KR101999454B1

KR101999454B1 - L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 l-아르기닌 생산방법

Info

Publication number: KR101999454B1
Application number: KR1020170175046A
Authority: KR
Inventors: 김선혜; 김형준; 오해나; 윤병훈; 강민경
Original assignee: 씨제이제일제당 (주)
Priority date: 2017-12-19
Filing date: 2017-12-19
Publication date: 2019-07-11
Anticipated expiration: 2037-12-19
Also published as: RU2716573C1; TW201940699A; AU2018353929A1; CL2019002319A1; KR20190073844A; MX383967B; EP3546581A4; AR114561A1; CN110234767B; US11345940B2; WO2019124932A2; US20210139937A1; PH12019500940A1; IL266290B2; JP2020504598A; EP3546581A2; PE20191702A1; BR112019015993A2; TWI736816B; MX2019009383A

Abstract

본 출원은 Ｌ-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용하여 L-아르기닌을 생산하는 방법에 관한 것이다.

Description

L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 L-아르기닌 생산방법 {A microorganism of corynebacterium genus having L-arginine productivity and method for producing L-arginine using the same}

L-아르기닌은 식물 종자나 마늘 중에 유리 상태로 함유되어 있으며, 아미노산류 강화제로도 사용되고, 의약품, 식품 등에도 널리 이용된다. 의약용으로는 간 기능 촉진제, 뇌기능 촉진제, 남성 불임 치료제, 종합 아미노산 제제 등에 사용되고 있으며, 식품용으로는 생선묵 첨가제, 건강 음료 첨가제, 고혈압 환자의 식염 대체용으로 최근 각광받고 있는 물질이다.

코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아르기닌의 생산을 위해 코리네박테리움 속 균주에서 주로 L-아르기닌 생합성에 관여하는 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키거나 또는 L-아르기닌의 생합성에 불필요한 유전자를 제거하는 것과 같은 목적 물질 특이적인 접근 방법이 주로 이용되고 있다(한국 등록특허공보 제10-1102263호). 그러나, 여전히 효율적으로 고수율로 L-아르기닌을 생산할 수 있는 방법에 대한 연구의 필요성이 대두되고 있다.

이러한 배경하에, 본 발명자들은 L-아르기닌을 고효율로 생산할 수 있는 미생물을 개발하고자 예의 연구한 결과, 코리네박테리움 속 미생물에 기능이 알려지지 않은 단백질을 암호화하는 유전자가 결손된 미생물의 경우 L-아르기닌의 생산 수율이 증가한다는 사실을 확인하여 본 출원을 완성하였다.

본 출원의 하나의 목적은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 불활성화된 Ｌ-아르기닌 생산능을 가지는 코리네박테리움 속 미생물을 제공하는 것이다.

본 출원의 또 하나의 목적은 상기 미생물을 이용한 Ｌ-아르기닌 생산방법을 제공하는 것이다.

이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 출원은 하나의 양태로서 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 불활성화된 L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물을 제공한다.

본 출원에서 용어, "L-아르기닌"(L-Arginine)은 모든 생물체에 존재하는 조건부 필수 아미노산으로서, C₆H₁₄N₄O₂의 화학식을 갖는 L-아미노산을 의미한다. L-아르기닌은 미생물 중에서도 주로 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 미생물에 의해 생산되는 것으로 알려져 있으나, 이들은 세포 내 아르기닌에 의해서 피드백 저해(feedback inhibition)를 받는 것으로 알려져 있어(Vehary Sakanyan, et al, Microbiology, 142:9-108, 1996), 고수율의 L-아르기닌을 생산하는 데에는 한계가 있는 것으로 알려져 있다. 본 발명자들은 놀랍게도 기능이 알려져 있지 않은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 불활성화시킬 경우 L-아르기닌 생산이 증가함을 확인하여, 새로운 L-아르기닌 생산용 미생물을 제공하게 되었다.

본 출원에서 용어, "서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질"은 코리네박테리움 속 미생물에 내재적으로 존재하는 단백질이나, 기능이 알려지지 않은 추정상의 단백질(hypothetical protein)을 의미한다. 그 예로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로(필수적으로) 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 출원에서 '특정 서열번호로 구성되는 단백질'이라고 기재되어 있다 하더라도, 해당 서열번호의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 동일 혹은 상응하는 활성을 가지는 경우라면 해당 서열번호의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이(silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 서열 추가 혹은 돌연변이를 가지는 경우에도 본원의 범위 내에 속하는 것이 자명하다.

하나의 구체 예로, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 상기 서열번호 1과 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 서열번호 1의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 상기 서열번호 1의 아미노산 서열에 대해서 적어도 80% 이상, 구체적으로는, 83% 이상, 84% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상의 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 포함할 수 있다. 상기 서열과 상동성을 갖는 서열로서 실질적으로 서열번호 1의 아미노산 서열과 동일하거나 상응하는 생물학적 활성을 갖는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 경우도 역시 본 출원의 범주에 포함됨은 자명하다.

