KR101998410B1

KR101998410B1 - 점진적인 무기물 농도를 갖는 이중층 구조의 조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR101998410B1
Application number: KR1020120091789A
Authority: KR
Inventors: 최성욱; 백동현; 문승관; 이혜리; 송해룡; 박종훈; 김성은
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2012-08-22
Filing date: 2012-08-22
Publication date: 2019-07-09
Anticipated expiration: 2032-08-22
Also published as: KR20140025221A

Abstract

본 발명은 뼈와 근육 사이의 세포들이 안착하고 증식하여 자랄 수 있는 점진적인 미네랄 농도를 갖는 이중층 구조의 조직 재생용 지지체 및 이러한 지지체의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 이중층 구조를 갖는 조직 재생용 지지체는 뼈와 근육사이의 세포들이 효과적으로 안착 및 증식할 수 있는 효과가 있으며, 뼈와 뼈, 뼈와 근육 사이의 결합을 촉진하여 손상된 조직을 효과적으로 재생시킬 수 있다. 또한, 간편한 수술과정에 의해 생체 내 이식이 가능하여 보다 빠르고 안정적으로 치료할 수 있으며, 천연물질을 사용하므로 인체에 무해하다.

Description

점진적인 무기물 농도를 갖는 이중층 구조의 조직 재생용 지지체 및 이의 제조방법{Scaffolds having double layer structure with gradient mineral concentration for tissue regeneration and preparation method thereof}

본 발명은 뼈와 근육 사이의 세포들이 안착하고 증식하여 자랄 수 있는 점진적인 무기물 농도를 갖는 이중층 구조의 조직 재생용 지지체 및 이러한 지지체의 제조방법에 관한 것이다.

지지체에 세포의 접착이 잘 일어날 뿐만 아니라 세포와 세포 사이에 충분한 공간이 확보되어 체액의 확산에 의해 산소나 영양분의 공급이 잘 일어나고 또 신생 혈관 형성도 원활히 이루어져서 성공적으로 세포가 성장, 분화할 수 있는 구조를 말한다. 기본적으로 세포는 2차원적인 배양이 이루어지는데 이를 조직이나 장기의 형태로 배양하기 위해서는 3차원의 지지체가 필요하다. 이러한 지지체는 수많은 기공을 가지고 있어 세포들이 내 외부에 부착할 수 있어야 하며 세포의 성장에 필요한 양분을 공급받고 노폐물을 배출하기 위해 열린 구조를 가져야 한다. 즉 다공성의 3차원 지지체가 필요한 것이다.

따라서 상기 기본적 요건을 만족하는 지지체로는 동물 체내의 세포외 기질과 유사한 것이 적합하며, 상기 세포외 기질과 같은 다공성을 가진 지지체를 제조하는 방법이 연구되어 왔다. 대표적인 방법으로 입자 침출법(particulate leaching), 유화동결 건조법(emulsion freeze-drying), 고압기체 팽창법(high pressure gas expansion), 상분리법(phase separation), 전기방사법(electrospining)이 있다.

또한, 이러한 지지체는 생체적합성이 있어야 하며, 세포는 조직 또는 기관의 등가물을 형성하기 위하여 지지체 상에 부착되고 증식할 수 있어야 한다. 따라서, 상기 지지체는 시험관내 또는 생체 내에서 세포 성장을 위한 기질로서 고려될 수 있으며, 이러한 특성을 갖는 지지체를 제조하기 위해 생분해성 고분자 물질을 사용하는 기술이 많이 활용되고 있다(대한민국 등록특허 제654,329호, 대한민국 특허출원 제20110-0066563호).

전술한 다공성 구조를 가지는 생분해성 고분자로 이루어진 지지체에 이식되는 조직세포는 계속적인 성장에 의하여 일련의 조직을 형성하게 되는데, 일반적인 생체조직의 재생은 재생하고자 하는 생체조직 형태로 지지체 모양을 제조한 후, 상기 지지체 내부에 조직세포를 이식하고, 이식된 조직세포를 성장시키는 방법을 이용하고 있다. 그러나 이러한 방법은 영양분 및 산소가 지지체의 내부 안쪽으로 용이하게 전달되지 못하고, 세포조직의 성장이 균일하지 않으며, 설령 지지체의 두께가 매우 얇다 하여도 그 중심부까지 조직세포가 성장하는 것이 어렵다는 문제점 등이 있다.

