KR102129852B1

KR102129852B1 - Rna 간섭 유도 핵산 및 이를 포함하는 hpv 감염 유발 암의 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102129852B1
Application number: KR1020170130179A
Authority: KR
Inventors: 지성욱; 장은숙
Original assignee: 주식회사 인코드젠
Priority date: 2016-10-11
Filing date: 2017-10-11
Publication date: 2020-07-24
Anticipated expiration: 2037-10-11
Also published as: KR20180040107A

Abstract

본 발명은 인간 유두종 바이러스 (human papilloma virus; 이하, HPV) 감염에 의해서 발생된 암을 억제하기 위한 RNA 간섭 유도 핵산에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 HPV의 E6 또는 E7 유전자의 전령RNA (messenger RNA; mRNA)에 결합할 수 있는 마이크로RNA (microRNA; miRNA)의 5‘말단 영역의 서열을 가지면서 나머지 부분의 서열이 HPV의 E6 또는 E7의 mRNA 염기와 상보 배열하여 그 발현을 억제하여 암을 효율적으로 치료할 수 있는 RNA 간섭 (RNA interference) 유도 핵산에 관한 것이다. 본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과(miRNA-like off-target effect)의 문제점을 역으로 활용하는 것으로, RNA 간섭 유도 핵산의 5‘말단이 HPV의 E6 또는 E7의 mRNA와 결합할 수 있는 종양 억제 마이크로RNA의 염기서열을 포함함으로써, 표적인 HPV의 E6와 E7의 발현을 저해하여 암을 억제할 뿐만 아니라 암 억제 마이크로RNA로 작용하여 암을 억제하는 기능이 추가적으로 나타나게 되고, 이에 따라 오프-타겟 부작용 없이 암 사멸 및 억제 효과를 극대화할 수 있다.

Description

RNA 간섭 유도 핵산 및 이를 포함하는 HPV 감염 유발 암의 치료용 약학 조성물 {Small interfering RNA and Pharmaceutical Composition for Treatment of HPV related cancer comprising the same}

본 발명은 인간 유두종 바이러스 (human papilloma virus; 이하, HPV) 감염에 의해서 발생된 암을 억제하기 위한 RNA 간섭 유도 핵산에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 HPV의 E6 또는 E7 유전자의 전령RNA (messenger RNA; mRNA)에 결합할 수 있는 마이크로RNA (microRNA; miRNA)의 5‘말단 영역의 서열을 가지면서 나머지 부분의 서열이 HPV의 E6 또는 E7의 mRNA 염기와 상보 배열하여 그 발현을 억제하여 암을 효율적으로 치료할 수 있는 RNA 간섭 (RNA interference) 유도 핵산에 관한 것이다.

인간 유두종 바이러스(huma papilloma virus; 이하, HPV)는 약 8,000개의 염기서열을 가진 양성 악성 종양을 일으키는 작은 DNA 바이러스이다. 현재까지 유전체의 차이에 따라 100여개 이상의 HPV 아류형이 확인되었으며, 이러한 타입 중에서 고위험성 HPV 타입(예를 들면, HPV-16, 18, 31, 33, 35, 45, 51, 52 및 56)은 자궁경부암의 거의 90%에 관계하고 있다. HPV에 감염된 자궁경부암의 50% 이상은 HPV-16 타입이 관련이 있으며 다음으로 HPV-18(12%), HPV-45(8%), HPV-31(5%) 타입이 관련이 있다. 이렇듯 고위험성의 대부분을 차지하는 16, 18 타입 (HPV16, HPV18)은 자궁경부암 및 자궁경부이형화의 주된 요인이 되며, 더불어 다른 생식기, 머리, 목 편팡상피세포 감염 시 암을 일으킨다. 자궁경부암의 발병률은 침윤성의 경우 서서히 감소하고는 있지만, 개발도상국의 여성에게서는 가장 빈번하게 나타나며 여성암의 ~25%를 차지한다.

HPV가 암을 일으키는 데는 2개의 발암성(oncogenic) 유전자인 E6와 E7이 매우 중요하며, 이들의 단백질은 모두 HPV를 매개로 한 세포의 불멸화 및 세포 형질 전환에 관계한다. 발암성 E6 단백질의 기능은 야생형의 p53 종양 억제 단백질에 결합하여 유비퀴틴(ubiquitin) 경로를 통하여 이를 분해시킨다. 이때 E6는 E6-AP(E6-associated protein)이라는 E3 유비퀴틴-단백질 리가아제(ubiquitin-protein ligase) 활성을 가지는 단백질에 결합하여 복합체를 형성하고, 이 복합체가 야생형 p53과 결합하여 유비퀴틴화시켜 p53을 분해하는 기작을 나타낸다. p53은 DNA 손상에 대해 반응하는 기능을 하므로, E6에 의해 p53이 분해되면 p53의 단백질 발현양이 현저하게 낮아지고, DNA 손상에 대해 대처하는 세포의 반응이 현저하게 떨어져 암으로 발생하기 수월해진다. 한편, E7 단백질은 직접 Rb 단백질과 결합하여 과-인산화를 유도한다. 이러한 HPV 유래의 단백질인 E6 또는 E7은 오로지 HPV에 감염된 암만을 죽일 수 있는 특정 타겟이기에 치료용 표적으로 주목을 받고 있으며, 실제로 HPV에 의해 유도된 암 치료에서 약물 표적으로 활용되고 있다.

RNA 간섭(RNA interference)은 특정 유전자의 발현을 억제하는 기술로 널리 사용되고 있으며, 특히 원하는 유전자의 전령RNA(mRNA)와 거의 완전상보결합을 할 수 있는 서열로 디자인하여 손쉽게 그 유전자의 발현을 전사 후 과정에서 억제할 수 있는 장점을 가지고 있다. 이러한 RNA 간섭을 유도하는 핵산으로는 약 21개 정도의 RNA 이중체로, 전형적으로는 19개의 이중나선 구조와 3’ 말단의 2개의 돌출부(overhang)로 구성된 siRNA(small interfering RNA)가 있다. 이때의 2개의 돌출부의 핵산은 주로 디옥시티민(deoxythymidine)을 사용한다. 또한 이외에도 마이크로RNA의 전구체인 헤어핀 구조로 만드는 shRNA(short hairpin RNA)도 RNA간섭 유도체로 널리 사용되고 있다. 최근에는 이러한 RNA간섭 현상을 활용하여, 특히 세포 내의 유전자가 아닌 외부에서의 유입된 유전자인 바이러스 유전자를 선택적으로 침묵시키기 위한 용도로 활발히 연구되고 있으며, 이를 통해 바이러스 및 바이러스에 의해 유도되는 질병을 억제할 수 있다는 것이 증명되었다. 특히 본 발명에서 대상으로 하고 있는 HPV 감염 유도 종양 중에서, 자궁경부암은 그 암 세포에서 E6와 E7의 유전자를 표적으로 하는 siRNA가 p53과 pRb의 축적을 일으켜 아폽토시스(apoptosis) 또는 세포노화를 일으키는 것이 밝혀졌다. 이는 HPV-16에 감염된 자궁경부암 세포주와 HPV-18에 감염된 세포주 모두 HPV의 E6 및 E7 암 유전자가 RNAi에 의해 선택적으로 발현이 억제되어 일어남을 알 수 있었다.