아울러, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질은 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있다. 또한, 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열로 필수적으로 구성되거나, 구성되는 유전자에 의해 암호화되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 출원의 상기 단백질은 상기 서열번호 2로 기재한 폴리뉴클레오티드 서열뿐만 아니라, 서열번호 2와 적어도 80% 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화될 수 있다.

구체적으로, 상기 서열번호 1과 적어도 80% 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단백질을 암호화할 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열이면 본 출원의 범주에 포함되나, 상기 단백질은 상기 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열에 대하여 적어도 80% 이상, 구체적으로는 83% 이상, 84% 이상, 88% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 또는 97% 이상의 상동성을 가지는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자에 의해 암호화될 수 있다. 또한, 유전 암호의 축퇴성(genetic code degeneracy)에 기인하여 동일 아미노산 서열을 암호화하는 상기 서열들의 변이체 또한 본 출원에 포함될 수 있다.

본 출원에서 용어 "상동성"은 주어진 아미노산 서열 또는 뉴클레오티드 서열과 일치하는 정도를 의미하며 백분율로 표시될 수 있다. 본 명세서에서, 주어진 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열과 동일하거나 유사한 활성을 갖는 그의 상동성 서열이 "% 상동성"으로 표시된다.

상기 아미노산 또는 뉴클레오티드 서열에 대한 상동성은 예를 들면, 문헌에 의한 알고리즘 BLAST[참조: Karlin 및 Altschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)]나 Pearson에 의한 FASTA(참조: Methods Enzymol., 183, 63, 1990)을 사용하여 결정할 수 있다. 이러한 알고리즘 BLAST에 기초하여, BLASTN이나 BLASTX라고 불리는 프로그램이 개발되어 있다(참조: http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

본 출원에서 용어 "불활성화"는 상기 단백질의 발현이 모균주, 야생형 균주, 또는 변형 전의 균주에 비하여 전혀 발현이 되지 않거나 또는 발현이 되더라도 그 활성이 없거나 감소된 것을 의미한다. 이때, 상기 감소는 상기 단백질을 암호화하는 유전자의 변이, 결손 등으로 단백질의 활성이 본래 미생물이 가지고 있는 단백질의 활성에 비해 감소한 경우와, 이를 암호화하는 유전자의 발현 저해 또는 번역(translation) 저해 등으로 세포 내에서 전체적인 단백질의 활성 정도가 야생형 균주 또는 변형 전의 균주에 비하여 낮은 경우, 이들의 조합 역시 포함하는 개념이다.

본 출원에서는, 상기 단백질의 불활성화가 L-아르기닌의 생산성과 관련 있음을 최초로 규명하였다.

본 출원에 있어서, 상기 불활성화는 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 1) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전체 또는 일부를 결실시키는 방법; 2) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 발현이 감소하도록 발현조절 서열의 변형, 3) 상기 단백질의 활성이 제거 또는 약화되도록 단백질을 암호화하는 상기 유전자 서열의 변형, 4) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 전사체에 상보적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드(예컨대, 안티센스 RNA)의 도입; 5) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 사인-달가르노(Shine-Dalgarno) 서열 앞단에 사인-달가르노 서열과 상보적인 서열을 부가하여 2차 구조물을 형성시켜 리보솜(ribosome)의 부착을 불가능하게 만드는 방법; 6) 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 폴리뉴클레오티드 서열의 ORF(open reading frame)의 3' 말단에 반대 방향으로 전사되는 프로모터를 부가하는 방법(Reverse transcription engineering, RTE) 등이 있으며, 이들의 조합으로도 달성할 수 있으나, 이에, 특별히 제한되는 것은 아니다.

구체적으로, 상기 발현 조절 서열을 변형하는 방법은 당해 분야에 잘 알려진 다양한 방법의 적용으로 달성될 수 있다. 상기 방법의 예로, 상기 발현 조절 서열의 활성을 더욱 약화하도록 폴리뉴클레오티드 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 발현 조절 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열로 교체함으로써 수행할 수 있다. 상기 발현 조절서열에는 프로모터, 오퍼레이터 서열, 리보좀 결합부위를 암호화하는 서열, 및 전사와 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 유전자 서열을 변형하는 방법은 상기 효소의 활성을 더욱 약화하도록 유전자 서열을 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도하여 수행하거나, 더욱 약한 활성을 갖도록 개량된 유전자 서열 또는 활성이 없도록 개량된 유전자 서열로 교체함으로써 수행할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 단백질을 암호화하는 상기 유전자의 일부 또는 전체를 결실하는 방법은, 미생물 내 염색체 삽입용 벡터를 통해 염색체 내 내재적 목적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 일부 뉴클레오티드 서열이 결실된 폴리뉴클레오티드 또는 마커 유전자로 교체함으로써 수행될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 일부 또는 전체를 결실하는 방법의 일례로 상동 재조합에 의하여 폴리뉴클레오티드를 결실시키는 방법을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.