한편, 오늘날 슬관절, 팔의 관절, 족관절의 근육, 인대를 재건 수술하는 사례가 증가하고 있다. 현재 찢어지고, 끊어지거나 이와 달리 손상된 근육을 치료하는 가장 보편적인 방법은 근육의 끊어진 단부를 접근시켜, 근육의 한측을 다른 한측에 봉합시킴으로써, 근육을 자신의 원래 위치로 복귀시키는 것이다. 그러나 지금의 치료법은 뼈와 근육 사이의 결합이 정상적으로 되지 않아 재파열의 빈도가 매우 높으며 치료 기간도 오래 걸린다는 단점을 가지고 있다.

따라서, 뼈와 근육 사이의 결합을 촉진하고, 손상된 조직의 재생에 유용한 생체적합성 다공성 지지체에 대해 여전히 요구되고 있다.

대한민국 등록특허 제654,329호 대한민국 특허출원 제20110-0066563호

이에 본 발명자들은 미네랄 성분이 점진적으로 분포한 지지체는 뼈와 근육 사이의 세포들이 안착하고 증식하여 자랄 수 있는 이중적인 구조의 지지체로서 이를 이식하여 힘줄(Tendon), 인대(ligament) 등의 뼈와 뼈, 뼈와 근육 사이의 결합을 촉진함으로써 보다 빠르고 안정적으로 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 뼈와 뼈, 뼈와 근육 사이의 결합을 촉진하여 손상된 조직을 효과적으로 재생시킬 수 있는 생체적합성 고분자로 이루어진 상부층과 미네랄 성분이 점진적으로 분포한 생체적합성 고분자로 이루어진 하부층을 포함하는 이중층 구조를 갖는 조직 재생용 지지체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상술한 조직 재생용 지지체의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체적합성 고분자로 이루어지고 인대 또는 근육과 닿는 부위인 상부층; 및 생체적합성 고분자와 미네랄 성분으로 이루어지고 뼈와 닿는 부위로써, 미네랄 성분이 뼈와 닿는 부분에 더 많이 함유되도록 점진적인 미네랄 농도를 갖는 하부층으로 이루어진 이중층 구조를 갖는 조직 재생용 지지체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생체적합성 고분자는 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미네랄 성분은 하이드록시아파타이트(HA), 불소화 아파타이트, 트리칼슘포스페이트(TCP), 인산일칼슘, 인산삼칼슘, 인산사칼슘, 육인산사칼슘, 탄산칼슘 및 결정화 유리로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 상부층은 라미닌, 도파민, 피브로넥틴, 및 FGF로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 근육 또는 인대의 재생 촉진 물질을 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 하부층은 BMP-2, IGF, TGFβ 및 알렌드로네이트(Alendronate)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상의 골 재생 촉진 물질을 더 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 하부층에 포함되는 미네랄 성분은 생체적합성 고분자 중량 대비 0.1 ~ 100 중량% 함유하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은,

(a) 생체적합성 고분자, 미네랄 성분 및 유기용매를 혼합하여 고분자 용액을 제조하는 단계; (b) 상기 (a)단계에서 얻은 고분자 용액을 원심분리하여 고분자 용액에서 미네랄 성분이 점진적으로 분포할 수 있도록 형성하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 얻은 고분자 용액을 전기 방사하여 미네랄 성분의 농도가 점진적으로 분포한 지지체를 제조하는 단계를 포함하는 이중층 구조를 갖는 조직 재생용 지지체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (c)단계의 전기방사는 7.5 ~ 30kV의 적용전압에서 주사바늘기를 이용하여 방사부와 적층부 간의 거리를 3.0 ~ 15cm로 이격하고, 고분자 용액의 유속을 분당 0.0001 ~ 1㎖로 하여 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 점진적인 무기물 농도를 갖는 이중층 구조의 조직 재생용 지지체는 뼈와 근육사이의 세포들이 효과적으로 안착 및 증식할 수 있는 효과가 있으며, 뼈와 뼈, 뼈와 근육 사이의 결합을 촉진하여 손상된 조직을 효과적으로 재생시킬 수 있다. 또한, 간편한 수술과정에 의해 생체 내 이식이 가능하여 보다 빠르고 안정적으로 치료할 수 있으며, 천연물질을 사용하므로 인체에 무해하다.

