KR101984623B1

KR101984623B1 - 트리아졸디온 기반 화합물을 이용한 비타민 d결합 및 형광이 담지된 실리카 나노입자를 이용한 비타민 d의 정량 검출 방법

Info

Publication number: KR101984623B1
Application number: KR1020170058984A
Authority: KR
Inventors: 이상명; 안태욱; 이남훈; 이대원; 김성수
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2017-05-12
Filing date: 2017-05-12
Publication date: 2019-05-31
Anticipated expiration: 2037-05-12
Also published as: KR20180124452A

Abstract

본 발명은 기존의 단백질을 이용한 비타민 D의 표지자가 아닌 수용액에서 사용가능한 화학물질 프로브인 트리아졸디온 기반 화합물을 이용하여 비타민 D를 고정함과 더불어, 형광이 담지된 실리나 나노입자를 이용하여 비타민 D를 낮은 농도에서도 정량 검출이 가능한 트리아졸디온 기반 화합물을 이용한 비타민 D결합 및 형광이 담지된 실리카 나노입자를 이용한 비타민 D의 정량 검출 방법에 관한 것이다. 본 발명은 트리아졸디온 유도체를 포함하는 비타민 D고정용 화학 프로브를 제공한다.

Description

트리아졸디온 기반 화합물을 이용한 비타민 D결합 및 형광이 담지된 실리카 나노입자를 이용한 비타민 D의 정량 검출 방법{Vitamin D Binding Using Triazolidione-based Compound and Detection of Quantitative Determination of Vitamin D Using Fluorescence Supported Silica Nanoparticles}

본 발명은 트리아졸디온 기반 화합물을 이용한 비타민 D결합 및 형광이 담지된 실리카 나노입자를 이용한 비타민 D의 정량 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 기존의 단백질을 이용한 비타민 D의 표지자가 아닌 수용액에서 사용가능한 화학물질 프로브인 트리아졸디온 기반 화합물을 이용하여 비타민 D를 고정함과 더불어, 형광이 담지된 실리나 나노입자를 이용하여 비타민 D를 낮은 농도에서도 정량 검출이 가능한 트리아졸디온 기반 화합물을 이용한 비타민 D결합 및 형광이 담지된 실리카 나노입자를 이용한 비타민 D의 정량 검출 방법에 관한 것이다.

비타민 D는 주로 태양광 노출에 의하여 피부에서 생산되거나 식이요법에 의한 섭취(주로 계란 노른자, 생선기름 및 식물)로부터 공급되는 지용성 스테로이드의 전구물질이다. 이러한 비타민 D는 생물학적으로 약리작용을 하지 않고 생물학적으로 활성화된 1,25-디하이드록시비타민 D(1,25-dihydrowyvitamin D)가 되기 위해서는 간과 신장에서 반드시 두 개의 수산기와 결합되어야 한다. 이러한 비타민 D의 주요한 두가지 형태는 비타민 D3(cholecalciferol)과 비타민 D2(ergocalciferol)이다. 이중 비타민 D3의 경우 채내 합성이 가능하지만 비타민 D2의 경우 채내 합성이 불가능하여 음식물로 섭취하여야 한다.

비타민 D는 주로 칼슘과 인의 대사를 좌우하며, 부족시 칼슘과 인의 열액내 농도가 충분하지 못하여 뼈에 축적되지 못함으로써 골격이 약해지고, 결국 몸에 부하되는 압력을 견디지 못하여 뼈가 휘거나 부러질 수 있다. 즉 뼈의 양은 정상이지만 뼈의 밀도가 감소된 상태가 되어 뼈가 연화되고 부러지기 쉬운 상태가 된다. 이러한 증상을 구루병, 골연화증으로 부르고 있으며. 폐경기 여성들에게 주로 발생하는 골다공증과는 달리 전연령에서 발생할 수 있다.

