KR102000286B1 - 신규 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 이용한 사포나린, 이소비텍신 및 루테올린 함량이 증진된 새싹보리 발효물의 제조방법 - Google Patents
신규 락토바실러스 퍼멘텀 균주를 이용한 사포나린, 이소비텍신 및 루테올린 함량이 증진된 새싹보리 발효물의 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 (1) 새싹보리에 물을 가하여 분쇄한 새싹보리 분쇄물을 준비하고, 상기 준비한 분쇄물에 비스코자임(Viscozyme)과 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 혼합한 복합 효소를 첨가한 후 가수분해하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 가수분해한 새싹보리 효소 분해물에 바나나 농축액을 첨가한 후 가열하여 효소를 불활성화시켜 새싹보리 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계의 준비한 새싹보리 효소 혼합물에 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 접종한 후 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 사포나린, 이소비텍신 및 루테오린 함량이 증진된 새싹보리 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 사포나린, 이소비텍신 및 루테오린 함량이 증진된 새싹보리 발효물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 새싹보리 분쇄물에 비스코자임과 펙티넥스 울트라 SP-L을 혼합한 복합 효소 처리한 후, 신규 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주로 발효하는 공정에 의한 사포나린, 이소비텍신 및 루테오린 함량이 증진된 새싹보리 발효물의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 사포나린, 이소비텍신 및 루테오린 함량이 증진된 새싹보리 발효물에 관한 것이다.
유산균은 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물 중의 한 종류로서, 비병원성균으로 인간의 장내에 서식하면서 정장 및 정균작용을 할 수 있고 당류를 발효해서 다량의 젖산을 생성하고 낮은 pH 및 혐기적인 조건에서도 잘 생육하며 여러 가지 영양물질을 요구하는 등의 특징을 가지고 있다. 유산균에 의해 채소류가 발효되면 독특한 향과 맛을 내게 되어 관능적 특성이 향상되고, 유기산에 의하여 비타민 C와 여러 생리활성물질이 잘 보존되며, 초기 재료에는 거의 존재하지 않았던 비타민 B12와 비타민 K가 합성되고 부패균과 병원성균의 성장과 증식을 저해하여 위생적인 식품이 되는 등의 장점을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 식물성 유산균은 김치와 장류 등의 발효식품 및 과일과 같은 식물성 식품에서 생식하는 유산균으로 우유나 치즈에 함유된 동물성 유산균과는 구분이 된다. 일본 유산균 식품학회지의 자료에 따르면 식물성 유산균의 종류는 200여 종으로 동물성 유산균 10여 종보다 그 수가 더 많으며 무엇보다 가장 큰 특징은 강인한 생존력을 들 수 있다. 특히 식물성 유산균은 인공 위액(pH 2.5) 내 생존율이 90% 이상이나 영양균형이 맞는 환경에서 생식하는 동물성 유산균은 20~30% 정도에 그치는 것으로 알려져 있다. 채식 위주의 식생활을 해온 동양인은 서양인보다 장(腸)의 길이가 더 길어 동물성 유산균에 비해 식물성 유산균을 통한 유산균 섭취가 효과적인 것으로 알려져 있다. 식물성 유산균에 대한 연구는 유산균에 대한 특성을 탐색하는 등 주로 약학적 효과에 대한 연구와 발명 등이 행해졌다. 또한, 유산균 배양법 및 발효기간에 따른 특성 등의 연구와 발명 등이 있다.
천연물질 내 함유되어 있는 배당체 화합물은 비배당체인 아글리콘(aglycon) 화합물과 당의 결합으로 이루어져 있으며 식물, 동물, 미생물 등 다양한 생물체에 널리 분포되어 존재한다. 배당체는 호르몬, 알칼로이드, 플라보노이드 등의 구조를 이루며 이들 배당체는 다양한 약물과 기능성 물질의 효능을 가지는 것으로 알려져 있다. 배당체는 자연계에서 존재할 때는 수용성으로 부여되어 조직과 세포내에 골고루 분포되어 있으나 인체 내로 섭취된 후에는 상대적으로 장을 통한 혈액내로의 흡수가 상당히 낮은 것으로 알려져 있다. 일반적으로 배당체는 인체의 장내에 있는 미생물에 의하여 비배당체로 전환되어지면 흡수율이 증가하지만 사람마다 장 내의 미생물에 의한 전환율과 전환 결과에 차이가 있다. 배당체를 산과 알칼리의 화학적 처리를 할 경우 에피머화(epimerization), 수화(hydration), 수산화(hydroxylation) 등의 반응을 일으켜 다양한 부반응 산물을 생성하는 단점이 있고 유산균 이외 타 미생물을 사용하는 경우에는 안전성에 대하여 고려하여야 한다. 배당체 화합물은 생물전환 또는 효소적 전환에 의하여 결합하고 있는 당이 가수분해 될 수 있다. 유산균이 생산하는 베타-글루코시다아제(β-glucosidase)는 셀룰로스나 β-당쇄 결합을 지니고 있는 기질로부터 포도당을 유리시키는 효소이다. 이와 같은 점들을 고려하여 볼 때 건강증진 작용을 갖는 프로바이오틱스 균주와 식용 가능한 유산균을 이용하여 천연물 중에 존재하는 배당체의 비배당체의 전환으로 인한 생리활성 증대와 유산균 발효에 의한 관능성을 증가시킬 수 있어 새로운 기능성 식품의 개발에 활용할 수 있다.
새싹보리는 보리 낱알을 침수한 후 싹을 틔워 대략 10~20 cm 전후로 키워낸 어린싹을 말한다. 새싹보리에는 각종 비타민, 미네랄과 효소를 포함한 단백질이 풍부하게 함유되어 있을 뿐 아니라, 활성산소를 분해하는 강력한 항산화 효소인 SOD(superoxide dismutase)가 풍부하고, 비타민 C, 비타민 E, β-카로틴 등도 다량 함유되어, 다양한 기능성 성분들에 의한 혈압강하, 항염증, 항산화, 항알러지, 항궤양, 항암 작용에 대한 효능이 보고되고 있다. 특히 새싹보리에 함유된 다량의 식이섬유는 콜레스테롤 및 중성 지방 등의 흡수를 억제하여 고혈압, 동맥경화, 비만 등 만성질환 예방에 효과적인 것으로 알려져 있다. 또한 새싹보리의 폴리코사놀이란 성분은 몸에 유익한 콜레스테롤(HDL 콜레스테롤)의 수치는 올리고, 해로운 콜레스테롤(LDL 콜레스테롤)의 수치를 낮추는 효과를 나타낸다는 연구 보고도 있다. 국내에서는 새싹보리의 최적 품종 선발과 재배 방법, 생산시기에 따른 새싹보리의 영양성분 비교 연구가 진행되고 있다. 새싹보리를 새로운 기능성 식품소재로 활용하는 연구로서 새싹보리를 이용하여 전임상, 임상시험을 통한 고지혈증, 당뇨병 개선 효과 확인, 새싹보리의 폴리페놀 성분을 크로마토그래피를 통해 물질을 분리하고 이들 순수물질 농축하여 생활습관병 개선 효과 핵심지표 성분과 작용원리 규명 등에 대한 연구도 진행되었다. 또한, 이미 일본, 미국 등에서는 그 영양학적 가치에 주목하여 새싹보리 관련 연구가 활발하여 여러 종류의 건강기능성 식품 소재에 적용 중이며, 그 수요량 또한 증가하고 있다. 일본의 요시히데 하기와라 박사의 연구에 따르면 연구한 150여 개의 녹색식물 중 새싹보리가 영양소가 많은 것으로 보고하였고, 그 외 미국에서도 새싹보리를 노출시켜 암세포 성장을 억제하는 실험을 진행하기도 하였다. Behell 등의 연구에 의하면 새싹보리에 풍부한 수용성 식이섬유소가 고지혈증을 비롯한 심혈관계 질환을 개선시킨다는 연구결과를 도출하였으며, Artiss 등은 새싹보리의 지방억제에 관한 연구와 같이, 새싹보리를 비롯한 새싹채소의 영양소에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 특히, 새싹보리에 함유된 루테오린(luteolin)은 항산화제로 알려진 비타민 C, 제니스테인 등에 비하여 우수한 항산화 활성을 가지며 당뇨치료제인 아카보스(Acarbose)보다 월등히 우수한 항당뇨 활성을 나타낸다고 알려져 있다.
