KR101402031B1

KR101402031B1 - 락토바실러스 플랜타룸 ｋ154를 이용한 ｇａｂａ 증진 발효 식물 추출물 제조방법

Info

Publication number: KR101402031B1
Application number: KR1020120117656A
Authority: KR
Inventors: 이삼빈; 양선아; 김지은; 김민아; 정연섭; 임상동; 허담; 최성기; 이준엽; 박수현
Original assignee: 계명대학교 산학협력단; 주식회사 비락; (주)옴니허브; 한국식품연구원
Priority date: 2012-10-23
Filing date: 2012-10-23
Publication date: 2014-06-02
Also published as: KR20140051543A

Abstract

본 발명은 락토바실러스 플랜타룸 K154를 이용한 GABA 증진 발효 식물 추출물 제조방법에 관한 것으로서, 배지에서 락토바실러스 플랜타룸을 배양하여 스타터(starter)를 준비하는 단계; 상기 락토바실러스 플랜타룸 스타터를 0.1 내지 10 중량% 글루코즈(glucose) 및 0.1 내지 5 중량% 효모추출물(yeast extract)이 포함된 식물 추출물에 접종하는 단계; 및 상기 접종된 식물 추출물을 발효시키는 단계를 포함하는 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 발효 식물 추출물 제조방법을 제공한다. 상세하게는, 상기 배지에는 0.1 내지 5 중량% 모노소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate; MSG)를 더 첨가하는 것을 특징으로 한다. 또한 상기의 방법에 의해 제조된 GABA가 증진된 발효 식물 추출물을 제공한다.

Description

락토바실러스 플랜타룸 Ｋ154를 이용한 ＧＡＢＡ 증진 발효 식물 추출물 제조방법{Method for producing fermented herb extract with high GABA content using Lactobacillus plantarum K154}

본 발명은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154를 이용하여 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 발효 식물 추출물 제조방법에 관한 것이다.

감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)은 억제성 신경전달물질로서 혈압상승을 억제하고 시력증진에 효과가 있으며 불안감, 초조감 등을 진정시키는 작용을 하는 것으로 알려진 물질이다. 동물의 경우 뇌, 심장, 폐, 신장 등에 분포되어 있으며, 식물의 경우 발아현미, 녹차 등에서 주로 발견되고 있다. 스트레스에 시달리는 현대인이나 수험생, 알코올 과다 섭취자의 경우 뇌와 혈중 GABA 농도가 낮은 것으로 보고되어 있으며, 체내 GABA 농도의 극심한 부족은 발작, 경련, 간질 증세를 일으키는 것으로 알려져 있다.

이러한 GABA의 기능성이 알려지면서 의약품으로서 뿐만 아니라 기능성 식품 소재로서 관심이 높아지고 있다. 현재 GABA는 현미, 녹차, 맥아, 배추 등에 자연적으로 약간 함유되어 있으나, 그 함량이 낮아 자연 식품으로 섭취하는 양으로는 생리활성을 기대하기 어렵다. 이러한 식물들의 GABA 함유량을 높이기 위해서 차잎과 보리맥아 제조시 발아된 보리의 혐기적 처리와 현미 발아시 글루탐산(glutamic acid) 첨가를 통하여 식물체 내 GABA 함량을 증가시켰다(Chang et al., 1992; Jeon et al., 2004; Park et al., 2001; Yokoyama et al., 2002). 그러나 식물을 원재료로 한 GABA의 생산에는 한계가 있으므로 GABA 대량생산을 위해 미생물을 이용한 많은 연구가 수행되고 있다. 이중 젖산균은 인간이 이용할 수 있는 가장 유익한 미생물의 한 종류로서 예로부터 발효 유제품을 중심으로 장류, 김치, 젓갈, 소시지, 의약품 등에 걸쳐 인류생활에 폭넓게 활용되어 내려오고 있다. 하지만, GABA를 생산하는 균주의 분리 및 개량에 대한 연구는 다양한 측면에서 이루어진데 반해 GABA의 함량을 높인 식품이나 기능성 음료에 관한 연구는 아직 미비한 실정이다.