인체내에서 비타민 D3와 D2는 혈장의 비타민 D 결합 단백질(vitamin D bonding protein)과 결합하고 간으로 이동하여 25(OH)D3를 형성하여 수산화 된다. 이러한 25(OH)D는 인체에서 비타민 D의 주된 저장형태이므로 전반적인 비타민 D의 상태를 분석하기 위해서는 25(OH)D의 양을 측정하고 있다. 이러한 인체의 혈액내 비타민 D 농도의 빠르고 정확한 측정은 비타민 D의 결핍과 관련된 다양한 노인성 질환의 현장 진단에 있어 필수적으로 확보되어야 하는 기술이다.

기존의 비타민 D를 검출하는 선행연구들은 특정 단백질 표지자(Protein probe)나 계면활성제를 이용하여 비타민 D를 분리 및 검출하고 있었다. 하지만 이러한 단백질 또는 계면활성제를 이용한 비타민 D의 분리 및 검출은 유기용매상에서 진행되기 때문에 유기용매의 세출/분리과정 중에서 고정화된 비타민 D가 유실되어 검출의 정확성에 문제를 가지고 있었다.

전술한 문제를 해결하기 위하여, 본 발명은 기존의 단백질 표지자가 아닌 수용액에서 사용가능한 화학 표지자 물질인 트리아졸디온 기반 화합물을 이용하여 비타민 D를 고정함과 더불어, 형광이 담지된 실리나 나노입자를 이용하여 비타민 D를 낮은 농도에서도 정량 검출이 가능한 트리아졸디온 기반 화합물을 이용한 비타민 D결합 및 형광이 담지된 실리카 나노입자를 이용한 비타민 D의 정량 검출 방법을 제공하고자 한다.

상술한 문제를 해결하기 위해, 제1양태에 의한 본 발명은 트리아졸디온 유도체를 포함하는 비타민 D고정용 화학 프로브를 제공한다.

상기 트리아졸디온 유도체는 4-페닐-1,2,4-트리아졸-3,5디온(4-phenyl-1,2,4-triazole-3,5-dione, PTAD)일 수 있다.

제2양태에 의한 본 발명은, 상기 비타민 D고정용 화학프로브를 통해 정량적 검출을 위한 형광이 담지된 실리카 나노입자를 제공한다.

상기 실리카 나노입자는 형광물질이 추가로 담지될 수 있다.

상기 실리카 나노입자는, (a) 형광 실리카 나노입자 중간체를 형성하는 단계; (b) 링커와 계면활성제를 이용하여 하기 화학식 1로 표시되는 표면 개질을 진행하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되며,

<화학식 1>

(단, 상기 화학식에서 n = 10 ~ 15 KDa 임); 상기 단계 (a)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

(a-1) 용매에 형광물질 및 형광물질 전처리제를 첨가한 후 교반하는 단계; (a-2) 상기 단계 (a-1)에서 얻어진 용액을 실리카 전구체 및 촉매를 포함하는 용액과 혼합하여 교반 후 세척하는 단계.

또한 제3양태에 의한 본 발명은 상기 실리카 나노입자를 이용한 비타민 D의 정량검출 방법을 제공한다.

본 발명에 의한 트리아졸디온 기반 화합물을 이용한 비타민 D결합 및 형광이 담지된 실리카 나노입자를 이용한 비타민 D의 정량 검출 방법은 낮은 농도에서도 정확하게 비타민 D의 정량검출이 가능하여 비타민 D의 결핍과 관련된 다양한 노인성 질환의 현장 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 의한 비타민 D고정용 화학 프로브를 이용한 비타민 D의 고정반응의 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 의한 실리카 나노입자를 이용하여 샌드위치 기법을 통하여 형광물질 및 화학프로브를 담지하는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 의한 화학프로브와 비타민 D의 콘쥬게이션에 따른 HPLC 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 의한 수용액상 반응에서 화학프로브와 비타민 D의 콘쥬게이션에 따른 HPLC 분석결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 의한 비타민 D의 검출응답 테스트 결과그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 의한 형광 전구체의 주입시점에 따른 형광패턴 및 실리카에 포함되지 않은 형광 전구체에 의한 형광세기의 변화는 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 의한 보관온도에 따른 크기 및 형광세기의 변화를 나타낸 그래프이다.