새싹보리와 관련한 발명으로 한국등록특허 제10-1645464호에는 새싹보리 추출물을 포함하는 비만억제용 조성물로서 새싹보리를 극성 및 비극성 유기용매로 화합물을 추출하여 분리한 루토나린과 사포나린이 지방세포 분화를 억제하여 효과적인 비만 치료에 활용될 수 있음에 관한 발명이다. 한국등록특허 제10-1174497호는 새싹보리 유래 폴리페놀계 화합물을 함유하는 추출물 및 이의 제조방법으로서 유기용매로 분획하여 얻어진 용매 분획물 중 페놀릭산, 루테오린, 루토나린 분획물의 항산화 활성을 가지는 새싹보리 분획물과 제조방법에 관한 발명이다. 한국공개특허 제10-2016-0055748호에는 항산화 또는 혈당강하 활성성분 함량이 증가된 새싹보리 차로서, 수확한 새싹보리를 고온에서 덖어서 혈당 및 항산화 활성성분이 증가된 차를 제조하여 물 등의 용매로서 추출한 추출물에 관한 발명이다. 한국등록특허 제10-1483592호는 새싹보리 건조분말을 발효 주정으로 추출한 추출액의 알코올 분해 및 간기능 보호효과 등의 효능을 바탕으로 한 숙취해소 등의 조성물에 관한 발명이다. 또한, 한국공개특허 제10-2017-0101672호는 보리새싹의 혈행개선 효능을 갖는 폴리코사놀을 증가시킨 보리새싹 발효 조성물 및 그의 제조방법에 관한 발명이다. 그러나 이들 발명은 본 발명이 추구하는 구성, 방법 및 대상 성분 및 목적의 분명한 차이가 있다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명자들은 새싹보리 내 유효성분인 사포나린, 이소비텍신 및 루테오린 함량이 증진된 새싹보리 발효물을 제조하기 위해, 균주 및 효소 선정, 효소 및 발효 조건과 부재료 첨가 조건 등의 제조조건을 최적화하여, 새싹보리의 특정 유효성분이 다량 증진된 새싹보리 발효물의 제조방법을 제공하는 데 있다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 (1) 새싹보리에 물을 가하여 분쇄한 새싹보리 분쇄물을 준비하고, 상기 준비한 분쇄물에 비스코자임(Viscozyme)과 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 혼합한 복합 효소를 첨가한 후 가수분해하는 단계; (2) 상기 (1)단계의 가수분해한 새싹보리 효소 분해물에 바나나 농축액을 첨가한 후 가열하여 효소를 불활성화시켜 새싹보리 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및 (3) 상기 (2)단계의 준비한 새싹보리 효소 혼합물에 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 접종한 후 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 사포나린(sponarin), 이소비텍신(isovitexin) 및 루테오린(luteolin) 함량이 증진된 새싹보리 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 사포나린(sponarin), 이소비텍신(isovitexin) 및 루테오린(luteolin) 함량이 증진된 새싹보리 발효물을 제공한다.
본 발명에서는 발효식품으로부터 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주를 분리하고, 상기 균주가 β-글루코시다아제 고활성, 내산성 및 내담즙성을 갖는 균주임을 확인하였다. 또한, 최적의 효소처리된 새싹보리에 상기 균주를 이용하여 발효할 경우 새싹보리 내 특정 유효성분이 다량 증진된 새싹보리 발효물을 제조할 수 있어, 새싹보리를 생산 및 가공하는 업계에 산업상 매우 유익한 발명으로 평가된다.
도 1은 본 발명의 새싹보리 발효물의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 2는 각종 발효식품으로부터 분리된 젖산균을 브로모크레졸퍼플(BCP)이 첨가된 시판용 MRS 한천배지에 100 ㎕씩 분주한 후 도말하여 배양한 사진이다.
도 3은 분리한 유산균 4종을 에스큘린(esculin), 알부틴(arbutin) 및 p-NPG 고체배지에 배양한 사진이다.
도 4는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주의 뉴클레오타이드 염기서열을 보여준다.
도 5는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주의 16S rRNA의 계통수 분석한 결과를 보여준다.
도 6은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주의 내담즙성(A)과 내산성(B) 시험한 결과를 보여준다.
도 7은 새싹보리 분쇄물을 다양한 시판 효소처리한 후 환원당 및 사포나린 함량을 비교한 그래프이다.
Con: 무처리, A: 알칼라아제(Alcalase) 처리, F: 플라보르자임(Flavourzyme) 처리, N: 뉴트라제(Neutrase) 처리, P: 프로타멕스(Protamex) 처리, AMG: AMG 300L 처리, C: 셀루클라스트(Celluclast) 처리, UM: 울트라플로 멕스(Ultraflo Max) 처리, PU: 펙티넥스 울트라(Pectinex Ultra) 처리, V: 비스코자임(Viscozyme) 처리
도 8은 효소 처리 농도, 반응온도 및 반응시간에 따른 새싹보리 효소 분해물의 환원당 함량에 대한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 9는 효소 처리 농도, 반응온도 및 반응시간에 따른 새싹보리 효소 분해물의 사포나린 함량에 대한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 10은 효소 처리 농도, 반응온도 및 반응시간에 따른 새싹보리 효소 분해물의 환원당 및 사포나린 함량에 대한 최적 효소 처리조건에 대한 수퍼임포징(superimposing)한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 11은 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 균 성장도에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 12는 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 pH에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 13은 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 산도에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 14는 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 사포나린 함량에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 15는 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 이소비텍신 함량에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 16은 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 총 페놀성 화합물 함량에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 17은 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 균 성장도, 사포나린, 이소비텍신 함량의 최적화를 위한 수퍼임포징된(superimposed) 등고도 결과이다.
도 18은 새싹보리 처리조건에 따른 유효성분(사포나린, 호모오리엔틴, 비텍신, 이소비텍신, 루테오린) 크로마토그램 결과이다.
(A): 표준물질 크로마토 그램, (B): 새싹보리 원료, (C): 새싹보리 효소분해물, (D): 효소분해 않은 새싹보리 발효물, (E): 효소분해한 후 최적조건으로 발효한 발효물
도 2는 각종 발효식품으로부터 분리된 젖산균을 브로모크레졸퍼플(BCP)이 첨가된 시판용 MRS 한천배지에 100 ㎕씩 분주한 후 도말하여 배양한 사진이다.
도 3은 분리한 유산균 4종을 에스큘린(esculin), 알부틴(arbutin) 및 p-NPG 고체배지에 배양한 사진이다.
도 4는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주의 뉴클레오타이드 염기서열을 보여준다.
도 5는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주의 16S rRNA의 계통수 분석한 결과를 보여준다.
도 6은 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주의 내담즙성(A)과 내산성(B) 시험한 결과를 보여준다.
도 7은 새싹보리 분쇄물을 다양한 시판 효소처리한 후 환원당 및 사포나린 함량을 비교한 그래프이다.
Con: 무처리, A: 알칼라아제(Alcalase) 처리, F: 플라보르자임(Flavourzyme) 처리, N: 뉴트라제(Neutrase) 처리, P: 프로타멕스(Protamex) 처리, AMG: AMG 300L 처리, C: 셀루클라스트(Celluclast) 처리, UM: 울트라플로 멕스(Ultraflo Max) 처리, PU: 펙티넥스 울트라(Pectinex Ultra) 처리, V: 비스코자임(Viscozyme) 처리
도 8은 효소 처리 농도, 반응온도 및 반응시간에 따른 새싹보리 효소 분해물의 환원당 함량에 대한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 9는 효소 처리 농도, 반응온도 및 반응시간에 따른 새싹보리 효소 분해물의 사포나린 함량에 대한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 10은 효소 처리 농도, 반응온도 및 반응시간에 따른 새싹보리 효소 분해물의 환원당 및 사포나린 함량에 대한 최적 효소 처리조건에 대한 수퍼임포징(superimposing)한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 11은 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 균 성장도에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 12는 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 pH에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 13은 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 산도에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 14는 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 사포나린 함량에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 15는 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 이소비텍신 함량에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 16은 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 총 페놀성 화합물 함량에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 17은 발효시간과 부원료 농도에 따른 새싹보리 발효물의 균 성장도, 사포나린, 이소비텍신 함량의 최적화를 위한 수퍼임포징된(superimposed) 등고도 결과이다.
도 18은 새싹보리 처리조건에 따른 유효성분(사포나린, 호모오리엔틴, 비텍신, 이소비텍신, 루테오린) 크로마토그램 결과이다.
(A): 표준물질 크로마토 그램, (B): 새싹보리 원료, (C): 새싹보리 효소분해물, (D): 효소분해 않은 새싹보리 발효물, (E): 효소분해한 후 최적조건으로 발효한 발효물
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
(1) 새싹보리에 물을 가하여 분쇄한 새싹보리 분쇄물을 준비하고, 상기 준비한 분쇄물에 비스코자임(Viscozyme)과 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 혼합한 복합 효소를 첨가한 후 가수분해하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 가수분해한 새싹보리 효소 분해물에 바나나 농축액을 첨가한 후 가열하여 효소를 불활성화시켜 새싹보리 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 준비한 새싹보리 효소 혼합물에 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 접종한 후 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 사포나린(sponarin), 이소비텍신(isovitexin) 및 루테오린(luteolin) 함량이 증진된 새싹보리 발효물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 새싹보리 발효물의 제조방법에서, 상기 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주로, 한국생명공학연구원에 2017년 12월 11일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 13419BP). 상기 기탁된 특정 균주는 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 활성이 높고, 내산성 및 내담즙성을 지니는 균주이며, 상기 균주를 이용하여 새싹보리 발효물을 제조할 경우, 특정 기능성 성분이 증진된 새싹보리 발효물로 제조할 수 있었다.
또한, 본 발명의 새싹보리 발효물의 제조방법에서, 상기 (1)단계의 비스코자임(Viscozyme)은 Novozyme사의 복합효소제로서 아라바나아제(arabanase), 셀룰라아제(cellulase), β-글루카나아제(β-glucanase), 헤미셀룰라아제(hemicellulase) 및 자일라나아제(xylanase)를 함유하는 효소를 의미한다. 또한, 상기 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)는 아스퍼질러스 아쿨레아투스(Aspergillus aculeatus) 유래 효소로, 폴리갈락투로나아제(polygalacturonase) 및 엔도-β-1,4-갈락타나아제(endo-β-1,4-galactanase)의 특성을 갖는 효소를 의미한다.
