KR101992356B1

KR101992356B1 - 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물

Info

Publication number: KR101992356B1
Application number: KR1020177026056A
Authority: KR
Inventors: 정병선; 김정애; 이현지; 남태규; 이상열
Original assignee: 영남대학교 산학협력단; 한양대학교 에리카산학협력단
Priority date: 2015-03-23
Filing date: 2015-03-23
Publication date: 2019-06-24
Anticipated expiration: 2035-03-23
Also published as: KR20170122770A; WO2016153087A1

Abstract

본 발명은 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 이를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것으로, 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염은 융모요막 모델에서의 신생혈관형성 억제 효과가 탁월하여, 황반변성 또는 관절염 등과 같은 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 암 전이 및 침윤에 중요한 역할을 수행하는 카텝신 S의 활성을 억제하므로, 암 예방 또는 치료용 약제, 암 성장 억제 및 암 전이 억제용 약제로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물

본 발명은 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염, 이를 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물, 암 예방 또는 치료용 약학조성물, 및 암 침윤 또는 암 전이의 예방 또는 억제용 약학조성물에 관한 것이다.

혈관신생(angiogenesis)이란 기존의 미세혈관으로부터 새로운 모세혈관이 형성되는 과정이다. 혈관신생이 정상적으로 일어나는 경우는 배아 발생(embryonic development), 조직재생 및 상처치료, 주기적인 여성의 생식기 계통의 변화인 황체가 발달될 때이며 이러한 경우에도 엄격히 조절되어 진행된다.

성인의 경우 혈관내피세포는 매우 느리게 자라며, 다른 종류의 세포에 비하여 상대적으로 잘 분열하지 않는다.

혈관신생이 일어나는 과정은 일반적으로 혈관신생 촉진인자의 자극에 의하여 프로테아제로 인한 혈관 기저막의 분해, 혈관 내피세포의 이동, 증식 및 혈관 내피세포 분화에 의한 관강의 형성으로 혈관이 재구성되어 새로운 모세혈관이 생성되는 것으로 이루어진다.

그러나 혈관신생이 자율적으로 조절되지 못하고 병적으로 성장함으로써 야기되는 질환들이 있다. 특히 암의 경우 혈관신생은 암세포의 성장과 전이에 중요한 역할을 한다. 종양은 신생혈관을 통하여 성장과 증식에 필요한 영양과 산소를 공급받으며, 또한 종양까지 침투한 신생 혈관들은 전이하는 암세포가 혈액순환계로 들어가는 기회를 줌으로써 암세포가 전이(metastasis) 되도록 한다(Folkman and Tyler, Cancer Invasion and metastasis, Biologic mechanisms and Therapy(S.B. Day ed.) Raven press, New York, pp94-103, 1977; Polverini PJ,Crit. Rev. Oral. Biol. Med., 6(3), pp230-247, 1995). 암 환자가 사망하는 주원인은 전이이며, 현재 임상에서 사용되는 화학요법이나 면역요법들이 암 환자의 생존율을 높이는데 기여하지 못하고 있는 것은 바로 암의 전이 때문이다.

대부분의 고형암 전이 과정을 살펴보면, 암세포가 처음 발생한 장소에서 증식이 이루어지고 암 덩어리가 점점 커지면 다른 장소로 이동하기 위하여 암세포가 암 덩어리에서 떨어져 나와서 혈관을 통하여 이동한 후 2차 장소에 정착하여 다시 세포 증식이 이루어진다. 이러한 과정에서 암세포가 혈관을 통하여 다른 장소로 이동하기 위해서는 암세포 침윤(invasion) 과정을 반드시 거쳐야 한다. 이때, 암세포는 세포외기질성분을 분해하기 위하여 단백질 분해 효소를 과발현하여 분비하며, 이에는 메트릭스 메탈로프로테나아제(matrix metalloproteinases; MMPs), 카텝신(cathepsins), 각종 단백질 분해효소(proteinases) 등이 있다. 카텝신(cathepsin)은 낮은 pH에서 단백질을 분해하는 라이소좀 효소로서, 구조와 촉매 유형에 따라 세린 프로테아제(A, G), 아스파틸 프로테아제(D, E), 시스테인 프로테아제(B, C, F, H, K, L1, V, O, S, W, Z)로 분류된다. 카텝신은 각기 특정한 생리적 프로세스 즉, 면역계에서 항원 제시, 뼈와 연골에서 콜라겐 턴오버, 뉴로펩타이드와 호르몬 프로세싱에 관여하고 있어, 이들 카텝신이 결핍되었을 때 다양한 질병 현상들이 발생할 뿐 아니라, 카텝신이 과발현된 경우도 여러 가지 질병들이 발생하게 된다. 특히 시스테인 카텝신(cathepsin B, F, H, K, L, V, S, Z)들의 과발현이 암 발생과 암 전이에 관여한다고 알려져 있다(Reiser J et al., J Clin Invest. 120(10), 3421-31, 2010).

대부분의 카텝신은 라이소좀 단백질 분해효소로 세포내에서 생리기능 조절 역할을 하고 있으나, 세포 외부로 분비되어 단백분해 기능을 수행하는 것으로 카텝신 S가 있다. 카텝신 S는 세포 내 라이소좀에 있을 때는 항원 프로세싱 또는 아팝토시스에 관여하지만, 세포 밖으로 분비되면 세포외 기질 성분인 라미닌, 피브로넥틴 엘라스틴, 콜라겐 등을 분해한다. 이러한 기능에 따라 카텝신 S가 암세포 침윤 및 혈관신생 과정에 관여하는 것으로 생각되고 있다.

최근 보고에서 대장암(colorectal cancer) 환자의 대장암 조직에서 카텝신 S의 발현이 정상 대장조직에 비하여 유의성 있게 증가되어 있음이 확인되었다 (Gormley JA et al., Br J Cancer, 105(10), 1487-94, 2011). 뿐만 아니라, 카텝신 S 유전자를 표적으로 한 siRNA를 간암세포에 도입하여 카텝신 S 발현을 감소시켰을 때, 간암세포의 증식, 침윤 그리고 혈관신생(angiogenesis)이 감소하는 결과가 보고 된 바 있다(Fan Q et al., Biochem Biophys Res Commun, 425(4), 703-10, 2012).

유방암의 경우는 림프절로 전이된 유방암 환자의 예후와 유방암 조직에서의 카텝신 D 염색이 유의성 있게 연관되어 있는 반면, 림프절 비전이 환자에서는 카텝신 D가 연관되어 있지 않음이 보고되었다(Henry JA et al., Cancer, 65(2), 265-71, 1990). 이러한 결과에 근거하여 유방암 전이와 침윤에 카텝신 D가 중요한 역할을 할 것으로 제기되었으나, 다른 연구에 의하면 MCF7, MDA-MB-231, MDA-MB-435 등과 같은 유방암 세포주를 사용하여 전이 실험을 수행하였을 때 카텝신 D는 유방암 세포의 침윤과 연관성이 없다는 결과를 얻었다(Johnson MD et al., Cancer Res., 53(4), 873-7, 1993). 전이성 유방암세포에서도 간암에서의 경우와 같이 카텝신 S의 작용이 중요한 역할을 할 수 있을 것으로 예측된다.

한편, 혈관신생을 억제시켜서 암의 성장과 암의 전이를 방지하려는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 종래 암의 성장과 전이를 방지하는 항암제들은 장기적 투여에 따른 독성 문제 등이 야기되므로, 독성이 적은 약제의 개발이 요구되고 있다.

이에, 본 발명자들은 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염이 우수한 혈관신생 억제 효과, 암 성장 억제 및 암전이 억제 효과를 가짐을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 화학식 Ⅰ 로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공하는 데에 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 침윤 또는 암 전이 예방 또는 억제용 약학조성물을 제공하는 데에 있다,

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 제공한다:

[화학식 Ⅰ]

상기 화학식 Ⅰ에서,

R¹및 R³은 각각 같거나 다르며, 수소, C1 내지 C6의 알킬, C1 내지 C4의 알콕시 및 할로겐으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,

R²는 C1 내지 C4의 알콕시, 벤질옥시, 하이드록시 및 아세틸옥시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,

R⁴은 수소, 알킬카보닐, 아릴알킬, C1 내지 C16의 알킬, 사이클로알킬로 치환된 알킬, 아릴로 치환된 카복스마이드, 알킬 아세테이트 및 알킬실릴로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,

X는 CR⁵R⁶, NH 또는 O이며, R⁵및 R⁶은 각각 같거나 다르며, 수소, 벤질 및 C1 내지 C16의 알킬로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이다.