이하에서는 본 발명의 바람직한 실시예를 상세하게 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 흐리게 할 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략하기로 한다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한, 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성요소를 더 포함할 수 있음을 의미한다.

제1양태에 의한 본 발명은 본 발명은 트리아졸디온 유도체를 포함하는 비타민 D고정용 화학 프로브에 관한 것이다.

기존의 비타민 D검출 방법에서는 단백질 프로브나 계면활성제를 이용하여 비타민 D를 고정하였으며, 유기용매를 이용하여 검출을 진행하므로, 유기용매의 세척 및 분리과정에서 단백질과 결합된 비타민 D의 일부가 유실되는 문제점을 가지고 있었다. 하지만 본 발명에서는 트리아졸디온 유도체를 이용하여 비타민 D를 고정함에 따라 수용액상에서 검출이 가능하며, 이에 따라 비타민 D의 유실량을 최소한으로 억제하여 정확한 정량 분석이 가능하도록 하였다. 이때 사용되는 트리아졸디온 유도체는 비타민 D를 고정할 수 있는 유도체라면 제한없이 사용가능하지만, 바람직 하게는 4-페닐-1,2,4-트리아졸-3,5디온(4-phenyl-1,2,4-triazole-3,5-dione, PTAD)를 사용할 수 있다. 또한 상기 4-페닐-1,2,4-트리아졸-3,5디온은 비타민 D를 직접 고정하는 것도 가능하지만 도1에 나타난 바와 같이, 1,3-다이브로모-5,5-다이메틸히덴토인(1,3-dibromo-5,5dimethyihydantoin)을 이용하여 활성화 한 다음, 딜스알더(Diels-Alder)반응을 이용하여 비타민 D를 고정하는 것이 더욱 바람직하다.

최종적으로 샌드위치 어세이 (Sandwich assay)를 통한 비타민 D정량 검출을 위해 자성나노입자에 고정화 하는 방법이 필요하며 수용액 상에서도 입자 안정성 및 균일한 분산을 위해 PEG 및 Biotin으로 개질된 다이벤조사이크로옥틴 (Dibenzocycloooctyne, DBCO)를 이용하여 클릭반응 (Click reaction)을 통한 PTAD-비타민 D고정용 프로브와 결합한다.

또한 제2양태에 의한 본 발명은 상기 비타민 D가 고정된 화학프로브의 정량적 검출을 위해 형광이 담지된 실리카 나노입자에 관한 것이다. 상기 비타민 D가 고정된 화학프로브의 경우 단독으로 검출에 사용할 수 없으므로, 상기 비타민 D가 고정된 화학프로브를 표면이 카르복실기로 개질된 자성나노입자에 결합한 다음, 형광이 담지된 실리카 나노입자를 이용하여 샌드위치 기법을 통하여 비타민 D의 정량검출에 사용할 수 있다(도 2).

상기 실리카 나노입자는 형광물질이 추가로 담지된 것으로 표면 개질제에 의해 표면이 개질되어 수용액에서 고분산성을 가지며 형광물질이 도입되어 광 조사에 의해 여기 상태(excitation state)가 되었다가 기저 상태(ground state)로 돌아가면서 흡수한 에너지를 특정 파장의 빛으로 방출하는 형광 특성을 가진다.

상기 형광 실리카 나노입자는, 표면에 작용기(functional group)를 가지고 형광물질이 도입된 형광 실리카 나노입자 중간체를 형성하고, 링커(linker)와 계면활성제를 이용하여 제조된 표면 개질제를 형성한 후, 상기 형광 실리카 나노입자 중간체의 표면을 상기 표면 개질제로 개질하여 제조될 수 있다. 또한 상기 표면 작용기는 원하는 목표물질에 따라 다양한 작용기가 사용될 수 있지만, 본 발명의 비타민 D를 검출하기 위하여 비타민 D고정용 화학프로브인 트리아졸디온 유도체를 사용하는 것이 바람직하다.

