KR102067009B1

KR102067009B1 - No 활성 억제제, 이를 포함하는 항염증 제제, 이를 포함하는 화장품 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102067009B1
Application number: KR1020190052100A
Authority: KR
Inventors: 윤여필; 김지연; 이현재; 김주덕; 도기환; 이용걸
Original assignee: (주) 인터코스; (주)리치케미칼
Priority date: 2018-05-11
Filing date: 2019-05-03
Publication date: 2020-01-15
Anticipated expiration: 2039-05-03
Also published as: KR20190129723A

Abstract

본 발명은 천연자원 소재인 담배잎산말을 이용한 NO 활성 억제제, 이를 포함하는 항염증 제제에 관한 것으로서, 좀 더 구체적으로 설명하면, 담배잎산말 추출물을 NO 활성 억제제로 응용하여, 항염증 제제, 이를 이용한 이를 이용한 화장품, 연고 등의 피부외용제, 건강보조식품에 이용할 수 있는 발명에 관한 것이다.

Description

NO 활성 억제제, 이를 포함하는 항염증 제제, 이를 포함하는 화장품 및 이의 제조방법{Inhibitor for NO activator, Anit-inflammation agent containing of the same, Revitalizing cosmetics containing the same and Manufacturing method thereof}

본 발명은 피부 등에 염증을 유발하는 NO 활성을 억제하고, 스트레스 받고 지친 피부를 효과적으로 회복시켜주는 NO 활성 억제제, 이를 포함하는 항염증 제제, 이를 이용한 화장품 및 이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

염증반응은 인체가 항상성 유지하기 위해 외부 자극원에 대한 인체의 방어 기작으로 미생물 유래의 LPS(lipopolysaccharide)와 같은 외부 자극원과 아라키돈산(arachidonic acid)과 같은 내부 자극원들을 매개로 하여 발생한다.

LPS는 그람 음성박테리아의 세포벽 최외각층에 존재하는 물질로서 병원성 세균과 진핵생물간의 상호작용에 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 특히LPS는 인체에서 외래물질로 인식되어 세포 방어시스템을 활성화시키고, 이로 인해 면역 방어시스템 중 하나인, 염증유발경로가 활성화된다.

세포가LPS 등의 외부 자극원에 의해 자극을 받게 되면, iNOS(유도형NO synthas) 및 COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현이 유도되고, 이로 인해 염증반응을 매개하는 세포 내 신호 전달 물질인 일산화질소(nitric oxide, NO)와 프로스타글란딘(prostaglandin E2, PGE₂)을 방출하게 된다. 이렇게 과다 방출된NO 및PGE₂로 인해 인체 및 조직에 염증반응이 일어나게 된다.

일반적으로 NO는 생리적인 현상인 혈압조절과 신경전달 매개체로 작용하는 등 정상적인 생리활성의 조절작용을 하는 조절물질이며, 면역반응에 있어서도 중추적인 조절물질 역할을 하고 있다. 하지만 iNOS에 의해 과발현된 NO는 염증반응을 일으키고 면역체계의 이상을 유발한다. 또한COX-2는 아라키돈산을 프로스타글란딘(PGE₂)로 전환시키는 효소로서, COX-2가 과발현하게 되면, PGE₂가 과다 생성되어 또 다른 염증유발경로 역할을 하게 된다.

대부분의 염증 질환의 치료제로서 널리 사용되고 있는 제제인 비스테로이드성 소염제(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDS)는 시클로옥시게나제(cyclooxygenase, COX)라고 하는 아라키돈산(arachidonicacid)로부터 프로스타글란딘(prostaglandin)의 생합성에 관여하는 효소 활성을 억제함으로써, 항염증 작용을 나타내는데, 주 치료작용 외에 위장관 장애, 간장애, 신장애 등의 심각한 부작용을 야기하기므로 장기간의 사용에 있어서 제약이 따르는 실정이다(Rajakariar R et al. 2006).

따라서 부작용이 거의 없어 장기간 사용하는데 무리가 없으면서 항염증 효능에 탁월한 새로운 소염 진통제의 개발이 널리 요구되고 있으며, 이는 최근 천연 자원으로부터의 효능 검증을 통한 소재 개발 연구가 활성화되고 있는 이유이기도 하며, 최근에 천연 자원을 이용한 항염 효과가 있는 피부 외용제, 화장품에 대한 인기가 증가하고 있으며, 이러한 부작용 없는 천연 화장품 소재 및 제품에 대한 연구가 증대하고 있다. 특히, 천연 한약재로 알려진 해조류를 이용한 응용제품이 미비한 실정이다.

대한민국 등록번호 10-1164083호(공고일 2012. 07. 16)

본 발명자들은 끊임없이 연구한 결과, 담배잎산말 추출물이 세포, 특히 피부 세포에 대한 독성 및 부작용이 없으면서 NO 생성 억제 효과가 있음을 확인하였다. 즉, 본 발명은 담배잎산말 추출물의 최적 농도로 포함하는 NO 활성 억제제, 이를 포함하는 항염증 제제, 이를 이용한 화장품 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

상기 과제를 해결하기 위한 본 발명은 담배잎산말 추출물을 포함하는 NO 활성억제제를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 NO 활성억제제를 포함하는 항염증 제제를 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 항염증 제제를 포함하는 화장품을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 항염증 제제를 제조하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 NO 활성억제제는 세포 독성이 없으면서도 LPS에 의한 NO 생성을 억제, 염증마커인 iNOS, COX-2, IL2, IL6의 세포 내 활성을 억제하여 우수한 항염 효과를 가진다. 따라서, 본 발명의 NO 활성억제제는 항염증 제제로 사용하기 적합하며, 나아가 화장품 등에 적용하여 피부트러블, 여드름 등으로 인한 염증 억제 효과가 있는 천연 피부외용제, 바람직하게는 천연 화장품을 제공할 수가 있다.

도 1 및 도 2는 실험예 1에서 실시한 루시퍼라제 활성도 측정 결과이다.
도 3의 A 및 B는 실험예 2에서 실시한 웨스턴 블랏 측정 결과이다.
도 4는 실험예 3에서 실시한 담배잎산말 추출물에 대한 세포 생존율 측정 데이타이다.
도 5a ~ 도 5d는 실시간 중합효소 연쇄반응 측정 데이터로서, 도 5a는 IL2, 도 5b는 IL6, 도 5c는 iNOS, 도 5d는 COX-2에 대한 측정 데이타이다.
도 6은 실험예 5에서 실시한 담배잎산말 추출물의 Raw264.7세포에 대한 산화적 스트레스 방어 측정 결과이다.
도 7은 실험예 6에서 실시한 일산화질소(NO) 생성량 측정 실험 측정 결과이다.
도 8은 실험예 7의 피부 첩포 안정성 평가시험 결과에 대한 요약서를 일부 발췌한 것이다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 자세하게 설명을 하겠다.

담배잎산말은 학명이 Desmarestia tabacoides인 해조류로서, 일명 Tabakogusa로도 불리는 해조류이다. 일본, 국내 방어진, 추자도, 제주도 등지에 분포하며, 형태적 특징은 몸이 매우 큰 엽상이며, 짧은 줄기가 있고, 넓은 난원형의 엽편을 가진다. 잎은 대체로 엇비슷하게 째어지고 단엽이며 중륵이 있다. 엽편은 열편을 펼치면 큰 난원형으로 되고 담배잎과도 비슷하다. 중륵은 하부에서는 좀 융기하나 차차 윗쪽으로 갈수록 희미하게 되고 대생하는 측맥이 있다. 측맥은 거의 그 기점에서 다수의 작은 세맥으로 된다. 담배잎산말의 색은 밤색이며 공기 중에서는 청록색으로 변하는 특징이 있다. Desmarestia에 속하는 해조류들은 산을 함유하고 있으며, Desmarestia에 속하는 해조류 추출액에는 능금산, 황산염 구연산 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있고 이들 산의 상승작용에 의해 산성도가 높은 걸로 알려져 있다.

