFX를 추출, 정제하였다.
(Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제 유전자에의 점변이 도입)
PnFX에 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율을 개선하는 변이를 도입하기 위해 전술한 바와 같이 조제한 재조합체 플라스미드 pET22b-PnFX를 주형으로 하고 서열 번호 50, 51의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 PnFX 변이체를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열의 276위의 시스테인이 글루타민으로 치환된 PnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-PnFX-276Q)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-PnFX를 주형으로 하고 서열 번호 50, 52의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 9에 기재된 아미노산 서열의 276위의 시스테인이 세린으로 치환된 PnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-PnFX-276S)를 얻었다.
그리고, 실시예 1과 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-PnFX-276Q)주, 대장균 BL21(DE3)(pET22b-PnFX-276S)주를 얻었다.
(재조합체 플라스미드 pET22b-AnFX DNA의 조제)
서열 번호 53은 프럭토실 펩티드 옥시다아제 활성을 부여하기 위해 59위의 세린을 글리신으로 치환한 Aspergillus nidulans 유래 프럭토실 아미노산 옥시다아제(AnFX)의 아미노산 서열로서, 서열 번호 53의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 54)를 삽입한 재조합체 플라스미드 pET22b-AnFX를 보유하는 대장균에 의해 생산할 수 있다(국제공개 제2012/018094호 공보 참조). pET22b-AnFX를 보유하는 대장균 JM109주를 「실시예 1 (1) 재조합체 플라스미드 pK223-3-CFP-T7 DNA의 조제」에 기재된 방법에 따라 배양하고 pET22b-AnFX를 추출, 정제하였다.
(Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제 유전자에의 점변이 도입)
AnFX에 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율을 개선하는 변이를 도입하기 위해 재조합체 플라스미드 pET22b-AnFX를 주형으로 하고 서열 번호 55, 56의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 AnFX 변이체를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 글루타민으로 치환된 AnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-AnFX-280Q)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-AnFX를 주형으로 하고 서열 번호 55, 57의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 53에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 세린으로 치환된 AnFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-AnFX-280S)를 얻었다.
그리고, 실시예 1과 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-AnFX-280Q)주, 대장균 BL21(DE3)(pET22b-AnFX-280S)주를 얻었다.
(재조합체 플라스미드 pKK223-3-CcFX DNA의 조제)
서열 번호 6은 Curvularia clavata 유래 케토아민 옥시다아제(CcFX)의 아미노산 서열이다(국제공개 제WO2004/104203호). 서열 번호 6의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 58)를 삽입한 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CcFX를 보유하는 대장균에 의해 생산할 수 있다(국제공개 제2015/020200호 공보 참조). pKK223-3-CcFX를 보유하는 대장균 JM109주를 「실시예 1 (1) 재조합체 플라스미드 pK223-3-CFP-T7 DNA의 조제」에 기재된 방법에 따라 배양하여 pKK223-3-CcFX를 추출, 정제하였다.
(Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제 유전자에의 점변이 도입)
CcFX에 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율을 개선하는 변이를 도입하기 위해 재조합체 플라스미드 pKK223-3-CcFX를 주형으로 하고 서열 번호 59, 60의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응, 대장균 JM109의 형질 전환 및 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 CcFX 변이체를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 278위의 시스테인이 글루타민으로 치환된 CcFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CcFX-278Q)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pKK223-3-CcFX를 주형으로 하고 서열 번호 59, 61의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 278위의 시스테인이 세린으로 치환된 CcFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CcFX-278S)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pKK223-3-CcFX를 주형으로 하고 서열 번호 62, 63의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응, DpnI 처리를 행한 후, DpnI 처리 완료된 DNA를 2μl, Ligation high ver.2(토요 방적사 제품)를 5μl, 5U/μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 1μl 가하여 멸균수에 의해 전체량을 15μl로 하여 16℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 이용하여 대장균 JM109를 형질 전환하여 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 265위의 페닐알라닌이 류신으로 치환된 CcFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CcFX-265L)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pKK223-3-CcFX를 주형으로 하고 서열 번호 62, 64의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응, DpnI 처리를 행한 후, DpnI 처리 완료된 DNA를 2μl, Ligation high ver.2(토요 방적사 제품)를 5μl, 5U/μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 1μl 가하여 멸균수에 의해 전체량을 15μl로 하여 16℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 이용하여 대장균 JM109를 형질 전환하여 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 265위의 페닐알라닌이 메티오닌으로 치환된 CcFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CcFX-265M)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pKK223-3-CcFX를 주형으로 하고 서열 번호 65, 66의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응, DpnI 처리를 행한 후, DpnI 처리 완료된 DNA를 2μl, Ligation high ver.2(토요 방적사 제품)를 5μl, 5U/μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 1μl 가하여 멸균수에 의해 전체량을 15μl로 하여 16℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 이용하여 대장균 JM109를 형질 전환하여 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 267위의 페닐알라닌이 류신으로 치환된 CcFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CcFX-267L)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pKK223-3-CcFX를 주형으로 하고 서열 번호 65, 82의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 PCR 반응, DpnI 처리를 행한 후, DpnI 처리 완료된 DNA를 2μl, Ligation high ver.2(토요 방적사 제품)를 5μl, 5U/μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 1μl 가하여 멸균수에 의해 전체량을 15μl로 하여 16℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 이용하여 대장균 JM109를 형질 전환하여 서열 번호 6에 기재된 아미노산 서열의 267위의 페닐알라닌이 메티오닌으로 치환된 CcFX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pKK223-3-CcFX-267M)를 얻었다.