한편, 한국등록특허 제0404921호에서는 건망증 개선 효능이 있는 총명차의 제조방법을 개시하고 있으나, 이는 원지, 감초 등의 한방 생약재가 혼합된 총명차로서 젖산균을 이용한 발효나 GABA에 대한 언급이 없다. 따라서, 본 발명자들은 총명탕의 주요 약재로 사용되는 석창포, 원지 및 복령 추출물의 젖산 발효를 통해 GABA 함량을 증진시킨 발효 식물 추출물을 제조하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 젖산균인 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 스타터를 이용하여 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 발효 식물 추출물 제조방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 방법에 의해 제조된 GABA가 증진된 발효 식물 추출물을 제공하는 데에 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 배지에서 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)을 배양하여 스타터(starter)를 준비하는 단계; 상기 락토바실러스 플랜타룸 스타터를 0.1 내지 10 중량% 글루코즈(glucose) 및 0.1 내지 5 중량% 효모추출물(yeast extract)이 포함된 식물 추출물에 접종하는 단계; 및 상기 접종된 식물추출물을 발효시키는 단계를 포함하는 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 발효 식물 추출물 제조방법을 제공한다. 상세하게는, 상기 배지에는 0.1 내지 5 중량% 모노소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate; MSG)를 더 첨가하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, "스타터(starter)"란 발효물을 제조하는 경우에 사용하는 미생물 배양액을 말한다. 따라서 스타터 미생물의 종류는 그 제품의 특성을 결정하게 되며 제품의 품질에 중요한 영향을 미친다. 미생물 중에서 스타터로 사용되고 있는 것은 박테리아, 곰팡이, 효모 등을 들 수 있으며, 이것을 단독 혹은 혼합하여 사용할 수 있다.

상기 배지로는 락토바실러스(Lactobacillus) MRS 배지가 바람직하나, 상기 균주의 배양에 적합한 배지라면 특별히 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 MSG의 첨가량이 0.1 중량% 이하인 경우 GABA 생성에 필요한 전구물질이 부족하게 되는 문제가 발생할 수 있고, 5.0 중량%을 초과하는 경우 GABA로 전환되지 않은 MSG가 남아 있게 되는 문제가 발생할 수 있다.

또한 본 발명에 있어서, 상기 식물 추출물은 원지, 백복령 및 석창포를 1:1:1의 중량비로 열수 추출한 것을 특징으로 하고, 상기 락토바실러스 플랜타룸은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154(KACC91727P)인 것을 특징으로 한다.

본 발명에 있어서, "총명탕"은 백복신, 원지, 감초 및 석창포의 4가지 천연 생약재로 구성된 한약조성물로서 동의보감에는 '치다망구복능일송천언'(治多忘久服能日誦千言)라 하여 '잘 잊어버리는 것을 치료하고 오랫동안 먹으면 능히 하루에 천가지 말을 외우게 된다.'라고 기록되어 있다(출처:네이버 백과사전). 본 발명에서는 원지 300g, 백복령 300g, 석창포 300g을 물 13,000mL와 함께 약탕기에 넣고 120℃에서 총 3시간을 가열하여 식물추출물 또는 총명탕을 제조하였다.

또한, 상기 접종하는 단계는 상기 락토바실러스 플랜타룸 스타터를 1 내지 10%(v/v) 접종하는 것을 특징으로 하고, 상기 발효시키는 단계는 25 내지 42℃에서 1일 내지 7일 동안 발효하는 것을 특징으로 한다.

상기 락토바실러스 플랜타룸 스타터의 접종량이 1 %(v/v) 이하인 경우 저농도의 균주로 인해 감마-아미노부틸산을 고함량으로 생산할 수 없고, 10 %(v/v)을 초과하는 경우 너무 빨리 발효되는 문제가 발생할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 제조된 GABA가 증진된 발효 식물 추출물을 제공한다.