본 발명의 NO 활성억제제는 담배잎산말 추출물을 포함하며, 이는 정제수 100 중량부에 대하여 담배잎산말 20 ~ 30 중량부를, 바람직하게는 22 ~ 30중량부를, 더욱 바람직하게는 22 ~ 28 중량부를, 더 더욱 바람직하게는 24 ~ 26.5 중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 단계; 상기 원료를 110℃ 하에서, 4 ~ 6시간 동안 증류추출을 수행하여 추출하여 추출물을 얻는 단계; 상기 추출물을 1차 필터링(filtering)하여 얻은 1차 여과액을 제조하는 단계; 상기 1차 여과액에 1,2-헥산디올을 첨가 및 교반한 후, 2차 필터링하여 담배잎산말 추출물을 제조하는 단계;의 공정을 수행하여 제조한 것을 사용할 수 있다.

상기 담배잎산말 추출물 제조시, 상기 1차 필터링은 평균기공 20 ~ 30㎛ 필터막으로 필터링을 수행할 수 있고, 바람직하게는 평균기공 23 ~ 27㎛ 인 필터막으로 필터링을 수행할 수 있다.

그리고, 상기 2차 필터링은 평균기공 8 ~ 15㎛ 필터막으로, 바람직하게는 8 ~ 12㎛ 필터막으로 필터링을 수행할 수 있다.

이렇게 제조한 본 발명의 NO 활성억제제는 담배잎산말 추출물을 30 중량% 이하로 포함할 때, RAW264.7 세포 생존율이 100% 이상일 수 있으며, 바람직하게는 담배잎산말 추출물을 20 ~ 30 중량%로 포함할 때, RAW264.7 세포 생존율이 99.8 ~ 105%일 수 있다.

또한, 본 발명의 NO 활성억제제는 담배잎산말 추출물을 200ppm 이하로 포함할 때, RAW264.7 세포 생존율이 100% 이상일 수 있다.

또한, 본 발명의 NO 활성억제제는 담배잎산말 추출물의 농도가 10 ~ 200ppm일 때, 하기 수학식 1에 의거하여 측정시, RAW264.7 세포에서의 일산화질소 생성 억제율이 20 ~ 45%일 수 있으며, 바람직하게는 RAW264.7 세포에서의 일산화질소 생성 억제율이 25 ~ 45%일 수 있다.

[수학식 1]

NO 생성 억제율(%) = (A-B)/A×100%

상기 수학식 1에서 A는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물 농도가 0ppm일 때 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(100%)이고, B는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물의 특정 농도에서의 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(%) 측정값이다.

본 발명의 NO 활성억제제는 담배잎산말 추출물을 포함하고, iNOS(유도형 NO synthas), COX-2(cyclooxygenase-2), 및/또는 인터류킨수용체인 IL2, IL6의 활성을 억제하여, NO 활성억제 효과 및/또는 항염 효과를 가질 수 있다.

본 발명의 항염증 제제는 상기 담배잎산말 추출물을 포함하는 NO 활성 억제제를 이용하며, 수상액; 유상액; 상기 활성화제; 및 정제수;를 포함한다.

또한, 본 발명의 함염증 제제는 향료를 더 포함할 수도 있다.

그리고, 본 발명의 항염증 제제는 상기 수상액 10 ~ 18.5 중량%, 상기 유상액 15 ~ 25 중량%, 상기 NO 활성 억제제 1 ~ 6 중량% 및 잔량의 정제수를 포함하며, 바람직하게는 상기 수상액 12.5 ~ 17.5 중량%, 상기 유상액 16.5 ~ 22.5 중량%, 상기 NO 활성 억제제 1.5 ~ 5.5 중량% 및 잔량의 정제수를, 더욱 바람직하게는 상기 수상액 14.0 ~ 16.5 중량%, 상기 유상액 17.5 ~ 20.0 중량%, 상기 NO 활성 억제제 2.0 ~ 5.0 중량% 및 잔량의 정제수를 포함한다. 이때, 상기 수상액이 10 중량% 미만이면 피부에 대한 보습력이 저하되는 문제가 있을 수 있고, 18.5 중량%를 초과하면 크림 제형의 안정성이 저하되는 문제가 있을 수 있다. 그리고, 상기 유상액이 15 중량% 미만이면 유분 미달로 피부 보습 유지에 문제가 있을 수 있고, 25 중량%를 초과하면 과도한 오일성분이 함유되어 피부호흡 방해나 지성피부의 뽀루지 등의 문제를 일으킬 수 있다. 또한, NO 활성 억제제가 1 중량% 미만이면 그 함량이 너무 적어서 NO 활성 억제 효과를 볼 수 없을 수 있고, 6 중량%를 초과하면 과다 사용으로 인해 다른 성분들과의 상용성이 떨어져서 제품의 질이 오히려 떨어질 수 있으며, 과다 사용으로 인한 NO 활성 억제제 효과도 거의 미비하므로 비경제적이다.

함염증 제제의 추가 성분 중 상기 향료는 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 구체적인 일례를 들면, Perfume 85147, Perfume 25399 등을 사용할 수 있다.

[수상액]

본 발명의 함염증 제제 성분 중 상기 수상액은 피부컨디셔닝제, 피부보호제, 보습제, 산화방지제, 점도증가제, 방부제 및 pH 조절제를 포함할 수 있다.

수상액 성분 중 상기 피부컨디셔닝제로는 다이포타슘글리시리제이트(Dipotassium Glycyrrhizate), 베타인(betane), 판테놀(panthenol) 및 1,2-헥산다이올(1,2-hexanediol), 소듐하이알루로네이트, 히알루론산 및 하이드롤라이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 다이포타슘글리시리제이트, 베타인, 판테놀 및 1,2-헥산다이올 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 다이포타슘글리시리제이트, 베타인, 판테놀 및 1,2-헥산다이올 중에서 선택된 3종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

그리고, 피부컨디셔닝제로서, 4종을 모두 혼합하여 사용하는 경우에는 베타인, 다이포타슘글리시리제이트, 판테놀 및 1,2-헥산다이올을 1 : 0.01 ~ 0.05 : 0.1 ~ 0.5 : 1.5 ~ 3 중량비로, 바람직하게는 베타인, 다이포타슘글리시리제이트, 판테놀 및 1,2-헥산다이올을 1 : 0.02 ~ 0.04 : 0.2 ~ 0.4 : 1.8 ~ 2.5 중량비로, 더욱 바람직하게는 베타인, 다이포타슘글리시리제이트, 판테놀 및 1,2-헥산다이올을 1 : 0.025 ~ 0.035 : 0.25 ~ 0.45 : 1.85 ~ 2.25 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 좋다.