또한, 상기 유전자의 일부 또는 전체를 결손시키는 방법은 자외선과 같은 빛 또는 화학물질을 이용하여 돌연변이를 유발하고, 얻어진 돌연변이체로부터 목적 유전자가 결손된 균주를 선별하여 수행될 수 있다. 상기 유전자 결손 방법에는 DNA 재조합 기술에 의한 방법이 포함된다. 상기 DNA 재조합 기술에는 예를 들면, 목적 유전자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터를 상기 미생물에 주입하여 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나게 함으로써 이루어질 수 있다. 또한, 상기 주입되는 뉴클레오티드 서열 또는 벡터에는 우성 선별 마커를 포함할 수 있다.

본 출원에서 용어 "L-아르기닌을 생산하는 미생물" 또는 "L-아르기닌 생산능을 가지는 미생물"은 자연적으로 L-아르기닌 생산능을 가지고 있는 미생물 또는 L-아르기닌의 생산능이 없는 모균주에 L-아르기닌의 생산능이 부여된 미생물을 의미한다. 예를 들어, 상기 L-아르기닌의 생산능은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 활성을 불활성화 및/또는 L-아르기닌 생합성 효소를 암호화하는 유전자의 발현을 증진시켜 부여할 수 있다.

이때, L-아르기닌 생합성 효소의 예는 N-아세틸글루타밀 포스페이트 리덕타제(argC), 오르니틴 아세틸 트랜스퍼라제(argJ), N-아세틸글루타메이트 키나제(argB), 아세틸오르니틴 트랜스아미나제(argD), 오르니틴 카바모일 트랜스퍼라제(argF), 아르기니노숙신산 신테타제(argG), 아르기니노숙신산 리아제(argH), 및 카바모일 포스페이트 신테타제를 포함한다. 이들 아르기닌 생합성 효소는 Arg 오페론(argCJBDFRGH) 상에 존재하고 argR에 의해 암호화된 아르기닌 리프레서에 의해 조절된다(J Bacteriol. 2002Dec;184(23):6602-14.). 따라서, 아르기닌 리프레서의 약화(US2002-0045223), 또는 상기 생합성 관련 유전자들 중 하나 이상의 유전자를 과발현시킴으로써 L-아르기닌 생산 능력을 부여할 수 있다.

본 출원에서, 상기 L-아르기닌을 생산하는 미생물은, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 불활성화된 미생물로서, 본 출원의 목적상 상기 미생물은 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질이 불활성화되어 L-아르기닌을 생산할 수 있는 미생물이라면 모두 가능하다. 구체적 예로, 에스케리키아(Escherichia) 속, 세라티아(Serratia) 속, 어위니아(Erwinia) 속, 엔테로박테리아(Enterobacteria) 속, 살모넬라(Salmonella) 속, 스트렙토마이세스(Streptomyces) 속, 슈도모나스(Pseudomonas) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 또는 코리네박테리움(Corynebacterium) 속 등의 미생물 균주가 포함될 수 있으며, 구체적으로 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다. 본 출원의 목적상, 상기 미생물은 L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물일 수 있다.

상기 "L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물"은 천연형 또는 변이를 통하여 L-아르기닌 생산능을 가지고 있는 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다. 코리네박테리움 속 미생물이 L-아르기닌을 생산할 수 있음은 이미 알려져 있었으나, 이의 생산능이 현저히 낮으며 생산 기작에 작용하는 유전자나 기작 원리가 밝혀지지 않은 상태이다. 따라서, 본 출원의 L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물은 천연형 미생물 자체 또는 외부 L-아르기닌 생산 기작과 관련된 유전자의 활성을 강화시키거나 불활성시켜 향상된 L-아르기닌 생산능을 가지게 된 코리네박테리움 속 미생물을 의미한다.

본 출원에서 "코리네박테리움 속 미생물"은 모든 코리네박테리움 속 미생물을 포함할 수 있다. 구체적으로, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes), 코리네박테리움 써모아미노게네스(Corynebacterium thermoaminogenes), 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum), 코리네박테리움 이피시엔스(Corynebacterium efficiens), 코리네박테리움 마리스(Corynebacterium maris), 코리네박테리움 루비칸티스(Corynebacterium lubricantis), 코리네박테리움 두사넨스(Corynebacterium doosanense), 코리네박테리움 필로섬(Corynebacterium pilosum), 코리네박테리움 시스티디스(Corynebacterium cystitidis), 코리네박테리움 우테레키(Corynebacterium uterequi), 코리네박테리움 리날레(Corynebacterium renale) 또는 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum)일 수 있고, 더욱 구체적으로 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)일 수 있다.

본 출원은, 본 출원에 따른 상기 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 미생물 또는 배지로부터 L-아르기닌을 회수하는 단계를 포함하는, L-아르기닌 생산방법을 제공한다.

본 출원에 따른 상기 미생물은 앞서 설명한 바와 같다.