(Emericella nidulans 유래의 케토아민 옥시다아제 유전자에의 점변이 도입)
서열 번호 67은 Emericella nidulans 유래 당화 헥사펩티드 옥시다아제(En42FX)의 아미노산 서열이다(국제공개 제WO2015/005258호). 서열 번호 67의 아미노산 서열을 코드하는 유전자(서열 번호 68)를 정법인 유전자 단편의 PCR에 의한 전체합성에 의해 cDNA를 전체합성함으로써 취득하였다(종지 코돈 TAA를 포함함). 이어서, 취득한 서열 번호 69의 유전자를 대장균으로 발현시키기 위해 이하의 순서를 행하였다. 우선, In-Fusion HD Cloning Kit(Clontech Laboratories, Inc. 제품)의 사용자 매뉴얼에 따라 서열 번호 68의 유전자를 포함하는 단편을 서열 번호 69, 70의 합성 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 증폭하였다. 평행하여 pET22b를 포함하는 단편을 서열 번호 71, 72의 합성 올리고 뉴클레오티드를 이용하여 증폭하였다. 이어서, In-fusion 반응에 의해 서열 번호 68의 유전자를 포함하는 단편을 pET22b를 포함하는 단편에 서브클로닝하여 재조합체 플라스미드 pET22b-En42FX를 취득하고, 상기와 같은 조건으로 대장균 JM109주를 형질 전환하여 대장균 JM109(pET22b-En42FX)주를 얻었다.
En42FX에 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율을 개선하는 변이를 도입하기 위해 재조합체 플라스미드 pET22b-En42FX를 주형으로 하고 서열 번호 73, 74의 합성 올리고 뉴클레오티드, KOD-Plus-(토요 방적사 제품)를 이용하여 실시예 1과 동일한 조건으로 PCR 반응을 행한 후, DpnI 처리 완료된 DNA를 2μl, Ligation high ver.2(토요 방적사 제품)를 5μl, 5U/μl의 T4 폴리뉴클레오티드 키나아제를 1μl 가하여 멸균수에 의해 전체량을 15μl로 하여 16℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 반응액을 이용하여 대장균 JM109를 형질 전환하여 생육 콜로니가 보유하는 플라스미드 DNA 중의 En42FX 변이체를 코드하는 DNA의 염기 서열 결정을 행하였다. 그 결과, 서열 번호 67에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 글루타민으로 치환된 En42FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-En42FX-280Q)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-En42FX를 주형으로 하고 서열 번호 73, 75의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 67에 기재된 아미노산 서열의 280위의 시스테인이 세린으로 치환된 En42FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-En42FX-280S)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-En42FX를 주형으로 하고 서열 번호 76, 77의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 67에 기재된 아미노산 서열의 267위의 페닐알라닌이 류신으로 치환된 En42FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-En42FX-267L)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-En42FX를 주형으로 하고 서열 번호 76, 78의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 67에 기재된 아미노산 서열의 267위의 페닐알라닌이 메티오닌으로 치환된 En42FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-En42FX-267M)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-En42FX를 주형으로 하고 서열 번호 79, 80의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 67에 기재된 아미노산 서열의 269위의 이소류신이 류신으로 치환된 En42FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-En42FX-269L)를 얻었다.
이어서, 상기와 같이 하여 pET22b-En42FX를 주형으로 하고 서열 번호 79, 81의 합성 올리고 뉴클레오티드를 사용하여 서열 번호 67에 기재된 아미노산 서열의 269위의 이소류신이 메티오닌으로 치환된 En42FX 유전자를 코드하는 재조합체 플라스미드(pET22b-En42FX-269M)를 얻었다.
그리고, 실시예 1과 동일한 조건으로 대장균 BL21(DE3)주를 형질 전환하여 대장균 BL21(DE3)(pET22b-En42FX-280Q)주, 대장균 BL21(DE3)(pET22b-En42FX-280S)주, 대장균 BL21(DE3)(pET22b-En42FX-267L)주, 대장균 BL21(DE3)(pET22b-En42FX-267M)주, 대장균 BL21(DE3)(pET22b-En42FX-269L)주, 대장균 BL21(DE3)(pET22b-En42FX-269M)주를 얻었다.
(각종 개변형 아마도리아제의 생산)
상기 순서에 의해 얻어진 상기 재조합체 플라스미드를 보유하는 각각의 대장균 JM109주 혹은 대장균 BL21(DE3)주를 0.1mM의 IPTG를 첨가한 LB-amp 배지 3ml에서 25℃에서 16시간 배양하였다. 그 후, 각 균체를 pH 7.0의 0.01M 인산 완충액으로 세정, 초음파 파쇄, 15,000rpm으로 10분간 원심분리하여 각 조효소액 1.5ml를 조제하였다.
(각종 개변형 아마도리아제의 옥시다아제 활성 및 디히드로게나아제 활성 평가)
이와 같이 하여 조제한 각 조효소액을 샘플로 하고, 상기 옥시다아제 활성 측정법 및 디히드로게나아제 활성 측정법에 따라 각종 개변형 아마도리아제의 옥시다아제 활성과 디히드로게나아제 활성의 평가를 행하였다. 결과를 표 3-7에 나타낸다. 표 4, 5, 6 중, 옥시다아제 활성(%)과 디히드로게나아제 활성(%)은 각각의 야생형 효소 또는 원효소의 옥시다아제 활성(U/mL)을 100으로 한 경우의 퍼센티지로 나타낸다. 또한, 표 3-7 중 OX/DH(%)는 각각의 야생형 효소 또는 원효소의 OX/DH비를 100으로 한 경우의 퍼센티지를 나타낸다.