다음으로, 수상액 성분 중 피부보호제는 건조나 외부 유해물질로부터 피부를 보호하는 역할을 하는 것으로서, 이의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 2 ~ 15 중량부를, 바람직하게는 2 ~ 10 중량부를, 더욱 바람직하게는 2.3 ~ 7 중량부를 사용하는 것이 좋으며, 피부보호제 사용량이 2 중량부 미만이면 그 사용량이 너무 적어서 피부 장벽효과를 볼 수 없을 수 있고, 그 사용량이 15 중량부를 초과하여 사용하면 피부를 끈적이게 하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내로 사용하는 것이 좋다. 그리고, 피부보호제로는 당업계에서 일반적으로 사용하는 피부보호제 성분을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 알란토인(allantoin), 다이포타슘글리시리제이트(Dipotassium Glycyrrhizate) 및 판테놀(Panthenol)중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 알란토인을 사용하는 것이 좋다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 보습제는 유상액의 수분증발차단제와 함께 피부 보습을 증대시키는 역할을 하는 것으로서, 이의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 250 ~ 400 중량부를, 바람직하게는 280 ~ 350 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 보습제의 사용량이 250 중량부 미만이면 피부 보습 효과가 떨어질 수 있고, 400 중량부를 초과하여 사용하더라도 보습 증대 효과가 없으므로 비경제적인 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 그리고, 보습제로는 다이프로필렌글라이콜(dipropylene glycol), 메틸프로판디올 및 글리세린 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 다이프로필렌글라이콜 및 글리세린 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 산화방지제는 원료의 산화, 산폐를 방지하는 역할을 하는 것으로서, 산화방지제의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 0.1 ~ 3.0 중량부를, 바람직하게는 0.5 ~ 2 중량부를, 더욱 바람직하게는 0.5 ~ 1.5 중량부를 사용할 수 있다. 이때, 산화방지제 사용량이 0.1 중량부 미만이면 안티옥시던트(Antioxidant)로서의 효과를 볼 수 없을 수 있고, 3 중량부를 초과하여 사용하면 과량 사용으로서 제형 안정도를 저하하는 문제가 있을 수 있다. 그리고, 산화방지제로는 당업계에서 일반적인 화장품 등에 사용하는 산화방지 소재를 사용할 수 있으나, 바람직하게는 비에이치티(BHT), 토코페롤(Tocopherol) 및 베타카로틴(β-Carotene)중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 더욱 바람직하게는 BHT를 사용하는 것이 좋다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 점도증가제는 제제에 적절한 점성과 끈적임을 부여하여 피부 밀착성을 증가시키 역할을 하는 것으로서, 점도증가제 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 10 ~ 35 중량부를, 바람직하게는 15 ~ 30 중량부를, 더욱 바람직하게는 18 ~ 25 중량부를 사용할 수 있다. 이때, 점도증가제의 사용량이 10 중량부 미만이면 그 사용량이 너무 적어서 이를 사용하는 효과가 미비하고, 35 중량부를 초과하여 사용하면 제제의 점도가 너무 높아져서 피부에 대한 끈쩍임이 너무 증가하여 상품성이 떨어지는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 증점제로는 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 잔탐검, 구아하이드록시 트리모니움 클로라이드, 암모늄아크릴로일다이메틸타우레이트/브이피코폴리머(ammonium acryloyldimethyltaurate/VP copolymer) 및 하이드록시 에틸 셀룰로오스 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있고, 바람직하게는 잔탄검, 암모늄아크릴로일다이메틸타우레이트/브이피코폴리머 및 하이드록시 에틸 셀룰로오스 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 잔탄검 및 암모늄아크릴로일다이메틸타우레이트/브이피코폴리머를 1 : 2 ~ 3 중량비로 혼합하여 사용할 수 있다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 방부제는 항염증 제제의 장기안정성을 도모 및 미생물 등의 외부 오염물로부터의 제제의 변성을 방지시키기 위해 사용하는 것으로서, 이의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 2 ~ 8 중량부를, 바람직하게는 4 ~ 7 중량부를, 더욱 바람직하게는 4.5 ~ 6.5 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 방부제 사용량이 2 중량부 미만이면 이를 사용하는 효과를 볼 수 없어서 외부 오염원에 대한 제제의 변성이 발생할 수 있고, 8 중량부를 초과하면 항염증 제제를 화장료로 적용시, 피부 트러블을 발생시킬 수 있다. 그리고, 상기 방부제로는 당업계에서 상업적으로 구입할 수 있는 피부 트러블 비유발 방부제를 사용할 수 있으며, 바람직한 일례로는 메틸파라벤(methylparaben) 및 클로페네신 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종을 혼합하여 사용할 수 있다.

다음으로, 수상액 성분 중 상기 pH 조절제는 수상액의 적정 pH 범위인 pH 5.3 ~ 6.5이 되도록 조절하기 위해 사용하는 것으로서, 일반적인 염기성 pH 조절제를 사용할 수 있고, 바람직한 일례를 들면, 트리에탄올아민을 사용할 수 있다. 그리고, pH 조절제의 사용량은 2 ~ 7 중량부, 바람직하게는 2.5 ~ 5 중량부, 더욱 바람직하게는 3 ~ 5 중량부 정도 사용할 수 있다.

이러한 조성을 혼합하여 제조한 상기 수상액은 pH가 5.3 ~ 6.5일 수 있다.

[유상액]

본 발명의 함염증 제제 성분 중 상기 유상액은 피부컨디셔닝제, 유화제, 유화안정제 및 점도증가제를 포함할 수 있다.

또한, 상기 유상액은 수분증발차단제, 토코페릴아세테이트, 피부유연화제, 비이온계면활성제 및 피막형성제 중에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수도 있다.

유상액 성분 중 상기 피부컨디셔닝제는 피부에 영양분을 공급하는 역할을 하는 것으로서, 부티로스퍼뮴 파키 시어버터(butyrospermum parkii shea butter), 세틸에틸헥사노에이트, 사이클로펜타실록세인, 카프릴릭/카프릭트라이글리세라이드(caprylic/capric triglyceride), 다이메티콘(dimethicone), 폴리아이소부텐(polyisobutene), 코코넛 오일, 마카다미아넛 오일, 호호바 오일 중에서 선택된 단종 또는 2종을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 부티로스퍼뮴 파키 시어버터, 세틸에틸헥사노에이트, 사이클로펜타실록세인, 카프릴릭/카프릭트라이글리세라이드, 다이메티콘 및 폴리아이소부텐 중에서 선택된 단종 또는 2종을 혼합하여 사용할 수 있다.

유상액 성분 중 상기 유화제는 유상액 조성물들간 상용성 향상 및 유화력을 증대시키기 위한 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 글리세릴스테아레이트, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 40, 폴리솔베이트 60, 폴리솔페이트 80 및 소르비탄 세스퀴올리에이트(sorbitan sesquioleate) 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 글리세릴스테아레이트, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 60 및 소르비탄 세스퀴올리에이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 글리세릴스테아레이트, 폴리솔베이트 20, 폴리솔베이트 60 및 소르비탄 세스퀴올리에이트를 1 : 0.35 ~ 0.55 : 0.10 ~ 0.25 : 0.30 ~ 0.50 중량비로 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 유화제의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 20 ~ 40 중량부를, 바람직하게는 24 ~ 36 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 유화제 사용량이 20 중량부 미만이면 유상액 간 혼합, 용해가 잘 되지 않을 수 있으며, 40 중량부를 초과하여 사용하는 것은 비경제적이다.

유상액 성분 중 상기 유화안정제는 제형의 유화를 안정화하는 역할을 하는 것으로서, 비즈왁스(beeswax), 세테아릴 글루코사이드-세테아릴 알코올(cetearyl glucoside and cetearyl alcohol), 세테아릴알코올, 피이지-20 스테아레이트, 피이지-40 스테아레이트 및 피이지-100 스테아레이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 비즈왁스, 세테아릴알코올, 및 피이지-100 스테아레이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 유화안정화제의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 35 ~ 75 중량부를, 바람직하게는 40 ~ 55 중량부를, 더욱 바람직하게는 45 ~ 52 중량부를 사용할 수 있으며, 이때, 유화안정화제 사용량이 35 중량부 미만이면 유상액 간 혼합, 용해가 잘 되지 않을 수 있으며, 75 중량부를 초과하여 사용하면 유화가 생성되지 않는 문제가 있을 수 있다.

유상액 성분 중 상기 점도증가제는 유상액의 점도를 조절하는 역할을 하는 것으로서, 그 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 5 ~ 15 중량부를, 바람직하게는 7.5 ~ 13 중량부를 사용할 수 있으며, 15 중량부를 초과하면 그 사용량이 너무 과하여 이루고자 하는 점도를 초과하여 사용하기에 불편할 수 있는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 그리고, 상기 점도증가제로는 소듐폴리아크릴레이트, 폴리아크릴레이트-13, 폴리이소부텐 및 카보머 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 폴리아크릴레이트-13, 폴리이소부텐 및 카보머 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다.