또한, 본 발명은 화학식 Ⅰ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 Ⅰ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 Ⅰ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 침윤 또는 암 전이 예방 또는 억제용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 Ⅱ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다:

[화학식 Ⅱ]

상기 화학식 Ⅱ에서,

또한, 본 발명은 화학식 Ⅱ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 Ⅱ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 침윤 또는 암 전이 예방 또는 억제용 약학조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염은 융모요막 모델에서의 신생혈관형성 억제 효과가 탁월하여, 황반변성 또는 관절염 등과 같은 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약제로서 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 암 전이 및 침윤에 중요한 역할을 수행하는 카텝신 S의 활성을 억제하므로, 암 성장 억제 및 암 전이 억제용 약제로서 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 피리딘 유도체의 화학식을 개시한 것이다.
도 2는 화합물 I-a, I-b, I-c, II-a, II-b 및 II-c의 CAM 분석 사진이다.
도 3은 화합물 I-a 및 II-a의 혈관신생 억제에 대한 ID₅₀를 나타낸 것이다.
도 4는 카뎁신 S 발현에 미치는 화합물 I-a, I-b, I-c, II-a, II-b 및 II-c의 억제 효과를 RT-PCR로 확인한 것이다.
도 5는 카뎁신 S 및 MMP-9 발현에 미치는 화합물 I-a 의 억제 효과를 RT-PCR로 확인한 것이다.
도 6은 화합물 I-a의 카뎁신 S 발현 및 유방암세포 MDA-MB-231에 대한 침윤 억제 효과를 확인한 것이다.
도 7은 유방암 세포주 및 정상 사람 세포주에 대하여 화합물 화합물 I-a의 세포독성을 나타낸 것이다.
도 8은 화합물 I-a의 카뎁신 S 발현 및 유방암세포 MDA-MB-231에 대한 침윤억제 효과를 확인한 것이다.
도 9는 화합물 I-b의 카뎁신 S 발현 및 유방암세포 MDA-MB-231에 대한 침윤억제 효과를 확인한 것이다.
도 10은 화합물 I-c의 카뎁신 S 발현 및 유방암세포 MDA-MB-231에 대한 침윤억제 효과를 확인한 것이다.

발명의 실시를 위한 최선의 형태

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 아미도피리딘올 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 제공한다:

[화학식 I]

상기 화학식 Ⅰ에서,

바람직하게, 상기 피리딘 유도체는 화학식 I에서,

R¹및 R³은 각각 같거나 다르며, 수소 및 C1 내지 C4의 알킬로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,

R²는 벤질옥시, 하이드록시 및 아세틸옥시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,

R⁴은 수소, 알킬카보닐(예, 메틸카보닐 등), 아릴알킬(예, 벤질 등), C1 내지 C16의 알킬, 사이클로알킬로 치환된 C1 내지 C6의 알킬(예, 사이클로프로필메틸 등), 아릴로 치환된 카복스아마이드(예, 할로겐 치환 아릴이 치환된 카복스아마이드, (클로로페닐)카르바모일(CONH(C₆H₄)Cl) 등), 알킬 아세테이트(예, 에틸아세테이트(CH₂CO₂CH₂CH₃) 등) 및 C1 내지 C10의 알킬실릴(예, tert-Butyldimethylsilyl 등)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이고,

X는 CR⁵R⁶, NH 또는 O이며, R⁵및 R⁶은 각각 같거나 다르며, 수소, 벤질 및 C1 내지 C16의 알킬로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 피리딘 유도체는 5-하이드록시-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온, 6-하이드록시-5,7-디메틸옥사졸로[4,5-b]피리딘-2(3H)-온, 6-하이드록시-5,7-디메틸-1H-이미다조[4,5-b]피리딘-2(3H)-온, 5-(벤질옥시)-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온, 3,3-디벤질-5-(벤질옥시)-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온, 1,3,3-트리벤질-5-(벤질옥시)-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온, 4,6-디메틸-2-옥소-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-5-일 아세테이트, N-(4-클로로페닐)-5-하이드록시-4,6-디메틸-2-옥소-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-카르복사마이드, 에틸 2-(5-하이드록시-4,6-디메틸-2-옥소-2,3-디하이드로-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-1-일)아세테이트, 1-벤질-5-하이드록시-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온, 1-에틸-5-하이드록시-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온, 1-(사이클로프로필메틸)-5-하이드록시-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온 및 1-(터트-부틸디메틸실릴)-5-하이드록시-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 약제학적 허용가능한 염은 옥살산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산 및 벤조산으로 이루어진 군에서 선택된 유기산이거나, 또는 염산, 황산, 인산 및 브롬화수소산으로 이루어진 군에서 선택된 무기산에 의해 형성되는 산부가염의 형태일 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염은 후술하는 합성예 1~3과 같은 방법에 의해 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 I로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학조성물을 제공한다:

[화학식 I]

상기 화학식 Ⅰ에서,

바람직하게, 상기 피리딘 유도체는 화학식 I에서,

R²는 벤질옥시, 하이드록시 및 아세틸옥시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이며,

가장 바람직하게, 상기 피리딘 유도체는 하기 화학식 I-a, I-b 또는 I-c일 수 있다.

[화학식 I-a]

[화학식 I-b]

[화학식 I-c]

또한, 본 발명은 하기 화학식 II로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 약학조성물을 제공한다:

[화학식 II]

상기 화학식 II에서,

보다 바람직하게, 상기 피리딘 유도체는 화학식 에서,

R²는 하이드록시이며,

R⁴은 수소 및 C1 내지 C4의 알킬로 이루어진 군에서 선택된 하나이고,

X는 CR⁵R⁶,NH 또는 O이며, 각각 같거나 다르며, 수소 및 C1 내지 C4의 알킬로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.

보다 바람직하게, 상기 피리딘 유도체는 하기 화학식 II-a, II-b 또는 II-c일 수 있다.

[화학식 II-a]

[화학식 II-b]

[화학식 II-c]

본 발명에 따른 약학조성물은 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학조성물, 암 예방 및 치료용 약학 조성물, 및/또는 암 침윤 또는 암 전이 예방 또는 억제용 약학조성물을 포함할 수 있다.

상기 혈관신생으로 인한 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환, 알츠하이머 질환 및 피부노화로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 I 또는 II로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염은 융모요막 모델에서 혈관내피성장인자와 같은 신생혈관형성 유도물질의 처리에 따른 신생혈관형성 증가를 억제하므로, 혈관신생으로 인한 질환의 예방 및 치료용 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

상기 암은 폐암, 유방암, 방광암, 뼈암, 갑상선암, 부갑상선암, 직장암, 인후암, 후두암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 I 또는 II로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염은 암 전이 및 침윤에 중요한 역할을 수행하는 카텝신 S의 활성을 억제하므로, 암 예방 또는 치료용, 및/또는 암 침윤 또는 암 전이 예방 또는 억제용 유효성분으로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물의 적용량 및 적용방법은 제형 및 사용목적에 따라 다를 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 화학식 I 또는 II로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

이러한 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다.

또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 I 또는 II로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.001 내지 100 mg/kg, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한, 6-아미노피리딘-3-올 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염의 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 화학식 I 또는 II로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염은 50% 치사량(LC₅₀)이 2 g/kg 이상으로 안정성이 확보된 것으로서, 본 발명의 약학조성물에 사용할 수 있다.

발명의 실시를 위한 형태

이하, 본 발명을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.

제조예: 화학식 II의 대표적 화합물(화합물 II-a, II-b 및 II-c)의 합성

화합물 II-a는 Remigiusz Serwa, Tae-gyu Nam, Luca Valgimigli, Sean Culbertson, Christopher L. Rector, Byeong-Seon Jeong, Derek A. Pratt, Ned A. Porter; Preparation and investigation of vitamin B6-derived aminopyridinol antioxidants; Chemistry-A European Journal 2010, 16(47), 1410614114.의 방법으로 제조하였다.

화합물 II-b 와 II-c는 Roman V. Shchepin, Wei Liu, Huiyong Yin, Irene Zagol-Ikapitte, Taneem Amin, Byeong-Seon Jeong, L. Jackson Roberts II, John A. Oates, Ned A. Porter, Olivier Boutaud; Rational design of novel pyridinol-fused ring acetaminophen analogues; ACS Medicinal Chemistry Letters, 2013, 4(8), 710714.의 방법으로 제조하였다.

[화학식 II-a]

[화학식 II-b]

[화학식 II-c]

실시예 1: 화합물 I-a(5-하이드록시-4,6-디메틸-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-2(3 H )-온)의 합성

[반응식 1]

5-(하이드록시메틸)-2,4-디메틸피리딘-3-올 하이드로클로라이드(5-(Hydroxymethyl)-2,4-dimethylpyridin-3-ol hydrochloride, 반응식 1의 화합물 2) 제조

피리독신ㆍHCl(PyridoxineHCl) (반응식 1의 화합물 1, 10.0 g, 48.6 mmol)의 아세트산 (40 mL) 용액에 아연 분말 (12.7 g, 0.195 mol)을 소량씩 가한 후 24시간 환류 교반하였다. 반응액을 실온으로 냉각한 후 감압 여과하고 CH₃CN(50 mL)으로 세척한 후, 과량의 염산-메탄올 용액 (150 mL)을 여액에 가하였다. 빙냉 하에서 2시간 교반한 후 얻은 현탁액을 감압여과하여 목적화합물(반응식 1의 화합물 2, 8.7 g, 94%)를 흰색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 10.62 (br s, 1H), 8.08 (s, 1H), 5.70 (br s, 1H), 4.60 (s, 2H), 2.61 (s, 3H), 2.32 (s, 3H) ppm.