또한, 본 발명의 새싹보리 발효물의 제조방법에서, 상기 (1)단계는 바람직하게는 새싹보리에 물을 0.8~1.2:8~10(w:v) 비율로 가하여 분쇄한 새싹보리 분쇄물을 준비하고, 상기 준비한 분쇄물에 100~120 FBG/ml 농도의 비스코자임(Viscozyme)과 18,000~30,000 PG/ml 농도의 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 0.8~1.2:0.8~1.2 부피비율로 혼합한 복합 효소를 8~12%(v/v) 첨가한 후 45~55℃에서 5~7시간 동안 가수분해할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 새싹보리에 물을 1:9(w:v) 비율로 가하여 분쇄한 새싹보리 분쇄물을 준비하고, 상기 준비한 분쇄물에 110 FBG/ml 농도의 비스코자임(Viscozyme)과 24,000 PG/ml 농도의 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 1:1 부피비율로 혼합한 복합 효소를 10%(v/v) 첨가한 후 50℃에서 6시간 동안 가수분해할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 효소 처리하는 것이 새싹보리의 환원당 및 사포나린을 보다 효과적으로 분리하여 효소 분해물 내 환원당 및 사포나린 함량을 더욱 증진시킬 수 있었다.
또한, 본 발명의 새싹보리 발효물의 제조방법에서, 상기 (2)단계는 바람직하게는 새싹보리 효소 분해물에 55~70 Brix의 바나나 농축액을 11~18%(v/v) 첨가한 후 80~90℃에서 10~20분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 새싹보리 효소 혼합물을 준비할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 새싹보리 효소 분해물에 65 Brix의 바나나 농축액을 15%(v/v) 첨가한 후 85℃에서 15분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 새싹보리 효소 혼합물을 준비할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 전처리하는 것이 효소를 불활성화시키고, 이후 공정인 발효에 적합하면서 품질이 우수한 발효물로 제조할 수 있는 새싹보리 효소 혼합물로 준비할 수 있었다.
또한, 상기 바나나 농축액은 바나나 과즙, 바나나 추출액, 바나나 건조물 및 바나나 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 바나나 원료 외에 갈락토올리고당(galacto-oligosaccharide), 말토올리고당(malto-oligosaccharide), 프락토올리고당(fructo-oligosaccharide) 및 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고당을 첨가하여 바나나 농축액을 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명의 새싹보리 발효물의 제조방법에서, 상기 (3)단계의 발효는 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 1~10%(v/v) 접종한 후 30~45℃에서 44~52시간 동안 발효할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 2%(v/v) 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 발효할 수 있다. 상기와 같은 조건으로 발효하는 것이 균 성장도가 높아 좋은 발효 특성을 지니면서 사포나린, 이소비텍신 및 총 페놀성 화합물 함량을 더욱 증진시킬 수 있었다.
본 발명의 새싹보리 발효물의 제조방법은, 보다 구체적으로는
(1) 새싹보리에 물을 0.8~1.2:8~10(w:v) 비율로 가하여 분쇄한 새싹보리 분쇄물을 준비하고, 상기 준비한 분쇄물에 100~120 FBG/ml 농도의 비스코자임(Viscozyme)과 18,000~30,000 PG/ml 농도의 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 0.8~1.2:0.8~1.2 부피비율로 혼합한 복합 효소를 8~12%(v/v) 첨가한 후 45~55℃에서 5~7시간 동안 가수분해하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 가수분해한 새싹보리 효소 분해물에 55~70 Brix의 바나나 농축액을 11~18%(v/v) 첨가한 후 80~90℃에서 10~20분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 새싹보리 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 준비한 새싹보리 효소 혼합물에 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주(기탁번호: KCTC 13419BP)를 1~10%(v/v) 접종한 후 30~45℃에서 44~52시간 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있으며,
더욱 구체적으로는
(1) 새싹보리에 물을 1:9(w:v) 비율로 가하여 분쇄한 새싹보리 분쇄물을 준비하고, 상기 준비한 분쇄물에 110 FBG/ml 농도의 비스코자임(Viscozyme)과 24,000 PG/ml 농도의 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 1:1 부피비율로 혼합한 복합 효소를 10%(v/v) 첨가한 후 50℃에서 6시간 동안 가수분해하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 가수분해한 새싹보리 효소 분해물에 65 Brix의 바나나 농축액을 15%(v/v) 첨가한 후 85℃에서 15분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 새싹보리 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 준비한 새싹보리 효소 혼합물에 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주(기탁번호: KCTC 13419BP)를 2%(v/v) 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 사포나린(sponarin), 이소비텍신(isovitexin) 및 루테오린(luteolin) 함량이 증진된 새싹보리 발효물을 제공한다. 본 발명의 상기 새싹보리 발효물의 맛과 향을 더욱 향상시키기 위해, 사과, 감, 블루베리, 블랙베리, 블랙커런트, 아사이베리, 복분자, 석류, 포도, 배, 복숭아, 바나나, 딸기, 토마토, 당근, 자두, 매실, 앵두, 다래, 오디, 머루, 키위, 참외, 귤, 오렌지, 자몽, 귤, 멜론, 체리, 멜론, 블랙수퍼베리, 망고, 레몬 및 파인애플로부터 선택되는 하나 이상의 과일 성분을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예
1. 새싹보리
발효물
제조
(1) 새싹보리 10 g에 증류수 90 mL를 가하여 분쇄한 새싹보리 분쇄물을 준비하고, 110 FBG(Fungal Beta-Glucanase Units)/ml 농도의 비스코자임(Viscozyme L.)과 24,000 PG(Polygalacturonase Units)/ml 농도의 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 1:1 비율로 혼합한 복합 효소를 상기 준비한 새싹보리 분쇄물에 분쇄물의 부피대비 10% 첨가한 후, 50℃에서 6시간 동안 가수분해하였다.
(2) 상기 (1)단계의 가수분해한 새싹보리 효소 분해물에 65 Brix의 바나나 농축액을 15%(v/v) 첨가한 후 85℃에서 15분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 새싹보리 효소 혼합물을 준비하였다.
(3) 상기 (2)단계의 준비한 새싹보리 효소 혼합물에 107 CFU/mL의 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31(KCTC 13419BP)을 2% 접종한 후 37℃에서 48시간 동안 발효하여 새싹보리 발효물을 제조하였다(도 1).
실험예
1. 유산균 선정
(1) 유산균의 분리
유산균 분리에 사용한 발효식품 시료는 가정집 및 음식점에서 담근 김치 수십종 및 침채류 등을 수집하여 유산균 분리 시료액으로 사용하였으며, 각 시료액을 멸균증류수로 10-1~10-5의 농도로 희석한 후 0.004% 브로모크레졸퍼플(BCP)이 첨가된 시판용 MRS 한천배지에 100 ㎕씩 분주한 후 도말하고, 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 독립된 콜로니 중 유산균의 특징적인 콜로니를 순수 분리하였다. 순수 분리한 유산균은 MRS 한천 사면배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 4℃ 냉장보관하면서 사용하였다.
(2) 베타-글루코시다아제(β-Glucosidase) 활성 균주 선발
베타-글루코시다아제 활성을 갖는 균주의 선발을 위해 에스쿨린 한천(esculin 0.1%, peptones 1.8%, ferric citrate 0.1%, agar 2%)법을 이용하여 에스쿨린(esculin)이 함유된 에스쿨린 한천배지에 균주를 접종하여 배지 내에서의 색깔 변화를 관찰하였다. 에스쿨린은 베타-글루코시다아제에 의하여 글루코스(glucose) 와 에스쿨린으로 분리되며 에스쿨린은 페릭 암모니움 시트레이트(ferric ammonium citrate)와 반응하여 콜로니 주위에 검은색 반점(black complex)을 형성하게 된다(화학식 1). 따라서 에스쿨린 한천배지에서 배양된 콜로니 주위에 검은색 반점을 형성하는 균주를 베타-글루코시다아제 활성을 가지는 균주로 판단하여 선별하였다.
(3) 베타-글루코시다아제(β-Glucosidase) 활성능 측정
베타-글루코시다아제 활성 측정은 1% 카르복시메칠셀루로오스(carboxymethyl cellulose, CMC)가 첨가된 시판용 MRS 배지에 12시간 전배양한 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후, 배양액을 4℃에서 6,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 상층액 0.5 ml를 취하여 1 ml의 5 mM 파라-니트로페닐-베타-디-글루코피라노사이드(ρ-nitrophenyl-β-D-glucopynanoside, ρ-NPG) 용액과 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액은 1 ml의 1M 탄산나트륨(Na2CO3) 용액을 첨가하여 반응을 중지시키고, 생성된 파라-니트로페놀(ρ-nitrophenol, ρ-NP)를 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 파라-니트로페놀의 검량곡선을 이용하여 농도를 환산하였다.
(4) 내담즙성 및 내산성 시험
내담즙성은 MRS 액체배지에 0.3% 담즙 추출물(Oxgall bile extract)을 첨가하고, 분리된 균주들을 2%씩 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였으며, 배양종료 후 브로모크레졸퍼플(BCP) 한천배지에서 생균수를 측정하였다. 내산성 시험은 1N 염산(HCl)을 증류수에 희석하여 MRS 산성액체배지(pH 2.5)를 준비하고 MRS 액체배지에서 37℃ 및 24시간 배양된 균주를 107 CFU/mL 수준으로 접종하여 37℃에서 3시간 동안 배양하고, BCP 한천배지에서 생균수를 측정하였다.
(5) 최종선별균주의 염기서열분석과 계통분류
최종 선별된 균주의 16S rRNA 유전자는 시퀀싱(sequencing)을 통하여 분석하였으며, NCBI 데이터베이스(database)를 이용하여 분리된 균주와 데이터베이스상의 표준균주(type strain)와의 유사성(similarity, %)을 확인하였다.
실험예
2. 새싹보리
분쇄물의
효소 처리 조건 선정
1) 새싹보리 분쇄물의 효소 처리
(1) 새싹보리 원료
본 발명에서 사용된 새싹보리 원료는 2017년에 7월에 수확된 것 중 길이가 15 cm 전후의 것을 구입한 후, 분쇄하여 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다.
