[go: up one dir, main page]

KR101979134B1 - 인자 １１ 발현의 조정 - Google Patents

인자 １１ 발현의 조정 Download PDF

Info

Publication number
KR101979134B1
KR101979134B1 KR1020177023938A KR20177023938A KR101979134B1 KR 101979134 B1 KR101979134 B1 KR 101979134B1 KR 1020177023938 A KR1020177023938 A KR 1020177023938A KR 20177023938 A KR20177023938 A KR 20177023938A KR 101979134 B1 KR101979134 B1 KR 101979134B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
factor
compound
isis
modified
certain embodiments
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020177023938A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170101324A (ko
Inventor
수잔 엠. 프라이어
브렛 피. 모니아
훙 장
천광 자오
제프리 알. 크로스비
앤드류 엠. 시우코우스키
Original Assignee
아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드 filed Critical 아이오니스 파마수티컬즈, 인코포레이티드
Publication of KR20170101324A publication Critical patent/KR20170101324A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101979134B1 publication Critical patent/KR101979134B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/365—Lactones
    • A61K31/366—Lactones having six-membered rings, e.g. delta-lactones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/4365—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system having sulfur as a ring hetero atom, e.g. ticlopidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/44—Non condensed pyridines; Hydrogenated derivatives thereof
    • A61K31/445—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine
    • A61K31/4523—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems
    • A61K31/4545—Non condensed piperidines, e.g. piperocaine containing further heterocyclic ring systems containing a six-membered ring with nitrogen as a ring hetero atom, e.g. pipamperone, anabasine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/726—Glycosaminoglycans, i.e. mucopolysaccharides
    • A61K31/727—Heparin; Heparan
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • A61K31/737—Sulfated polysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/14—Vasoprotectives; Antihaemorrhoidals; Drugs for varicose therapy; Capillary stabilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1137—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21027—Coagulation factor XIa (3.4.21.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/334—Modified C
    • C12N2310/3341—5-Methylcytosine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/341—Gapmers, i.e. of the type ===---===
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/34—Spatial arrangement of the modifications
    • C12N2310/346—Spatial arrangement of the modifications having a combination of backbone and sugar modifications

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Pulmonology (AREA)

Abstract

필요로 하는 개체에서 인자 11을 감소시키고 혈전색전성 합병증을 치료 또는 예방하기 위한 안티센스 화합물 및 방법이 본원에 개시된다. 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 화합물의 투여로 개선될 수 있는 질환 상태의 예로는 혈전증, 색전증, 및 혈전색전증, 예컨대 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 심근 경색증, 및 졸중이 포함된다. 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 혈전증 및 색전증의 위험이 있는 개체를 예방하기 위한 예방적 처치로서 또한 사용될 수 있다.

Description

인자 １１ 발현의 조정{MODULATION OF FACTOR 11 EXPRESSION}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e) 하에 미국 가출원 번호 61/105,772 (2008년 10월 15일 출원) 및 미국 가출원 번호 61/174,461 (2009년 4월 30일 출원)을 우선권으로 청구한다. 상기 출원 각각은 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 전자 양식의 서열 목록과 함께 출원된다. 이러한 서열 목록은 2009년 10월 15일 생성된 20091015_BIOL0107WOSEQ.txt 명칭의 파일로서 제공되고, 이의 크기는 92 Kb이다. 전자 양식의 서열 목록 내의 정보는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명의 실시양태들은 동물에서 인자 11 mRNA 및 단백질의 발현을 감소시키기 위한 방법, 화합물 및 조성물을 제공한다. 이같은 방법, 화합물 및 조성물은 혈전색전성 합병증의 치료, 예방 또는 개선에 유용하다.
배경기술
순환계는 혈액 상실을 방지하는 메커니즘, 뿐만 아니라 부적합한 혈관내 폐쇄에 대응하는 메커니즘을 필요로 한다. 일반적으로, 응고는 가용성 피브리노겐이 불용성 피브린 젤로 전환되는 것에서 절정을 이루는 반응 케스케이드를 포함한다. 이러한 케스케이드의 단계들은 불활성 효소원의 활성화된 효소로의 전환을 수반한다. 그후, 활성 효소가 케스케이드 내의 다음 단계를 촉매한다.
응고 케스케이드
응고 케스케이드는 주요 경로인 조직 인자 경로 (또한 "외인성 경로"), 및 접촉 활성화 경로 (또한 "내인성 경로")의 2가지 분지를 통해 개시될 수 있다.
조직 인자 경로는 세포 표면 수용체 조직 인자 (인자 III로 또한 지칭되는 TF)에 의해 개시되고, 이는 혈관외 세포 (혈관주위세포, 심근세포, 평활근 세포, 및 각질세포)에 의해 구성적으로 발현되고, 염증성 시토카인 또는 내독소에 의한 유도 시 혈관 단핵구 및 내피 세포에 의해 발현된다 ([Drake et al., Am J Pathol 1989, 134:1087-1097]). TF는 세린 프로테아제(protease)인 응고 인자 VIIa에 대한 고친화력 세포 수용체이다. TF의 부재 하에, VIIa는 촉매 활성이 매우 낮고, TF에 결합하는 것이 알로스테릭한(allosteric) 메커니즘을 통해 VIIa를 기능성이게 하는데 필요하다 ([Drake et al., Am J Pathol 1989, 134:1087-1097]). TF-VIIa 복합체는 인자 X를 Xa로 활성화시킨다. 차례로 Xa가 자신의 공동인자인 인자 Va와 프로트롬비나제(prothrombinase) 복합체로 회합하고, 차례로 이는 프로트롬빈 (인자 II 또는 인자 2로 또한 공지됨)을 트롬빈 (인자 IIa, 또는 인자 2a로 또한 공지됨)으로 활성화시킨다. 트롬빈은 혈소판을 활성화시키고, 피브리노겐을 피브린으로 전환시키며, 인자 XIII를 활성화시킴으로써 피브린 가교를 촉진하고, 따라서 TF가 혈관외 세포 상에 노출된 부위에서 안정적인 마개를 형성시킨다. 또한, 트롬빈은 인자 V 및 VIII를 활성화시킴으로써 응고 케스케이드 응답을 강화한다.
접촉 활성화 경로는 인자 XII가 XIIa로 활성화되는 것에 의해 촉발된다. 인자 XIIa는 XI을 XIa로 전환시키고, XIa는 IX를 IXa로 전환시킨다. IXa는 자신의 공동인자인 VIIIa와 회합하여 X를 Xa로 전환시킨다. 인자 Xa가 인자 Va와 회합하여 프로트롬빈 (인자 II)을 트롬빈 (인자 IIa)으로 전환시킴에 따라, 이러한 지점에서 2가지 경로가 수렴된다.
응고 억제
적어도 3가지의 메커니즘, 즉 활성화된 단백질 C의 작용, 항트롬빈, 및 조직 인자 경로 억제제가 응고 케스케이드를 제어한다. 활성화된 단백질 C는 공동인자 Va 및 VIIIa를 분해하는 세린 프로테아제이다. 단백질 C는 트롬보모듈린과 함께 트롬빈에 의해 활성화되고, 기능하기 위해 보조효소 단백질 S를 필요로 한다. 항트롬빈은 세린 프로테아제인 트롬빈, Xa, XIIa, XIa 및 IXa를 억제하는 세린 프로테아제 억제제 (세르핀)이다. 조직 인자 경로 억제제는 Xa 및 TF-VIIa 복합체의 작용을 억제한다 ([Schwartz AL et al., Trends Cardiovasc Med. 1997;7:234-239]).
질환
혈전증은 병리학적인 혈병 발달이고, 혈병이 신체의 또 다른 부분으로 이동하여 장기의 기능을 방해하는 경우 색전증이 발생한다. 혈전색전증은 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 심근 경색증, 및 졸중과 같은 상태를 야기할 수 있다. 두드러지게, 혈전색전증은 매년 2백만 명이 넘는 미국인에게 영향을 미치는 이환률의 주요 원인이다 ([Adcock et al. American Journal of Clinical Pathology. 1997;108:434-49]). 대부분의 혈전증 사례는 후천적인 외인성 문제, 예를 들어, 수술, 암, 부동에 기인하지만, 일부 사례는 유전적인 소인, 예를 들어, 항-인지질 증후군 및 보통염색체 우성 상태인 인자 V 라이덴(Factor V Leiden)에 기인한다 ([Bertina RM et al. Nature 1994; 369:64-67]).
치료
가장 통상적으로 사용되는 항응고제인 와파린, 헤파린 및 저분자량 헤파린 (LMWH)은 모두 상당한 단점을 보유한다.
와파린은 심방 세동을 앓고 있는 환자를 치료하기 위해 전형적으로 사용된다. 이러한 약물은 인자 II, VII, IX 및 X가 포함되는 비타민 K-의존적 응고 인자와 상호작용한다. 항응고 단백질 C 및 S가 또한 와파린에 의해 억제된다. 와파린을 사용한 약물 요법은 와파린이 심방 세동을 치료하기 위해 사용되는 약물, 예컨대 아미오다론이 포함되는 또 다른 약제와 상호작용한다는 사실로 인해 더 복잡하다. 와파린으로의 요법은 예측하기 어렵기 때문에, 임의의 이상 출혈 징후를 검출하기 위해 환자를 주의하여 모니터링하여야 한다.
헤파린은 트롬빈 및 인자 X 양쪽 모두를 억제하는 항트롬빈을 활성화시킴으로써 기능한다 ([Bjork I, Lindahl U. Mol Cell Biochem. 1982 48: 161-182]). 헤파린으로의 치료는 혈소판이 혈관 내에서 응집하게 만드는 면역 반응을 야기할 수 있고, 이는 혈전증에 이를 수 있다. 이러한 부작용은 헤파린-유도 저혈소판증 (HIT)으로 공지되어 있고, 환자 모니터링을 필요로 한다. 헤파린으로의 장기 치료는 골다공증에 또한 이를 수 있다. LMWH 또한 인자 2를 억제할 수 있지만, 미분획 헤파린 (UFH)보다 억제 정도가 덜하다. HIT의 발달에 LMWH가 연루되었다.
따라서, 현재의 항응고제는 예측성 및 특이성이 부족하여, 불리한 부작용, 예컨대 출혈 합병증을 방지하기 위해 주의 깊은 환자 모니터링을 필요로 한다. 현재, 내인성 또는 외인성 경로만을 표적으로 하는 항응고제가 없다.
발명의 개요
인자 11 mRNA 및 단백질의 발현을 조정하기 위한 방법, 화합물 및 조성물이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 인자 11 특이적 억제제가 인자 11 mRNA 및 단백질의 발현을 조정한다. 특정 실시양태에서, 인자 11 특이적 억제제는 핵산, 단백질, 또는 소형 분자이다.
특정 실시양태에서, 조정이 세포 또는 조직에서 일어날 수 있다. 특정 실시양태에서, 세포 또는 조직이 동물 내에 존재한다. 특정 실시양태에서, 동물은 인간이다. 특정 실시양태에서, 인자 11 mRNA 수준이 감소된다. 특정 실시양태에서, 인자 11 단백질 수준이 감소된다. 이같은 감소는 시간-의존적 방식으로 또는 용량-의존적 방식으로 일어날 수 있다.
질환, 장애 및 상태의 예방, 치료 및 개선에 유용한 방법, 화합물 및 조성물이 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, 이같은 질환, 장애 및 상태는 혈전색전성 합병증이다. 이같은 혈전색전성 합병증에는 혈전증, 색전증, 및 혈전색전증 카테고리가 포함된다. 특정 실시양태에서, 이같은 혈전색전성 합병증에는 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 심근 경색증, 및 졸중이 포함된다.
이같은 질환, 장애 및 상태에는 하나 이상의 공통적인 위험 인자, 원인 또는 결과가 있을 수 있다. 혈전색전성 합병증의 발달에 대한 특정 위험 인자 및 원인에는 부동, 수술 (특히, 정형외과 수술), 악성 종양, 임신, 노령, 경구 피임약의 사용, 심방 세동, 기존의 혈전색전성 합병증, 만성 염증성 질환, 및 선천적 또는 후천적 전-혈전성(prothrombotic) 응고 장애가 포함된다. 혈전색전성 합병증의 발달과 관련된 특정 결과에는 침범된 혈관을 통한 혈류 감소, 조직사, 및 사망이 포함된다.
특정 실시양태에서, 치료 방법은 인자 11 특이적 억제제를 이를 필요로 하는 개체에게 투여하는 것을 포함한다.
본원 발명의 구체적인 실시양태는 다음을 포함한다:
1. 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 223의 12개 이상의 인접 핵염기(nucleobase)를 포함하는 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물.
2. 제1항에 있어서, 단일 가닥의 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물.
3. 제2항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열이 서열 1의 핵염기 서열에 대해 100％ 상보적인 화합물.
4. 제2항에 있어서, 1개 이상의 뉴클레오시드간(internucleoside) 연결이 변형된 뉴클레오시드간 연결인 화합물.
5. 제4항에 있어서, 각각의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 화합물.
6. 제1항에 있어서, 1개 이상의 뉴클레오시드가 변형된 당을 포함하는 화합물.
7. 제6항에 있어서, 1개 이상의 변형된 당이 비시클릭 당인 화합물.
8. 제7항에 있어서, 1개 이상의 비시클릭 당 각각이 4'-(CH2)n-O-2' 다리 [식 중, n은 1 또는 2이다]를 포함하는 화합물.
9. 제7항에 있어서, 1개 이상의 비시클릭 당 각각이 4'-CH(CH3)-O-2' 다리를 포함하는 화합물.
10. 제6항에 있어서, 1개 이상의 변형된 당이 2'-O-메톡시에틸 기를 포함하는 화합물.
11. 제1항에 있어서, 테트라히드로피란 고리가 푸라노스 고리를 교체하는 1개 이상의 테트라히드로피란-변형 뉴클레오시드를 포함하는 화합물.
12. 제11항에 있어서, 1개 이상의 테트라히드로피란-변형 뉴클레오시드 각각이 하기의 구조를 갖는 화합물:
Figure 112017082589307-pat00001
[식 중, Bx는 임의적으로 보호된 헤테로시클릭 염기 모이어티(moiety)이다].
13. 제2항에 있어서, 1개 이상의 뉴클레오시드가 변형된 핵염기를 포함하는 화합물.
14. 제13항에 있어서, 변형된 핵염기가 5-메틸시토신인 화합물.
15. 제1항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가
연결된 데옥시뉴클레오시드들로 구성된 갭(gap) 절편;
연결된 뉴클레오시드들로 구성된 5' 윙(wing) 절편;
연결된 뉴클레오시드들로 구성된 3' 윙 절편
을 포함하고, 이때 갭 절편이 5' 윙 절편과 3' 윙 절편에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하고, 각각의 윙 절편의 각각의 뉴클레오시드가 변형된 당을 포함하는 화합물.
16. 제15항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가
10개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 절편;
5개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 5' 윙 절편;
5개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 3' 윙 절편
을 포함하고, 이때 갭 절편이 5' 윙 절편과 3' 윙 절편에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하고, 각각의 윙 절편의 각각의 뉴클레오시드가 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하며, 각각의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 연결인 화합물.
17. 제16항에 있어서, 각각의 시토신이 5-메틸시토신인 화합물.
18. 제2항 또는 제17항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가 20개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 화합물.
19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 혈전색전성 합병증의 치료를 위한 화합물.
20. 제19항에 있어서, 동물이 인간인 화합물.
21. 제20항에 있어서, 심부 정맥 혈전증의 치료를 위한 화합물.
22. 제20항에 있어서, 폐 색전증의 예방을 위한 화합물.
23. 제19항에 있어서, 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰, 헤파린, 레피루딘, 티클로피딘, 와파린, 아픽사반, 리바록사반, 로베녹스(LOVENOX), 및 인자 Xa 억제제로부터 선택된 임의의 군과의 공동투여를 위한 화합물.
24. 제19항에 있어서, 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰, 헤파린, 레피루딘, 티클로피딘, 와파린, 아픽사반, 리바록사반, 로베녹스, 및 인자 Xa 억제제로부터 선택된 임의의 군과의 동시 투여를 위한 화합물.
25. 제23항에 있어서, 비경구 투여를 위한 화합물.
26. 제24항에 있어서, 비경구 투여를 위한 화합물.
27. 제25항에 있어서, 피하 또는 정맥내 투여를 위한 화합물.
28. 제26항에 있어서, 피하 또는 정맥내 투여를 위한 화합물.
29. 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이때 변형된 올리고뉴클레오티드가 응고 장애를 치료하기 위해 인자 11 핵산에 대해 상보적인 화합물.
30. 혈전색전성 합병증 치료용 약제의 제조를 위한, 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰, 헤파린, 레피루딘, 티클로피딘, 와파린, 아픽사반, 리바록사반 및 로베녹스로부터 선택된 임의의 군과 함께의 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 화합물의 용도.
31. 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 223의 12개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 염, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물.
32. 제31항에 있어서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드로 구성된 조성물.
33. 제32항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가 20개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 조성물.
34. 혈전색전성 합병증의 위험이 있는 동물을 확인하는 단계; 및
위험이 있는 동물에게 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 인자 11 핵산에 대해 상보적인 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 치료 유효량으로 투여하는 단계
를 포함하는 방법.
35. 제34항에 있어서, 혈전색전성 합병증이 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 또는 이들의 조합인 방법.
36. 응고 장애를 가진 동물을 확인하는 단계; 및
동물에게 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 인자 11 핵산에 대해 상보적인 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 치료 유효량으로 투여하는 단계
를 포함하는 방법.
37. 제36항에 있어서, 상기 화합물, 및 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰, 헤파린, 레피루딘, 티클로피딘, 와파린, 아픽사반, 리바록사반, 로베녹스 및 인자 Xa 억제제로부터 선택된 임의의 군을 공동-투여하는 것을 포함하는 방법.
38. 동물에서 혈전색전성 합병증의 위험을 감소시키는 단계; 및
동물에게 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 인자 11 핵산에 대해 상보적인 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 치료 유효량으로 투여하는 단계
를 포함하는 방법.
39. 동물에서 응고 장애를 치료하는 단계; 및
동물에게 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 인자 11 핵산에 대해 상보적인 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 치료 유효량으로 투여하는 단계
를 포함하는 방법.
40. 제39항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드에 대한 해독제를 투여함으로써 동물에서 인자 11 억제를 역전시키는 단계를 포함하는 방법.
41. 제39항에 있어서, 해독제가 변형된 올리고뉴클레오티드에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드인 방법.
42. 제40항에 있어서, 인자 7, 인자 7a, 인자 11, 또는 인자 11a 단백질로부터 선택된 임의의 군을 투여함으로써 동물에서 인자 11 억제를 역전시키는 단계를 포함하는 방법.
43. 혈전색전성 합병증의 위험이 있는 동물을 확인하는 단계; 및
위험이 있는 동물에게 치료 유효량의 인자 11 특이적 억제제 및 항-혈소판 요법을 투여하는 단계
를 포함하는 방법.
44. 응고 장애를 가진 동물을 확인하는 단계; 및
동물에게 치료 유효량의 인자 11 특이적 억제제 및 항-혈소판 요법을 투여하는 단계
를 포함하는 방법.
45. 동물에서 혈전색전성 합병증의 위험을 감소시키는 단계; 및
동물에게 치료 유효량의 인자 11 특이적 억제제 및 항-혈소판 요법을 투여하는 단계
를 포함하는 방법.
46. 동물에서 응고 장애를 치료하는 단계; 및
동물에게 치료 유효량의 인자 11 특이적 억제제 및 항-혈소판 요법을 투여하는 단계
를 포함하는 방법.
47. 제43항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 항-혈소판 요법이 ADP 수용체 억제제, NSAID, 포스포디에스테라제(phosphodiesterase) 억제제, 당단백질 IIB/IIIA 억제제 또는 아데노신 재흡수 억제제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 방법.
48. 제47항에 있어서, NSAID가 아스피린, 나프록센 또는 이들의 조합인 방법.
49. 제47항에 있어서, ADP 수용체/P2Y12 억제제가 티에노피리딘인 방법.
50. 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 1의 핵염기 738 내지 762 중 동일한 길이의 부분에 대해 상보적인 8개 이상의 인접 핵염기 부분을 포함하는 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이때 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열이 서열 1에 대해 90％ 이상 상보적인 화합물.
51. 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 1의 핵염기 656 내지 704 중 동일한 길이의 부분에 대해 상보적인 8개 이상의 인접 핵염기 부분을 포함하는 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이때 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열이 서열 1에 대해 90％ 이상 상보적인 화합물.
52. 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 1의 핵염기 1018 내지 1042 중 동일한 길이의 부분에 대해 상보적인 8개 이상의 인접 핵염기 부분을 포함하는 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이때 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열이 서열 1에 대해 90％ 이상 상보적인 화합물.
53. 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 1의 핵염기 1062 내지 1091 중 동일한 길이의 부분에 대해 상보적인 8개 이상의 인접 핵염기 부분을 포함하는 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이때 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열이 서열 1에 대해 90％ 이상 상보적인 화합물.
54. 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 1의 핵염기 1275 내지 1318 중 동일한 길이의 부분에 대해 상보적인 8개 이상의 인접 핵염기 부분을 포함하는 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이때 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열이 서열 1에 대해 90％ 이상 상보적인 화합물.
인자 11 mRNA 및 단백질의 발현을 조정하기 위한 방법, 화합물 및 조성물이 본원에서 제공된다. 특정 실시양태에서, 인자 11 특이적 억제제가 인자 11 mRNA 및 단백질의 발현을 조정한다. 특정 실시양태에서, 인자 11 특이적 억제제는 핵산, 단백질, 또는 소형 분자이다. 질환, 장애 및 상태의 예방, 치료 및 개선에 유용한 방법, 화합물 및 조성물이 또한 제공된다. 특정 실시양태에서, 이같은 질환, 장애 및 상태는 혈전색전성 합병증이다. 이같은 혈전색전성 합병증에는 혈전증, 색전증, 및 혈전색전증 카테고리가 포함된다. 특정 실시양태에서, 이같은 혈전색전성 합병증에는 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 심근 경색증, 및 졸중이 포함된다.
발명의 상세한 설명
상기의 개괄적인 설명 및 하기의 상세한 설명 양쪽 모두 단지 예시적 및 설명적이고, 청구된 바와 같은 본 발명을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본원에서, 단수형의 사용은 달리 구체적으로 명시되지 않는 한 복수형을 포함한다. 본원에서 사용된 "또는"는 달리 명시되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 또한, 용어 "포함하는(including)", 뿐만 아니라 "포함하다(include)" 및 "포함되는(included)"과 같은 또 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다. 또한, "요소" 또는 "성분"과 같은 용어들은, 달리 구체적으로 명시되지 않는 한, 1개의 유닛(unit)를 포함하는 요소 및 성분, 및 1개를 초과하는 서브유닛(subunit)을 포함하는 요소 및 성분 양쪽 모두를 포함한다.
본원에서 사용된 섹션 제목은 조직 목적만을 위한 것이고, 기술된 주제를 한정하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 특허, 특허 출원, 기사, 도서 및 논문을 포함하여, 본 출원에서 언급된 모든 문헌 또는 문헌의 일부분은 본원에 논의된 문헌의 일부분에 대해서, 뿐만 아니라 이의 전문이 본원에 명확하게 참고로 포함된다.
정의
구체적인 정의가 제공되지 않는 한, 본원에 기술된 분석 화학, 합성 유기 화학, 및 의학 및 제약 화학과 관련되어, 그리고 이의 절차 및 기술에서 사용된 명명법은 당업계에 주지되어 있고 당업계에서 통상적으로 사용되는 것들이다. 화학적 합성 및 화학적 분석에 표준 기술이 사용될 수 있다. 허용되는 경우, 본원의 개시 내용 전반에 걸쳐 언급된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 기타 간행물, <National Center for Biotechnology Information> (NCBI)와 같은 데이터베이스를 통해 수득가능한 진뱅크(GENBANK) 접속 번호 및 관련 서열 정보, 및 기타 데이터는 본원에서 논의된 이러한 문서의 부분에서 대해서, 뿐만 아니라 이들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
달리 지시되지 않는 한, 하기의 용어들의 의미는 하기와 같다:
"2'-O-메톡시에틸" (또한 2'-MOE 및 2'-O(CH2)2-OCH3)은 푸로실 고리의 2' 위치의 O-메톡시-에틸 변형을 지칭한다. 2'-O-메톡시에틸-변형 당은 변형된 당이다.
"2'-O-메톡시에틸 뉴클레오티드"는 2'-O-메톡시에틸-변형 당 모이어티(moiety)를 포함하는 뉴클레오티드를 의미한다.
"5-메틸시토신"은 5' 부분에 부착된 메틸 기로 변형된 시토신을 의미한다. 5-메틸시토신은 변형된 핵염기(nucleobase)이다.
"활성 약제"는 개체에게 투여되는 경우에 치료 이점을 제공하는 제약 조성물 내의 물질 또는 물질들을 의미한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 인자 11을 표적으로 하는 안티센스(antisense) 올리고뉴클레오티드가 활성 약제이다.
"활성 표적 영역" 또는 "표적 영역"은 하나 이상의 활성 안티센스 화합물이 표적으로 하는 영역을 의미한다. "활성 안티센스 화합물"은 표적 핵산 수준 또는 단백질 수준을 감소시키는 안티센스 화합물을 의미한다.
"동시에 투여되는"은 양쪽 작용제의 약리학적 효과가 환자에서 동시에 나타나는 임의의 방식으로의 2가지 작용제의 공동-투여를 지칭한다. 동시 투여는 양쪽 작용제가 단일 제약 조성물로 투여되거나, 동일한 투약 형태로 투여되거나 또는 동일한 투여 경로에 의해 투여되는 것을 필요로 하지 않는다. 양쪽 작용제의 효과가 동일한 시기에 나타날 필요가 없다. 일정 기간 동안만 효과가 중첩될 필요가 있고, 동일한 시간에 걸쳐질 필요는 없다.
"투여"는 개체에게 약제를 제공하는 것을 의미하고, 의료인에 의한 투여 및 자가 투여를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
"개선"은 관련된 질환, 장애 또는 상태의 하나 이상의 지표, 징후 또는 증상의 감소를 지칭한다. 당업자에게 공지된 주관적 또는 객관적 척도에 의해 지표의 중증도를 결정할 수 있다.
"동물"은 마우스, 래트, 토끼, 개, 고양이, 돼지, 및 원숭이 및 침팬지를 포함하지만 이에 한정되지 않는 비-인간 영장류를 포함하지만 이에 한정되지 않는 인간 또는 비-인간 동물을 지칭한다.
"해독제 화합물"은 임의의 안티센스-매개 활성의 강도 또는 기간을 감소시킬 수 있는 화합물을 지칭한다.
"해독제 올리고뉴클레오티드"는 안티센스 화합물에 대해 상보적이고 이와 혼성화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 포함하는 해독제 화합물을 의미한다.
"해독제 단백질"은 펩티드를 포함하는 해독제 화합물을 의미한다.
"항체"는 어떠한 방식으로든 항원과 특이적으로 반응하는 것을 특징으로 하는 분자를 지칭하고, 이때 항체 및 항원은 각각 서로에 관하여 정의된다. 항체는 완전한 항체 분자 또는 이의 임의의 단편 또는 영역, 예컨대 중쇄, 경쇄, Fab 영역, 및 Fc 영역을 지칭할 수 있다.
"안티센스 활성"은 안티센스 화합물이 이의 표적 핵산에 혼성화하는 것에 기인하는 임의의 검출가능한 또는 측정가능한 활성을 의미한다. 특정 실시양태에서, 안티센스 활성은 표적 핵산 또는 이같은 표적 핵산에 의해 코딩되는 단백질의 양 또는 발현에서의 감소이다.
"안티센스 화합물"은 수소 결합을 통해 표적 핵산에 대해 혼성화할 수 있는 올리고머 화합물을 의미한다.
"안티센스 억제"는 표적 핵산 화합물에 대해 상보적인 안티센스 화합물의 존재 하에 안티센스 화합물의 부재 하의 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준과 비교하여 표적 핵산 수준 또는 표적 단백질 수준이 감소하는 것을 의미한다.
"안티센스 올리고뉴클레오티드"는 표적 핵산의 상응하는 영역 또는 절편에 대한 혼성화를 허용하는 핵염기 서열의 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"비시클릭 당"은 2개의 비-같은자리(non-geminal) 고리 원자에 의해 변형된 푸로실 고리를 의미한다. 비시클릭 당은 변형된 당이다.
"비시클릭 핵산" 또는 "BNA"는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드의 푸라노스 부분이 푸라노스 고리 상의 2개의 탄소 원자를 연결하는 다리를 포함함으로써 비시클릭 고리 시스템을 형성하는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드를 지칭한다.
"캡(cap) 구조" 또는 "말단 캡 모이어티"는 안티센스 화합물의 양쪽 말단에 혼입된 화학적 변형물을 의미한다.
"화학적으로 상이한 영역"은 동일한 안티센스 화합물의 또 다른 영역과 어떠한 방식으로든 화학적으로 다른 안티센스 화합물 영역을 지칭한다. 예를 들어, 2'-O-메톡시에틸 뉴클레오티드가 있는 영역은 2'-O-메톡시에틸 변형이 없는 뉴클레오티드가 있는 영역과 화학적으로 상이하다.
"키메라 안티센스 화합물"은 2개 이상의 화학적으로 상이한 영역이 있는 안티센스 화합물을 의미한다.
"공동-투여"는 2가지 이상의 약제를 개체에게 투여하는 것을 의미한다. 2가지 이상의 약제는 단일 제약 조성물 내에 존재할 수 있거나, 또는 분리된 제약 조성물 내에 존재할 수 있다. 2가지 이상의 약제 각각이 동일한 투여 경로 또는 상이한 투여 경로를 통해 투여될 수 있다. 공동-투여는 병행 투여 또는 순차적 투여를 포함한다.
"응고 인자"는 혈액 응고 케스케이드 내의 인자 I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, 또는 TAFI 중 임의의 것을 의미한다. "응고 인자 핵산"은 응고 인자를 코딩하는 임의의 핵산을 의미한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 응고 인자 핵산에는 응고 인자를 코딩하는 DNA 서열 (인트론 및 엑손을 포함하는 게놈 DNA 포함), 응고 인자를 코딩하는 DNA 서열로부터 전사된 RNA 서열, 및 응고 인자를 코딩하는 mRNA 서열이 비제한적으로 포함된다. "응고 인자 mRNA"는 응고 인자 단백질을 코딩하는 mRNA를 의미한다.
"상보성"은 제1 핵산과 제2 핵산 간의 쌍을 이루는 능력을 의미한다.
"인접 핵염기"는 서로 바로 인접한 핵염기를 의미한다.
"희석제"는 약리학적 활성은 없지만 약학적으로 필요하거나 바람직한, 조성물 내의 성분을 의미한다. 예를 들어, 주사 용액 내의 희석제는 액체, 예를 들어, 생리식염수일 수 있다.
"용량"은 단일 투여로 또는 특정 기간에 제공되는 약제의 특정량을 의미한다. 특정 실시양태에서, 용량은 1개(회), 2개(회) 또는 이를 초과하는 개수(횟수)의 볼루스, 정제 또는 주사로 투여될 수 있다. 예를 들어, 피하 투여를 원하는 특정 실시양태에서, 원하는 용량은 단일 주사에 의해 쉽게 수용되지 않는 부피를 필요로 하고, 따라서 원하는 용량을 달성하도록 2회 이상의 주사가 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 장기간에 걸쳐 또는 연속적으로 주입에 의해 약제가 투여된다. 1시간, 1일, 1주, 또는 1개월 당 약제의 양으로 용량이 언급될 수 있다.
"유효량"은 약제를 필요로 하는 개체에서 원하는 생리학적 결과를 달성하는데 충분한 활성 약제의 양을 의미한다. 유효량은 치료될 개체의 건강 및 신체 상태, 치료될 개체의 분류 집단, 조성물의 제형, 개체의 의학 상태의 평가, 및 기타 관련 인자에 따라 개체마다 다를 수 있다.