(5-(벤질옥시)-4,6-디메틸피리딘-3-일)메탄올((5-(Benzyloxy)-4,6-dimethylpyridin-3-yl)methanol, 반응식 1의 화합물 3) 제조

반응식 1의 화합물 2 (8.6 g, 45.7 mmol)의 DMF (450 mL) 용액에 포타슘 카보네이트(potassium carbonate) (107 g, 0.776 mol)와 벤질 클로라이드(benzyl chloride) (26.2 mL, 0.228 mol)를 가한 후 실온에서 24시간 교반하였다. 반응액을 감압 농축한 뒤 EtOAc (1 L)로 희석하고 물 (100 mL × 3)로 세척하였다. EtOAc용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하여 목적화합물(반응식 1의 화합물 3, 8.2 g, 74%)을 갈색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 8.07 (s, 1H), 7.38-7.47 (m, 5H), 4.80 (s, 2H), 4.65 (s, 2H), 2.48 (s, 3H), 2.32 (s, 3H) ppm.

3-벤질옥시-5-클로로메틸-2,4-디메틸피리딘 하이드로클로라이드(3-Benzyloxy-5-chloromethyl-2,4-dimethylpyridine hydrochloride, 반응식 1의 화합물 4) 제조

반응식 1의 화합물 3(2.85 g, 11.71 mmol)의 1,2-디클로로에탄 (1,2-dichloroethane) (35 mL) 용액에 DMF (0.09 mL, 23.43 mmol)와 티오닐 클로라이드(thionyl chloride) (1.7 mL, 23.43 mmol)을 가하고 80 ℃에서 1시간 교반하였다. 반응액을 실온으로 식힌 뒤 에틸 에테르(ethyl ether) (150 mL)를 반응액에 가하고 빙냉 하에서 1시간 교반하였다. 석출된 고체를 감압여과하여 걸러진 고체를 에틸 에테르로 세척한 후 건조시켜 목적화합물 (반응식 1의 화합물 4, 3 g, 86%)를 갈색의 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 8.19 (s, 1H), 7.34-7.44 (m, 5H), 4.81 (s, 2H), 4.56 (s, 2H), 2.50 (s, 3H), 2.32 (s, 3H) ppm.

2-(5-벤질옥시-4,6-디메틸피리딘-3-일)아세토니트릴(2-(5-Benzyloxy-4,6-dimethylpyridin-3-yl)acetonitrile, 반응식 1의 화합물 5) 제조

반응식 1의 화합물 4 (9.95 g, 38.01 mmol)의 DMF (500 mL) 용액에 KCN (7.42 g, 114.04 mmol)을 가하고 30~40 ℃에서 2일 교반하였다. 반응액을 농축시킨 후 잔사를 EtOAc (2 L)로 희석하고 유기층을 물 (4×200 mL)로 세척하였다. EtOAc 용액을 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CHCl₃:MeOH=50:1->20:1)로 정제하여 목적화합물 (반응식 1의 화합물 5, 8.06 g, 95%)를 갈색의 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 8.18 (s, 1H), 7.35-7.43 (m, 5H), 4.80 (s, 2H), 3.61 (s, 2H), 2.51 (s, 3H), 2.26 (s, 3H) ppm.

에틸 2-(5-하이드록시-4,6-디메틸피리딘-3-일)아세테이트(Ethyl 2-(5-hydroxy-4,6-dimethylpyridin-3-yl)acetate , 반응식 1의 화합물 6) 제조

반응식 1의 화합물 5 (500 mg, 1.98 mmol)의 에탄올 (20 mL) 용액에 진한 황산 (3.7 mL, 69.36 mmol)을 가하고 24시간 환류 교반하였다. 반응액을 실온으로 식히고 에탄올 (150 mL)을 넣어 희석하였다. Na₂CO₃(7.35 g,69.36 mmol)을 반응액에 소량씩 나누어 가하고 실온에서 3시간 교반하였다. 반응액을 농축하고 잔사를 EtOAc (150 mL)에 희석한 뒤 감압여과 하여 고체를 걸러내고 EtOAc로 세척하였다. 여액을 감압농축한 뒤 잔사를 관크로마토그래피(CHCl₃:MeOH=70:1->20:1)로 정제하여 목적화합물 (반응식 1의 화합물 6, 366 mg, 88%)을 노란색의 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 7.80 (s, 1H), 6.96 (br s, 1H), 4.11 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.56 (s, 2H), 2.38 (s, 3H), 2.19 (s, 3H), 1.21 (t, J=7.1 Hz, 3H) ppm.

에틸 2-(5-하이드록시-4,6-디메틸-2-(페닐디아제닐)피리딘-3-일)아세테이트 (Ethyl 2-(5-hydroxy-4,6-dimethyl-2-(phenyldiazenyl)pyridin-3-yl)acetate, 반응식 1의 화합물 7)

비커에 반응식 1의 화합물 6 (1 g, 4.78 mmol)을 물THF 혼합용매 (1:1, 30 mL)에 녹이고 교반기와 pH 미터기를 장착한 뒤 빙냉 하에서 냉각시켰다. 별도의 삼각 플라스크에 아닐린(aniline) (0.48 mL, 5.26 mmol) 을 6M 염산 (5 mL)에 녹인 후 빙냉 하에서 냉각시키고, 차가운 NaNO₂(363 mg,5.26 mmol)의 물 (2 mL) 용액을 아닐린 용액에 소량씩 나누어 넣어주었다. 이 디아조화 아닐린 용액을 차가운 화합물 6의 용액에 소량씩 나누어 넣어주었다. 동시에 10M NaOH 용액으로 반응액을 pH 8로 유지했다. 디아조화 아닐린 용액을 모두 넣은 후 반응액을 실온에서 2시간 교반하였다. 반응액을 EtOAc (150 mL×3)로 추출하고 EtOAc 용액을 포화소금물로 세척한 후 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CHCl₃:MeOH=80:1->20:1)로 정제하여 목적화합물(반응식 1의 화합물 7, 1.3 g, 87%)을 적색의 고체로 얻었다

¹H-NMR (CHCl₃-d) 7.32-7.37 (m, 4H), 7.08-7.13 (m, 1H), 4.14 (q, J=7.1 Hz, 2H), 3.89 (s, 2H), 2.40 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.22 (t, J=7.1 Hz, 3H) ppm.

5-하이드록시-4,6-디메틸-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-2(3 H )-온(5-Hydroxy-4,6-dimethyl-1 H -pyrrolo[2,3- b ]pyridin-2(3 H )-one, 반응식 1의 화합물 I-a) 제조

반응식 1의 화합물 7 (550 mg, 1.75 mmol)의 아세트산 (35 mL) 용액에 아연분말 (344 mg, 5.26 mmol)을 소량씩 나누어 넣고 12시간 환류 교반하였다. 반응액을 실온으로 냉각한 후 감압 여과하여 고체를 걸러내고 CH₃CN으로 세척하였다. 여액을 농축한 후 잔사를 관크로마토그래피(CHCl₃:MeOH=80:1->10:1)로 정제하여 목적화합물 (반응식 1의 화합물 I-a, 273 mg, 87%)를 갈색의 고체로 얻었다

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 10.4 (s, 1H), 8.05 (s, 1H), 3.38 (s, 2H), 2.27 (s, 3H), 2.07 (s, 3H) ppm.

실시예 2: 화합물 I-b(6-하이드록시-5,7-디메틸옥사졸로[4,5- b ]피리딘-2(3 H )-온)의 합성

[반응식 2]

5-(벤질옥시)-4,6-디메틸니코틴알데하이드(5-(Benzyloxy)-4,6-dimethylnicotinaldehyde, 반응식 2의 화합물 8) 제조

반응식 2의 화합물 3 (500 mg, 2.055 mmol)의 CH₂Cl₂(10 mL) 용액에 TEMPO (3.2 mg, 0.021 mmol), NaHCO₃수용액 (397.1 mg, 4.726 mmol in 5 mL H₂O),4% NaOCl 수용액 (5 mL)을 차례로 가한 후 실온에서 10분간 교반하였다. 반응액을 CH₂Cl₂(30 mL)로 희석하고 물로 세척하였다. CH₂Cl₂용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하여 목적화합물 (반응식 2의 화합물 8, 466 mg, 94%)을 무색 액체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 10.19 (s, 1H), 8.63 (s, 1H), 7.34-7.43 (m, 5H), 4.82 (s, 2H), 2.58 (s, 3H), 2.57 (s, 3H) ppm.

5-(벤질옥시)-4,6-디메틸니코틴아마이드(5-(Benzyloxy)-4,6-dimethylnicotinamide, 반응식 2의 화합물 9) 제조

반응식 2의 화합물 8 (466 mg, 1.932 mmol)의 THF (10 mL) 용액에 28% 암모니아수 (6 mL)와 I₂(736 mg,2.898 mmol)을 차례로 가한 후 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 CH₂Cl₂(50 mL)로 희석하고 포화 Na₂S₂O₃수용액 (50 mL)으로 세척하였다. CH₂Cl₂용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 THF (10 mL)에 녹인 후 그 용액에 28% 암모니아수 (6 mL), 35% 과산화수소수 (6 mL)를 0 ℃에서 차례로 가하였다. 실온에서 2시간 교반한 뒤 반응액을 CH₂Cl₂(60 mL)로 희석하고 물 (60 mL)로 세척하였다. CH₂Cl₂용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하여 목적화합물 (반응식 2의 화합물 9, 446 mg, 90%)를 흰색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 8.31 (s, 1H), 7.34-7.43 (m, 5H), 4.79 (s, 2H), 2.47 (s, 3H), 2.42 (s, 3H) ppm.