(2) 가수분해 효소
본 발명 실험에 사용한 분해효소로는 식품 용도로 상업적으로 판매되어 사용되고 있는 Novo Nordisk사(Denmark)의 당 분해효소인 셀루클라스트 1.5L(Celluclast 1.5L), 비스코자임 L(Viscozyme L), 펙티넥스 울트라 SL-L(Pectinex Ultra SL-L) 및 펙티넥스 XXL(Pectinex XXL), 단백질 분해효소로서 알카라아제 2.4 L(Alcalase 2.4 L), 플라보르자임 500 MG(Flavourzyme 500 MG), 뉴트라아제 0.8 L(Neutrase 0.8 L) 및 프로타멕스(Protamex) 등을 구매하여 사용하였다.
(3) 새싹보리 최적 효소 선정
새싹보리의 분해에 적합한 효소 선정을 위한 처리는 새싹보리 시료 10 g에 90 mL의 증류수를 가하여 충분히 혼합한 후 각각의 상업용 효소를 2% 첨가하여 50℃에서 24시간 동안 처리하였다. 처리가 끝난 즉시 효소처리군은 85℃에서 15분간 열처리하여 효소를 불활성화하고 원심분리한 후 상등액을 취하여 환원당 함량과 사포나린(saponarin) 함량을 측정하였다.
(4) 환원당 함량 측정
각 효소별로 처리된 새싹보리 효소 분해물의 환원당 함량은 디니트로살리실릭산(dinitrosalicylic acid, DNS)법에 따라 측정하였다. 즉, 시료용액 0.5 mL에 DNS액 0.5 mL를 혼합한 뒤 100℃에서 5분간 반응시킨 후 냉각하고 증류수 4 mL를 첨가하여 분광광도계를 이용하여 550 nm에서 흡광도를 측정하였다.
(5) 사포나린 함량 분석
각 효소별로 처리된 새싹보리 효소 분해물의 사포나린 함량은 효소처리 시료 용액을 0.45 ㎛ 막여과지(membrane filter)로 여과한 후, HPLC 시스템(Alliance e2695, Waters Co., USA)으로 분석하였고, 분석조건은 표 1에 나타내었다. 표준품은 사포나린(Sigma Chemical Co.)을 이용하여 표준 검량선을 작성한 후 각각의 함량을 계산하였다.
| 장치 | 조건 |
| 컬럼 | Xbridge C18(Waters Co., USA)(길이 150 × 4.6 mm 직경, 입자크기 5 ㎛) |
| 이동상 | 5% acetic acid : methanol = 80 : 20 (v/v) |
| 흐름 속도 | 1.0 mL/min |
| 주입량 | 10 ㎕ |
| 컬럼 오븐온도 | 35℃ |
| 검출기 | PDA 270 nm |
2) 효소분해 조건 최적화를 위한 실험계획
선정된 효소에 의한 새싹보리의 효소처리 조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법(repose surface methodology, RSM)을 이용하였다. 효소처리 조건은 중심합성계획법(Central Composite Design, CCD)을 이용하여 독립변수로서 효소/기질 농도(5~15%), 반응온도(40~60℃) 및 반응시간(2~10시간)의 범위를 설정하였다. 종속변수는 효소분해 후 생성된 환원당 함량(YRSC, mg/100 g)과 사포나린 함량(YSC, mg/100 g)으로 지정하여 실험을 설계하였으며 표 2와 3에 나타내었다. 또한, 효소분해 조건이 새싹보리 효소분해물의 환원당과 사포나린 함량에 미치는 영향을 예측된 모델식을 바탕으로 매스매티카 프로그램(Mathematica program)을 이용하여 4차원 반응표면분석으로 해석하였다.
| 매개변수 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 |
| X1 효소농도(E/S, %) | 5 | 7.5 | 10 | 12.5 | 15 |
| X2 반응온도(℃) | 40 | 45 | 50 | 55 | 60 |
| X3 반응시간(hour) | 2 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| 실험번호1 ) | 효소가수분해 조건 | ||
| 효소/기질농도(E/S, %) | 온도(℃) | 시간(hour) | |
| 1 | 12.5 | 55 | 8 |
| 2 | 12.5 | 55 | 4 |
| 3 | 12.5 | 45 | 8 |
| 4 | 12.5 | 45 | 4 |
| 5 | 7.5 | 55 | 8 |
| 6 | 7.5 | 55 | 4 |
| 7 | 7.5 | 45 | 8 |
| 8 | 7.5 | 45 | 4 |
| 9 | 10 | 50 | 6 |
| 10 | 10 | 50 | 6 |
| 11 | 10 | 50 | 6 |
| 12 | 10 | 50 | 6 |
| 13 | 10 | 50 | 6 |
| 14 | 10 | 50 | 6 |
| 15 | 15 | 50 | 6 |
| 16 | 5 | 50 | 6 |
| 17 | 10 | 60 | 6 |
| 18 | 10 | 40 | 6 |
| 19 | 10 | 50 | 10 |
| 20 | 10 | 50 | 2 |
1) 중심합성계획에 의한 실험조건 번호
3) 최적 효소처리 조건 예측
선정된 효소의 처리 조건별 새싹보리 효소분해물의 최적 조건 예측은 환원당 함량과 사포나린 함량에 대한 반응표면을 수퍼임포징(superimposing) 했을 때 겹쳐지는 부분의 범위에서 최적 효소처리 조건을 설정하였고, 예측된 범위에서 임의의 중심점을 최적 조건으로 예측한 뒤 각 회귀식에 대입하여 예측 값을 설정하였다. 또한 예측된 값들에 대하여 동일조건에서 실제 실험을 통하여 얻은 실험치를 비교하였다.
실험예
3. 새싹보리 유산발효조건 최적화
1) 새싹보리 유산발효조건
최적 효소처리조건에서 처리된 새싹보리 효소 가수분해물을 선정된 신규한 유산균주로 발효하여 목적으로 하는 새싹보리의 유산발효조건을 최적화하기 위하여 중심합성계획법(central composite design)에 따라 표 4와 같은 발효시간(X1)과 부원료 첨가 농도(X2)를 독립변수로 설정하고, 반응표면분석(response surface methodology, RSM)에 의하여 설정한 13가지 발효조건으로 새싹보리를 발효하였다(표 5). 각 종속변수에 대한 회귀 방정식을 얻어 발효조건에서 독립변수의 상호영향 및 최적 발효조건을 구하였다. 발효조건의 회귀식에 의한 예측은 SAS(Statistical Analysis System) 프로그램을 사용하였다. 중섬합성계획에서 독립변수(Xn)은 발효시간(12~60시간, X1) 및 부원료 첨가 농도(0~20%, X2)이며 실험계획은 2, -1, 0, 1, 2 다섯 단계로 부호화하여 실험값을 나타내었다. 최적 발효조건과 관련된 종속변수(Yn)으로는 생육도, pH, 산도, 유기산 함량 및 유효성분 함량으로 각각 나타내었다.
| 매개변수 | -2 | -1 | 0 | 1 | 2 |
| X1 발효시간(hour) | 12 | 24 | 36 | 48 | 60 |
| X2 부원료 농도(%) | 0 | 5 | 10 | 15 | 20 |
| 실험번호1 ) | 발효조건 | |
| 발효시간(hour) | 부원료 농도(%) | |
| 1 | 48 | 15 |
| 2 | 48 | 5 |
| 3 | 24 | 15 |
| 4 | 24 | 5 |
| 5 | 36 | 10 |
| 6 | 36 | 10 |
| 7 | 36 | 10 |
| 8 | 36 | 10 |
| 9 | 36 | 10 |
| 10 | 60 | 10 |
| 11 | 12 | 10 |
| 12 | 36 | 20 |
| 13 | 36 | 0 |
1) 중심합성계획에 의한 실험조건 번호
(1) 발효
새싹보리 효소 가수분해물을 기본 배지로 하여 실험계획에 따라 부원료인 바나나 농축액(65 brix) 첨가량을 달리하여, MRS 액체배지에서 12시간 전배양된 신규한 유산균인 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주를 종균으로 하여 2%(v/v) 접종 후 발효시간을 달리하여 발효하였다.
(2) 발효물의 생육도, pH 및 산도 측정
발효물의 유산균 생육도는 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys co., Ltd., Korea)로 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. pH는 pH 미터(Metter Toledo Group, Switzerland)를 사용하여, 적정 산도는 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.3으로 중화 적정하여 소비된 0.1N NaOH 용액을 젖산 함량(%)으로 환산하였다.
(3) 발효물의 유효성분 함량 측정
유효성분 함량은 새싹보리 원료 분쇄물, 효소처리물 및 발효물 시료 용액을 0.45 ㎛ 막여과지로 여과한 후, HPLC 시스템(Alliance e2695, Waters Co., USA)으로 분석하였고, 분석조건은 표 6에 나타내었다. 표준품은 사포나린(saponarin), 비텍신(vitexin), 이소비텍신(isovitexin) 및 루테올린(luteolin) 등(이상 ChromaDex Co.)을 이용하여 표준 검량선을 작성한 후 각각의 함량을 계산하였다.
| 장치 | 조건 | ||
| 컬럼 | Jupiter 4 proteo 90A (Phenomenex Co.) (길이 250 × 4.6 mm 직경, 입자크기 4 ㎛) |
||
| 이동상 A | 5% 아세트산 | ||
| 이동상 B | 아세토나이트릴:메탄올=1:1(v:v) | ||
| 흐름속도 | 1.0 mL/분 | ||
| 구배(%) | 시간(min) | 용매비 | |
| A | B | ||
| 0 | 95 | 5 | |
| 7 | 85 | 15 | |
| 25 | 80 | 20 | |
| 35 | 75 | 25 | |
| 45 | 65 | 35 | |
| 55 | 55 | 45 | |
| 60 | 95 | 5 | |
| 주입량 | 20 ㎕ | ||
| 컬럼 오븐 온도 | 35℃ | ||
| 검출기 | PDA 338 ㎚ | ||
실시예
1.