본 출원의 방법에 있어서, 코리네박테리움 속 미생물의 배양은 당업계에 알려진 임의의 배양 조건 및 배양 방법이 사용될 수 있다.

본 출원에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 출원에서 코리네박테리움 속 미생물을 이용하여 L-아르기닌을 배양하는 방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 구체적으로, 상기 배양은 배치 공정, 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

배양에 사용되는 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리움 균주에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981).

배지 중에서 사용될 수 있는 당원으로는 포도당, 사카로즈, 유당, 과당, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨을 함유하는 염이 포함될 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유할 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

상기 미생물의 배양 중 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물 내로 산소 또는 산소-함유 기체(예, 공기)를 주입할 수 있다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 구체적으로는 25℃ 내지 40℃일 수 있다. 배양 시간은 원하는 L-아미노산의 생성량이 얻어질 때까지 계속할 수 있으나, 구체적으로는, 10 내지 160시간일 수 있다.

본 출원의 방법에 있어서, 배양은 배치 공정, 주입 배치 및 반복 주입 배치 공정과 같은 연속식 또는 회분식으로 이루어질 수 있다. 이러한 배양방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자에 의해 선택되는 임의의 방법이 사용될 수 있다.

배양물로부터의 L-아르기닌의 분리는 당업계에 알려진 통상적인 방법에 의하여 분리될 수 있다. 이러한 분리방법에는, 원심분리, 여과, 이온교환 크로마토그래피 및 결정화 등의 방법이 이용될 수 있다. 예를 들면, 배양물을 저속 원심분리하여 바이오매스를 제거하고 얻어진 상등액을, 이온교환 크로마토그래피를 통하여 분리할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.

본 출원의 L-아르기닌을 생산하는 미생물은 L-아르기닌을 높은 효율로 생산할 수 있다. 또한, 제조된 L-아르기닌은 동물 사료 또는 동물 사료 첨가제뿐만 아니라 인간의 식품 또는 식품 첨가제, 의약품 등 다양한 제품에 응용될 수 있다.

이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 트랜스포존을 이용한 무작위적 돌연변이 라이브러리 제작

L-아르기닌 생산능이 증가된 균주를 얻기 위하여, 하기의 방법으로 벡터 라이브러리를 제작하였다.

먼저 EZ-Tn5™ <R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome™ Kit(Epicentre)를 사용하여 얻은 플라스미드를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P(대한민국 특허등록번호 0791659)를 모균주로 하여 전기펄스법(Appl. Microbiol. Biothcenol.(1999) 52:541-545)으로 형질전환하고, 카나마이신 (25 ㎎/ℓ)이 포함된 복합평판배지에 도말하여 약 20,000개의 콜로니를 확보하였다.

<복합평판배지 (pH 7.0)>

포도당 10 g, 펩톤 10 g, 쇠고기 추출물 5 g, 효모 추출물 5 g, 뇌심장 침출액(Brain Heart Infusion) 18.5 g, NaCl 2.5 g, 요소 2 g, 소르비톨 91 g, 한천 20 g (증류수 1 리터 기준)

실시예 2: 트랜스포존을 이용한 무작위적 돌연변이 라이브러리 스크리닝

상기 실시예 1에서 확보된 약 20,000개의 콜로니를 각각 300 ㎕의 하기의 선별배지에 접종하여 96 딥 웰 플레이트(96-deep well plate)에서 30℃, 1000 rpm으로 약 24시간 동안 배양하였다.

<선별배지 (pH 8.0)>

포도당 10 g, 5.5 g 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), MgSO₄7H₂O 1.2 g, KH₂PO₄ 0.8 g, K₂HPO₄ 16.4 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1 ㎎, 칼슘-판토텐산 2 ㎎, 니코틴아미드 2 ㎎ (증류수 1 리터 기준)

배양액에 생산된 L-아르기닌의 생산량을 분석하기 위하여 닌하이드린 방법을 이용하였다(Moore, S., Stein, W. H., Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem.1948, 176, 367-388).

배양이 완료된 후 배양 상층액 10 ㎕ 와 닌하이드린 반응용액 190 ㎕를 65℃에서 30분간 반응시킨 후, 파장 570 nm에서 분광 광도계(spectrophotometer)로 흡광도를 측정하고, 대조구인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 균주와 비교하여 높은 흡광도를 보이는 변이균주들로서 약 60여 종의 콜로니를 선별하였다. 그 외 콜로니들은 대조구로 이용된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 균주와 유사하거나 감소한 흡광도를 보임을 확인하였다.

상기 선별된 60여 종의 균주들을 상기와 동일한 방법으로 다시 배양한 후 닌하이드린 반응을 반복 수행하여, 결과적으로 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 균주 대비 L-아르기닌 생산능이 향상된 상위 10종의 돌연변이주를 선별하였다.