유상액 추가 첨가제 중 수분증발차단제는 함염증 제제 제조 중 적정 수분 유지 및 제조된 제제를 피부에 적용시, 보습제와 함께 적정 수분 함량을 유지시키는 역할을 하는 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 MCT 오일 및 스쿠알란 중에서 선택된 1종 또는 2종을 혼합하여 사용할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 MCT 오일 및 스쿠알란을 5 ~ 10 : 1 중량비로 혼합하여 사용하는 것이 좋다.

다음으로 유상액 추가 첨가제 중 상기 토코페릴아세테이트는 제제가 시간이 지남에 따라 산화하여 변질되는 것을 막는 역할을 하는 것으로서, 그 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 0.1 ~ 5 중량부를, 바람직하게는 0.4 ~ 2 중량부를 사용할 수 있다. 이때, 토코페릴아세테이트 사용량이 0.1 중량부 미만이면 그 사용량이 너무 적어서 산화방지 효과를 볼 수 없을 수 있고, 그 함량이 5 중량부를 초과하면 피부에 자극을 초래하는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

다음으로 유상액 추가 첨가제 중 상기 피부유연화제는 거친 피부를 부드럽게 하는 역할을 하는 것으로서, 그 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 2 ~ 10 중량부를, 바람직하게는 3 ~ 7.5 중량부를 사용하는 것이 좋으며, 이때, 피부유연화제 사용량이 2 중량부 미만이면 효과가 미미 할 수 있는 문제가 있을 수 있고, 그 함량이 10 중량부를 초과하면 그 사용량이 너무 과하여 사용시 끈적거림이 심할 수 있는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다. 그리고, 피부유연화제는 하나 이상의 중간사슬 모노글리세라이드 함유한 유상제, 글리세릴카프레이트, 폴리글리세릴-2-라우레이트 및 폴리글리세릴-10-라우레이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 바람직하게는 하나 이상의 중간사슬 모노글리세라이드 함유한 유상제 및 폴리글리세릴-10-라우레이트 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 하나 이상의 중간사슬 모노글리세라이드 함유한 상기 유상제의 구체적인 일례로는 알콜라인 MCM(AKOLINE MCM) 등이 있다.

다음으로 유상액 추가 첨가제 성분 중 상기 비이온계면활성제는 유화제와 함께 조성물들에 대한 용해 보조제 역할을 하는 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 비이온 계면활성제를 사용할 수 있으며, 구체적인 일례로는 Tween 20, Tween 40 및 Tween 60 중에서 선택된 1종 단독 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 그리고, 비이온계면활성제의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 2 ~ 15 중량부를, 바람직하게는 3 ~ 10 중량부를 사용할 수 있다.

다음으로, 유상액 추가 첨가제 성분 중 피막형성제는 제제가 피부에 적용 후, 외부의 불필요한 오염 물질 등으로부터 피부를 보호하는 역할을 하는 것으로서, 당업계에서 사용하는 일반적인 것을 사용할 수 있으며, 구체적인 일례로는 세피플러스 400(sepiplus 400) 등을 사용할 수 있다. 그리고, 피막형성제의 사용량은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 피막형성제 1.5 ~ 8 중량부를, 바람직하게는 2.5 ~ 7 중량부를 사용할 수 있으며, 그 사용량이 1.5 중량부 미만이면 그 사용량이 너무 적어서 이를 사용하는 효과를 볼 수 없고, 8 중량부를 초과하여 사용하면 유상액 성분 내 고형분이 발생할 수 있으므로 상기 범위 내에서 사용하는 것이 좋다.

이하에서는 앞서 설명한 본 발명의 함염증 제제를 제조하는 방법에 대하여 설명을 한다.

본 발명의 함염증 제제는 유상액 및 수상액을 각각 제조한 후, 이들을 특정 조건 온도 하에서 유화시켜 제조한 것으로서, 수상액 및 유상액을 각각 제조하는 1단계; 상기 유상액에 수상액을 첨가한 다음 교반시켜서 혼합물을 제조하는 2단계; 40 ~ 50℃ 하에서 상기 혼합물, 담배잎산말 추출물, 향료 및 정제수를 혼합 및 2,000 ~ 3,000rpm의 교반속도로 교반시키는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.

그리고, 상기 1단계의 유상액은 피부컨디셔닝제, 유화제, 유화안정제를 혼합한 후, 70 ~ 85℃, 바람직하게는 75 ~ 80℃의 온도가 되도록 가열 및 교반시켜서 용액을 제조한 다음, 상기 용액에 점도증가제를 첨가 및 교반시켜서 제조할 수 있다.

또한, 1단계의 수상액은 피부컨디셔닝제, 피부보호제, 보습제, 산화방지제, 점도증가제 및 방부제를 혼합한 후, 50 ~ 60℃가 되도록 가열 및 교반시켜서 용액을 제조한 후, 상기 용액에 pH 조절제를 투입 및 교반하여 제조할 수 있다.

상기 유상액 및 수상액에 사용되는 성분 및 이의 사용량은 앞서 설명한 바와 동일하다.

2단계는 유상액에 수상액을 첨가한 다음 70 ~ 80℃ 하에서 2,000 ~ 3,000rpm의 교반 속도로 1 ~ 4분간 유화를 수행하여 혼합물을 제조할 수 있다.

그리고, 3단계의 담배잎산말 추출물(및/또는 이의 분획물)은 앞서 설명한 방법으로 제조한 것일 수 있다.

이렇게 제조된 본 발명의 항염증 제제는 pH 5.4 ~ 6.2, 바람직하게는 pH 5.6 ~ 6.0, 더욱 바람직하게는 pH 5.8 ~ 6.0일 수 있다.

앞서 설명한 본 발명의 항염증 제제를 사용하여 다양한 타입의 화장품을 제조할 수 있으며, 일례를 들면, 크림 타입, 세럼 타입 등의 화장품을 제조할 수 있다.

이하, 실시예에 의거하여 본 발명을 더욱 자세하게 설명을 한다. 그러나, 하기 실시예에 의해 본 발명의 권리범위를 한정하여 해석해서는 안된다.

[실시예]

실시예 1 : 담배잎산말 추출물의 제조

정제수 100 중량부에 대하여 건조 및 분말화시킨 담배잎산말 20 ~ 30 중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 준비하였다.

다음으로, 상기 원료를 110℃에서 4시간 동안 증류 추출하여 추출물을 얻었다.

다음으로, 상기 추출물을 평균기공 25㎛인 필터막으로 필터링하여 1차 여과액을 얻었다.

다음으로 상기 여과액 94.9ml에 1,2-헥산디올 2ml 을 첨가한 다음 충분하게 교반한 후, 교반액을 평균기공 10㎛인 필터막으로 2차 필터링을 수행하여 담배잎산말 추출물을 제조하였다.

실험예 1 : 담배잎산말 추출물의 루시퍼라아제 활성도 측정

(1) 실시예 1의 담배잎산말 추출물을 증류수와 혼합하여, 20ppm(pH 1.7), 200ppm(pH 1.7), 2,000ppm(pH 1.7), 20ppm(pH 4.8), 200ppm(pH 4.8), 2,000ppm(pH 4.8), 20ppm(pH 6), 200ppm(pH 6), 2,000ppm(pH 6), 20ppm(pH 8), 200ppm(pH 8), 2,000ppm(pH 8)인 담배잎산말 추출물을 각각 준비하였다. 이때 pH는 1M NaOH를 적가하여 조절하였다.

또한, 실시예 1의 담배잎산말 추출물을 80% 에탄올 수용액과 혼합하여 10ppm, 20ppm, 50ppm, 100ppm, 200ppm, 1,000ppm 및 2,000ppm을 각각 준비하였다.