나아가, 지지체의 상부층에는 골 재생 촉진물질이 함유되어 골 형성을 유도하고, 하부층에는 인대 또는 근육 재생 촉진물질이 함유되어 인대 또는 근육의 형성을 촉진함으로써 치료효과를 상승시킬 수 있다.

도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 점진적인 무기물 농도를 갖는 이중층 구조의 조직 재생용 지지체를 제조하는 과정을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 점진적인 무기물 농도를 갖는 이중층 구조의 조직 재생용 지지체의 SEM(Scanning Electronic Microscope)사진을 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 조직 재생용 지지체의 층별 Ca 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 뼈와 뼈, 뼈와 근육사이의 결합을 효과적으로 촉진시킬 수 있는 점진적인 무기물 농도를 갖는 이중층 구조의 조직 재생용 지지체에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 하부층은 뼈와 닿는 부위로서 생체적합성 고분자와 미네랄 성분으로 이루어지고 미네랄 성분이 뼈쪽에 더 많이 분포하도록 점진적인(Gradient) 미네랄 농도 분포도를 보이도록 구성되어 있으며, 상부층은 근육 또는 인대가 닿는 부위로 생체적합성 고분자로 구성되어 있다는 점에 특징이 있다.

“조직공학”은 일반적으로 이식에 적합한 지지체 상에 또는 내에 세포를 파종하여 조직 또는 기관의 등가물을 제조하는 것으로서 정의된다. 일반적으로, 대부분의 조직들은 계층적인 여러 가지 세포로 구성되어있으며, 분리시켰을 때 많은 세포들이 작은 규모에서 본래의 형태를 다시 형성할 수 있지만 그 세포들은 큰 형태를 이루기 위해 보조 지지체를 필요로 한다. 이러한 보조 지지체는 생체 내에서나 외에서나 세포를 모아 점착시킬 수 있어야하고 조직으로 발전시키기 위한 잠재적 장소가 되어야하며 점착된 세포들과 주변의 숙주 세포들이 새로운 조직을 형성할 수 있도록 해주어야 하는 특성을 충분히 발휘할 수 있어야 한다.

“지지체”는 스캐폴드(Scaffold)라고도 하며, 조직 세포의 체외 배양과 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체 및 점착 기질을 칭하는 것으로, 이러한 지지체는 인체조직 재생을 위한 세포 이식에 사용되고 있으며, 또한 세포의 대량배양 및 증식에 있어서 그 중요성은 매우 높다. 그 이유는 줄기세포 또는 생검으로부터 얻은 세포들이 환자들에게 보다 효과적으로 사용되기 위해서는 체외에서 가능한 많은 수의 세포가 얻어져야 함은 물론 새로운 자기유래의 조직으로 분화가 이루어져야 하는데, 지지체의 사용은 이들을 가능하게 할 수 있는 유일한 방법이기 때문이다.

인체 조직의 재생을 위해 사용되는 지지체 재료의 주된 요건으로는 조직세포가 재료 표면에 유착하여 3차원적 구조를 가진 조직을 형성할 수 있도록 기질 또는 틀의 역할을 충분히 해내야 하고, 이식된 세포와 숙주 세포 사이에 위치하는 벽으로서의 역할도 담당해야 하는데, 이는 이식 후 혈액응고나 염증반응이 일어나지 않는 무독성의 생체적합성이 있어야 함을 의미한다. 또한, 이식된 세포가 충분히 조직으로서 본연의 기능과 역할을 수행하게 되면 원하는 시간에 따라 생체 내에서 완전히 분해되어 사라질 수 있는 생분해성을 지녀야 한다.