본 발명자들은 식물 추출물(석창포, 원지 및 복령 추출물)의 젖산 발효를 통해 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA) 함량을 증진시킨 발효 식물 추출물을 제조하였고, 이를 활용하여 고함량의 GABA가 포함된 기능성 음료 및 식품 개발의 가능성을 높일 수 있다.

도 1은 MSG가 첨가된 경우(0.5%)와 첨가되지 않은 경우, 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K66과 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 균주의 GABA 생성능을 확인한 TLC 결과이다.
도 2는 발효시간에 따른 GABA 생산능을 확인한 TLC 결과이다.
도 3은 열처리 조건에 따른 GABA 생산능 변화를 확인한 TLC 결과이다.
도 4는 GABA 함량을 증진시킨 발효 식물 추출물을 제조하기 위한 발효공정도를 나타낸다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1 > GABA 생성 균주의 스크리닝( screening )을 통해 GABA 생산 최적화 균주 선별

1. 균주 배양 방법

김치에서 분리한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K66과 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 균주는 Lactobacilli MRS agar 배지(Difco co., Ltd.)에서 단일 콜로니(colony)가 나타나게 배양한 후, MRS 배지(broth)에 모노소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate; MSG)를 0.5% 첨가한 구와 첨가하지 않은 구로 나누어 접종한 뒤 30℃에서 24시간 동안 배양하였다.

본 발명의 균주 분리에 사용된 MRS 배지의 조성

성 분	성분비(그람/리터)
프로테오스 펩톤 #3	10.0
쇠고기 추출물	10.0
효모 추출물	5.0
덱스트로스	20.0
트윈 80	1.0
암모늄 시트레이트	2.0
소디움 아세테이트	5.0
마그네슘 설페이트	0.1
망간 설페이트	0.05
디포타시움 포스페이트	2.0

2. TLC 측정방법

샘플에 함유된 MSG 및 생성된 GABA 함량은 TLC(Silica gel 60 F254, Merck)로 확인하였다. 배양액 1mL을 speed vaccum을 이용하여 4배 농축하여 TLC plate에 2uL 점적하였다. 분석 시 전개용매로는 아세트산(acetic acid): n-부틸 알콜(n-butyl alcohol): 증류수(distilled water) (2:6:2, v/v/v)의 비율로 조제하여 4시간 이상 포화시킨 용매를 사용하였고, 발색 시약으로 0.2% 닌하이드린 용액(ninhydrin solution)을 분무하여 95℃에서 5분간 발색시켜 스팟(spot)을 확인하였다. 그 결과 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K66 보다 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 균주가 GABA 생산능이 좋았으며, MSG 첨가시 GABA 생산량이 크게 증가하는 것을 확인하였다(도 1).

< 실시예 2 > 발효시간에 따른 GABA 생성능 확인

발효시간에 따른 GABA 생성 최적 조건을 모색하기 위해서, 원지 300g, 백복령 300g, 석창포 300g을 물 13,000mL와 함께 약탕기에 넣고 120℃에서 총 3시간을 가열하여 미리 제조한 식물추출물을 기본배지로 하여 효모추출물(Yeast extract) 2.5%와 글루코즈(glucose) 0.5%를 첨가하여 멸균시켰다. 여기에 MRS 배지에 2% MSG를 첨가하여 30℃에서 24시간 동안 배양한 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154 스타터(starter)를 10%(v/v) 첨가하여 7일 동안 시간별로 발효하였다.