하지만 이러한 RNA 간섭을 유도하여 유전자를 억제하는 기술의 피할 수 없는 단점으로, 다른 유전자도 비특이적으로 저해시키는 오프-타겟 현상이 있다. 이러한 오프-타겟 효과는 RNA간섭에서 가장 핵심적인 역할을 하는 아고너트(Argonaute) 단백질이 RNA 간섭을 유도하기 위해서 인위적으로 도입시킨 RNA 간섭 유도 핵산을 세포 내에 존재하는 마이크로RNA와 동일하게 취급하여 일어난다. 그래서 이를 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과(miRNA-like off-target effect)라고 부르고 있다. 마이크로RNA는 발단 위치(seed region; 5'말단의 2번째부터 7번째까지, 추가적으로 오프셋의 5’말단 기준 3번째부터 8번째도 존재함)의 염기 배열(base pairing)을 통하여 주로 타겟 유전자를 인식하여 그 발현을 저해하며, siRNA도 또한 같은 위치인 발단 위치의 서열에 의존적으로 오프-타겟이 일어난다. 발단 부분의 서열에 따라 적으면 수백개에서 많으면 약 1500개 정도의 유전자의 발현에 영향을 미치며, siRNA를 이용한 표현형 스크리닝 과정에서는 양성 hit중에 30%까지의 표현형이 이러한 오프-타겟으로 나타날 정도로 그 부작용이 심각하다. 따라서 RNA간섭을 이용한 유전자 억제에서는 항상 오프-타겟으로 인하여 발생되는 잘못된 연구결과 및 치료 부작용이 크게 염려되고 있다. 한편, 마이크로RNA는 ~20개정도의 작은 리보핵산으로 타겟 유전자 저해를 통해 여러 가지 생물학적 기능을 조절한다. 특히 몇몇의 마이크로RNA는 정상세포에는 많이 발현하다가, 암세포에서는 그 발현양이 현저하게 줄어드는 현상을 보이는데, 그 중 일부는 암을 억제하는 기능이 알려져 있다. 이렇게 암을 억제하는 마이크로RNA를 종양 억제 마이크로RNA (tumor suppressor miRNA)라 부르며, 이러한 마이크로RNA의 암 억제 기능을 활용한 치료가 활발히 연구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 HPV가 감염되어 발생한 암세포에서 종양 발생과 유지에 중요한 역할을 하고 있는 HPV의 E6와 E7 유전자를 억제하기 위하여, RNA간섭을 통해 그 발현을 침묵시켜 암을 억제할 수 있는 RNA 간섭 유도 핵산을 개발하고자 하였으며, 동시에 이때 발생할 수 있는 마이크로RNA 유사 오프-타겟 현상을 역이용하고자 하였다. 즉, HPV의 E6/E7 전령RNA(mRNA)에 결합할 수 있는 마이크로RNA 중 종양 억제능을 지닌 마이크로RNA를 선별하고, 선별한 마이크로RNA의 5‘발단 서열(최소한 5'말단의 2번째부터 7번째까지를 포함. 추가적으로 오프셋의 5’말단 기준 3번째부터 8번째를 포함하는 것도 의미함)을 가지도록 디자인하여 siRNA를 제작한 후에, 이것이 E6/E7에 대한 siRNA이면서 암 억제 마이크로RNA로 동시에 작용하여 기존의 siRNA에 비해 유의하게 높은 암 억제 효과를 보인다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나의 단일가닥이 miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218로 구성된 군에서 선택되는 하나의 마이크로RNA의 염기서열의 일부를 포함하여 해당 종양 억제 마이크로RNA와 같이 작용하고, 동시에 전체 염기서열이 HPV의 E6 또는 E7의 mRNA와 상보적인 서열 조성을 가져 HPV의 E6/E7 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산 및 이를 포함하는 HPV 감염으로 유발된 암의 치료용 RNA 전달 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나의 단일가닥이 miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218로 구성된 군에서 선택되는 하나의 마이크로RNA의 염기서열을 포함하고 HPV의 E6와 E7 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 이중가닥 중 하나의 단일가닥이 206/E7(서열번호 7)의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5’-GGAAUGCUCGAAGGUC-3’; 376a/E7(서열번호 8)의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5’-ACAUAGAAGGUCAACC-3’; 329/E7-1(서열번호 9)의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5’-ACACACAAAGGACAGG-3’; 329/E6-1(서열번호 13)의 5'말단의 2번째 내지 18번째 서열인 5’-ACACACAUUCUAAUAU-3’; 329/E6-2(서열번호 14)의 5'말단의 2번째 내지 18번째 서열인 5’-ACACACUAUAACAAUA-3’; 218/E7(서열번호 11)의 5'말단의 2번째 내지 18번째 서열인 5’-UGUGCUUGCCAGAAUC-3’; 218/E7-1(서열번호 16)의 5'말단의 2번째 내지 18번째 서열인 5’-UGUGCUUUGUACGCAC-3’; 및 497/E6(서열번호 12)의 5'말단의 2번째 내지 18번째 서열인 5’-UGCAGCACGAAUGGCA-3’으로 이루어진 군에서 선택되는 서열 중 어느 하나를 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나의 단일가닥의 5’ 말단의 발단서열(seed region)은 miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218로 구성되는 군에서 선택되는 하나의 마이크로RNA의 발단 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하고, 마이크로RNA의 발단서열로 정의되는 5’말단 기준 2번째부터 7번째의 염기 서열인 GGAAUG, UCAUAG, ACACAC, AGCAGC 또는 UGUGCU를 포함하는 6-8개의 연속된 염기서열일 수 있으며, 추가적으로 오프셋 6mer 발단서열(off-set 6me seed)인 GAAUGU, CAUAGA, CACACC, GCAGCA, GUGCUU를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endosiRNA 및 asiRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 상기 서열 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 단일가닥은 아고너트 단백질과 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 miR-1 또는 miR-206의 염기서열을 포함하는 단일가닥은 그 표적으로 알려져 있는 PTK9 또는 ADAR1 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 206/E7의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5'-GGAAUGCUCGAAGGUC-3'을 포함하는 단일가닥은 PTK9 또는 ADAR1 유전자 발현을 억제하고, AUUCCA 서열을 가지고 있는 전사체를 억제할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 RNA 간섭 유도 핵산은 자궁경부암 세포의 사멸을 유도하고, 침윤 또는 전이를 억제하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 RNA 간섭 유도 핵산 서열에 상응하는 DNA 서열을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 HPV의 감염으로 유발되는 암의 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 자궁경부암, 질암(vagina cancer), 외음부암(vulva cancer), 항문암(anal cancer), 음경암(penis cancer), 편도암(tonsil cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 머리와 목암(head & neck) 및 폐의 선암(lung adenocarcinoma)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, RNA 간섭을 유도하는 핵산은 18 내지 23개로 구성되는 뉴클레오티드의 가이드 가닥(guide strand) 및 상기 가이드 가닥에 상보적인 운반자 가닥(passenger strand)으로 이루어진 이중가닥인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 21개의 뉴클레오티드로 구성될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 이때, 상기 이중가닥은 줄기-루프(stem-loop)의 헤어핀(hairpin) 구조를 가지는 핵산이 다이서(Dicer) 단백질에 의해 줄기부분이 가공되어 이중가닥 형태로 변형되는 것, 즉, shRNA가 가공되어 siRNA 형태를 이루는 것일 수 있으나, 이는 핵산 형태에 따라 달라질 수 있으므로 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 핵산은 일반적으로 3'말단에 2개의 뉴클레오티드 돌출부(overhang)를 갖는다.

RNA 간섭을 유도하는 핵산은 안티센스 올리고뉴클레오티드로 이루어진 가이드 가닥 및 이에 상보적인 센스 올리고뉴클레오티드인 운반자 가닥이 상보적으로 이중가닥으로 혼성화된 siRNA(small interfering RNA), 가이드 가닥 서열과 운반자 가닥 서열이 루프에 의해 연결된 스템-루프 구조의 단일 RNA 가닥인 shRNA(short hairpin RNA)로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 상기 siRNA는 siRNA 제조회사나 RNA 합성 회사에 의뢰하여 손쉽게 제작할 수 있고, 21nt 내외의 짧은 올리고머이기 때문에 일반적인 세포주에 형질도입이 수월하다. 따라서 RNA 간섭을 유도하는 핵산은 표적유전자의 발현을 손쉽게 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법 또는 유전자 치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고, 스템-루프(stem-loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가질 수 있는데, 이를 특히 shRNA(short hairpin RNA)라 지칭한다. 한편, 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한, 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며, 단지 센스 올리고뉴클레오티드와 안티센스 올리고뉴클레오티드를 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3 ~ 10 정도의 염기가 있으면 가능하다. siRNA 말단 구조는 평활(blunt) 말단 또는 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3' 말단 돌출한 구조(protruding structure)와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있으나, 가장 바람직하게는 다이서 단백질에 의해 잘린 형태의 특징이 2염기 돌출(overhang)이다. 또한, siRNA는 발암성 E6/E7 단백질의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

본 발명에서 용어 ‘가이드 가닥(guide strand; antisense strand)’이란 상기 이중가닥 중 표적을 저해할 용도로 서열이 정해진 단일가닥 부분으로, 실질적으로 아고너트 단백질에 주로 결합하여, 아고너트 복합체가 표적 유전자를 인식하도록 가이드를 해주는 역할을 하며, 관심 있는 타겟 유전자 mRNA에 실질적으로 또는 100% 상보적인 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로, 이에 따라 안티센스 가닥이라고도 불리우며, 예를 들면, siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA 또는 asiRNA 등의 핵산 서열과 전체 또는 일부 상보적일 수 있다. 용어 ‘운반자 가닥(passenger strand; sense strand)’이란 상기의 이중가닥 중 가이드 가닥과 이중가닥 구조를 이루어서, 가이드 가닥이 아고너트 단백질과 결합할 수 있도록 도와주는 운반자 역할을 하며, 표적 핵산과 실질적으로 또는 100% 동일한 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로서, 이에 따라 센스 가닥이라고도 불리우며, 예를 들면, siRNA, miRNA, shRNA, DsiRNA, lsiRNA, ss-siRNA, piRNA, endo-siRNA 또는 asiRNA 등의 핵산 서열과 전체 또는 일부 동일한 폴리뉴클레오티드를 말한다.

본 발명에 있어서, HPV 감염에 의해 유발된 암은, 이에 제한되는 것은 아니나 자궁경부암, 질암(vagina cancer), 외음부암(vulva cancer), 항문암(anal cancer), 음경암(penis cancer), 편도암(tonsil cancer), 인두암(pharynx cancer), 후두암(larynx cancer), 머리와 목암(head & neck) 및 폐의 선암(lung adenocarcinoma)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 자궁경부암이다.