상기 표면 개질제는 링커와 계면활성제를 이용하여 제조되는데, 상기 링커는 계면활성제가 형광 실리카 나노입자의 표면을 코팅할 수 있도록 형광 실리카 나노입자 중간체와 계면활성제 사이를 가교하는 역할을 하는 것으로서, 계면활성제와 결합된 형태를 가지며, 형광 실리카 나노입자 중간체 표면의 작용기와 반응할 수 있는 작용기를 가진다. 예를 들면, 형광 실리카 나노입자 중간체 표면의 작용기가 아민기인 경우, 상기 링커는 글루타알데하이드(glutaraldehyde) 등과 같이 알데하이드기가 포함된 링커일 수 있다.

상기 계면활성제는 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자의 표면에 코팅되어 상기 형광 실리카 나노입자가 수용액에서 응집되지 않고 높은 분산성을 갖도록 하는 것으로서, 바람직하게는, 음이온성 계면활성제 또는 비이온성 계면활성제일 수 있으며, 구체적으로, 폴리비닐피롤리돈(PVP: Polyvinylpyrrolidone), 폴리아크릴산, 폴리이민, 설포 숙신산, 알킬포스페이트, 폴리옥시에틸렌 지방에테르, 폴리옥시에틸렌 페닐에테르, DBS(Dodecyl benzene sulfonate), 지방산아민 에테르 폴리옥시에틸렌, 소비탄 지방산 에스터, 폴리옥시에틸렌 소비탄 지방산 에스터, 지방 에테르 함유 폴리옥시에틸렌, 방향족 에테르 함유 폴리옥시에틸렌 및 폴리에틸렌글리콜 에스터 등을 그 예로서 들 수 있다.

본 발명에서 사용되는 표면 개질제의 구체적인 예로서는, 하기 화학식 1로 표시되며, 히알루론산을 반응시켜 제조된 표면 개질제를 들 수 있다.

<화학식 1>

(단, 상기 화학식에서 n = 10 ~ 15 KDa 임)

또한, 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자에 도입되는 상기 형광물질은 공지의 형태를 용도에 따라 적절히 선택하여 사용할 수 있는데, 상기 형광물질의 예로서, 알렉사 플루오르(Alexa fluor, AF) 350, 405, 430, 488, 500, 514, 633, 647, 660, 680, 700, cy3, cy5, cy7, 루피(Rubpy)(tris(2,2-bipyridyl)ruthenium(Ⅱ)) FITC(fluoresein Isothiocyanate), 로다민 6G(rhodamine 6G), 로다민 B(rhodamine B), TAMRA(6-carboxytetramethyl-rhodamine), 텍사스 레드(Texas Red), DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole) 및 Coumarin 등을 들 수 있다. 그 중에서도, 본 발명에서 사용하는 형광물질은 근적외선(near infrared, NIR)을 발광하는 것이 바람직한데, 이는 근적외선은 생체 투과도가 높아서 생체 이미징(imaging) 에 적합하기 때문이다.

실리카 나노입자에 도입되는 형광물질의 함량과 관련하여, 통상 나노입자는 일반 염료 분자보다 형광 신호가 강하기 때문에 농도를 낮추는 것이 가능하긴 하지만, 형광 실리카 나노입자 하나 당 2 ~ 500개의 형광분자를 함유한 형광 실리카 나노입자가 바람직한데, 이는 형광물질의 함량이 나노입자 하나 당 2개 미만이면 형광성이 저하되고, 500개를 초과하면 나노입자의 크기가 너무 커지기 때문에 본 발명의 용도에 부합하지 않기 때문이다.