5-(벤질옥시)-4,6-디메틸피리딘-3-아민(5-(Benzyloxy)-4,6-dimethylpyridin-3-amine, 반응식 2의 화합물 10) 제조

NaOH (94 mg, 2.34 mmol)의 THF/H₂O=1:1(8 mL) 용액에 4% NaOCl 용액 (2 mL)과 반응식 2의 화합물 9 (200 mg, 0.780 mmol)를 가하고 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 90 ℃로 가온하여 2시간 동안 교반하였다. 반응액을 실온으로 식힌 뒤 CH₂Cl₂(40 mL)로 희석하고 포화 NH₄Cl 용액 (40 mL)으로 세척하였다. CH₂Cl₂용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=10:1)로 정제하여 목적화합물(반응식 2의 화합물 10, 176 mg, 99%)을 노란색 액체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 7.79 (s, 1H), 7.33-7.46 (m, 5H), 4.77 (s, 2H), 3.49 (br s, 2H), 2.41 (s, 3H), 2.06 (s, 3H) ppm.

5-(벤질옥시)-4,6-디메틸피리딘-3-올(5-(Benzyloxy)-4,6-dimethylpyridin-3-ol, 반응식 2의 화합물 11)

반응식 2의 화합물 10 (176 mg, 0.772 mmol)의 THF/H₂O=1:1(2 mL) 용액에 5% (v/v) 황산 수용액 (4 mL)과 아질산나트륨 (59 mg, 0.849 mmol)을 빙냉 하에서 가하고 1시간 교반하였다. 반응액의 온도를 실온으로 올린 후 2시간 추가 교반하였다. 반응액을 실온으로 식힌 뒤 CH₂Cl₂(40 mL)로 희석하고 포화 NaHCO₃용액 (40 mL)으로 세척하였다. CH₂Cl₂용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=30:1)로 정제하여 목적화합물(반응식 2의 화합물 11, 143 mg, 81%)을 흰색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 7.98 (s, 1H) 7.36-7.47 (m, 5H), 4.82 (s, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.26 (s, 3H) ppm.

5-(벤질옥시)-4,6-디메틸-2-(페닐디아제닐)피리딘-3-올(5-(Benzyloxy)-4,6-dimethyl-2-(phenyldiazenyl)pyridin-3-ol, 반응식 2의 화합물 12) 제조

반응식 2의 화합물 11 (237 mg, 1.04 mmol)의 THF/H₂O=1:1(7 mL) 용액을 0 ℃로 냉각하고 교반기와 pH 미터기를 설치하였다. 별도의 삼각플라스크에 아닐린(aniline) (0.104 mL, 1.14 mmol)을 6M 염산 수용액 (1.04 mL)에 녹이고 0 ℃로 냉각하였다. 차가운 NaNO₂수용액 (79 mg, 1.14 mmol in 3 mL H₂O)을 아닐린 용액에 소량씩 가하였다. 다이아조화 아닐린 용액을 화합물 11이 녹아있는 용액에 소량씩 가하면서, 반응액이 pH 8로 유지되도록 2.5M NaOH를 함께 가하여 주었다. 반응액의 온도를 실온으로 올린 후 1시간 교반하였다. 반응액을 CH₂Cl₂로 희석하고 물로 세척하였다. CH₂Cl₂용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(EtOAc:Hexane=1:3)로 정제하여 목적화합물 (반응식 2의 화합물 12, 314 mg, 91%)를 붉은색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 13.59 (s, 1H) 7.93-7.98 (m, 2H), 7.35-7.55 (m, 8H), 4.91 (s, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.23 (s, 3H) ppm.

2-아미노-5-(벤질옥시)-4,6-디메틸피리딘-3-올(2-Amino-5-(benzyloxy)-4,6-dimethylpyridin-3-ol, 반응식 2의 화합물 13) 제조

반응식 2의 화합물 12 (250 mg, 0.750 mmol)의 메탄올 (7.5 mL) 용액에 아연 분말 (148 mg, 2.26 mmol)과 포름산(formic acid) (0.3 mL, 7.53 mmol)를 가한 후 70 ℃에서 1시간 환류 교반하였다. 반응액을 실온으로 냉각한 후 반응액을 여과하여 여액을 감압 농축하였다. 잔사를 CH₂Cl₂(40 mL)로 희석하고 포화 NaHCO₃용액 (40 mL)으로 세척하였다. CH₂Cl₂용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1)로 정제하여 목적화합물 (반응식 2의 화합물 13, 153 mg, 83%)를 흰색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 7.30-7.41 (m, 5H), 4.83 (br s, 3H), 4.69 (s, 2H), 2.26 (s, 3H), 2.14 (s, 3H) ppm.

6-(벤질옥시)-5,7-디메틸옥사졸로[4,5- b ]피리딘-2(3 H )-온(6-(Benzyloxy)-5,7-dimethyloxazolo[4,5- b ]pyridin-2(3 H )-one, 반응식 2의 화합물 14) 제조

반응식 2의 화합물 13 (153 mg, 0.623 mmol)의 DMF (6 mL) 용액에 카보닐 디이미다졸(carbonyl diimidazole) (152 mg, 0.935 mmol)을 가한 후 실온에서 12시간 교반하였다. 감압조건 하에서 용매를 제거한 뒤 잔사를 CH₂Cl₂(40 mL)로 희석하고 물 (230 mL)로 세척하였다. CH₂Cl₂용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하여 목적화합물 (반응식 2의 화합물 14, 156 mg, 93%)를 흰색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 7.38-7.41 (m, 5H), 4.82 (s, 2H), 2.55 (s, 3H), 2.30 (s, 3H) ppm.

6-하이드록시-5,7-디메틸옥사졸로[4,5- b ]피리딘-2(3 H )-온(6-Hydroxy-5,7-dimethyloxazolo[4,5- b ]pyridin-2(3 H )-one (반응식 2의 화합물 I-b) 제조

반응식 2의 화합물 14 (142 mg, 0.525 mmol)의 메탄올 (5 mL) 용액에 10% Pd/C (28 mg)을 가하고 수소기류 하 실온에서 2시간 교반하였다. 반응액을 여과하고 여액을 감압 농축하였다. 잔사를 메탄올에 녹인 후 이 용액을 syringe filter (Advantec JP050AN)를 사용하여 여과하고 농축하여 목적화합물 (반응식 2의 화합물 I-b, 94 mg, 99%)를 연노란색의 고체로 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 2.29 (s, 3H), 2.16 (s, 3H) ppm.

실시예 3: 화합물 I-c(6-하이드록시-5,7-디메틸-1H-이미다조[4,5-b]피리딘-2(3H)-온)의 합성

[반응식 3]

3-(벤질옥시)-5-카바모일-2,4-디메틸피리딘 1-옥사이드(3-(Benzyloxy)-5-carbamoyl-2,4-dimethylpyridine 1-oxide, 반응식 3의 화합물 15) 제조

반응식 2의 화합물 9 (446 mg, 1.740 mmol)의 CH₂Cl₂ (17 mL) 용액에 m-CPBA (330 mg, 1.914 mmol)를 가한 후 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 CH₂Cl₂ (40 mL)로 희석하고 포화 NaHCO₃ 용액 (40 mL)으로 세척하였다. CH₂Cl₂ 용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1)로 정제하여 목적화합물 (반응식 3의 화합물 15, 417 mg, 88%)를 흰색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 8.21 (s, 1H), 7.36 (s, 5H), 4.79 (s, 2H), 2.39 (s, 3H), 2.38 (s, 3H) ppm.

5-(벤질옥시)-2-(1,3-디옥소이소인돌린-2-일)-4,6-디메틸니코틴아마이드(5-(Benzyloxy)-2-(1,3-dioxoisoindolin-2-yl)-4,6-dimethylnicotinamide, 반응식 3의 화합물 16) 제조

반응식 3의 화합물 15 (417 mg, 1.531 mmol)의 CH₂Cl₂(15 mL) 용액에 프탈이미드(phthalimide) (227.5 mg, 1.546 mmol), 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine) (0.80 mL, 4.594 mmol), p-톨루엔설포닐 클로라이드(p-toluenesulfonyl chloride) (438 mg, 2.297 mmol)를 차례로 가한 후 실온에서 1시간 교반하였다. 반응액을 CH₂Cl₂(40 mL)로 희석하고 물 (40 mL)로 세척하였다. CH₂Cl₂용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사에 에테르를 가하고 여과한 후 얻은 잔류물을 감압 건조하여 목적화합물 (반응식 3의 화합물 16, 479 mg, 78%)을 흰색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 7.88-7.93 (m, 2H), 7.75-7.80 (m, 2H), 7.37-7.50 (m, 5H), 6.06 (br s, 1H), 5.76 (br s, 1H), 4.88 (s, 2H), 2.54 (s, 3H), 2.40 (s, 3H) ppm.