"인자 11 핵산" 또는 "인자 XI 핵산" 또는 "F 11 핵산" 또는 "F XI 핵산"은 인자 11을 코딩하는 임의의 핵산을 의미한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 인자 11 핵산에는 인자 11을 코딩하는 DNA 서열, 인자 11을 코딩하는 DNA 서열 (인트론 및 엑손을 포함하는 게놈 DNA 포함)로부터 전사된 RNA 서열, 및 인자 11을 코딩하는 mRNA 서열이 포함된다. "인자 11 mRNA"는 인자 11 단백질을 코딩하는 mRNA를 의미한다.
"인자 11 특이적 억제제"는 분자 수준에서 인자 11 mRNA 및/또는 인자 11 단백질의 발현을 특이적으로 억제할 수 있는 임의의 작용제를 지칭한다. 예를 들어, 인자 11 특이적 억제제에는 인자 11 mRNA 및/또는 인자 11 단백질의 발현을 억제할 수 있는 핵산 (안티센스 화합물 포함), 펩티드, 항체, 소형 분자 및 기타 작용제가 포함된다. 특정 실시양태에서, 인자 11 mRNA 발현 및/또는 인자 11 단백질 발현을 특이적으로 조정함으로써, 인자 11 특이적 억제제는 하류 성분이 포함되는 응고 케스케이드의 또 다른 성분에 영향을 미칠 수 있다. 유사하게, 특정 실시양태에서, 인자 11 특이적 억제제는 동물 내의 또 다른 분자성 프로세스에 영향을 미칠 수 있다.
"인자 11 특이적 억제제 해독제"는 인자 11 특이적 억제제의 효과를 감소시킬 수 있는 화합물을 의미한다. 특정 실시양태에서, 인자 11 특이적 억제제 해독제는 인자 11 펩티드; 인자 11 안티센스 화합물에 대해 상보적인 인자 11 해독제 화합물이 포함되는 인자 11 해독제 올리고뉴클레오티드; 및 내인성 또는 외인성 응고 경로에 영향을 미치는 임의의 화합물 또는 단백질로부터 선택된다.
"완전히 상보적" 또는 "100％ 상보적"은 제1 핵산의 각각의 핵염기가 제2 핵산에서 상보적인 핵염기를 갖는다는 것을 의미한다. 특정 실시양태에서, 제1 핵산은 안티센스 화합물이고, 표적 핵산은 제2 핵산이다.
"갭머(gapmer)"는 RNase H 절단을 지지하는 다수의 뉴클레오시드가 있는 내부 영역이 하나 이상의 뉴클레오시드가 있는 외부 영역들 사이에 있고, 이때 내부 영역을 이루는 뉴클레오시드가 외부 영역을 이루는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드들과 화학적으로 상이한 키메라 안티센스 화합물을 의미한다. 내부 영역은 "갭(gap) 절편"으로 지칭될 수 있고, 외부 영역은 "윙(wing) 절편"으로 지칭될 수 있다.
"갭-확장(gap-widened)"은 1개 내지 6개의 뉴클레오시드가 있는 5' 및 3' 윙 절편에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하는 12개 이상의 인접 2'-데옥시리보뉴클레오시드의 갭 절편이 있는 키메라 안티센스 화합물을 의미한다.
"혼성화"는 상보적인 핵산 분자들의 어닐링(annealing)을 의미한다. 특정 실시양태에서, 상보적인 핵산 분자는 안티센스 화합물 및 표적 핵산을 포함한다.
"혈전색전성 합병증의 위험이 있는 동물의 확인"은 혈전색전성 합병증으로 진단된 동물의 확인 또는 혈전색전성 합병증이 발달될 경향이 있는 동물의 확인을 의미한다. 혈전색전성 합병증이 발달될 경향이 있는 개체에는 부동, 수술 (특히, 정형외과 수술), 악성 종양, 임신, 노령, 경구 피임약의 사용, 및 선천적 또는 후천적 전-혈전성 응고 장애가 포함되는 혈전색전성 합병증에 대한 하나 이상의 위험 인자가 있는 개체가 포함된다. 이같은 확인은 개체의 병력 평가 및 표준 임상 테스트 또는 평가가 포함되는 임의의 방법에 의해 달성될 수 있다.
"바로 인접한"은 바로 인접한 요소들 사이에 중재 요소가 없음을 의미한다.
"개체"는 치료 또는 요법에 대해 선택된 인간 또는 비-인간 동물을 의미한다.
"뉴클레오시드간 연결"은 뉴클레오시드들 간의 화학적 결합을 지칭한다.
"연결된 뉴클레오시드"는 함께 결합된 인접한 뉴클레오시드들을 의미한다.
"미스매치(mismatch)" 또는 "비-상보적 핵염기"는 제1 핵산의 핵염기가 제2 핵산 또는 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 쌍을 이룰 수 없는 경우를 지칭한다.
"변형된 뉴클레오시드간 연결"은 천연 발생 뉴클레오시드간 결합 (즉, 포스포디에스테르 뉴클레오시드간 결합)으로부터의 치환 또는 임의의 변화를 지칭한다.
"변형된 핵염기"는 아데닌, 시토신, 구아닌, 티미딘 또는 우라실 이외의 임의의 핵염기를 지칭한다. "변형되지 않은 핵염기"는 퓨린 염기인 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기인 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 의미한다.
"변형된 뉴클레오티드"는 변형된 당 모이어티, 변형된 뉴클레오시드간 연결, 또는 변형된 핵염기가 독립적으로 있는 뉴클레오티드를 의미한다. "변형된 뉴클레오시드"는 변형된 당 모이어티 또는 변형된 핵염기가 독립적으로 있는 뉴클레오시드를 의미한다.
"변형된 올리고뉴클레오티드"는 변형된 뉴클레오시드간 연결, 변형된 당, 또는 변형된 핵염기를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"변형된 당"은 천연 당으로부터의 치환 또는 변화를 지칭한다.
"모티프"는 안티센스 화합물 내의 화학적으로 상이한 영역들의 패턴을 의미한다.
"천연 발생 뉴클레오시드간 연결"은 3' → 5' 포스포디에스테르 연결을 의미한다.
"천연 당 모이어티"는 DNA (2'-H) 또는 RNA (2'-OH)에서 발견되는 당을 의미한다.
"핵산"은 단량체성 뉴클레오티드로 구성된 분자를 지칭한다. 핵산에는 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA), 단일 가닥 핵산, 이중 가닥 핵산, 소형 간섭 리보핵산 (siRNA), 및 마이크로RNA (miRNA)가 포함된다.
"핵염기"는 또 다른 핵산의 염기와 쌍을 이룰 수 있는 헤테로시클릭 모이어티를 의미한다.
"핵염기 서열"은 임의의 당, 연결 또는 핵염기 변형과 독립적인 인접 핵염기들의 순서를 의미한다.
"뉴클레오시드"는 당에 연결된 핵염기를 의미한다.
"뉴클레오시드 모방체"에는 모르폴리노, 시클로헥세닐, 시클로헥실, 테트라히드로피라닐, 바이시클로 또는 트리시클로 당 모방체, 예를 들어, 비-푸라노스 당 유닛이 있는 뉴클레오시드 모방체와 같이, 올리고머성 화합물의 하나 이상의 위치에서 당 또는 당 및 염기, 그리고 필수적이지는 않지만 연결을 교체하도록 사용되는 구조물이 포함된다. 뉴클레오티드 모방체에는 펩티드 핵산 또는 모르폴리노 (-N(H)-C(=O)-O- 또는 기타 비-포스포디에스테르 연결에 의해 연결된 모르폴리노)와 같이 올리고머성 화합물의 하나 이상의 위치에서 뉴클레오시드 및 연결을 교체하도록 사용되는 구조물이 포함된다. 당 대용물은 약간 더 광범위한 용어 뉴클레오시드 모방체와 겹쳐지지만, 당 유닛 (푸라노스 고리)만의 교체를 지시하도록 의도된다. 본원에서 제공되는 테트라히드로피라닐 고리는 푸라노스 당 기가 테트라히드로피라닐 고리 시스템으로 교체된 당 대용물의 예를 설명한다.
"뉴클레오티드"는 뉴클레오시드의 당 부분에 포스페이트 기가 공유결합으로 연결된 뉴클레오시드를 의미한다.
"올리고머성 화합물" 또는 "올리고머"는 핵산 분자의 영역에 적어도 혼성화할 수 있는 연결된 단량체성 서브유닛들의 중합체를 의미한다.
"올리고뉴클레오티드"는 연결된 뉴클레오시드들의 중합체를 의미하고, 이의 뉴클레오시드 각각은 서로 독립적으로 변형되거나 변형되지 않을 수 있다.
"비경구 투여"는 주사 또는 주입을 통한 투여를 의미한다. 비경구 투여에는 피하 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 동맥내 투여, 복강내 투여, 또는 두개내 투여, 예를 들어, 수막강내 또는 뇌실내 투여가 포함된다.
"펩티드"는 2개 이상의 아미노산을 아미드 결합에 의해 연결시킴으로써 형성된 분자를 의미한다. 펩티드는 폴리펩티드 및 단백질을 지칭한다.
"제약 조성물"은 개체에게 투여하기에 적절한 물질들의 혼합물을 의미한다. 예를 들어, 제약 조성물은 하나 이상의 활성 약제 및 무균성 수용액을 포함할 수 있다.
"제약상 허용가능한 염"은 안티센스 화합물의 생리학적으로, 그리고 제약상 허용가능한 염, 즉, 어버이 올리고뉴클레오티드의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 바람직하지 않은 독성학적 효과를 이에 부여하지 않는 염을 의미한다.
"포스포로티오에이트 연결"은 다리를 형성하지 않는 산소 원자들 중 하나를 황 원자로 교체함으로써 포스포디에스테르 결합이 변형된 뉴클레오시드들 간의 연결을 의미한다. 포스포로티오에이트 연결 (P=S)은 변형된 뉴클레오시드간 연결이다.
"일부분"은 핵산의 한정된 개수의 인접 (즉, 연결된) 핵염기들을 의미한다. 특정 실시양태에서, 일부분은 표적 핵산의 한정된 개수의 인접 핵염기들이다. 특정 실시양태에서, 일부분은 안티센스 화합물의 한정된 개수의 인접 핵염기들이다.
"예방"은 수분 내지 무기한의 기간 동안 질환, 장애 또는 상태의 개시 또는 발달을 지연시키거나 이에 대해 선수를 쓰는 것을 지칭한다. 예방은 질환, 장애 또는 상태가 발달될 위험을 감소시키는 것을 또한 의미한다.
"전구약물"은 내인성 효소 또는 기타 화학물질 또는 조건의 작용에 의해 신체 또는 신체 세포 내에서 활성 형태로 전환되는 불활성 형태로 제조된 치료제를 의미한다.
"부작용"은 치료로 인한, 원하는 효과 이외의 생리학적 응답을 의미한다. 특정 실시양태에서, 주사 부위 반응, 간 기능 테스트 이상, 신장 기능 이상, 간 독성, 신장 독성, 중추 신경계 이상, 근육병증 및 권태감이 부작용에 포함된다. 예를 들어, 혈청 내의 아미노트랜스퍼라제 수준 증가가 간 독성 또는 간 기능 이상을 가리킬 수 있다. 예를 들어, 빌리루빈 증가가 간 독성 또는 간 기능 이상을 가리킬 수 있다.
"단일 가닥 올리고뉴클레오티드"는 상보적 가닥에 혼성화되지 않은 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
"특이적으로 혼성화가능한"은 특이적 결합이 바람직한 조건, 즉 생체내 검정 및 치료적 처치의 경우에서의 생리학적 조건 하에, 안티센스 올리고뉴클레오티드와 표적 핵산 간의 상보성 정도가 원하는 효과를 유도하기에 충분하면서, 비-표적 핵산에 대해서는 최소의 효과를 나타내거나 효과를 나타내지 않는 안티센스 화합물을 지칭한다.
"표적화" 또는 "표적으로 하는"은 표적 핵산에 특이적으로 혼성화하여 원하는 효과를 유도할 안티센스 화합물의 디자인 및 선별 과정을 의미한다.
"표적 핵산", "표적 RNA", 및 "표적 RNA 전사물"은 모두 안티센스 화합물이 표적으로 할 수 있는 핵산을 지칭한다.
"표적 절편"은 안티센스 화합물이 표적으로 하는 표적 핵산의 뉴클레오티드의 서열을 의미한다. "5' 표적 부위"는 표적 절편의 가장 5'인 뉴클레오티드를 지칭한다. "3' 표적 부위"는 표적 절편의 가장 3'인 뉴클레오티드를 지칭한다.
"치료 유효량"은 개체에게 치료적 이점을 제공하는 약제의 양을 의미한다.
"혈전색전성 합병증"은 혈전에 의해 야기된 색전증을 수반하는 임의의 질환, 장애 또는 상태를 의미한다. 이같은 질환, 장애 및 상태의 예로는 혈전증, 색전증, 및 혈전색전증의 카테고리가 포함된다. 특정 실시양태에서, 이같은 질환, 장애 및 상태에는 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 심근 경색증, 및 졸중이 포함된다.
"치료"는 질환, 장애 또는 상태를 변경 또는 개선시키기 위해 제약 조성물을 투여하는 것을 지칭한다.
"변형되지 않은 뉴클레오티드"는 천연 발생 핵염기, 당 모이어티 및 뉴클레오시드간 연결로 구성된 뉴클레오티드를 의미한다. 특정 실시양태에서, 변형되지 않은 뉴클레오티드는 RNA 뉴클레오티드 (즉, β-D-리보뉴클레오시드) 또는 DNA 뉴클레오티드 (즉, β-D-데옥시리보뉴클레오시드)이다.
특정 실시양태
본 발명의 실시양태는 인자 11 mRNA 및 단백질 발현을 감소시키기 위한 방법, 화합물 및 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태는 이를 필요로 하는 개체에서 인자 11과 관련된 질환, 장애 및 상태를 치료, 예방 또는 개선하기 위한 방법, 화합물 및 조성물을 제공한다. 인자 11과 관련된 질환, 장애 및 상태를 치료, 예방 또는 개선하기 위한 약제의 제조를 위한 방법 및 화합물이 또한 구현된다. 인자 11과 관련된 질환, 장애 및 상태에는 혈전색전성 합병증 예컨대 혈전증, 색전증, 혈전색전증, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 심근 경색증, 및 졸중이 포함된다.
본 발명의 실시양태는 인자 11과 관련된 질환의 치료, 예방 또는 개선에서 사용하기 위한 인자 11 특이적 억제제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 인자 11 특이적 억제제는 인자 11 mRNA 및/또는 인자 11 단백질의 발현을 억제할 수 있는 핵산 (안티센스 화합물 포함), 펩티드, 항체, 소형 분자 및 기타 작용제이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 인자 11 특이적 억제제는 [J Clin Invest 1982, 69:844-852]에 기술된 바와 같은 알파 1 프로테아제 억제제, 항트롬빈 III, C1 억제제, 및 알파 2 플라스민 억제제; [Thromb Res 1987, 48:145-151]에 기술된 바와 같은 알파 1 항-트립신 (알파 1AT); USPPN 2008/021998 및 [Blood 1998, 92:4198-206]에 기술된 바와 같은 인자 11 펩티드 억제제; [Thromb Res 2001, 104:451-465]에 기술된 바와 같은 MAP4-RGKWC; [Proc Natl Acad Sci 2004, 101:3939-44]에 기술된 바와 같은 베타 2 GPI; [Eur J Biochem 1999, 262:915-923]에 기술된 바와 같은 렌티너스(Lentinus) 단백질분해효소 억제제; [J Biol Chem 2004, 279:29485-29492]에 기술된 바와 같은 프로테아제 넥신-2/아밀로이드 베타 단백질 전구체 쿤니츠(Kunitz) 도메인 억제제 (APPI) 및 항트롬빈 (AT); 및 [J Biol Chem 2005, 280:23523-30]에 기술된 바와 같은 아프로티닌과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 펩티드 또는 단백질이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 인자 11 특이적 억제제는 [Blood 1988, 72:1748-54]에 기술된 바와 같은 윈스톤-살렘(Winston-Salem) (IgG3 카파) 및 볼티모어(Baltimore) (IgG1 카파); [J Biol Chem 1985, 260:10714-719]에 기술된 바와 같은 5F4, 3C1, 및 1F1; [Throm Haemost 1990, 63:417-23]에 기술된 바와 같은 모노클로날 항체; [J Thromb Haem 2006, 4:1496-1501]에 기술된 바와 같은 XI-5108; [Thromb Res 1986, 42:225-34]에 기술된 바와 같은 모노클로날 항체 4-1; 및 USPN 6,566,140의 실시예 19에 기술된 바와 같은 압식시맙(abciximab) 항체와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 항체이다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 인자 11 특이적 억제제는 디이소프로필 플루오로포스페이트 (DFP); USPPN 2004/0180855의 실시예 1-7에 기술된 바와 같은 소형 분자 억제제; 및 [J Biol Chem 2005, 280:23523-30]에 기술된 바와 같은 p-아미노벤즈아미딘 (pAB)과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 소형 분자이다.
본 발명의 실시양태는 혈전색전성 합병증 예컨대 혈전증, 색전증, 혈전색전증, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 심근 경색증, 및 졸중의 치료, 예방 또는 개선에서 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 인자 11 특이적 억제제를 제공한다.
본 발명의 실시양태는 혈전색전성 합병증 예컨대 혈전증, 색전증, 혈전색전증, 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 심근 경색증, 및 졸중의 치료, 개선 또는 예방을 위한 약제의 제조에서의 본원에 기술된 바와 같은 인자 11 특이적 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태는 본원에 기술된 바와 같은 추가적인 작용제 또는 요법과의 조합 요법에 의해 본원에 기술된 바와 같은 혈전색전성 합병증을 치료, 예방 또는 개선하는데 사용하기 위한 본원에 기술된 바와 같은 인자 11 특이적 억제제를 제공한다. 작용제 또는 요법은 공동-투여될 수 있거나 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 실시양태는 본원에 기술된 바와 같은 추가적인 작용제 또는 요법과의 조합 요법에 의해 본원에 기술된 바와 같은 혈전색전성 합병증을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기술된 바와 같은 인자 11 특이적 억제제의 용도를 제공한다. 작용제 또는 요법은 공동-투여될 수 있거나 또는 동시에 투여될 수 있다.
본 발명의 실시양태는 본원에 기술된 바와 같은 추가적인 작용제 또는 요법이 후속 투여되는 환자에서 본원에 기술된 바와 같은 혈전색전성 합병증을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 약제의 제조에서의 본원에 기술된 바와 같은 인자 11 특이적 억제제의 용도를 제공한다.
본 발명의 실시양태는 하기를 포함하는, 본원에 기술된 바와 같은 혈전색전성 합병증을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 키트를 제공한다:
(i) 본원에 기술된 바와 같은 인자 11 특이적 억제제; 및 별법적으로
(ii) 본원에 기술된 바와 같은 추가적인 작용제 또는 요법.
본 발명의 키트는 키트를 사용하여 본원에 기술된 바와 같은 조합 요법에 의해 본원에 기술된 바와 같은 혈전색전성 합병증을 치료, 예방 또는 개선하기 위한 설명서를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시양태는 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 인자 11 핵산은 진뱅크 접속 번호 NM_000128.3 (서열 1로서 본원에 포함됨), 19598000에서 19624000까지 말단절단된 진뱅크 접속 번호 NT_022792.17 (서열 2로서 본원에 포함됨), 진뱅크 접속 번호 NM_028066.1 (서열 6으로서 본원에 포함됨), 엑손 1-15 진뱅크 접속 번호 NW_001118167.1 (서열 274로서 본원에 포함됨)에 기재된 서열들 중 임의의 것이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 656 내지 676의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 656 내지 676의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 80％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 665 내지 687의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 665 내지 687의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 50％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 675 내지 704의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 675 내지 704의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 50％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 677 내지 704의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 677 내지 704의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 60％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 678 내지 697의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 678 내지 697의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 70％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 680 내지 703의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 680 내지 703의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3 및 실시예 30에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 80％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 683 내지 702의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 683 내지 702의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 90％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 738 내지 759의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 738 내지 759의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3 및 실시예 30에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 80％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 738 내지 760의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 738 내지 760의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 60％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 738 내지 762의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 738 내지 762의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 45％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 1018 내지 1042의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 1018 내지 1042의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 80％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 1062 내지 1089의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 1062 내지 1089의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 70％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 1062 내지 1090의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 1062 내지 1090의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 60％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 1062 내지 1091의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 1062 내지 1091의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 20％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 1275 내지 1301의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 1062 내지 1091의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 80％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 1276 내지 1301의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 1062 내지 1091의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 30에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 80％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 1284 내지 1308의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 1062 내지 1091의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 80％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 1291 내지 1317의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 1062 내지 1091의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 80％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 서열 1의 핵염기 1275 내지 1318의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵염기 서열을 포함하는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 핵염기 1275 내지 1318의 동일한 길이 부분에 대해 상보적인 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 80％ 이상, 85％ 이상, 90％ 이상, 95％ 이상, 96％ 이상, 97％ 이상, 98％ 이상 또는 99％ 이상 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 1의 동일한 길이 부분에 대해 100％ 상보적인 핵염기 서열을 포함할 수 있다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 70％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
본 발명의 실시양태는 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 15 내지 241에 열거된 핵염기 서열에서 선택된 핵염기 서열의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다.
본 발명의 실시양태는 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 15 내지 269에 열거된 핵염기 서열에서 선택된 핵염기 서열의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다.
본 발명의 실시양태는 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 242 내지 269에 열거된 핵염기 서열에서 선택된 핵염기 서열의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 ISIS 번호 22, 31, 32, 34, 36 내지 38, 40, 41, 43, 51 내지 53, 55, 56, 59, 60, 64, 66, 71, 73, 75, 96, 98 내지 103, 105 내지 109, 113 내지 117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181 내지 197, 199 내지 211, 및 213 내지 232로부터 선택된 핵염기 서열의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 또는 18개 이상의 핵염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 22, 31, 32, 34, 36 내지 38, 40, 41, 43, 51 내지 53, 55, 56, 59, 60, 64, 66, 71, 73, 75, 96, 98 내지 103, 105 내지 109, 113 내지 117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181 내지 197, 199 내지 211, 및 213 내지 232로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 22, 31, 32, 34, 36 내지 38, 40, 41, 43, 51 내지 53, 55, 56, 59, 60, 64, 66, 71, 73, 75, 96, 98 내지 103, 105 내지 109, 113 내지 117, 119, 124, 127, 129, 171, 172, 174, 176, 178, 179, 181 내지 197, 199 내지 211, 및 213 내지 232로부터 선택된 핵염기 서열로 구성된다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 70％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 ISIS 번호 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51 내지 53, 60, 98, 100 내지 102, 105 내지 109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188 내지 193, 195, 196, 199 내지 210, 및 213 내지 232로부터 선택된 핵염기 서열의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 또는 18개 이상의 핵염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51 내지 53, 60, 98, 100 내지 102, 105 내지 109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188 내지 193, 195, 196, 199 내지 210, 및 213 내지 232로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 22, 31, 34, 37, 40, 43, 51 내지 53, 60, 98, 100 내지 102, 105 내지 109, 114, 115, 119, 171, 174, 176, 179, 181, 186, 188 내지 193, 195, 196, 199 내지 210, 및 213 내지 232로부터 선택된 핵염기 서열로 구성된다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 80％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 ISIS 번호 31, 37, 100, 105, 179, 190 내지 193, 196, 202 내지 207, 209, 210, 214 내지 219, 221 내지 224, 226, 227, 229, 및 231로부터 선택된 핵염기 서열의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 또는 18개 이상의 핵염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 31, 37, 100, 105, 179, 190 내지 193, 196, 202 내지 207, 209, 210, 214 내지 219, 221 내지 224, 226, 227, 229, 및 231로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 31, 37, 100, 105, 179, 190 내지 193, 196, 202 내지 207, 209, 210, 214 내지 219, 221 내지 224, 226, 227, 229, 및 231로부터 선택된 핵염기 서열로 구성된다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 3에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 90％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 내지 232, 242 내지 260, 및 262 내지 266으로부터 선택된 핵염기 서열의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 또는 18개 이상의 핵염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 내지 232, 242 내지 260, 및 262 내지 266으로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 내지 232, 242 내지 260, 및 262 내지 266으로부터 선택된 핵염기 서열로 구성된다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 30에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 70％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 내지 216, 218 내지 226, 243 내지 246, 248, 249, 252 내지 259, 264, 및 265로부터 선택된 핵염기 서열의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 또는 18개 이상의 핵염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 내지 216, 218 내지 226, 243 내지 246, 248, 249, 252 내지 259, 264, 및 265로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 34, 52, 53, 114, 115, 190, 213 내지 216, 218 내지 226, 243 내지 246, 248, 249, 252 내지 259, 264, 및 265로부터 선택된 핵염기 서열로 구성된다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 30에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 80％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 34, 190, 215, 222, 223, 226, 246, 및 254로부터 선택된 핵염기 서열의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 또는 18개 이상의 핵염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 34, 190, 215, 222, 223, 226, 246, 및 254로부터 선택된 핵염기 서열을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 서열 34, 190, 215, 222, 223, 226, 246, 및 254로부터 선택된 핵염기 서열로 구성된다. 상기 변형된 올리고뉴클레오티드는, 임의적으로 HepG2 세포에서 (예를 들어, 실시예 30에 기술된 바와 같이), RT-PCR 검정 방법을 사용하여 결정 시 인간 mRNA 수준의 90％ 이상의 억제를 달성할 수 있다.
특정 실시양태에서, 화합물은 단일 가닥의 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성된다.
특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드는 20개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된다.
특정 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열은 서열 1 또는 서열 2 또는 서열 6 또는 서열 274의 핵염기 서열에 대해 100％ 상보적이다.
특정 실시양태에서, 화합물은 1개 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 갖는다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
특정 실시양태에서, 화합물은 변형된 당을 포함하는 뉴클레오시드를 1개 이상 갖는다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 변형된 당은 비시클릭 당이다. 특정 실시양태에서, 1개 이상의 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸을 포함한다.
본 발명의 실시양태는 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 15 내지 241, 서열 15 내지 269, 또는 서열 242 내지 269에 열거된 핵염기 서열에서 선택된 핵염기 서열의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 이때 1개 이상의 뉴클레오시드가 변형된 당을 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기 1개 이상의 변형된 당은 비시클릭 당이다.
특정 실시양태에서, 상기 1개 이상의 비시클릭 당은 4'-(CH2)n-O-2' 다리 [식 중, n은 1 또는 2이다]를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 1개 이상의 비시클릭 당은 4'-CH(CH3)-O-2' 다리를 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 1개 이상의 변형된 당은 2'-O-메톡시에틸 기를 포함한다.
본 발명의 실시양태는 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 15 내지 241, 서열 15 내지 269, 또는 서열 242 내지 269에 열거된 핵염기 서열에서 선택된 핵염기 서열의 8개 이상, 10개 이상, 12개 이상, 14개 이상, 16개 이상, 18개 이상 또는 20개의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 테트라히드로피란 고리가 푸라노스 고리를 교체하는 1개 이상의 테트라히드로피란-변형 뉴클레오시드를 포함하는 화합물을 제공한다.
특정 실시양태에서, 상기 1개 이상의 테트라히드로피란-변형 뉴클레오시드는 하기의 구조를 갖는다:
Figure 112017082589307-pat00002
특정 실시양태에서, 화합물은 변형된 핵염기를 포함하는 뉴클레오시드를 1개 이상 갖는다. 특정 실시양태에서, 변형된 핵염기는 5-메틸시토신이다.
특정 실시양태에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오티드는:
(i) 연결된 데옥시뉴클레오시드들로 구성된 갭 절편;
(ii) 연결된 뉴클레오시드들로 구성된 5' 윙 절편;
(iii) 연결된 뉴클레오시드들로 구성된 3' 윙 절편
을 포함하고, 이때 갭 절편은 5' 윙 절편과 3' 윙 절편에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하고, 각각의 윙 절편의 각각의 뉴클레오시드는 변형된 당을 포함한다. 일부 이같은 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드 내의 각각의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 실시양태에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오티드는
(i) 10개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 절편;
(ii) 5개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 5' 윙 절편;
(iii) 5개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 3' 윙 절편
을 포함하고, 이때 갭 절편은 5' 윙 절편과 3' 윙 절편에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하고, 각각의 윙 절편의 각각의 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하며, 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 이같은 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드 내의 각각의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 실시양태에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오티드는
(i) 14개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 절편;
(ii) 3개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 5' 윙 절편;
(iii) 3개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 3' 윙 절편
을 포함하고, 이때 갭 절편은 5' 윙 절편과 3' 윙 절편에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하고, 각각의 윙 절편의 각각의 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하며, 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 이같은 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드 내의 각각의 시토신은 5-메틸시토신이다.
특정 실시양태에서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오티드는
(i) 13개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 절편;
(ii) 2개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 5' 윙 절편;
(iii) 5개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 3' 윙 절편
을 포함하고, 이때 갭 절편은 5' 윙 절편과 3' 윙 절편에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하고, 각각의 윙 절편의 각각의 뉴클레오시드는 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하며, 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 일부 이같은 실시양태에서, 변형된 올리고뉴클레오티드 내의 각각의 시토신은 5-메틸시토신이다.
본 발명의 실시양태는 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 15 내지 241에 열거된 핵염기 서열에서 선택된 핵염기 서열의 12개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 염, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태는 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 15 내지 269에 열거된 핵염기 서열에서 선택된 핵염기 서열의 12개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 염, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태는 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 241 내지 269에 열거된 핵염기 서열에서 선택된 핵염기 서열의 12개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드 또는 이의 염, 및 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명의 실시양태는 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 15 내지 241에 열거된 핵염기 서열에서 선택된 핵염기 서열의 8개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태는 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 15 내지 269에 열거된 핵염기 서열에서 선택된 핵염기 서열의 8개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태는 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 서열 241 내지 269에 열거된 핵염기 서열에서 선택된 핵염기 서열의 8개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 핵염기 서열을 갖는 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 동물에게 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 동물은 인간이다.
특정 실시양태에서, 투여는 심부 정맥 혈전증 또는 폐 색전증을 예방한다.
특정 실시양태에서, 화합물은 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰, 헤파린, 레피루딘, 티클로피딘, 와파린, 아픽사반, 리바록사반, 및 로베녹스(LOVENOX)로부터 선택된 임의의 군과 공동-투여된다.
특정 실시양태에서, 화합물은 임의의 인자 Xa 억제제와 공동-투여된다.
특정 실시양태에서, 인자 Xa 억제제는 리바록사반, LY517717, YM150, 아픽사반, PRT054021, 및 DU-176b 중 임의의 것이다.
특정 실시양태에서, 화합물은 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰, 헤파린, 레피루딘, 티클로피딘, 와파린, 아픽사반, 리바록사반, 및 로베녹스로부터 선택된 임의의 군과 동시에 투여된다.
특정 실시양태에서, 투여는 비경구 투여이다. 특정 실시양태에서, 비경구 투여는 피하 투여 또는 정맥내 투여 중 임의의 것이다.
본 발명의 실시양태는 혈전색전성 합병증이 발달될 위험이 있는 동물을 확인하는 단계, 및 위험이 있는 동물에게 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 인자 11 핵산에 대해 상보적인 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 치료 유효량으로 투여하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 혈전색전성 합병증은 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 또는 이들의 조합이다.
본 발명의 실시양태는 동물에게 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 인자 11 핵산에 대해 상보적인 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 치료 유효량으로 투여함으로써 응고 장애를 가진 동물을 확인하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 화합물은 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰, 헤파린, 레피루딘, 티클로피딘, 와파린, 아픽사반, 리바록사반 및 로베녹스로부터 선택된 임의의 군과 공동-투여된다.
특정 실시양태에서, 화합물은 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰, 헤파린, 레피루딘, 티클로피딘, 와파린, 아픽사반, 리바록사반 및 로베녹스로부터 선택된 임의의 군과 동시에 투여된다.