플라스미드 아미노산
변이		 사용 올리고
뉴클레오티드
서열번호		 OX/DH OX/DH
(%)
pUTE100K'-EFP-T5 없음 없음 1.44 100.00
pUTE100K'-EFP-T5-280Q C280Q 46, 47 0.24 16.67
pUTE100K'-EFP-T5-280S C280S 46, 48 0.91 63.19
플라스미드 아미노산
변이		 사용 올리고
뉴클레오티드
서열번호		 옥시
다아제
활성
(%)		 디히드로
게나아제
활성
(%)		 OX/DH OX/DH
(%)
pET22b-PnFX 없음 없음 100 46.01 2.17 100.00
pET22b-PnFX-276Q C276Q 50, 51 0.46 12.32 0.037 1.71
pET22b-PnFX-276S C276S 50, 52 35.06 52.69 0.67 30.88
플라스미드 아미노산
변이		 사용 올리고
뉴클레오티드
서열번호		 옥시
다아제
활성
(%)		 디히드로
게나아제
활성
(%)		 OX/DH OX/DH
(%)
pET22b-AnFX 없음 없음 100 6.67 15.0 100.00
pET22b-AnFX-280Q C280Q 55, 56 4.35 13.95 0.31 2.07
pET22b-AnFX-280S C280S 55, 57 38.36 10.16 3.77 25.13
플라스미드 아미노산
변이		 사용 올리고
뉴클레오티드
서열번호		 옥시
다아제
활성
(%)		 디히드로
게나아제
활성
(%)		 OX/DH OX/DH
(%)
pKK223-3-CcFX 없음 없음 100.00 5.32 18.8 100.00
pKK223-3-CcFX-278Q C278Q 59, 60 0.47 9.90 0.047 0.25
pKK223-3-CcFX-278S C278S 59, 61 26.85 9.21 2.91 15.48
pKK223-3-CcFX-265L F265L 62, 63 3.30 9.26 0.36 1.91
pKK223-3-CcFX-265M F265M 62, 64 40.92 178.31 0.23 1.22
pKK223-3-CcFX-267L F267L 65, 66 8.39 17.41 0.48 2.55
pKK223-3-CcFX-267M F267M 65, 82 74.21 128.62 0.58 3.09
플라스미드 아미노산
변이		 사용 올리고
뉴클레오티드
서열번호		 OX/DH OX/DH
(%)
pET22b-EnFX42 없음 없음 0.81 100.00
pET22b-EnFX42-280Q C280Q 73, 74 0.38 46.91
pET22b-EnFX42-280S C280S 73, 75 0.24 29.63
pET22b-EnFX42-267L F267L 76, 77 0.77 95.1
pET22b-EnFX42-267M F267M 76, 78 0.045 5.56
pET22b-EnFX42-269L I269L 79, 80 0.48 59.3
pET22b-EnFX42-269M I269M 79, 81 0.57 70.4
표 3-7에 나타내는 바와 같이, 서열 번호 1의 아마도리아제의 280위의 시스테인에 대응하는 위치의 아미노산 잔기를 글루타민 혹은 세린으로 치환한 모든 경우에서 아미노산 치환 전의 야생형 효소와 비교하여 OX/DH의 값이 개선되었다. 이는 전술한 아미노산 치환에 의한 OX/DH 개선 효과가 아마도리아제의 유래를 불문하고 발휘되는 것을 의미한다.
[실시예 4]
(인쇄 전극에 의한 αFVH의 정량)
실시예 2에서 얻은 CFP-T7 및 CFP-T7-280Q의 정제 효소를 이용하여 인쇄 전극 측정에 의한 αFVH의 정량을 행하였다. 구체적으로 카본의 작용 전극, 은염화은의 참조 전극이 인쇄되어 이루어지는 DEP Chip 전극(DEP-EP-PP, 둥근형 카본 댐 링 부착; 바이오 디바이스 테크놀로지사 제품) 상에 종농도 3.75mM 또는 7.5mM의 mPMS, 종농도 약 10mM의 인산 완충액(pH 7.0) 및 1mM αFVH에 대해 50mU의 각종 정제 효소액을 15μl에 용해한 액을 놓았다. 그 후, DEP Chip 전용 커넥터를 이용하여 소형 포텐쇼스탯 BDT miniSTAT 100(바이오 디바이스 테크놀로지사 제품)에 접속하였다. 그리고, +200mV(v.s. Ag/AgCl)의 전압을 인가하여 소정 농도의 αFVH 용액 5μl를 각각 전극 상에 놓고 반응을 행하여 120초 후의 전류값을 측정하였다. CFP-T7을 이용하여 반응시킨 각 αFVH 농도에서의 전류 응답값을 플롯한 결과를 도 7-8에, CFP-T7-280Q를 이용하여 반응시킨 각 αFVH 농도에서의 전류 응답값을 플롯한 결과를 도 9-10에 나타낸다.
도 7, 도 9로부터 3.75mM의 mPMS를 첨가한 계에서는 CFP-T7보다 CFP-T7-280Q가 정밀도 높게 αFVH를 정량할 수 있는 것이 나타났다. 또한, 도 8, 도 10으로부터 7.5mM의 mPMS를 첨가한 계에서도 CFP-T7보다 CFP-T7-280Q가 정밀도 높게 αFVH를 정량할 수 있는 것이 나타났다.
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로서 본 명세서에 도입하는 것으로 한다.
서열의 간단한 설명
서열 번호 1 CFP-T7의 아미노산 서열
서열 번호 2 CFP-T7의 유전자 서열
서열 번호 3 Eupenicillium terrenum 유래의 아마도리아제
서열 번호 4 Pyrenochaeta sp. 유래의 케토아민 옥시다아제
서열 번호 5 Arthrinium sp. 유래의 케토아민 옥시다아제
서열 번호 6 Curvularia clavata 유래의 케토아민 옥시다아제
서열 번호 7 Neocosmospora vasinfecta 유래의 케토아민 옥시다아제
서열 번호 8 Cryptococcus neoformans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제
서열 번호 9 Phaeosphaeria nodorum 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제
서열 번호 10 Aspergillus nidulans 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제
서열 번호 11 Emericella nidulans 유래의 프럭토실 펩티드 옥시다아제
서열 번호 12 Ulocladium sp. 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제
서열 번호 13 Penicillium janthinellum 유래의 프럭토실 아미노산 옥시다아제
서열 번호 14 C280Q-Fw
서열 번호 15 C280Q-Rv
서열 번호 16 C280S-Fw
서열 번호 17 C280D-Fw
서열 번호 18 C280E-Fw
서열 번호 19 C280M-Fw
서열 번호 20 C280K-Fw
서열 번호 21 C280R-Fw
서열 번호 22 C280V-Fw
서열 번호 23 C280N-Fw
서열 번호 24 F267Y-Fw
서열 번호 25 F267X-Rv
서열 번호 26 F269Y-Fw
서열 번호 27 F269X-Rv
서열 번호 28 D54N-Fw
서열 번호 29 D54X-Rv
서열 번호 30 D54A-Fw
서열 번호 31 Y241E-Fw
서열 번호 32 Y241X-Rv
서열 번호 33 Y241Q-Fw
서열 번호 34 Y241K-Fw
서열 번호 35 CFP-T7 C280X r
서열 번호 36 CFP-T7 C280H f
서열 번호 37 CFP-T7 C280T f
서열 번호 38 CFP-T7 F267X r
서열 번호 39 CFP-T7 F267L f
서열 번호 40 CFP-T7 F267M f
서열 번호 41 CFP-T7 F269X r
서열 번호 42 CFP-T7 F269L f
서열 번호 43 CFP-T7 F269M f
서열 번호 44 EFP-T5 protein
서열 번호 45 EFP-T5 gene
서열 번호 46 EFP C280X r
서열 번호 47 EFP C280Q f
서열 번호 48 EFP C280S f
서열 번호 49 PnFX gene
서열 번호 50 Pn C276X r
서열 번호 51 Pn C276Q f
서열 번호 52 Pn C276S r
서열 번호 53 AnFX protein
서열 번호 54 AnFX gene
서열 번호 55 An C280X r
서열 번호 56 An C280Q f
서열 번호 57 An C280S f
서열 번호 58 CcFX gene
서열 번호 59 Cc C278X r
서열 번호 60 Cc C278Q f
서열 번호 61 Cc C278S f
서열 번호 62 Cc F265X r
서열 번호 63 Cc F265L f
서열 번호 64 Cc F265M f
서열 번호 65 Cc F267X r
서열 번호 66 Cc F267L f
서열 번호 67 En42FX protein
서열 번호 68 En42FX gene
서열 번호 69 In-fusion En42X insert
서열 번호 70 In-fusion En42X insert
서열 번호 71 In-fusion pET22b vector
서열 번호 72 In-fusion pET22b vector
서열 번호 73 En C280X r
서열 번호 74 En C280Q f
서열 번호 75 En C280S f
서열 번호 76 En F267X r
서열 번호 77 En F267L f
서열 번호 78 En F267M f
서열 번호 79 En I269X r
서열 번호 80 En I269L f
서열 번호 81 En I269M f
서열 번호 82 Cc F267M f