각각 pH와 총산도(Total acidity)를 측정하였는데, pH는 각 샘플 10mL을 원심 분리한 상층액을 pH meter (Digital pH meter 420A+, Thermo Orion. Beverly, MA., USA)를 이용하여 측정하였고, 적정 산도는 상층액 10mL를 취하여 pH가 8.3에 도달할 때까지 0.1N-NaOH로 적정에 사용된 소비량을 젖산(lactic acid) 함량(%)으로 환산하여 계산하였다. 그 결과 발효가 진행될수록 pH는 증가하고 산도는 감소하여 산성화되는 경향을 나타내었다(표 2). 한편 TLC를 이용하여 GABA 함량을 알아본 결과, GABA spot은 1일째보다 3일째에서 확연히 커지며 3일 이후의 spot의 크기는 큰 차이가 없어 3일 발효 조건이 최적인 것을 확인하였다(도 2).

발효시간 ( day )	pH	총산도 ( Total acidity ) (%)
1	3.77	1.13
3	3.85	1.08
5	3.82	1.04
7	3.86	1.03

< 실시예 3 > HPLC 를 이용한 GABA 정량

분석에 사용한 고성능 액체 크로마토그래프는 Hewlett Packard 1100 Series를 이용하였다. 컬럼은 Waters Nova-Pac C18 4μm (3.9 x 300mm)를 사용하였으며, 46℃로 유지되는 column oven에 장착하여 항온 조건에서 재현성 있게 분리되도록 하였다. 이동상은 2가지의 buffer를 이용하였다. Buffer A는 140mM NaHAc, 0.1% TEA, 6% CH₃CN, pH 6.1, buffer B는 60% CH₃CN을 사용하였다. 분리를 위한 gradient 조건은 표3과 같으며, 1.0mL의 유속으로 30분간 분석하였다. 검출은 UV-VIS detector (HP 1100 Series)를 사용하여 파장 254nm에서 측정하였다.

용매 구배 조건(Solvent gradient condition)

시간	%B	유량(ml/min)
0	0	1
12	8	1
13	12	1
15.2	20	1
22.5	46	1
22.72	100	1.5
23.2	100	1.5
25	100	1.5
25.7	100	1.5
26	0	1.5
29	0	1.5
30	0	1

조건 별로 발효된 총명탕 중 1일에서 3일의 GABA 함량 증가 차이를 확인해보기 위해 발효총명탕에 함유된 GABA 함량을 HPLC로 분석한 결과, 발효하지 않은 총명탕에 비해 하루 발효 후 약 40배 이상, 3일 발효 뒤에는 약 60배 이상까지 GABA가 증가 되는 것을 확인하였다(표 4 및 표 5).

발효에 따른 유리아미노산 함량

	ug/mL
AA	총명탕	총명탕+glucose 0.5% +Y.E. 2.5%+ Starter 10% (MSG 2%) 1day	총명탕+glucose 0.5% +Y.E. 2.5%+ Starter 10% (MSG 2%) 3day
Cys	0.00	14.48	41.23
ASP	352.58	332.42	335.98
GLU	949.29	732.26	25.56
ASN	292.13	404.97	383.58
SER	210.14	228.36	149.40
GLN	11.66	0.00	11.13
GLY	163.68	164.29	156.03
HIS	68.78	69.82	74.55
ARG	310.53	319.47	324.91
THR	222.54	215.16	214.83
ALA	594.60	565.02	540.91
GABA	31.40	1356.57	1942.84
PRO	153.66	130.67	123.48
TYR	159.21	159.56	154.46
VAL	440.02	428.19	417.06
MET	130.46	116.81	112.69
Cys2	0.00	0.00	0.00
ILE	353.45	343.70	327.57
LEU	610.91	584.43	556.56
PHE	313.09	330.56	311.75
TRP	160.88	254.45	234.27
LYS	203.82	237.99	222.57
TOTAL	5746.88	6989.18	6661.34

조건	GABA 함량 (ug/mL)
총명탕	31.40
총명탕+glucose 0.5%+Y.E. 2.5%+ Starter 10% (MSG 2%) 1day	1356.57
총명탕+glucose 0.5%+Y.E. 2.5%+ Starter 10% (MSG 2%) 3day	1942.84