상기 HPV 감염에 의해 유발된 암세포는 E6/E7 유전자를 발현하는 분리된 세포이거나 배양된 세포일 수 있고, 분리되지 않은 채로 포유동물 중에 포함될 수 있다. 포유동물의 예로는 비인간 포유동물(예컨대, 개, 고양이, 말, 돼지, 양, 소, 염소, 설치류; 햄스터, 마우스, 래트, 및 영장류) 및 인간을 들 수 있다. 본 발명에서는 E6/E7 유전자를 발현하는 HPV 감염과 관련된 암으로 HPV 18 감염으로는 HeLa 세포를 HPV16 감염으로는 SiHa 세포를 자궁경부암 세포로 사용하였다.

상기 발현벡터는 본 발명에서의 siRNA, shRNA 및 안티센스 올리고뉴클레오티드로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 발현할 수 있는 종래 알려진 어떠한 발현 벡터도 사용할 수 있다. 예컨대, Promega 제품으로 GeneClip™ U1 Hairpin Cloning System(Cat.#'s C8750, C8760, C8770, C8780, C8790), siLentGene™ U6 Cassette RNA Interference System(Cat.# C7800), T7 RiboMAX™ Express RNAi System(Cat.#P1700), siSTRIKE™ U6 Hairpin Cloning Systems(Cat.#'s C7890, C7900, C7910, C7920) 및 siLentGene™ -2 U6 Hairpin Cloning Systems(Cat.#'s C7860, C8060, C8070, C8080) 등을 사용할 수 있으며, Genscript 제품으로 pRNA-U6.1(Cat.#'s SD1201, SD1202, SD1207), pRNATin-H1.2(Cat.#'s SD1223, 1224) 및 pRNAH1.1/Adeno(Cat.# SD12009) 등을 사용할 수 있다.

상기 조성물의 유효성분으로 포함된 siRNA, shRNA, 올리고뉴클레오티드 또는 발현벡터는 보통 약학적 조성물로서 투여된다. 상기 투여는 핵산이 원하는 in vitro 또는 in vivo에서 표적 세포로 도입되는, 통상적으로 사용되는 유전자 도입 기법에 의하여 수행될 수 있다. 이때, siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포 내로 도입은 특별히 이에 제한되지 않으나, 직접 합성한 뒤, 숙주세포 내로 직접 함입되거나, 또는 siRNA, shRNA 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 세포 안에서 발현되도록 제조된 발현 벡터 또는 PCR-기반 발현카세트 등으로 세포를 형질전환 또는 감염(infection)시켜서 수행하는 것이 바람직하며, 발현벡터는 특별히 이에 제한되지는 않는다.

한편, 통상적으로 사용되는 표적 세포로의 유전자 도입 기법에는 칼슘 포스페이트, DEAE-덱스트란, 전기천공 및 미세주입법 및 바이러스 법이 포함된다(Graham FL 및 van der Eb AJ Virol. 52:456, 1973; McCutchan JH & Pagano JS J. Natl. Cancer Inst. 41:351, 1968; Chu G et al., Nucl. Acids Res. 15:1311, 1987; Fraley R et al., J. Biol. Chem. 255:10431, 1980; Capecchi MR, Cell 22:479, 1980). 뉴클레오티드를 세포 내로 도입하는 이러한 기법들에 최근 추가된 것은 양이온성 리포좀을 사용하는 것이다(Felgner PL et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 84:7413, 1987). 상업적으로 구입할 수 있는 양이온성 지질 제제는 예를 들면, Tfx50(Promega) 또는 Lipofectamin 2000(Life Technologies)이 있다.

RNA간섭을 유도하는 핵산인, siRNA 또는 shRNA의 유효농도는 원하는 효과, 예를 들면 siRNA 또는 shRNA의 부재 하에서 검출되는 발현 수준에 비해 발암성 단백질인 E7/E7 유전자의 발현의 감소를 제공하기에 충분한 양이다. siRNA 또는 shRNA는 세포 하나 당 적어도 하나의 카피의 전달을 허용하는 양으로 도입될 수 있다. 이중 가닥 물질의 도입량이 많을수록(예컨대, 세포 하나당 5개 이상, 10 개 이상, 100개 이상, 500개 이상 또는 1000개 이상의 카피), 억제 효율이 더 높아질 수 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는, 자궁경부암세포(HeLa)의 HPV 18 발현 유전자중 마이크로RNA에 의해 결합되는 부분을 Ago HITS-CLIP 결과를 통해 분석하고, 여기에 결합하는 마이크로RNA중 종양 억제 기능을 가질 수 있는 마이크로RNA를 선별하기 위해서, 자궁경부암 세포주와 자궁경부암 환자 시료에서 측정된 마이크로RNA 발현 결과를 분석하였다. 그 결과, 일반 세포에 비해서 종양에서 그 발현이 저해되는 마이크로RNA인 miR-206, miR-1, miR-376a, miR-329, miR-497 및miR-218를 발견하였으며, 이 중에서 miR-206과 miR-1는 마이크로RNA로써 종양의 침윤과 전의를 막는 것으로 알려져 있고, 그 외의 마이크로RNA들은 해당 마이크로RNA의 발현에 따른 자궁경부암 환자의 생존분석(Survival analysis)과 실제 자궁경부암 세포주인 HeLa에서의 창상회복실험(wound healing assay)으로 종양 억제 효과가 있음을 확인하고 선별하였다.

miR-206과 miR-1은 같은 5‘ 발단 지역(seed region)을 가지므로 같은 표적을 인식하고 저해하여 동일한 암 억제 효과를 나타낼 것으로 여겨진다. 이에 따라 miR-1또는 miR-206이 결합하는 HPV의 E7 mRNA 부위의 서열을 기반으로 miR-1/206과 같이 작용할 수 있으면서도, E6/E7 mRNA에 완전하게 배열하여 HPV의 E6/E7 유전자 발현을 억제할 수 있는 서열(206/E7)을 siRNA 형태로 합성하였다. 또한 동일한 방법으로 miR-376a, miR-329, miR-497, miR-218의 발단 서열을 포함하여 해당 마이크로RNA와 유사하게 기능하면서 HPV의 E6/E7 유전자의 발현을 억제하는 siRNA를 디자인 하였다. 특히, HPV의 감염에서 종양 발생을 일으키는 고위험군인 16과 18 타입에 대해서 동일한 방법으로 siRNA를 디자인 하였으며, 해당 siRNA의 효과는 HPV 18 감염 자궁경부암 세포인 HeLa와 HPV 16 감염 자궁경부암 세포인 SiHa에서 검증하였다. 기존의 siRNA를 디자인 할 경우에는 이론상 모든 전령mRNA의 위치와 완전 상보염기배열 하도록 제작할 수 있지만, 이 중에서 어떤 부분이 가장 효율적일지 알 수 없어 모든 경우를 실험을 통해 조사하여 동정해야 한다. 하지만, 본 발명과 같이 RNA간섭을 유도하는 핵심 단백질인 아고너트가 결합하는 위치를 미리 파악하면, siRNA가 타겟팅 되었을 때 효율적으로 표적을 억제할 수 있는 위치를 손쉽게 결정 할 수 있다.

HPV를 효율적으로 저해하기 위해서는 본 실시예에서 밝힌 바와 같이, siRNA를 HPV에 대한 아고너트 결합 위치를 표적으로 하게 디자인 하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 자궁경부암에서 발현이 억제되어 암 억제 마이크로RNA로 작용할 수 있는 마이크로RNA가 결합하는 위치를 표적으로 하며, 가장 바람직하게는 자궁경부암에서 낮게 발현되는 miR-206, miR-1, miR-376a, 또는 miR-329이 결합하는 위치를 표적으로 하는 것이 바람직하다. 추가적으로, 자궁경부암 환자에서 그 발현이 높았을 때 환자의 생존에서 좋은 예후를 보이는 miR-497, miR-218의 위치를 표적으로 하는 자궁경부암 치료용 RNA간섭물질의 서열을 상보적으로 디자인 하는 것이 바람직하다.