나아가, 상기 형광 실리카 나노입자는 표면에 도입된 알데히드기, 아민기, 수산기, 티올기 등의 작용기를 매개로 생체분자(biomolecue)를 포함한 유용한 다른 분자를 형광 실리카 나노입자에 콘쥬게이션(conjugation) 시킬 수 있다. 이때, 형광 실리카 나노입자에 컨쥬게이션 시키는 분자는 특별히 제한되지 않으나, 생체분자와 특이적으로 결합할 수 있는 물질인 것이 바람직하며, 예를 들면, 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D, 비타민E, 비타민K, 항체, 항원, RNA, DNA, PNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵ 등의 방사선 동위원소 표지 물질 등이다.

한편, 상기 형광 실리카 나노입자는 그 직경이 50 ~ 500nm 인 것이 바람직하다. 직경이 50nm 미만이면 나노입자가 지나치게 작아서 다루기 힘들어지고, 다른 유용한 분자를 컨쥬게이션 시키는 것이 용이하지 않으며, 직경이 500nm를 초과하면 형광 실리카 나노입자를 멤브레인 타입 진단 키트 또는 생체 시스템에 사용하기에 과도한 크기를 가진다는 문제점이 발생한다.

상기에서 상세히 설명한 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자는 형광물질이 도입되고 항체 등의 분자가 접합되어 있을 뿐만 아니라, 수용액 내에서 고분산성을 나타내기 때문에, 생체분자의 검출 및 생체분자의 영상화에 효과적으로 사용될 수 있다.

보다 구체적으로, 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자는 형광 현미경을 이용한 영상 진단 프로브(조영제), 바이오칩, 바이오센서 등의 생물의학적 분야에 널리 유용하게 사용될 수 있다.

예를 들어, 항체가 접합된 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자는, ELISA(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석, 면역침전, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry) 등의 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining)의 용도로 유용하게 사용될 수 있다. 한편, 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자는 적절한 담체에 담지되어 윤활제, 습윤제, 유화제, 보존제 등과 함께 조성물을 이루어 사용되는 것이 바람직하다. 여기서, 상기 담체는 약학적으로 허용되는 담체인 것이 바람직하며, 구체적으로, 물, 이온 교환 수지, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 혈청 단백질, 각종 완충물질, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로즈계 기질, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 카르복시메틸 셀룰로즈, 폴리아릴레이트, 왁스, 폴리에틸렌 글리콜 등을 들 수 있다.

다음으로, 본 발명에 따른 수용액에서 고분산성을 가지는 형광물질이 도입된 형광 실리카 나노입자의 제조방법에 대해 설명한다.

본 발명에 따른 수용액에서 고분산성을 가지는 형광물질이 도입된 형광 실리카 나노입자의 제조방법은, (a) 형광 실리카 나노입자 중간체를 형성하는 단계; 및 (b) 링커와 계면활성제를 이용하여 형광실리카 나노입자의 표면 개질을 진행하는 단계를 포함하며, 이하에서 상기 각 단계에 대해 상세히 설명한다.

본 제조방법의 단계 (a)에서는 형광 실리카 나노입자 중간체를 형성하는 단계로서 그 구체적인 수행 조건은 특별히 한정되지 않으며, 아래와 같은 방법으로 수행되는 것을 일례로 들 수 있다.

즉, 상기 단계 (a)는, (a-1) 용매에 형광물질 및 형광물질 전처리제를 첨가한 후 교반하는 단계; (a-2) 상기 단계(a-1)에서 얻어진 용액을 실리카 전구체 및 촉매를 포함하는 용액과 혼합하여 교반 후 세척하는 단계를 포함하여 수행될 수 있다.

구체적으로, 상기 단계 (a-1)는 형광물질과 형광물질 전처리제를 혼합하여 반응시킴으로써 실리카 나노입자에 도입될 형광물질을 개질하는 단계이다.

이때, 상기 용매는 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 에틸 아세테이트, 테트라 하이드로퓨란(THF), 에틸아세테이트, 아세톤, 아세토니트릴 등의 극성 유기 용매인 것이 바람직하며, 상기 형광물질은 상기에서 이미 설명한 바와 같이 알렉사 플루오르(Alexa fluor, AF) 등을 사용할 수 있다.