(2) 인간피부 세포주인 HaCaT 세포에 ARE(antioxidant response element)로 루시퍼라아제를 삽입하여 HaCaT 리포터 세포(HaCaT reporter cell, HaCaT-ARE-GFP-luciferase cell)을 만들었고, 이 세포주는 이용하여 루시퍼라아제 활성도를 측정하였다. 이 세포주는 Nrf2에 의하여 ARE가 활성화되면 GFP 또는 루시퍼라아제(luciferase)가 발현되므로 Nrf2의 활성을 빠르게 감지할 수 있는 측정이다.

루시퍼라아제 활성도 측정은 HaCaT 리포터 세포(HaCaT-ARE-GFP-luciferase cell)에 RPMI1640 미디아(media) 0ug/ml(control), 상기 담배잎산말 추출물 20ppm(pH 1.7), 200ppm(pH 1.7), 2,000ppm(pH 1.7), 20ppm(pH 4.8), 200ppm(pH 4.8), 2,000ppm(pH 4.8), 증류 20 ~ 2,000ppm, 80% 에탄올 수용액 20 ~ 2,000ppm 및 브로콜리 추출물인 설포라페인(sulforaphane, SFN, Positive Control)으로 각각 10Um의 농도로 처리 한 후, 24시간 동안 인큐베이션시킨 후 세포(cell)의 용해물(Lysate)를 단백질 정량한 값과 루시퍼라아제 활성도(Luciferase activity)의 값을 측정하여 데이터 처리하였다.

측정 결과, 설포라페인(SFN) 보다 루시퍼라아제 활성도가 작지만, 항산화 반응을 보이는 것을 확인할 수 있었다(도 1참조). 구체적으로, pH 8의 200ppm에서의 활성이 항산화 반응이 가장 우수했으며, 다만 pH 1.7의 2000ppm의 경우, 낮은 산도 때문에 루시퍼라아제 값이 튄 것으로 사료되며, 2,000ppm(pH 1.7)이 항산화 반응이 있다고 단정 짓기는 모호한 문제가 있다.

(3) 상기 루시퍼라아제 활성도 측정과 동일한 방법으로 상기 대조군, 상기 설포라페인, 80% 에탄올 수용액 10ppm, 20ppm, 50ppm, 100ppm, 200ppm 및 1,000ppm의 루시퍼라아제 활성 측정을 수행하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 80% 에탄올 수용액에 7개의 농도로 담배잎산말 추출물을 용해 및 나누어 루시퍼라아제 활성도를 측정한 것인데, 80% 에탄올-200ppm에서 가장 우수한 항산화 반응이 확인되었다.

실험예 2 : 웨스턴 블랏 측정

HaCaT 세포에 대조군(LPS, lipopolysaccharide), 담배잎산말 추출물, 80% 에탄올 수용액 20ppm, 80% 에탄올 수용액 200ppm 을 처리한 후, 1시간 후에 염증반응을 유발하기 위해 2㎍/㎖ 농도의 LPS를 처리한 다음, 24시간 배양한 후, 웨스턴 블랏(Western blot)을 이용하여 단백질 양을 정량하였으며, 그 결과를 도 3의 A 및 B에 나타내었다. 이때, 담배잎산말 추출물은 상기 실험예 2의 (1)과 동일한 방법으로 20ppm(pH 1.7), 200ppm(pH 1.7), 20ppm(pH 4.8), 200ppm(pH 4.8), 20ppm(pH 6), 200ppm(pH 6), 20ppm(pH 8), 200ppm(pH 8)의 담배잎산말 추출물을 제조하고, 이를 이용하여 측정하였다.

도 3의 A는 루시퍼라아제 활성을 통해 항산화 반응을 보인 것 중에서 염증반응에도 반응하는지 여부를 확인하기 위해 염증마커인 COX-2와 cJun 항체를 이용하여 웨스턴블럿을 측정한 것인데, pH 1.7-200ppm에서 항산화 반응은 있었으나 산도로 인한 것으로 사료되었듯 cJun의 활성을 보아 염증에는 효과가 없었고, pH8 200ppm은 COX-2와 cJun 모두 감소시켰고, 80% 에탄올 수용액-200ppm은 cJun에서 반응하였기에 이 결과로 pH 8-200ppm이 가장 적합하다고 결정하였습니다.

다음으로, 도2의 B는 20ppm(pH 8)과 200ppm(pH 8)의 COX-2 뿐만 아니라 iNOS 염증마커를 이용하여 염증에 대한 반응을 보이는 것을 다시 확인한 결과이다.

실험예 3 : 담배잎산말 추출물에 대한 세포 생존율 측정

담배잎산말 추출물의 세포 독성을 확인하기 위해서 마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포를 염증유발 모델로 측정하였다.

(1) 세포 배양

마우스 대식세포주인 RAW 264.7 세포는 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, Thermo사의 SH30406.02) 및 1% 페니실린/스테렙토마이신(penicillin/streptomycin, Thermo사의 SV30010)이 함유된 DMEM 배지(high glucose, Thermo사의 SH30243.01)를 이용하여 100mm 세포배양접시(cell culture dish)를 사용하여 5% CO₂ 배양기에 배양했다. 컨플루언스(confluence)에 도달한 세포는 스크래퍼(Scraper, SPL사의 90030)를 사용하여 계대 배양하여 유지했다.

(2) 세포 생존율 실험

살아있는 세포 내의 미토콘드리아에 존재하는 탈수소효소는 WST(Tetrazolium Salt)에서 포르마잔(formazan)이라는 발색물질을 생성한다. 따라서 이를 측정하여 살아있는 세포의 수를 측정할 수 있다. 96 웰세포 배양기(well cell culture plate, 코닝사의 3595)에 1×10⁴ cells/well 농도의 RAW 264.7 세포를 10% FBS(fetal bovine serum), 1% 페니실린/스테렙토마이신이 첨가된 DMEM 배양액으로 24시간 배양한다. 그 후 시료가 담배잎산말 추출물(10ppm, 20ppm, 50ppm, 100ppm, 200ppm, 1,000ppm)의 농도별로 포함된 DMEM 배지로 교체하여 48시간 배양한다. 배양이 끝난 세포에 EZ-CYTOX 시약(Daeilab의 EZ-1000)을 이용하고 570nm에서 흡광도를 측정하여 하기 수학식 2 에 의거하여, 농도별 세포 생존율을 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 1 및 도 4에 나타내었다.

그리고, 대조군(control)은 담배잎산말을 처리하지 않은 Raw 264.7 세포를 이용하여 측정한 것이다.

[수학식 2]

세포생존율(Cell viability)=(시료 첨가군의 흡광도/무처리군 흡광도)× 100

구분	세포생존율(대조군 기준 %)
대조군(0 중량%)	100
10ppm	120
20ppm	120
50ppm	105
100ppm	100
200ppm	95
1000ppm	55

상기 표 1의 실험결과를 살펴보면, 담배잎산말 추출물을 200ppm 이하의 농도로 처리한 시험군은 대조군과 대비하여 통계적으로 유의한 세포 생존율의 차이를 나타내지 않았으나, 1,000ppm 농도에서는 생포 생존율이 급격하게 감소함을 확인할 수 있었다. 즉, 200ppm 이하의 농도에서는 RAW264.7 세포에 대한 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 4 : real time RT PCR 측정

인터류킨수용체인 IL2, IL6, 염증마커인 iNOS 및 COX-2에 대해 mRNA 레벨을 감소시키지 확인하기 위해 실시간 중합효소 연쇄반응(Real-time RT PCR)으로 측정하였다.

실시예 1의 담배잎산말 추출물을 20ppm(pH 8) 및 200ppm(pH 8)을 준비하였다. 또한, 대조군(control)로서, Raw264.7세포를 준비하였고, LPS(lipopolysaccharide) 준비하였다.

Raw264.7 세포에 대조군, 담배잎산말 추출물을 각각 처리한 후, 1시간 후에 염증반응을 유발하기 위해 2㎍/㎖ 농도의 LPS를 처리(18시간 인큐베이션함)하여 RNA를 뽑고, 뽑아낸 RNA를 다시 cDNA로 합성한 후에 실시간 중합효소 연쇄반응으로 mRNA 레벨을 측정하였고, 그 결과를 도 5a(IL2), 도 5b(IL6), 도 5c(iNOS) 및 도 5d(COX-2)에 각각 나타내었다.