SEQUENCE LISTING <110> Kikkoman Corporation <120> Amadoriase with improved dehydrogenase activity <130> PH-6321-PCT <150> JP 2014-217405 <151> 2014-10-24 <160> 82 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 437 <212> PRT <213> Coniochaeta sp. <400> 1 Met Thr Ser Asn Arg Ala Asp Thr Arg Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Val Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Ala Pro Ala Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Phe Glu Ile Pro Ser Ala 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Met Ser Leu Glu Ala Arg Gln Met Trp Lys 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Gln Pro Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Met Asp 85 90 95 Cys Glu His Thr Pro Glu Gly Ile Glu Asp Leu Lys Lys Gln Tyr Gln 100 105 110 Ala Leu His Asp Ala Gly Ala Gly Leu Glu Lys Thr His Ala Trp Leu 115 120 125 Asp Asn Glu Asp Glu Ile Leu Ser Lys Met Pro Leu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 Gln Ile Gln Gly Trp Lys Ala Ile Trp Ser Gln Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Arg 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser Phe Lys Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Asp Asp Glu Gly Thr Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Ala Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Cys Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Tyr Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Glu Glu Ala Ala Glu Tyr Lys Gly 245 250 255 Val Pro Val Val Tyr Asn Gly Glu Phe Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asp 260 265 270 Glu Phe Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg 275 280 285 Phe Lys Glu His Gln Pro Tyr Gly Ala Pro Ser Pro Lys Arg Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Ser Ile Lys Lys Ala Ile Ala Thr Phe Leu Pro Arg Phe 325 330 335 Gln Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Leu Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Ala Leu Leu Met Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe 355 360 365 Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Ile Leu Pro Asn 370 375 380 Val Gly Lys Tyr Val Val Glu Leu Ile Glu Gly Arg Leu Pro Glu Glu 385 390 395 400 Met Ala Tyr Gln Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Lys Ser 405 410 415 Arg Arg Ala Ala Pro Pro Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp Lys 420 425 430 His Asp Pro Lys Leu 435 <210> 2 <211> 1314 <212> DNA <213> Coniochaeta sp. <400> 2 atgacgtcga atcgtgcaga tacaagggtg attgtcgtcg gtggcggagg aacgattggt 60 tcctcgacag cgctgcatct tgtgaggagt ggttatgctc ccgcaaatat cacggtcttg 120 gacacatttg agattccatc ggctcaatca gccggccatg atctcaacaa gatcatggga 180 atacgactgc gcaacaaggt ggacctgcaa atgagtctag aggctagaca gatgtggaag 240 gaggatgagt tattccagcc cttctttcac aataccggca gaatggactg cgaacacacg 300 cctgagggta tcgaggacct gaaaaagcag taccaggcac tgcacgatgc cggtgcgggt 360 ctggagaaga ctcatgcctg gttggacaac gaggatgaga tcttatccaa gatgccgttg 420 cttcaacgtg accaaataca aggatggaaa gcaatatgga gtcaagatgg cggctggtta 480 gctgcggcaa aggccatcaa tgcgatcgga cagttcttga aagaacgtgg tgtaaagttc 540 ggattcggcg gcgctggatc cttcaagcaa ccccttttcg acgatgaagg cacaacttgc 600 attggcgttg agacggcaga tggtaccaaa tattacgctg acaaggtggt cttagcagct 660 ggcgcatgga gcccaaccct ggtggacctg gaagatcaat gttgctcgaa ggcttgggtg 720 tatgctcata ttcagttgac gcctgaagag gccgctgagt ataagggtgt cccagttgtg 780 tataatggcg aatttggctt cttctttgag cctgatgagt ttggtgtaat aaaggtgtgc 840 gacgagttcc caggattctc gcgcttcaag gaacatcaac cctatggcgc cccatctccg 900 aaacggatat cagtaccacg atcgcacgcc aagcatccca cagacactta tccagacgca 960 tccgaagtca gcatcaaaaa agcaatcgcg acgtttctcc ctcgatttca ggacaaggag 1020 ctcttcaatc gcgccttgtg ctggtgtaca gacactgcgg acgctgctct cttgatgtgt 1080 gaacacccca aatggaagaa tttcattcta gcgaccggcg acagcggaca ctcattcaaa 1140 atcttgccta acgtcggaaa atacgtagtc gagttgatag agggccgcct gccggaggaa 1200 atggcttatc aatggaggtg gcggccagga ggcgatgcac tcaagtctag acgtgcggca 1260 ccgccaaaag atcttgcaga catgccagga tggaaacatg atccgaaatt gtaa 1314 <210> 3 <211> 437 <212> PRT <213> Eupenicillium terrenum <400> 3 Met Ala His Ser Arg Ala Ser Thr Lys Val Val Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Ile Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Val Tyr Lys Thr Pro Ser Leu 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Gly Pro Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ser Leu Asp Met Trp Gln 65 70 75 80 Asn Asp Glu Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Gln Val Gly Met Ile Asp 85 90 95 Cys Ser Ser Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asn Leu Arg Arg Lys Tyr Gln 100 105 110 Thr Leu Leu Asp Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Val Trp Leu 115 120 125 Glu Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro Asn Phe Thr Arg Glu 130 135 140 Gln Val Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Thr Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Ile Phe Leu Gln Asp Lys 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Thr Phe Gln Gln Pro Leu 180 185 190 Phe Ala Ala Asp Gly Lys Thr Cys Ile Gly Leu Glu Thr Thr Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Phe Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Pro Thr Leu Val Asp Leu Glu Asp Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Lys Glu Ala Asp Ala Tyr Lys Asn 245 250 255 Val Pro Val Val Tyr Asp Gly Glu Tyr Gly Phe Phe Phe Glu Pro Asn 260 265 270 Glu Tyr Gly Val Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Ser