본 발명의 실시양태는 동물에게 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 인자 11 핵산에 대해 상보적인 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 치료 유효량으로 투여함으로써 동물에서 혈전색전성 합병증의 위험을 감소시키는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태는 동물에게 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 인자 11 핵산에 대해 상보적인 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 치료 유효량으로 투여함으로써 동물에서 응고 장애를 치료하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시양태는 동물에게 12개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성되고 인자 11 핵산에 대해 상보적인 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물을 치료 유효량으로 투여함으로써 동물에서 인자 11 발현을 억제하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 동물에서의 인자 11 억제가 변형된 올리고뉴클레오티드에 대한 해독제를 투여함으로써 역전된다.
특정 실시양태에서, 해독제는 변형된 올리고뉴클레오티드에 대해 상보적인 올리고뉴클레오티드이다.
안티센스 화합물
올리고머성 화합물에는 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드, 올리고뉴클레오티드 유사체, 올리고뉴클레오티드 모방체, 안티센스 화합물, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 및 siRNA가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 올리고머성 화합물은 표적 핵산에 대해 "안티센스"일 수 있고, 이는 올리고머성 화합물이 수소 결합을 통해 표적 핵산에 혼성화할 수 있음을 의미한다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 5' → 3' 방향으로 기재된 경우 자신이 표적으로 하는 표적 핵산의 표적 절편의 역 상보물을 포함하는 핵염기 서열을 갖는다. 특정한 이같은 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 5' → 3' 방향으로 기재된 경우 자신이 표적으로 하는 표적 핵산의 표적 절편의 역 상보물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 서브유닛 12개 내지 30개의 길이이다. 달리 말하면, 이같은 안티센스 화합물은 12개 내지 30개의 연결된 서브유닛이다. 또 다른 실시양태에서, 안티센스 화합물은 8개 내지 80개, 12개 내지 50개, 15개 내지 30개, 18개 내지 24개, 19개 내지 22개, 또는 20개의 연결된 서브유닛이다. 특정한 이같은 실시양태에서, 안티센스 화합물은 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 또는 80개의 연결된 서브유닛의 길이, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위이다. 일부 실시양태에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이고, 연결된 서브유닛들은 뉴클레오티드이다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 단축 또는 말단절단될 수 있다. 예를 들어, 단일 서브유닛이 5' 끝부분 (5' 말단절단), 또는 별법적으로 3' 끝부분 (3' 말단절단)으로부터 결실될 수 있다. 인자 11 핵산을 표적으로 하는 단축 또는 말단절단 안티센스 화합물에서, 안티센스 화합물의 5' 끝부분으로부터 2개의 서브유닛이 결실될 수 있거나, 또는 별법적으로 화합물의 3' 끝부분으로부터 2개의 서브유닛이 결실될 수 있다. 별법적으로, 결실된 뉴클레오시드가 안티센스 화합물 전반에 걸쳐 분산될 수 있고, 예를 들어, 안티센스 화합물에서 5' 끝부분에서 1개의 뉴클레오시드가 결실되고 3' 끝부분에서 1개의 뉴클레오시드가 결실된다.
연장된 안티센스 화합물 내에 1개의 추가적인 서브유닛이 존재하는 경우, 추가적인 서브유닛은 안티센스 화합물의 5' 또는 3' 끝부분에 위치할 수 있다. 2개 이상의 추가적인 서브유닛이 존재하는 경우, 부가된 서브유닛은 서로 인접할 수 있거고, 예를 들어, 안티센스 화합물에서 2개의 서브유닛이 안티센스 화합물의 5' 끝부분에 부가되거나 (5' 부가), 또는 별법적으로 화합물의 3' 끝부분에 부가된다 (3' 부가). 별법적으로, 부가된 서브유닛이 안티센스 화합물 전반에 걸쳐 분산될 수 있고, 예를 들어, 안티센스 화합물에서 5' 끝부분에서 1개의 서브유닛이 부가되고 3' 끝부분에서 1개의 서브유닛이 부가된다.
활성을 제거하지 않으면서 안티센스 화합물, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드의 길이를 증가 또는 감소시키고/시키거나 미스매치 염기를 도입할 수 있다. 예를 들어, [Woolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7305-7309, 1992]에서, 핵염기 13개-25개 길이의 일련의 안티센스 올리고뉴클레오티드들이 표적 RNA의 절단을 유도하는 이들의 능력에 대해 난모세포 주입 모델에서 테스트되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 끝부분 근처에 8개 또는 11개의 미스매치 염기가 있는 핵염기 25개 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드가, 비록 미스매치를 함유하지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 적은 정도이기는 하지만, 표적 mRNA의 특이적 절단을 지시할 수 있었다. 유사하게, 핵염기 13개의 안티센스 올리고뉴클레오티드 (1개 또는 3개의 미스매치가 있는 것들을 포함)를 사용하여 표적 특이적 절단이 달성되었다.
[Gautschi et al., J. Natl. Cancer Inst. 93:463-471, March 2001]에서, bcl-2 mRNA에 대한 상보성이 100％이고 bcl-xL mRNA에 대한 3개의 미스매치가 있는 올리고뉴클레오티드의 시험관내 및 생체내에서 bcl-2 및 bcl-xL 양쪽 모두의 발현을 감소시키는 능력이 실연되었다. 또한, 이러한 올리고뉴클레오티드는 생체 내에서 강력한 항종양 활성을 나타냈다.
[Maher and Dolnick, Nuc. Acid. Res. 16:3341-3358, 1988]은 일련의 14개의 직렬 핵염기의 안티센스 올리고뉴클레오티드들, 및 이러한 직렬 안티센스 올리고뉴클레오티드들 중 2개 또는 3개의 서열로 구성된 28개 및 42개의 핵염기의 안티센스 올리고뉴클레오티드 각각을 토끼 망상적혈구 검정에서 인간 DHFR의 번역을 정지시키는 이들의 능력에 대해 테스트하였다. 3개의 핵염기 14개의 안티센스 올리고뉴클레오티드 단독 각각은, 비록 핵염기 28개 또는 42개의 안티센스 올리고뉴클레오티드보다 더 온건한 수준이기는 하지만, 번역을 억제할 수 있었다.
안티센스 화합물 모티프
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물에서 화학적으로 변형된 서브유닛들이 강화된 억제 활성, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화력, 또는 생체내 뉴클레아제(nuclease)에 의한 분해에 대한 저항성과 같은 성질을 안티센스 화합물에 부여하도록 패턴 또는 모티프로 배열된다.
키메라 안티센스 화합물은 뉴클레아제 분해에 대한 증가된 저항성, 증가된 세포 흡수, 표적 핵산에 대한 증가된 결합 친화력, 및/또는 증가된 억제 활성을 부여하도록 변형된 하나 이상의 영역을 전형적으로 함유한다. 임의적으로, 키메라 안티센스 화합물의 제2 영역이 RNA:DNA 듀플렉스(duplex)의 RNA 가닥을 절단하는 세포성 엔도뉴클레아제 RNase H에 대한 기질로서 작용할 수 있다.
갭머 모티프가 있는 안티센스 화합물은 키메라 안티센스 화합물로 간주된다. 갭머에서, RNaseH 절단을 지지하는 다수의 뉴클레오티드가 있는 내부 영역이 내부 영역의 뉴클레오시드와 화학적으로 상이한 다수의 뉴클레오티드가 있는 외부 영역들 사이에 위치한다. 갭머 모티프가 있는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 경우에, 일반적으로 갭 절편은 엔도뉴클레아제 절단에 대한 기질로서 작용하는 한편, 윙 절편은 변형된 뉴클레오시드를 포함한다. 특정 실시양태에서, 갭머의 영역들은 각각의 상이한 영역을 이루는 당 모이어티의 유형에 의해 구별된다. 일부 실시양태에서, 갭머의 영역들을 구별하기 위해 사용되는 당 모이어티의 유형은 β-D-리보뉴클레오시드, β-D-데옥시리보뉴클레오시드, 2'-변형 뉴클레오시드 (이같은 2'-변형 뉴클레오시드는 특히 2'-MOE, 및 2'-O-CH3을 포함할 수 있다), 및 비시클릭 당 변형 뉴클레오시드 (이같은 비시클릭 당 변형 뉴클레오시드는 4'-(CH2)n-O-2' 다리 [식 중, n=1 또는 n=2]가 있는 것들을 포함할 수 있다)를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 각각의 상이한 영역은 균일한 당 모이어티를 포함한다. 윙-갭-윙 모티프는 종종 "X-Y-Z"로 기술되고, 식 중, "X"는 5' 윙 영역의 길이를 나타내고, "Y"는 갭 영역의 길이를 나타내며, 및 "Z"는 3' 윙 영역의 길이를 나타낸다. 본원에서 사용되는, "X-Y-Z"로 기술되는 갭머는 갭 절편이 5' 윙 절편과 3' 윙 절편 각각에 바로 인접하여 위치하는 형상을 갖는다. 따라서, 5' 윙 절편과 갭 절편 사이, 또는 갭 절편과 3' 윙 절편 사이에 중재 뉴클레오티드가 존재하지 않는다. 임의의 본원에 기술된 안티센스 화합물에 갭머 모티프가 있을 수 있다. 일부 실시양태에서는 X 및 Z가 동일하고, 또 다른 실시양태에서는 상이하다. 바람직한 실시양태에서, Y는 8개 내지 15개 사이의 뉴클레오티드이다. X, Y 또는 Z는 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 25개, 30개 또는 이를 초과하는 개수 중 임의의 개수의 뉴클레오티드일 수 있다. 따라서, 본 발명의 갭머에는, 예를 들어 5-10-5, 4-8-4, 4-12-3, 4-12-4, 3-14-3, 2-13-5, 2-16-2, 1-18-1, 3-10-3, 2-10-2, 1-10-1, 2-8-2, 5-8-5, 또는 6-8-6이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 윙-갭 또는 갭-윙 형상, 즉, 갭머 형상에 대해 상기 기술된 바와 같은 X-Y 또는 Y-Z 형상의 "윙머(wingmer)" 모티프를 갖는다. 따라서, 본 발명의 윙머 형상에는, 예를 들어 5-10, 8-4, 4-12, 12-4, 3-14, 16-2, 18-1, 10-3, 2-10, 1-10, 8-2, 2-13, 5-13, 5-8, 또는 6-8이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 5-10-5 갭머 모티프를 보유한다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 3-14-3 갭머 모티프를 보유한다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 2-13-5 갭머 모티프를 보유한다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 5-8-5 갭머 모티프를 보유한다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 6-8-6 갭머 모티프를 보유한다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 갭-확장 모티프를 보유한다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 갭-확장 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 3개의 윙 절편들에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하는 2'-데옥시리보뉴클레오티드 14개의 갭 절편을 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학적 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학적 변형은 2'-MOE 당 변형을 포함한다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 갭-확장 안티센스 올리고뉴클레오티드는 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 2개의 5' 윙 절편과 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 5개의 3' 윙절편에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하는 2'-데옥시리보뉴클레오티드 13개의 갭 절편을 갖는다. 특정 실시양태에서, 화학적 변형은 2'-당 변형을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 화학적 변형은 2'-MOE 당 변형을 포함한다.
표적 핵산, 표적 영역 및 뉴클레오티드 서열
인자 11을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에는 비제한적으로 하기의 것들이 포함된다: 진뱅크 접속 번호 NM_000128.3 (1999년 3월 24일에 진뱅크에 최초로 기탁되었고, 본원에 서열 1로 포함됨); 19598000에서 19624000까지 말단절단된 NT_022792.17 (2000년 11월 29일에 진뱅크에 최초로 기탁되었고, 본원에 서열 2로 포함됨); 진뱅크 접속 번호 NM_028066.1 (2002년 6월 2일에 진뱅크에 최초로 기탁되었고, 본원에 서열 6으로 포함됨); 및 엑손 1-15 진뱅크 접속 번호 NW_001118167.1 (2006년 3월 28일에 진뱅크에 최초로 기탁되었고, 본원에 서열 274로 포함됨).
본원에 포함된 실시예에서 각각의 서열 번호에 기재된 서열은 당 모이어티, 뉴클레오시드간 연결, 또는 핵염기에 대한 임의의 변형에 독립적인 것으로 이해된다. 따라서, 서열 번호에 의해 정의되는 안티센스 화합물은 당 모이어티, 뉴클레오시드간 연결, 또는 핵염기에 대한 하나 이상의 변형을 독립적으로 포함할 수 있다. 아이시스 번호 (ISIS 번호)에 의해 기술되는 안티센스 화합물은 핵염기 서열 과 모티프의 조합을 가리킨다.
특정 실시양태에서, 표적 영역은 표적 핵산의 구조적으로 정의되는 영역이다. 예를 들어, 표적 영역은 3' UTR, 5' UTR, 엑손, 인트론, 엑손/인트론 접합부, 코딩 영역, 번역 개시 영역, 번역 종결 영역, 또는 또 다른 정의된 핵산 영역을 포함할 수 있다. 인자 11에 대해 구조적으로 정의되는 영역은 NCBI와 같은 서열 데이터베이스로부터의 접속 번호에 의해 수득될 수 있고, 이같은 정보는 본원에 참고로 포함된다. 특정 실시양태에서, 표적 영역은 표적 영역 내의 1개의 표적 절편의 5' 표적 부위에서 동일한 표적 영역 내의 또 다른 표적 절편의 3' 표적 부위까지의 서열을 포함할 수 있다.
표적화는 원하는 효과가 일어나도록 안티센스 화합물이 혼성화할 수 있는 하나 이상의 표적 절편의 결정을 포함한다. 특정 실시양태에서, 원하는 효과는 mRNA 표적 핵산 수준에서의 감소이다. 특정 실시양태에서, 원하는 효과는 표적 핵산에 의해 코딩되는 단백질 수준의 감소 또는 표적 핵산과 관련된 표현형 변화이다.
표적 영역은 하나 이상의 표적 절편을 함유할 수 있다. 표적 영역 내의 다중 표적 절편들은 중첩될 수 있다. 별법적으로, 이들은 중첩되지 않을 수 있다. 특정 실시양태에서, 표적 영역 내의 표적 절편들은 약 300개 이하의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 특정 실시양태에서, 표적 영역 내의 표적 절편들은 표적 핵산 상에서 250개, 200개, 150개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개, 30개, 20개, 또는 10개의 뉴클레오티드이거나, 대략적으로 상기 개수이거나, 상기 개수 이하이거나, 대략적으로 상기 개수 이하이거나, 상기 값들 중 임의의 2가지에 의해 정해지는 범위인 다수의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 특정 실시양태에서, 표적 영역 내의 표적 절편들은 표적 핵산 상에서 5개 이하 또는 약 5개 이하의 뉴클레오티드에 의해 분리된다. 특정 실시양태에서, 표적 절편들은 연속적이다. 본원에 나열된 5' 표적 부위 또는 3' 표적 부위 중 임의의 것인 출발 핵산을 갖는 범위에 의해 정의되는 표적 영역이 구현된다.
5' UTR, 코딩 영역, 3' UTR, 인트론 또는 엑손/인트론 접합부 내에서 적절한 표적 절편이 확인될 수 있다. 개시 코돈 또는 정지 코돈을 함유하는 표적 절편이 또한 적절한 표적 절편이다. 적절한 표적 절편은 특정한 구조적으로 정의되는 영역 예컨대 개시 코돈 또는 정지 코돈을 명확하게 배제할 수 있다.
적절한 표적 절편의 결정은 표적 핵산의 서열을 게놈 전반에 걸쳐 다른 서열에 비교하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, BLAST 알고리즘을 사용하여 상이한 핵산들 사이에서 유사성 영역을 확인할 수 있다. 이러한 비교는 선택된 표적 핵산 이외의 서열 (즉, 비-표적 또는 오프(off)-표적 서열)에 비-특이적 방식으로 혼성화할 수 있는 안티센스 화합물 서열의 선택을 방지할 수 있다.
활성 표적 영역에서의 안티센스 화합물의 활성 (예를 들어, 표적 핵산 수준의 백분율 감소에 의해 정의됨)의 변동이 있을 수 있다. 특정 실시양태에서, 인자 11 mRNA 수준의 감소가 인자 11 발현의 억제의 지표이다. 인자 11 단백질 수준의 감소 또한 표적 mRNA 발현의 억제의 지표이다. 또한, 표현형 변화가 인자 11 발현의 억제의 지표이다. 예를 들어, 연장된 aPTT 시간이 인자 11 발현의 억제의 지표일 수 있다. 또 다른 예에서, 연장된 aPTT 시간 + 정상적인 PT 시간이 인자 11 발현의 억제의 지표일 수 있다. 또 다른 예에서, 혈소판 인자 4 (PF-4)의 양 감소가 인자 11 발현의 억제의 지표일 있다. 또 다른 예에서, 혈전 형성 감소 또는 혈전 형성을 위한 시간 증가가 인자 11 발현의 억제의 지표일 수 있다.
혼성화
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 안티센스 화합물과 인자 11 핵산 사이에 혼성화가 일어난다. 가장 통상적인 혼성화 메커니즘은 핵산 분자들의 상보적 핵염기 사이의 수소 결합 (예를 들어, 왓슨-크릭(Watson-Crick), 후그스틴(Hoogsteen) 또는 역(reversed)-후그스틴 수소 결합)을 수반한다.
다양한 조건 하에 혼성화가 일어날 수 있다. 엄격한 조건은 서열-의존적이고, 혼성화될 핵산 분자들의 성질 및 조성에 의해 결정된다.
서열이 표적 핵산에 대해 특이적으로 혼성화가능한지 여부를 결정하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 안티센스 화합물은 인자 11 핵산에 특이적으로 혼성화한다.
상보성
안티센스 화합물의 충분한 개수의 핵염기가 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 수소 결합할 수 있는 경우에 안티센스 화합물과 표적 핵산이 서로 상보적이어서, 원하는 효과 (예를 들어, 표적 핵산, 예컨대 인자 11 핵산의 안티센스 억제)가 일어날 것이다.
안티센스 화합물이 여전히 특이적으로 표적 핵산에 혼성화할 수 있는 한 안티센스 화합물과 인자 11 핵산 간에 비-상보적 핵염기가 허용될 수 있다. 또한, 안티센스 화합물이 중재 절편 또는 인접한 절편이 혼성화 이벤트에 수반되지 않도록 인자 11 핵산의 하나 이상의 절편에 걸쳐 혼성화될 수 있다 (예를 들어, 루프(loop) 구조, 미스매치 또는 헤어핀(hairpin) 구조).
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 안티센스 화합물, 또는 이의 특정 부분은 인자 11 핵산, 표적 영역, 표적 절편, 또는 이의 특정 부분에 대해 70％, 80％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 상보적이거나 또는 적어도 70％, 80％, 85％, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％, 또는 100％ 상보적이다. 일상적인 방법을 사용하여 안티센스 화합물과 표적 핵산의 백분율 상보성을 결정할 수 있다.
예를 들어, 안티센스 화합물의 20개의 핵염기 중 18개가 표적 영역에 대해 상보적이고, 따라서 특이적으로 혼성화할 안티센스 화합물은 90％ 상동성을 나타낼 것이다. 이러한 예에서, 나머지 비-상보적 핵염기들은 군집되거나 또는 상보적 핵염기에 산재되고, 서로 또는 상보적 핵염기에 대해 연속적일 필요가 없다. 따라서, 표적 핵산과 완전히 상보적인 2개의 영역이 플랭킹(flanking)된 4개의 비-상보적 핵염기가 있는 핵염기 18개 길이의 안티센스 화합물은 표적 핵산과의 전체적인 상보성이 77.8％일 것이고, 따라서 본 발명의 범주 내에 속할 것이다. 당업계에 공지된 BLAST 프로그램 (기본적인 국소 정렬 검색 도구) 및 PowerBLAST 프로그램을 사용하여 안티센스 화합물과 표적 핵산의 영역의 백분율 상보성을 일상적으로 결정할 수 있다 ([Altschul et al., J. Mol. Biol., 1990, 215, 403 410]; [Zhang and Madden, Genome Res., 1997, 7, 649 656]). 백분율 상동성, 서열 동일성 또는 상보성을, 예를 들어, 디폴트 설정을 사용하여 갭(Gap) 프로그램 (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.)에 의해 결정할 수 있고, 이는 [Smith and Waterman (Adv. Appl. Math., 1981, 2, 482 489]의 알고리즘을 사용한다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 안티센스 화합물, 또는 이의 특정 부분은 표적 핵산 또는 이의 특정 부분에 대해 완전히 상보적 (즉, 100％ 상보적)이다. 예를 들어, 안티센스 화합물은 인자 11 핵산, 또는 표적 영역, 또는 표적 절편 또는 이의 표적 서열에 대해 완전히 상보적일 수 있다. 본원에서 사용된 "완전히 상보적"은 안티센스 화합물의 각각의 핵염기가 표적 핵산의 상응하는 핵염기와 정확한 염기 쌍을 이룰 수 있음을 의미한다. 예를 들어, 안티센스 화합물에 대해 완전히 상보적인 표적 핵산의 상응하는 핵염기 20개의 부분이 있는 한, 핵염기 20개의 안티센스 화합물이 핵염기 400개 길이의 표적 서열에 대해 완전히 상보적이다. 완전히 상보적은 제1 핵산 및/또는 제2 핵산의 특정 부분과 관련되어 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 핵염기 30개의 안티센스 화합물의 핵염기 20개의 부분이 핵염기 400개 길이의 표적 서열에 대해 "완전히 상보적"일 수 있다. 각각의 핵염기가 안티센스 화합물의 핵염기 20개의 부분에 대해 상보적인, 상응하는 핵염기 20개의 부분이 표적 서열에 있다면 핵염기 30개의 올리고뉴클레오티드의 핵염기 20개의 부분이 표적 서열에 대해 완전히 상보적이다. 동시에, 안티센스 화합물의 나머지 10개의 핵염기가 표적 서열에 대해 또한 상보적인지 여부에 따라, 전체적인 핵염기 30개의 안티센스 화합물이 표적 서열에 대해 완전히 상보적일 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다.
비-상보적 핵염기의 위치는 안티센스 화합물의 5' 끝부분 또는 3' 끝부분일 수 있다. 별법적으로, 비-상보적 핵염기 또는 핵염기들이 안티센스 화합물의 내부 위치에 있을 수 있다. 2개 이상의 비-상보적 핵염기가 존재하는 경우, 이들은 연속적일 수 있거나 (즉, 연결됨), 또는 비-연속적일 수 있다. 한 실시양태에서, 비-상보적 핵염기는 갭머 안티센스 올리고뉴클레오티드의 윙 절편에 위치한다.
특정 실시양태에서, 핵염기 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 또는 20개 또는 이러한 개수 이하의 길이인 안티센스 화합물이 표적 핵산, 예컨대 인자 11 핵산, 또는 이의 특정 부분에 비해 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 비-상보적 핵염기(들)를 포함한다.
특정 실시양태에서, 핵염기 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 또는 30개 또는 이러한 개수 이하의 길이인 안티센스 화합물이 표적 핵산, 예컨대 인자 11 핵산, 또는 이의 특정 부분에 비해 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 2개 이하, 또는 1개 이하의 비-상보적 핵염기(들)를 포함한다.
본원에서 제공되는 안티센스 화합물은 표적 핵산의 일부분에 대해 상보적인 것들을 또한 포함한다. 본원에서 사용된 "일부분"은 표적 핵산의 영역 또는 절편 내의 한정된 개수의 인접 (즉, 연결된) 핵염기들을 지칭한다. "일부분"은 안티센스 화합물의 한정된 개수의 인접 핵염기들을 또한 지칭할 수 있다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 적어도 표적 절편의 핵염기 8개의 부분에 대해 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 적어도 표적 절편의 핵염기 12개의 부분에 대해 상보적이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 적어도 표적 절편의 핵염기 15개의 부분에 대해 상보적이다. 적어도 표적 절편의 핵염기 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 또는 이를 초과하는 개수, 또는 이러한 값들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위의 부분에 대해 상보적인 안티센스 화합물이 또한 구현된다.
동일성
본원에서 제공되는 안티센스 화합물은 특정 뉴클레오티드 서열, 서열 번호, 또는 특정 아이시스 번호로 표시되는 화합물, 또는 이의 일부분에 대해 규정된 백분율 동일성을 또한 가질 수 있다. 본원에서 사용된 안티센스 화합물은 동일한 핵염기 쌍형성 능력을 갖는다면 본원에 개시된 서열과 동일하다. 예를 들어, 우라실 및 티미딘 양쪽 모두 아데닌과 쌍을 이루기 때문에, 개시된 DNA 서열 내의 티미딘 대신 우라실을 함유하는 RNA는 이러한 DNA 서열과 동일한 것으로 간주될 것이다. 본원에 기술된 안티센스 화합물의 단축형 및 연장형, 뿐만 아니라 본원에서 제공되는 안티센스 화합물에 비해 동일하지 않은 염기들이 있는 화합물이 또한 구현된다. 동일하지 않은 염기들은 서로 인접할 수 있거나, 또는 안티센스 화합물 전반에 걸쳐 분산될 수 있다. 자신이 비교될 서열과 비교하여 동일한 염기 쌍 형성을 지니는 염기의 개수에 따라 안티센스 화합물의 백분율 동일성이 계산된다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물, 또는 이의 일부분은 본원에 개시된 안티센스 화합물 또는 서열 번호, 또는 이의 일부분 중 하나 이상에 대해 적어도 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일하다.
특정 실시양태에서, 안티센스 화합물의 일부분이 표적 핵산의 동일한 길이 부분에 비교된다. 특정 실시양태에서, 핵염기 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개의 부분이 표적 핵산의 동일한 길이 부분에 비교된다.
특정 실시양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오티드의 일부분이 표적 핵산의 동일한 길이 부분에 비교된다. 특정 실시양태에서, 핵염기 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 또는 25개의 부분이 표적 핵산의 동일한 길이 부분에 비교된다.
변형
뉴클레오시드는 염기-당 조합물이다. 뉴클레오시드의 핵염기 (염기로 또한 공지됨) 부분은 보통 헤테로시클릭 염기 모이어티이다. 뉴클레오티드는 뉴클레오시드의 당 부분에 공유결합으로 연결된 포스페이트 기를 추가로 포함하는 뉴클레오시드이다. 펜토푸라노실 당을 포함하는 뉴클레오시드에 대해, 포스페이트 기가 당의 2', 3' 또는 5' 히드록실 모이어티에 연결될 수 있다. 선형 중합체성 올리고뉴클레오티드를 형성하도록 인접한 뉴클레오시드들이 서로 공유결합으로 연결되는 것을 통해 올리고뉴클레오티드가 형성된다. 올리고뉴클레오티드 구조 내에서, 포스페이트 기가 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오시드간 연결을 형성하는 것으로서 통상적으로 언급된다.
안티센스 화합물에 대한 변형은 뉴클레오시드간 연결, 당 모이어티 또는 핵염기에 대한 치환 또는 변화를 포함한다. 바람직한 성질, 예를 들어, 강화된 세포 흡수, 핵산 표적에 대한 강화된 친화력, 뉴클레아제의 존재 하에서의 증가된 안정성, 또는 증가된 억제 활성으로 인해, 변형된 안티센스 화합물이 천연 형태보다 종종 선호된다.
화학적으로 변형된 뉴클레오시드는 표적 핵산에 대한 단축 또는 말단절단 안티센스 올리고뉴클레오티드의 결합 친화력을 증가시키는데 또한 사용될 수 있다. 결과적으로, 이같은 화학적으로 변형된 뉴클레오시드들이 있는 더 짧은 안티센스 화합물로 유사한 결과가 종종 수득될 수 있다.
변형된 뉴클레오시드간 연결
RNA 및 DNA의 천연 발생 뉴클레오시드간 연결은 3'→5' 포스포디에스테르 연결이다. 바람직한 성질, 예를 들어, 강화된 세포 흡수, 핵산 표적에 대한 강화된 친화력, 및 뉴클레아제의 존재 하에서의 증가된 안정성으로 인해, 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결, 즉, 비-천연 발생 뉴클레오시드간 연결이 있는 안티센스 화합물이 천연 발생 뉴클레오시드간 연결이 있는 안티센스 화합물에 비해 종종 선택된다.
변형된 뉴클레오시드간 연결이 있는 올리고뉴클레오티드에는 인 원자가 유지된 뉴클레오시드간 연결, 뿐만 아니라 인 원자가 없는 뉴클레오시드간 연결이 포함된다. 대표적인 인 함유 뉴클레오시드간 연결에는 포스포디에스테르, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트, 포스포르아미데이트, 및 포스포로티오에이트가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 인을 함유하는 연결 및 인을 함유하지 않는 연결의 제조 방법이 주지되어 있다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 하나 이상의 변형된 뉴클레오시드간 연결을 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 연결이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물의 각각의 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결이다.
변형된 당 모이어티
본 발명의 안티센스 화합물은 당 기가 변형된 하나 이상의 뉴클레오시드를 임의적으로 함유할 수 있다. 이같은 당-변형 뉴클레오시드는 강화된 뉴클레아제 안정성, 증가된 결합 친화력 또는 일부 또 다른 이로운 생물학적 성질을 안티센스 화합물에 부여할 수 있다. 특정 실시양태에서, 뉴클레오시드는 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리 모이어티를 포함한다. 화학적으로 변형된 리보푸라노스 고리의 예로는 치환기 (비-같은자리 고리 원자들을 연결시켜 비시클릭 핵산 (BNA)을 형성시키는 5' 및 2' 치환기 포함)의 부가, 리보실 고리 산소 원자를 S, N(R), 또는 C(R1)(R)2 (R = H, C1-C12 알킬 또는 보호기)로 교체하는 것, 및 이들의 조합이 비제한적으로 포함된다. 화학적으로 변형된 당의 예로는 2'-F-5'-메틸로 치환된 뉴클레오시드 (또 다른 개시된 5',2'-비스 치환 뉴클레오시드에 대해 2008년 8월 21일 공개된 PCT 국제 출원 WO 2008/101157호 참조), 또는 2'-위치에서의 추가적인 치환과 함께 리보실 고리 산소 원자를 S로 교체하는 것 (2005년 6월 16일 공개된 미국 특허 출원 US2005-0130923 참조), 또는 별법적으로 BNA의 5'-치환 (2007년 11월 22일 공개된 PCT 국제 출원 WO 2007/134181을 참조하고, 이때 LNA가 예를 들어 5'-메틸 또는 5'-비닐 기로 치환된다)이 포함된다.
변형된 당 모이어티가 있는 뉴클레오시드의 예로는 5'-비닐, 5'-메틸 (R 또는 S), 4'-S, 2'-F, 2'-OCH3 및 2'-O(CH2)2OCH3 치환기를 포함하는 뉴클레오시드가 비제한적으로 포함된다. 알릴, 아미노, 아지도, 티오, O-알릴, O-C1-C10 알킬, OCF3, O(CH2)2SCH3, O(CH2)2-O-N(Rm)(Rn), 및 O-CH2-C(=O)-N(Rm)(Rn) [식 중, 각각의 Rm 및 Rn은 독립적으로 H 또는 치환 또는 비-치환 C1-C10 알킬이다]으로부터 2' 위치에서의 치환체가 또한 선택될 수 있다
비시클릭 핵산 (BNA)의 예로는 4' 리보실 고리 원자와 2' 리보실 고리 원자 사이의 다리를 포함하는 뉴클레오시드가 비제한적으로 포함된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 안티센스 화합물은 하기 식 중 하나를 다리가 포함하는 하나 이상의 BNA 뉴클레오시드를 포함한다: 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)-S-2'; 4'-(CH2)-O-2' (LNA); 4'-(CH2)2-O-2' (ENA); 4'-C(CH3)2-O-2' (PCT/US2008/068922 참조); 4'-CH(CH3)-O-2' 및 4'-C-H(CH2OCH3)-O-2' (2008년 7월 15일 허여된 미국 특허 7,399,845 참조); 4'-CH2-N(OCH3)-2' (PCT/US2008/064591 참조); 4'-CH2-O-N(CH3)-2' (2004년 9월 2일 공개된 미국 특허 출원 공보 US2004-0171570 참조); 4'-CH2-N(R)-O-2' (2008년 9월 23일 허여된 미국 특허 7,427,672 참조); 4'-CH2-C(CH3)-2' 및 4'-CH2-C-(=CH2)-2' (PCT/US2008/066154 참조) [식 중, R은 독립적으로 H, C1-C12 알킬, 또는 보호기이다]. 각각의 상기 BNA는 α-L-리보푸라노스 및 β-D-리보푸라노스가 예를 들어 포함되는 다양한 입체화학적 당 형상을 포함한다 (WO 99/14226으로 1999년 3월 25일 공개된 PCT 국제 출원 PCT/DK98/00393 참조).