또한, 본 발명에 따른 siRNA는 마이크로RNA의 발단 서열(seed sequence)을 가지고 있으므로 기존에 모든 siRNA에서 일어나는 오프-타겟 효과가 본 발명자가 의도한 특정 마이크로RNA와 같이 일어나게 된다. 본 발명에 따른 siRNA는 암 억제 마이크로RNA와 동일한 발단 서열을 통해서 표적 유전자들을 억제하고, 이를 통해 암을 억제하는 기능을 나타낸다. 따라서 본 발명의 RNA간섭 유도 핵산은 HPV 유래 암세포를 억제하는 치료효과를 나타내기 위해서 HPV E6/E7 유전자를 억제하는 효율적인 siRNA로 작용할 뿐만 아니라, 암 억제 마이크로RNA로 동시에 작용한다. 또한, 기존의 siRNA에서 보였던 마이크로RNA 유사 오프-타겟 부작용에 대한 걱정 없이, 오히려 마이크로RNA의 발단 서열을 포함하여 이를 역이용할 수 있으므로, 암 사멸 및 억제 효과를 극대화할 수 있다는 점에 주목하여 본 RNA간섭 유도 핵산 발명을 완성하였다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 206/E7 siRNA가 E6/E7 mRNA의 양을 줄여, p21의 발현을 증가시키는 효과를 보이고, 또한 자궁경부암세포(HeLa)의 사멸을 유도하여 암세포의 수를 줄이는 결과를 나타내는 것을 확인하였다. 이는 기존의 siRNA인 E7 siRNA보다 효과적으로 자궁암세포 사멸을 유도하는 것임을 밝힐 수 있었다. 또한 206/E7 siRNA는 miR-206과 같이 기능하여, miR-206의 표적으로 알려져 있는 PTK9, ADAR1 유전자의 mRNA를 감소시켰으며, 또한 전체 전사체에서도 miR-206의 발단 표적위치(seed site)를 가지고 있는 표적 mRNA를이 모두 206/E7 siRNA에 의해서 억제된다는 것을 RNA-Seq 분석을 통해 유전체 수준에서 확인하였다. 이러한 miR-206과 같은 유전자 억제 효과는 실제로 자궁경부암세포의 이동(migration)과 침윤(invasion)을 억제하고, 따라서 암 전이(metastasis)를 막을 수 있으며, 이를 통해 기존의 HPV 특이적 siRNA인 E7 siRNA보다 암 억제가 효과적인 것을 검증할 수 있었다.

본 발명의 다른 실시예에서는, 자궁경부암세포(HeLa)에 대한 이종이식 생쥐 종양모델을 사용하여 206/E7의 siRNA의 종양 억제 효과를 생체에서 평가하였으며, 이때 종양의 크기를 효과적으로 줄임을 알 수 있었다. 추가적으로 기존의 HPV siRNA인 E7 siRNA와 비교하여 평가하였을 때에도, E7 siRNA 보다 효과적으로 206/E7 siRNA기 자궁경부암을 생체에서 억제할 수 있음을 확인하였다.

본 발명에 따른 RNA 간섭 유도 핵산은 마이크로RNA 유사 오프-타겟 효과(miRNA-like off-target effect)의 문제점을 역으로 활용하는 것으로, RNA 간섭 유도 핵산의 5‘말단 중 발단 지역(seed region)이 HPV의 E6 또는 E7의 mRNA와 결합할 수 있는 종양 억제 마이크로RNA의 염기서열을 포함함으로써, 표적인 HPV의 E6와 E7의 발현을 저해하여 암을 억제할 뿐만 아니라 암 억제 마이크로RNA로 작용하여 암을 억제하는 기능이 추가적으로 나타나게 되고, 이에 따라 오프-타겟 부작용 없이 암 사멸 및 억제 효과를 극대화할 수 있다.

도1은 HPV 유발 종양 중 하나인 자궁경부암을 억제하기 위한 HPV 특이적 siRNA를 암 억제 마이크로RNA로도 작용하게 하는 본 발명을 도식화해서 나타낸 것이다.
도2는 자궁경부암세포(HeLa)의 HPV 전사체에 결합하는 마이크로RNA에 대한 Ago HITS-CLIP 분석 지도와 자궁암세포 및 환자 조직에서의 마이크로RNA 발현 변화에 대한 분석 결과를 나타낸 것이다.
도3은 도2에서 발굴한 마이크로RNA의 종양 억제 기능을 확인하기 위해, 그 발현에 따른 자궁경부암 환자의 생존분석 결과와 과발현시의 자궁경부암세포(HeLa)의 세포 수 측정 및 창상회복실험(wound healing assay) 결과를 나타낸 것이다.
도4는 HPV 16과 18의 감염에 의해 발생된 자궁경부암 세포인 HeLa와 SiHa에서의 E6, E7 mRNA를 타겟팅하면서 도2에서 발굴한 마이크로RNA의 발단 서열을 가질 수 있는 siRNA 서열에 대한 분석 및 RNA간섭 효과를 검증한 결과로서, 특히 HPV 18의 E6/E7 mRNA를 타겟팅하면서 miR-1과 miR-206의 5‘말단 발단 지역(seed region)의 서열을 포함하는 206/E7 siRNA와 그 E7 표적 유전자 억제 효과를 기존의 E7 siRNA와 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도5는 206/E7 siRNA의 E6와 E7 mRNA의 억제 효과, 이를 통한 p53의 표적 유전자인 p21의 mRNA 양 증가, 자궁경부암세포(HeLa)의 사멸 증대를 기존의 E7 siRNA와 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도6은 206/E7 siRNA가 miR-206과 같이 기능하여 알려진 표적의 mRNA를 억제하고, 자궁경부암 세포의 침윤성과 전이성을 기존의 siRNA보다 더 효과적으로 억제하는 비교 결과를 matriegel을 이용한 boyden chamber 실험과 창상회복실험(wound healing assay) 결과로 나타낸 것이다.
도7은 206/E7 siRNA를 자궁경부암(HeLa) 이종 이식 생쥐 종양 모델에 적용하였을 때, 기존의 E7 siRNA보다 생체에서 효과적으로 암을 억제하는 결과를 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

[ 실시예 1]

자궁경부암에서의 HPV18 유전자에 대한 마이크로RNA 표적 지도 및 마이크로RNA 발현 분석

HPV에 의해 유발된 암세포 내에서 자연적으로 존재하는 RNA간섭 유도 핵산인 마이크로RNA와 이에 대한 표적 결합을 매개하는 아고너트 단백질이 HPV 유전자의 어느 부분을 인식하여 결합하는지를 파악하기 위해서, 마이크로RNA와 전사체와의 결합 위치를 차세대염기서열 (next-generation sequencing)로 동정해내는 Ago HITS-CLIP 분석 중(Nature, 2009, 460 (7254): 479-86) HPV의 18 type에 의해 발생된 자궁경부암세포인 HeLa에서 수행된 실험을 대조군의 결과에서 분석하였다 (도 2A). Ago HITS-CLIP 실험은 HeLa 세포에 UV를 조사하여 RNA와 아고너트 단백질 사이에 공유결합을 유도시켜 단단하게 복합체를 형성하게 하고, 이 RNA-아고너트 복합체를 아고너트를 인식하는 항체를 이용하여 면역침강법으로 분리한 다음, 이로 인해 분리된 RNA를 차세대염기서열로 파악하는 방법으로, 이를 통해서 아고너트에 결합하는 마이크로RNA와 이를 통해 결합하는 표적 mRNA 내의 표적 위치를 정확하게 알 수 있다. 여기서 분석한 Ago HITS-CLIP의 대조군 실험 결과는 자궁경부암 세포인 HeLa를 약 1천만개씩 100cm 배양접시 2개에 배양 한 후, 아고너트 단백질을 인식하는 2개의 항체인 2A8와 7G1-1*(Nature, 2009, 460 (7254): 479-86)를 각각 사용하여 아고너트-RNA 복합체를 분리하여 얻어진 결과로, 서열분석 결과인 FASTQ 파일을 Bowtie 프로그램으로 HPV 18의 유전체 서열에 배열하여 2개의 항체에서 얻어진 결과가 일치하는 크러스터(cluster) 부분(Biological complexity; BC ≥ 2)을 중심으로 분석하였다. 그 결과, 아고너트-마이크로RNA 복합체는 HPV 유전체에서 주로 E7, E1, L1 유전자의 mRNA에 결합하고, 특히 암 유발 핵심 유전자인 E6/E7에서 E7 mRNA의 여러 지역이 마이크로RNA와 결합하는 것으로 분석되었다(도 2A).