Arg 275 280 285 Phe Lys Leu His Gln Pro Tyr Gly Ala Ala Ser Pro Lys Met Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro Asp Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Thr Ile Arg Lys Ala Ile Ala Arg Phe Leu Pro Glu Phe 325 330 335 Lys Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Thr Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ala Asn Leu Leu Ile Cys Glu His Pro Lys Trp Lys Asn Phe 355 360 365 Ile Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn 370 375 380 Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Ser Leu Ser Gln Glu 385 390 395 400 Met Ala Gly Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Gly Asp Ala Leu Arg Ser 405 410 415 Arg Arg Gly Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Glu Met Pro Gly Trp Lys 420 425 430 His Asp Ala His Leu 435 <210> 4 <211> 440 <212> PRT <213> Pyrenochaeta sp. <400> 4 Met Ala Ala Ser Arg Ala Lys Thr Thr Val Ile Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Leu 35 40 45 Gln Ser Ala Gly Asn Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Lys Val Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ala Arg Glu Met Trp Arg 65 70 75 80 Glu Asp Glu Leu Phe Arg Asp Phe Phe His Asn Thr Gly Arg Leu Asp 85 90 95 Cys Ala His Gly Glu Lys Gly Ile Asn Asp Leu Arg Gln Ala Tyr Gln 100 105 110 Thr Leu Leu Asp Ala Asn Ala Gly Leu Glu Glu Thr Asn Glu Trp Leu 115 120 125 Asp Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Arg Met Pro Leu Leu Ser Arg Glu 130 135 140 Gln Ile Lys Gly Trp Lys Ala Val Phe Ser Arg Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Gly Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Glu Tyr Leu Arg Lys Glu 165 170 175 Gly Val Lys Phe Gly Phe Gly Gly Ala Gly Ser 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primer <400> 15 gaagcgcgag aatcctggga attcgtc 27 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 16 gtaataaagg tgagcgacga attcccagga 30 <210> 17 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 17 gtaataaagg tggatgacga attcccagga 30 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 18 gtaataaagg tggaagacga attcccagga 30 <210> 19 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 19 gtaataaagg tgatggacga attcccagga 30 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 20 gtaataaagg tgaaagacga attcccagga 30 <210> 21 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 21 gtaataaagg tgcgtgacga attcccagga 30 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 22 gtaataaagg tggtggacga attcccagga 30 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 23 gtaataaagg tgaacgacga attcccagga 30 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 24 ggcgaatttg gctatttctt cgaacctgat 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 25 tattacacca aactcatcag gttcgaagaa 30 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 26 ggcttcttct atgaacctga tgagttt 27 <210> 27 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 27 ctttattaca ccaaactcat caggttc 27 <210> 28 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 28 tcagccggcc ataacctcaa caagatcatg 30 <210> 29 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 29 gcgcagtcgt attcccatga tcttgttgag 30 <210> 30 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 30 tcagccggcc atgcgctcaa caagatcatg 30 <210> 31 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 31 aaggcttggg tggaagctca tattcagttg 30 <210> 32 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 32 ggcctcttca ggcgtcaact gaatatgagc 30 <210> 33 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 33 aaggcttggg tgcaggctca 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43 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 43 atggagcctg atgagtttgg tgtaataaag 30 <210> 44 <211> 437 <212> PRT <213> Eupenicillium terrenum <400> 44 Met Ala His Ser Arg Ala Ser Thr Lys Val Val Val Val Gly Gly Gly 1 5 10 15 Gly Thr Ile Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Ile Arg Ser Gly Tyr 20 25 30 Thr Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Val Tyr Lys Thr Pro Ser Leu 35 40 45 Gln Ser Ala Gly His Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg 50 55 60 Asn Gly Pro Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ser Leu Asp Met Trp Gln 65 70 75 80 Asn Asp Glu Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Gln Val Gly Met Ile Asp 85 90 95 Cys Ser Ser Ser Lys Glu Gly Ile Glu Asn Leu Arg Arg Lys Tyr Gln 100 105 110 Thr Leu Leu Asp Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Val Trp Leu 115 120 125 Glu Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro Asn Phe Thr Arg Glu 130 135 140 Gln Val Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Thr Asp Gly Gly Trp Leu 145 150 155 160 Ala Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Ile Phe Leu Gln Asp Lys 165 170 175 Gly 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aatttccggg 30 <210> 52 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 52 cgttatcaaa gtcagcgatg aatttccggg 30 <210> 53 <211> 438 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 53 Met