특정 실시양태에서, 리보실 고리를 당 대용물로 교체하는 것에 의해 뉴클레오시드가 변형된다. 이같은 변형에는 대용물 고리 시스템 (때때로 DNA 유사체로 지칭됨), 예컨대 하기 식 중 하나의 고리와 같은 모르폴리노 고리, 시클로헥세닐 고리, 시클로헥실 고리 또는 테트라히드로피라닐 고리로 리보실 고리를 교체하는 것이 비제한적으로 포함된다:
Figure 112017082589307-pat00003
안티센스 화합물 내로의 혼입을 위해 뉴클레오시드를 변형시키는데 사용될 수 있는 다수의 또 다른 바이시클로 및 트리시클로 당 대용물 고리 시스템이 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어 리뷰 문헌 [Leumann, J. C, Bioorganic & Medicinal Chemistry, 2002, 10, 841-854] 참조). 활성을 강화하도록 이같은 고리 시스템에 다양한 추가적인 치환이 진행될 수 있다.
변형된 당의 제조 방법이 당업자에게 주지되어 있다.
변형된 당 모이어티가 있는 뉴클레오티드에서, 적합한 핵산 표적과의 혼성화를 위해 핵염기 모이어티 (천연, 변형 또는 이들의 조합 포함)가 유지된다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 변형된 당 모이어티가 있는 뉴클레오티드를 1개 이상 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 당 모이어티는 2'-MOE이다. 특정 실시양태에서, 2'-MOE 변형 뉴클레오티드가 갭머 모티프 내에 배열된다.
변형된 핵염기
핵염기 (또는 염기) 변형 또는 치환은 천연 발생 또는 변형되지 않은 합성 핵염기와 구조적으로는 구별가능하지만, 기능적으로는 상호교환가능하다. 천연 핵염기 및 변형된 핵염기 양쪽 모두 수소 결합에 참여할 수 있다. 이같은 핵염기 변형은 뉴클레아제 안정성, 결합 친화력 또는 일부 또 다른 이로운 생물학적 성질을 안티센스 화합물에 부여할 수 있다. 변형된 핵염기에는 합성 핵염기 및 천연 핵염기, 예를 들어, 5-메틸시토신 (5-me-C)이 포함된다. 5-메틸시토신 치환이 포함되는 특정 핵염기 치환이 표적 핵산에 대한 안티센스 화합물의 결합 친화력을 증가시키는데 특히 유용하다. 예를 들어, 5-메틸시토신 치환은 0.6-1.2℃만큼 핵산 듀플렉스 안정성을 증가시키는 것으로 나타났다 ([Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278]).
추가적인 변형된 핵염기에는 5-히드록시메틸 시토신, 잔틴, 하이포잔틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 기타 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 기타 알킬 유도체, 2-티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 (-C≡C-CH3) 우라실 및 시토신 및 피리미딘 염기의 기타 알키닐 유도체, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (슈도우라실), 4-티오우라실, 8-할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 기타 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로, 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 기타 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 2-F-아데닌, 2-아미노-아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7-데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아네닌이 포함된다.
헤테로시클릭 염기 모이어티는 퓨린 또는 피리미딘 염기가 다른 헤테로환, 예를 들어, 7-데아자아데닌, 7-데아자구아노신, 2-아미노피리딘 및 2-피리돈으로 교체된 것들을 또한 포함한다. 안티센스 화합물의 결합 친화력을 증가시키는데 특히 유용한 핵염기에는 5-치환 피리미딘, 6-아자피리미딘 및 N-2, N-6 및 O-6 치환 퓨린 (2 아미노프로필아데닌, 5-프로피닐우라실 및 5-프로피닐시토신 포함)이 포함된다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물이 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 갭-확장 안티센스 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 변형된 핵염기를 포함한다. 특정 실시양태에서, 변형된 핵염기는 5-메틸시토신이다. 특정 실시양태에서, 각각의 시토신은 5-메틸시토신이다.
제약 조성물을 제형하기 위한 조성물 및 방법
제약 조성물 또는 제형의 제조를 위해 안티센스 올리고뉴클레오티드가 제약상 허용가능한 활성 또는 불활성 물질과 혼합될 수 있다. 제약 조성물의 제형을 위한 조성물 및 방법은 투여 경로, 질환 정도 또는 투여될 용량을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 기준에 좌우된다.
인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물은 안티센스 화합물을 적절한 제약상 허용가능한 희석제 또는 담체와 조합함으로써 제약 조성물에서 사용될 수 있다. 제약상 허용가능한 담체에는 포스페이트-완충 염수 (PBS)가 포함된다. PBS는 비경구적으로 전달될 조성물에서 사용하기에 적절한 희석제이다. 따라서, 한 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물 및 제약상 허용가능한 희석제를 포함하는 제약 조성물이 본원에 기술된 방법에서 사용된다. 특정 실시양태에서, 제약상 허용가능한 희석제는 PBS이다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
안티센스 화합물을 포함하는 제약 조성물은 인간이 포함되는 동물에게 투여 시 생물학적으로 활성인 대사물 또는 이의 잔기를 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는 임의의 제약상 허용가능한 염, 에스테르, 또는 이같은 에스테르의 염, 또는 임의의 또 다른 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 예를 들어, 본 개시내용은 안티센스 화합물의 제약상 허용가능한 염, 전구약물, 이같은 전구약물의 제약상 허용가능한 염, 및 기타 생물학적 등가물(bioequivalent)을 또한 포함한다. 적절한 제약상 허용가능한 염에는 나트륨 및 칼륨 염이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
전구약물은 활성 안티센스 화합물을 형성하도록 신체 내의 내인성 뉴클레아제에 의해 절단되는, 안티센스 화합물의 한쪽 또는 양쪽 끝부분에서의 추가적인 뉴클레오시드의 혼입을 포함할 수 있다.
접합된 안티센스 화합물
안티센스 화합물은 생성된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 강화하는 하나 이상의 모이어티 또는 접합체에 공유결합으로 연결될 수 있다. 전형적인 접합체 기에는 콜레스테롤 모이어티 및 지질 모이어티가 포함된다. 추가적인 접합체 기에는 탄수화물, 인지질, 비오틴, 페나진, 폴레이트, 페난트리딘, 안트라퀴논, 아크리딘, 플루오레세인, 로다민, 쿠마린 및 염료가 포함된다.
뉴클레아제 안정성과 같은 성질을 강화하도록 안티센스 화합물의 한쪽 또는 양쪽 말단에 일반적으로 부착되는 하나 이상의 안정화 기가 있도록 안티센스 화합물이 또한 변형될 수 있다. 안정화 기에는 캡 구조가 포함된다. 이러한 말단 변형은 말단 핵산이 있는 안티센스 화합물을 엑소뉴클레아제 분해로부터 보호하고, 세포 내에서의 전달 및/또는 국소화를 도울 수 있다. 캡은 5'-말단 (5'-캡) 또는 3'-말단 (3'-캡)에 존재할 수 있거나, 또는 양쪽 말단에 존재할 수 있다. 캡 구조는 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, 역전된 데옥시 탈염기성(abasic) 캡이 포함된다. 뉴클레아제 안정성을 부여하기 위해 안티센스 화합물의 한쪽 또는 양쪽 끝부분을 캡핑(capping)하도록 사용될 수 있는 추가적인 3' 및 5'-안정화 기에는 2003년 1월 16일 공개된 WO 03/004602에 개시된 것들이 포함된다.
세포 배양 및 안티센스 화합물 처리
인자 11 핵산의 수준, 활성 또는 발현에 대한 안티센스 화합물의 효과를 다양한 세포 유형에서 시험관 내에서 테스트할 수 있다. 이같은 분석에 사용되는 세포 유형은 상업적 공급원 (예를 들어, <American Type Culture Collection> (Manassus, VA); <Zen-Bio, Inc.> (Research Triangle Park, NC); <Clonetics Corporation> (Walkersville, MD))에서 입수가능하고, 시판되는 시약 (예를 들어, <Invitrogen Life Technologies> (Carlsbad, CA))을 사용하여 공급원의 설명서에 따라 배양된다. 예시적인 세포 유형에는 HepG2 세포, Hep3B 세포, 및 1차 간세포가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
안티센스 올리고뉴클레오티드의 시험관내 테스트
세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하는 방법이 본원에서 기술되고, 이는 또 다른 안티센스 화합물로의 처리에 대해 적절하게 변형될 수 있다.
일반적으로, 세포가 배양에서 약 60-80％ 전면 성장에 도달했을 때 안티센스 올리고뉴클레오티드로 세포를 처리한다.
배양된 세포 내로 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하기 위해 통상적으로 사용되는 한가지 시약에는 양이온성 지질 형질감염 시약인 리포펙틴(LIPOFECTIN) (Invitrogen (Carlsbad, CA))이 포함된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 원하는 최종 농도 및 전형적으로 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드 당 2 내지 12 ug/㎖ 범위인 리포펙틴 농도를 달성하도록 안티센스 올리고뉴클레오티드를 OPTI-MEM 1 (Invitrogen (Carlsbad, CA)) 내의 리포펙틴과 혼합한다.
배양된 세포 내로 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하기 위해 사용되는 또 다른 시약에는 리포펙타민(LIPOFECTAMINE) (Invitrogen (Carlsbad, CA))이 포함된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드의 원하는 최종 농도 및 전형적으로 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드 당 2 내지 12 ug/㎖ 범위인 리포펙타민 농도를 달성하도록 안티센스 올리고뉴클레오티드를 OPTI-MEM 1 혈청 감소 배지 (Invitrogen (Carlsbad, CA)) 내의 리포펙타민과 혼합한다.
배양된 세포 내로 안티센스 올리고뉴클레오티드를 도입하기 위해 사용되는 또 다른 기술에는 전기천공이 포함된다.
통상적인 방법에 의해 세포를 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리한다. 전형적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하고 나서 16-24시간 후에 세포를 수확하고, 이러한 시점에 표적 핵산의 RNA 또는 단백질 수준을 당업계에 공지되어 있고 본원에 기술된 방법에 의해 측정한다. 일반적으로, 처리가 다중 반복으로 수행되는 경우, 반복 처리의 평균으로서 데이터가 제시된다.
사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도는 세포주마다 다르다. 특정 세포주에 대한 최적의 안티센스 올리고뉴클레오티드 농도를 결정하는 방법이 당업계에 주지되어 있다. 리포펙타민으로 형질감염되는 경우 1 nM 내지 300 nM 범위의 농도로 안티센스 올리고뉴클레오티드가 전형적으로 사용된다. 전기천공을 사용하여 형질감염되는 경우 625 내지 20,000 nM 범위의 더 높은 농도로 안티센스 올리고뉴클레오티드가 사용된다.
RNA 단리
전체 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 RNA 분석이 수행될 수 있다. RNA 단리 방법은 당업계에 주지되어 있다. 당업계에 주지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 제조사의 권장 프로토콜에 따라 트리졸(TRIZOL) 시약 (Invitrogen (Carlsbad, CA))을 사용하여 RNA를 제조한다.
표적 수준 또는 발현의 억제의 분석
인자 11 핵산의 수준 또는 발현의 억제를 당업계에 공지된 다양한 방식으로 분석할 수 있다. 예를 들어, 표적 핵산 수준을 예를 들어 노던 블롯(Northern blot) 분석, 경쟁적 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 또는 정량적 실시간 PCR에 의해 분석할 수 있다. 전체 세포 RNA 또는 폴리(A)+ mRNA에 대해 RNA 분석을 수행할 수 있다. RNA 단리 방법은 당업계에 주지되어 있다. 노던 블롯 분석 또한 당업계에서 일상적이다. <PE-Applied Biosystems> (Foster City, CA)로부터 입수가능하고 제조사의 설명서에 따라 사용되는 시판되는 ABI PRISM 7600, 7700, 또는 7900 서열 검출 시스템을 사용하여 정량적 실시간 PCR을 편리하게 완수할 수 있다.
표적 RNA 수준의 정량적 실시간 PCR 분석
제조사의 설명서에 따라 ABI PRISM 7600, 7700, 또는 7900 서열 검출 시스템 (PE-Applied Biosystems (Foster City, CA))을 사용하여 정량적 실시간 PCR에 의해 표적 RNA 수준을 정량할 수 있다. 정량적 실시간 PCR 방법은 당업계에 주지되어 있다.
실시간 PCR 전에, 단리된 RNA를 상보적 DNA (cDNA)가 생산되는 역전사효소 (RT) 반응에 적용한 후, cDNA를 실시간 PCR 증폭을 위한 기질로서 사용한다. RT 및 실시간 PCR 반응은 동일한 샘플 웰에서 순차적으로 수행된다. RT 및 실시간 PCR 시약은 <Invitrogen> (Carlsbad, CA)으로부터 수득된다. RT 실시간-PCR 반응은 당업자에게 주지된 방법으로 수행된다.
발현이 일정한 유전자, 예컨대 시클로필린 A의 발현 수준을 사용하여, 또는 리보그린(RIBOGREEN) (Invitrogen, Inc. (Carlsbad, CA))을 사용하여 전체 RNA를 정량함으로써, 실시간 PCR에 의해 수득된 유전자 (또는 RNA) 표적의 양을 표준화한다. 시클로스포린 A 발현은 표적과 동시에 다중으로 또는 별도로 실행함으로써 실시간 PCR에 의해 정량된다. 전체 RNA는 리보그린 RNA 정량 시약 (Invetrogen, Inc. (Eugene, OR))을 사용하여 정량된다. 리보그린에 의한 RNA 정량 방법이 [Jones, L.J., et al., Analytical Biochemistry, 1998, 265, 368-374]에 교시되어 있다. 시토플루오르(CYTOFLUOR) 4000 기기 (PE Applied Biosystems)가 리보그린 형광을 측정하는데 사용된다.
인자 11 핵산에 혼성화하도록 프로브 및 프라이머가 디자인된다. 실시간 PCR 프로브 및 프라이머를 디자인하는 방법은 당업계에 주지되어 있고, 프라이머 익스프레스(PRIMER EXPRESS) 소프트웨어 (Applied Biosystems (Foster City, CA))와 같은 소프트웨어의 사용을 포함한다.
단백질 수준의 분석
인자 11 핵산의 안티센스 억제를 인자 11 단백질 수준을 측정함으로써 평가할 수 있다. 당업계에 주지된 다양한 방식, 예컨대 면역침전, 웨스턴 블롯(Western blot) 분석 (면역블롯팅), 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA), 정량적 단백질 검정, 단백질 활성 검정 (예를 들어, 카스파제(caspase) 활성 검정), 면역조직화학, 면역세포화학 또는 형광-활성화 세포 분류 (FACS)로 인자 11의 단백질 수준을 평가 또는 정량할 수 있다. 표적에 대해 지시된 항체를 다양한 공급원, 예컨대 MSRS 항체 카탈로그 (Aerie Corporation (Birmingham, MI))로부터 확인 및 수득할 수 있거나, 또는 당업계에 주지된 통상적인 모노클로날 또는 폴리클로날 항체 생성 방법을 통해 제조할 수 있다. 마우스, 래트, 원숭이 및 인간 인자 11의 검출에 유용한 항체들이 시판된다.
안티센스 화합물의 생체내 테스트
인자 11의 발현을 억제하고, 표현형 변화, 예컨대 연장된 aPTT, 연장된 aPTT 시간 + 정상 PT, 혈소판 인자 4 (PF-4)의 양 감소, 및 혈전 형성 감소 또는 혈전 형성을 위한 시간 증가를 일으키는 능력에 대해 안티센스 화합물, 예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드를 동물에서 테스트한다. 테스트는 정상 동물에서 또는 실험용 질환 모델에서 수행될 수 있다. 동물에게 투여하기 위해, 안티센스 올리고뉴클레오티드가 제약상 허용가능한 희석제, 예컨대 포스페이트-완충 염수 내에 제형된다. 투여는 비경구 투여 경로, 예컨대 복강내, 정맥내 및 피하 투여를 포함한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 투여량 및 투여 빈도의 계산은 당업자의 능력 내에 있고, 투여 경로 및 동물 체중과 같은 인자에 좌우된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 치료 기간 후, RNA를 간 조직으로부터 단리하고, 인자 11 핵산 발현의 변화를 측정한다. 트롬빈 생성 검정을 사용하여 인자 11 단백질 수준에서의 변화가 또한 측정된다. 또한, 치료된 동물로부터의 혈장을 사용하여 응고 시간, 예를 들어 PT 및 aPTT에 대한 효과가 결정된다.
허용성
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 최소의 부작용을 나타낸다. 부작용에는 전형적으로 인자 11의 표적화와 관련되지 않는, 안티센스 화합물의 투여에 대한 응답, 예컨대 동물에서의 염증성 응답이 포함된다. 특정 실시양태에서, 화합물들은 동물에 의해 잘 허용된다. 증가된 허용성은 안티센스 화합물의 뉴클레오티드 서열, 뉴클레오티드에 대한 화학적 변형, 안티센스 화합물 내의 변형되지 않은 뉴클레오시드 및 변형된 뉴클레오시드의 특정 모티프, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되지 않는 다수의 인자에 좌우될 수 있다. 허용성은 다수의 요인에 의해 결정될 수 있다. 이같은 인자에는 체중, 장기 중량, 간 기능, 신장 기능, 혈소판 수, 백혈구 수가 포함된다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 장기 중량에 대해 최소의 효과를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 화합물은 지라 및/또는 간 중량의 7배, 6배, 5배, 4배, 3배 또는 2배 미만의 증가 또는 유의하지 않은 증가를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 간 기능에 대해 최소의 효과를 나타낸다. 간 기능의 평가를 위한 인자에는 ALT 수준, AST 수준, 혈장 빌리루빈 수준 및 혈장 알부민 수준이 포함된다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 ALT 또는 AST의 7배 미만, 6배 미만, 5배 미만, 4배 미만, 3배 미만 또는 2배 미만의 증가 또는 유의하지 않은 증가를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 혈장 빌리루빈 수준의 3배 미만 또는 2배 미만의 증가 또는 유의하지 않은 증가를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 신장 기능에 대해 최소의 효과를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 혈액 요소 질소 (BUN)의 혈장 농도의 3배 미만 또는 2배 미만의 증가 또는 유의하지 않은 증가를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 소변 단백질 대 크레아티닌 비율의 6배, 5배, 4배, 3배 또는 2배 미만의 증가 또는 유의하지 않은 증가를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 혈액학적 인자에 대해 최소의 효과를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 혈소판 수의 60％, 50％, 40％, 30％, 20％, 10％ 또는 5％ 미만의 증가를 나타낸다. 특정 실시양태에서, 본원에서 제공되는 화합물은 단핵구 수의 4배 미만, 3개 미만 또는 2배 미만의 증가 또는 유의하지 않은 증가를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 화합물은 유리한 약동학을 추가로 나타낸다. 특정 실시양태에서, 안티센스 화합물은 관련된 생체액 또는 조직에서 비교적 높은 반감기를 나타낸다.
특정 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 유리한 점도를 추가로 나타낸다. 특정 실시양태에서, 화합물 또는 조성물의 점도는 165-185 ㎎/㎖의 농도에서 40cP 이하이다.
또 다른 실시양태에서, 화합물은 상기 특성들의 조합을 나타내고, 높은 효율로 동물 모델에서 인자 11 mRNA 발현을 감소시킨다.
특정 적응증
특정 실시양태에서, 본 발명은 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 개체의 치료 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 개체는 혈전색전성 합병증에 걸린 개체이다. 특정 실시양태에서, 개체는 경색증, 혈전증, 색전증, 혈전색전증 예컨대 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 심근 경색증, 및 졸중을 포함하지만 이에 한정되지 않는 응고 장애의 위험이 있는 개체이다. 이는 혈전증의 위험에 이르는 후천적인 문제, 질환 또는 장애, 예를 들어, 수술, 암, 부동, 패혈증, 죽상동맥경화증, 심방 세동, 뿐만 아니라 유전적 소인, 예를 들어, 항-인지질 증후군 및 보통염색체 우성 상태인 인자 V 라이덴이 있는 개체를 포함한다. 특정 실시양태에서, 개체는 항응고 요법을 필요로 하는 것으로 확인되었다. 이같은 개체의 예로는 정형외과 대수술 (예를 들어, 엉덩이/무릎 대치술 또는 엉덩이 골절 수술)을 받는 개체, 및 졸중을 예방하기 위해 심방 세동을 앓고 있는 환자와 같이 만성 치료를 필요로 하는 환자가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명은 개체에서 인자 11 발현을 예방적으로 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태는 치료 유효량의 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물을 개체에게 투여함으로써 치료를 필요로 하는 개체를 치료하는 것을 포함한다.
한 실시양태에서, 치료 유효량의 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물의 투여에 개체의 혈청 내의 인자 11 수준을 모니터링하여 안티센스 화합물의 투여에 대한 개체의 응답을 결정하는 것이 동반된다. 안티센스 화합물의 투여에 대한 개체의 응답이 의사에 의해 사용되어, 치료적 개입의 양 및 기간이 결정된다.
특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물의 투여는 적어도 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위만큼 인자 11 발현의 감소를 초래한다. 특정 실시양태에서, 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 화합물의 투여는 예를 들어, 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT) 테스트, 프로트롬빈 시간 (PT) 테스트, 트롬빈 시간 (TCT), 출혈 시간, 또는 D-이량체와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 표준 테스트에 의해 측정 시 혈액 응고 척도에서의 변화를 초래한다. 특정 실시양태에서, 인자 11 안티센스 화합물의 투여는 이러한 척도를 적어도 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위만큼 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 인자 11 안티센스 화합물의 투여는 이러한 척도를 적어도 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％ 또는 99％, 또는 상기 값들 중 임의의 2개에 의해 정의되는 범위만큼 감소시킨다.
특정 실시양태에서, 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 화합물을 포함하는 제약 조성물이 혈전색전성 합병증을 앓고 있거나 이에 대해 감수성인 환자를 치료하기 위한 약제의 제조에서 사용된다.
특정 조합 요법
특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물이 하나 이상의 약제와 공동-투여된다. 특정 실시양태에서, 이같은 하나 이상의 또 다른 약제는 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물과 동일한 질환, 장애 또는 상태를 치료하도록 디자인된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 또 다른 약제는 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물과 상이한 질환, 장애 또는 상태를 치료하도록 디자인된다. 특정 실시양태에서, 이같은 하나 이상의 또 다른 약제는 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물의 바람직하지 않은 부작용을 치료하도록 디자인된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물이 또 다른 약제와 공동-투여되어, 이러한 또 다른 약제의 바람직하지 않은 효과를 치료한다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물이 또 다른 약제와 공동-투여되어, 조합 효과를 일으킨다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물이 또 다른 약제와 공동-투여되어 상승 효과를 일으킨다.
특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물 및 하나 이상의 또 다른 약제가 동시에 투여된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물 및 하나 이상의 또 다른 약제가 상이한 시점에 투여된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물 및 하나 이상의 또 다른 약제가 단일 제형 내에 함께 제조된다. 특정 실시양태에서, 하나 이상의 본 발명의 제약 조성물 및 하나 이상의 또 다른 약제가 분리되어 제조된다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물과 공동-투여될 수 있는 약제에는 항응고제 또는 항혈소판제가 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물과 공동-투여될 수 있는 약제에는 NSAID/시클로옥시게나제(Cyclooxygenase) 억제제, 예컨대 아스피린이 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물과 공동-투여될 수 있는 약제에는 아데노신 디포스페이트 (ADP) 수용체 억제제, 예컨대 클로피도그렐 (PLAVIX) 및 티클로피딘 (TICLID)이 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물과 공동-투여될 수 있는 약제에는 포스포디에스테라제(phosphodiesterase) 억제제, 예컨대 실로스타졸 (PLETAL)이 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물과 공동-투여될 수 있는 약제에는 당단백질 IIB/IIIA 억제제, 예컨대 압식시맙 (REOPRO), 엡티피바티드 (INTEGRILIN), 티로피반 (AGGRASTAT), 및 데피브로티드가 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물과 공동-투여될 수 있는 약제에는 아데노신 재흡수 억제제, 예컨대 디피리다몰 (PERSANTINE)이 포함된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 제약 조성물과 공동-투여될 수 있는 약제에는 와파린 (및 관련 쿠마린), 헤파린, 직접적인 트롬빈 억제제 (예컨대 레피루딘, 비발리루딘), 아픽사반, 로베녹스, 및 특정 응고 인자의 효소 작용을 직접적으로 방해하는 소형 분자 화합물 (예를 들어, 인자 Xa를 방해하는 리바록사반)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 인자 11 특이적 억제제와 공동-투여될 수 있는 약제에는 추가적인 인자 11 억제제가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 특정 실시양태에서, 항응고제 또는 항혈소판제는 본 발명의 제약 조성물의 투여 전에 투여된다. 특정 실시양태에서, 항응고제 또는 항혈소판제는 본 발명의 제약 조성물의 투여 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 항응고제 또는 항혈소판제는 본 발명의 제약 조성물과 동시에 투여된다. 특정 실시양태에서, 공동-투여되는 항응고제 또는 항혈소판제의 용량은 항응고제 또는 항혈소판제가 단독으로 투여되는 경우에 투여될 용량과 동일하다. 특정 실시양태에서, 공동-투여되는 항응고제 또는 항혈소판제의 용량은 항응고제 또는 항혈소판제가 단독으로 투여되는 경우에 투여될 용량보다 낮다. 특정 실시양태에서, 공동-투여되는 항응고제 또는 항혈소판제의 용량은 항응고제 또는 항혈소판제가 단독으로 투여되는 경우에 투여될 용량보다 높다.
특정 실시양태에서, 제2 화합물의 공동-투여는 제1 화합물의 항응고 효과를 강화시켜, 화합물들의 공동-투여가 제1 화합물 단독 투여의 효과보다 큰 항응고 효과를 초래한다. 또 다른 실시양태에서, 공동-투여는 단독으로 투여되는 경우의 화합물들의 효과의 합계인 항응고 효과를 초래한다. 특정 실시양태에서, 공동-투여는 단독으로 투여되는 경우의 화합물들의 효과의 합계보다 높은 항응고 효과를 초래한다. 특정 실시양태에서, 제2 화합물의 공동-투여는 출혈 위험을 증가시키지 않으면서 항혈전 활성을 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 제1 화합물이 안티센스 화합물이다. 특정 실시양태에서, 제2 화합물이 안티센스 화합물이다.
특정 실시양태에서, 해독제가 인자 11 특이적 억제제의 투여 후 임의 시점에 투여된다. 특정 실시양태에서, 해독제가 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 투여 후 임의 시점에 투여된다. 특정 실시양태에서, 해독제가 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 화합물을 투여하고 나서 수분, 수시간, 수일, 수주 또는 수개월 후에 투여된다. 특정 실시양태에서, 해독제는 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 화합물에 대해 상보적이다 (예를 들어, 센스 가닥). 특정 실시양태에서, 해독제는 인자 7, 인자 7a, 인자 11, 또는 인자 11a 단백질이다. 특정 실시양태에서, 인자 7, 인자 7a, 인자 11, 또는 인자 11a 단백질은 인간 인자 7, 인간 인자 7a, 인간 인자 11, 또는 인간 인자 11a 단백질이다. 특정 실시양태에서, 인자 7 단백질은 노보세븐(NOVOSEVEN)이다.
공동-투여되는 특정 항혈소판 요법
특정 실시양태에서, 인자 11 억제제가 항혈소판 요법과 조합된다. 특정 실시양태에서, 인자 11 억제제를 항혈소판 요법과 조합하여 투여하는 것은 항혈소판 요법 단독과 비교하여 출혈 위험에서의 인지가능한 또는 검출가능한 증가를 거의 초래하지 않거나 초래하지 않는다. 특정 실시양태에서, 위험 프로파일 또는 위험 지표가 항혈소판 요법 단독에 비해 변화되지 않는다.
항혈소판 및 항응고제 요법의 조합은, 예를 들어, 혈전색전증, 심방 세동, 심장 판막 장애, 판막성 심장 질환, 졸중, CAD로 진단된 환자, 및 기계 판막이 있는 환자에서 가장 빈번하게 임상 실행에서 사용된다. 이중 요법의 이점은 혈소판 및 응고 인자 활성 양쪽 모두를 억제하는 것의 가능한 부가적인 효과에 관련된다. 이중 요법의 위험은 출혈 증가에 대한 가능성이다 ([Dowd, M. Plenary Sessions/Thrombosis Research 123 (2008)]).
항혈소판 및 항응고제 요법의 기존의 조합은 항응고제 또는 항혈소판 요법 단독과 비교하여 출혈 위험을 증가시키는 것으로 나타났다. 이같은 조합에는 FXa 억제제 (예를 들어, 아픽시반 및 리바록사반) + ADP 수용체/P2Y12 억제제 (티에노피리딘 예컨대 클로피도그렐 - 플라빅스(PLAVIX)로 또한 공지됨) 및 NSAID (예를 들어, 아스피린 및 나프록센)이 포함된다 ([Kubitza, D. et al., Br. J. Clin. Pharmacol. 63:4 (2006)]; [Wong, P.C. et al. Journal of Thrombosis and Haemostasis 6 (2008)]; [FDA Advisory Committee Briefing Document for New Drug Application 22-406 (2009)]). 예를 들어, [Wong, 상기 문헌]에서, 특정 용량의 아픽사반을 아스피린 및 아스피린 + 클로피도그렐에 부가하는 것이 아스피린 단독 및 아스피린 + 클로피도그렐과 비교하여 출혈 시간에서의 유의한 증가를 일으켰음이 보고되었다. [Kubitza, 상기 문헌]에서는, 리바록사반 및 나프록센의 조합 투여가 나프록센 단독에 비해 출혈 시간을 유의하게 증가시켰음이 보고되었다.
실시예
비-제한적인 개시 및 참고로 포함
본원에 기술된 특정 화합물, 조성물 및 방법이 특정 실시양태들에 따라 특수하게 기술되었지만, 하기의 실시예들은 단지 본원에 기술된 화합물들을 예시하는 작용을 할 뿐이고, 이를 한정하도록 의도되지 않는다. 본 출원에서 인용된 각각의 참고문헌은 이의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
실시예 1: HepG2 세포에서의 인간 인자 11의 안티센스 억제
인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 시험관 내에서 인자 11 mRNA에 대한 이의 효과에 대해 테스트하였다. 10,000개의 세포/웰 밀도의 배양된 HepG2 세포를 75 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드로 리포펙틴 시약을 사용하여 형질감염시켰다. 약 24시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다.
표 1 및 2의 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 5-10-5 MOE 갭머로서 디자인되었다. 이러한 갭머들은 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 5' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드 및 3' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드에는 2'-MOE 변형이 있다. 각각의 갭머 전반에 걸친 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전반에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. "표적 개시 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. "표적 정지 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다. 표 1에 열거된 각각의 갭머는 서열 1 (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3)을 표적으로 하고, 표 2에 열거된 각각의 갭머는 서열 2 (진뱅크 접속 번호 NT_022792.17, 19598000에서 19624000까지 말단절단됨)를 표적으로 한다.
Figure 112017082589307-pat00004
Figure 112017082589307-pat00005
Figure 112017082589307-pat00006
Figure 112017082589307-pat00007
Figure 112017082589307-pat00008
실시예 2: HepG2 세포에서의 인간 인자 11의 용량-의존적 안티센스 억제
인간 인자 11의 84％ 이상의 시험관내 억제를 나타낸 12개의 갭머를 HepG2 세포에서 다양한 용량으로 테스트하였다. 세포를 10,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 표 3에 상술된 바와 같이 9.375 nM, 18.75 nM, 37.5 nM, 75 nM, 및 150 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 리포펙틴 시약을 사용하여 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 인자 11 프라이머 프로브 세트 RTS 2966 (본원에 서열 3으로 포함된 전방향 서열
Figure 112017082589307-pat00009
; 본원에 서열 4로 포함된 역방향 서열
Figure 112017082589307-pat00010
; 본원에 서열 5로 포함된 프로브 서열
Figure 112017082589307-pat00011
)을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 3에 설명된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 인자 11 mRNA 수준이 용량-의존적 방식으로 감소되었다.