실시예 3: 선별된 무작위적 돌연변이주들의 L-아르기닌 생산능 분석

상기 실시예 2에서 선발한 10종의 돌연변이주들을 대상으로 L-아르기닌 생산능이 재현성있게 증가된 균주들을 최종 선별하기 위하여, 하기의 배지를 이용한 플라스크 배양을 실시하였다. 배양이 완료된 후 HPLC를 이용하여 배양액 내 L-아르기닌 농도를 분석하였고, 각 돌연변이주들의 L-아르기닌 생산 농도를 하기 표 1에 나타내었다.

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 6%, 황산암모늄 3%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.2%, CSL(옥수수 침지액) 1.5%, NaCl 1%, 효모 추출물 0.5%, 비오틴 100 ㎎/ℓ, CaCO₃ 3%, (증류수 1리터 기준).

선별한 무작위 돌연변이주 10종의 L-아르기닌 생산 농도

	균주	L-아르기닌(g/ℓ)
	균주	배치 1	배치 2	배치 3	평균
대조군	KCCM10741P	3	3.1	3.1	3.07
1	KCCM10741P/mt-1	2.8	3	2.7	2.83
2	KCCM10741P/mt-2	3.1	3	3.2	3.10
3	KCCM10741P/mt-3	3.3	3.2	3.4	3.30
4	KCCM10741P/mt-4	2.5	2.2	2.1	2.27
5	KCCM10741P/mt-5	2.9	3	3.2	3.03
6	KCCM10741P/mt-6	3.5	3.2	3.2	3.30
7	KCCM10741P/mt-7	3.2	3.3	3.3	3.27
8	KCCM10741P/mt-8	3.4	3	3.2	3.20
9	KCCM10741P/mt-9	2.7	2.7	3	2.80
10	KCCM10741P/mt-10	3.6	3.9	3.5	3.67

선별한 10종의 변이주들 중 L-아르기닌 생산능이 의미있게 향상된 균주로서 KCCM10741P/mt-10을 최종 선별하였다.

실시예 4: 최종 선별주에서의 L-아르기닌 생산능 증가 원인 규명

본 실시예에서는 상기 실시예 3으로부터 최종 선별된 돌연변이주를 대상으로 트랜스포존의 무작위적인 삽입에 의해 결손된 유전자를 동정하고자 하였다.

KCCM10741P/mt-10의 게놈 DNA를 추출하여 절단한 후 연결하여 대장균 DH5α에 형질전환하고, 카나마이신(25 ㎎/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다. 형질전환된 콜로니 20종을 선별한 후, 미지의 유전자 일부가 포함된 플라스미드를 획득하였고, EZ-Tn5™ <R6Kγori/KAN-2>Tnp Transposome™ Kit의 프라이머 1(서열번호 3) 및 프라이머 2(서열번호 4)를 사용하여 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 상기 결실되어 불활성화된 유전자는 서열번호 1의 아미노산 서열을 암호화하는 서열번호 2의 뉴클레오티드의 서열임을 확인하였다.

프라이머 1(서열번호 3): ACCTACAACAAAGCTCTCATCAACC

프라이머 2(서열번호 4): CTACCCTGTGGAACACCTACATCT

이에 따라, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 단백질의 불활성화 시에, L-아르기닌 생산능에 영향이 있는지 확인하기 위하여, 상기 유전자를 결손 후보 유전자로 선별하였다.

실시예 5: 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 결손을 위한 재조합 벡터 제작

본 실시예에서는 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 불활성화와 L-아르기닌 생산의 영향을 확인하기 위해서, 상기 실시예 4에서 선별된 상기 유전자를 코리네박테리움 L-아르기닌 생산균주 염색체 상에서 결손시키기 위한 재조합 플라스미드를 제작하였다.

먼저, 코리네박테리움 속 미생물의 염색체 상에서, 상기 유전자를 결손시킬 수 있는 재조합 벡터를 제작하기 위하여, 하기 표 2에 나타낸 바와 같은 프라이머 3 내지 6을 합성하였다.

사용된 프라이머	염기 서열
프라이머 3(서열번호 5)	CCGCTCGAGACATCGAAATCGTAAGGGTA
프라이머 4(서열번호 6)	CAGCATTGACAAGCAGTTCT
프라이머 5(서열번호 7)	AGAACTGCTTGTCAATGCTGGGCCCTTTCCCAGGTGGCAT
프라이머 6(서열번호 8)	CCGCTCGAGAAGGCCACCGCTGCAGACCG

구체적으로, 상기 유전자의 ORF 부위(서열번호 2)를 결손하기 위하여, 5' 말단과 3' 말단에 XhoI 제한효소 부위를 가지도록 프라이머 3(서열번호 5), 프라이머 4(서열번호 6), 프라이머 5(서열번호 7), 프라이머 6(서열번호 8)를 합성하였다. 상기 프라이머 3, 프라이머 4, 프라이머 5, 및 프라이머 6을 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 그 결과, 상기 유전자가 암호화하는 단백질이 암호화되는 부분의 앞부분과 뒷부분에 해당하는 DNA 단편들이 각각 500 bp씩 증폭됨을 확인하였다. 이때, PCR 조건은 변성 95℃에서 5분간 변성한 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 통해 수행하였다. 그 다음, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)에 XhoI 제한효소 처리 후 상기 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit(Clontech)를 사용하여 수행하였고, 이를 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25 ㎎/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.