Thr Pro Arg Ala Asn Thr Lys Ile Ile Val Val Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Thr Met Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ala Gly Tyr Thr 20 25 30 Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Cys Pro Ile Pro Ser Ala Gln 35 40 45 Ser Ala Gly Tyr Asp Leu Asn Lys Ile Met Gly Ile Arg Leu Arg Asn 50 55 60 Lys Pro Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ala Leu Asp Met Trp Lys Asn 65 70 75 80 Asp Pro Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Asn Val Gly Met Ile Asp Val 85 90 95 Ser Ser Thr Glu Glu Gly Ile Glu Gly Leu Arg Lys Lys Tyr Gln Ser 100 105 110 Leu Leu Asp Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Phe Met Leu Glu 115 120 125 Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro His Phe Thr Gln Glu Gln 130 135 140 Ile Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Gly Asp Gly Gly Trp Leu Ala 145 150 155 160 Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Gln 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<211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 56 catcataaaa gtccaggacg aattccctgg 30 <210> 57 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 57 catcataaaa gtcagtgacg aattccctgg 30 <210> 58 <211> 1323 <212> DNA <213> Curvularia clavata <400> 58 atggccccga gtcgcgctaa cacgagcgtc attgtggtgg gtggtggtgg cacgattggt 60 tcctcaacgg cactgcatct ggtccgtagc ggctataccc cgtctaacat taccgtgctg 120 gacacgtacc cgatcccgag cgcccagtct gcaggcaacg atctgaataa aattatgggt 180 atccgtctgc gcaacaaagt tgatctgcag ctgtcactgg aagcccgtca aatgtggcgc 240 gaagatgacc tgtttaaaga atacttccat aacaccggcc gtctggattg cgcacacggt 300 gaagaaggtc tggccgacct gcgccaggct taccaagcgc tgctggatgc caacgcaggt 360 ctggaagaaa ccacggaatg gctggattca gaagacgaaa ttctgaagaa aatgccgctg 420 ctggatcgtg aacagatcaa aggttggaaa gccgtgtatt cgcaagatgg cggttggctg 480 gcggccgcaa aagccattaa tgcaatcggc gaatacctgc gcgcgcaggg cgttaaattc 540 ggttttggcg gtgctggttc ctttaaacag ccgctgctgg cagaaggcgt ctgcattggt 600 gtcgaaaccg tggatggcac gcgttattac gcggacaaag tggttctggc tgcaggtgca 660 tggagtccgg tgctggttga tctggaagac cagtgtgtgt ccaaagcgtg ggtttatgcg 720 catatccaac tgaccccgga agaagccgca gaatataaaa acgtcccggt cgtgtacaat 780 ggcgatgtgg gctttttctt tgaaccggac gaacatggcg ttattaaagt ctgcgatgaa 840 tttccgggtt ttacccgctt caaacagcac caaccgtatg gcgctaaagc gccgaaacgt 900 atctcagtgc cgcgttcggc tgcaaaacac ccgaccgata cgtacccgga cgcgagtgaa 960 aaatccattc gtaaagccat cgcaaccttt ctgccgaaat tcacggaaaa agaactgttt 1020 aatcgccatc tgtgctggtg taccgatacg gccgacgccg cactgctgat gtgtgaacac 1080 ccggaatgga aaaactttgt tctggcgacc ggcgatagcg gtcatacgtt caaactgctg 1140 ccgaatattg gcaaacacgt tgtcgaactg ctggaaggta ccctggcaga agacctggct 1200 catgcgtggc gttggcgtcc gggtacgggt gatgcactga aatctcgtcg cgctgcgccg 1260 gcgaaagacc tggcggatat gccgggctgg aaacacgacg atgtggtgaa aagcaaactg 1320 taa 1323 <210> 59 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 59 gactttaata acgccatgtt cgtccggttc 30 <210> 60 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 60 cgttattaaa gtccaggatg aatttccgg 29 <210> 61 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 61 cgttattaaa gtcagcgatg aatttccgg 29 <210> 62 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 62 gcccacatcg ccattgtaca cgaccgggac 30 <210> 63 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 63 ttattctttg aaccggacga acatggcgtt 30 <210> 64 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 64 atgttctttg aaccggacga acatggcgtt 30 <210> 65 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 65 gaaaaagccc acatcgccat tgtacacgac 30 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 66 ttagaaccgg acgaacatgg cgttattaaa 30 <210> 67 <211> 438 <212> PRT <213> Emericella nidulans <400> 67 Met Ala Pro Arg Ala Asn Thr Lys Ile Ile Val Val Gly Gly Gly Gly 1 5 10 15 Thr Met Gly Ser Ser Thr Ala Leu His Leu Leu Arg Ala Gly Tyr Thr 20 25 30 Pro Ser Asn Ile Thr Val Leu Asp Thr Tyr Pro Ile Pro Ser Ala Gln 35 40 45 Ser Ala Gly Tyr Asp Leu Asn Lys Ile Phe Gly Ile Ser Gly Ala Asn 50 55 60 Lys His Asp Leu Gln Leu Ser Leu Glu Ala Phe Asp Met Trp Lys Asn 65 70 75 80 Asp Pro Leu Phe Lys Pro Phe Phe His Asn Val Gly Gln Met Asp Val 85 90 95 Ser Ser Thr Glu Glu Gly Ile Lys Arg Leu Arg Arg Arg Tyr Gln Ser 100 105 110 Leu Leu Arg Ala Gly Ile Gly Leu Glu Lys Thr Asn Phe Leu Leu Glu 115 120 125 Ser Glu Asp Glu Ile Leu Ala Lys Ala Pro His Phe Thr Arg Glu Gln 130 135 140 Ile Lys Gly Trp Lys Gly Leu Phe Cys Gly Asp Gly Gly Trp Leu Ala 145 150 155 160 Ala Ala Lys Ala Ile Asn Ala Ile Gly Gln Phe Leu Lys Glu Gln Gly 165 170 175 Val Lys Phe Gly Phe Gly Glu Ala Gly Thr Phe Lys Lys Pro Leu Phe 180 185 190 Ala Asp Ala Asp Glu Lys Thr Cys Ile Gly Val Glu Thr Val Asp Gly 195 200 205 Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Lys Val Val Leu Ala Ala Gly Ala Trp Ser 210 215 220 Ser Thr Leu Val Asp Leu Glu Glu Gln Cys Val Ser Lys Ala Trp Val 225 230 235 240 Phe Ala His Ile Gln Leu Thr Pro Ala Glu Ala Ala Ala Tyr Lys Asn 245 250 255 Thr Pro Val Ile Tyr Asp Gly Asp Tyr Gly Phe Phe Ile Glu Pro Asp 260 265 270 Glu Asn