Figure 112017082589307-pat00012
실시예 3: 마이크로워크(microwalk)에 의해 디자인된 올리고뉴클레오티드에 의한 HepG2 세포에서의 인간 인자 11의 안티센스 억제
표 3에 제시된 갭머들을 기초로 추가적인 갭머들을 디자인하였다. 표 3으로부터의 원본 갭머의 상류 및 하류로 약간 이동(shift)된 갭머를 생성시킴으로써 (즉, "마이크로워크(microwalk)"), 이러한 갭머들을 디자인하였다. 다양한 모티프, 예를 들어 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE, 및 2-13-5 MOE로 갭머를 또한 생성시켰다. 이러한 갭머들을 시험관 내에서 테스트하였다. 10,000개의 세포/웰 밀도의 배양된 HepG2 세포를 75 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드로 리포펙틴 시약을 사용하여 형질감염시켰다. 약 24시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다.
그후, 표 4, 5, 6, 7, 및 8에 지시된 바와 같이, 마이크로워크에 의해 디자인된 갭머들에 대한 시험관내 억제 데이터를 표 3으로부터의 갭머의 시험관내 억제 데이터와 비교하였다. 올리고뉴클레오티드는 이들이 맵핑(mapping)되는 인간 mRNA (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3) 상의 영역에 따라 표시된다.
표 4의 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE, 및 2-13-5 MOE 갭머로서 디자인되었다. 표 4의 첫부분에 열거된 갭머들은 이로부터 나머지 갭머들이 마이크로워크를 통해 디자인된 원본 갭머 (표 3 참조)이고, 별표로 명시된다. 5-10-5 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 3-14-3 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 14개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 2-13-5 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 13개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된다. 중앙의 갭의 5' 끝부분 상에 2개 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹되고, 3' 끝부분 상에 5개 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 각각의 모티프 (5-10-5, 3-14-3, 및 2-13-5)에 대해, 5' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드 및 3' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드에는 2'-MOE 변형이 있다. 각각의 갭머 전반에 걸친 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전반에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. "표적 개시 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. "표적 정지 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다. 표 4에 열거된 각각의 갭머는 서열 1 (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3)을 표적으로 한다.
표 4에 나타난 바와 같이, 서열 1의 표적 개시 부위 656에서 시작하고 표적 정지 부위 704에서 끝나는 표적 영역 (즉, 핵염기 656-704)을 표적으로 하는 5-10-5 MOE 갭머, 3-14-3 MOE 갭머 및 2-13-5 MOE 갭머 모두가 인자 11 mRNA의 20％ 이상의 억제를 나타냈다. 다수의 갭머가 60％ 이상의 억제를 나타냈다. ISIS 번호 416806, 416809, 416811, 416814, 416821, 416825, 416826, 416827, 416828, 416868, 416869, 416878, 416879, 416881, 416883, 416890, 416891, 416892, 416893, 416894, 416895, 416896, 416945, 416946, 416969, 416970, 416971, 416972, 416973, 412203, 413467, 413468, 및 413469가 포함되는 여러 갭머가 80％ 이상의 억제를 나타냈다. 하기의 ISIS 번호들은 90％ 이상의 억제를 나타냈다: 412203, 413467, 416825, 416826, 416827, 416868, 416878, 416879, 416892, 416893, 416895, 416896, 416945, 416972, 및 416973. 하기의 ISIS 번호들은 95％ 이상의 억제를 나타냈다: 416878, 416892, 416895, 및 416896.
Figure 112017082589307-pat00013
Figure 112017082589307-pat00014
Figure 112017082589307-pat00015
표 5의 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE, 및 2-13-5 MOE 갭머로서 디자인되었다. 표 5의 첫부분에 열거된 갭머들은 이로부터 나머지 갭머들이 마이크로워크를 통해 디자인된 원본 갭머 (표 3 참조)이고, 별표로 명시된다. 5-10-5 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 3-14-3 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 14개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 2-13-5 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 13개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된다. 중앙의 갭의 5' 끝부분 상에 2개 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹되고, 3' 끝부분 상에 5개 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 각각의 모티프 (5-10-5, 3-14-3, 및 2-13-5)에 대해, 5' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드 및 3' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드에는 2'-MOE 변형이 있다. 각각의 갭머 전반에 걸친 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전반에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. "표적 개시 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. "표적 정지 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다. 표 5에 열거된 각각의 갭머는 서열 1 (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3)을 표적으로 한다.
표 5에 나타난 바와 같이, 서열 1의 표적 개시 부위 738에서 시작하고 표적 정지 부위 762에서 끝나는 표적 영역 (즉, 핵염기 738-762)을 표적으로 하는 5-10-5 MOE 갭머, 3-14-3 MOE 갭머 및 2-13-5 MOE 갭머 모두가 인자 11 mRNA의 45％ 이상의 억제를 나타냈다. 대부분의 갭머가 60％ 이상의 억제를 나타냈다. ISIS 번호 412206, 416830, 416831, 416898, 416899, 416900, 416903, 416975, 416976, 416977, 및 416980이 포함되는 여러 갭머들은 80％ 이상의 억제를 나타냈다. 하기의 ISIS 번호들은 90％ 이상의 억제를 나타냈다: 412206, 416831, 및 416900.
Figure 112017082589307-pat00016
표 6의 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE, 및 2-13-5 MOE 갭머로서 디자인되었다. 표 6의 첫부분에 열거된 갭머들은 이로부터 나머지 갭머들이 마이크로워크를 통해 디자인된 원본 갭머 (표 3 참조)이고, 별표로 명시된다. 5-10-5 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 3-14-3 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 14개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 2-13-5 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 13개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된다. 중앙의 갭의 5' 끝부분 상에 2개 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹되고, 3' 끝부분 상에 5개 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 각각의 모티프 (5-10-5, 3-14-3, 및 2-13-5)에 대해, 5' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드 및 3' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드에는 2'-MOE 변형이 있다. 각각의 갭머 전반에 걸친 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전반에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. "표적 개시 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. "표적 정지 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다. 표 6에 열거된 각각의 갭머는 서열 1 (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3)을 표적으로 한다.
표 6에 나타난 바와 같이, 서열 1의 표적 개시 부위 1018에서 시작하고 표적 정지 부위 1042에서 끝나는 표적 영역 (즉, 핵염기 1018-1042)을 표적으로 하는 5-10-5 MOE 갭머, 3-14-3 MOE 갭머 및 2-13-5 MOE 갭머 모두가 인자 11 mRNA의 80％ 이상의 억제를 나타냈다. 하기의 ISIS 번호들은 90％ 이상의 억제를 나타냈다: 413474, 416837, 416838, 416904, 416907, 및 416908.
Figure 112017082589307-pat00017
표 7의 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE, 및 2-13-5 MOE 갭머로서 디자인되었다. 표 7의 첫부분에 열거된 갭머들은 이로부터 나머지 갭머들이 마이크로워크를 통해 디자인된 원본 갭머 (표 3 참조)이고, 별표로 명시된다. 5-10-5 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 3-14-3 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 14개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 2-13-5 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 13개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된다. 중앙의 갭의 5' 끝부분 상에 2개 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹되고, 3' 끝부분 상에 5개 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 각각의 모티프 (5-10-5, 3-14-3, 및 2-13-5)에 대해, 5' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드 및 3' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드에는 2'-MOE 변형이 있다. 각각의 갭머 전반에 걸친 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전반에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. "표적 개시 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. "표적 정지 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다. 표 7에 열거된 각각의 갭머는 서열 1 (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3)을 표적으로 한다.
표 7에 나타난 바와 같이, 서열 1의 표적 개시 부위 1062에서 시작하고 표적 정지 부위 1091에서 끝나는 표적 영역 (즉, 핵염기 1062-1091)을 표적으로 하는 5-10-5 MOE 갭머, 3-14-3 MOE 갭머 및 2-13-5 MOE 갭머 모두가 인자 11 mRNA의 20％ 이상의 억제를 나타냈다. 412215, 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416846, 416847, 416909, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416915, 416916, 416917, 416918, 416986, 416987, 416988, 416989, 416990, 416991, 416992, 416993, 416994, 416995가 포함되는 다수의 갭머가 50％ 이상의 억제를 나타냈다. 하기의 ISIS 번호들은 80％ 이상의 억제를 나타냈다: 412215, 413476, 413476, 416839, 416840, 416841, 416842, 416843, 416844, 416845, 416910, 416911, 416912, 416913, 416914, 416916, 416917, 416986, 416987, 416989, 416991, 416992, 416993, 및 416994. 하기의 ISIS 번호들은 90％ 이상의 억제를 나타냈다: 413476, 413476, 416842, 416844, 416910, 416911, 416912, 416913, 416916, 416917, 및 416993.
Figure 112017082589307-pat00018
표 8의 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 5-10-5 MOE, 3-14-3 MOE, 및 2-13-5 MOE 갭머로서 디자인되었다. 표 8의 첫부분에 열거된 갭머들은 이로부터 나머지 갭머들이 마이크로워크를 통해 디자인된 원본 갭머 (표 3 참조)이고, 별표로 명시된다. 5-10-5 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 3-14-3 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 14개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 2-13-5 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 13개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성된다. 중앙의 갭의 5' 끝부분 상에 2개 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹되고, 3' 끝부분 상에 5개 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 각각의 모티프 (5-10-5, 3-14-3, 및 2-13-5)에 대해, 5' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드 및 3' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드에는 2'-MOE 변형이 있다. 각각의 갭머 전반에 걸친 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전반에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. "표적 개시 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. "표적 정지 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다. 표 8에 열거된 각각의 갭머는 서열 1 (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3)을 표적으로 한다.
표 8에 나타난 바와 같이, 서열 1의 표적 개시 부위 1275에서 시작하고 표적 정지 부위 1318에서 끝나는 표적 영역 (즉, 핵염기 1275-1318)을 표적으로 하는 5-10-5 MOE 갭머, 3-14-3 MOE 갭머 및 2-13-5 MOE 갭머 모두가 인자 11 mRNA의 70％ 이상의 억제를 나타냈다. 412223, 412224, 412225, 413482, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 416920, 416921, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416927, 416928, 416929, 416930, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416936, 416937, 416938, 416939, 416940, 416941, 416942, 416943, 416944, 416997, 416998, 416999, 417000, 417001, 417002, 417003, 417004, 417006, 417007, 417008, 417009, 417010, 417011, 417013, 417014, 417015, 417016, 417017, 417018, 417019, 및 417020이 포함되는 다수의 갭머가 80％ 이상의 억제를 나타냈다. 하기의 ISIS 번호들은 90％ 이상의 억제를 나타냈다: 412224, 416850, 416853, 416856, 416857, 416858, 416861, 416862, 416864, 416922, 416923, 416924, 416925, 416926, 416928, 416931, 416932, 416933, 416934, 416935, 416937, 416938, 416940, 416941, 416943, 416999, 417002, 416854, 및 416859.
Figure 112017082589307-pat00019
Figure 112017082589307-pat00020
Figure 112017082589307-pat00021
실시예 4: HepG2 세포에서의 인간 인자 11의 용량-의존적 안티센스 억제
인간 인자 11의 시험관내 억제를 나타내는 실시예 3으로부터의 갭머들 (표 4, 5, 6, 7, 및 8 참조)을 HepG2 세포에서 다양한 용량으로 테스트하였다. 세포를 10,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 표 9에 상술된 바와 같이 9.375 nM, 18.75 nM, 37.5 nM 및 75 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 리포펙틴 시약을 사용하여 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 인자 11 프라이머 프로브 세트 RTS 2966을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 9에 설명된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 인자 11 mRNA 수준이 용량-의존적 방식으로 감소되었다.
Figure 112017082589307-pat00022
갭머들을 전기천공을 통해 또한 형질감염시키고, 이들의 인간 인자 11 mRNA의 용량 의존적 억제를 측정하였다. 세포를 20,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 표 10에 상술된 바와 같이 0.7 μM, 2.2 μM, 6.7 μM, 및 20 μM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전기천공을 통해 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 인자 11 프라이머 프로브 세트 RTS 2966을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 10에 설명된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 인자 11 mRNA 수준이 용량-의존적 방식으로 감소되었다.
Figure 112017082589307-pat00023
실시예 5: HepG2 세포에서의 인간 인자 11의 효과적인 용량-의존적 안티센스 억제의 선별 및 확인
실시예 4에서 인간 인자 11의 유의한 용량-의존적 억제를 나타낸 갭머들을 선별하고, HepG2 세포에서 다양한 용량으로 테스트하였다. 세포를 10,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 표 11에 상술된 바와 같이 2.34 nM, 4.69 nM, 9.375 nM, 18.75 nM, 37.5 nM, 및 75 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 리포펙틴 시약을 사용하여 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 인자 11 프라이머 프로브 세트 RTS 2966을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 11에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 인자 11 mRNA 수준이 용량-의존적 방식으로 감소되었다.
Figure 112017082589307-pat00024
갭머들을 전기천공을 통해 또한 형질감염시키고, 이들의 인간 인자 11 mRNA의 용량 의존적 억제를 측정하였다. 세포를 20,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 표 12에 상술된 바와 같이 625 nM, 1250 nM, 2500 nM, 5,000 nM, 10,000 nM, 및 20,000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전기천공을 통해 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 인자 11 프라이머 프로브 세트 RTS 2966을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 12에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 인자 11 mRNA 수준이 용량-의존적 방식으로 감소되었다.
Figure 112017082589307-pat00025
실시예 6: 시아노 1차 간세포에서의 인간 인자 11의 효과적인 용량-의존적 안티센스 억제의 선별 및 확인
인간 인자 11의 유의한 용량-의존적 시험관내 억제를 나타낸 실시예 4로부터의 갭머들을 시아노 1차 간세포에서 다양한 용량으로 또한 테스트하였다. 세포를 35,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 표 13에 상술된 바와 같이 0.74 nM, 2.2 nM, 6.7 nM, 20 nM, 60 nM, 및 180 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전기천공을 통해 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 인자 11 프라이머 프로브 세트 RTS 2966을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 13에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 인자 11 mRNA 수준이 용량-의존적 방식으로 감소되었다.
Figure 112017082589307-pat00026
실시예 7: 갭머에 의한 HepB3 세포에서의 인간 인자 11의 효과적인 용량-의존적 안티센스 억제의 선별 및 확인
실시예 4에서 인간 인자 11의 유의한 용량-의존적 억제를 나타낸 갭머들을 인간 HepB3 세포에서 다양한 용량으로 테스트하였다. 세포를 4,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 표 14에 상술된 바와 같이 2.3 nM, 4.7 nM, 9.4 nM, 18.75 nM, 37.5 nM, 및 75 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 리포펙틴 시약을 사용하여 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 인자 11 프라이머 프로브 세트 RTS 2966을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 14에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 인자 11 mRNA 수준이 용량-의존적 방식으로 감소되었다.
Figure 112017082589307-pat00027
갭머들을 전기천공을 통해 또한 형질감염시키고, 이들의 인간 인자 11 mRNA의 용량 의존적 억제를 측정하였다. 세포를 20,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 표 15에 상술된 바와 같이 41.15 nM, 123.457 nM, 370.37 nM, 1111.11 nM, 3333.33 nM, 및 10,000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전기천공을 통해 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 인자 11 프라이머 프로브 세트 RTS 2966을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 15에 설명된 바와 같이, 대조군과 비교하여 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 인자 11 mRNA 수준이 용량-의존적 방식으로 감소되었다.
Figure 112017082589307-pat00028
실시예 8: 1차 마우스 간세포에서의 뮤린 ( murine ) 인자 11의 안티센스 억제
뮤린 인자 11을 표적으로 하는 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드를 뮤린 인자 11 (진뱅크 접속 번호 NM_028066.1, 본원에서 서열 6으로 포함됨)을 표적으로 하는 5-10-5 MOE 갭머로서 디자인하였다. 이러한 갭머들은 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 각각의 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드에는 2'-MOE 변형이 있다. 각각의 갭머 전반에 걸친 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전반에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 1차 마우스 간세포에서 뮤린 인자 11 mRNA를 감소시키는 능력에 대해 평가하였다.
1차 마우스 간세포를 약 24시간의 기간 동안 6.25 nM, 12.5 nM, 25 nM, 50 nM, 100 nM, 및 200 nM의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 세포로부터 RNA를 단리하고, 뮤린 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 뮤린 인자 11 프라이머 프로브 세트 RTS 2898 (전방향 서열
Figure 112017082589307-pat00029
, 본원에 서열 7로 포함됨; 역방향 서열
Figure 112017082589307-pat00030
, 본원에 서열 8로 포함됨; 프로브 서열
Figure 112017082589307-pat00031
, 본원에서 서열 9로 포함됨)을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 여러 뮤린 안티센스 올리고뉴클레오티드가 인자 11 mRNA 수준을 용량-의존적 방식으로 감소시켰다.
실시예 9: 1차 마우스 간세포에서의 뮤린 인자 11의 교차-반응성 안티센스 억제
뮤린 인자 11 핵산을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 시험관 내에서의 인자 11 mRNA에 대한 효과에 대해 테스트하였다. 10,000개의 세포/웰 밀도의 배양된 1차 마우스 간세포를 100 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하였다. 약 24시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 마우스 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다.
표 16의 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 5-10-5 MOE 갭머로서 디자인되었다. 이러한 갭머들은 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 5' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드 및 3' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드에는 2'-MOE 변형이 있다. 각각의 갭머 전반에 걸친 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전반에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. "마우스 표적 개시 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. "마우스 표적 정지 부위"는 갭머가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다. 열거된 모든 마우스 올리고뉴클레오티드들이 서열 6으로 본원에 포함된 마우스 인자 11 mRNA (진뱅크 접속 번호 NM_028066.1)와 서열 1로 본원에 포함된 인간 인자 11 mRNA (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3) 간의 교차-반응성을 나타냈다. "인간 표적 개시 부위"는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적으로 하는 인간 mRNA (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3)의 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. "인간 표적 정지 부위"는 안티센스 올리고뉴클레오티드가 표적으로 하는 인간 mRNA (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3)의 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다. "미스매치 개수"는 마우스 올리고뉴클레오티드와 인간 mRNA 서열 간의 미스매치를 가리킨다.
Figure 112017082589307-pat00032
실시예 10: 뮤린 인자 11의 생체내 안티센스 억제
통계적으로 유의한 용량-의존적 억제를 나타내는, 뮤린 인자 11 mRNA (진뱅크 접속 번호 NM_028066.1, 본원에 서열 6으로 포함됨)를 표적으로 하는 여러 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생체 내에서 평가하였다. BALB/c 마우스를 ISIS 404057 (
Figure 112017082589307-pat00033
, 표적 개시 부위 487, 본원에 서열 10으로 포함됨) 및 ISIS 404071 (
Figure 112017082589307-pat00034
, 표적 개시 부위 869, 본원에서 서열 11로 포함됨)로 처리하였다.
처리
BALB/c 마우스에 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏, 또는 50 ㎎/㎏의 ISIS 404057 또는 ISIS 404071을 3주 동안 1주일에 2회 주사하였다. 대조군 마우스에는 포스페이트 완충 염수 (PBS)를 3주 동안 1주일에 2회 주사하였다. 마지막 용량을 제공하고 나서 5일 후 마우스를 희생시켰다. RNA 분석을 위해 전체 간을 회수하고, 응고 분석 (PT 및 aPTT) 및 단백질 분석을 위해 혈장을 수집하였다.
RNA 분석
인자 11의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 표 17에 나타난 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드들이 PBS 대조군에 비해 뮤린 인자 11을 용량-의존적으로 감소시켰다. 결과는 대조군과 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00035
PT 및 aPTT 검정
프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)을 ISIS 404057 및 ISIS 404071로 처리된 마우스로부터의 혈소판 결핍 혈장 (PPP)을 사용하여 측정하였다. 표 18에 제공된 PT 및 aPTT 값은 국제 표준화 비율 (INR) 값으로서 보고된다. 각각의 실험군 (즉, ISIS 404057 또는 ISIS 404071로의 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏, 및 50 ㎎/㎏ 처리)에 대한 PT 또는 aPTT 값을 PBS 처리군에 대한 PT 또는 aPTT로 나눔으로써 PT 또는 aPTT에 대한 INR 값을 결정하였다. 그후, 이러한 비율을 사용된 조직 인자의 국제 민감도 지수 (ISI)로 제곱하였다. 표 18에 나타난 바와 같이, PT가 ISIS 404057 또는 ISIS 404071로 처리된 마우스에서 유의하게 연장되지 않았다. 그러나, aPTT는 ISIS 404057 또는 ISIS 404071로 처리된 마우스에서 용량-의존적 방식으로 연장되었다. 이러한 데이터는 인자 11의 안티센스 감소가 혈액 응고의 접촉 활성화 경로에 영향을 미치지만, 외인성 경로에는 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다.
Figure 112017082589307-pat00036
단백질 분석
ISIS 404071로 처리된 마우스의 혈장으로부터의 인자 11 효소전구체(proenzyme)를 응고 시간을 기초로 하는 F11 검정을 사용하여 측정하였다. 응고 시간을 ST4 반자동 응고 설비 (Diagnostica Stago (NJ))로 이중으로 결정하였다. BSA가 있는 HEPES-NaCl 완충제에 1/20 희석된 시트레이트 첨가 샘플 혈장 30 ㎕를 30 ㎕ aPTT 시약 (혈소판 인자 3 시약 + 미립자 활성화제) 및 30 ㎕의 인자 11이 결핍된 시트레이트 첨가 혈장 (인간 선천적, George King Bio-Medical Inc.)과 함께 37℃에서 인큐베이션하여, 응고를 개시시켰다. 결과를 단계적으로 희석된 시트레이트 첨가 대조군 뮤린 혈장의 표준 곡선 상에 내삽하였다.
표 19에 나타난 바와 같이, ISIS 404071로의 처리는 인자 11 단백질의 유의한 용량-의존적 감소를 초래하였다. 결과는 PBS 대조군에 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00037
실시예 11: 와파린과 비교된 FeCl 3 -유도 정맥 혈전증 (VT) 모델에서의 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
ISIS 404071 및 와파린 (COUMADIN)을 FeCl3-유도 VT 마우스 모델에서 평가하였다. 6개의 군의 BALB/c 마우스를 1.25 ㎎/㎏, 2.5 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 또는 40 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 마지막 용량의 ISIS 404071을 투여하고 나서 2일 후, 마우스를 150 ㎎/㎏ 케타민 + 10 ㎎/㎏ 자일라진 혼합물로 복강내 주사에 의해 투여하여 마취시켰다. 추가적인 6개의 군의 BALB/c 마우스를 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏, 및 5 ㎎/㎏의 와파린으로 6일 동안 매일 복강내 투여하여 처리하였다. 마지막 용량의 와파린을 투여하고 나서 4시간 후, 마우스를 150 ㎎/㎏ 케타민 + 10 ㎎/㎏ 자일라진 혼합물로 복강내 주사에 의해 투여하여 마취시켰다. 2개의 대조군의 BALB/c 마우스는 PBS로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 마지막 용량의 PBS를 투여하고 나서 2일 후, 양쪽 군의 마우스를 150 ㎎/㎏ 케타민 + 10 ㎎/㎏ 자일라진 혼합물로 복강내 주사에 의해 투여하여 마취시켰다. 제1 대조군을 제외한 모든 마우스 군에서 FeCl3로 혈전 형성을 유도하였다.
FeCl3 처리가 진행되는 마우스에서, 10 ％ FeCl3 용액으로 미리 포화된 여과지 조각 (2×4 ㎜)을 대정맥 상에 직접 적용함으로써 혈전 형성이 유도되었다. 노출 3분 후, 여과지를 제거하였다. 여과지 적용 30분 후, 혈전을 함유하는 고정 길이의 정맥을 혈소판 분석용으로 절개하였다. RNA 분석을 위해 간을 수집하였다.
RNA 분석
인자 11의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과는 PBS 대조군과 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 20에 나타난 바와 같이, ISIS 404071로의 처리는 PBS 대조군에 비해 인자 11 mRNA의 유의한 용량-의존적 감소를 초래하였다. 반대로, 와파린으로의 처리는 PBS 대조군에 비해 인자 11의 유의한 감소를 초래하지 않았다
Figure 112017082589307-pat00038
혈소판 조성의 정량
혈소판 인자-4 (PF-4)의 실시간 PCR 정량을 사용하여, 혈전 형성의 척도로서 대정맥 내의 혈소판을 정량하였다. 결과는 2개의 PBS-처리 대조군과 비교된 ISIS 404071 또는 와파린으로 처리된 마우스에서의 PF-4의 백분율로서 제시된다. 표 21에 나타난 바와 같이, ISIS 404071로의 처리는 5 ㎎/㎏ 이상의 투여량에 대해 PBS 대조군에 비해 PF-4의 용량-의존적 감소를 초래하였다. 와파린으로의 처리는 2 ㎎/㎏ 이상의 투여량에 대해 PBS 대조군에 비해 PF-4의 감소를 초래하였다. 따라서, 본원에서 제공되는 화합물에 의한 인자 11의 감소는 혈전 및 혈병 형성을 억제하는데 유용하다.　　　
Figure 112017082589307-pat00039
실시예 12: 꼬리 출혈 검정에서의 와파린과 비교된 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
꼬리 출혈을 측정하여, ISIS 404071 또는 와파린으로의 처리가 마우스에서의 내출혈을 야기하는지 여부를 관찰하였다. ISIS 404071 및 와파린 (COUMADIN)을 꼬리 출혈 검정에서 평가하였다. 6개의 군의 BALB/c 마우스를 1.25 ㎎/㎏, 2.5 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 또는 40 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 추가적인 6개의 군의 BALB/c 마우스를 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏, 및 5 ㎎/㎏의 와파린으로 6일 동안 매일 복강내 투여하여 처리하였다. 별도의 대조군의 BALB/c 마우스를 PBS로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다.
꼬리 출혈 검정
ISIS 404071, 와파린, 또는 PBS로의 최종 처리 2일 후, 마우스를 꼬리 출혈 챔버 내에 놓았다. 챔버에서 이소플루란으로 마우스를 마취시키고, 꼬리의 작은 조각 (끝으로부터 약 4 ㎜)을 무균 가위로 절단하였다. 즉각적으로, 꼬리 절단물을 37℃로 가온된 약 10 ㎖의 0.9％ NaCl 완충제 용액이 충전된 15 ㎖ 팔콘(Falcon) 튜브 내에 놓았다. 40분에 걸쳐 혈액을 수집하였다. 염수가 충전된 튜브를 출혈 전 및 후에 칭량하였다. 결과가 표 22에서 제공된다.
ISIS 404071로의 처리는 PBS로 처리된 마우스와 비교하여 출혈에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 와파린은 PBS 대조군과 비교하여 마우스에서 출혈을 증가시켰다. 증가된 용량의 와파린은 증가된 혈액 손실과 양성으로 상관되었다. 이러한 데이터는, 특히 와파린과 비교하여, 본원에서 제공되는 화합물의 출혈 잠재력이 낮다는 것을 시사한다. 실시예 11에서 제공된 결과와 함께 이러한 데이터는 본원에 기술된 화합물로의 인자 11 억제가 관련된 출혈 위험 없이 항혈전 활성을 제공하는데 유용하다는 것을 시사한다.
Figure 112017082589307-pat00040
실시예 13: PT 및 aPTT 에 대한 와파린과 비교된 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
PT 및 aPTT를 ISIS 404071 또는 와파린으로 처리된 마우스로부터의 PPP를 사용하여 측정하였다. 6개의 군의 BALB/c 마우스를 1.25 ㎎/㎏, 2.5 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 또는 40 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 추가적인 6개의 군의 BALB/c 마우스를 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏, 및 5 ㎎/㎏의 와파린으로 6일 동안 매일 복강내 투여하여 처리하였다. 대조군에서는, BALB/c 마우스를 PBS로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 최종 용량을 투여하고 나서 2일 후, PPP를 수집하고, PT 및 aPTT 검정을 수행하였다.
PT 및 aPTT 검정
표 16에 제공된 PT 및 aPTT 값은 국제 표준화 비율 (INR) 값으로서 보고된다. 각각의 실험군 (즉, ISIS 404071로의 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 25 ㎎/㎏, 및 50 ㎎/㎏ 처리)에 대한 PT 또는 aPTT 값을 PBS 처리군에 대한 PT 또는 aPTT로 나눔으로써 PT 또는 aPTT에 대한 INR 값을 결정하였다. 그후, 이러한 비율을 사용된 조직 인자의 국제 민감도 지수 (ISI)로 제곱하였다. 표 23에 나타난 바와 같이, 와파린으로 처리된 마우스에서의 PT가 모든 투여량에서 유의하게 연장되었다. 와파린으로 처리된 마우스에서의 aPTT가, 특히 1 ㎎/㎏ 이상의 투여량에서, 연장되었다. ISIS 404071은 PT에 유의하게 영향을 미치지 않았지만, aPTT는 연장시켰다; 그러나, 와파린으로 처리된 마우스에서만큼 유의하지는 않았다. 이러한 데이터는 ISIS 404071은 혈액 응고의 접촉 활성화 경로에 영향을 미치지만, 외인성 경로에는 영향을 미치지 않는 반면, 와파린은 혈액 응고의 접촉 활성화 경로 및 외인성 경로 양쪽 모두에 영향을 미친다는 것을 시사한다.
Figure 112017082589307-pat00041
실시예 14: 아픽사반과 비교된 FeCl 3 -유도 정맥 혈전증 (VT) 모델에서의 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
ISIS 404071 및 아픽사반을 FeCl3-유도 VT 마우스 모델에서 평가하였다. 6개의 군의 BALB/c 마우스를 1.25 ㎎/㎏, 2.5 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 또는 40 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 마지막 용량의 ISIS 404071을 투여하고 나서 2일 후, 마우스를 150 ㎎/㎏ 케타민 + 10 ㎎/㎏ 자일라진 혼합물로 복강내 주사에 의해 투여하여 마취시켰다. 추가적인 6개의 군의 BALB/c 마우스를 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏, 및 5 ㎎/㎏의 아픽사반으로 1회 피하 투여하여 처리하였다. 아픽사반을 제공하고 나서 20분 후, 마우스를 150 ㎎/㎏ 케타민 + 10 ㎎/㎏ 자일라진 혼합물로 복강내 주사에 의해 투여하여 마취시켰다. 2개의 대조군의 BALB/c 마우스는 PBS로 3주 동안 일주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 마지막 용량의 PBS를 투여하고 나서 2일 후, 양쪽 군의 마우스를 150 ㎎/㎏ 케타민 + 10 ㎎/㎏ 자일라진 혼합물로 복강내 주사에 의해 투여하여 마취시켰다. 제1 대조군을 제외한 모든 마우스 군에서 FeCl3로 혈전 형성을 유도하였다.
FeCl3 처리가 진행되는 마우스에서, 10 ％ FeCl3 용액으로 미리 포화된 여과지 조각 (2×4 ㎜)을 대정맥 상에 직접 적용함으로써 혈전 형성이 유도되었다. 노출 3분 후, 여과지를 제거하였다. 여과지 적용 30분 후, 혈전을 함유하는 고정 길이의 정맥을 혈소판 분석용으로 절개하였다. RNA 분석을 위해 간을 수집하였다.