신규한
유산균의 분리 동정
1) 발효식품으로부터 유산균 분리
각종 발효식품 시료를 생리멸균식염수를 이용하여 10-1~10-4의 농도로 희석하고 MRS 고체배지에 도말하여 37℃에서 배양한 후, 균주의 크기, 색, 모양, 투명도 등을 관찰하여, 4종의 유산균을 최종분리하였다. 일부 발효식품에서는 숙성에 따라 유산균이 거의 검출되지 않는 시료도 있었으며, 발효식품의 종류와 숙성도에 따른 콜로니(colony)의 분포는 달랐으며 희석배수가 10-3~10- 5일 때 균주의 분리가 가장 용이하였다. 발효식품으로부터 최종분리한 균주는 DU.LA.EIJ-31, DU.LA.IH-02~DU.LA.IH-04로 명명하였으며 분리한 균주는 계대배양을 실시하여 단독 콜로니를 순수분리 하였다. 최종 분리된 유산균은 MRS 배지상 BCP를 환원하여 전형적인 노란색으로 변화시켰고 전형적인 유산균종의 형태를 보였다(도 2).
2) 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 활성 균주 선발
발효식품에서 최종 분리한 4종의 유산균들을 에스큘린 고체배지(esculin agar)를 이용하여 배양을 실시한 후, 콜로니(colony) 주변에 검은 반점(black complex)를 형성한 균주를 베타-글루코시데이즈 활성 균주로 간주하였다. 분리한 균주 4주 중, 3주에서 콜로니 주변에 검은 환(black circle)을 형성하여 베타-글루코시데이즈 활성이 있는 것으로 나타났다. 또한, 에스큘린 뿐만 아니라 알부틴(arbutin)과 p-NPG 고체배지에서도 유사한 반응을 보였다(도 3).
3) 분리 균주의 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성능 측정
에스큘린 고체배지 등을 이용하여 분리균주의 콜로니(colony) 주변에 환 형성 여부에 따라 베타-글루코시다아제 활성을 확인한 균주의 효소활성능을 측정하였다. 그 결과, DU.LA.EIJ-31이 가장 높은 활성을 보였으며, DU.LA.IH-04는 베타-글루코시다아제 활성이 거의 없는 것으로 나타났다(표 7). 따라서 새싹보리 발효를 위하여 최종 선발된 1종의 균주는 베타-글루코시다아제 활성이 가장 높은 DU.LA.EIJ-31로 선정하였다.
| 분리 균주 | 활성능(U/mL) |
| DU.LA.EIJ-31 | 13.35±1.33 |
| DU.LA.IH-02 | 10.21±0.80 |
| DU.LA.IH-03 | 9.97±1.19 |
| DU.LA.IH-04 | 0.94±0.23 |
4) 최종 선발균주(DU,La.EIJ-31)의 동정
최종 분리된 균주 중 베타-글루코시데이즈 활성능이 가장 높은 균주인 DU.LA.EIJ-31을 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 NCBI blast DB와 비교한 결과(표 8), 락토바실러스(Lactobacillus) 속에 속하는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum)과 99% 상동성을 보였다. NCBI Blast 검색을 통해 락토바실러스(Lactobacillus) 속 내에 DU.LA.EIJ-31 균주와 유연관계가 가까운 종들을 찾고 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 뉴클레오타이드 염기서열(도 4) 검색을 통하여 동일 균주들의 염기서열을 조사하였다. Bioedit program과 Clustal X program을 이용하여 염기서열을 배열(alignment)한 후 근연관계를 조사해 본 결과는 도 5와 같으며, 락토바실러스 퍼멘텀 균주 NBRC 15885와 락토바실러스 퍼멘텀 균주 CIP 102980가 99% 상동성을 보였다. 따라서 DU.LA.EIJ-31 균주를 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31로 명명하였으며 국제미생물 특허기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) 2017년 12월 11일자로 기탁하였으며 기탁번호 KCTC 13419BP를 부여받았다.
| 표준균주 | 동일성(Identities) | 상동성(Similarity) |
| Lactobacillus fermentum strain NBRC 15885 | 1/1438 | 99% |
| Lactobacillus fermentum strain CIP 102980 | 1/1438 | 99% |
| Lactobacillus gorillae strain KZ01 | 27/1438 | 98% |
| Lactobacillus gastricus strain Kx156A7 | 61/1440 | 96% |
| Lactobacillus equigenerosi strain NRIC 0697 | 62/1442 | 96% |
5) 분리균주의 내담즙성 및 내산성
최종 분리된 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주의 내담즙성 측정은 담즙산 추출물(bile extract) 0.3%와 담즙산 무첨가구(control)에서 성장상태를 비교하였고 내산성의 측정은 배양 배지를 pH 2.5의 조건으로 조절한 것과 pH 5.7(control)에서의 37℃에서 24시간 동안 성장 실험한 결과는 도 6과 같다. 담즙산 추출물 첨가구에서는 무첨가구와 비교할 때 생장율이 다소 억제되기는 하였으나, 내성이 강한 성장상태를 보였다. 또한, 위산과 유사한 pH에서 생존 여부를 관찰한 분리균의 내산성의 결과, pH 2.5에서도 90% 이상의 생존력을 보였다.
실시예
2. 새싹보리
분쇄물의
효소 분해 조건 설정
1) 효소 종류의 영향
새싹보리 분쇄물의 효소적 가수분해를 위한 시판효소의 선정을 위해 5종의 셀룰라아제(cellulase)와 4종의 프로테아제(protease)에 대한 영향을 조사한 결과는 표 9와 도 7과 같다. 각 시판효소를 처리하여 얻은 새싹보리 가수분해물의 환원당 함량은 비스코자임 L(Viscozyme L)의 처리구에서 6.82%으로 가장 높은 함량을 나타내었으며, 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L)의 처리구가 가장 낮은 1.77%를 나타내어 효소 간에 유의적인 차이를 보였다. 반면, 사포나린(saponarin) 함량은 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L)의 처리구에서 다른 효소처리구에 비해 유의적인 차이를 보이며 높은 함량(35.08 mg/100 mL)을 나타내었다. 이상의 결과를 유추하였을 때 비스코자임 L(Viscozyme L)은 효소에 의하여 배당체의 당의 부분적 가수분해에 의하여 당 함량이 높은 것으로 유추되며, 이와 반대로 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L)의 처리구는 결합당 가수분해보다 플라본(flavon) 화합물과 결합된 주변부의 고분자들을 가수분해하여 새싹보리의 유효성분 중 하나인 사포나린(saponarin) 함량이 증가하는 것을 유추할 수 있다. 따라서 새싹보리 분쇄물의 효소적 가수분해를 위하여 비스코자임 L(Viscozyme L)과 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L) 혼합효소를 사용하여 최적조건 설정을 위한 실험에 사용하였다.
| 효소종류 | 환원당 함량(%) | 사포나린 함량(mg/100 mL) |
| Control(무첨가) | 0.72 | 24.18 |
| Alcalase 2.4 L | 6.38 | 28.50 |
| Flavourzyme 500 MG | 4.42 | 31.68 |
| Neutrase 0.8 L | 2.78 | 27.73 |
| Protamex | 2.19 | 31.76 |
| AMG 300L | 6.26 | 28.41 |
| Celluclast 1.5L | 3.55 | 29.25 |
| Ultraflo Max | 1.94 | 30.47 |
| Pectinex Ultra SP-L | 1.77 | 35.08 |
| Viscozyme L | 6.82 | 29.36 |
2) 반응표면분석법을 이용한 새싹보리의 복합효소분해의 최적화 조건 설정
새싹보리 분쇄물의 효소적 가수분해를 위하여 비스코자임 L(Viscozyme L)과 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex Ultra SP-L)을 1:1로 혼합하여 복합효소를 사용하여 최적 효소처리 조건을 설정하기 위해 효소/기질 농도, 반응온도 및 반응시간을 독립변수로 하여 중심합성계획에 의해 설계된 20구의 효소처리조건에서 얻어진 환원당 함량과 사포나린 함량은 표 10과 같다. 각각의 결과를 이용하여 반응표면분석을 실시하고, 각 종속변수 즉, 환원당 함량과 사포나린 함량에 대한 회귀식을 얻었다(표 11).