도 5a ~ 도 5d를 보면, 담배잎산말 추출물을 처리한 경우, IL2, IL6, iNOS 및 COX-2의 Phase II mRNA 레벨이 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이에 반해, LPS만 처리한 경우, Phase II mRNA 레벨이 증가하는 결과를 보였다. 이를 통하여, 담배잎산말 추출물이 iNOS, COX-2, IL2및 IL6 인자를 감소시킴을 확인할 수 있었다.

실험예 5 : 담배잎산말 추출물의 산화적 스트레스 방어 테스트 측정

(1) Raw264.7 세포에 대한 산화적 스트레스 방어 테스트

Raw264.7 세포 (대조군, control), Raw264.7 세포에 2㎍/㎖ 농도의 LPS(lipopolysaccharide)만 처리한 경우 및 RAW 264.7 세포에 상기 LPS(2㎍/㎖)와 담배잎산말 추출물(pH 8, 200ppm)를 함께 처리한 경우의 Raw264.7세포내 방어 여부를 측정하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6은 대조군(control)은 산화적 스트레스에 의하여 DNA 손실(damage)이 일어나는지를 알아보기 위해 RAW 264.7 세포 에 DNA 염색을 하여 세포 내 DAPI, 8-OH-dG(8-hydroxy deoxyguanosine) 및 MERGE 레벨을 측정한 것이다.

도 6을 살펴보면, LPS만으로 처리한 것과 LPS와 함께 담배잎산말 추출물로 처리한 경우가 산화적 스트레스 방어를 하고 있음을 확인할 수 있다.

실험예 6 : 담배잎산말 추출물의 NO 생성억제 측정

(1) 시험 물질 처리

RAW 264.7 세포를 4×10⁴ cells/dish density로 96well 플레이트(plate)에 분주하여 24시간 동안 플레이트에 부착시켰다. 담배잎산말 추출물을 각각 처리한 1시간 후에 염증반응을 유발하기 위해 2㎍/㎖ 농도의 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 18시간 배양하였다.

(2) 일산화질소(NO) 생성량 측정 실험

RAW 264.7 세포에서 생성되어 배양액에 존재하는 NO 수준을 그리스(Griess) 반응을 기본으로 하는 NO 디텍션키트(detection kit, intron사의 21021)를 사용하여 측정하였다. NO가 존재한다고 추정되는 배양액을 96 well-플레이트(well plate)에 100㎕씩 분주한 후 N1 버퍼(sulfanilamide) 50㎕를 넣어 10분간 실온에서 반응시킨다. 이어서 N2 버퍼(naphthylethylenediamine) 50㎕를 넣고 10분간 실온에서 반응시킨 후 540nm에서 흡광도 측정하였으며, 각 NO 생성량은 아질산염 기준(nitrite standard)를 이용하여 얻은 표준검량곡선을 이용하여 산출하였다. 양성대조군(Positive control)은 L-NMMA 50μM(N^G-Methyl-L-arginine acetate salt, 시그마사의 M7033)을 사용하였다.

각각의 결과는 마이크로소프트사의 오피스 엑셀 2007(Office Excel 2007)의 t-테스트(Paired t-test, 양측검증) 기능을 이용하여 시험결과의 통계적 유의성을 확인한 것이며, 그 결과는 하기 표 2 및 도 7과 같다. 그리고, 표 2의 NO 생성 억제율은 하기 수학식 1에 의거하여 계산하였다.

[수학식 1]

NO 생성 억제율(%) = (A-B)/A * 100%

수학식 1에서 A는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물 농도가 0%일 때 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(100%)이고, B는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물의 특정 농도에서의 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(%) 측정값이다.

구분	NO 생성 억제율(대조군 기준%)
대조군(0 중량%)	100
10ppm	20%
100ppm	25%
200ppm	45%

상기 표 2의 측정결과를 살펴보면, 양성 대조군인 L-NMMA는 50μM 농도 범위에서 RAW264.7 세포의 NO 생성을 약 45% 정도 저해시켰다. 그리고, 담배잎산말 추출물은 10ppm, 100ppm 및 200ppm 농도 범위에서 통계적으로 유의한 수준으로 RAW264.7 세포의 Nitirc oxide(NO) 생성을 저해하는 것을 확인할 수 있다. 200ppm 이하로 처리시 약 20 ~ 45%의 NO 생성을 저해하는 것을 확인할 수 있었으며, 1000ppm 농도에서는 오히려 NO 생성 저해율이 크게 저하되는 문제가 있었다.

실험예 7 : 담배잎산말 추출물의 피부 첩포 안정성 평가시험 1

실시예 1에서 제조한 담배잎산말 추출물의 피부 첩포 안정성 평가시험을 (주)대학피부과학연구소에 의뢰하여 평가하였다(시험기간 2018.01.31. ~ 2018.03.20.).

평가는 패치에 2,000ppm 농도의 담배잎산말 추출물(pH 7.4)을 묻혀서 피부에 패치를 30분, 24시간, 48시간 폐쇄첩포 적용한 다음, 패치 제거 후 피부 반응 육안평가를 하였으며, 평가는 국제접촉피부염연구회 (ICDRG, International Contact Dermatitis Research Group)의 평가기준과 미국화장품협회 (PCPC, Personal Care Products Council)의 안전성 평가 가이드라인을 응용한 다음 기준에 따라 평가하였다. 이때, 시험 인원은 총 32명이었으며, 평가기준은 국제접촉피부염학회(ICDRG) 및 미국화장품협회(PCPC)기준을 응용한 자체 기준에 의거하여 평가하였다.

하기 표 3은 피부 자극성 점수 시스템이고, 표 4는 자극성 분류 기준이다. 그리고, 평가시험 결과 피부 자극성 점수 0.010점 및 자극성 분류로서 저자극 평가를 받았다(도 8 참조-피부 첩포 안정성 평가시험 결과 요약서 일부 발췌)

점수	판정기준
0	No signs of inflammation, normal skin
0.5	Doubtful or slight reaction
1	Slight erythema
2	Moderate erythema with or without partial edema or papules
3	Moderate erythema with diffuse edema
4	Intense erythema with diffuse edema with veicles

자극 지수	자극성 평가
0.00≤ <0.02	무자극 no irritancy
0.02≤ <0.25	저자극 low irritancy
0.25≤ <1.00	경자극 slight irritancy
1.00≤ <2.50	중자극 moderate irritancy
2.5≤	강자극 severe irritancy

실험예 8 : 담배잎산말 추출물의 피부첩포에 의한 안정성 평가시험 2

실시예 1의 담배잎산말 추출물의 피부 첩포 안정성 평가시험을 (주)지에스씨알오에 의뢰하여 평가하였다(시험기간 2018.01.29. ~ 2018.02.09.).

시험평가 연구 대상자는 총 31명(여자, 평균연령 46.77)이었으며, 연령분포도는 20대 1명, 30대 3명, 40대 15명, 50대 12명이었다.

평가방법은 연구 대상자 31명을 대상으로 반데르 밴드 챔버(Van der bend chamber, Brielle, the Netherlands)를 이용하여 등에 척추를 중심으로 어깨뼈와 허리선 사이에 시료를 적용하였다. 시험부위를 증류수로 닦아 내고 건조시킨 다음 담배잎산말 추출물을 35㎕씩 반데르 밴드 챔버에 적하시킨 후, 시험부위에 얹어 고정시켰다. 24시간 동안 피부에 첩포하였으며, 첩포를 제거한 후에는 메이킹 펜(making pen)으로 시험부위를 표시하여 각각 30분, 24시간 및 48시간 경과 후에 시험부위를 관찰하였다.