RNA 분석
인자 11의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과는 PBS 대조군과 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 24에 나타난 바와 같이, ISIS 404071로의 처리는 PBS 대조군에 비해 인자 11 mRNA의 유의한 용량-의존적 감소를 초래하였다. 반대로, 아픽사반으로의 처리는 PBS 대조군에 비해 인자 11의 유의한 감소를 초래하지 않았다
Figure 112017082589307-pat00042
혈소판 조성의 정량
혈소판 인자-4 (PF-4)의 실시간 PCR 정량을 사용하여, 혈전 형성의 척도로서 대정맥 내의 혈소판을 정량하였다. 표 25에 나타난 바와 같이, ISIS 404071로의 처리는 PBS 대조군에 비해 PF-4의 감소를 초래하였다. 아픽사반으로의 처리 또한 PBS 대조군에 비해 PF-4의 감소를 초래하였다. 결과는 2개의 PBS-처리 대조군과 비교된 ISIS 404071 또는 아픽사반으로 처리된 마우스에서의 PF-4의 백분율로서 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00043
실시예 15: 꼬리 출혈 검정에서의 아픽사반과 비교된 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
꼬리 출혈을 측정하여, ISIS 404071 또는 와파린으로의 처리가 마우스에서의 내출혈을 야기하는지 여부를 관찰하였다. ISIS 404071 및 아픽사반을 꼬리 출혈 모델에서 평가하였다. 6개의 군의 BALB/c 마우스를 1.25 ㎎/㎏, 2.5 ㎎/㎏, 5 ㎎/㎏, 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 또는 40 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 추가적인 6개의 군의 BALB/c 마우스를 0.5 ㎎/㎏, 1 ㎎/㎏, 2 ㎎/㎏, 3 ㎎/㎏, 4 ㎎/㎏, 및 5 ㎎/㎏의 아픽사반으로 단일 피하 용량으로 투여하여 처리하였다. 별도의 대조군의 BALB/c 마우스를 PBS로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다.
꼬리 출혈 검정
ISIS 404071, 아픽사반, 또는 PBS로의 최종 처리 2일 후, 마우스를 꼬리 출혈 챔버 내에 놓았다. 챔버에서 이소플루란으로 마우스를 마취시키고, 꼬리의 작은 조각 (끝으로부터 약 4 ㎜)을 무균 가위로 절단하였다. 즉각적으로, 절단된 꼬리를 37℃로 가온된 약 10 ㎖의 0.9％ NaCl 완충제 용액이 충전된 15 ㎖ 팔콘 튜브 내에 놓았다. 40분에 걸쳐 혈액을 수집하였다. 염수가 충전된 튜브를 출혈 전 및 후에 칭량하였다.
표 26에 나타난 바와 같이, ISIS 404071로의 처리는 PBS로 처리된 마우스와 비교하여 출혈에 영향을 미치지 않았다. 그러나, 아픽사반은 PBS 대조군과 비교하여 마우스에서 출혈을 증가시켰다. 증가된 용량의 아픽사반은 증가된 혈액 손실과 양성으로 상관되었다. 이러한 데이터는, 특히 아픽사반과 비교하여, 본원에서 제공되는 화합물의 출혈 잠재력이 낮다는 것을 시사한다. 실시예 14에서 제공된 결과와 함께 이러한 데이터는 본원에 기술된 화합물로의 인자 11 억제가 관련된 출혈 위험 없이 항혈전을 제공하는데 유용하다는 것을 시사한다.
Figure 112017082589307-pat00044
실시예 16: 로베녹스와 조합된 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체외 효과
처리
3개의 군의 BALB/c 마우스를 10 ㎎/㎏, 20 ㎎/㎏, 또는 40 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 대조군 마우스 군은 PBS로 3주 동안 1주일에 2회 투여하여 처리하였다. 최종 용량 5일 후, 마우스를 희생시키고, 혈장을 수집하였다. 저분자량 (LMW) 헤파린인 로베녹스를 0 ㎍/㎖, 2.5 ㎍/㎖, 5.0 ㎍/㎖, 및 7.5 ㎍/㎖의 다양한 농도로 생체외 혈장에 투여하였다. 로베녹스를 투여하고 나서 20분 후에 PT 및 aPTT를 측정하였다.
PT 및 aPTT 검정
표 27에 나타난 바와 같이, 로베녹스로의 처리는 용량-의존적 방식으로 PT를 증가시켰다. ISIS 404071로의 처리는 PT를 유의하게 증가시키지 않았다. PT가 ISIS 404071로의 처리에 의해 유의하게 영향을 받지 않았다. ISIS 404071 및 로베녹스로 처리된 혈장에서 PT에 대한 조합 효과의 증거가 없었다.
Figure 112017082589307-pat00045
표 28에 나타난 바와 같이, 로베녹스로의 처리는 aPTT를 용량-의존적 방식으로 증가시켰다. ISIS 404071로의 처리 또한 aPTT를 용량-의존적 방식으로 증가시켰다. 또한, ISIS 404071과 로베녹스의 조합 치료가 aPTT에 대한 상승 효과가 있는 것으로 나타났다.
Figure 112017082589307-pat00046
실시예 17: FeCl 3 -유도 정맥 혈전증 (VT) 모델에서의 로베녹스와 조합된 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
ISIS 404071과 로베녹스의 조합을 FeCl3-유도 VT 마우스 모델에서 평가하였다. 4개의 군의 BALB/c 마우스를 15 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏, 45 ㎎/㎏, 또는 60 ㎎/㎏의 로베녹스로 3일 동안 매일 1회 피하 투여하여 처리하였다. 추가적인 4개의 군의 BALB/c 마우스를 20 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 마지막 용량의 ISIS 404071 후, 마우스를 15 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏, 45 ㎎/㎏, 또는 60 ㎎/㎏의 로베녹스로 3일 동안 매일 1회 피하 투여하여 처리하였다. 2개의 대조군의 BALB/c 마우스는 PBS로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 제1 대조군을 제외한 모든 마우스 군에서 FeCl3로 혈전 형성을 유도하였다. 모든 마우스를 150 ㎎/㎏ 케타민 + 10 ㎎/㎏ 자일라진 혼합물로 복강내 주사에 의해 투여하여 마취시켰다.
FeCl3 처리가 진행되는 마우스에서, 10 ％ FeCl3 용액으로 미리 포화된 여과지 조각 (2×4 ㎜)을 대정맥 상에 직접 적용함으로써 혈전 형성이 유도되었다. 노출 3분 후, 여과지를 제거하였다. 여과지 적용 30분 후, 혈전을 함유하는 고정 길이의 정맥을 혈소판 분석용으로 절개하였다.
혈소판 조성의 정량
혈소판 인자-4 (PF-4)의 실시간 PCR 정량을 사용하여, 혈전 형성의 척도로서 대정맥 내의 혈소판을 정량하였다. 표 29에 나타난 바와 같이, 로베녹스로의 처리는 PBS 대조군에 비해 PF-4의 감소를 초래하였다. ISIS 404071과 조합된 로베녹스로의 처리는 로베녹스 단독과 비교하여 PF-4의 더 높은 감소를 초래하였다.
Figure 112017082589307-pat00047
실시예 18: 출혈에 대한 로베녹스와 조합된 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
꼬리 출혈을 측정하여, ISIS 404071 및 로베녹스로의 처리가 마우스에서 내출혈을 야기하는지 여부를 관찰하였다. ISIS 404071을 4개의 군의 BALB/c 마우스에게 20 ㎎/㎏의 투여량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였고, 로베녹스를 15 ㎎/㎏, 30 ㎎/㎏, 45 ㎎/㎏, 및 60 ㎎/㎏의 다양한 투여량으로 ISIS 404071 처리의 마지막 3일 동안 매일 1회 피하 투여하였다. 5번째 군에서, ISIS 404071을 BALB/c 마우스에 20 ㎎/㎏의 투여량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 6번째 군에서, 대조군으로서, PBS를 BALB/c 마우스에 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다.
꼬리 출혈 검정
최종 처리 2일 후, 마우스를 꼬리 출혈 챔버 내에 놓았다. 챔버에서 이소플루란으로 마우스를 마취시키고, 꼬리의 작은 조각 (끝으로부터 약 4 ㎜)을 무균 가위로 절단하였다. 즉각적으로, 절단된 꼬리를 37℃로 가온된 약 10 ㎖의 0.9％ NaCl 완충제 용액이 충전된 15 ㎖ 팔콘 튜브 내에 놓았다. 40분에 걸쳐 혈액을 수집하였다. 염수가 충전된 튜브를 출혈 전 및 후에 칭량하였다.
표 30에 나타난 바와 같이, 로베녹스는 PBS로 처리된 마우스와 비교하여 마우스에서 출혈을 증가시켰다. 증가된 용량의 로베녹스는 증가된 혈액 손실과 양성으로 상관되었다. 로베녹스와 조합된 ISIS 404071은 로베녹스 단독으로 처리된 마우스에서 나타난 증가된 혈액 손실을 넘어서 출혈을 유의하게 증가시키지 않았다.
Figure 112017082589307-pat00048
실시예 19: PT 및 aPTT 에 대한 로베녹스와 조합된 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
PT 및 aPTT를 로베녹스와 조합된 ISIS 404071로 처리된 마우스로부터의 PPP를 사용하여 측정하였다. 제1 코호트에서, ISIS 404071을 BALB/c 마우스에 25 ㎎/㎏의 투여량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 마지막 용량의 ISIS 404071을 투여하고 나서 5일 후, 이러한 마우스들로부터 혈장을 수집하였다. 제2 코호트에서, 로베녹스를 BALB/c 마우스에 20 ㎎/㎏의 투여량으로 3일 동안 매일 1회 피하 투여하였다. 마지막 용량의 로베녹스를 투여하고 나서 4시간 후, 이러한 마우스들로부터 혈장을 수집하였다. 제3 코호트에서, ISIS 404071을 BALB/c 마우스에 20 ㎎/㎏의 투여량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하고, 마지막 용량의 ISIS 404071을 투여하고 나서 2일 후, 로베녹스를 20 ㎎/㎏의 투여량으로 매일 1회 피하투여하였다. 마지막 용량의 로베녹스를 투여하고 나서 4시간 후, 이러한 마우스들로부터 혈장을 수집하였다. 제4 코호트에서, 대조군으로서, PBS를 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 마지막 용량을 투여하고 나서 5일 후, 이러한 마우스들로부터 혈장을 수집하였다.
PT 및 aPTT 검정
표 31에 제공된 PT 및 aPTT 값은 국제 표준화 비율 (INR) 값으로서 보고된다. 표 31에 나타난 바와 같이, PT가 ISIS 404071로의 처리, 로베녹스로의 처리, 또는 로베녹스와 조합된 ISIS 404071로의 처리에 유의하게 영향을 받지 않았다. 이러한 데이터는 로베녹스와 조합된 ISIS 404071로의 처리에 의한 PT에 대한 조합 효과가 없음을 시시한다. 표 31에 또한 나타난 바와 같이, 로베녹스로의 처리 및 로베녹스와 조합된 ISIS 404071로의 처리는 aPTT를 증가시켰다. 이러한 데이터는 ISIS 404071 및 로베녹스의 조합 처리가 aPTT에 대한 부가 효과가 있음을 시사한다.
Figure 112017082589307-pat00049
실시예 20: PT 및 aPTT 에 대한 아픽사반과 조합된 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
PT 및 aPTT를 아픽사반과 조합된 ISIS 404071로 처리된 마우스로부터의 PPP를 사용하여 측정하였다. 제1 코호트에서, ISIS 404071을 BALB/c 마우스에 25 ㎎/㎏의 투여량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 마지막 용량의 ISIS 404071을 투여하고 나서 5일 후, 이러한 마우스들로부터 혈장을 수집하였다. 제2 코호트에서, 아픽사반을 BALB/c 마우스에 6 ㎎/㎏의 투여량으로 3일 동안 매일 2회 피하 투여하였다. 마지막 용량의 아픽사반을 투여하고 나서 20분 후, 이러한 마우스들로부터 혈장을 수집하였다. 제3 코호트에서, ISIS 404071을 BALB/c 마우스에 20 ㎎/㎏의 투여량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하고, ISIS 404071 처리의 마지막 3일 동안 아픽사반을 6 ㎎/㎏의 투여량으로 매일 2회 피하투여하였다. 마지막 용량의 아픽사반을 투여하고 나서 20분 후, 이러한 마우스들로부터 혈장을 수집하였다. 제4 코호트에서, 대조군으로서, PBS를 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. PBS의 최종 용량을 투여하고 나서 5일 후, 이러한 마우스들로부터 혈장을 수집하였다.
PT 및 aPTT 검정
표 32에 제공된 PT 및 aPTT 값은 국제 표준화 비율 (INR) 값으로서 보고된다. 표 32에 나타난 바와 같이, PT가 ISIS 404071로의 처리에 유의하게 영향을 받지 않았다. 그러나, 아픽사반 및 ISIS 404071과 조합된 아픽사반은 PT를 증가시켰다. 표 32에 또한 나타난 바와 같이, 아픽사반, ISIS 404071, 및 아픽사반과 조합된 ISIS 404071이 aPTT를 증가시켰다.
Figure 112017082589307-pat00050
실시예 21: PT 및 aPTT 에 대한 와파린과 조합된 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
PT 및 aPTT를 와파린과 조합된 ISIS 404071로 처리된 마우스로부터의 PPP를 사용하여 측정하였다. 2개의 군의 BALB/c 마우스를 25 ㎎/㎏ 또는 50 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 마지막 용량을 투여하고 나서 5일 후, 각각의 군으로부터 혈장을 수집하였다. 제3 군에서, BALB/c 마우스를 2 ㎎/㎏의 와파린으로 5일 동안 매일 1회 처리하였다. 마지막 용량의 와파린을 투여하고 나서 6시간 후 혈장을 수집하였다. 2개의 추가적인 군의 BALB/c 마우스를 25 ㎎/㎏ 또는 50 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하고, 와파린을 ISIS 404071 처리의 마지막 5일 동안 2 ㎎/㎏의 투여량으로 매일 1회 피하 투여하였다. 마지막 와파린 처리 6시간 후 각각의 군으로부터 혈장을 수집하였다. 최종 군의 BALB/c 마우스에서, 대조군으로서, PBS를 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 최종 PBS 처리 5일 후, 혈장을 수집하였다.
PT 및 aPTT 검정
표 33에 제공된 PT 및 aPTT 값은 국제 표준화 비율 (INR) 값으로서 보고된다. 표 33에 나타난 바와 같이, PT가 PBS 또는 ISIS 404071 (양쪽 모두의 투여량)로의 처리에 영향을 받지 않았다. 그러나, 2 ㎎/㎏ 와파린, 2 ㎎/㎏ 와파린과 조합된 25 ㎎/㎏ ISIS 404071, 및 2 ㎎/㎏ 와파린과 조합된 50 ㎎/㎏ ISIS 404071로의 처리는 PT를 증가시켰다. 이러한 데이터는 ISIS 404071 및 와파린의 조합 처리가 PT에 대한 부가 효과가 있음을 시사한다. 표 33에 또한 나타난 바와 같이, aPTT가 ISIS 404071 및 와파린으로의 처리에 의해 영향을 받았다. ISIS 404071과 와파린의 조합은 어느 한쪽 약물 단독보다 aPTT 증가를 더 크게 나타냈다. 이러한 데이터는 ISIS 404071과 와파린의 조합이 aPTT에 대한 상승작용성 효과가 있음을 시사한다.
Figure 112017082589307-pat00051
실시예 22: 마우스에서의 장간막 정맥 혈전증에 대한 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 항혈전 효과
처리
제1 코호트에서, ISIS 404071을 C57BL/6 마우스에 50 ㎎/㎏의 용량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 제2 코호트에서, 본원에 서열 12로 포함된 대조군 올리고뉴클레오티드인 ISIS 405277 (
Figure 112017082589307-pat00052
; 인자 2에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드)을 C57BL/6 마우스에 50 ㎎/㎏의 용량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다.
혈소판 제조
천자에 의해 나이브 C57BL/6 마우스의 안와 정맥총으로부터 혈액을 수집하여, 300 ㎕의 헤파린 (30 U/㎖)을 함유하는 폴리프로필렌 튜브 내에 수집하였다. 1000 rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 혈소판 풍부 혈장 (PRP)을 수득하였다. PRP를 2 ㎕의 프로스타글란딘 I2 (PGI2) (2 ㎍/㎖)를 함유하는 새로운 튜브로 옮기고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 2600 rpm에서의 원심분리 후, 펠렛을 2 ㎕의 PGI2를 함유하는 1 ㎖의 변형 타이로드(Tyrode)-HEPES 완충제 (137 mM NaCl, 0.3 mM Na2HPO4, 2 mM KCl, 12 mM NaHCO3, 5 mM HEPES, 5 mM 글루코스, 0.35％ BSA, pH 7.2)에 재현탁시키고, 37℃에서 5분 동안 인큐베이션하였다. 현탁된 펠렛을 2600 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. PGI2를 제거하기 위해, 세정 단계를 2회 반복하고, 혈소판을 10분 동안 실온에서 칼세인 AM 2.5 ㎍/㎖ (Molecular Probes (Eugene, OR))로 형광으로 표지시켰다.
혈전증에 대한 생체 현미경
형광으로 표지된 혈소판을 ISIS 404071로 처리된 C57BL/6 마우스 및 대조군 올리고뉴클레오티드로 처리된 C57BL/6 마우스에 정맥내 주사하였다. 마우스를 2.5％ 아버틴(avertin)으로 마취시키고, 복벽을 지나 절개하여, 직경이 250-300 ㎛이고 전단 속도가 약 150 s-1인 장간막 정맥을 노출시켰다. 노출된 장간막을 가온된 (37℃) PBS로의 주기적인 과융해에 의해 실험 전반에 걸쳐 습하게 유지시켰다. 12V, 100W, DC 안정화 광원으로 장간막을 투조하였다. CCD 비디오 카메라 (Hamamatsu Photonic Systems (Hamamatsu City, Japan))를 사용하는 SVHS 비디오 레코더 (AG-6730; Panasonic (Tokyo, Japan))에 연결된 짜이스(Zeiss) (Germany)의 액시오버트(Axiovert) 135 도립 현미경 (대물 32×)을 사용하여 정맥을 가시화하였다. 광학적 도플러 속도계 (Microcirculation Research Institute, Texas A&M College of Medicine (College Station, TX))를 사용하여 중앙선 적혈구 속도 (Vrbc)를 측정하였다. 세정맥 전단 속도 (τ)를 뉴턴 유체에 대한 포아즈이유(Poiseuille) 법칙 τ = 8(V평균/Dv) [식 중, Dv는 세정맥의 직경이고, V평균은 측정된 Vrbc로부터 경험적 상관식 V평균 = Vrbc/1.6을 사용하여 추정된다]을 기초로 계산하였다.
결과 분석
마지막 안티센스 올리고뉴클레오티드 주사 2일 후 장간막 정맥 혈전증이 실행되었다. 10％ FeCl3 용액에 침지된 와트만 여과지를 5분 동안 장간막 정맥 상에 적용함으로써 혈전증이 유도되었다. 40분 동안 또는 폐쇄될 때까지 정맥을 모니터링하였다. 직경 30-50 ㎛의 최초의 혈전 이전의 경과 시간, 및 30초 동안 혈액이 유동을 멈추기 전의 경과 시관을 관찰하였다.
ISIS 404071로 처리된 마우스에서 혈전 형성 (직경 30 ㎛)이 14.8분 ± 1.7분에 일어났다. 대조군 마우스에서 혈전 형성 (직경 30 ㎛)이 8.9분 ± 0.6분에 일어났다. 폐쇄성 혈전이 대조군 마우스에서 19.3분 ± 0.8분에 형성되었고, 모든 손상된 세정맥이 폐쇄되었다. 대조적으로, ISIS 404071로 처리된 마우스 내의 대부분의 정맥은 손상 40분 후 관찰이 종결되었을 때 폐쇄되지 않았고, 정맥들이 폐색을 나타내지 않았다. ISIS 404071로 처리된 마우스에서 폐쇄를 나타낸 유일한 정맥은 29.5분에 폐쇄되었고, 5분 후에, 연구가 끝나기 전에 다시 개방되었다.
실시예 23: BALB /c 마우스에서의 뮤린 인자 11의 안티센스 억제에 대한 생체내 센스-올리고뉴클레오티드-해독제
처리
ISIS 404071에 대한 특이적 센스 올리고뉴클레오티드의 해독제로서의 효과를 BALB/c 마우스에서 테스트하였다. 제1 코호트에서, ISIS 404071을 BALB/c 마우스에 40 ㎎/㎏의 용량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 제2 코호트에서, ISIS 404057을 BALB/c 마우스에 40 ㎎/㎏의 용량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 본원에 서열 13으로 포함된, ISIS 404071 특이적 해독제인 ISIS 418026 (
Figure 112017082589307-pat00053
; ISIS 404071에 대해 상보적)을 ISIS 404071 또는 404057의 최종 처리 48시간 후에 90 ㎎/㎏의 단일 주사로 양쪽 코호트에 피하 투여하였다. 제3 코호트에서, ISIS 404071을 BALB/c 마우스에 40 ㎎/㎏의 용량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 최종 ISIS 404071 처리 후, 마우스에 PBS를 피하 주사하였다. 제4 코호트에서, ISIS 404057을 BALB/c 마우스에 40 ㎎/㎏의 용량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 마지막 ISIS 404057 처리 후, 마우스에 PBS를 피하 주사하였다. 해독제 투여 후, 각각의 코호트로부터의 마우스 4마리의 세트를 12시간, 1일, 2일, 3일, 7일, 및 14일에 희생시켰다. RNA 분석을 위해 전체 간을 수집하고, aPTT 분석을 위해 PPP를 수집하였다.
RNA 분석
인자 11의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과는 PBS 대조군과 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 34에 나타난 바와 같이, 해독제 없이 ISIS 404071로 처리된 마우스는 14일 관찰 기간에 걸쳐 억제에서 점진적인 감소를 나타냈다. 그러나, ISIS 404071 및 해독제로 처리된 마우스는 해독제가 제공되지 않은 마우스에 비해 14일 관찰 기간에 걸쳐 억제에서의 가속화된 감소를 나타냈다. 표 34에 또한 나타난 바와 같이, ISIS 418026으로의 처리는 ISIS 404057로 처리된 마우스에서 인자 11 mRNA 발현의 억제에 대한 효과가 없었다.
Figure 112017082589307-pat00054
aPTT 검정
표 35에 나타난 바와 같이, ISIS 404071 및 해독제 (ISIS 418026)로 처리된 마우스는 해독제 없이 ISIS 404071로 처리된 마우스에 비해 14일 관찰 기간에 걸쳐 aPTT의 점진적인 감소를 나타냈다.
Figure 112017082589307-pat00055
실시예 24: BALB /c 마우스에서의 뮤린 인자 11의 안티센스 억제에 대한 생체내 인자 7a 단백질-해독제
처리
ISIS 404071에 대한 해독제로서의 인간 인자 7a (인자 VIIa) 단백질의 효과를 BALB/c 마우스에서 테스트하였다. 2개의 실험군의 BALB/c 마우스를 20 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 2개의 대조군의 BALB/c 마우스를 PBS로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 제1 대조군을 제외한 모든 마우스에서 FeCl3로 혈전 형성을 유도하였다. FeCl3 처리 15분 전에, 제1 실험군을 5 ㎍/㎏의 인간 인자 7a 단백질 해독제 (제품 번호 407act; American Diagnostica Inc.)로 처리하였다. 마지막 용량 2일 후, 마우스를 150 ㎎/㎏ 케타민 + 10 ㎎/㎏ 자일라진 혼합물로 복강내 주사에 의해 투여하여 마취시켰다.
FeCl3 처리가 진행되는 마우스에서, 10 ％ FeCl3 용액으로 미리 포화된 여과지 조각 (2×4 ㎜)을 대정맥 상에 직접 적용함으로써 혈전 형성이 유도되었다. 노출 3분 후, 여과지를 제거하였다. 여과지 적용 30분 후, 혈전을 함유하는 고정 길이의 정맥을 혈소판 분석용으로 절개하였다.
혈소판 조성의 정량
혈소판 인자-4 (PF-4)의 실시간 PCR 정량을 사용하여, 혈전 형성의 척도로서 대정맥 내의 혈소판을 정량하였다. 결과는 2개의 PBS-처리 대조군에 비교된, 해독제로 처리된 마우스 및 해독제로 처리되지 않은 마우스에서의 PF-4의 백분율로서 제시된다. 표 36에 나타난 바와 같이, 인간 인자 7a 단백질 해독제로 처리된 동물은 ISIS 404071 단독으로 처리된 동물과 비교하여 더 많은 PF-4를 발현하였다. 이러한 데이터는 인간 인자 7a가 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제의 효과를 구조하는데 있어서 성공적임을 가리킨다.
Figure 112017082589307-pat00056
실시예 25: 콜라게나제 ( collagenase )-유도 뇌내 출혈 모델에서의 뮤린 인자 11의 생체내 안티센스 억제
처리
ISIS 404071 및 와파린 (COUMADIN)을 콜라게나제-유도 뇌내 출혈 모델에서 시험하였다. 제1 코호트에서, ISIS 404071을 BALB/c 마우스에 40 ㎎/㎏의 용량으로 2주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 제2 코호트에서, 와파린을 마우스에 2 ㎎/㎏의 용량으로 2주 동안 1주일에 2회 투여하였다. 제3 코호트에서, ISIS 421208 (
Figure 112017082589307-pat00057
, 뮤린 인자 11에 대해 8개의 미스매치, 본원에 서열 14로 포함됨)을 BALB/c 마우스에 40 ㎎/㎏의 용량으로 2주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 제4 코호트에서, PBS를 BALB/c 마우스에 2주 동안 1주일에 2회 투여하였다.
최종 용량을 제공하고 나서 2일 후, 모든 코호트 내의 모든 마우스를 5 ㎍/g의 아버틴으로 마취시켰다. 이어서, 정수리점의 편평한 두개골로부터 -1 mm AP, 1 mm R ML, -4 mm DV에서 0.075 U 콜라게나제 (150 U/㎖)를 함유하는 10 ㎕ 해밀턴(Hamilton) 주사기로 마우스에 주사를 놓았다. 콜라게나제를 5분에 걸쳐 전달하였고, 추가로 5분 동안 바늘을 제자리에 놓아 역류를 방지하였다. 그후, 출혈 크기, 신경학적 결함 점수, 및 사망률에 대해 분석하였다.
표 37은 콜라게나제 처리 후에 마우스에서 검출된 출혈 부피를 나타내고, 표 38은 마우스의 신경학적 결함 점수를 나타내며, 표 39는 마우스의 사망률을 나타낸다. 결함이 없으면 0점, 중증 결함은 5점인 표준 채점 시스템에 의해 신경학적 결함을 측정하였다. 총괄적으로, 데이터는 ISIS 404071이 출혈 크기, 신경학적 결함 점수, 또는 마우스의 사망률에 대한 유의한 효과가 없었음을 시사한다. 따라서, 뇌내 출혈 위험 (와파린으로 처리된 개체에 대한 위험 인자)이 와파린으로 처리된 마우스에 비해 ISIS 404071로 처리된 마우스에서 유의하게 감소되었다.
Figure 112017082589307-pat00058
Figure 112017082589307-pat00059
Figure 112017082589307-pat00060
실시예 26: FeCl 3 -유도 정맥 혈전증 (VT) 모델에서의 플라빅스와 조합된 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
ISIS 404071과 플라빅스의 조합을 FeCl3-유도 VT 마우스 모델에서 평가하였다. 체중이 각각 약 25 g인 BALB/c 마우스 8마리의 군 4개를 6.25 ㎎/㎏, 12.50 ㎎/㎏, 25.00 ㎎/㎏, 또는 50.00 ㎎/㎏의 플라빅스로 처리하였다. 마우스에게 제1일에 2회 용량의 플라빅스를 제공하고, 제2일에 수술 2시간 전에 1회 용량의 플라빅스를 투여하였다.
체중이 각각 약 25 g인 BALB/c 마우스 8마리의 추가적인 군 4개를 20 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였다. 마지막 용량의 ISIS 404071 후, 마우스를 6.25 ㎎/㎏, 12.50 ㎎/㎏, 25.00 ㎎/㎏, 또는 50.00 ㎎/㎏의 플라빅스로 처리하였다. 제1일에 2회 용량의 플라빅스를 마우스에 투여하였고, 제2일에 수술 2시간 전에 1회 용량의 플라빅스를 투여하였다.
체중이 각각 약 25 g인 BALB/c 마우스 8마리의 대조군 2개는 ISIS 404071 또는 플라빅스로 처리하지 않았다. 체중이 각각 약 25 g인 BALB/c 마우스 8마리의 추가적인 대조군 2개는 20 ㎎/㎏의 ISIS 404071로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하여 처리하였지만, 플라빅스로는 처리하지 않았다. 제1 대조군 및 제3 대조군을 제외한 모든 마우스에서 FeCl3로 혈전 형성을 유도하였다. 모든 마우스를 150 ㎎/㎏ 케타민 + 10 ㎎/㎏ 자일라진 혼합물로 복강내 주사에 의해 투여하여 마취시켰다.
FeCl3 처리가 진행되는 마우스에서, 10 ％ FeCl3 용액으로 미리 포화된 여과지 조각 (2×4 ㎜)을 아래 대정맥 상에 직접 적용함으로써 혈전 형성이 유도되었다. 노출 3분 후, 여과지를 제거하였다. 여과지 적용 30분 후, 혈전을 함유하는 고정 길이의 정맥을 혈소판 분석용으로 절개하였다.
혈소판 조성의 정량
PF-4의 실시간 PCR 정량을 사용하여, 혈전 형성의 척도로서 대정맥 내의 혈소판을 정량하였다. 표 40에 나타난 바와 같이, 플라빅스로의 처리는 PBS 대조군에 비해 PF-4의 감소를 초래하였다. ISIS 404071과 조합된 플라빅스로의 처리는 플라빅스 단독과 비교하여 PF-4의 더 높은 감소를 초래하였다. 따라서, 항-혈소판 요법과 인자 11 ASO의 조합이 항혈전 활성을 증가시켰다. 데이터는 PBS + FeCl3 대조군에 비교된 PF-4 mRNA의 백분율로서 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00061
실시예 27: 출혈에 대한 플라빅스와 조합된 뮤린 인자 11의 안티센스 억제의 생체내 효과
처리
꼬리 출혈을 측정하여, 플라빅스와 조합된 ISIS 404071로의 처리가 출혈 경향 증가를 야기하는지 여부를 관찰하였다. ISIS 404071을 BALB/c 마우스 8마리의 군 5개에 20 ㎎/㎏의 투여량으로 3주 동안 1주일에 2회 피하 투여하였다. 마지막 용량의 ISIS 404071 후, 마우스를 0 ㎎/㎏, 6.25 ㎎/㎏, 12.50 ㎎/㎏, 25.00 ㎎/㎏, 또는 50.00 ㎎/㎏의 플라빅스로 처리하였다. 제1일에 2회 용량의 플라빅스를 마우스에 투여하였고, 제2일에 출혈 2시간 전에 1회 용량의 플라빅스를 투여하였다.
BALB/c 마우스 8마리의 추가적인 군 5개를 ISIS 404071 주사를 제공하지 않은 것을 제외하고는 유사하게 처리하였다.
꼬리 출혈 검정
최종 처리를 제공하고 나서 2시간 후, 마우스를 꼬리 출혈 챔버 내에 놓았다. 챔버에서 이소플루란으로 마우스를 마취시키고, 꼬리의 작은 조각 (끝으로부터 약 4 ㎜)을 무균 가위로 절단하였다. 즉각적으로, 절단된 꼬리를 37℃로 가온된 약 10 ㎖의 0.9％ NaCl 완충제 용액이 충전된 15 ㎖ 팔콘 튜브 내에 놓았다. 40분에 걸쳐 혈액을 수집하였다. 염수가 충전된 튜브를 출혈 전 및 후에 칭량하였다.
실시예 26의 결과와 함께, 이러한 데이터는 항-혈소판 요법과 인자 11 ASO의 조합이 증가된 출혈 위험 없이 항혈전 활성을 증가시킨다는 것을 나타낸다.
Figure 112017082589307-pat00062
실시예 28: 출혈에 대한 플라빅스와 조합된 인자 Xa 소형 분자 억제제의 생체내 효과
처리
꼬리 출혈을 측정하여, 플라빅스와 조합된 인자 10a 소형 분자로의 처리가 출혈 경향 증가를 야기하는지 여부를 관찰하였다. BALB/c 마우스 8마리의 군 5개를 0 ㎎/㎏, 6.25 ㎎/㎏, 12.50 ㎎/㎏, 25.00 ㎎/㎏, 또는 50.00 ㎎/㎏의 플라빅스로 처리하였다. 제1일에 2회 용량의 플라빅스가 마우스에 제공되었고, 제2일에 출혈 2시간 전에 1회 용량의 플라빅스가 제공되었다.