PCR을 통해 상기 목적한 유전자가 삽입된 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-ΔRS1이라 명명하였다.

실시예 6: 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자가 결손된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P의 제작 및 이의 L-아르기닌 생산능 평가

대표적인 L-아르기닌 생산 코리네박테리움 속 균주인 KCCM10741P 균주를 기반으로, 상기 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자가 결손된 균주를 제작하고 이의 L-아르기닌 생산능을 평가하고자 하였다.

구체적으로, 상기 실시예 5에서 제작한 재조합 플라스미드 pDZ-△RS1을 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999).

이후, 4%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합을 하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주를 대상으로 프라이머 3과 프라이머 6을 이용하여 PCR법을 통하여 상기 유전자가 결손된 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 'KCCM10741P-RS1'이라 명명하였다.

L-아르기닌 생산능을 분석하기 위해 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 균주와 상기 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P-RS1 균주를 아래와 같은 방법으로 배양하였다.

하기의 종배지 25 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P와 실시예 6에서 제작된 균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P-RS1를 접종하고, 30℃에서 20시간 동안, 200 rpm으로 진탕 배양하였다. 그런 다음, 생산 배지 24 ㎖을 함유하는 250 ㎖ 코너-바플 플라스크에 1㎖의 종 배양액을 접종하고 30℃에서 72시간 동안, 200 rpm에서 진탕 배양하였다. 상기 종 배지와 생산 배지의 조성은 각각 하기와 같다.

<종배지 (pH 7.0)>

포도당 20 g, 펩톤 10 g, 효모추출물 5 g, 요소 1.5 g, KH₂PO₄ 4 g, K₂HPO₄ 8 g, MgSO₄·7H₂O 0.5 g, 바이오틴 100 ㎍, 티아민 HCl 1 ㎎, 칼슘-판토텐산 2 ㎎, 니코틴아미드 2 ㎎ (증류수 1 리터 기준)

<생산배지 (pH 7.0)>

포도당 6%, 황산암모늄 3%, 제1인산칼륨 0.1%, 황산마그네슘7수염 0.2%, CSL(옥수수 침지액) 1.5%, NaCl 1%, 효모 추출물 0.5%, 비오틴 100 mg/L (증류수 1리터 기준).

배양 종료 후 HPLC에 의해 L-아르기닌의 생산량을 측정하였고, 분석한 L-아르기닌의 농도를 하기 표 3에 나타내었다.

서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자가 결손된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P의 L-아르기닌 생산능 분석

균주	L-아르기닌(g/ℓ)
균주	배치 1	배치 2	배치 3	평균
KCCM10741P	3.0	3.1	3.1	3.06
KCCM10741P-RS1	3.8	3.9	3.8	3.83

상기 결과와 같이, L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P으로부터 상기 유전자를 결손시킨 KCCM10741P-RS1의 경우, 모균주 대비 L-아르기닌 생산능이 평균 25% 증가함을 확인하였다.

상기 KCCM10741P-RS1 균주를 CA06-2830으로 명명하고, 2017년 12월 15일자로 부다페스트조약하의 국제기탁기관인 한국미생물보존센터(Korea Culture Center of Microorganisms, KCCM)에 기탁하여 수탁번호 KCCM12187P를 부여 받았다.

따라서, 코리네박테리움 속 미생물에서 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 결손시킴으로써 L-아르기닌 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 7: 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자 약화를 위한 재조합 벡터 제작

코리네박테리움 속 균주의 염색체 상에서 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 약화시킬 수 있는 재조합 벡터의 제작을 위하여, 상기 유전자의 개시코돈을 ATG에서 TTG로 치환하여 약화시키도록 하였으며 이를 위한 단편을 제작하기 위하여 하기 표 4에 나타낸 바와 같은 프라이머 3, 및 프라이머 7 내지 9를 합성하였다.

유전자	사용된 프라이머	염기서열
서열번호 2	프라이머 3(서열번호 5)	CCGCTCGAGACATCGAAATCGTAAGGGTA
	프라이머 7(서열번호 9)	GATCCACAGTCCCAATATTCTCGCTTCTTC
	프라이머 8(서열번호 10)	GAAGAAGCGAGAATATTGGGACTGTGGATC
	프라이머 9(서열번호 11)	CCGCTCGAGCAGCATTGACAAGCAGTTCT