이상적인 생체적합성 지지체의 속성에는 시험관내 또는 생체 내에서 세포 성장을 지지하는 능력, 다양한 범위의 세포 유형 또는 계통의 성장을 지지하는 능력, 요구되는 유연성 또는 경직성의 다양한 수준을 갖는 능력, 다양한 수준의 생분해성을 갖는 능력, 2차 손상을 유발하지 않고 생체 내에서 목적하는 부위로 도입되는 능력, 및 원하는 작용 부위로 약물, 세포 및/또는 생활성 물질의 운반을 위한 저장소 또는 담체로서 제공되는 능력이 포함되어야 한다. 또한, 뼈 조직 공학을 위한 지지체는 세포 부착, 증식, 조직 성장 및 적절한 영양분 공급을 수행할 수 있는 생물학적 환경을 조성하기 위해 높은 다공성과 상호 연결된 기공 구조가 필수적이다.

이러한 요구를 가장 잘 충족하는 것으로 생분해성 고분자를 들 수 있다. 생분해성 고분자는 정해진 크기나 모양으로 조직을 재생할 수 있는 능력이 있고, 생체 내에서나 생체 외에서 세포의 점착과 확장을 위한 임시적인 장소를 제공해주기에 세포증식 및 세포분화를 위한 합성 세포외 기질로 사용하기에 좋은 물질이다.

이에 본 발명자들은 생분해성 고분자를 포함하는 상부층 및 생분해성 고분자와 미네랄 물질을 포함하는 하부층의 이중층 구조를 갖되, 미네랄 성분이 뼈쪽에 더 많이 분포하도록 점진적인(Gradient) 미네랄 농도 분포도를 보이도록 구성된 지지체를 제조하였다.

본 발명의 일실시예에 따르며, 이중층 구조의 지지체를 회전근 개 파열로 인해 뼈와 근육이 탈리되어 손상된 부위에 이식하고 골건 봉합술을 수행한 결과, 지지체의 상부층은 골 형성을 유도하고, 하부층은 인대 및 근육의 형성을 촉진함에 따라 뼈와 뼈, 뼈와 근육 사이의 결합을 촉진시켜 빠르고 안정적으로 치료할 수 있다는 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 생체적합성 고분자로 이루어지고 인대 또는 근육과 닿는 부위인 상부층; 및 생체적합성 고분자와 미네랄 성분으로 이루어지고 뼈와 닿는 부위로써, 미네랄 성분이 뼈와 닿는 부분에 더 많이 함유되도록 점진적인 미네랄 농도를 갖는 하부층으로 이루어진 이중층 구조를 갖는 조직 재생용 지지체를 제공한다.

미네랄 성분의 점진적인 농도 분포는 원심분리기를 이용하여 고분자 용액에서 미네랄 성분이 점진적으로(gradient) 분포할 수 있도록 한 후, 전기방사를 이용하여 제조한다는 점에 특징이 있다.

본 발명에 있어서 상기 “생체적합성”은 생체조직 또는 혈액과 접촉하여 조직을 괴사시키거나 혈액을 응고시키지 않는 조직적합성 및 혈액적합성을 의미하며, “생체적합성 고분자”란 이러한 생체적합성을 갖추고 있는 고분자를 의미한다.

상기 생체적합성 고분자는 일정 기간 후 체내에서 자발적으로 분해되는 것으로, 조직세포의 유착과 증식이 잘 일어나고 분화된 세포의 기능이 보전되며 체내 이식 후에도 주위 조직과 잘 융화되어 염증 반응을 유발하지 않아야 한다.

본 발명에서 이러한 생체적합성 고분자로는 체내에서 분해될 수 있는 무독성 고분자라면 제한없이 사용할 수 있는데, 예를 들어 콜라겐(collagen), 젤라틴(gelatin), 키토산(chitosan), 알지네이트 (Alginate), 히알루론산(hyaluronic acid), 덱스트란(dextran), 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 폴리락트산-글리콜산공중합체(PLGA), 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 폴리안하이드리드(polyanhydrides), 폴리오르토에스테르(polyorthoesters), 폴리비닐알콜(polyviniyalcohol), 폴리에틸렌글리콜(polyethyleneglycol), 폴리우레탄(polyurethane), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드, 폴리(에틸렌옥사이드)-폴리(프로필렌옥사이드)-폴리(에틸렌옥사이드) 공중합체, 이들의 공중합체 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 상기 생체적합성 고분자는 중량평균 분자량이 5,000 내지 2,000,000, 보다 바람직하게는 70,000 내지 90,000 범위인 것을 사용할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 미네랄 성분은 생체 적합성(biocompatibility)과 생체친화성(bioaffinity)이 우수한 것으로, 인산칼슘계 물질을 사용할 수 있으며, 예를 들어 하이드록시아파타이트(HA), 불소화 아파타이트, 트리칼슘포스페이트(TCP), 인산일칼슘, 인산삼칼슘, 인산사칼슘, 육인산사칼슘, 탄산칼슘 및 결정화 유리로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용할 수 있다. 하부층에 포함되는 미네랄 성분은 생체적합성 고분자 중량에 대하여 0.1 ~ 100 중량%로 함유되도록 한다.