이렇게 HPV의 E7 부위에 결합하는 것으로 분석된 마이크로RNA 중에서, HPV 감염으로 인해 발생된 암을 억제하는 기능을 가질 수 있는 마이크로RNA를 선별하기 위해서, 자궁경부암에서의 마이크로RNA 발현을 조사하였다 (도 2B). 여기서 HPV 유인성 자궁경부암 환자의 조직과 정상조직에서의 마이크로RNA의 발현을 마이크로어래이(microarray)로 비교한 결과(Oncogene 2013 Jan 3;32(1):106-16, 도 2B의 왼쪽 도면의 1)와 차세대서열 분석을 통한 결과(BMC Biol 2010 May 11;8:58, 도 2B의 왼쪽 도면의 2)를 분석하였고, 추가적으로 HPV16 유래 자궁경부암 세포(CaSKI, SIHa, 20861, 201402; 도 2B의 왼쪽도면의 3)와 HPV18 유래 자궁경부암 세포인 HeLa에서의 마이크로RNA 발현 결과(Oncogene 2008 April 17;27(18):2575-2582; 도 2B의 왼쪽 도면의 4)를 분석하고, 이를 log2 비율(정상/암조직, N/T)로 정규화 시킨 후 계층적 크러스터링(hierarchical clustering)을 통해 heat map으로 나타내었다 (도 2B의 왼쪽 도면 그림). 또한 TCGA 데이터베이스(The cancer genome atlas, https://gdc-portal.nci.nih.gov/)에서 자궁경부암에서 유래된 마이크로RNA 발현을 miRNA-Seq로 분석한 124개 결과(2013년 3월 데이터 기준)를 추가하여, 중간값을 기준으로 miRNA-seq의 RPKM (Reads per kilobase per million total reads) 값을 log2로 정규화하여 통합 분석하였다 (도 2B의 오른쪽 도면 그림). 그 결과, miR-1과 miR-206이 모든 자궁경부암 세포에서 가장 낮게 발현되어 있으며, 추가적으로 miR-376a, miR-497, miR-218, miR-329등이 자궁경부암 환자의 조직에서 정상 조직보다 매우 낮게 발현됨을 발견하였다. 이렇게 자궁경부암 조직에서 낮아지는 마이크로RNA는 상대적으로 암을 억제하는 기능을 할 가능성이 높으며, 실제로 암 억제능을 가지는 것으로 알려진 miR-1 또는 miR-206은 암의 전이를 막는 것으로 이전에 보고 되었으며, 또한 본 실시예의 HeLa에서 분석한 마이크로RNA 결합 지도 (도 2A)를 통해 HPV18의 발암 유전자인 E7에 발단 위치(seed region)를 매개로 결합한다는 사실을 확인하였다. 추가적으로 miR-376a, miR-329도 자궁경부암 환자에서 그 발현이 낮으면서, 동시에 HPV18의 E7 유전자에 발단 위치를 통해 결합한다는 사실을 통해 억제 마이크로RNA로 작용할 수 있다는 점을 발견하였다.

[실시예 2]

자궁경부암 억제 마이크로RNA 후보군 발현에 따른 자궁경부암 환자의 생존율 및 세포 수와 전이 억제 가능성 확인

상기 실시예 1에서 발굴된 miR-1, miR-206, miR-376a, miR-329, miR-497 및 miR-218이 자궁경부암을 억제할 수 있다는 사실을 확인하기 위하여, TCGA에서 자궁경부암 환자(n=425, 2016년 9월 기준)의 임상정보를 바탕으로 생존율(survival analysis)을 카플란 메이어(Kaplan-Meier, 이하 KM으로 표기) 생존분석을 통하여 조사하였다. 특히 해당 마이크로RNA의 발현이 높은 경우와 낮은 경우에서의 생존율에 차이가 있는지를 확인하기 위해서, 임상정보와 함께 miRNA-Seq 결과를 함께 분석하여 전체 환자군에서 상위 25%로 해당 마이크로RNA가 높게 발현되는 경우(High 25%; 도3A, 도3B, 도3E)와 하위 25%로 낮게 발현하는 경우(Low 25%; 도3A, 도3B, 도3E)로 나눠서 시간에 따른 생존 확률을 퍼센트(%)로 계산하여 생존함수와 함께 KM 생존곡선으로 나타내었고 (도3A, 도3B, 도3E), 차이가 나타나는 경우 그 통계적인 유효성은 로그순위법 (log-rank test) 또는 Wilcoxon 부호 순위 검증으로 분석하였다. 그 결과, miR-1이 상대적으로 많이 발현되는 환자에서는 4년 이내의 생존율이 높게 나타나고 (Wilcoxon, P=0.06, 도3A의 왼쪽 도면), 3년 이내에서는 더욱 유의적으로 나타나는 것을 확인하였다 (Wilcoxon, P=0.04, 도3A의 왼쪽 도면). 또한 miR-206도 발현이 많이 되었을 때, 환자의 5년 생존율이 증가하는 것을 관찰하였다 (log-rank, P=0.08, 도3A의 오른쪽 도면). 이전에 암억제 기능이 보고된 miR-1, miR-206 이외에 miR-376a, miR-329도 실시예1에서 HPV18의 E7 mRNA에 결합하면서 자궁경부암 환자에서 그 발현이 억제되는 것을 관찰하였으므로, 이들의 암억제 기능을 확인하기 위해서 동일하게 생존율 분석을 실시하였으나 큰 차이를 나타내지 않았다 (도 3B). 하지만 miR-497의 경우 그 발현이 증가된 환자에서 유의하게 5년 생존율이 증가하는 것을 발견하였으며 (log-rank, P=0.04, 도3C의 왼쪽 도면), miR-218도 동일하게 4년 생존율을 증가시키며 (Wilcoxon, P=0.08, 도3C의 오른쪽 도면) 보다 더 유의하게는 3년 생존율이 증가함을 관찰하였다 (Wilcoxon, P=0.06, 도3C의 오른쪽 도면).

이렇게 자궁경부암 환자의 생존율을 증가시키는 것으로 관찰된 마이크로RNA가 실제로 분열되는 자궁경부암 세포의 수에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해서, 대조군 miRNA (NT (non-targeting), 도3D), miR-1, miR-329, miR-376a를 합성하였다. 상기 마이크로RNA miRBase (http://www.mirbase.org/) 데이터베이스에 있는 서열대로 인간의 마이크로RNA를 기준으로 동일한 가이드 가닥과 운반 가닥을 Bioneer사 또는 ST Pharma사를 통해 화학적으로 합성하고 HPLC로 분리하였으며, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 가이드 가닥과 운반 가닥의 이중체(duplex)로 제조하였다. 이 때, 대조군인 NT는 예쁜 꼬마 선충(C.elegans)에만 발현하는 마이크로RNA인 cel-miR-67의 서열을 siRNA 형태로 합성한 후, 가이드 가닥과 운반자 가닥 모두 5‘말단 기준 1번째와 2번째 모두를 2’OMe로 변형시킨 것을 사용하였다. 이들 각각을 50nM의 농도로 HeLa세포에 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen) 시약을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 전달(transfection)하였다. 이때, HeLa 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 100 U/ml 페니실린, 및 100 ㎍/ml 스텝토마이신을 보충한 Dulbecco's 개질 Eagle's 배지(Invitrogen)에서 배양하였으며, 항생제 없는 완전배지에서 트랜스펙션을 수행하였다. 이후 24시간, 48시간 후에 세포의 수를 countess II (Life technologies) 기기로 측정하였다. 그 결과 miR-1의 경우 유의하게 자궁경부암 세포인 HeLa의 세포수를 감소시키는 것을 확인하였다 (도3D, P<0.01,n=4, t-test). 이때 miR-329, miR-376a의 발현 증가는 세포수 감소를 일으키지 못하여, 대신에 이들이 암세포의 전이를 억제하는게 관여하는 세포 이동에 영향을 미치는지를 확인하기 위하여, 창상회복실험(wound healing assay)을 실시하였다. 위의 실험과 동일한 방법으로 대조군(NT), miR-206, miR-329, miR-376a를 합성하고 이를 HeLa세포에 도입한 후, 창상(wound)을 일으킨 후 이것이 메꿔져서 회복되는 것을 Leica DMi8 현미경으로 관찰하고 (도3E, 위의 도면), 이를 image J (https://imagej.nih.gov) 프로그램으로 정량분석(도3E, 아래 도면) 하였다. 그 결과 이미 암세포 전이를 막는 것으로 알려진 miR-206의 경우 이전에 보고된 결과와 동일하게 대조군에 비하여 유의하게 세포의 이동을 막았다 (P<0.05, t-test, n=4). 또한 miR-329, miR-376a도 알려진 전이 억제 마이크로RNA인 miR-206과 동일하게 자궁경부암 세포의 이동을 유의하게 억제하였으며 (도면3E, P<0.05, t-test, n=4), 따라서 miR-329, miR-376a가 자궁경부암의 전이를 억제하는 종양 억제 마이크로RNA로 작용할 수 있음을 확인하였다.

[실시예 3]

RNA간섭 유도 핵산인 206/E7 siRNA의 표적 유전자 발현 억제 효율 비교

상기 실시예 1과 실시예 2에서의 결과를 토대로, miR-1 (또는 miR-206), miR-376a, miR-329, miR-218-5p. miR-497-5p는 종양 억제 마이크로RNA로 작용한다는 것을 확인하였기에, 이들의 발단 위치(seed region)인 5‘ 말단 기준 2번째에서 8번째 사이에 최소한 6개 이상의 연속적인 서열을 포함하면서 HPV18의 E6/E7의 mRNA와는 완전 상보적으로 염기배열할 수 있는 RNA간섭 유도 핵산의 서열을 디자인 하였다 (도 4A). 이때 miR-1과 miR-206은 동일한 발단서열(1번째에서 8번째까지의 서열이 5’-UGGAAUG-3’로 동일함)을 가지므로 함께 디자인 하였으며, 이때 사용한 HPV18의 E6/E7 mRNA 서열은 HeLa 세포에서 보고된 GenBank (M20324) 데이터를 사용하였다. 더불어 HPV 16에 대해서도 동일하게 마이크로RNA의 발단서열을 포함하여 해당 마이크로RNA와 같이 기능하면서 E6/E7 mRNA를 억제하는 RNA 간섭유도 물질로서 작용하는 서열을 디자인 하였다 (도 4B). 이때에는 HPV16의 감염으로 자궁경부암이 발생된 SiHa 세포에서 얻어진 E6와 E7의 코딩유전자서열(CDS (coding sequence))을 GenBank에서 사용하였다 (E6, AF003019.1; E7, AF003021.1).