상기 유전자의 ORF 부위(서열번호 2)를 증폭하기 위하여, 5' 말단과 3' 말단에 XhoI 제한효소 부위를 가지도록 프라이머 3(서열번호 5), 프라이머 7(서열번호 9), 프라이머 8(서열번호 10), 프라이머 9(서열번호 11)를 합성하였다. 프라이머 3, 프라이머 7, 프라이머 8, 및 프라이머 9를 이용하여 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P의 염색체 DNA를 주형으로 하여 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건은 변성 95℃에서 5분간 변성 후, 94℃/30초 변성, 56℃/30초 어닐링, 72℃/1분 중합을 30회 반복한 후, 72℃에서 7분간 중합반응을 통해 수행하였다. 그 다음, 코리네박테리움 글루타미쿰 내에서 복제가 불가능한 pDZ 벡터(대한민국 특허 등록번호 제10-0924065호)를 XhoI 제한효소 처리 후 상기에서 수득한 PCR 산물을 퓨전 클로닝하였다. 퓨전 클로닝은 In-Fusion® HD Cloning Kit(Clontech)를 사용하여 수행하였고, 이를 대장균 DH5α에 형질전환하고 카나마이신(25 ㎎/ℓ)이 포함된 LB 고체배지에 도말하였다.

PCR을 통해 상기 목적한 유전자가 삽입된 플라스미드로 형질전환된 콜로니를 선별한 후, 플라스미드 추출법을 이용하여 플라스미드를 획득하였고, 이 플라스미드를 pDZ-ΔRS2라 명명하였다.

실시예 8: 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자가 약화된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P의 제작 및 이의 L-아르기닌 생산능 평가

상기 실시예 7에서 제작된 재조합 플라스미드 pDZ-△RS2를 염색체 상에서의 상동 재조합에 의해 L-아르기닌 생산균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P 에 형질전환시켰다(van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999).

이후, 4%의 수크로오스를 포함하는 고체평판배지에서 2차 재조합을 하였다. 2차 재조합이 완료된 상기 코리네박테리움 글루타미쿰 형질전환주를 대상으로 프라이머 3과 프라이머 9를 이용하여 염기서열을 분석하여 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 개시코돈이 TTG로 치환된 균주를 확인하였다. 상기 재조합 균주를 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P-RS2라 명명하였다.

L-아르기닌 생산능을 분석하기 위해 모균주인 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P와 상기 제작된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P-RS2 균주를 상기 실시예 6과 동일한 방법으로 배양한 후, HPLC를 이용하여 L-아르기닌의 생산량을 측정하였고, 분석한 L-아르기닌의 농도를 하기 표 5에 나타내었다.

서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자가 약화된 코리네박테리움 글루타미쿰 KCCM10741P의 L-아르기닌 생산능 분석

균주	L-아르기닌(g/ℓ)
균주	배치 1	배치 2	배치 3	평균
KCCM10741P	4.2	4.2	4.1	4.17
KCCM10741P-RS2	4.6	4.8	4.6	4.67

상기 결과와 같이, L-아르기닌 생산균주인 KCCM10741P을 대상으로 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자를 약화시켰을 경우, L-아르기닌 생산능이 평균 12% 증가함을 확인하였다.

따라서, 코리네박테리움 속 미생물에서 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자의 발현을 약화시킴으로써 L-아르기닌 생산능을 향상시킬 수 있음을 확인하였다.

상기 결과를 종합하면, 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 유전자가 결손 또는 약화된 균주는 L-아르기닌 생산능이 증가한다는 것을 알 수 있으며, 이는 미생물에서 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 활성을 불활성화시켜 L-아르기닌을 대량생산할 수 있다는 것을 시사하는 것이다.

이상의 설명으로부터, 본원이 속하는 기술분야의 당업자는 본원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

한국미생물보존센터(국외)