Gly Ile Ile Lys Val Cys Asp Glu Phe Pro Gly Phe Thr His 275 280 285 Phe Lys Met His Gln Pro Tyr Gly Ser Pro Val Pro Lys Leu Ile Ser 290 295 300 Val Pro Arg Ser His Ala Lys His Pro Thr Asp Thr Tyr Pro His Ala 305 310 315 320 Ser Glu Val Thr Ile Lys Lys Ala Ile Asn Arg Phe Leu Pro Arg Phe 325 330 335 Asn Asp Lys Glu Leu Phe Asn Arg Ala Met Cys Trp Cys Thr Asp Thr 340 345 350 Ala Asp Ser Asn Leu Leu Val Cys Glu His Pro Arg Trp Lys Gly Phe 355 360 365 Tyr Leu Ala Thr Gly Asp Ser Gly His Ser Phe Lys Leu Leu Pro Asn 370 375 380 Ile Gly Lys His Val Val Glu Leu Leu Glu Gly Arg Leu Glu Ser Val 385 390 395 400 Phe Lys Asp Ala Trp Arg Trp Arg Pro Gly Ser Gly Asp Ala Leu Lys 405 410 415 Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ala Lys Asp Leu Ala Asp Met Pro Gly Trp 420 425 430 Arg Asn Glu Ala Lys Met 435 <210> 68 <211> 1317 <212> DNA <213> Emericella nidulans <400> 68 atggctccgc gtgcgaatac gaaaatcatt gttgtcggtg gtggtggtac gatgggttca 60 agtacggctc tgcatctgct gcgtgcgggc tataccccga gcaacattac cgtgctggat 120 acgtatccga tcccgtcagc gcagtcggcc ggttacgacc tgaacaaaat ttttggtatc 180 agcggtgcaa ataaacatga tctgcaactg tctctggaag cgtttgatat gtggaaaaac 240 gacccgctgt ttaaaccgtt tttccacaat gtgggccaga tggatgttag ctctaccgaa 300 gaaggtatta aacgcctgcg tcgccgttac caaagtctgc tgcgtgccgg catcggtctg 360 gaaaaaacca acttcctgct ggaatccgaa gatgaaattc tggcgaaagc cccgcatttc 420 acgcgcgaac agatcaaagg ctggaaaggt ctgttttgcg gtgatggcgg ttggctggcc 480 gcagcaaaag caattaatgc tatcggccag tttctgaaag aacaaggtgt gaaatttggc 540 ttcggtgaag cgggtacctt caaaaaaccg ctgtttgcag atgctgacga aaaaacgtgc 600 attggcgttg aaaccgtcga tggtacgaaa tattacgcag acaaagtggt tctggctgcg 660 ggcgcttgga gttccaccct ggttgatctg gaagaacagt gtgtcagcaa agcgtgggtg 720 tttgcccaca tccaactgac cccggccgaa gccgcagctt ataaaaacac gccggtgatt 780 tatgatggcg actacggctt tttcatcgaa ccggatgaaa atggcattat caaagtttgc 840 gacgaatttc cgggtttcac ccattttaaa atgcaccagc cgtatggctc accggttccg 900 aaactgatta gtgtcccgcg ttcccatgca aaacacccga ccgatacgta cccgcatgca 960 tcggaagtca cgattaagaa agcgatcaac cgcttcctgc cgcgttttaa cgacaaagaa 1020 ctgttcaatc gcgcgatgtg ctggtgtacc gatacggccg acagcaatct gctggtttgt 1080 gaacacccgc gttggaaagg tttctatctg gcgaccggcg atagcggtca ttcttttaaa 1140 ctgctgccga atattggcaa acacgtcgtg gaactgctgg aaggtcgcct ggaatctgtg 1200 tttaaagatg cgtggcgctg gcgtccgggc tcaggtgatg cactgaaatc gcgtcgcgca 1260 gcaccggcga aagacctggc ggatatgccg ggttggcgta atgaagcgaa aatgtaa 1317 <210> 69 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 69 gaaggagata tacatatggc tccgcgtgcg aatac 35 <210> 70 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 70 ctcgaattcg gatccttaca ttttcgcttc attac 35 <210> 71 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 71 ggatccgaat tcgagctccg tcgacaagct 30 <210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 72 atgtatatct ccttcttaaa gttaaacaaa 30 <210> 73 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 73 aactttgata atgccatttt catccggttc 30 <210> 74 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 74 caggacgaat ttccgggttt cacccatttt 30 <210> 75 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 75 agcgacgaat ttccgggttt cacccatttt 30 <210> 76 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 76 gccgtagtcg ccatcataaa tcaccggcgt 30 <210> 77 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 77 ttattcatcg aaccggatga aaatggcatt 30 <210> 78 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 78 atgttcatcg aaccggatga aaatggcatt 30 <210> 79 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 79 gaaaaagccg tagtcgccat cataaatcac 30 <210> 80 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 80 ctcgaaccgg atgaaaatgg cattatcaaa 30 <210> 81 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 81 atggaaccgg atgaaaatgg cattatcaaa 30 <210> 82 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 82 atggaaccgg acgaacatgg cgttattaaa 30

Claims (19)

  1. 디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율(OX/DH)이 개변 전 아마도리아제와 비교하여 저감되어 있는 개변 아마도리아제로서,
    아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 치환되어 있고 디히드로게나아제 활성을 가지며, 이하의 아미노산 서열 동일성을 가지는 개변 아마도리아제:
    해당 개변 아마도리아제의 전체길이 아미노산 서열이 서열 번호 1, 서열 번호 6, 서열 번호 9, 서열 번호 44, 서열 번호 53 또는 서열 번호 67의 아미노산 서열과 90% 이상의 아미노산 서열 동일성을 가지며 디히드로게나아제 활성을 갖는 개변 아마도리아제,
    여기서 그 개변 아마도리아제는
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 트레오닌 및 아스파라긴으로 이루어지는 군에서 선택되는 극성 아미노산, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 및 히스티딘으로 이루어지는 군에서 선택되는 하전 아미노산, 또는 메티오닌, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있는 상기 개변 아마도리아제.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서,
    (A)서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 히스티딘, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 또는 메티오닌으로 치환되어 있거나, 또는
    (B) 추가적으로, 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신 또는 트립토판으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신, 티로신, 이소류신 또는 트립토판으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 54위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 글루타민산 또는 리신으로 치환되어 있는 개변 아마도리아제.