BALB/c 마우스 8마리의 추가적인 군 5개를 0 ㎎/㎏, 6.25 ㎎/㎏, 12.50 ㎎/㎏, 25.00 ㎎/㎏, 또는 50.00 ㎎/㎏의 플라빅스로 처리하였다. 제1일에 2회 용량의 플라빅스가 마우스에 제공되었고, 제2일에 출혈 2시간 전에 1회 용량의 플라빅스가 제공되었다. 이러한 마우스들을 0.5 ㎎/㎏의 소형 분자 인자 10a 억제제인 아픽사반으로 출혈 20분 전에 1회 복강내 투여로 처리하였다.
꼬리 출혈 검정
최종 처리를 제공하고 나서 2시간 후, 마우스를 꼬리 출혈 챔버 내에 놓았다. 챔버에서 이소플루란으로 마우스를 마취시키고, 꼬리의 작은 조각 (끝으로부터 약 4 ㎜)을 무균 가위로 절단하였다. 즉각적으로, 절단된 꼬리를 37℃로 가온된 약 10 ㎖의 0.9％ NaCl 완충제 용액이 충전된 15 ㎖ 팔콘 튜브 내에 놓았다. 40분에 걸쳐 혈액을 수집하였다. 염수가 충전된 튜브를 출혈 전 및 후에 칭량하였다.
하기 표 42에 나타난 바와 같이, 이러한 데이터는 항-혈소판 요법과 소형 분자 인자 10a 억제제, 예컨대 아픽사반의 조합이 출혈 위험을 증가시킨다는 것을 나타낸다. 따라서, 항-혈소판 요법와 인자 11 ASO의 조합으로의 처리가 항-혈소판 요법과 소형 분자 인자 10a 억제제의 조합의 안전성 프로파일과 비교하여 더 양호한 안전성을 제공한다.
Figure 112017082589307-pat00063
실시예 29: 뮤린 인자 11의 안티센스 -매개 생체내 감소 및 혈액에서의 상응하는 항응고의 경시적 과정
처리
뮤린 인자 11 mRNA의 안티센스-매개 감소의 경시적 과정을 BALB/c 마우스에서 관찰하였다. 1회 용량의 50 ㎎/㎏ ISIS 404071을 BALB/c 마우스에 피하 투여하였다. ISIS 404071 투여 후, 마우스를 12시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 7일, 14일, 28일 및 56일에 희생시켰다. RNA 분석을 위해 전체 간을 수집하고, aPTT 분석을 위해 PPP를 수집하였다. 대조군 마우스는 PBS의 1회 피하 투약으로 처리하였다.
RNA 분석
인자 11의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과는 PBS 대조군과 비교하여 제시된다. ISIS 404071로 처리된 마우스는 제1일에 유의한 인자 11 mRNA 하향 조절을 나타냈다. 제14일에 마우스가 인자 11 mRNA 발현을 회복하기 시작하였다. 제28일에 마우스가 완전한 인자 11 mRNA 발현을 회복하였고, 제56일의 결과는 인자 mRNA가 처리전 수준으로 유지되었음을 가리켰다. 따라서, ISIS 404071로 처리된 마우스가 반동(rebound) 효과를 겪지 않았다.
반동 효과가 인자 11의 항체-매개 감소에서 기존에 관찰되었다 ([Blood, First Edition Paper (2008년 10월 22일 온라인에서 예비공개됨); Prevention of vascular graft occlusion and thrombus-associated thrombin generation by inhibition of factor XI]). 인자 11의 과발현은 증가된 응고에 이름으로써 해로울 수 있기 때문에, 이러한 데이터는 인자 11의 안티센스-매개 억제는 반동되지 않으므로 인자 11의 안티센스-매개 억제가 인자 11의 항체-매개 억제보다 더 안전하다는 것을 시사한다.
aPTT 검정
표 43에 제공된 aPTT 값은 국제 표준화 비율 (INR) 값으로서 보고된다. ISIS 404071로 처리된 마우스에 대한 aPTT 값을 PBS 처리군에 대한 aPTT로 나눔으로써 aPTT에 대한 INR 값을 결정하였다. 그후, 이러한 비율을 사용된 조직 인자의 국제 민감도 지수 (ISI)로 제곱하였다. 표 43에 나타난 바와 같이, ISIS 404071로 처리된 마우스가 제4일까지 aPTT의 점진적인 감소를 나타냈고, 제7일부터 제28일까지 처리전 수준으로 점진적으로 증가하였다.
Figure 112017082589307-pat00064
실시예 30: 마이크로워크에 의해 디자인된 올리고뉴클레오티드에 의한 HepG2 세포에서의 인간 인자 11의 안티센스 억제
ISIS 416850 및 ISIS 416858 (상기 표 8 참조)을 기초로 추가적인 갭머들을 디자인하였다. 이러한 갭머들은 ISIS 416850 및 ISIS 416858의 상류 및 하류로 약간 이동되었다 (즉, "마이크로워크"). 이러한 마이크로워크 갭머들은 5-8-5 MOE 또는 6-8-6 MOE 모티프로 디자인되었다.
이러한 마이크로워크 갭머들을 시험관 내에서 테스트하였다. 20,000개의 세포/웰 밀도의 배양된 HepG2 세포를 8,000 nM 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전기천공을 사용하여 형질감염시켰다. 약 24시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다.
ISIS 416850 및 ISIS 416858, 뿐만 아니라 표 1 및 8로부터의 선택된 갭머들 (즉, ISIS 412206, ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416825, ISIS 416848, ISIS 416849, ISIS 416850, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416853, ISIS 416854, ISIS 416855, ISIS 416856, ISIS 416857, ISIS 416858, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416862, ISIS 416863, ISIS 416864, ISIS 416865, ISIS 416866, 및 ISIS 416867)을 상기 기술된 것과 동일한 조건 하에 마이크로워크 갭머와 함께 시험관 내에서 다시 테스트하였다.
표 44의 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 5-10-5 MOE, 5-8-5 및 6-8-6 MOE 갭머로서 디자인되었다. 표 44의 처음 2개의 갭머는 이로부터 ISIS 445493-445543이 마이크로워크를 통해 디자인된 원본 갭머 (ISIS 416850 및 ISIS 416858)이고, 별표로 명시된다. 5-10-5 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 5-8-5 갭머는 뉴클레오티드 18개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 8개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 5개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 6-8-6 갭머는 뉴클레오티드 20개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 8개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 6개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 각각의 모티프 (5-10-5, 5-8-5 및 6-8-6)에 대해, 5' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드 및 3' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드에는 2'-MOE 변형이 있다. 각각의 갭머 전반에 걸친 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전반에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. "인간 표적 개시 부위"는 인간 서열 내의, 갭머가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. "인간 표적 정지 부위"는 인간 서열 내의, 갭머가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다. 표 44에 열거된 각각의 갭머는 서열 1 (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3)을 표적으로 한다. 또한 표 44의 각각의 갭머는 본원에서 서열 274로 명시된 붉은털 원숭이 인자 11 유전자 서열 (엑손 1-15 진뱅크 접속 번호 NW_001118167.1)과 충분히 교차-반응성이다. '붉은털 원숭이 개시 부위'는 붉은털 원숭이 서열 내의, 갭머가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. '붉은털 원숭이 정지 부위'는 붉은털 원숭이 서열 내의, 갭머가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다.
표 44에 나타난 바와 같이, 서열 1의 표적 개시 부위 1275에서 시작하고 표적 정지 부위 1317에서 끝나는 표적 영역 (즉, 핵염기 1275-1317)을 표적으로 하는, 마이크로워크에 의해 디자인된 갭머 모두가 인자 11 mRNA의 60％ 이상의 억제를 나타냈다. 유사하게, 표 1 및 8로부터의 다시 테스트된 갭머 모두가 60％ 이상의 억제를 나타냈다.
하기의 ISIS 번호를 포함하는 여러 갭머가 70％ 이상의 억제를 나타냈다: ISIS 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445499, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445511, 445512, 445513, 445514, 445515, 445516, 445517, 445518, 445519, 445520, 445521, 445522, 445523, 445524, 445525, 445526, 445527, 445528, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 445537, 455538, 445539, 445540, 445541, 445542, 및 445543.
하기의 ISIS 번호를 포함하는 여러 갭머가 80％ 이상의 억제를 나타냈다: ISIS 412206, 412224, 412225, 413481, 413482, 416825, 416848, 416849, 416850, 416851, 416852, 416853, 416854, 416855, 416856, 416857, 416858, 416859, 416860, 416861, 416862, 416863, 416864, 416865, 416866, 416867, 445494, 445495, 445496, 445497, 445498, 445500, 445501, 445502, 445503, 445504, 445505, 445506, 445507, 445508, 445509, 445510, 445513, 445514, 445519, 445520, 445521, 445522, 445525, 445526, 445529, 445530, 445531, 445532, 445533, 445534, 445535, 445536, 455538, 445541, 및 445542.
하기의 ISIS 번호를 포함하는 여러 갭머가 90％ 이상의 억제를 나타냈다: ISIS 412206, 416825, 416850, 416857, 416858, 416861, 445522, 및 445531.
Figure 112017082589307-pat00065
Figure 112017082589307-pat00066
Figure 112017082589307-pat00067
Figure 112017082589307-pat00068
Figure 112017082589307-pat00069
실시예 31: HepG2 세포에서의 인간 인자 11의 용량-의존적 안티센스 억제
인간 인자 11의 시험관내 억제를 나타내는 실시예 30으로부터의 갭머들을 HepG2 세포에서 다양한 용량으로 테스트하였다. 세포를 20,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 표 45에 상술된 바와 같이 123.46 nM, 370.37 nM, 1,111.11 nM, 3,333.33 nM 및 10,000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전기천공을 사용하여 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 인자 11 프라이머 프로브 세트 RTS 2966을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다. 표 45에 설명된 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 인자 11 mRNA 수준이 용량-의존적 방식으로 감소되었다.
사용된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도 대 각각의 농도에서 달성된 인자 11 mRNA 발현의 백분율 억제를 플롯팅(plotting)하고, PBS 대조군에 비해 인자 11 mRNA 발현의 50％ 억제가 달성된 안티센스 올리고뉴클레오티드의 농도를 주목함으로써, 각각의 올리고뉴클레오티드의 절반 최대 억제 농도 (IC50)를 계산하였다. IC50 값이 표 45에서 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00070
실시예 32: 마이크로워크에 의해 디자인된 올리고뉴클레오티드에 의한 HepG2 세포에서의 인간 인자 11의 용량-의존적 안티센스 억제
ISIS 416850 및 ISIS 416858 (상기 표 8 참조)을 기초로 추가적인 갭머들을 디자인하였다. 이러한 갭머들은 ISIS 416850 및 ISIS 416858의 상류 및 하류로 약간 이동되었다 (즉, "마이크로워크"). 마이크로워크에 의해 디자인된 갭머들은 3-8-3 MOE, 4-8-4 MOE, 2-10-2 MOE, 3-10-3 MOE, 또는 4-10-4 MOE 모티프를 지녔다.
이러한 갭머들을 HepG2 세포에서 다양한 용량으로 테스트하였다. 세포를 20,000개의 세포/웰의 밀도로 플레이팅하고, 표 47에 상술된 바와 같이 375 nM, 750 nM, 1,500 nM, 3,000 nM, 6,000 nM 및 12,000 nM 농도의 안티센스 올리고뉴클레오티드로 전기천공을 사용하여 형질감염시켰다. 약 16시간의 처리 기간 후, 세포로부터 RNA를 단리하고, 인자 11 mRNA 수준을 정량적 실시간 PCR에 의해 측정하였다. 인간 인자 11 프라이머 프로브 세트 RTS 2966을 사용하여 mRNA 수준을 측정하였다. 리보그린에 의해 측정된 전체 RNA 함량에 따라 인자 11 mRNA 수준을 조정하였다. 결과는 미처리 대조군 세포와 비교된 인자 11의 백분율 억제로 제시된다.
ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 445522, 및 ISIS 445531 (상기 표 45 참조)을 상기 기술된 것과 동일한 조건 하에 마이크로워크 갭머와 함께 시험관 내에서 다시 테스트하였다.
표 46의 키메라 안티센스 올리고뉴클레오티드들은 3-8-3 MOE, 4-8-4 MOE, 2-10-2 MOE, 3-10-3 MOE, 또는 4-10-4 MOE 갭머로서 디자인되었다. 3-8-3 갭머는 뉴클레오티드 14개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 8개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 4-8-4 갭머는 뉴클레오티드 16개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 8개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 2-10-2 갭머는 뉴클레오티드 14개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 2개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 3-10-3 갭머는 뉴클레오티드 16개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 3개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 4-10-4 갭머는 뉴클레오티드 18개의 길이이고, 이때 중앙의 갭 절편은 10개의 2'-데옥시뉴클레오티드로 구성되고, 양쪽 측면 (5' 및 3' 방향) 상에 각각 4개의 뉴클레오티드를 포함하는 윙이 플랭킹된다. 각각의 모티프 (3-8-3, 4-8-4, 2-10-2, 3-10-3, 및 4-10-4)에 대해, 5' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드 및 3' 윙 절편 내의 각각의 뉴클레오티드에는 2'-MOE 변형이 있다. 각각의 갭머 전반에 걸친 뉴클레오시드간 연결은 포스포로티오에이트 (P=S) 연결이다. 각각의 갭머 전반에 걸친 모든 사이티딘 잔기는 5-메틸사이티딘이다. "인간 표적 개시 부위"는 인간 서열 내의, 갭머가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. "인간 표적 정지 부위"는 인간 서열 내의, 갭머가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다. 표 46에 열거된 각각의 갭머는 서열 1 (진뱅크 접속 번호 NM_000128.3)을 표적으로 한다. 또한 표 46의 각각의 갭머는 본원에서 서열 274로 명시된 붉은털 원숭이 인자 11 유전자 서열 (엑손 1-15 진뱅크 접속 번호 NW_001118167.1)과 충분히 교차-반응성이다. '붉은털 원숭이 개시 부위'는 붉은털 원숭이 서열 내의, 갭머가 표적으로 하는 가장 5'의 뉴클레오티드를 가리킨다. '붉은털 원숭이 정지 부위'는 붉은털 원숭이 서열 내의, 갭머가 표적으로 하는 가장 3'의 뉴클레오티드를 가리킨다.
Figure 112017082589307-pat00071
용량-응답 억제 데이터가 표 47에 제공된다. 표 47에 설명된 바와 같이, 인자 11 mRNA 수준이 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리된 세포에서 용량-의존적 방식으로 감소되었다. 각각의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 IC50이 또한 계산되었고, 표 47에서 제시된다. 표 47의 처음 2개의 갭머는 이로부터 나머지 갭머들이 마이크로워크를 통해 디자인된 원본 갭머 (ISIS 416850 및 ISIS 416858)이고, 별표로 명시된다.
Figure 112017082589307-pat00072
실시예 33: CD1 마우스에서의 인간 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 허용성
CD1 마우스를 인간 인자 11을 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하고, 다양한 대사 마커의 수준에서의 변화에 대해 평가하였다.
처리
각각 CD1 마우스 5마리의 군들에 50 ㎎/㎏의 ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002, 또는 ISIS 417003을 2주, 4주 또는 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 마우스 5마리의 대조군에 PBS를 2주 동안 피하 주사하였다. 모든 실험군 (즉, 2주, 4주, 6주의 ASO-처리 마우스)을 대조군 (즉, PBS, 2주)과 비교하였다.
모든 군에 마지막 용량을 투여하고 나서 3일 후, 마우스들을 희생시켰다. 장기 중량을 측정하고, 추가적인 분석을 위해 혈액을 수집하였다.
장기 중량
간, 지라 및 신장 중량을 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중에 대해 표준화하여 PBS 대조군의 백분율로서 표 48, 49, 및 50에서 제시한다. PBS 대조군에 비해 간 및 지라 중량에서 6배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00073
Figure 112017082589307-pat00074
Figure 112017082589307-pat00075
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 트랜스아미나제의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)의 측정치는 IU/L로 표현되고, 결과가 표 51 및 52에서 제시된다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 동일한 임상 화학 분석기를 사용하여 또한 측정하였고, 이는 ㎎/㎗로 표현된다. 결과가 표 53 및 54에서 제시된다. 대조군 수준의 7배를 초과하는 ALT/AST 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 대조군 수준의 2배를 초과하여 빌리루빈 수준을 증가시키지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00076
Figure 112017082589307-pat00077
Figure 112017082589307-pat00078
Figure 112017082589307-pat00079
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 요소 질소 (BUN) 및 크레아티닌의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 55 및 56에서 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 BUN 수준에서 2배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00080
Figure 112017082589307-pat00081
혈액학 검정
모든 마우스 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적률 (HCT), 평균 적혈구 용적 (MCV), 평균 적혈구 헤모글로빈 (MCH), 및 평균 적혈구 헤모글로빈 농도 (MCHC) 측정 및 분석, 뿐만 아니라 다양한 혈액 세포, 예컨대 WBC (중성구, 림프구, 및 단핵구), RBC 및 혈소판, 및 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 <Antech Diagnostics>로 보냈다. 결과가 표 57-67에서 제시된다. 표에서 제공된 백분율은 전체 혈액 세포 수의 백분율을 가리킨다. 50％를 초과하는 혈소판 수에서의 감소 및/또는 3배를 초과하는 단핵구 수에서의 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00082
Figure 112017082589307-pat00083
Figure 112017082589307-pat00084
Figure 112017082589307-pat00085
Figure 112017082589307-pat00086
Figure 112017082589307-pat00087
Figure 112017082589307-pat00088
Figure 112017082589307-pat00089
Figure 112017082589307-pat00090
Figure 112017082589307-pat00091
Figure 112017082589307-pat00092
실시예 34: CD1 마우스 간에서의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 반감기의 측정
CD1 마우스를 인간 인자 11을 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하고, 올리고뉴클레오티드 반감기, 뿐만 아니라 간으로부터의 올리고뉴클레오티드 분해 및 제거에 대한 경과 시간을 평가하였다.
처리
각각 CD1 마우스 15마리의 군들에 50 ㎎/㎏의 ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002, 또는 ISIS 417003을 2주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 각각의 군으로부터의 마우스 5마리를 최종 용량 3일 후, 28일 후 및 56일 후에 희생시켰다. 분석을 위해 간을 수확하였다.
올리고뉴클레오티드 농도의 측정
전장 올리고뉴클레오티드의 농도, 뿐만 아니라 전체 올리고뉴클레오티드 농도 (분해된 형태 포함)를 측정하였다. 사용된 방법은 페놀-클로로포름 (액체-액체) 추출에 이은 고체 상 추출로 구성되는 기존에 공개된 방법 ([Leeds et al., 1996]; [Geary et al., 1999])의 변형이었다. 내부 표준물 (ISIS 355868, 27량체 2'-O-메톡시에틸 변형 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드,
Figure 112017082589307-pat00093
, 본원에 서열 270으로 명시됨)을 추출 전에 첨가하였다. 조직 샘플 농도를 검정 곡선을 사용하여 계산하였고, 이때 정량 하한 (LLOQ)은 약 1.14 ㎍/g이었다. 그후, 윈논린(WinNonlin) 소프트웨어 (PHARSIGHT)를 사용하여 반감기를 계산하였다.
결과가 간 조직 1 g 당 ㎍으로 표현되어 표 68 및 69에서 제시된다. 각각의 올리고뉴클레오티드의 반감기가 표 70에서 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00094
Figure 112017082589307-pat00095
Figure 112017082589307-pat00096
실시예 35: 스프라그 -돌리(Sprague- Dawley ) 래트에서의 인간 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 허용성
스프라그-돌리 래트를 인간 인자 11을 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하고, 다양한 대사 마커의 수준에서의 변화에 대해 평가하였다.
처리
각각 스프라그 돌리 래트 4마리의 군들에 50 ㎎/㎏의 ISIS 416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416848, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002, 또는 ISIS 417003을 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 스프라그 돌리 래트 4마리의 대조군에 PBS를 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 처리 기간 전에, 그리고 처리 기간 전반에 걸쳐 체중을 측정하였다. 처리 시작 전에 소변 샘플을 취하였다. 마지막 용량 3일 후, 소변 샘플을 취하고, 래트들을 희생시켰다. 장기 중량을 측정하고, 추가적인 분석을 위해 혈액을 수집하였다.
체중 및 장기 중량
래트의 체중을 연구 착수 시, 그리고 이어서 1주일에 2회 측정하였다. 체중이 표 71에 제시되고, 이는 연구 시작 시에 취해진 체중에 대한 백분율 변화로서 표현된다. 간, 지라 및 신장 중량을 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중에 대해 표준화하여 염수 대조군의 백분율로서 표 71에서 제시한다. PBS 대조군에 비해 간 및 지라 중량에서 6배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00097
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 트랜스아미나제의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)의 측정치는 IU/L로 표현되고, 결과가 표 72에서 제시된다. 대조군 수준의 7배를 초과하여 ALT/AST 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 동일한 임상 화학 분석기를 사용하여 또한 측정하였고, 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 72에서 제시된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리에 의해 대조군 수준의 2배를 초과하여 빌리루빈 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00098
신장 기능
신장 기능에 대한 효과를 평가하기 위해, 혈액 요소 질소 (BUN) 및 크레아티닌의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 73에서 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 BUN 수준에서 2배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 전 및 후에 전체 소변 샘플 내의 소변 단백질 대 크레아티닌 비율을 또한 계산하였고, 이는 표 74에 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 소변 단백질/크레아티닌 비율에서 5배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00099
Figure 112017082589307-pat00100
혈액학 검정
모든 래트 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적률 (HCT), 평균 적혈구 용적 (MCV), 평균 적혈구 헤모글로빈 (MCH), 및 평균 적혈구 헤모글로빈 농도 (MCHC) 측정 및 분석, 뿐만 아니라 다양한 혈액 세포, 예컨대 WBC (중성구, 림프구, 및 단핵구), RBC 및 혈소판, 뿐만 아니라 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 <Antech Diagnostics>로 보냈다. 결과가 표 75 및 76에서 제시된다. 50％를 초과하는 혈소판 수에서의 감소 및 3배를 초과하는 단핵구 수에서의 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00101
Figure 112017082589307-pat00102
실시예 36: 스프라그 -돌리 래트 간 및 신장에서의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 반감기의 측정
스프라그 돌리 래트를 인간 인자 11을 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하고, 올리고뉴클레오티드 반감기, 뿐만 아니라 간 및 신장으로부터의 올리고뉴클레오티드 분해 및 제거에 대한 경과 시간을 평가하였다.
처리
각각 스프라그 돌리 래트 4마리의 군들에 20 ㎎/㎏의 ISIS416825, ISIS 416826, ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, ISIS 416892, ISIS 416925, ISIS 416999, ISIS 417002, 또는 ISIS 417003을 2주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 마지막 용량 3일 후, 래트들을 희생시키고, 분석을 위해 간 및 신장을 수확하였다.
올리고뉴클레오티드 농도의 측정
전장 올리고뉴클레오티드의 농도, 뿐만 아니라 전체 올리고뉴클레오티드 농도 (분해된 형태 포함)를 측정하였다. 사용된 방법은 페놀-클로로포름 (액체-액체) 추출에 이은 고체 상 추출로 구성되는 기존에 공개된 방법 ([Leeds et al., 1996]; [Geary et al., 1999])의 변형이었다. 내부 표준물 (ISIS 355868, 27량체 2'-O-메톡시에틸 변형 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드,
Figure 112017082589307-pat00103
, 본원에 서열 270으로 명시됨)을 추출 전에 첨가하였다. 조직 샘플 농도를 검정 곡선을 사용하여 계산하였고, 이때 정량 하한 (LLOQ)은 약 1.14 ㎍/g이었다. 결과가 간 또는 신장 조직 1 g 당 ㎍으로 표현되어 표 77 및 78에서 제시된다. 그후, 윈논린 소프트웨어 (PHARSIGHT)를 사용하여 반감기를 계산하였다.
Figure 112017082589307-pat00104
Figure 112017082589307-pat00105
Figure 112017082589307-pat00106
실시예 37: CD1 마우스에서의 인간 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 허용성
CD1 마우스를 인간 인자 11을 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하고, 다양한 대사 마커의 수준에서의 변화에 대해 평가하였다.
처리
각각 CD1 마우스 5마리의 군들에 50 ㎎/㎏의 ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416849, ISIS 416850, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416853, ISIS 416854, ISIS 416855, ISIS 416856, ISIS 416857, ISIS 416858, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416862, ISIS 416863, ISIS 416864, ISIS 416865, ISIS 416866, 또는 ISIS 416867을 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. CD1 마우스 10마리의 대조군에 PBS를 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 처리 기간 전에, 그리고 처리 기간 전반에 걸쳐 체중을 측정하였다. 마지막 용량 3일 후, 마우스들을 희생시키고, 장기 중량을 측정하고, 추가적인 분석을 위해 혈액을 수집하였다.
체중 및 장기 중량
체중을 연구 착수 시, 그리고 이어서 1주일에 2회 측정하였다. 마우스들의 체중이 표 80에 제시되고, 이는 연구 시작 시에 취해진 PBS 대조군 체중에 대한 증가 (g)로서 표현된다. 간, 지라 및 신장 중량을 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중의 백분율로서 표 80에서 또한 제시한다. PBS 대조군에 비해 간 및 지라 중량에서 6배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00107
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 트랜스아미나제의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)의 측정치는 IU/L로 표현되고, 결과가 표 81에서 제시된다. 대조군 수준의 7배를 초과하여 ALT/AST 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 빌리루빈, 콜레스테롤 및 알부민의 혈장 수준을 동일한 임상 화학 분석기를 사용하여 또한 측정하였고, 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 81에서 제시된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리에 의해 대조군 수준의 2배를 초과하여 빌리루빈 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00108
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 요소 질소 (BUN)의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기를 사용하여 측정하였고, 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 82에서 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 BUN 수준에서 2배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00109
혈액학 검정
모든 마우스 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적률 (HCT) 측정, 뿐만 아니라 다양한 혈액 세포, 예컨대 WBC (중성구, 림프구, 및 단핵구), RBC 및 혈소판의 측정, 뿐만 아니라 전체 헤모글로빈 함량 분석을 위해 <Antech Diagnostics>로 보냈다. 결과가 표 83 및 84에서 제시된다. 50％를 초과하는 혈소판 수에서의 감소 및 3배를 초과하는 단핵구 수에서의 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00110
Figure 112017082589307-pat00111
실시예 38: CD1 마우스 간에서의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 반감기의 측정
CD1 마우스에서 평가된 15개의 안티센스 올리고뉴클레오티드 (실시예 37)를 추가로 평가하였다. CD1 마우스를 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하고, 올리고뉴클레오티드 반감기, 뿐만 아니라 간으로부터의 올리고뉴클레오티드 분해 및 제거에 대한 경과 시간을 평가하였다.
처리
각각 CD1 마우스 15마리의 군들에 50 ㎎/㎏의 ISIS 412223, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866, ISIS 416867, ISIS 412224, ISIS 416848 또는 ISIS 416859를 2주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 각각의 군으로부터의 마우스 5마리를 마지막 용량 3일 후, 28일 후 및 56일 후에 희생시키고, 분석을 위해 간을 수확하였다.
올리고뉴클레오티드 농도의 측정
전장 올리고뉴클레오티드의 농도를 측정하였다. 사용된 방법은 페놀-클로로포름 (액체-액체) 추출에 이은 고체 상 추출로 구성되는 기존에 공개된 방법 ([Leeds et al., 1996]; [Geary et al., 1999])의 변형이었다. 내부 표준물 (ISIS 355868, 27량체 2'-O-메톡시에틸 변형 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드,
Figure 112017082589307-pat00112
, 본원에 서열 270으로 명시됨)을 추출 전에 첨가하였다. 조직 샘플 농도를 검정 곡선을 사용하여 계산하였고, 이때 정량 하한 (LLOQ)은 약 1.14 ㎍/g이었다. 결과가 간 조직 1 g 당 ㎍으로 표현되어 표 85에서 제시된다. 각각의 올리고뉴클레오티드의 반감기가 표 85에서 또한 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00113
실시예 39: 스프라그 -돌리 래트에서의 인간 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 허용성
CD1 마우스에서 평가된 15개의 안티센스 올리고뉴클레오티드 (실시예 37)를 다양한 대사 마커의 수준에서의 변화에 대해 스프라그-돌리 래트에서 추가로 평가하였다.
처리
각각 4마리의 스프라그 돌리 래트의 군들에 50 ㎎/㎏의 ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866, 또는 ISIS 416867을 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 스프라그 돌리 래트 4마리의 대조군에 PBS를 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 처리 기간 전에, 그리고 처리 기간 전반에 걸쳐 체중을 측정하였다. 마지막 용량 3일 후, 소변 샘플을 취하고, 래트들을 희생시키고, 장기 중량을 측정하고, 추가적인 분석을 위해 혈액을 수집하였다.
체중 및 장기 중량
래트의 체중을 연구 착수 시, 그리고 이어서 1주일에 2회 측정하였다. 체중이 표 86에 제시되고, 이는 연구 시작 시에 취해진 PBS 대조군 체중에 대한 증가 (g)로서 표현된다. 간, 지라 및 신장 중량을 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중의 백분율로서 표 86에서 또한 제시한다. PBS 대조군에 비해 간 및 지라 중량에서 6배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00114
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 트랜스아미나제의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)의 측정치는 IU/L로 표현되고, 결과가 표 87에서 제시된다. 대조군 수준의 7배를 초과하여 ALT/AST 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 동일한 임상 화학 분석기를 사용하여 또한 측정하였고, 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 87에서 제시된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리에 의해 대조군 수준의 2배를 초과하여 빌리루빈 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00115
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 요소 질소 (BUN) 및 크레아티닌의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 88에서 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 BUN 수준에서 2배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후의 전체 소변 샘플 내의 전체 소변 단백질 및 소변 단백질 대 크레아티닌 비율을 계산하였고, 이 또한 표 88에 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 소변 단백질/크레아티닌 비율에서 5배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00116
혈액학 검정
모든 래트 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적률 (HCT) 측정, 뿐만 아니라 다양한 혈액 세포, 예컨대 WBC (중성구 및 림프구), RBC 및 혈소판, 및 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 <Antech Diagnostics>로 보냈다. 결과가 표 89 및 90에서 제시된다. 50％를 초과하는 혈소판 수에서의 감소 및 3배를 초과하는 단핵구 수에서의 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00117
Figure 112017082589307-pat00118
실시예 40: 스프라그 -돌리 래트의 간 및 신장에서의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 반감기의 측정
스프라그 돌리 래트를 인간 인자 11을 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드로 처리하고, 올리고뉴클레오티드 반감기, 뿐만 아니라 간 및 신장으로부터의 올리고뉴클레오티드 분해 및 제거에 대한 경과 시간을 평가하였다.
처리
각각 4마리의 스프라그 돌리 래트의 군들에 20 ㎎/㎏의 ISIS 412223, ISIS 412224, ISIS 412225, ISIS 413481, ISIS 413482, ISIS 416848, ISIS 416851, ISIS 416852, ISIS 416856, ISIS 416859, ISIS 416860, ISIS 416861, ISIS 416863, ISIS 416866, 또는 ISIS 416867을 2주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 마지막 용량 3일 후, 래트들을 희생시키고, 간 및 신장을 수확하였다.
올리고뉴클레오티드 농도의 측정
전장 올리고뉴클레오티드의 농도, 뿐만 아니라 전체 올리고뉴클레오티드 농도 (분해된 형태 포함)를 측정하였다. 사용된 방법은 페놀-클로로포름 (액체-액체) 추출에 이은 고체 상 추출로 구성되는 기존에 공개된 방법 ([Leeds et al., 1996]; [Geary et al., 1999])의 변형이었다. 내부 표준물 (ISIS 355868, 27량체 2'-O-메톡시에틸 변형 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드,
Figure 112017082589307-pat00119
, 본원에 서열 270으로 명시됨)을 추출 전에 첨가하였다. 조직 샘플 농도를 검정 곡선을 사용하여 계산하였고, 이때 정량 하한 (LLOQ)은 약 1.14 ㎍/g이었다. 결과가 간 또는 신장 조직 1 g 당 ㎍으로 표현되어 표 91 및 92에서 제시된다. 그후, 윈논린 소프트웨어 (PHARSIGHT)를 사용하여 반감기를 계산하였다.