2-아미노-5-(벤질옥시)-4,6-디메틸니코틴아마이드(2-Amino-5-(benzyloxy)-4,6-dimethylnicotinamide, 반응식 3의 화합물 17) 제조

반응식 3의 화합물 16 (479 mg, 1.193 mmol)의 THF/H₂O=1:1(12 mL) 용액에 하이드라진(hydrazine) (4.2 mL)을 가한 후 실온에서 12시간 교반하였다. 용매를 제거한 후 에틸 에테르를 가하고 녹지 않는 고체를 여과하여 제거하였다. 여액을 CH₂Cl₂(40 mL)로 희석한 후 물 (40 mL)로 세척하였다. CH₂Cl₂용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과, 감압 농축하여 목적화합물 (반응식 3의 화합물 17, 288 mg, 89%)을 흰색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (CHCl₃-d) 7.24-7.41 (m, 5H), 6.28 (br d, 1H), 4.94 (br s, 1H), 4.68 (s, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.27 (s, 3H) ppm.

6-(벤질옥시)-5,7-디메틸-1 H -이미다조[4,5- b ]피리딘-2(3 H )-온(6-(Benzyloxy)-5,7-dimethyl-1 H -imidazo[4,5- b ]pyridin-2(3 H )-one, 반응식 3의 화합물 18) 제조

KOH (179 mg, 3.168 mmol)의 메탄올 (10 mL) 용액에 반응식 3의 화합물 17 (288 mg, 1.062 mmol)을 가하였다. 0 ℃에서 PhI(OAc)₂(342 mg,1.062 mmol)를 가한 후 1시간 동안 교반하고 실온에서 1시간 동안 추가 교반하였다. 반응 현탁액을 여과하고 고체를 메탄올로 세척하였다. 걸러진 고체를 감압 건조하여 목적화합물 (반응식 3의 화합물 18, 249 mg, 87%)을 흰색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 11.0 (br s, 1H), 7.36-7.50 (m, 4H), 4.77 (s, 2H), 2.33 (s, 3H), 2.20 (s, 3H) ppm.

6-하이드록시-5,7-디메틸-1 H -이미다조[4,5- b ]피리딘-2(3 H )-온(6-Hydroxy-5,7-dimethyl-1 H -imidazo[4,5- b ]pyridin-2(3 H )-one, 반응식 3의 화합물 I-c) 제조

반응식 3의 화합물 18 (249 mg, 0.9235 mmol)의 메탄올 (10 mL) 용액에 10% Pd/C (50 mg)을 가하고 수소기류 하 실온에서 2시간 교반하였다. 반응액을 여과하고 여액을 감압 농축하였다. 잔사를 메탄올에 녹인 후 이 용액을 syringe filter (Advantec JP050AN)를 사용하여 여과하고 농축하여 목적화합물 (반응식 3의 화합물 I-c, 164 mg, 99%)를 연노란색의 고체로 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 2.27 (s, 3H), 2.13 (s, 3H) ppm.

실시예 4: 5-(벤질옥시)-4,6-디메틸-1 H -피롤로[2,3-b]피리딘-2(3 H )-온(5-(Benzyloxy)-4,6-dimethyl-1 H -pyrrolo[2,3-b]pyridin-2(3 H )-one, 반응식 4의 화합물 19), 3,3-디벤질-5-(벤질옥시)-4,6-디메틸-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-2(3 H )-온(3,3-Dibenzyl-5-(benzyloxy)-4,6-dimethyl-1 H -pyrrolo[2,3- b ]pyridin-2(3 H )-one, 반응식 4의 화합물 20) 및 1,3,3-트리벤질-5-(벤질옥시)-4,6-디메틸-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-2(3 H )-온(1,3,3-Tribenzyl-5-(benzyloxy)-4,6-dimethyl-1 H -pyrrolo[2,3- b ]pyridin-2(3 H )-one, 반응식 4의 화합물 21) 제조

[반응식 4]

반응식 4의 화합물 I-a (20 mg, 0.1134 mmol)의 CH₃CN(1.1mL)와 DMF (0.5 mL) 현탁액에 세슘 카보네이트(cesium carbonate) (55.4 mg, 0.1701 mmol)과 벤질 브로마이드(benzyl bromide) (0.04 mL, 0.3401 mmol)을 차례로 가하고 60 ℃에서 7시간 교반하였다. 반응액을 감압농축한 후, 잔사를 CH₂Cl₂(40 mL)로 희석하고 물 (40 mL)로 세척하였다. CH₂Cl₂용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=30:1)로 정제하여 목적화합물 (반응식 4의 화합물 19, 8 mg, 25%), 목적화합물 (반응식 4의 화합물 20, 11 mg, 21%), 목적화합물 (반응식 4의 화합물 21, 25 mg, 41%)을 각각 얻었다.

반응식 4의 화합물 19: ¹H-NMR(CHCl₃-d) 7.20-7.40 (m, 5H), 4.71 (s, 2H), 3.47 (s, 2H), 2.45 (s, 3H), 2.19 (s, 3H) ppm.

반응식 4의 화합물 20: ¹H-NMR(CHCl₃-d) 6.95-7.66 (m, 15H), 4.75 (s, 2H), 3.42 (d, J=13.3 Hz, 2H), 3.27 (d, J=13.3 Hz, 2H), 2.49 (s, 3H), 2.20 (s, 3H) ppm.

반응식 4의 화합물 21: ¹H-NMR(CHCl₃-d) 6.75-7.52 (m, 20H), 4.75 (s, 2H), 4.50 (s, 2H), 3.43 (d, J=13.3 Hz, 2H), 3.28 (d, J=13.3 Hz, 2H), 2.51 (s, 3H), 2.24 (s, 3H) ppm.

실시예 5: 4,6-디메틸-2-옥소-2,3-디하이드로-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-5-일 아세테이트(4,6-Dimethyl-2-oxo-2,3-dihydro-1 H -pyrrolo[2,3- b ]pyridin-5-yl acetate, 반응식 5의 화합물 22) 제조

[반응식 5]

반응식 5의 화합물 I-a (50 mg, 0.28 mmol)와 아세틱 안하이드라이드(acetic anhydride) (3.0 mL)의 반응 혼합물을 60 ℃에서 20분 교반하였다. 반응액을 얼음물 (10 mL)에 쏟아 부은 후, EtOAc (3×20 mL)로 추출하였다. EtOAc 용액을 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하여 목적화합물(반응식 5의 화합물 22, 43 mg, 59%)을 노란색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 3.74 (s, 2H), 2.58 (s, 3H), 2.38 (s, 3H), 2.26 (s, 3H), 2.05 (s, 3H) ppm.

실시예 6: N-(4-클로로페닐)-5-하이드록시-4,6-디메틸-2-옥소-2,3-디하이드로-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-1-카르복사마이드(N-(4-Chlorophenyl)-5-hydroxy-4,6-dimethyl-2-oxo-2,3-dihydro-1 H -pyrrolo[2,3- b ]pyridine-1-carboxamide, 반응식 6의 화합물 23) 제조

[반응식 6]

반응식 6의 화합물 I-a (39 mg, 0.22 mmol)의 1,2-디클로로에탄(1,2-dichloroethane) (2.2 mL) 용액에 4-클로로페닐 이소시아네이트(4-chlorophenyl isocyanate) (37 mg, 0.24 mmol)을 가했다. 반응액을 밀폐한 후 120 ℃에서 18시간 교반한 후, 감압농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=15:1)로 정제하여 목적화합물 (반응식 6의 화합물 23, 47 mg, 65%)을 갈색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 10.90 (s, 1H), 10.55 (s, 1H), 7.53 (d, J=9.2 Hz, 2H), 7.39 (d, J=9.2 Hz, 2H), 3.53 (s, 2H), 2.25 (s, 3H), 2.07 (s, 3H) ppm.

실시예 7: 에틸 2-(5-하이드록시-4,6-디메틸-2-옥소-2,3-디하이드로-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-1-일)아세테이트(Ethyl 2-(5-hydroxy-4,6-dimethyl-2-oxo-2,3-dihydro-1 H -pyrrolo[2,3- b ]pyridin-1-yl)acetate, 반응식 7의 화합물 24) 제조

[반응식 7]

반응식 7의 화합물 I-a (40 mg, 0.23 mmol)와 트리페닐포스핀(triphenylphosphine) (88 mg, 0.33 mmol)의 THF (1.1 mL) 용액을 0 ℃로 냉각하고, 여기에 에틸 글리코레이트(ethyl glycolate) (26 μL, 0.27 mmol)의 THF (1.0 mL) 용액을 가하였다. 이이서 디이소프로필 아조디카복실레이트(diisopropyl azodicarboxylate) (66 μL, 0.33 mmol)의 THF (1.0 mL) 용액을 약 20분에 걸쳐서 적가한 후, 반응액의 온도를 서서히 실온으로 올리면서 3시간 교반하였다. 반응액을 감압농축하고 얻어진 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하여 목적화합물(반응식 7의 화합물 24, 36 mg, 62%)을 백색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 10.77 (s, 1H), 4.45 (s, 2H), 4.19 (q, J=7.0 Hz, 2H), 3.44 (s, 2H), 2.32 (s, 3H), 2.14 (s, 3H), 1.23 (t, J=7.0 Hz, 3H) ppm.