| 실험번호1 ) | 가수분해 조건 | 환원당 함량(%) | 사포나린 함량(㎎/100 g) | ||
| 효소/기질농도 (E/S, %) |
반응온도(℃) | 반응시간 (hour) |
|||
| 1 | 12.5 | 55 | 8 | 6.84 | 45.03 |
| 2 | 12.5 | 55 | 4 | 5.77 | 31.66 |
| 3 | 12.5 | 45 | 8 | 7.79 | 49.26 |
| 4 | 12.5 | 45 | 4 | 5.24 | 32.57 |
| 5 | 7.5 | 55 | 8 | 5.91 | 36.97 |
| 6 | 7.5 | 55 | 4 | 5.28 | 30.69 |
| 7 | 7.5 | 45 | 8 | 7.24 | 35.13 |
| 8 | 7.5 | 45 | 4 | 6.09 | 31.76 |
| 9 | 10 | 50 | 6 | 8.15 | 51.79 |
| 10 | 10 | 50 | 6 | 8.37 | 52.79 |
| 11 | 10 | 50 | 6 | 8.49 | 49.93 |
| 12 | 10 | 50 | 6 | 7.99 | 50.26 |
| 13 | 10 | 50 | 6 | 8.46 | 48.34 |
| 14 | 10 | 50 | 6 | 7.98 | 51.46 |
| 15 | 15 | 50 | 6 | 6.61 | 38.33 |
| 16 | 5 | 50 | 6 | 4.16 | 31.90 |
| 17 | 10 | 60 | 6 | 6.22 | 34.16 |
| 18 | 10 | 40 | 6 | 7.62 | 36.00 |
| 19 | 10 | 50 | 10 | 6.86 | 38.81 |
| 20 | 10 | 50 | 2 | 3.96 | 28.56 |
1) 중심합성계획에 의한 실험조건 번호
| 반응변수 | 2차다항식 | R2 | 유의수준 |
| 환원당 함량 | Y = -40.992500 + 1.176000X1 + 1.331000X2 + 3.337500X3 - 0.109200X1 2 + 0.01720 X1X2 - 0.014200X2 2 + 0.046000X1X3 - 0.025000X2X3 - 0.183125X3 2 | 0.9644 | <.0001 |
| 사포나린함량 | Y = -481.626080 + 13.921159X1 + 16.939761X2 + 10.395540X3 - 0.655345X1 2 - 0.059100 X1X2 - 0.164186X2 2 + 0.510250X1X3 - 0.005125X2X3 - 1.113352X3 2 | 0.9521 | <.0001 |
복합효소처리 조건에 따른 새싹보리 효소분해물의 환원당 함량은 3.96~8.49%의 범위로 나타났으며(표 10), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 11과 같다. 환원당 함량에 대한 R2값은 0.9644로 높은 신뢰도를 보였으며, P-값은 1% 이내 유의수준을 보였다. 효소처리 조건에 대한 영향에서 환원당 함량의 경우 효소처리 온도 > 효소농도 > 효소처리 시간 순으로 세 가지 조건 모두에서 영향을 크게 받는 것으로 나타났다(표 12). 효소처리에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점은 최대점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 환원당 함량의 최댓값은 8.54%이고 이때의 효소처리조건은 효소농도 10.62%, 반응온도 46.49℃ 및 반응시간 7.33시간으로 나타났다(표 13). 실험조건에 따라 얻은 효소분해물의 환원당 함량에 대한 4차원 반응표면은 도 8과 같이 최대점의 형태를 나타내었으며, 효소 농도가 높고, 반응시간이 길수록 증가하는 것으로 나타났다.
| 반응변수 | F-Ratio | ||
| 효소/기질농도 (E/S, %) |
반응온도(℃) | 반응시간 (hour) |
|
| 환원당 함량 | 28.44*** | 11.73*** | 44.75*** |
| 사포나린 함량 | 21.31*** | 16.35*** | 29.42*** |
*유의성 10% 이내; **유의성 5% 이내; ***유의성 1% 이내
| 반응변수 | 예측반응 | 형태 | ||||
| 반응값 | 효소/기질농도 (E/S, %) |
반응온도 (℃) |
반응시간 (hour) |
결과값 | ||
| 환원당 함량 | 최소 | 10.83 | 49.03 | 2.07 | 3.81 | 최대값 |
| 최대 | 10.62 | 46.49 | 7.33 | 8.54 | ||
| 사포나린 함량 | 최소 | 11.76 | 51.25 | 2.29 | 23.85 | 최대값 |
| 최대 | 11.27 | 49.40 | 7.20 | 51.98 | ||
복합효소처리 조건에 따른 새싹보리 효소분해물의 사포나린 함량은 28.56~52.79 mg/100 mL의 범위로 나타났으며(표 10), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 11과 같으며, 이 모델에 대한 회귀식의 R2 값은 0.9521로 1% 이내의 유의성이 인정되었다. 사포나린 함량은 효소농도, 반응시간, 반응온도의 효소처리조건 모두에서 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 효소농도와 반응온도가 높고, 효소처리 시간이 길어질수록 사포나린 함량이 증가하는 것으로 나타났다(표 12). 표 13과 같이 사포나린 함량의 예측된 정상점은 최대점으로 최댓값이 51.98 mg/100 mL이었고, 이때 효소농도 11.27%, 반응온도 49.40℃ 및 반응시간 7.20시간이었다. 효소분해물의 사포나린 함량은 효소처리 조건에 따른 4차원 반응표면에서 볼 때 효소 농도 8~12%, 반응온도 48~52℃ 및 반응시간 6~8시간에서 가장 함량이 높은 것으로 나타났다(도 9).
3) 최적 효소처리조건의 예측
새싹보리의 최적 효소처리조건을 설정하기 위하여 환원당과 사포나린 함량을 모두 만족시켜주는 최적 효소처리 조건을 얻고자 각 반응표면을 수퍼임포징(superimposing)하여 도 10의 겹쳐진 부분으로써 표 14에 최적 조건을 나타내었다. 새싹보리 효소처리 최적 조건 범위는 효소/기질 농도 8~12%, 반응온도 45~55℃ 및 반응시간 5~7시간으로 나타났다. 따라서 이와 같은 예측 결과에 대한 모델식의 신뢰성을 확인하기 위하여 예측된 최적 조건 범위 내에서 임의의 조건 즉, 효소농도 10%, 반응온도 50℃ 및 반응시간 6시간을 대입하여 실제 효소처리를 실시하고, 효소분해물의 환원당 함량과 사포나린 함량을 측정한 결과 예측된 값들과 유사한 수준으로 비교되었다(표 15).
| 가수분해 조건 | 예측된 조건 범위(최적점) |
| 효소/기질농도(E/S, %) | 8~12(10) |
| 반응온도(℃) | 45~55(50) |
| 반응시간(hr) | 5~7(6) |
| 반응변수 | 예측된 조건(A)1 ) | 실측된 조건(B)2 )* | B/A×100(%) |
| 환원당 함량(%) | 687.66 | 720.67±6.30 | 104.80 |
| 사포나린 함량(mg/100 g) | 176.78 | 184.01±3.55 | 104.08 |
1) 반응변수에 대한 예측식으로부터 계산된 값
2) 독립변수의 최적조건: 효소/기질 농도 10%, 반응온도 50℃, 반응시간 6시간
*) 평균값은 3반복 표준편차
실시예
3.
신규한
유산균
락토바실러스
퍼멘텀
(
Lactobacillus
fermentum
) DU.LA.EIJ-31에 의한 새싹보리
효소분해물의
유산균 발효 조건 선정
1) 반응표면분석법을 이용한 새싹보리 유산발효조건 최적화
(1) 균 생육도, pH 및 산도값
신규한 유산균 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31(KCTC 13419BP)에 의한 새싹보리 가수분해물의 최적 발효조건을 설정하기 위해 발효시간과 부원료인 바나나 농축액 첨가 농도를 독립변수로 하여 중심합성계획에 의해 설계된 13구의 발효조건에서 얻어진 발효적 특성 값 즉, 균 생육도, pH 및 산도값은 표 16과 같다.
| 실험번호1) | 생육도(O.D. 600 nm) | pH | 산도(%) |
| 1 | 1.785 | 3.39 | 1.13 |
| 2 | 1.654 | 3.49 | 0.60 |
| 3 | 1.745 | 3.40 | 1.10 |
| 4 | 1.418 | 3.27 | 0.81 |
| 5 | 1.618 | 3.32 | 0.95 |
| 6 | 1.647 | 3.32 | 0.96 |
| 7 | 1.632 | 3.36 | 0.90 |
| 8 | 1.624 | 3.40 | 0.80 |
| 9 | 1.635 | 3.48 | 0.77 |
| 10 | 1.611 | 3.34 | 1.04 |
| 11 | 1.204 | 3.98 | 0.43 |
| 12 | 1.546 | 3.55 | 1.12 |
| 13 | 1.314 | 3.16 | 0.48 |
1)중심합성계획에 의한 실험조건 번호
중심합성계획법에 따라 표 5와 같은 각 독립변수의 범위를 설정한 후, 13가지의 발효조건을 설정하고 새싹보리를 유산발효 하였다. 발효조건에 따른 새싹보리 발효물의 균 생육도는 1.204~1.785(흡광도 600 nm)의 범위로 나타났으며(표 16), 이를 바탕으로 한 균 생육도의 회귀식은 표 17과 같고, R2 값은 0.9977로 1% 이내의 수준에서 유의성이 확인되었다. ANOVA 분석을 통한 모형에 대한 적합성을 검증하기 위해서는 적합결여도의 P-value가 0.5051로 나타나 모형의 적합성이 인정되었다(표 17). 발효조건에 대한 영향은 표 18에서와 같이 발효시간과 부원료 농도 모두에 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석결과 임계점이 최대점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 최댓값은 1.762(흡광도 600 nm)이며, 이때의 발효 조건은 발효시간 54.25시간 및 부원료 농도 12.47%로 나타났다(표 19). 실험조건에 따라 얻은 새싹보리 발효물의 생육도에 대한 반응표면은 도 11에 나타내었다.