또한 상기 형광물질 전처리제는 3-아미노프로필트리메톡시실란, 3-아미노프로필트리에톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-메틸-3-아미노프로필트리에톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리메톡시실란, N-(2-아미노에틸)-3-아미노프로필트리에톡시실란, 4-아미노사이클로트리메톡시실란, 4-아미노사이클로트리에톡시실란, p-아미노페닐트리메톡시실란 및 p-아미노페닐트리에톡시실란으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으며 바람직하게는 3-아미노프로필트리메톡시실란(APTMS)을 사용할 수 있다.

상기 단계 (a-2)는 단계 (a-1)에서 얻어진 개질된 형광물질과 실리카 전구체를 적절한 촉매의 존재 하에 적절한 용매에서 혼합하여 실리카 전구체의 클러스터로의 결합, 가수분해 및 축합반응을 통한 겔화 반응에 의해 형광물질이 도입된 실리카 나노입자 중간체를 합성하는 단계이다.

이때, 상기 용매는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는, 실리카 전구체의 가수 분해 반응을 진행시키는 역할을 하는 탈이온수(D.I. water) 등의 물과, 물 및 실리카 전구체를 균질하게 혼합시켜 가수 분해 반응을 진행시킬 수 있는 알코올의 혼합 용매를 사용한다. 상기 혼합용매에서 물과 알코올의 혼합비는 특별히 제한되지 않고, 당업자가 적절히 선택할 수 있다.

또한, 상기 실리카 전구체는 테트라메톡시 실란(tetramethoxy silane, TMOS), 테트라에톡시실란(tetraethoxysilane, TEOS) 또는 그 혼합물 등의 공지의 알콕시 실란을 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 본 단계 (a-2)는 상기 가수 분해 반응을 촉진시키기 위해 촉매하에서 진행되는 것이 바람직한데, 상기 촉매는 염산, 아세트산 등의 산성 촉매 또는 염화암모늄, 염화칼륨 등의 염기성 촉매 등에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다.

본 제조방법의 단계 (b)에서는 링커와 계면활성제를 이용하여 표면 개질제를 형성하는 단계로서 초순수, 증류수, PBS(phosphate-buffered saline), 에탄올, 메탄올, 프로판올, 부탄올 등의 각종 알코올, 아세트산(acetic acid) 또는 포름산(formic acid), NaHCO3 완충용액 등의 수계 용매에, 상기에서 상세히 설명한 바 있는 링커와 계면활성제를 첨가하여 반응시킴으로써 표면 개질제를 제조할 수 있다.

구체적으로, 단계 (b)는 상기 단계 (a)에서 얻어진 표면에 표면 개질제를 첨가하여 교반하여 반응시킴으로써 이루어지는데, 본 단계에서는 형광실리카 나노입자 중간체 표면의 작용기가 링커에서 유래하는 표면 개질제의 작용기와 반응함으로써, 표면 개질제, 더욱 엄밀하게는 표면 개질제 내에서도 계면활성제로부터 유래하는 부분에 의해 형광 실리카 나노입자 중간체가 코팅되어 최종적으로 형광 실리카 나노입자가 제조된다.