실시예 8: 1-벤질-5-하이드록시-4,6-디메틸-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-2(3 H )-온(1-Benzyl-5-hydroxy-4,6-dimethyl-1 H -pyrrolo[2,3- b ]pyridin-2(3 H )-one, 반응식 8의 화합물 25) 제조

[반응식 8]

반응식 8의 화합물 I-a (40 mg, 0.23 mmol)와 트리페닐포스핀(triphenylphosphine) (88 mg, 0.33 mmol)의 THF (1.1 mL) 용액을 0 ℃로 냉각하고, 여기에 벤질 알콜 (28 μL, 0.27 mmol)의 THF (1.0 mL) 용액을 가하였다. 이어서 디이소프로필 아조디카복실레이트(diisopropyl azodicarboxylate) (66 μL, 0.33 mmol)의 THF (1.0 mL) 용액을 약 20분에 걸쳐서 적가한 후, 반응액의 온도를 서서히 실온으로 올리면서 3시간 교반하였다. 반응액을 감압농축하고 얻어진 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하여 목적화합물(반응식 8의 화합물 25, 41 mg, 48%)을 백색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 10.76 (s, 1H), 7.34-7.52 (m, 5H), 4.76 (s, 2H), 3.46 (s, 2H), 2.32 (s, 3H), 2.15 (s, 3H) ppm.

실시예 9: 1-에틸-5-하이드록시-4,6-디메틸-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-2(3 H )-온(1-Ethyl-5-hydroxy-4,6-dimethyl-1 H -pyrrolo[2,3- b ]pyridin-2(3 H )-one, 반응식 9의 화합물 26) 제조

[반응식 9]

반응식 9의 화합물 I-a (40 mg, 0.23 mmol)와 트리페닐포스핀(triphenylphosphine) (88 mg, 0.33 mmol)의 THF (1.1 mL) 용액을 0 ℃로 냉각하고, 여기에 에탄올 (16 μL, 0.27 mmol)의 THF (1.0 mL) 용액을 가하였다. 이어서 디이소프로필 아조디카복실레이트(diisopropyl azodicarboxylate) (66 μL, 0.33 mmol)의 THF (1.0 mL) 용액을 약 20분에 걸쳐서 적가한 후, 반응액의 온도를 서서히 실온으로 올리면서 3시간 교반하였다. 반응액을 감압농축하고 얻어진 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하여 목적화합물(반응식 9의 화합물 26, 21 mg, 45%)을 백색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 10.70 (s, 1H), 3.75 (q, J=8.0 Hz, 2H), 3.43 (s, 2H), 2.30 (s, 3H), 2.12 (s, 3H), 1.32 (t, J=8.0 Hz, 3H) ppm.

실시예 10: 1-(사이클로프로필메틸)-5-하이드록시-4,6-디메틸-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-2(3 H )-온(1-(Cyclopropylmethyl)-5-hydroxy-4,6-dimethyl-1 H -pyrrolo[2,3- b ]pyridin-2(3 H )-one, 반응식 10의 화합물 27) 제조

[반응식 10]

반응식 10의 화합물 I-a (40 mg, 0.23 mmol)와 트리페닐포스핀(triphenylphosphine) (88 mg, 0.33 mmol)의 THF (1.1 mL) 용액을 0 ℃로 냉각하고, 여기에 사이클로프로판메탄올(cyclopropanemethanol) (22 μL, 0.27 mmol)의 THF (1.0 mL) 용액을 가하였다. 이어서 디이소프로필 아조디카복실레이트(diisopropyl azodicarboxylate) (66 μL, 0.33 mmol)의 THF (1.0 mL) 용액을 약 20분에 걸쳐서 적가한 후, 반응액의 온도를 서서히 실온으로 올리면서 3시간 교반하였다. 반응액을 감압농축하고 얻어진 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하여 목적화합물(반응식 10의 화합물 27, 26 mg, 49%)을 백색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 10.71 (s, 1H), 3.55 (d, J=7.2 Hz, 2H), 3.43 (s, 2H), 2.31 (s, 3H), 2.13 (s, 3H), 1.18-1.21 (m, 1H), 0.53-0.58 (m, 2H), 0.25-0.30 (m, 2H) ppm.

실시예 11:1-(터트-부틸디메틸실릴)-5-하이드록시-4,6-디메틸-1 H -피롤로[2,3- b ]피리딘-2(3 H )-온(1-(tert-Butyldimethylsilyl)-5-hydroxy-4,6-dimethyl-1 H -pyrrolo[2,3- b ]pyridin-2(3 H )-one, 반응식 11의 화합물 28) 제조

[반응식 11]

반응식 11의 화합물 I-a (40 mg, 0.23 mmol)의 CH₂Cl₂(4.0 mL) 용액에 트리에틸렌아민(triethylamine) (94 μL, 0.69 mmol)과 터트-부틸디메틸실리 클로라이드(tert-butyldimethylsilyl chloride) (40 μL, 0.23 mmol)을 가한 후, 반응액을 50 ℃에서 6시간 교반하였다. 반응액을 실온으로 냉각하고 CH₂Cl₂(40 mL)로 희석한 후, 물, 포화소금물로 세척하고 무수 MgSO₄로 건조, 여과하여 감압 농축하였다. 잔사를 관크로마토그래피(CH₂Cl₂:MeOH=20:1)로 정제하여 목적화합물 (반응식 11의 화합물 28, 30 mg, 45%)을 백색 고체로 얻었다.

¹H-NMR (DMSO-d ₆ ) 10.64 (s, 1H), 3.42 (s, 2H), 2.26 (s, 3H), 2.06 (s, 3H), 1.01 (s, 9H), 0.15 (s, 6H) ppm.

실험예 1: VEGF에 의한 혈관신생 억제 효과

생체 내 시험상(in vivo)에서의 혈관신생 억제 효과를 확인하기 위하여, 융모요막(chorioallantoic membrane, CAM) 분석을 실시하였다 (Nguyen M et al., Microvascular Res., 47, pp31-40, 1994). 닭의 유정란을 온도 37 ℃, 상대습도 55%를 유지해주면서 배양시켜 9일째에 기낭 (air sac) 부위에 피하주사침(hypodermic needle, 녹십자의료공업, 한국)을 이용하여 첫 번째 작은 구멍을 뚫고, 창(window)을 낼 유정란의 평평한 부위에 두 번째 구멍을 뚫었다. 첫 번째 구멍인 기낭 부위의 구멍을 통해 공기를 빼냄으로써, 융모요막(CAM)이 유정란의 껍질로부터 분리가 되게 하여 이 부위를 회전연마기(grinding wheel, Multipro 395JA, Dremel, Mexico)로 절단하여 창을 만들고, 다음으로 와트만 필터 디스크(whatman filter disk #1, whatman사, USA)에 코티존 아세테이트(cortisone acetate) 3 mg/mL을 처리하여 건조시킨 후 혈관내피성장인자(VEGF)는 20 ng/CAM의 농도로 적셔두었다. 만들어 둔 창을 통해 필터 디스크를 혈관 위에 얹고, 제조예, 실시예 1~3의 화합물들을 각각 디메틸술폭사이드(DMSO)로 녹여 인산완충용액(PBS)으로 희석하여 각 농도별로 처리하였다. 화합물 처리 3일 뒤, 필터 디스크가 얹힌 CAM 부분을 떼어내어 인산완충용액을 이용하여 씻어준 후, 입체현미경(Stemi SV6 stereomicroscope, Carl Zeiss, Germany)과 Image-Pro Plus software(Media Cybernetics; Silver Spring, MD, USA)를 이용하여 이미지를 촬영하여 혈관 가지의 개수를 측정하고 자료를 분석하였다.

그 결과, 하기 표 3 및 도 2와 같이, VEGF로 유도된 신생혈관형성 증가가 본 발명에 따른 화합물들의 처리(CAM 당 각 화합물 0.01 nmol을 처리)로 인해 감소됨을 확인할 수 있었으며, 대부분의 경우 우수한 혈관신생 억제 효과를 나타내었다. 또한, 화합물 I-a 및 II-a를 용량별로 CAM에 처리하여 ID₅₀을 구한 결과, 도 3과 같이 각각 0.191 ng/CAM (1.072 pmol/CAM) 및 0.225 ng/CAM (1.171 pmol/CAM) 이었다.

실험군 (0.01 nmol/CAM)	혈관신생 억제율(%)
Sutent(Sunitinib malate)	91.7 ± 11.4*
화합물 II-a	87.0 ± 7.3*
화합물 I-a	88.8 ± 4.3*
화합물 I-b	31.0 ± 8.9*
화합물 I-c	63.7 ± 15.9*
화합물 II-b	48.0 ± 12.7*
화합물 II-c	59.8 ± 9.6*

*P<0.05 compared to the vehicle-treated group.