자세하게는 miR-1 또는 miR-206의 발단부분의 서열을 포함하면서 HPV18의 E6/E7 mRNA를 억제하는 siRNA (206/E7)는 5'-UGGAAUGCUCGAAGGUCGdtdt-3'로 제작하였다 (도 4C).이 때 마이크로RNA의 발단 위치는 5’말단 기준 1번째부터 8번째 사이에서 최소한 6개 이상의 염기배열이 연속적으로 되는 서열을 가지며, 이에 따라 1-6, 2-7, 3-8 위치의 3가지 6mer와 1-7, 2-8의 2가지 7mer, 그리고 1-8 위치의 1가지 8mer가 최소한으로 만들어 질 수 있다. 위에서의 206/E7 siRNA는 발단 위치에서 5’말단 기준 1-7 위치의 miR-1/206 7mer (UGGAAUG)를 가지고 있다. 206/E7 siRNA는 miR-206과 miR-1의 발단서열뿐만 아니라, 5’말단 기준 12번째부터 16번째까지 서열과 19번째 서열이 동일하며, 추가적으로 siRNA를 디자인하는 19+2의 규칙에 따라 3‘말단에 추가하는 2개의 디옥시리보스 티민(deoxyribose thymine)중 3’말단 기준 2번째 디옥스리보스 티민이 miR-206의 유라실(Uracil)과 유사하도록 구성되었다. 이에 따라, 206/E7 siRNA는 전체적으로 ~64%의 염기서열이 miR-206 또는 miR-1과 동일하며, 동일한 발단서열을 가지고 있다는 점에서, miR-206 또는 miR-1과 동일하게 작용할 수 있다 (도 4C).

206/E7 siRNA의 기능에서 온-타겟인 E7 유전자에 결합하고 억제하는 면을 생각해보면, miR-1과 miR-206이 자궁경부암 세포(HeLa)에서 E7 mRNA에 쉽게 결합하고 있는 결과 (도 2A)를 바탕으로, 206/E7 siRNA도 세포에 도입되었을 때 효과적으로 E7 유전자를 억제할 수 있을 것으로 생각된다. 또한 이러한 온-타겟 효과는 기존에 E7 siRNA와 동일하게 효과적일 것으로 예상되어, 기존에 HPV18의 E7을 억제할 용도로 여러 siRNA 서열로부터 가장 효과적인 것으로 동정된 E7 siRNA (5‘-UGCAAUAUACACAGGUUAdTdT-3', 도 3A)와 함께 E7에 대한 온-타겟 저해 효율을 다음과 같이 비교하여 보았다 (도 4D). 우선은 본 발명에 따른 siRNA는 우선 가이드 가닥으로 합성하고, 이와 함께 운반자 가닥을 기존의 구조인 19개의 완전 상보배열(perfect reverse complement)과 함께 3'말단에 2개의 dT(Deoxy Thymine Nucleotide)의 돌출부를 가지는 이중가닥으로 생성될 수 있도록 제조하였다. 이러한 RNA는 Bioneer사 또는 ST Pharma사를 통해 화학적으로 합성하고 HPLC로 분리하였으며, 상기 회사에서 제공한 방법에 따라 가이드 가닥과 운반 가닥의 이중체(duplex)로 제조하였다. siRNA의 온-타겟 저해 효율을 정확하게 측정하고자 루시퍼라제 리포터(luciferase reporter) 측정을 여러 농도의 siRNA에서 수행하여 IC₅₀ (inhibitory concentration 50) 분석을 수행하였다. 이러한 루시퍼라제 리포터 실험은 Promega사의 psi-check2 벡터를 사용하여 레닐라 루시퍼라제 유전자 다음에 해당 siRNA와 완전상보적인 서열을 삽입 제작하여 시행하였다. 즉, 상기에서 이중체로 제조된 siRNA는 0, 0.05, 0.1, 0.8, 5, 20, 75 nM을 사용하여 HeLa세포(ATCC CCL-2)에 psi-check2 벡터와 함께 Lipofectamine 2000 시약(Invitrogen)을 이용하여 제조자의 프로토콜에 따라 HeLa 세포에 전달(co-transfection)시켜서 그 효과를 조사하였다. 트랜스펙션을 수행한 후 24시간 후, Promega사의 Dual-luciferase reporter asssay system을 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 루시퍼라제의 활성을 측정하여 siRNA의 효과를 조사하였으며, 레닐라 루시퍼라제 활성 계측은 Promega사의 Glomax Luminometer를 이용하여 최소 4번 이상의 반복 실험으로 반딧불(firefly) 루시퍼라제의 활성에 의해 표준화되어 계산하였다.

그 결과, 도 4D에 나타낸 바와 같이, 206/E7 siRNA의 온-타겟 억제능이 IC₅₀가 1.02nM로 기존에 최적의 온-타겟 효과를 보이는 것으로 선택된 E7 siRNA의 IC₅₀인 1.01nM과 동일하게 나타남을 관찰하였다. 또한 이러한 siRNA의 효과가 실제로 자궁경부암 세포 내에서 E7 단백질의 발현을 저해하는지를 확인하기 위해서, HeLa 세포에서의 E7 단백질 양의 변화를 면역 블롯 분석(immunoblot assay)으로 측정하였다 (도 4D). 즉, 각각 75nM의 대조군 siRNA(Cont), E7 siRNA 또는 206/E7 siRNA을 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)로 제조사의 프로토콜에 따라 전달하고, 48시간 이후에 세포를 얻었다. 이 후 세포를 RIPA 용해 시약(바이오세상)으로 깬 후, 그 세포 용해액의 단백질 양을 Quick Start Bradford 단백질 측정 시약 (Bio-Rad)으로 제조사의 프로토콜에 따라 측정하여, 동일양으로 맞추어준 후에, SDS-PAGE로 전기영동을 한 후, PVDF 막에 옮기고, HPV의 E7을 인식하는 항체(8E2; abcam)로 그 양을 측정하였으며, 대조군으로는 β-actin 항체(Cell signaling)를 사용하였다. 그 결과, E7 siRNA와 206/E7 siRNA 둘 다 효율적으로 자궁경부암 세포의 HPV E7 단백질의 발현을 억제하는 것을 확인하였다 (도 4D). 이와 같이, 206/E7 siRNA는 기존의 개발된 E7 siRNA와 동일하게 우수한 온-타겟 억제 효과를 보이면서, 실제로 자궁경부암 세포 내에서의 E7 단백질의 양을 효과적으로 없앤다는 것을 확인하였다.

miR-1 (또는 miR-206) 이외에 HPV18과 HPV16의 E6/E7 mRNA를 억제하는 RNA 간섭물질로 디자인한 siRNA 서열도, 도 4E에 나타낸 서열로 합성하였고, E6/E7 유전자 억제 효과를 HPV18은 HeLa 세포에서 HPV16은 SiHa 세포에서 qPCR로 확인하였다 (도 4F). 이 때 50nM의 siRNA를 사용하였고, 이를 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) 시약을 이용하여 해당 프로토콜에 따라 트랜스펙션하고 24시간 후에 총 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)로 추출하고, 해당 프로토콜에 따라 Superscript III RT (Invitrogen)로 역전사하고, SYBR　Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 qPCR을 수행하여 PCSK9의 mRNA을 측정하고 GAPDH mRNA 값으로 표준화하였다. 그 결과 모든 siRNA가 E6/E7 유전자를 효과적으로 억제한다는 것을 확인할 수 있었다 (도 4F)

[ 실시예 4]

206/E7 siRNA의 표적 유전자 발현 저해 효과 및 자궁경부암 세포의 사멸 유도 효과 비교

상기 실시예 3에서 확인한 바와 같이, 206/E7 siRNA는 기존의 E7 siRNA와 동일하게 효율적으로 E7 단백질 발현을 억제하였다. HPV의 E6와 E7 유전자는 함께 전사되어 동일한 E7/E7 전령RNA(mRNA)를 만들고, 따라서 이를 억제하는 siRNA는 동일하게 E6와 E7 모두의 유전자 발현을 억제할 수 있다. 따라서 206/E7 siRNA이 E6/E7 mRNA를 동일하게 억제하는지를 확인하기 위해서, E6와 E7 mRNA 부분을 특이적으로 인식하는 프라이머를 디자인하여, 그 RNA 양을 qPCR(Quantitative Polymerase Chain Reaction)로 측정하였다. 먼저, HeLa 세포에 75nM의 대조군 siRNA, E7 siRNA, 또는 206/E7 siRNA 분자를 Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen) 시약을 이용하여 해당 회사가 제공하는 프로토콜에 따라 트랜스펙션하고, 24시간 후에 총 RNA를 RNeasy 키트(Qiagen)로 추출하고, 해당 프로토콜에 따라 Superscript III RT(Invitrogen)로 역전사하고, SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)로 qPCR을 수행하여 E6와 E7의 부분을 측정하는 프라이머로 그 RNA의 양을 측정하고 GAPDH mRNA 값으로 표준화하였다. 그 결과, 206/E7 siRNA는 기존의 E7 siRNA와 동일하게 HPV18의 E6와 E7 mRNA 부분의 양을 효과적으로 줄이는 것을 확인하였다 (도 5A).