상기 형광 실리카 나노입자는 표면 개질제에 의해 코팅됨으로써 전체 제타 전위(Zeta potential)가 -5 ~ -50mV이하의 범위로 제어됨으로써 수용액 내에서 나노입자 간의 엉김 현상이 발생하는 일 없이 높은 분산성을 유지할 수 있다. 상기 제타 전위의 제어는 본 단계에서 사용되는 표면 개질제의 함량을 적절히 조절함으로써 이루어질 수 있으며, 이와 같이 표면 개질제의 함량 조절에 의한 형광 실리카 나노입자의 제타 전위 제어는 당업자가 과도한 시행착오 없이 용이하게 수행할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자의 제조방법은 상기 단계 (b)를 수행한 후에, (c) 상기 단계 (b)에서 표면 개질된 형광 실리카 나노입자의 표면에 비타민 D고정용 화학프로브를 도입하는 단계를 추가로 수행할 수 있다. 본 단계는 도입하고자 하는 비타민 D고정용 화학프로브를 이용해 형광 실리카 나노입자의 표면을 처리함으로써 수행되는데, 그 구체적인 실행 방법은 특별히 제한되지 아니하고 공지의 방법에 의해 행할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자의 제조방법은, (d) 상기 단계 (c)에서 형성된 형광 실리카 나노입자의 표면에 존재하는 비타민 D고정용 화학프로브를 통해 생체분자(biomolecue)를 포함한 유용한 다른 분자를 형광 실리카 나노입자에 콘쥬게이션(conjugation)시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자에 컨쥬게이션 시키는 분자는 특별히 제한되지 않으나, 생체분자와 특이적으로 결합할 수 있는 물질인 것이 바람직하며, 예를 들면, 비타민A, 비타민B, 비타민C, 비타민D, 비타민E, 비타민 K, 항체, 항원, RNA, DNA, PNA, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 방사선 동위원소 표지 물질 등이다.

본 단계에서는 접합하고자 하는 분자에 대응하여 상기 단계 (b)에서 도입된 작용기를 매개로 컨쥬게이션을 수행하게 되며, 이때, 형광 실리콘 나노입자의 작용기에 생체분자를 컨쥬게이션 시키는 구체적인 수행 방법은 공지된 기법을 이용하여 당업자가 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 표면에 알데히드기를 가지는 형광 실리카 나노입자의 경우에는 알데히드기에 의해 항체와 같은 단백질과 접합이 가능하고, 아민기를 가지는 형광 실리카 나노입자는 무수 숙신산(succinic anhydride) 등으로 아민기를 카르복실기로 전환시킨 후, 이를 EDC(dicyclohexylcarbodiimide)와 반응시켜 아민기를 함유한 생체분자와 컨쥬게이션 시킬 수 있다.

다음으로, 본 발명은 상기 형광 실리카 나노입자를 이용한 비타민 D 검출방법에 대해 설명한다.

본 발명에 따른 형광 실리카 나노입자를 이용한 비타민 D 검출방법은, (a) 분자가 접합된 형광 실리카 나노입자를 준비하는 단계; (b) 상기 형광 실리카 나노입자를 검출 대상 물질(비타민 D)을 포함하는 시료에 투입하여 반응시킨 후 광을 조사하는 단계; 및 (c) 상기 시료로부터 형광을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 (a) 단계는 위에서 상세하게 설명한 제조방법에 따라 형광 실리카 나노입자를 제조함으로써 수행될 수 있다. 상기 (b) 단계에서는 실리카 나노입자에 포함된 형광물질의 흡광 영역에 해당하는 파장의 광을 조사한다. 상기 (c) 단계에서는 시료와 반응한 형광물질로부터 발산되는 형광을 형광 현미경 등을 통해 검출한다.

이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 자세히 설명한다.

실시예 1

유기용매(아크릴로니트릴, acrylonitrile, ACN)상에서 1,3-다이브로모-5,5-다이메틸히덴토인(1,3-dibromo-5,5dimethyihydantoin)을 이용하여 PEG chain이 결합된 4-페닐-1,2,4-트리아졸-3,5디온(4-phenyl-1,2,4-triazole-3,5-dione, PTAD)을 활성화 시킨 다음, 비타민 D와 딜스알더(Diels-Alder)반응을 수행하였다. 이후 HPLC분석을 통해 비타민 D와 PTAD간의 결합을 확인하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, HPLC 분석 상에서 30분 대에 나타나는 비타민 D의 고유 머무름 피크가 사라지는 것을 확인할 수 있었으며, 이에 따라 효과적인 컨쥬게이션이 진행되고 있는 것을 확인하였다.