실험예 2: KDR kinase 활성 억제 효과

VEGF 수용체로 혈관신생을 매개하는 KDR의 티로신 키나아제(tyrosine kinase) 활성을 측정하기 위해 시판되는 KDR 키나아제 효소 시스템 (Promega #V2681) 과 ADP-Glow^TM키나아제 분석 키트 (Promega#V9101)을 사용하였다. KDR 효소 활성 측정과정은 다음과 같다.

키트에 함유된 KDR 효소 1.5 ng/㎕, poly (Glu4, Tyr1) 0.2 ㎍/㎕과 약물능 혼합한 용액에 ATP 50M (최종 농도)를 첨가하면서 반응이 시작되며, 반응 용액의 총 부피는 25 ㎕가 되도록 하였다. 이어서 ADP-Glow^TM용액과 키나아제 활성 감지 용액을 첨가한 후 발광 값을 측정하였다.

그 결과, 제조예 및 실시예 1~3 화합물의 처리에 의해 KDR 키나아제 활성은 양성대조군인 sutent에 비해 낮은 편이지만, 억제 되었다[표 4].

실험군 (0.5 μM)	KDR 키나아제 억제율(%)
Sutent (Sunitinib malate)	96.5 ± 0.7*
화합물 II-a	21.0 ± 4.9*
화합물 I-a	15.8 ± 4.0*
화합물 I-b	11.3 ± 4.1*
화합물 I-c	15.1 ± 7.7*
화합물 II-b	15.1 ± 5.2*
화합물 II-c	21.8 ± 1.5*

*P<0.05 compared to the vehicle-treated group.

실험예 3: 카텝신 S 활성 억제 효과

카텝신 S 활성은 시판되고 있는 형광측정법에 의한 카텝신 S 활성 억제 스크리닝 키트 (Catalog # K149-100; S. Milpitas Blvd., Milpitas, CA 95035 USA kit)를 이용하였다. 키트에 함유된 양성대조군 (Z-FF-FMAK)외에 카텝신 S 억제제로 잘 알려진 Z-FL-COCHO를 사용하였다.

그 결과, 하기 표 5와 같이 화합물의 처리에 의해 카텝신 S 활성이 억제되었다.

실험군 (10 μM)	카뎁신 S 활성 억제율(%)
Z-FL-COCHO	111.5 ± 0.6*
Z-FF-FMK	105.0 ± 0.3*
화합물 II-a	50.1 ± 0.8
화합물 I-a	82.9 ± 1.2*
화합물 I-b	2.3 ± 2.3
화합물 I-c	30.8 ± 3.5*
화합물 II-b	1.2 ± 2.7
화합물 II-c	28.7 ± 0.7*

*P<0.05 compared to the vehicle-treated group.

실험예 4: 카텝신 S 발현 및 MMP-9 발현 억제 효과 검토

제조예 및 실시예 1~3에서 합성된 화합물들을 MDA-MB-231 세포에 처리하였을 때 카텝신 S 유전자 및 MMP-9 유전자 발현에 미치는 영향을 검토하기 위하여 다음과 같이 RT-PCR을 수행하였다.

유방암 세포 MDA-MB-231 (1x10⁵cell/cm²)에 각 화합물을 각각 처리하여 37 ℃ 세포 배양기에서 24시간 동안 배양 후 트리졸 시약을 사용하여 전체 mRNA를 추출하였다. 24시간 후 배양액을 제거하고 트리졸 시약 1 mL을 각 웰에 첨가 후 세포 용출물을 1.5 mL 튜브로 옮겼다. 각 샘플에 클로로포름 200 ㎕를 첨가하여 4 ℃, 12,000 g에서 15분간 원심분리한 후 상층액 500 ㎕를 새 튜브로 옮겼다. 각 샘플에 이소프로필알코올 500 ㎕를 첨가 후 4 ℃, 12,000 g에서 15분간 원심분리 하였다. 각 샘플의 상등액을 제거하고 75% 에탄올로 mRNA를 헹군 후 침전을 말렸다. 그리고 추출한 mRNA는 RNase가 없는 물로 녹인 후 55 ℃에서 10분간 가열하였다.

RNA 정량 후, GoScript^TM역전사반응계(Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. PCR은 TaKaRa TaqTM (Takara bio Inc., Shiga, Japan)을 사용하여 실시하였으며, 카텝신 S 프라이머는 서열번호 1(정방향 서열: 5'-GCA GTG GCA CAG TTG CAT AA-3')의 정방향 프라이머와 서열번호 2(역방향 서열: 5'-AGC ACC ACA AGA ACC CAT GT-3')의 역방향 프라이머 세트를 사용하였다. MMP-9 프라이머는 서열번호 3(정방향 서열: 5'-CAC TGT CCA CCC CTC AGA GC-3')의 정방향 프라이머와 서열번호 4(역방향 서열: 5'-GCC ACT TCT CGG CGA TAT GG -3')의 역방향 프라이머 세트를 사용하였다. PCR 산물을 아가로스 겔에서 전기영동한 후 에티듐 브로마이드(0.5 ㎍/ml)로 염색하여 겔 이미징 시스템(UVP, Cambridge, UK)을 사용하여 사진을 얻었다. 이때, 글리세르알데히드 3-포스페이트 디하이드로게나아제(Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GAPDH)를 기준으로 정량하였다. GAPDH 프라이머는 서열번호 5(정방향 서열: 5-GGT GAA GGT CGG AGT CAA CG-3)의 정방향 프라이머와 서열번호 6(역방향 서열: 5-CAA AGT TGT CAT GGA TGA CC-3)의 역방향 프라이머 세트를 사용하였다.

그 결과, MDA-MB-231 세포에서 카텝신 S 유전자 발현 감소 효과는 화합물 I-a, II-a, I-c의 순으로 우수함을 확인하였다. 또한, 세포 침윤 억제 효과가 가장 큰 화합물 I-a는 카텝신 S 유전자 발현 감소 효과 또한 가장 큼을 확인할 수 있었다. 따라서, MDA-MB-231 세포의 침윤 억제 효과와 카텝신 S 유전자의 발현 억제 효과는 매우 높은 상관성이 있음을 확인하였다[도 4].

이 중 화합물 I-a는 도 5에 나타낸 바와 같이 카뎁신 S는 물론 MMP-9의 발현도 농도의존적으로 현저히 억제함을 확인하였다.

실험예 5: 화합물 I-a 를 사용한 유방암 세포의 침윤 억제 효과 검토

전이성이 강한 유방암 세포 MDA-MB-231의 침윤에 중요한 역할을 하는 카텝신 S의 억제제를 사용하여 유방암 세포 침윤 억제 효과를 검토하였다.

침윤 실험(invasion assay)는 8 ㎛ 포어 사이즈 필터를 가진 트랜스웰 인서트(Transwell insert; BD FALCON, Bedford, USA)를 사용하여 수행하였다. 트랜스웰 인서트 필터 위쪽에는 매트리겔(1 mg/ml) 20 ㎕로 코팅하고 아래쪽은 제1유형 콜라겐(0.5 mg/ml) 30 ㎕로 코팅하였다. MDA-MB-231 (5x10⁵cells/100 ㎕)을 인서트 챔버에 추가하고 각 억제제도 각 인서트 챔버에 추가하였다. 세포의 침윤을 유도하기 위하여 5% FBS를 포함한 배지를 바텀 챔버의 각 웰에 추가하여 37 ℃ 세포 배양기에서 반응시켰다. 18시간 후, 인서트 챔버 안의 용액을 버리고 남아 있는 세포를 면봉으로 제거한 후 멤브레인 아래에 있는 세포는 메탄올로 고정하고, 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 현미경으로 멤브레인에 있는 세포를 관찰하고 200x 해상도로 5 필드를 선택한 후 각 필드에 있는 세포 수를 계수하였다.

하기 표 6과 도 6과 같이, 카텝신 S 억제제(Z-FL-COCHO, 1 μM) 또는 MMP 억제제(Batimastst, 10 μM) 에 비하여 화합물 I-a가 처리된 세포에서 0.1 μM 농도부터 농도의존적인 현저한 침윤 억제 효과가 관찰되었다.

실험군	농도 (μM)	침윤 억제율(%)
Z-FL-COCHO	1	52.6 ± 1.6*
Batimastat	10	70.0 ± 1.8*
화합물 I-a	0.01	7.1 ± 0.7
	0.1	51.7 ± 1.8*
	1	86.6 ± 0.9
	10	87.8 ± 1.0*

*P<0.05 compared to the vehicle-treated group.

실험예 6: BJ-2302와 Z-FL-COCHO의 세포독성 비교

본 실험에서는 상기 실시예에서 제조된 화합물 I-a와 시판되는 카뎁신 S 억제제 Z-FL-COCHO의 세포 독성을 MTT 에세이로 측정하였다.

도 7에서 나타낸 바와 같이, 유방암세포 MDA-MB-231은 물론 정상 사람세포주인 ARPE(adult pigment retinal epithelial cell)-19에 대하여 화합물 I-a의 경우 대조군인 Z-FL-COCHO과 비교하여 훨씬 낮은 세포독성을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 7: 화합물 I-a, 화합물 I-b, 화합물 I-c의 카뎁신 S 발현 및 MDA-MB-231세포의 침윤 억제 활성 비교

카뎁신 S 발현 및 유방암세포 MDA-MB-231에 대한 침윤 억제 효과를 상기 실험예 4 및 5와 같이 실험하여 분석한 결과, 화합물 I-a, 화합물 I-c, 화합물 I-b의 순으로 억제 활성이 우수함을 확인하였다[도 8~10].