206/E7 siRNA가 HPV18의 E6의 단백질 발현을 억제한다면, E6에 의해서 일어나는 p53의 분해가 저해될 것이다. 한편 p53은 DNA의 손상을 인식하고 복구하거나 세포를 사멸시키는 유전자의 전사를 조절하는 것으로 잘 알려져 있고 이에 따라 암 억제 유전자로 작용하므로, 이러한 p53 단백질의 증가로 p53의 전사 표적인 p21의 mRNA가 증가할 것이다. 이를 확인하고자 위와 동일한 조건으로 qPCR을 수행하고 대신에 p21의 mRNA를 측정하였다. 그 결과, 206/E7 siRNA도 동일하게 E7 siRNA와 같이 p21의 전사를 늘리는 것을 확인하여, p53의 기능 회복을 관찰하였다 (도 5B). 상기 관찰한 바와 같이, 206/E7 siRNA가 기존의 E7 siRNA와 같이 HPV18의 E6와 E7의 발현을 억제하여 p53의 단백질 양과 기능을 회복시킨다는 점에서, 206/E7 siRNA는 효과적으로 HPV18 유래 자궁경부암의 사멸을 촉진시켜 암세포를 억제할 가능성이 있다. 이를 확인하고자, 이전과 동일하게 75nM 대조군 siRNA와 206/E7 siRNA를 HeLa 세포에 전달한 후 48시간 후에 PI(propodium iodide)로 염색하고, FACS(Fluorescence-activated cell sorting)로 분석한 결과, 세포사멸인 아폽토시스(apoptosis)로 인해 생성되는 DNA 조각화가 206/E7 siRNA의 경우에는 43±3%(3번 반복 실험 결과)로 대조군의 13±2%에 비해 3배 이상 증가한 것을 관찰 할 수 있었다 (도 5C). 206/E7 siRNA에 의한 아폽토시스 증가가 siRNA를 자궁경부암 세포인 HeLa에 전달한지 48시간 후에 일어난다는 사실에 기반하여, 이번에는 siRNA를 전달한 후에 3일까지 매일 세포의 숫자를 측정하였다 (도 5D). 그 결과 2일 후부터 급격하게 206/E7 siRNA를 전달한 HeLa 세포의 숫자가 줄어드는 것을 확인하였으며, 동시에 현미경 상에서도 세포가 아폽토시스의 특징을 보이면서 사멸되는 것을 관찰하였다 (도 5D). 추가적으로, 이러한 세포사멸 효율을 기존의 E7 siRNA와 비교하기 위해서, 위의 실시예와 동일하게 대조군, E7, 206/E7 siRNA를 각각 HeLa에 전달 시킨 후, 72시간 후에 Annexin V: FITC Apoptosis Detection Kit II (BD Pharmingen)를 사용하여, 회사에서 제공된 프로토콜에 따라 PI와 annexin V로 염색한 후, FACS로 세포사멸을 아폽토시스와 네크로시스(necrosis)로 구별하여 측정하였다 (도 5E). 그 결과, 206/E7 siRNA는 기존의 E7 siRNA보다 2배 이상으로 아폽토시스로 인한 세포 사멸을 일으키는 것을 확인하였다 (도 5E). 상기와 같이, 206/E7 siRNA는 기존의 E7 siRNA와 동일하게 E6, E7의 mRNA를 분해하고, 이에 따라 증가된 p53 단백질의 전사 표적인 p21의 전사를 활성화시키며, HPV18 유래 자궁경부암 세포인 HeLa의 아폽토시스에 의한 세포사멸을 증가시켜 암을 억제한다는 사실을 확인하였으며, 이에 따라 206/E7 siRNA는 기존의 E7 siRNA 보다 효과적으로 자궁암 세포의 사멸을 유도한다는 것을 알 수 있다.

[실시예 5]

206/E7 siRNA의 마이크로RNA로써의 표적 유전자 억제 효과 및 암 침윤 억제 효과 확인

206/E7 siRNA는 miR-206 또는 miR-1의 5‘말단으로부터 1번째부터 8번째까지의 서열인 발단 부위(seed region)를 가지고 있으므로 miR-206(또는 miR-1)과 동일하게 표적 유전자를 억제하고 동일한 기능을 하도록 발명되었다. 따라서 이러한 마이크로RNA로써의 기능을 확인하고자, 상기 실시예에서 qPCR을 시행했던 방법과 동일하게 HeLa 세포에 75nM의 대조군 siRNA (-), miR-206 (206), E7 siRNA 또는 206/E7 siRNA를 전달하고, qPCR 실험을 miR-206(또는 miR-1)의 발단 싸이트 표적(seed site target)으로 알려진 PTK9과 ADAR1 유전자에 대해서 실시하였다. 이때 miR-206은 상기 실시예에서 siRNA에 대해 기술한 동일 방법으로 합성하여 제작했으며, 이 때 miRBase (http://www.mirbase.org/)의 인간 miR-206과 동일한 서열을 사용하였다. PTK9과 ADAR1 유전자는 그 mRNA에 miR-1 또는 miR-206의 발단부위와 결합할 수 있는 AUUCCA 서열을 가지고 있으며, 이들은 miR-1 또는 miR-206에 의해서 저해되는 표적 유전자로 알려져 있다. 상기에서 실시한 qPCR 분석 결과, 206/E7 siRNA도 miR-206과 동일하게 그 표적 유전자인 PTK9과 ADAR1의 mRNA의 양을 효율적으로 감소시키는 것을 관찰하였으며, 이를 통하여 206/E7 siRNA가 miR-206과 동일한 표적을 억제할 수 있다는 사실을 확인하였다 (도 6A).

206/E7 siRNA에 의해서 일어나는 miR-206 표적 유전자의 저해를 전체 전사체에 대해서 확인하고자 RNA-Seq 분석을 추가로 시행하였다. 즉, HeLa 세포에 206/E7 siRNA와 대조군 siRNA를 각각 전달시킨 다음, 24시간 후에 전체 RNA를 RNAeasy(Qiagen) 키트로 추출하여, Otogenetics 에서 제공하는 RNA-Seq 는 유전자 서열분석에 기반한 유전자 발현 실험을 수행하였다. 상기 실험으로 얻어진 서열 데이터인 FASTAQ 파일을 TopHat, Cufflink, Cuffdiff 프로그램을 사용하여 순차적으로 분석한 다음, 대조군 siRNA를 도입한 HeLa 세포에서의 결과로 표준화하여 로그비(Fold change, log2 ratio)로 나타내어 분석을 실시하였다. 이러한 결과는 최종적으로는 miR-206의 발단 싸이트, 즉 AUUCCA 서열을 포함하면서, 가장 강력하게 표적으로써의 억제 효과를 보이는 것으로 알려진 CAUUCCA (5‘말단 기준 2번째에서부터 8번째까지와 염기 배열하는 7mer)를 가지고 있는 타겟 mRNA를 대상으로, 전체 전사체(total)와 비교하여 얻어진 mRNA 프로파일 결과를 저해되는 순서대로 누적비율(cumulative fraction)로 비교 분석하였다 (도 6B). 그 결과, 206/E7 siRNA가 miR-206의 7mer 발단 싸이트(CAUUCCA)를 가지고 있는 mRNA들이 전체 전사체와 비교하여 상대적으로 유의하게 억제된다는 사실을 통계적인 테스트를 통해 확인하였다(Kolmogorov-Smirnov test, P<0.01). 이를 통해 206/E7 siRNA를 자궁경부암 세포인 HeLa에 도입되었을 때, miR-206(또는 miR-1)과 동일하게 작용하여 그 발단 싸이트 표적 유전자군을 억제하고, 이러한 효과는 miR-206(또는 miR-1)과 동일한 생물학적 기능을 나타낼 수 있다는 점을 알 수 있었다.

따라서, 206/E7 siRNA가 miR-206과 동일하게 암세포의 침윤을 억제하는지를 확인하고자 Corning™ BioCoat™ Matrigel™ Invasion Chamber with BD Matrigel Matrix 키트(BD)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 HeLa 세포에 75nM의 대조군 siRNA(NT), miR-206, E7 siRNA, 206/E7 siRNA를 상기 실시예와 동일하게 Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) 시약을 사용하여 트랜스펙션하고 HeLa 세포의 침윤 변화를 측정하였다. 그 결과, miR-206과 E7 siRNA 모두 HeLa 세포의 침윤을 억제하였으나, 206/E7의 경우에는 이 둘의 저해 정도를 합한 정도로 HeLa 세포의 침윤을 더 많이 억제하였다. 특히, 추가적으로 206/E7 siRNA의 5‘말단 기준 2번째를 2'OMe로 변형하여 miR-206의 기능을 하는 발단 부분이 표적을 인식하지 못하도록 했을 때, HeLa 세포의 침윤 억제가 miR-206/E7에 비해 줄어들었으며, 그 침윤 억제 정도가 E7 siRNA에 의해 일어나는 정도와 비슷한 것을 관찰하였다 (도 6C).