시험부위 자극유무 판정은 Draize Dermal Irritation Scoring system의 평가기준에 따라 자극 정도를 평가하였다(하기 그림 1 참조). 그리고 평균 피부자극도 계산 공식에 따라 MII(Mean irritation Index, 그림 2 참조)를 산정한 후 EPA(Environmental Protection Agency) Standard Evaluation Procedure Dermal Classification System의 자극 분류법 기준을 반영한 피부 1차 자극 시험 결과 판정표에 따라 자극군을 판정하였다(표 5 참조).

그리고, 피부첩포 시험 결과를 하기 표 6에 나타내었으며, 실시예 1의 평가결과에 대한 결과표를 도 9에 나타내었다.

[그림 1]

[그림 2]

자극 지수	자극군(Grade)
0.00≤ MII <0.50	무자극 (Negligible)
0.50≤ MII <2.00	미자극 (Slight)
2.00≤ MII <5.00	중자극 (Moderate)
5.00≤ MII <8.00	강자극 (Strong)

구분	반응 자수		피부자극정도												평균피부 자극도
			30분 경화 후				24시간 경화 후				48시간 경화 후
			1	2	3	4	1	2	3	4	1	2	3	4
실시예1	홍반	5	4	-	-	-	1	-	-	-	1	-	-	-	0.06
실시예1	부종	0	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	0.06

평가 결과, 담배잎산말 추출물이 피부 무자극 제품인 것으로 판정되었다.

제조예 1 : 항염증 제제의 제조

(1) 수상액의 제조

하기 표 7의 성분들을 용제에 완전 분산시킨 후, 정제수를 투입한 다음, 56 ~ 57℃로 가열 및 교반하여 완전 용해시켜서 용액을 제조한 후, 용액에 pH 조절제를 첨가하여 수상액 pH가 약 6.0 정도가 되도록 하여 수상액을 제조하였다.

수상액	구분	종류	중량비	중량부
	피부컨디셔닝제	베타인	1	100
		다이포타슘글리시리제이트	0.03
		판테놀	0.3
		1,2-헥산다이올	2
	보습제	글리세린	1	90
	보습제	다이프로피렌글라이콜	2.67	240
	방부제	메틸파라빈	*	6
	피부보호제	알란토인	*	3
	산화방지제	1,2-헥산디올	*	0.9
	점도증가제	잔탄검	1	6
	점도증가제	암모늄아크릴로일다이메틸타우레이트 /브이피코폴리머	2.5	15
	pH 조절제	트리에틴올아민	*	4.5

(2) 유상액의 제조

하기 표 8의 성분들을 혼합한 후, 78℃ 에서 아지믹서로 저어주면서 혼합 및 용해시킨 다음, 점도증가제를 투입하여 골고루 분산 및 혼합하여 유상액을 제조하였다.

유상액	구분	종류	중량비	중량부
	피부컨디셔닝제	시어버터	20.10	100
		세틸에틸헥사노에이트	20.10
		사이클로펜타실록세인	30.15
		카프릴릭/ 카프릭트라이글리세라이드	20.10
		다이메티콘	5.03
		폴리아이소부텐	4.52
	유화안정제	비즈왁스	1	48.49
		세테아릴알코올	3
		피이지-100스테아레이트	0.8
	유화제	글리세릴스테아레이트	1	28.64
		폴리솔베이트60	0.478
		솔르비탄세스퀴올리에이트	0.179
		폴리솔베이트20	0.045
	점도증가제	폴리아크릴레이트-13	*	9.05

(3) 앞서 제조한 유상액에 수상액을 천천히 첨가한 후, 호모믹서를 이용하여 이들의 혼합물을 74 ~ 75℃ 하에서 2,500rpm의 교반 속도로 2분간 교반한 후, 45℃에서 실시예 1의 담배잎산말 추출물를 첨가하고, 천천히 교반시켜서 항염증 제제를 제조하였다. 제조된 제제는 세럼 타입이었으며, pH는 5.95였다.

그리고, 제조된 제제는 전체 중량 중 수상액 15.5 중량%, 유상액 18.5 중량%, 담배잎산말 추출물 3.0 중량% 및 잔량의 물을 포함하도록 제조하였다.

실험예 9 : 여드름 피부 적합성 임상평가

담배잎산말 추출물로 제조한 제조예 1의 항염증 제제를 크림화한 후, 이에 대한 여드름 피부 적합성 이상평가를 ㈜지에스씨알오에 의뢰하였다(연구기간 : 2018년 2월 19일 ~ 2018년 4월 27일).

평가 대상자는 총 25명(중도탈락자 4명, 최종 21명 시험완료, 평균연령 29.24세, 10대 3명, 20대 8명, 30대 7명, 40대 3명)였으며, 시험 부의는 등 상부(시험제품, 유발물질, 무처치 포함 총 3부위)였다.

제품 적용 방법은 평가 대상자 시험 부위(등 상부, 4x4 cm/site, 4 sites)에 시험제품 및 유발물질을 300ml씩 각각 고르게 도포 및 적용하여 4주간 12회 폐쇄 첩포하였으며, 구체적으로는 48시간(1차, 4차, 7차, 10차 첩포), 48시간(2차, 5차, 8차, 11차), 72시간(3차, 6차, 9차, 12차 첩포) 주기로 각각 첩포 제재(방수밴드)의 제거와 재첩포(폐쇄첩포)를 반복하였다(총 12회 반복 첩포). 이때, 대조물질로 무처치는 방수밴드만 적용하고, 유발물질로는 코코아버터(Cocoa butter)를 사용하였으며, 첩포 부위는 도 10과 같다.

(1) 면포 유발 여부 평가를 위해 각 시험 부위에서 시험제품 적용 전(0주)와 12회 적용 후(4주) 총 2회에 걸쳐 면포채취를 실시하였으며, 채취방법은 시아노아크릴레이트 글루(Cyanoacrylate glue)를 슬라이드 글래스에 1 ~ 2 방울 떨어뜨려 시험 부위에 적용시키고, 시아노아크릴레이트 글루 건조 후, 바로 시험부위에서 제거하여 표면을 얻었다. 얻은 표본을 대상으로 오일 레드 O 스테이닝(oil red O staining) 후 무작위로 1cm²크기로 5부위를 선택하여 현미경 사진을 촬영한 뒤 사진 상으로 보이는 모낭과 면포 개수를 세어 (모낭 수)/(면포 수) 비를 구하였다.

(2) Oil red O staining

보통의 친수성 알코올류 염색시약 보다 지질류에 더 큰 용해도를 갖는 염색시약을 이용하여 지질 혹은 지방만을 선택적으로 염색하는 기법으로 좀 더 분별력 있는 사진 판독을 위해 본 기법을 이용해 지질성분인 면포을 염색하여 평가였다.

(3) 피부 이상 반응 평가

각 방문 시(3차 ~ 14차 방문) 마다 첩포 제거 30분 경과 후에 국제 접촉피부염연구회(ICDRG)의 평가기준에 따라 시험제품에 의한 피부자극유무를 확인하였다. 평가기준을 그림 3과 같으며, 유발 물질 및 각 시험제품의 적용으로 인해 여드림에서 심하면 모낭염까지 발생할 수 있는 부분과 첩포 제제로 인한 이상반응 피부과 전문의가 면밀히 관찰하였다.

[그림 3]

통계분석은 하기 표 9와 같다.