또한, 본 발명에 따른 이중층 구조의 지지체의 상부층에는 뼈의 재생을 돕는 성분이나 약물을 더 함유할 수 있으며, 하부층에는 근육 또는 인대의 재생을 돕는 성분이나 약물을 더 함유할 수 있다. 이를 통해 뼈와 결합되는 상부층은 골 형성을 유도하며, 하부층은 인대 및 근육의 형성을 촉진하는 특징적인 구조를 갖게 된다.

상부층에 포함되는 근육 또는 인대의 재생 촉진 물질로는 라미닌, 도파민, 피브로넥틴, 및 FGF로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있으며, 하부층에 포함되는 골 재생 촉진 물질로는 BMP-2, IGF, TGFβ 및 알렌드로네이트(Alendronate)로 이루어진 그룹에서 선택된 어느 하나 이상을 사용할 수 있다.

나아가 본 발명에 따른 은 항균성 부여를 위해 항생제를 추가로 포함할 수도 있다. 항생제는 당업계에 세균의 생육과 활성을 저지 또는 억제할 수 있다고 알려진 것이라면 어느 것이나 사용할 수 있으며, 대표적인 예로는 암피실린(ampicillin), 젠타마이신(gentamicin), 메틸파라벤(methyl paraben), 에틸파라벤(ethyl paraben), 페니실린(penicillin), 세팔로스포린(cephalosporin), 모노박탐(monobactam), 카바페넴(carbapenem), 아미노글리코사이드(aminoglycoside), 마크롤라이드(macrolide), 테트라사이클린(tetracycline), 클로르암페니콜(chloramphnicol), 퀴놀론(quinolone), 반코마이신(vancomycin), 테이코플라닌(teicoplanin), 린코사미드(lincosamide), 메트로니다졸(metronidazole), 설폰아미드(sulfonamide), 트리메소프림(trimethoprim) 및 이들의 염이 포함되고, 이들은 단독으로 또는 2종 이상의 혼합물 형태로 사용될 수 있다. 이때 항생제는 각 항생제가 표적으로 하는 세균의 생육 및 활성을 저지하거나 억제하는데 최적으로 알려진 농도로 사용할 수 있다.

한편, 본 발명은 점진적인 무기물(미네랄) 농도를 갖는 이중층 구조의 조직 재생용 지지체의 제조방법을 제공하는데, 구체적으로, (a) 생체적합성 고분자, 미네랄 성분 및 유기용매를 혼합하여 고분자 용액을 제조하는 단계;(b) 상기 (a)단계에서 얻은 고분자 용액을 원심분리하여 고분자 용액에서 미네랄 성분이 점진적으로 분포할 수 있도록 형성하는 단계; 및 (c) 상기 (b)단계에서 얻은 고분자 용액을 전기 방사하여 미네랄 성분의 농도가 점진적으로 분포한 지지체를 제조하는 단계를 포함한다.

먼저 생체적합성 고분자, 미네랄 성분 및 유기용매를 혼합하여 고분자 용액을 제조한다. 고분자 용액을 제조할 때, 본 발명에 사용되는 유기용매로는 고분자의 종류에 따라 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 사염화탄소, 아세톤, 다이옥산, 테트라하이드로퓨란 등을 사용할 수 있다.

다음으로 고분자 용액에서 미네랄 성분이 점진적으로 분포하도록 하는데, 본 발명에서는 고분자 용액을 원심분리하여 미네랄 성분이 점진적으로 분포할 수 있도록 형성한다.