실시예 2

상기 실시예 1은 유기용매상에서 진행되었지만 비타민 D의 검출 정확도를 높이고 검출과정에서 비파괴적인 특성을 부여하기 위하여 수용액상에서의 실험을 실시하였다. ACN과 물을 50:50의 부피비율로 혼합하여 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일하게 실시하였다.

도 4에 나타난 바와 같이, 비타민 D의 고유피크가 1분이내의 반응시간에서도 사라지는 것을 확인할 수 있었으며, 이는 수용액에 가까운 환경에서도 비타민 D의 컨쥬게이션이 가능하며, 검출 또한 가능한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3

상기 PTAD기반의 프로브를 이용하여 마그네틱 비드와 결합한 다음, 본 특허에서 개발한 실리카 나노입자를 이용하여 비타민 D의 검출응답 테스트를 수행하였다. 도 5에 나타난 바와 같이, 목표 D농도(0.01~0.1㎍/mL)에서 안정적인 선형응답 특성을 나타내었다.

실시예 4

상기 PTAD기반 프로브의 선형응답특성을 보다 개선하기 위하여 형광유도체(AF647, Invitrogen)의 형광 응답 세기를 향상시킬 필요가 있으므로 최적화된 형광유도체를 합성을 위한 실험을 실시하였다.

기존의 AF647의 형광 효율 증대를 위하여 형광 유도체의 주입시점을 단계적으로 변화시켜 각 주입시점에 따른 형광의 변화를 측정하였다. 이를 통하여 형광유도체(AF647)이 실리카 입자의 외측에 분포하도록 유도하였다.

형광유도체의 주입시점을 10분 간격으로 변경하며 주입한 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 형광유도체의 주입시점이 늦어질수록 형광신호가 높아지며, 약 60분에서 최대 형광이 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 최종적으로 주입시점이 늦어짐에 따라, 적은양의 형광전구체로도 높은 형광의 세기를 확인할 수 있었으며, 이전보다 효과적인 형광유도체의 합성이 가능할 것으로 판단되었다.

실시예 5

상기 실시예 4의 방법으로 합성한 형광유도체의 안정성을 확인하기 위하여 온도(4℃, 25℃)에 따른 형광의 변화를 관측하였다. 도 7에 나타난 바와 같이 두 개의 온도조건에서 모두 형광의 크기 및 입자의 크기변화가 거의 없음을 확인할 수 있었으며, 실제 제품 적용시에도 안정성의 문제는 발생하지 않을 것으로 판단되었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

트리아졸디온 유도체를 포함하는 비타민 D고정용 화학프로브의 정량적 검출을 위한 실리카 나노입자.
제 1항에 있어서,
상기 트리아졸디온 유도체는 4-페닐-1,2,4-트리아졸-3,5디온(4-phenyl-1,2,4-triazole-3,5-dione, PTAD)인 실리카 나노입자.
삭제
제1항에 있어서,
상기 실리카 나노입자는 형광물질이 추가로 담지된 실리카 나노입자.
제4항에 있어서,
상기 실리카 나노입자는,
(a) 형광 실리카 나노입자 중간체를 형성하는 단계; 및
(b) 링커와 계면활성제를 이용하여 하기 화학식 1로 표시되는 표면 개질을 진행하는 단계를 포함하는 방법으로 제조되며;
<화학식 1>

(단, 상기 화학식에서 n = 10 ~ 15 KDa 임)
상기 단계 (a)는 하기 단계를 포함하는 방법으로 제조되는 실리카 나노입자:
(a-1) 용매에 형광물질 및 형광물질 전처리제를 첨가한 후 교반하는 단계;
(a-2) 상기 단계 (a-1)에서 얻어진 용액을 실리카 전구체 및 촉매를 포함하는 용액과 혼합하여 교반 후 세척하는 단계.
제1항의 실리카 나노입자를 이용한 비타민 D의 정량검출 방법.