또한, 206/E7 siRNA가 자궁경부암 세포의 이동을 miR-1과 동일하게 억제하면서, 세포 사멸을 유도하는 효과를 보이는 지를 확인하기 위해서 창상회복실험(wound healing assay)을 HeLa 세포에서 실시 하였으며, 그 결과 206/E7은 miR-1과 동일하게 자궁경부암 세포의 이동을 유의하게 억제하면서 (p<0.01, n=4, t-test) E7 siRNA와 마찬가지로 세포 사멸을 유도하는 것으로 확인할 수 있었다 (도 6D). 또한 이 효과는 image J 프로그램으로 정량했을 때, 기존의 siRNA인 E7에 비해서 월등하게 자궁경부암 세포의 이동을 억제함을 알 수 있었다 (도 6E). 이러한 결과로부터 206/E7 siRNA가 miR-206과 동일하게 전사체 수준에서 발단 부분을 통해 표적 유전자를 억제하며, 이는 기존의 E7 siRNA에 비해서 추가적으로 miR-206과 같은 기능을 수행함으로써 HPV 유래 자궁경부암의 침윤 및 전이를 보다 효과적으로 억제할 수 있음을 알 수 있다.

[실시예 6]

206/E7 siRNA의 생체 암 저해 효과를 자궁경부암 이종이식 생쥐 모델에서 평가

상기 실시예에서 분석한 206/E7 siRNA의 자궁경부암 억제 효과를 생체 내에서 평가하기 위해, 인간 자궁경부암 세포인 HeLa를 생쥐에 이종 이식한 후, 이에 대한 206/E7 siRNA의 암 억제 효과를 평가하였다. 즉 실험용 누드 마우스(Nu/nu; Orient)에 5 x 10⁵ 개의 HeLa-luc (Bioware Cell Line; Caliper) 세포를 Matrigel(BD Matrigel Matrix; BD)를 이용하여 제공되는 제조사의 프로토콜에 따라 PBS 용액과 섞어서 25%로 피하 주사하여 자궁경부암 이종이식 생쥐 모델을 만들었다(도 7). 이 후 4일, 6일, 8일, 11일이 지난 시기에 각각 대조군 siRNA 또는 206/E7 siRNA를 이종이식된 암세포에 주입하였다 (도 6A, 화살표로 표시). 이러한 siRNA의 주입은 in vivo-jetPEI(polyplus)를 사용하여, 회사에서 제공되는 프로토콜에 따라 4일과 6일 후에 각각 10ug씩, 8일과 11일 후에는 15ug씩 siRNA를 사용하여 1.2배의 in vivo-jetPEI(10ug당 1.2ul)와 함께 처리하였으며, 암세포의 크기는 vivoGlo Luciferin(Xenogen)를 제조사의 프로토콜에 따라 투여한 후, bioluminiscence image(Caliper)로 분석하였다. 그 결과, 206/E7 siRNA를 처리했을 경우 암세포의 크기가 8일 이후부터 현저하게 줄어드는 것을 관찰하였다 (도 7A). 또한 이렇게 줄어든 암세포의 크기는 18일, 20일 후에 추가적으로 20ug의 siRNA를 처리하고 그 부피를 측정했을 때에도 줄어든 크기가 유지되어 29일까지 유효함을 확인하였다 (도 7B).

또한, 추가적으로 자궁경부암 이종이식 마우스모델를 유도한 초기 시점에서 206/E7 siRNA의 효과를 기존의 E7 siRNA와 비교하기 위해서, HeLa 세포를 실험용 누드 마우스의 피하조직에 이식한 후 3일, 4일, 9일, 11일, 13일에 각각 10ug의 siRNA를 투여하고, 그 효능을 상기와 동일한 방법으로 평가하였다 (도 7C). 그 결과, 206/E7 siRNA와 E7 siRNA 둘 다 자궁경부암의 크기를 현저하게 줄이며, 특히 206/E7의 경우에는 14일 후의 암세포의 크기가 기존의 E7 siRNA에 비해 보다 많이 줄어들어 있음을 관찰하였다 (도 7D). 이러한 206/E7 siRNA의 우수한 자궁경부암 억제 효과는 반복한 실험에서도 유효하였으며, 특히 22일 후에는 E7 siRNA 보다 우수함을 추가적으로 확인하였다 (도 7E). 이와 같이, 자궁경부암 이종이식 마우스 모델 실험에서 206/E7 siRNA는 생체 내에서 효과적으로 자궁경부암의 크기를 줄이며, 이러한 효과는 30일까지 유지되며 기존의 E7 siRNA 보다 효율적으로 암을 억제함을 알 수 있었다.

<110> Encodegen Co., LTD <120> Small interfering RNA and Pharmaceutical Composition for Treatment of HPV related cancer comprising the same <130> APE-2017-0116 <140> 10-2017-0130179 <141> 2017-10-11 <160> 18 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-206 <400> 1 uggaauguaa ggaagugugu gg 22 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-1 <400> 2 uggaauguaa agaaguaugu au 22 <210> 3 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-376a <400> 3 aucauagagg aaaauccacg u 21 <210> 4 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-329 <400> 4 gagguuuucu ggguuucugu uuc 23 <210> 5 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-497 <400> 5 cagcagcaca cugugguuug u 21 <210> 6 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-218 <400> 6 uugugcuuga ucuaaccaug u 21 <210> 7 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siRNA206/E7 <400> 7 uggaaugcuc gaaggucg 18 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 376a/E7 siRNA <400> 8 aacauagaag gucaaccgg 19 <210> 9 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 329/E7-1 siRNA <400> 9 aacacacaaa ggacaggg 18 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 329/E7-2 siRNA <400> 10 agcacaccac ggacacaca 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 218/E7 siRNA <400> 11 uugugcuugc cagaaucuu 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 497/E6 siRNA <400> 12 uugcagcacg aauggcacu 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 329/E6-1 siRNA <400> 13 aacacacauu cuaauauua 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 329/E6-2 siRNA <400> 14 aacacacuau aacaauaau 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 206/E7-1 siRNA <400> 15 ucgaaugucu acgugugug 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 218/E7-1 siRNA <400> 16 uugugcuuug uacgcacaa 19 <210> 17 <211> 22 <212> RNA <213> Human papillomavirus <400> 17 gaccuuacga gcuuccagca ga 22 <210> 18 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HPV 18 E7 siRNA <400> 18 ugcaauauac acagguua 18

Claims

인간유두종 바이러스(human papilloma virus: HPV)의 E6 또는 E7 유전자의 발현을 억제하는 RNA 간섭 유도 핵산이고,
RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 하나의 단일가닥이 하기 군에서 선택되는 서열 중 어느 하나를 포함하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산:
206/E7의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5’-GGAAUGCUCGAAGGUC-3’;
376a/E7의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5’-ACAUAGAAGGUCAACC-3’;
329/E7-1의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5’-ACACACAAAGGACAGG-3’;
329/E6-1의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5’-ACACACAUUCUAAUAU-3’;
329/E6-2의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5’-ACACACUAUAACAAUA-3’;
218/E7의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5’-UGUGCUUGCCAGAAUC-3’;
218/E7-1의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5’-UGUGCUUUGUACGCAC-3’; 및
497/E6의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5’-UGCAGCACGAAUGGCA-3’.
삭제
삭제
삭제
제 1항에 있어서,
상기 서열 중 어느 하나를 포함하는 단일가닥은 아고너트 단백질과 결합하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산의 이중가닥 중 206/E7의 5'말단의 2번째 내지 17번째 서열인 5'-GGAAUGCUCGAAGGUC-3'을 포함하는 단일가닥은 PTK9 또는 ADAR1 유전자 발현을 억제하고, AUUCCA 서열을 가지고 있는 전사체를 억제하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 자궁경부암 세포의 사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는 RNA간섭 유도 핵산.
제 1항에 있어서,
상기 RNA 간섭 유도 핵산은 자궁경부암 세포의 침윤 또는 전이를 억제하는 것을 특징으로 하는 RNA 간섭 유도 핵산.
제 1항의 RNA 간섭 유도 핵산 서열에 상응하는 DNA 서열을 포함하는 벡터.
제 1항의 RNA 간섭 유도 핵산을 포함하는 HPV의 감염으로 유발되는 암의 치료용 약학 조성물.
제 10항에 있어서,
상기 암은 자궁경부암, 질암, 외음부암, 항문암, 음경암, 편도암, 인두암, 후두암, 머리와 목암 및 폐의 선암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 HPV 감염으로 유발되는 암의 치료용 약학 조성물.
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