마지막으로 미네랄 성분이 점진적으로 분포한 지지체를 제조한다. 여기서 전기방사는 7.5 ~ 30kV의 적용전압에서 주사바늘기를 이용하여 방사부와 적층부 간의 거리를 7.5 ~ 15cm로 이격하고, 고분자 용액의 유속을 분당 0.001 ~ 1㎖로 하여 수행할 수 있다.

본 발명에 따른 지지체는 뼈와 근육 사이의 세포들이 안착하고 증식하여 자랄 수 있는 이중적인 구조의 지지체로서, 이를 이식하는 경우 힘줄(Tendon), 인대(ligament) 등의 뼈와 뼈, 뼈와 근육 사이의 결합을 촉진함으로써 보다 빠르고 안정적으로 치료하는데 유용하게 적용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

<1-1> 하부층용 고분자 섬유 지지체의 제조

단계 1: 트리칼슘포스페이트 ( TCP ) 고분자 용액의 제조

트리칼슘포스페이트 분말(Alfa Aesar, 36731) 0.5g과 폴리(ε-카프로락톤)(PCL)(Sigma- Adlich, 440744-500G, Mn 70,000 ~ 90,000) 3g을 클로로포름(Sigma-Aldrich, 288306-2L) 20g에 용해시켜 트리칼슘포스페이트 고분자 용액을 제조하였다.

단계 2: 고분자 용액 속 트리칼슘포스페이트의 점진적인 분포

상기 단계 1에서 얻은 고분자 용액을 원심분리기를 이용하여 트리칼슘포스페이트가 고분자 용액에서 점진적으로 분포할 수 있도록 하였다.

단계 3 : 고분자 섬유 지지체의 제조

상기 단계 2에서 얻은 고분자 용액을 전기방사장치를 이용하여 7.5~30 kV의 적용전압, 1.2 mm의 직경을 갖는 주사기바늘을 이용하여 방사부와 적층부 간의 거리를 7.5~15 cm로 이격하고, 고분자 용액의 유속을 분당 0.01~1 ml로 하여 트리칼슘포스페이트가 점진적으로 분포한 지지체를 제조하였다.

<1-2> 상부층용 고분자 용액의 제조

콜라겐과 라미닌을 함유하는 상부층용 고분자 수용액을 제조하였다.

<1-3> 이중층 구조의 조직 재생용 지지체의 제조

상기 <1-1>에서 제조된 하부층용 고분자 섬유 지지체 상에 상부층용 고분자 용액을 부은 다음 동결시켰다. 동결된 지지체를 충분히 건조하여 이중층 구조를 갖는 지지체를 제조하였다(도 2 참조).

< 실시예 2>

지지체의 미네랄 성분 함량 측정

본 발명에 따른 지지체의 미네랄 성분 함량을 측정한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 하부층의 맨 아래층에는 무기물 Ca 함량이 많으며 위층으로 갈수록 Ca 함량이 감소하는 것으로 나타났다.

이러한 결과를 통해 본 발명의 이중층 구조의 지지체의 하부층에서 생체적합성 고분자 내에 미네랄 성분이 뼈와 닿는 부분에 더 많이 함유되도록 점진적으로 분포되어 있는 것을 확인하였다.

< 실시예 3>

지지체의 세포 테스트

본 발명자들은 이중층에서 한쪽은 골형성을 잘 유도하고, 한쪽은 근육이나 인대 재생을 촉진한다는 것을 세포 실험을 통하여 확인하였다.

우선, PCL 용액과 HAp-PCL 용액을 각각 전기방사하여 이를 PCL 지지체와 HAp-PCL 지지체로 만든 다음 모양 틀을 이용하여 직경 5mm의 원형 지지체를 각각 제조하였다.

osteoblast인 MG63 세포를 media를 채워둔 Spiner culture flask에 분산(suspension)시켰다. 이후, PCL 지지체와 HAp-PCL 지지체를 Spiner culture flask에 각각 넣어 150rpm, 2시간 동안 지지체에 MG63 세포를 seeding하였다.

seeding한 지지체를 24 웰 플레이트에 넣고(한 웰당 3개의 지지체, media 1ml), 하루 동안 안정화시켰다. 각각의 웰에 들어있는 media를 blastmedia(골세포분화유도 media)로 교체하였다.