| 용어 | 균생육도 | pH | 산도 | |||
| 회귀계수 | t-값 | 회귀계수 | t-값 | 회귀계수 | t-값 | |
| 절편 β0 | 0.389479 | 9.54 | 4.595208 | 15.96 | -0.380208 | -3.68 |
| 1차항 β1 | 0.035321 | 23.86 | -0.049345 | -4.73 | 0.036773 | 9.82 |
| β2 | 0.064325 | 16.94 | -0.029730 | -1.11 | 0.058282 | 6.07 |
| 2차항 β11 | -0.000266 | -16.79 | 0.000559 | 5.01 | -0.000355 | -8.89 |
| β22 | -0.001505 | -16.52 | 0.001170 | 1.82 | -0.001397 | -6.06 |
| 교차곱 β12 | -0.000488 | -5.37 | -0.000125 | -0.20 | -0.000041667 | 0.18 |
| R2 | 0.9977 | 0.8994 | 0.9913 | |||
| 적합결여도(Lack of fit) | 0.5051 | 0.0014 | 0.0619 | |||
| 반응변수 | F-Ratio | |
| 발효시간(hour) | 부원료 농도(%) | |
| 균 생육도 | 725.34*** | 334.73*** |
| pH | 128.22*** | 145.56*** |
| 산도 | 128.22*** | 145.56*** |
*유의성 10% 이내; **유의성 5% 이내; ***유의성 1% 이내
| 반응변수 | 예측반응 | 형태 |
|||
| 반응값 | 발효시간(hour) | 부원료 농도(%) | 결과값 | ||
| 균 생육도 | 최소 | 16.81 | 3.98 | 1.108 | 최대값 |
| 최대 | 54.25 | 12.47 | 1.762 | ||
| pH | 최소 | 46.16 | 15.57 | 3.23 | 최소값 |
| 최대 | 12.17 | 8.80 | 3.89 | ||
| 산도 | 최소 | 17.58 | 3.58 | 0.35 | 최대값 |
| 최대 | 49.26 | 18.33 | 1.20 | ||
발효조건별로 처리된 새싹보리 발효물의 pH는 3.16~3.49의 범위로 나타났으며(표 16), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 17과 같다. pH에 대한 R2값은 0.8994로 높은 신뢰도를 보였으며, P-value는 1% 이내 유의수준을 보였다. pH의 모델에 대한 적합결여도의 P-value는 0.0014로 나타나 모델이 적합하지 않은 것으로 나타났다(표 17). 발효조건에 대한 영향에서 pH의 경우 부원료 농도 > 발효시간 순으로 영향을 크게 받는 것으로 나타났다(표 18). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최저점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 pH의 최저값은 3.23이고 이때의 발효조건은 발효시간 46.16시간 및 부원료 농도 15.57%로 나타났다(표 19). 실험조건에 따라 얻은 새싹보리 발효물의 pH에 대한 반응표면은 도 12에 나타내었으며, 발효시간이 길수록 pH가 감소하는 것으로 나타났다.
발효조건에 따른 새싹보리 발효물의 산도 변화는 0.43~1.13%의 범위로 나타났으며(표 16), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 17과 같으며, 이 모델에 대한 회귀식의 R2 값은 0.9913로 1% 이내의 유의성이 인정되었다. 산도를 위한 발효조건 모델에 대한 적합결여도의 P-value는 0.0691로 나타나 모델이 적합한 것으로 나타났다. 산도는 발효온도와 부원료 농도의 발효조건 모두에서 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며(표 18), 표 19와 같이 산도의 예측된 정상점은 최댓점으로 최댓값이 1.20%이었고, 이때 발효시간 49.26 시간 및 부원료 농도 18.33%이었다. 반응표면의 결과, 부원료 농도가 높고 발효시간이 길수록 산도가 증가하는 것으로 나타났다(도 13).
(2) 새싹보리 발효물의 유용성분 함량
신규한 유산균 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31에 의한 새싹보리 효소분해물의 최적 발효조건을 설정하기 위해 발효시간과 부원료 농도를 독립변수로 하여 중심합성계획에 의해 설계된 13구의 발효조건에서 얻어진 유용성분 함량은 표 20과 같다.
| 실험번호1 ) | 사포나린 함량(㎍/mL) | 이소비텍신 함량(㎍/mL) | 총 페놀성 화합물 함량 (mg/100 mL) |
| 1 | 34.54 | 2.84 | 5.70 |
| 2 | 29.97 | 2.65 | 4.67 |
| 3 | 30.83 | 2.47 | 5.30 |
| 4 | 26.52 | 2.57 | 4.74 |
| 5 | 30.58 | 2.53 | 4.63 |
| 6 | 30.34 | 2.73 | 4.94 |
| 7 | 30.87 | 2.41 | 5.34 |
| 8 | 30.17 | 2.74 | 4.63 |
| 9 | 31.26 | 2.47 | 4.98 |
| 10 | 32.02 | 2.50 | 5.04 |
| 11 | 23.94 | 1.65 | 5.00 |
| 12 | 32.26 | 2.67 | 5.97 |
| 13 | 25.30 | 1.58 | 4.50 |
1)중심합성계획에 의한 실험조건 번호
발효조건에 따른 새싹보리 발효물의 사포나린 함량을 측정한 결과는 표 20과 같으며, 23.94~34.54 ㎍/mL의 범위로 측정되었다. 조건에 따른 값을 이용한 사포나린 함량의 회귀식은 표 21과 같으며, 이 모델에 대한 회귀식의 R2 값은 0.9615로 회귀방정식에 대한 적합도가 높았으며, P-value는 1% 이내 유의 수준을 보였다. ANOVA 분석을 통한 적합결여도의 P-value는 0.0615로 분석되어 반응표면 모형에 대한 적합성이 인정되었다(표 21). 발효시간과 부원료 농도 모두에서 큰 영향을 받는 것으로 나타났다(표 22). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 정상점은 최대점으로 구하였고, 사포나린 함량의 최대 함량은 34.31 ㎍/mL이었고, 이때의 발효조건은 발효시간 50.80시간, 부원료 농도 17.87%로 나타났다(표 23). 반응표면을 통한 새싹보리 발효물의 사포나린 함량 변화는 도 14와 같다.
| 용어 | 사포나린 함량 | 이소비텍신 함량 | 총페놀성 화합물 함량 | |||
| 회귀계수 | t-값 | 회귀계수 | t-값 | 회귀계수 | t-값 | |
| 절편 | ||||||
| β0 | 14.022500 | 4.94 | 0.664167 | 0.65 | 5.386875 | 6.13 |
| 1차항 | ||||||
| β 1 | 0.475896 | 4.63 | 0.062933 | 1.69 | -0.031984 | -1.01 |
| β2 | 0.700655 | 2.66 | 0.080471 | 0.84 | -0.062397 | -0.76 |
| 2차항 | ||||||
| β11 | -0.004511 | -4.11 | -0.000835 | -2.10 | 0.000212 | 0.62 |
| β22 | -0.017983 | -2.84 | -0.004307 | -1.88 | 0.001958 | 1.72 |
| 교차곱 | ||||||
| β12 | 0.001083 | 0.17 | 0.001208 | 0.53 | 0.003370 | 1.00 |
| R2 | 0.9615 | 0.7129 | 0.8348 | |||
| 적합결여도 | 0.0615 | 0.0537 | 0.9292 | |||
| 반응변수 | F-Ratio | |
| 발효시간(hour) | 발효 부원료 농도(%) | |
| 사포나린 함량 | 31.98*** | 27.89*** |
| 이소비텍신 함량 | 3.28* | 3.19* |
| 총 페놀성 화합물 함량 | 0.55 | 11.70*** |
*유의성 10% 이내; **유의성 5% 이내; ***유의성 1% 이내
| 반응변수 | 예측반응 | 형태 | |||
| 반응값 | 발효시간 (hour) |
부원료 농도(%) | 결과값 | ||
| 사포나린 함량 (㎍/mL) |
최소 | 16.44 | 4.19 | 23.33 | 최대점 |
| 최대 | 50.80 | 17.87 | 34.31 | ||
| 이소비텍신 함량 (㎍/mL) |
최소 | 12.73 | 7.54 | 1.80 | 최대점 |
| 최대 | 48.84 | 15.95 | 2.87 | ||
| 총 페놀성 화합물 함량 (mg/100 mL) |
최소 | 47.73 | 1.27 | 4.38 | 안장점 |
| 최대 | 44.58 | 19.33 | 6.12 | ||
발효조건별로 처리된 새싹보리 발효물의 이소비텍신(isovitexin) 함량은 표 20과 같이 1.65~2.84 ㎍/mL의 범위로 나타났으며, 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 21과 같다. 이소비텍신 함량에 대한 R2값은 0.7129로 낮은 신뢰도를 보였으며, P-value는 10% 이내 유의수준을 보였다. 이소비텍신 함량 값의 모델에 대한 적합결여도의 P-value는 0.0537로 나타나 모델이 적합한 것으로 나타났다(표 21). 발효조건에 대한 영향에서 이소비텍신 함량의 경우 발효시간 > 부원료 농도 순으로 두 조건 모두에서 적은 영향을 받고 있는 것으로 나타났다(표 22). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 이소비텍신 함량의 최댓값은 2.87 ㎍/mL이고 이때의 발효조건은 발효시간 48.84시간, 부원료 농도 15.95%로 나타났다(표 23). 실험조건에 따라 얻은 새싹보리 발효물의 이소비텍신 함량에 대한 반응표면은 도 15에 나타내었다.
발효조건에 따른 새싹보리 발효물의 총 페놀성 화합물 함량을 측정한 결과는 4.50~5.97 mg/100 mL의 범위로 나타났으며(표 20), 이를 이용한 회귀식은 표 21에 나타내었다. 반응표면 모델의 회귀식의 R2 값은 0.8348로 확인되었으며, ANOVA 분석을 통한 적합결여도의 P-value가 0.9292이므로 반응표면 모형에 대한 적합성이 인정되었다(표 21). 발효조건에 대한 영향에서 부원료 농도의 큰 영향을 받는 것으로 나타났으며, 설정된 범위 내에서 발효시간에는 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(표 22). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 정상점은 안장점으로 나타났으며, 능선분석을 하여 최적점을 산출한 결과, 총 페놀성 화합물 함량의 최댓값은 6.12 mg/100 mL였으며, 이때의 발효조건은 발효시간 44.58시간, 부원료 농도 19.33%로 나타났다(표 23). 반응표면을 통한 발효조건에 따른 새싹보리 발효물의 총 페놀성 화합물 함량 변화는 도 16과 같다.