1) 첩포 전 각 시험 부위간 동질성 검정은 Repeated measures ANOVA를 실시하여 확인하였다.
2) 첩포 전과 첩포 4 주 후 시험부위의 모낭 수/면포 수 비의 비교는 정규 분포 검정 후, Paired t-test를 실시하여 확인하였다.
3) 제품의 면포 유발 가능성을 확인하기 위해 시험부위(무처치, 유발물질 적용, 제품 적용) 간의 유의성 여부는 정규성 검정 후, Repeated measures ANOVA를 실시하여 확인하고, 군 간에 유의한 차이(p<0.05)가 있는 경우에는 대비검정(Contrast test)를 실시하여 통계 분석하였다.
- 면포 유발물질 적용 부위의 모낭 수/면포 수 비는 감소하여야 하며, 시험 제품을 적용한 부위의 모낭 수/면포 수 비가 유발 물질 적용 부위보다 유의하게(p<0.05) 높을 경우 하기와 같이 시험제품 적용 부위와 무처지 부위의 통계 값을 확인하였다.
- 시험제품 적용 부위와 무처치 부위의 모낭 수/면포 수 비의 경향이 같고, 유효값이 p>0.05일 경우는 비유발원(Non-comedogenic)이라 판단하였다.
4) 통계 분석 프로그램은 IBM SPSS statistics version 21.0을 이용하였다.

(4) 면포 유발 가능성 평가

첩포 전과 첩포 4주 후에 얻은 면포채취 표본을 이용하여 측정한 모낭 수/면포 수 비를 통계분석한 결과를 하기 표 10 ~ 표 13과 같다.

표 10은 시험 부의의 모낭 수/면포 수 사전 등질성 검정 결과이고, 표 11은 시험 부의의 모낭 수, 면포 수 비 전/후 비교 결과이며, 표 12는 개체-내 효과 검정(무처치 vs. 유발물질 적용 vs. 시험제품 적용) 결과이고 표 13은 모낭 수/면포 수 비의 기술통계량 및 개체 내 대비 검정 결과이다.

무처치	유발물질 적용	시험제품 적용	F	자유도	유의확률⁽¹⁾
15.377 ±6.925	16.572 ±6.684	16.782 ±7.446	1.228	2.19	0.315
(1) : Probability p(Repeated measure ANONA, Wilks의 람다

첩포 전 각 시험 부위 간의 모낭 수/면포 수 비에 대한 차이를 분석하기 위해 등질성 검정을 실시한 결과 첩포 전의 무처치, 유발물질 적용, 시험제품 적용 부위의 모낭 수/면포 수 비는 유의한 차이(p>0.05)가 없는 것으로 나타나 등질하였다(표 10).

구분	첩포 전(0)주	적용 4주 후	유의확률⁽¹⁾
무처치	15.377 ±6.925	13.692 ±7.770	0.087
유발물질 적용	16.572 ±6.684	10.722 ±5.520	<0.001
시험제품	16.782 ±7.446	13.423 ±7.081	<0.001
(1) : Probability p(paired t-test, significant: p<0.001)

유발물질 및 시험제품 첩포 전과 첩포 4주 후의 모낭 수/면포 수 비의 차이를 분석한 결과, 유발물질 및 시험제품 적용 부위는 유의한 차이(p<0.001)가 있는 것으로 나타났으며, 무처치 부위는 통계적으로 유의한 차이가 있었다(표 11).

구분	F	자유도	유의확률⁽¹⁾
부위	0.892	2.19	0.426
시간	36.893	1.20	<0.001
부위*시간	11.369	2.19	<0.001
(1) : Probability p(Repeated measure ANONA, significant: p<0.01, p<0.001)

구분		무처치	유발물질 적용	시험제품 적용
첩포 전(0주)		15.377 ±6.925	16.572 ±6.684	16.782 ±7.446
적용 4주 후		13.692 ±7.770	10.722 ±5.520	13.423 ±7.081
부위 간 비교	무처치 vs. 유발물질	< 0.001
	무처치 vs. 시험제품	0.110
	유발물질 vs. 시험제품	0.008

시험제품의 면포 유발 가능성에 대한 검종을 위해 무처치, 유발물질 적용 부위 및 시험제품 적용 부위 간(3부위) 모낭 수/면포 수 비의 변화량 차이를 분석한 결과, 시험제품 적용 부위의 모낭 수/면포 수 비는 무처치 부위와 비교하여 유의한 차이(p<0.05)를 나타냈으며, 적용 4주 후 시험제품 적용 부위의 모낭 수/면포 수 비는 유발물질 적용 부위 보다 높게 나타났다(표 12 및 표 13 참조). 참고로, 평가 결과에 대한 세부자료를 도 11a ~ 도 11c(면포 채취 평가 결과) 및 도 12a ~ 도 12c(피부 이상 평가 결과)를 나타내었다.

결론적으로, 등 상부의 폐쇄 첩포 기간 동안 시험제품의 피부 자극 평가를 실시한 결과, 시험 기간 도안 피부 이상반응이 관찰되지 않았으며, 면포 유발 가능성이 적어서 여드름성 피부 사용에 적합한 것으로 평가되었다.

상기 실시예 및 실험예를 통하여, 담배잎산말 추출물 및/또는 이의 특정 분획물이 우수한 항염 효과가 있으면서도, 산화적 스트레스 방어 효과가 있는 것을 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 이러한, 본 발명은 담배잎산말 추출물 및/또는 이의 특정 분획물을 포함하는 NO 활성억제제, 항염증 제제를 개발하고, 이를 이용한 이를 이용한 화장품, 연고 등의 피부외용제, 건강보조식품 등의 다양한 응용제품을 제공할 수 있을 것으로 판단된다.

Claims

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수상액 및 유상액을 각각 제조하는 1단계;
상기 유상액에 수상액을 첨가한 다음 교반시켜서 혼합물을 제조하는 2단계;
40 ~ 50℃ 하에서 상기 혼합물, NO 활성 억제제 및 정제수를 혼합 및 2,000 ~ 3,000rpm의 교반속도로 교반시키는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하며,
상기 NO 활성 억제제는 정제수 100 중량부에 대하여 담배잎산말 20 ~ 30 중량부를 혼합하여 원료를 준비하는 단계; 상기 원료를 110℃ 하에서, 4 ~ 6시간 동안 증류추출을 수행하여 추출하여 추출물을 얻는 단계; 상기 추출물을 1차 필터링(filtering)하여 얻은 1차 여과액을 제조하는 단계; 상기 1차 여과액에 1,2-헥산디올을 첨가 및 교반한 후, 2차 필터링하여 담배잎산말 추출물을 제조하는 단계;의 공정을 수행하여 제조한 것이고,
3단계에서 교반된 교반물은 수상액 10 ~ 18.5 중량%, 유상액 15 ~ 25 중량%, NO 활성 억제제 1 ~ 6 중량% 및 잔량의 정제수를 포함하며,
상기 수상액은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 피부보호제 2 ~ 15 중량부, 보습제 250 ~ 400 중량부, 산화방지제 0.1 ~ 3.0 중량부, 점도증가제 10 ~ 35 중량부, 방부제 2 ~ 8 중량부 및 pH 조절제 2 ~ 7 중량부를 포함하고,
상기 수상액은 pH가 5.3 ~ 6.5이며,
상기 유상액은 피부컨디셔닝제 100 중량부에 대하여, 유화제 20 ~ 40 중량부, 유화안정제 35 ~ 75 중량부 및 점도증가제 5 ~ 15 중량부를 포함하며,
상기 NO 활성 억제제는 담배잎산말 추출물을 10 ~ 200 ppm 농도로 포함하며,
상기 NO 활성 억제제는 담배잎산말 추출물의 농도가 10 ~ 200ppm일 때, RAW264.7 세포 생존율이 95 ~ 120%이고,
상기 NO 활성 억제제는 담배잎산말 추출물의 농도가 10 ~ 200ppm일 때, 하기 수학식 1에 의거하여 측정시, RAW264.7 세포에서의 일산화질소(NO) 생성 억제율이 20 ~ 45%인 것을 특징으로 하는 화장품용 항염증 제제의 제조방법.
[수학식 1]
NO 생성 억제율(%) = (A-B)/A * 100%
수학식 1에서 A는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물 농도가 0%일 때 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(100%)이고, B는 NO 활성 억제제 내 담배잎산말 추출물의 특정 농도에서의 RAW264.7 세포에서의 NO 생성량(%) 측정 값이다.