< 실시예 4 > 발효 총명탕의 DPPH (2,2- diphenyl -1- picryl - hydrazyl ) 라디칼 소거능

추출물의 항산화력은 Moreno 등의 방법을 변형한 DPPH 라디칼 소거활성으로 측정하였다. 시료의 자유 라디칼(free radical) 소거활성은 안정성 라디칼(stable radical)인 DPPH에 대한 환원력을 측정한 것으로, 99% 메탄올에 각 시료를 녹여 농도 별로 희석한 희석액 800μL와 20% 메탄올에 녹인 0.15mM DPPH 용액 200μL를 가하여 30분 방치한 후 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 추출물의 유리 라디칼 소거활성은 시료를 첨가하지 않은 대조구의 흡광도를 1/2로 환원시키는데 필요한 시료의 농도인 RC50값으로 나타내었다(표 6). 이때 활성비교를 위하여 BHA를 사용하였다. 총명탕의 DPPH 라디컬 소거능은 높은 아니었으나, 발효가 진행되면서 높아지는 것을 확인하였다.

Sample	RC₅₀ value(%) DPPH scavenging¹ ⁾
총명탕	311.25 ± 6.24²⁾
발효총명탕 1 day	240.52 ± 4.36
발효총명탕 3 day	208.46 ± 21.52

¹⁾ Concentration required for 50% reduction of DPPH at 30 min after starting the reaction.

²⁾ Each value is mean±S.D. (n≥3).

< 실시예 5 > 열처리 조건에 따른 GABA 함량 변화 확인

발효총명탕을 제품화하고자 할 때 시중에 유통되기 위해서는 열처리를 해주어 잡균의 오염과 생균의 증식을 억제시켜야 한다. 따라서 가장 효율적인 조건을 찾기 위해 85℃에서 15분, 30분, 45분 시간별로 열처리를 해준 뒤, 생균수를 측정하고, TLC법을 이용하여 GABA 함량에 변화가 있는지를 관찰하였다. 생균수 측정 결과 모든 plate에서 콜로니(colony)가 나타나지 않았고, TLC결과 GABA 함량에도 차이가 없어 85℃에서 15분 동안 가열해주는 것이 최적 열처리 조건인 것을 확인하였다(도 3).

농업생명공학연구원

KACC91727

20120706

Claims

0.1 내지 5 중량% 모노소듐 글루타메이트(mono sodium glutamate; MSG)가 포함된 배지에서 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum)을 배양하여 스타터(starter)를 준비하는 단계;
상기 락토바실러스 플랜타룸 스타터를 0.1 내지 10 중량% 글루코즈(glucose) 및 0.1 내지 5 중량% 효모추출물(yeast extract)이 포함된, 원지, 백복령 및 석창포로 이루어진 식물 추출물에 접종하는 단계; 및
상기 접종된 식물 추출물을 발효시키는 단계를 포함하는 감마-아미노뷰티르산(gamma-aminobutyric acid; GABA)이 증진된 발효 식물 추출물 제조방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 식물 추출물은 원지, 백복령 및 석창포를 1:1:1의 중량비로 열수추출한 것을 특징으로 하는 GABA가 증진된 발효 식물 추출물 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 락토바실러스 플랜타룸은 락토바실러스 플랜타룸(Lactobacillus plantarum) K154(KACC91727P)인 것을 특징으로 하는 GABA가 증진된 발효 식물 추출물 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 접종하는 단계는 상기 락토바실러스 플랜타룸 스타터를 1 내지 10%(v/v) 접종하는 것을 특징으로 하는 GABA가 증진된 발효 식물 추출물 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 발효시키는 단계는 25 내지 42℃에서 1일 내지 7일 동안 발효하는 것을 특징으로 하는 GABA가 증진된 발효 식물 추출물 제조방법.
제1항의 방법에 의해 제조된 GABA가 증진된 발효 식물 추출물.