실험예 8: 독성실험

웅성 Balb/c 마우스에 화합물 I-a, I-b, I-c를 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 각각 현탁하여 0.5g/kg, 1g/kg 및 2g/kg의 용량으로 1회 단회 경구투여하고 7일간 마우스의 생존율 및 체중을 조사하였다.

이러한 투여 후 동물의 폐사 여부, 임상 증상, 체중 변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다.

이상의 결과, 본 발명의 화합물들은 마우스에서 2g/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며, 따라서, 경구 투여 중 간치사량(LD₅₀)은 2g/kg 이상인 안전한 물질로 판단되었다.

하기에 본 발명에 따른 화합물 I-a를 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1: 산제의 제조

화합물 I-a 20 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

제제예 2: 정제의 제조

화합물 I-a 20 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

제제예 3: 캅셀제의 제조

화합물 I-a 10 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

제제예 4: 주사제의 제조

화합물 I-a 10 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 혼합한 후 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

제제예 5: 연고제의 제조

화합물 I-a 10 mg, PEG-4000 250 mg, PEG-400 650 mg, 백색바셀린 10 mg, 파라옥시안식향산메틸 1.44 mg, 파라옥시안식향산프로필 0.18 mg 및 잔량의 정제수를 혼합한 후 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고제를 제조하였다.

<110> Research Cooperation Foundation of Yeungnam University <120> pyridin derivative or a pharmaceutically acceptable salt thereof and pharmaceutical composition comprising the same <130> X15U10C0023 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 gcagtggcac agttgcataa 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gcagtggcac agttgcataa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 cactgtccac ccctcagagc 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 gccacttctc ggcgatatgg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 5 ggtgaaggtc ggagtcaacg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 6 caaagttgtc atggatgacc 20

Claims

하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염:
[화학식 Ⅰ]

상기 화학식 Ⅰ에서,
R¹및 R³은 각각 같거나 다르며, C1 내지 C6의 알킬이고,
R²는 벤질옥시, 하이드록시 및 아세틸옥시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
R⁴은 수소; 비치환되거나 C_3-8사이클로알킬, COOC_1-6알킬, 페닐로 치환된 C_1-6알킬; CONHPh-할로겐; 및 Si(C_1-6알킬)₃;로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 상기 Ph는 페닐이고,
X는 CR⁵R⁶이며, R⁵및 R⁶은 각각 같거나 다르며, 수소, 벤질 및 C1 내지 C16의 알킬로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이다.
제 1 항에 있어서,
상기 피리딘 유도체는 화학식 Ⅰ에서,
R¹및 R³은 각각 같거나 다르며, C1 내지 C4의 알킬이고,
R²는 벤질옥시, 하이드록시 및 아세틸옥시로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며,
R⁴은 수소; 비치환되거나 C_3-8사이클로알킬, COOC_1-6알킬, 페닐로 치환된 C_1-6알킬; CONHPh-할로겐; 및 Si(C_1-6알킬)₃;로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나이며, 상기 Ph는 페닐이고,
X는 CR⁵R⁶이며, R⁵및 R⁶은 각각 수소인 것을 특징으로 하는 피리딘온 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염.
제 1 항에 있어서,
상기 피리딘 유도체는 5-하이드록시-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온인 것을 특징으로 하는 피리딘온 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염.
제 1 항에 있어서,
상기 약제학적 허용가능한 염은 옥살산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산 및 벤조산으로 이루어진 군에서 선택된 유기산이거나, 또는 염산, 황산, 인산 및 브롬화수소산으로 이루어진 군에서 선택된 무기산에 의해 형성되는 산부가염의 형태인 것을 특징으로 하는 피리딘온 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염.
하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물:
[화학식 Ⅰ]

상기 화학식 Ⅰ에서,
R¹및 R³은 각각 같거나 다르며, C1 내지 C6의 알킬이고,
R²는 하이드록시이며,
R⁴은 수소이고,
X는 CR⁵R⁶이며, R⁵및 R⁶은 각각 수소이고;
상기 혈관신생으로 인한 질환은 류마티스성 관절염, 골관절염, 패혈증성 관절염, 건선, 각막궤양, 노화와 관련된 황반 변성, 당뇨성 망막병증, 증식성 유리체 망막병증, 미성숙 망막병증, 안과 염증, 원추 각막, 쇼그렌 증후군, 근시 안과종양, 각막이식 거부, 이상 창상 유합, 골질환, 단백뇨증, 복대동맥류 질환, 외상성 관절 손상에 따른 퇴행성 연골손실, 신경계의 수초탈락 질환, 간경변, 신사구체 질환, 배태막의 미성숙 파열, 염증성 장질환, 치근막 질환, 동맥경화증, 재협착증, 중추신경계의 염증질환 및 알츠하이머 질환으로 이루어진 군에서 선택된다.
제 5 항에 있어서,
상기 피리딘 유도체는 화학식 Ⅰ에서,
R¹및 R³은 각각 같거나 다르며, C1 내지 C4의 알킬이고,
R²는 하이드록시이며,
R⁴은 수소이고,
X는 CR⁵R⁶이며, R⁵및 R⁶은 각각 수소인 것을 특징으로 하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 피리딘 유도체는 5-하이드록시-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온인 것을 특징으로 하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 약제학적 허용가능한 염은 옥살산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산 및 벤조산으로 이루어진 군에서 선택된 유기산이거나, 또는 염산, 황산, 인산 및 브롬화수소산으로 이루어진 군에서 선택된 무기산에 의해 형성되는 산부가염의 형태인 것을 특징으로 하는 혈관신생으로 인한 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
삭제
하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물:
[화학식 Ⅰ]

상기 화학식 Ⅰ에서,
R¹및 R³은 각각 같거나 다르며, C1 내지 C6의 알킬이고,
R²는 하이드록시이며,
R⁴은 수소이고,
X는 CR⁵R⁶이며, R⁵및 R⁶은 각각 수소이다.
제 10 항에 있어서,
상기 피리딘 유도체는 화학식 Ⅰ에서,
R¹및 R³은 각각 같거나 다르며, C1 내지 C4의 알킬이고,
R²는 하이드록시이며,
R⁴은 수소이고,
X는 CR⁵R⁶이며, R⁵및 R⁶은 각각 수소인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 10 항에 있어서,
상기 피리딘 유도체는 5-하이드록시-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 10 항에 있어서,
상기 약제학적 허용가능한 염은 옥살산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산 및 벤조산으로 이루어진 군에서 선택된 유기산이거나, 또는 염산, 황산, 인산 및 브롬화수소산으로 이루어진 군에서 선택된 무기산에 의해 형성되는 산부가염의 형태인 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
제 10 항에 있어서,
상기 암은 폐암, 유방암, 방광암, 뼈암, 갑상선암, 부갑상선암, 직장암, 인후암, 후두암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 암 예방 또는 치료용 약학조성물.
하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 피리딘 유도체 또는 이의 약제학적 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 암 침윤 또는 암 전이 예방 또는 억제용 약학조성물:
[화학식 Ⅰ]

상기 화학식 Ⅰ에서,
R¹및 R³은 각각 같거나 다르며, C1 내지 C6의 알킬이고,
R²는 하이드록시이며,
R⁴은 수소이고,
X는 CR⁵R⁶이며, R⁵및 R⁶은 각각 수소이다.
제 15 항에 있어서,
상기 피리딘 유도체는 화학식 Ⅰ에서,
R¹및 R³은 각각 같거나 다르며, C1 내지 C4의 알킬이고,
R²는 하이드록시이며,
R⁴은 수소이고,
X는 CR⁵R⁶이며, R⁵및 R⁶은 각각 수소인 것을 특징으로 하는 암 침윤 또는 암 전이 예방 또는 억제용 약학조성물.
제 15 항에 있어서,
상기 피리딘 유도체는 5-하이드록시-4,6-디메틸-1H-피롤로[2,3-b]피리딘-2(3H)-온인 것을 특징으로 하는 암 침윤 또는 암 전이 예방 또는 억제용 약학조성물.
제 15 항에 있어서,
상기 약제학적 허용가능한 염은 옥살산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 시트르산 및 벤조산으로 이루어진 군에서 선택된 유기산이거나, 또는 염산, 황산, 인산 및 브롬화수소산으로 이루어진 군에서 선택된 무기산에 의해 형성되는 산부가염의 형태인 것을 특징으로 하는 암 침윤 또는 암 전이 예방 또는 억제용 약학조성물.
제 15 항에 있어서,
상기 암은 폐암, 유방암, 방광암, 뼈암, 갑상선암, 부갑상선암, 직장암, 인후암, 후두암, 식도암, 췌장암, 대장암, 위암, 설암, 피부암, 뇌종양, 자궁암, 두부 또는 경부암, 담낭암, 구강암, 결장암, 항문 부근암, 중추신경계 종양, 간암 및 대장암으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 암 침윤 또는 암 전이 예방 또는 억제용 약학조성물.
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