KCCM12187P

20171215

<110> CJ CheilJedang Corporation <120> A microorganism of corynebacterium genus having L-arginine productivity and method for producing L-arginine using the same <130> KPA171133-KR <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 356 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 Val Leu Leu Arg Ala Glu Glu Val Val Arg Gln Gly Gln Arg Gly Ile 1 5 10 15 Lys Leu His Val Glu Ala Gln His Glu His His His His Arg His Leu 20 25 30 Ser Thr Ile Lys Glu Leu Leu Val Asn Ala Asp Ile Pro Ala Gln Thr 35 40 45 Lys Gln Asp Ala Leu Gly Val Phe Glu Leu Ile Ala Ile Ala Glu Gly 50 55 60 Lys Val His Gly Ile Glu Pro Glu Lys Ile His Phe His Glu Val Gly 65 70 75 80 Ala Trp Asp Ser Ile Ala Asp Ile Val Gly Val Cys Glu Ala Ile Arg 85 90 95 Gln Leu Asn Pro Gly Leu Ile Ala Ala Ser Pro Ile Ala Leu Gly Phe 100 105 110 Gly Arg Ile Lys Ala Ala His Gly Asp Ile Pro Val Pro Val Pro Ala 115 120 125 Val Ala Glu Leu Val Lys Gly Trp Pro Thr Gln Thr Gly Ala Leu Met 130 135 140 Glu Ser Thr Glu Pro Val Gly Glu Leu Ala Thr Pro Thr Gly Val Ala 145 150 155 160 Leu Ile Arg His Phe Ala Thr Gln Asp Gly Pro Phe Pro Gly Gly Ile 165 170 175 Ile Asn Glu Val Gly Ile Gly Ala Gly Thr Lys Asp Thr Ala Gly Arg 180 185 190 Pro Asn Val Val Arg Ala Val Leu Phe Ser Thr Ser Gly Lys Ala Ala 195 200 205 Ser Asn Pro Asp Thr Arg Thr Leu Val Gln Leu Glu Ala Asn Val Asp 210 215 220 Asp Gln Asp Pro Arg Leu Trp Pro Gly Val Ile Glu Ser Leu Phe Ala 225 230 235 240 Ala Gly Ala Val Ala Ala Trp Leu Thr Pro Ile Leu Met Lys Lys Gly 245 250 255 Arg Pro Ala His Thr Val Ser Ala Leu Val Asp Ser Ser Glu Val Glu 260 265 270 Ala Val Lys Thr Ala Leu Phe Ala Ala Thr Thr Thr Phe Gly Val Arg 275 280 285 Ser Trp Glu Val Gln Arg Glu Gly Leu Asp Arg Arg Phe Glu Gln Val 290 295 300 Glu Val Asp Gly Arg Thr Ile Asn Ile Lys Ile Gly Ser Arg Asn Gly 305 310 315 320 His Asp Ile Ser Ala Gln Pro Glu Phe Glu Asp Ile Arg Ser Ala Ala 325 330 335 Val Ala Leu Gly Ile Ser Glu Arg Glu Val Val Ala Arg Ile Pro Gln 340 345 350 Gly Thr Thr Glu 355 <210> 2 <211> 1071 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 gtgcttttga gagcagaaga ggtagtgcgc caaggccaac gaggcatcaa actacatgta 60 gaagcacaac atgaacacca ccatcaccgc catttgagca ccattaaaga actgcttgtc 120 aatgctgaca tccctgcaca aaccaagcag gatgccttag gcgtttttga actcatcgct 180 atcgctgaag gaaaagtcca cggcatcgag ccggagaaaa tccacttcca tgaggtagga 240 gcttgggatt ccatcgcaga cattgtgggt gtgtgcgaag cgatcaggca gcttaaccca 300 ggtttgattg ctgcatctcc gattgcttta ggattcggac gcatcaaggc agctcacgga 360 gacattccag tgccagttcc agcagtggca gagctggtga aaggctggcc cacccaaacc 420 ggagctctta tggagagcac cgaacctgtt ggtgaattag ccaccccaac tggtgttgcg 480 ttgatccgtc actttgccac ccaagatggc cctttcccag gtggcatcat caatgaagtc 540 ggtatcggcg caggaactaa ggacaccgca gggcgtccca atgtggtgcg cgcggtcctg 600 ttcagcacct ccggtaaggc tgcctcaaac ccagacaccc gtaccctcgt gcaattggaa 660 gccaacgttg atgatcaaga cccacggctg tggccaggag taatagagag cctctttgcc 720 gctggcgcag tagctgcatg gctgactcca attttgatga agaagggccg tcctgcacat 780 acggtgtcag cattggtgga tagctccgag gtggaagcag tgaaaaccgc attatttgca 840 gccaccacga cttttggggt cagatcatgg gaagtccagc gagaagggtt ggatcgtcgt 900 ttcgaacaag tcgaggtgga cggacgcacc atcaacatca agattggctc ccgaaatggc 960 cacgacatca gtgcacagcc cgagtttgaa gatattcggt ctgcagcggt ggccttggga 1020 atttcagaga gggaagttgt ggcaagaatt ccgcaaggca ccactgagta a 1071 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 <400> 3 acctacaaca aagctctcat caacc 25 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 <400> 4 ctaccctgtg gaacacctac atct 24 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 <400> 5 ccgctcgaga catcgaaatc gtaagggta 29 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 <400> 6 cagcattgac aagcagttct 20 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 <400> 7 agaactgctt gtcaatgctg ggccctttcc caggtggcat 40 <210> 8 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 <400> 8 ccgctcgaga aggccaccgc tgcagaccg 29 <210> 9 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7 <400> 9 gatccacagt cccaatattc tcgcttcttc 30 <210> 10 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 8 <400> 10 gaagaagcga gaatattggg actgtggatc 30 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 9 <400> 11 ccgctcgagc agcattgaca agcagttct 29

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질이 불활성화된, L-아르기닌을 생산하는 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,
상기 단백질은 서열번호 2의 염기서열로 이루어지는 유전자에 의해 코딩되는, 코리네박테리움 속 미생물.
제1항에 있어서,
상기 미생물은 코리네박테리움 글루타미쿰인, 코리네박테리움 속 미생물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 미생물을 배지에서 배양하는 단계; 및
상기 미생물 또는 배지로부터 L-아르기닌을 회수하는 단계를 포함하는, L-아르기닌을 생산하는 방법.