  4. 청구항 3에 있어서,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 세린, 히스티딘, 트레오닌, 아스파라긴, 아스파라긴산, 글루타민산, 리신, 아르기닌 또는 메티오닌으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 54위에 대응하는 위치의 아미노산이 아스파라긴 또는 알라닌으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민, 글루타민산 또는 리신으로 치환되어 있는 개변 아마도리아제.
  5. 청구항 3에 있어서,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민 또는 세린으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌, 류신 또는 티로신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 241위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민으로 치환되어 있는 개변 아마도리아제.
  6. 청구항 3에 있어서,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민 또는 히스티딘으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있는 개변 아마도리아제.
  7. 청구항 3에 있어서,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 280위에 대응하는 위치의 아미노산이 글루타민으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 267위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있거나,
    서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 269위에 대응하는 위치의 아미노산이 메티오닌 또는 류신으로 치환되어 있는 개변 아마도리아제.
  8. 청구항 1, 및 청구항 3 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    디히드로게나아제 활성에 대한 옥시다아제 활성의 비율(OX/DH)이 개변 전 아마도리아제(100%)와 비교하여 80% 미만으로 저감되어 있는 개변 아마도리아제.
  9. 청구항 1, 및 청구항 3 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아마도리아제가 코니오카에타(Coniochaeta) 속, 유페니실리움(Eupenicillium) 속, 피레노케타(Pyrenochaeta) 속, 아르트리늄(Arthrinium) 속, 커벌라리아(Curvularia) 속, 네오코스모스포라(Neocosmospora) 속, 크립토코커스(Cryptococcus) 속, 페오스페리아(Phaeosphaeria) 속, 아스페르길루스(Aspergillus) 속, 에메리셀라(Emericella) 속, 울로클라디움(Ulocladium) 속, 페니실리움(Penicillium) 속, 푸사리움(Fusarium) 속, 아카에토미엘라(Achaetomiella) 속, 아카에토미움(Achaetomium) 속, 티엘라비아(Thielavia) 속, 카에토미움(Chaetomium) 속, 겔라시노스포라(Gelasinospora) 속, 미크로아스커스(Microascus) 속, 렙토스페리아(Leptosphaeria) 속, 오피오볼러스(Ophiobolus) 속, 플레오스포라(Pleospora) 속, 코니오케티듐(Coniochaetidium) 속, 피치아(Pichia) 속, 데바리오마이세스(Debaryomyces) 속, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 아그로박테리움(Agrobacterium) 속 또는 아스로박터(Arthrobacter) 속 유래인 개변 아마도리아제.
  10. 삭제
  11. 청구항 1, 및 청구항 3 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    추가적으로 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치에 아미노산 치환 또는 결실을 하나 이상 가지며 디히드로게나아제 활성을 갖는 개변 아마도리아제:
    (A) 62위, 63위, 102위, 106위, 110위, 113위, 355위, 419위, 68위 및 356위,
    (B) 262위, 257위, 249위, 253위, 337위, 340위, 232위, 129위, 132위, 133위, 44위, 256위, 231위 및 81위, 및
    (C) 카르복실 말단의 435위, 436위 및 437위의 3아미노산 잔기의 결실.
  12. 삭제
  13. 청구항 1, 및 청구항 3 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 기재된 개변 아마도리아제를 포함하는 HbA1c 측정 시약 키트.
  14. 청구항 1, 및 청구항 3 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 기재된 개변 아마도리아제를 포함하는 효소 전극.
  15. 청구항 14에 기재된 효소 전극을 작용 전극으로서 갖는 효소 센서.
  16. 청구항 1, 및 청구항 3 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 기재된 개변 아마도리아제를 이용하는 HbA1c의 측정 방법.
  17. 청구항 14에 기재된 효소 전극 및 전자 매개자를 이용하는 HbA1c의 측정 방법.
  18. 청구항 15에 기재된 효소 센서 및 전자 매개자를 이용하는 HbA1c의 측정 방법.
  19. 청구항 11에 있어서, 추가적으로 아마도리아제의 아미노산 서열을 서열 번호 1에 기재된 아미노산 서열과 얼라이먼트하였을 때에 서열 번호 1에 나타내는 아미노산 서열에서의 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 위치에 대응하는 위치의 아미노산의 하나 이상이 이하로 이루어지는 군에서 선택되는 아미노산으로 치환되어 있거나 결실되어 있고 디히드로게나아제 활성을 갖는 아마도리아제:
    (A) 62위의 아르기닌에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 아스파라긴 또는 아스파라긴산으로 치환,
    63위의 류신에 대응하는 위치의 아미노산을 히스티딘 또는 알라닌으로 치환,
    102위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신으로 치환,
    106위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 리신 또는 아르기닌으로 치환,
    110위의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산을 류신 또는 티로신으로 치환,
    113위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 리신 또는 아르기닌으로 치환,
    355위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 세린으로 치환,
    419위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 리신으로 치환,
    68위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 아스파라긴으로 치환,
    356위의 알라닌에 대응하는 위치의 아미노산을 트레오닌으로 치환,
    (B) 262위의 아스파라긴에 대응하는 위치의 아미노산을 히스티딘으로 치환,
    257위의 발린에 대응하는 위치의 아미노산을 시스테인, 세린, 트레오닌으로 치환,
    249위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    253위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    337위의 글루타민에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    340위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 프롤린으로 치환,
    232위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    129위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    132위의 아스파라긴산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    133위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 알라닌, 메티오닌, 리신, 아르기닌으로 치환,
    44위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 프롤린으로 치환,
    256위의 글리신에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    231위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환,
    81위의 글루타민산에 대응하는 위치의 아미노산을 리신, 아르기닌으로 치환, 및
    (C) 435위의 프롤린, 436위의 리신 및 437위의 류신에 대응하는 위치의 카르복실 말단 3아미노산의 결실.
KR1020177009797A 2014-10-24 2015-10-23 디히드로게나아제 활성이 향상된 아마도리아제 Active KR102159807B1 (ko)

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