(3) 최적 발효조건의 예측
새싹보리의 최적 발효조건을 설정하기 위하여 발효적 특성 및 유용성분 함량을 모두 만족시켜주는 최적 발효조건을 얻고자 각 반응표면을 수퍼임포징(superimposing)하여 도 17의 겹쳐진 부분으로써 표 24에 최적 발효조건을 나타내었다. 새싹보리의 최적 발효조건 범위는 발효시간 44~52시간 및 부원료 농도 11~18%로 나타났다. 따라서 이와 같은 예측 결과에 대한 모델식의 신뢰성을 확인하기 위하여 예측된 최적 조건 범위 내에서 임의의 조건 즉, 발효시간 48시간 및 부원료 농도 15%을 대입하여 실제 유산 발효를 실시하고, 새싹보리 발효물의 발효적 특성과 유용성분 함량을 측정한 결과 예측된 값들과 유사한 수준으로 비교되었다(표 25).
| 발효조건 | 예측된 조건 범위 |
| 발효시간(hour) | 44~52 |
| 발효 부원료 농도(%) | 11~18 |
| 반응변수 | 예측된 조건(A)1 ) | 실측된 조건(B)2 )* | B/A×100(%) |
| 균 성장도(O.D. 600 nm) | 1.733 | 1.758 | 101.44 |
| pH | 3.24 | 3.36 | 103.70 |
| 산도(%) | 1.08 | 1.11 | 102.77 |
| 사포나린 함량(㎍/mL) | 33.72 | 32.38 | 96.03 |
| 이소비텍신 함량(㎍/mL) | 2.87 | 2.35 | 82.45 |
| 총 페놀성 화합물 함량 (mg/100 mL) |
6.96 | 6.27 | 90.08 |
1) 반응변수에 대한 예측식으로부터 계산된 값
2) 독립변수의 최적조건: 발효시간 48시간, 발효 부원료 농도 15%
*) 평균값은 3반복 표준편차
실시예
4. 유산균 발효 전후 새싹보리의 특성 및 유효성분 함량 비교
본 발명이 추구한 새싹보리의 효소적 분해와 효소분해물을 신규한 유산균 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31에 의하여 최적발효 조건으로 발효되었을 때 발효 전후의 새싹보리의 특성과 유효성분 변화를 조사한 결과는 표 26과 같다. 또한, 이들을 HPLC로 분석한 크로마토그램은 도 18과 같다. 발효 특성상 산도의 경우 새싹보리 원료의 0.08%에서 발효시 0.23%와 1.11%로 나타나 최적조건에서 유산균 발효가 적절한 발효가 일어났음을 알 수 있다. 또한, 유효성분의 경우도 새싹보리 원료내 함량보다 대부분 그 함량이 증가된 것을 볼수 있었다. 사포나린 함량의 경우, 효소가수분해물이 새싹보리 원료대비 44.3% 증가하였고, 효소분해물을 발효한 시료는 새싹보리원료 대비 52.7%의 증가되었다. 효소분해물과 효소분해물을 발효한 시료간에도 유의적인 함량 증가가 있는 것으로 나타났다. 효소분해하지 않은 발효물의 경우 원료대비 함량이 오히려 다소 감소하였다. 이소비텍신 함량의 경우 새싹보리 효소분해물은 원료대비 71.2%의 함량의 증가가 있었고 새싹보리 효소분해물을 발효한 시료는 원료대비 126.7%의 함량이 증가된 것으로 나타났다. 효소처리 하지 않은 발효물의 이소비텍신 함량은 효소분해물과 유의적으로 차이가 없어 본 발명의 유산균 발효가 이소비텍신의 함량 증가에 유효하게 작용한 것으로 보인다. 루테오린 함량의 경우 새싹보리 원료의 경우 검출되지 않았지만 효소처리물의 경우 0.12 ㎍/mL이었고 효소처리물을 최적조건에서 발효한 발효물의 경우 0.18 ㎍/mL으로 유의적인 증가가 있는 것으로 나타나, 본 발명의 발효처리가 루테오린 함량 증가에 효과적인 처리인 것으로 보인다. 한편, 호모오리엔틴 함량의 경우 새싹보리를 가수분해하지 않고 그대로 발효한 경우 원료대비 16.9%의 함량 증가가 있었으나 효소처리한 경우 원료 함량대비 53.52%의 함량감소와 효소처리물을 발효한 시료는 원료 함량대비 46.5%의 함량의 감소가 나타났다. 이는 호모오리엔틴이 루테오린-6-C-글루코사이드 화합물로서 효소적 가수분해에 함량 감소가 있었고 이들 효소적 분해에 의하여 루테오린의 전환의 중간산물로 적용되었으리라 생각된다. 또한 비텍신 함량도 원료 새싹보리에서 함량이 검출되지 않았으나 효소처리와 효소처리 발효물에서 유의적인 증가가 나타나 이들의 함량 증가에도 효소처리와 발효물의 처리가 유효한 것으로 나타났다.
| 특성 및 유효성분 | 새싹보리 | 새싹보리 효소 가수분해물 | 효소분해 않은 새싹보리 발효물 | 효소분해 후 최적조건에서 발효된 발효물 |
| pH | 5.48±0.01a | 5.05±0.03b | 3.56±0.01c | 3.36±0.03d |
| 산도(%) | 0.08±0.01c | 0.15±0.03bc | 0.23±0.03b | 1.11±0.04a |
| 사포나린(㎍/mL) | 24.95±0.31c | 35.99±0.37b | 22.50±0.15d | 38.09±0.35a |
| 호모오리엔틴(㎍/mL) | 0.71±0.07b | 0.33±0.04c | 0.83±0.08a | 0.38±0.06c |
| 비텍신(㎍/mL) | - | 2.12±0.08a | - | 0.17±0.04b |
| 이소비텍신(㎍/mL) | 1.46±0.06c | 2.50±0.07b | 2.19±0.08b | 3.31±0.05a |
| 루테오린(㎍/mL) | - | 0.12±0.03b | - | 0.18±0.02a |
Claims (5)
- (1) 새싹보리에 물을 가하여 분쇄한 새싹보리 분쇄물을 준비하고, 상기 준비한 분쇄물에 비스코자임(Viscozyme)과 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 혼합한 복합 효소를 첨가한 후 가수분해하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 가수분해한 새싹보리 효소 분해물에 바나나 농축액을 첨가한 후 가열하여 효소를 불활성화시켜 새싹보리 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 준비한 새싹보리 효소 혼합물에 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주를 접종한 후 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 사포나린(saponarin), 이소비텍신(isovitexin) 및 루테오린(luteolin) 함량이 증진된 새싹보리 발효물의 제조방법. - 제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) 균주는 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주(기탁번호: KCTC 13419BP)인 것을 특징으로 하는 사포나린(saponarin), 이소비텍신(isovitexin) 및 루테오린(luteolin) 함량이 증진된 새싹보리 발효물의 제조방법.
- 제2항에 있어서,
(1) 새싹보리에 물을 가하여 분쇄한 새싹보리 분쇄물을 준비하고, 상기 준비한 분쇄물에 비스코자임(Viscozyme)과 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 0.8~1.2:0.8~1.2 부피비율로 혼합한 복합 효소를 8~12%(v/v) 첨가한 후 45~55℃에서 5~7시간 동안 가수분해하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 가수분해한 새싹보리 효소 분해물에 바나나 농축액을 11~18%(v/v) 첨가한 후 가열하여 효소를 불활성화시켜 새싹보리 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 준비한 새싹보리 효소 혼합물에 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주(기탁번호: KCTC 13419BP)를 접종한 후 30~45℃에서 44~52시간 동안 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 사포나린(saponarin), 이소비텍신(isovitexin) 및 루테오린(luteolin) 함량이 증진된 새싹보리 발효물의 제조방법. - 제3항에 있어서,
(1) 새싹보리에 물을 0.8~1.2:8~10(w:v) 비율로 가하여 분쇄한 새싹보리 분쇄물을 준비하고, 상기 준비한 분쇄물에 100~120 FBG(Fungal Beta-Glucanase Units)/ml 농도의 비스코자임(Viscozyme)과 18,000~30,000 PG(Polygalacturonase Units)/ml 농도의 펙티넥스 울트라 SP-L(Pectinex ultra SP-L)을 0.8~1.2:0.8~1.2 부피비율로 혼합한 복합 효소를 8~12%(v/v) 첨가한 후 45~55℃에서 5~7시간 동안 가수분해하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 가수분해한 새싹보리 효소 분해물에 55~70 Brix의 바나나 농축액을 11~18%(v/v) 첨가한 후 80~90℃에서 10~20분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 새싹보리 효소 혼합물을 준비하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 준비한 새싹보리 효소 혼합물에 락토바실러스 퍼멘텀(Lactobacillus fermentum) DU.LA.EIJ-31 균주(기탁번호: KCTC 13419BP)를 1~10%(v/v) 접종한 후 30~45℃에서 40~48시간 동안 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 사포나린(saponarin), 이소비텍신(isovitexin) 및 루테오린(luteolin) 함량이 증진된 새싹보리 발효물의 제조방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 방법으로 제조된 사포나린(saponarin), 이소비텍신(isovitexin) 및 루테오린(luteolin) 함량이 증진된 새싹보리 발효물.
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