다음날부터 1,7,21일 간격으로 MTT와 ALP 활성을 측정하였다.

<3-1> MTT 분석

생세포수를 측정하기 위하여, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)- 2,5-diphenyltetrazolium bromide)는 담황색의 기질로서, 생세포의 미토콘드리아 내의 호흡쇄효소에 의해 개열하고 암청색의 formazan을 생성한다. 사멸세포에서는 이러한 반응이 일어나지 않는다. 생성한 formazan을 0.04N HCl-isopropanol 용액을 사용하여 세포 중에서 추출하여 450nm의 흡광도에서 정량한다.

웰에 있는 지지체를 새로운 media로 세척한 후 다른 24웰 플레이트에 옮겼다. 지지체가 들어있는 각 웰당 blastmedia 500ul를 넣고 MTT시약 50ul 넣은 후, 1시간 30분 반응 후 sup.을 96웰 플레이트로 옮겼다. 그리고 ELISA로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.

MTT 활성을 측정한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, osteoblast 세포가 PCL보다는 HAp-PCL에서 잘 자라는 것으로 나타났다.

<3-2> ALP 분석

Bone-specific alkaline phosphatase는 osteoblast cell 표면에서 관찰되어지는 tetrameric glycoprotein이다. Osteoblast는 뼈 형성에 관여하므로 혈청 내의 bone-specific alkaline phosphatase를 측정하여 뼈 대사의 유무를 확인할 수 있는 방법이다. 골모세포의 분화는 총 단백질 함유량에 ALP(Alkaline phosphatase) 활성을 측정함으로써 평가한다.

웰에 있는 지지체를 새로운 media로 세척한 후, 각각의 ep-tube에 지지체 3개씩을 -20℃에서 냉동보관하였다(1, 7, 21일 차 데이터를 한번에 ALP 활성을 측정함으로써 정확도를 높인다.)

Cell lysis buffer 65ul를 ep-tube에 넣고 voltexing하고, 세포가 다 파괴될 때까지 pipetting하였다. 이후 얼음에 30분간 놔두고, centrifuge. Max(13000rpm) 4℃로 10분간 돌린 후 상등액(sup.)을 얻는다.

ALP 샘플은 상등액 50ul에 PNPP를 50ul 넣어준 후, 37℃에서 30분간 배양한 다음 3N NaOH 50ul 넣어서 PNPP의 반응을 중지시켰다. 이후, 96웰 플레이트에 100ul씩 넣고 405nm에서 측정하였다.

단백질 샘플은 상등액 2ul를 DW 800ul에 넣은 후 protein assay 시약 200ul를 첨가한다. 이후, 96웰 플레이트에 200ul씩 3번 넣고 595nm에서 측정하였다..

측정한 값을 ALP 활성 값으로 계산하였다.

ALP 분석 결과 도 5에 나타낸 바와 같이, osteoblast가 PCL보다는 HAp-PCL에서 골분화가 더 잘된다는 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
삭제
(a) 생체적합성 고분자로서 폴리-ε-(카프로락톤)(PCL), 미네랄 성분으로서 트리칼슘포스페이트(TCP) 및 유기용매를 혼합하여 고분자 용액을 제조하는 단계;
(b) 상기 (a)단계에서 얻은 고분자 용액을 원심분리하여 고분자 용액에서 미네랄 성분이 점진적으로 분포할 수 있도록 형성하는 단계; 및
(c) 상기 (b)단계에서 얻은 고분자 용액을 전기 방사하여 미네랄 성분의 농도가 점진적으로 분포한 지지체를 제조하는 단계를 포함하는 이중층 구조의 조직 재생용 조성물의 제조 방법.
제7항에 있어서,
상기 (c)단계의 전기방사는 7.5 ~ 30kV의 적용전압에서 주사바늘기를 이용하여 방사부와 적층부 간의 거리를 3.0 ~ 15cm로 이격하고, 고분자 용액의 유속을 분당 0.0001 ~ 1㎖로 하여 수행하는 것인, 이중층 구조의 조직 재생용 조성물의 제조방법.