Figure 112017082589307-pat00120
Figure 112017082589307-pat00121
Figure 112017082589307-pat00122
실시예 41: CD1 마우스에서의 인간 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 허용성
인간 인자 11을 표적으로 하는 6-8-6 MOE 및 5-8-5 MOE 모티프가 있는 ISIS 올리고뉴클레오티드를 CD1 마우스에 투여하고, 다양한 대사 마커 수준에서의 변화에 대해 평가하였다.
처리
각각 CD1 마우스 5마리의 군들에 50 ㎎/㎏의 ISIS 416850, ISIS 445498, ISIS 445503, ISIS 445504, ISIS 445505, ISIS 445509, ISIS 445513, ISIS 445522, ISIS 445530, ISIS 445531, 또는 ISIS 445532를 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. CD1 마우스 5마리의 대조군에 PBS를 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 처리 기간 전 및 처리 기간 말기에 체중을 측정하였다. 마지막 용량 3일 후, 마우스들을 희생시키고, 장기 중량을 측정하고, 추가적인 분석을 위해 혈액을 수집하였다.
체중 및 장기 중량
마우스들의 체중 변화가 표 94에 제시되고, 이는 연구 시작 시에 취해진 PBS 대조군 체중에 대한 증가 (g)로서 표현된다. 간, 지라 및 신장 중량을 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중의 백분율로서 표 94에서 또한 제시한다. PBS 대조군에 비해 간 및 지라 중량에서 6배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00123
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 트랜스아미나제의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)의 측정치는 IU/L로 표현되고, 결과가 표 95에서 제시된다. 대조군 수준의 7배를 초과하여 ALT/AST 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 또한 측정하였고, 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 95에서 또한 제시된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리에 의해 대조군 수준의 2배를 초과하여 빌리루빈 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00124
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 요소 질소 (BUN)의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 96에서 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 BUN 수준에서 2배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00125
혈액학 검정
모든 마우스 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적률 (HCT) 측정, 뿐만 아니라 다양한 혈액 세포, 예컨대 WBC (중성구 및 림프구), RBC 및 혈소판, 및 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 <Antech Diagnostics>로 보냈다. 결과가 표 97 및 98에서 제시된다. 50％를 초과하는 혈소판 수에서의 감소 및 3배를 초과하는 단핵구 수에서의 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00126
Figure 112017082589307-pat00127
실시예 42: 스프라그 -돌리 래트에서의 인간 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 허용성
CD1 마우스에서 평가된 8개의 안티센스 올리고뉴클레오티드 (실시예 41)를 다양한 대사 마커의 수준에서의 변화에 대해 스프라그-돌리 래트에서 추가로 평가하였다.
처리
각각 4마리의 스프라그 돌리 래트의 군들에 50 ㎎/㎏의 ISIS 445498, ISIS 445504, ISIS 445505, ISIS 445509, ISIS 445513, ISIS 445522, ISIS 445530, 또는 ISIS 445531을 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 스프라그 돌리 래트의 대조군에 PBS를 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 처리 기간 전에, 그리고 처리 기간 전반에 걸쳐 체중을 측정하였다. 마지막 용량 3일 후, 소변 샘플을 수집하고, 래트들을 희생시키고, 장기 중량을 측정하고, 추가적인 분석을 위해 혈액을 수집하였다.
체중 및 장기 중량
래트의 체중을 연구 착수 시, 그리고 이어서 1주일에 2회 측정하였다. 체중이 표 99에 제시되고, 이는 연구 시작 시에 취해진 PBS 대조군에 대한 백분율 증가로서 표현된다. 간, 지라 및 신장 중량을 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중의 백분율로서 표 99에서 또한 제시한다. PBS 대조군에 비해 간 및 지라 중량에서 6배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00128
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 트랜스아미나제의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. ALT (알라닌 트랜스아미나제) 및 AST (아스파르테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였고, 결과가 IU/L로 표현되어 표 100에서 제시된다. 대조군 수준의 7배를 초과하여 ALT/AST 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 동일한 임상 화학 분석기를 또한 측정하였고, 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 100에서 제시된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리에 의해 대조군 수준의 2배를 초과하여 빌리루빈 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00129
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 요소 질소 (BUN) 및 크레아티닌의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 101에서 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 BUN 수준에서 2배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후의 전체 소변 샘플 내의 전체 소변 단백질 및 소변 단백질 대 크레아티닌 비율을 계산하였고, 이 또한 표 101에 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 소변 단백질/크레아티닌 비율에서 5배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00130
혈액학 검정
모든 래트 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적률 (HCT) 측정, 뿐만 아니라 다양한 혈액 세포, 예컨대 WBC (중성구, 림프구, 및 단핵구), RBC 및 혈소판, 및 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 <Antech Diagnostics>로 보냈다. 결과가 표 102 및 103에서 제시된다. 50％를 초과하는 혈소판 수에서의 감소 및 3배를 초과하는 단핵구 수에서의 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00131
Figure 112017082589307-pat00132
실시예 43: CD1 마우스에서의 인간 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 허용성
인간 인자 11을 표적으로 하는 4-8-4 MOE, 3-8-3 MOE, 2-10-2 MOE, 3-10-3 MOE, 및 4-10-4 MOE 모티프가 있는 ISIS 올리고뉴클레오티드를 CD1 마우스에 투여하고, 다양한 대사 마커 수준에서의 변화에 대해 평가하였다.
처리
각각 CD1 마우스 5마리의 군들에 50 ㎎/㎏의 ISIS 449707, ISIS 449708, ISIS 449409, ISIS 449710, 또는 ISIS 449711을 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. CD1 마우스 5마리의 대조군에 PBS를 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 처리 기간 전 및 처리 기간 말기에 체중을 측정하였다. 마지막 용량 3일 후, 마우스들을 희생시키고, 장기 중량을 측정하고, 추가적인 분석을 위해 혈액을 수집하였다.
체중 및 장기 중량
연구 말기에 취해진 마우스들의 체중이 표 104에 제시되고, 이는 g 단위로 표현된다. 간, 지라 및 신장 중량을 연구 말기에 또한 측정하였고, 이는 체중의 백분율로서 표 104에서 또한 제시된다. PBS 대조군에 비해 간 및 지라 중량에서 6배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00133
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 트랜스아미나제의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. ALT (알라닌 트랜스아미나제) 및 AST (아스파르테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였고, 결과가 IU/L로 표현되어 표 105에서 제시된다. 대조군 수준의 7배를 초과하여 ALT/AST 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 동일한 임상 화학 분석기를 또한 측정하였고, 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 105에서 제시된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리에 의해 대조군 수준의 2배를 초과하여 빌리루빈 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00134
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 혈액 요소 질소 (BUN) 및 크레아티닌의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 106에서 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 BUN 수준에서 2배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00135
혈액학 검정
모든 마우스 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적률 (HCT) 측정, 뿐만 아니라 다양한 혈액 세포, 예컨대 WBC (중성구, 림프구, 및 단핵구), RBC 및 혈소판, 및 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 <Antech Diagnostics>로 보냈다. 결과가 표 107 및 108에서 제시된다. 50％를 초과하는 혈소판 수에서의 감소 및 3배를 초과하는 단핵구 수에서의 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00136
Figure 112017082589307-pat00137
실시예 44: 스프라그 -돌리 래트에서의 인간 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 허용성
CD1 마우스에서 평가된 5개의 안티센스 올리고뉴클레오티드 (실시예 43)를 다양한 대사 마커의 수준에서의 변화에 대해 스프라그-돌리 래트에서 추가로 평가하였다.
처리
각각 4마리의 스프라그 돌리 래트의 군들에 50 ㎎/㎏의 ISIS 449707, ISIS 449708, ISIS 449709, ISIS 449710, 또는 ISIS 449711을 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 스프라그 돌리 래트 4마리의 대조군에 PBS를 6주 동안 1주일에 2회 피하 주사하였다. 처리 기간 전에, 그리고 처리 기간 전반에 걸쳐 체중을 측정하였다. 마지막 용량 3일 후, 소변 샘플을 수집하고, 래트들을 희생시키고, 장기 중량을 측정하고, 추가적인 분석을 위해 혈액을 수집하였다.
체중 및 장기 중량
래트의 체중을 연구 착수 시와 연구 말기에 측정하였다. 체중 변화가 표 109에 제시되고, 이는 연구 시작 전에 취해진 PBS 대조군 체중에 대한 증가 (g)로서 표현된다. 간, 지라 및 신장 중량을 연구 말기에 측정하였고, 이를 체중의 백분율로서 표 109에서 또한 제시한다. PBS 대조군에 비해 간 및 지라 중량에서 6배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00138
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, ALT 및 AST의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. ALT (알라닌 트랜스아미나제) 및 AST (아스파르테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였고, 결과가 IU/L로 표현되어 표 110에서 제시된다. 대조군 수준의 7배를 초과하여 ALT/AST 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 빌리루빈 및 알부민의 혈장 수준을 또한 측정하였고, 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 110에서 제시된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리에 의해 대조군 수준의 2배를 초과하여 빌리루빈 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00139
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, BUN 및 크레아티닌의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 111에서 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 BUN 수준에서 2배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후의 전체 소변 샘플 내의 전체 소변 단백질 및 소변 단백질 대 크레아티닌 비율을 계산하였고, 이 또한 표 111에 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 소변 단백질/크레아티닌 비율에서 5배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00140
혈액학 검정
모든 래트 군으로부터 수득된 혈액을 적혈구용적률 (HCT) 측정, 뿐만 아니라 다양한 혈액 세포, 예컨대 WBC (중성구, 림프구, 및 단핵구), RBC 및 혈소판, 및 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 <Antech Diagnostics>로 보냈다. 결과가 표 112 및 113에서 제시된다. 50％를 초과하는 혈소판 수에서의 감소 및 3배를 초과하는 단핵구 수에서의 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00141
Figure 112017082589307-pat00142
실시예 45: 사이노몰거스 ( cynomolgus ) 원숭이에서의 인간 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 용량-의존적 약리학적 효과
여러 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 사이노몰거스 원숭이에서 테스트하여, 인자 11 활성, 항응고 및 출혈 시간, 간 및 신장 분포, 및 허용성에 대한 올리고뉴클레오티드들의 약리학적 효과를 결정하였다. 이러한 연구에서 사용된 모든 ISIS 올리고뉴클레오티드는 인간 인자 11 mRNA를 표적으로 하고, 또한 붉은털 원숭이 유전자 서열과 충분히 교차-반응성이다 (표 44 참조). 붉은털 원숭이 ISIS 올리고뉴클레오티드가 사이노몰거스 원숭이 유전자 서열과 또한 충분히 교차-반응성인 것으로 예상된다. 연구가 착수된 시점에, 사이노몰거스 원숭이 게놈 서열이 <National Center for Biotechnology Information> (NCBI) 데이터베이스에서 입수가능하지 않았다; 따라서, 사이노몰거스 원숭이 유전자 서열과의 교차-반응성이 확증될 수 없었다.
처리
각각 2마리의 수컷 및 3마리의 암컷 원숭이로 구성되는 군들에 ISIS 416838, ISIS 416850, ISIS 416858, ISIS 416864, 또는 ISIS 417002를 단계적으로 상승되는 용량으로 피하 주사하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제1주에는 5 ㎎/㎏으로 1주일에 3회; 제2주 및 제3주에는 5 ㎎/㎏으로 1주일에 2회; 제4주에는 10 ㎎/㎏으로 1주일에 3회; 제5주 및 제6주에는 10 ㎎/㎏으로 1주일에 2회; 제7주에는 25 ㎎/㎏으로 1주일에 3회; 제8주, 제9주, 제10주, 제11주 및 제12주에는 25 ㎎/㎏으로 1주일에 2회 원숭이에게 투여하였다. 2마리의 수컷 및 3마리의 암컷 원숭이로 구성되는 1개의 대조군에는 동일한 투약 계획에 따라 PBS를 피하 주사하였다. 2마리의 수컷 및 3마리의 암컷 원숭이로 구성되는 추가적인 실험군에게 더 낮은 용량의 장기 요법으로 ISIS 416850을 피하 주사하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제1주에는 5 ㎎/㎏으로 1주일에 3회; 제2주 및 제3주에는 5 ㎎/㎏으로 1주일에 2회; 제4주에는 10 ㎎/㎏으로 1주일에 3회; 제5주 내지 제12주에는 10 ㎎/㎏으로 1주일에 2회 원숭이에게 투여하였다. 매주 체중을 측정하였다. 혈장 내의 인자 11 단백질 활성 분석, 피브리노겐 측정, PT 및 aPTT 측정, 출혈 시간, 및 다양한 혈액학 인자의 측정을 위해, 혈액 샘플을 처리 시작 14일 전 및 5일 전에 수집하였고, 이어서 1주일에 1회 수집하였다. 제85일에, 깊은 마취 하에 원숭이를 방혈에 의해 안락사시키고, 추가적인 분석을 위해 장기들을 수확하였다.
RNA 분석
제85일에, 프라이머 프로브 세트 LTS00301 (본원에 서열 271로 명시된 전방향 프라이머 서열
Figure 112017082589307-pat00143
; 본원에 서열 272로 명시된 역방향 프라이머 서열
Figure 112017082589307-pat00144
; 및 본원에 서열 273으로 명시된 프로브 서열
Figure 112017082589307-pat00145
)을 사용하는 인자 11의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과는 PBS 대조군에 비교된 인자 11의 백분율 억제로서 제시된다. 표 114에 나타난 바와 같이, ISIS 올리고뉴클레오티드로의 처리는 PBS 대조군과 비교하여 인자 11 mRNA의 유의한 감소를 초래하였다.
Figure 112017082589307-pat00146
단백질 분석
상이한 날짜에 취해진 모든 원숭이 군으로부터의 혈장 샘플들을 친화력-정제 폴리클로날 항-인자 11 항체를 포획 항체로, 과산화효소-접합 폴리클로날 항-인자 11 항체를 검출 항체로 사용하여 샌드위치-스타일 ELISA 검정 (Affinity Biologicals Inc.)에 의해 분석하였다. 검정을 위해 원숭이 혈장을 1:50 희석하였다. 기질인 o-페닐렌디아민과의 인큐베이션에 의해 과산화효소 활성이 발현되었다. 발색을 490 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 정량하였고, 이는 샘플 내의 인자 11의 농도에 비례하는 것으로 간주되었다.
결과가 PBS 대조군과 비교하여 백분율 감소로서 표현되어 표 115에서 제시된다. ISIS 416850 및 ISIS 416858로의 처리는 단백질 수준의 시간-의존적 감소를 초래하였다.
Figure 112017082589307-pat00147
PT 및 aPTT 검정
시트르산나트륨을 함유하는 튜브 내에 혈액 샘플을 수집하였다. PT 및 aPTT를 ACL 9000 응고 설비 (Instrumentation Laboratory (Italy))로 이중으로 결정하였다. 정상 백분율로 결과 보고를 제공하도록 테스트된, 단계적으로 희석된 시트레이트 첨가 대조군 원숭이 혈장의 표준 곡선 상에 결과를 내삽하였다.
프로트롬빈 시간 (PT) 및 활성화 부분 트롬보플라스틴 시간 (aPTT)을 ISIS 올리고뉴클레오티드들로 처리된 원숭이로부터의 혈소판 결핍 혈장 (PPP)을 사용하여 측정하였다. PT 및 aPTT 값이 표 116 및 117에서 제공되고, 국제 표준화 비율 (INR) 값으로서 보고된다. 각각의 실험군에 대한 PT 또는 aPTT 값을 PBS 처리군에 대한 PT 또는 aPTT로 나눔으로써 PT 또는 aPTT에 대한 INR 값을 결정하였다. 그후, 이러한 비율을 사용된 조직 인자의 국제 민감도 지수 (ISI)로 제곱하였다. 장기 용량 요법으로 제공된 ISIS 올리고뉴클레오티드인 ISIS 416850은 별표 (*)로 다른 올리고뉴클레오티드들과 구별된다.
표 116에 나타난 바와 같이, PT가 상승 용량 요법 또는 장기 용량 요법으로 ISIS 올리고뉴클레오티드들로 처리된 원숭이에서 유의하게 연장되지 않았다. 그러나, 표 117에 제시된 바와 같이, aPTT는 용량-의존적 방식으로 연장되었다. 이러한 데이터는 인자 11의 안티센스 감소가 혈액 응고의 접촉 활성화 경로에 영향을 미치지만, 외인성 경로에는 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다. 따라서, 인자 11의 안티센스 감소는 비정상적인 혈관 벽에 응답하여 혈전 또는 혈병 형성을 억제하는데 유용하지만, 조직 손상에 응답하여서는 그렇지 않다.
Figure 112017082589307-pat00148
Figure 112017082589307-pat00149
단백질 활성 분석
혈액 샘플을 다양한 시점에 수집하고, 인자 11 효소전구체를 응고 시간을 기초로 하는 F11 검정을 사용하여 측정하였다. 응고 시간을 ST4 반자동 응고 설비 (Diagnostica Stago (NJ))로 이중으로 결정하였다. BSA가 있는 HEPES-NaCl 완충제에 1/20 희석된 시트레이트 첨가 샘플 혈장 30 ㎕를 30 ㎕ aPTT 시약 (자동 aPTT, Organon Technika (NC)) 및 30 ㎕의 인자 11이 결핍된 시트레이트 첨가 혈장 (George King Bio-Medical Inc.)과 함께 37℃에서 5분 동안 인큐베이션한 후, 30 ㎕의 25 mM CaCl2를 첨가하여 응고를 개시시켰다. 결과를 단계적으로 희석된 시트레이트 첨가 대조군 혈장의 표준 곡선 상에 내삽하였다.
결과가 PBS 대조군에 비교된 인자 11 활성의 백분율 억제로서 표 118에서 제시된다. 장기 용량 요법으로 제공된 ISIS 올리고뉴클레오티드인 ISIS 416850은 별표 (*)로 다른 올리고뉴클레오티드들과 구별된다.
Figure 112017082589307-pat00150
피브리노겐 검정
신선한 원숭이 혈장 9부를 시트르산3나트륨 1부 내로 수집하였다. ACL 9000 응고 설비 (Instrumentation Laboratory (Italy))를 사용하여 샘플의 피브리노겐 함량을 평가하였다. 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 119에서 제시된다. 장기 용량 요법으로 제공된 ISIS 올리고뉴클레오티드인 ISIS 416850은 별표 (*)로 다른 올리고뉴클레오티드들과 구별된다.
Figure 112017082589307-pat00151
출혈 검정
처리 기간 동안의 여러 날에, 서지컷 주니어(Surgicutt Jr.) 장치 (ITC (New Jersey))를 사용하여 출혈 검정을 수행하였다. 원숭이들을 원숭이 의자에 앉히고, 이때 이의 팔을 고정된 지지체에 놓았다. 팔을 가볍게 면도하고, 혈압계를 위팔에 놓았다. 혈압계의 커프를 40 mm Hg로 팽창시키고, 시술 전반에 걸쳐 이러한 압력을 유지하였다. 절개될 위팔 영역을 살균 면봉으로 닦아내고, 서지컷 주니어 장치를 사용하여, 전주와 5 ㎝ 밑으로 이에 평행하게 아래팔의 외측 손바닥쪽 표면을 절개하였다. 절개가 이루어진 정확한 시점에, 스톱워치를 시작시켰다. 30초마다, 혈소판 마개의 형성이 교란되지 않도록, 절개부를 직접적으로 건드리지 않으면서 압지를 사용하여 절개로부터의 혈액을 블롯팅(blotting)하였다. 더 이상 혈액이 압지에 묻지 않을 때까지 30초마다 혈액을 블롯팅하였다. 그후, 스톱워치를 정지시키고, 출혈 시간을 결정하였다. 동물의 팔에서 혈압계를 제거하고, 절개 부위를 살균 면봉으로 닦아내고, 상처 봉합 스트립을 적용하였다. 결과가 초 단위로 표현되어 표 X에서 제공된다. 결과가 표 120에서 제공된다. 장기 용량 요법으로 제공된 ISIS 올리고뉴클레오티드인 ISIS 416850은 별표 (*)로 다른 올리고뉴클레오티드들과 구별된다.
이러한 데이터는 본원에서 제공되는 화합물의 출혈 잠재력이 낮다는 것을 시사한다.
Figure 112017082589307-pat00152
혈소판 응집 검정
1 mmol/L ADP 및/또는 3 ㎍ 콜라겐 (표 121에 개요된 바와 같이 수집일에 좌우됨)을 혈장 샘플에 첨가함으로써 혈소판 응집을 개시시키고, 10분 동안 진행시켰다. 전기 저항 또는 임피던스에서의 변화 및 혈소판 형상 변화 후의 응집의 초기 기울기에서의 변화를 기록함으로써 응집을 특성화하였다. 응집 테스트를 각각의 수집일에 샘플 당 2회씩 수행하였고, 평균값을 취하였다. 장기 용량 요법으로 제공된 ISIS 올리고뉴클레오티드인 ISIS 416850은 별표 (*)로 다른 올리고뉴클레오티드들과 구별된다.
Figure 112017082589307-pat00153
체중 및 장기 중량
투약 계획 전반에 걸쳐 체중을 매주 1회 측정하였다. 각각의 군의 측정치가 g 단위로 표현되어 표 122에서 제공된다. 결과는 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리가 PBS 대조군과 비교하여 체중에서의 유의한 변동을 초래할 수 있는 동물 건강에서의 어떠한 불리한 변화도 야기하지 않았음을 가리킨다. 동물을 안락사시키고, 간, 신장 및 지라를 수확하여 칭량한 후, 장기 중량을 취하였다. 결과가 표 123에서 제시되고, 지라 중량에서 증가를 나타낸 ISIS 416858을 제외하고는, PBS 대조군과 비교하여 중량에서 유의한 변동이 없음을 또한 나타낸다. 장기 용량 요법으로 제공된 ISIS 올리고뉴클레오티드인 ISIS 416850은 별표 (*)로 다른 올리고뉴클레오티드들과 구별된다.
Figure 112017082589307-pat00154
Figure 112017082589307-pat00155
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, 트랜스아미나제의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. ALT (알라닌 트랜스아미나제) 및 AST (아스파르테이트 트랜스아미나제)의 혈장 농도를 측정하였고, 결과가 IU/L로 표현되어 표 124 및 125에서 제시된다. 대조군 수준의 7배를 초과하여 ALT/AST 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 빌리루빈의 혈장 수준을 또한 측정하였고, 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 126에서 제시된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리에 의해 대조군 수준의 2배를 초과하여 빌리루빈 수준 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 장기 용량 요법으로 제공된 ISIS 올리고뉴클레오티드인 ISIS 416850은 별표 (*)로 다른 올리고뉴클레오티드들과 구별된다.
Figure 112017082589307-pat00156
Figure 112017082589307-pat00157
Figure 112017082589307-pat00158
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 영향을 평가하기 위해, 소변 샘플을 수집하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후의 소변 단백질 대 크레아티닌 비율이 계산되었고, 표 127에서 제시된다. PBS 대조군과 비교하여 소변 단백질/크레아티닌 비율에서 5배를 초과하는 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다.
Figure 112017082589307-pat00159
올리고뉴클레오티드 농도의 측정
전장 올리고뉴클레오티드의 농도, 뿐만 아니라 간 및 신장으로부터의 올리고뉴클레오티드 분해 및 제거에 대한 경과 시간을 평가하였다. 사용된 방법은 페놀-클로로포름 (액체-액체) 추출에 이은 고체 상 추출로 구성되는 기존에 공개된 방법 ([Leeds et al., 1996]; [Geary et al., 1999])의 변형이었다. 내부 표준물 (ISIS 355868, 27량체 2'-O-메톡시에틸 변형 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드,
Figure 112017082589307-pat00160
, 본원에 서열 270으로 명시됨)을 추출 전에 첨가하였다. 조직 샘플 농도를 검정 곡선을 사용하여 계산하였고, 이때 정량 하한 (LLOQ)은 약 1.14 ㎍/g이었다. 그후, 윈논린 소프트웨어 (PHARSIGHT)를 사용하여 반감기를 계산하였다. 결과가 간 또는 신장 조직 1 g 당 ㎍으로 표현되어 표 128 및 129에서 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00161
Figure 112017082589307-pat00162
혈액학 검정
모든 원숭이 군으로부터 수득된 혈액을 HCT, MCV, MCH 및 MCHC 분석, 뿐만 아니라 다양한 혈액 세포, 예컨대 WBC (중성구, 림프구, 단핵구, 호산구, 호염기구, 망상적혈구), RBC, 혈소판 및 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 <Korea Institute of Toxicology> (KIT)로 보냈다. 결과가 표 130-143에서 제시된다. 50％를 초과하는 혈소판 수에서의 감소 및 3배를 초과하는 단핵구 수에서의 증가에 영향을 미치지 않은 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 추가적인 연구용으로 선택하였다. 장기 용량 요법으로 제공된 ISIS 올리고뉴클레오티드인 ISIS 416850은 별표 (*)로 다른 올리고뉴클레오티드들과 구별된다.
Figure 112017082589307-pat00163
Figure 112017082589307-pat00164
Figure 112017082589307-pat00165
Figure 112017082589307-pat00166
Figure 112017082589307-pat00167
Figure 112017082589307-pat00168
Figure 112017082589307-pat00169
Figure 112017082589307-pat00170
Figure 112017082589307-pat00171
Figure 112017082589307-pat00172
Figure 112017082589307-pat00173
Figure 112017082589307-pat00174
Figure 112017082589307-pat00175
Figure 112017082589307-pat00176
시토카인 및 케모카인 검정
PBS, ISIS 416850 및 ISIS 416858 (상승 용량 계획으로 투여됨)로 처리된 원숭이 군으로부터 수득된 혈액 샘플을 케모카인 및 시토카인 수준의 측정을 위해 <Pierce Biotechnology> (Woburn, MA)로 보냈다. IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α의 수준을 각각의 영장류 항체를 사용하여 측정하였고, IL-8, MIP-1α, MCP-1, MIP-1β 및 RANTES의 수준을 각각의 교차-반응 인간 항체를 사용하여 측정하였다. 처리를 시작하기 14일전 및 원숭이가 안락사된 제85일에 측정하였다. 결과가 표 144 및 145에서 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00177
Figure 112017082589307-pat00178
실시예 46: 사이노몰거스 원숭이에서의 인간 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 약리학적 효과
설치류 허용성 연구 (실시예 41-44)로부터 선택된 여러 안티센스 올리고뉴클레오티드를 사이노몰거스 원숭이에서 테스트하여, 사이노몰거스 원숭이 모델에서의 이의 약리학적 효과, 인자 11 활성에 대한 상대적인 효능 및 허용성을 결정하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드들을 앞서 기술된 원숭이 연구 (실시예 45)로부터 선택된 ISIS 416850 및 ISIS 416858에 또한 비교하였다. 이러한 연구에서 사용된 모든 ISIS 올리고뉴클레오티드는 인간 인자 11 mRNA를 표적으로 하고, 또한 붉은털 원숭이 유전자 서열과 충분히 교차-반응성이다 (표 44 및 46 참조). 붉은털 원숭이 ISIS 올리고뉴클레오티드가 사이노몰거스 원숭이 유전자 서열과 또한 충분히 교차-반응성인 것으로 예상된다. 연구가 착수된 시점에, 사이노몰거스 원숭이 게놈 서열이 <National Center for Biotechnology Information> (NCBI) 데이터베이스에서 입수가능하지 않았다; 따라서, 사이노몰거스 원숭이 유전자 서열과의 교차-반응성이 확증될 수 없었다.
처리
각각 2마리의 수컷 및 2마리의 암컷 원숭이로 구성되는 군들에 25 ㎎/㎏의 ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522, ISIS 449710, ISIS 449707, ISIS 449711, ISIS 449708, 416858, 및 ISIS 445531을 피하 주사하였다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 제1주에는 25 ㎎/㎏으로 1주일에 3회, 제2주 내지 제8주에는 25 ㎎/㎏으로 1주일에 2회 투여하였다. 2마리의 수컷 및 2마리의 암컷 원숭이로 구성되는 대조군에는 동일한 투약 계획에 따라 PBS를 피하 주사하였다. 처리를 시작하기 14일 전 및 7일 전에 체중을 측정한 후, 처리 기간 전반에 걸쳐 매주 체중을 측정하였다. PT 및 aPTT 측정, 및 다양한 혈액학 인자의 측정을 위해, 혈액 샘플을 처리 시작 14일 전 및 5일 전에 수집하였고, 이어서 투약 계획 동안 여러번 수집하였다. 제55일에, 깊은 마취 하에 원숭이를 방혈에 의해 안락사시키고, 추가적인 분석을 위해 장기들을 수확하였다.
RNA 분석
제55일에, 프라이머 프로브 세트 LTS00301을 사용하는 인자 11의 실시간 PCR 분석을 위해 간 조직으로부터 RNA를 추출하였다. 결과는 PBS 대조군에 비교된 인자 11의 백분율 억제로서 제시된다. 표 146에 나타난 바와 같이, ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522, ISIS 449710, ISIS 449707, ISIS 449708, ISIS 416858, 및 ISIS 445531로의 처리는 PBS 대조군과 비교하여 인자 11 mRNA의 유의한 감소를 초래하였다.
Figure 112017082589307-pat00179
단백질 분석
상이한 날짜에 취해진 모든 원숭이 군으로부터의 혈장 샘플들을 친화력-정제 폴리클로날 항-인자 11 항체를 포획 항체로, 과산화효소-접합 폴리클로날 항-인자 11 항체를 검출 항체로 사용하여 샌드위치-스타일 ELISA 검정 (Affinity Biologicals Inc.)에 의해 분석하였다. 검정을 위해 원숭이 혈장을 1:50 희석하였다. 기질인 o-페닐렌디아민과의 인큐베이션에 의해 과산화효소 활성이 발현되었다. 발색을 490 nm에서 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 정량하였고, 이는 샘플 내의 인자 11의 농도에 비례하는 것으로 간주되었다.
결과가 PBS 대조군과 비교하여 백분율 감소로서 표현되어 표 147에서 제시된다. ISIS 416850, ISIS 449709, ISIS 445522, 및 ISIS 416858로의 처리는 단백질 수준의 시간-의존적 감소를 초래하였다.
Figure 112017082589307-pat00180
PT 및 aPTT 검정
PT 및 aPTT를 ISIS 올리고뉴클레오티드들로 처리된 원숭이로부터의 혈소판 결핍 혈장 (PPP)을 사용하여 측정하였다. PT 및 aPTT 값이 표 148 및 149에서 제공되고, 국제 표준화 비율 (INR) 값으로서 보고된다. 각각의 실험군에 대한 PT 또는 aPTT 값을 PBS 처리군에 대한 PT 또는 aPTT로 나눔으로써 PT 또는 aPTT에 대한 INR 값을 결정하였다. 그후, 이러한 비율을 사용된 조직 인자의 국제 민감도 지수 (ISI)로 제곱하였다. 표 148에 나타난 바와 같이, PT가 ISIS 올리고뉴클레오티드들로 처리된 원숭이에서 유의하게 연장되지 않았다. 그러나, 표 149에 제시된 바와 같이, ISIS 416850, ISIS 445522, 및 ISIS 416858로 처리된 군에서 aPTT가 유의하게 연장되었다. 이러한 데이터는 인자 11의 안티센스 감소가 혈액 응고의 접촉 활성화 경로에 영향을 미치지만, 외인성 경로에는 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다. 따라서, 이러한 ISIS 올리고뉴클레오티드들로의 인자 11의 안티센스 감소는 비정상적인 혈관 벽에 응답하여 혈전 또는 혈병 형성을 억제하는데 유용하지만, 조직 손상에 응답하여서는 그렇지 않다.
Figure 112017082589307-pat00181
Figure 112017082589307-pat00182
체중 및 장기 중량
각각의 군의 체중이 g 단위로 표현되어 표 150에서 제공된다. 결과는 안티센스 올리고뉴클레오티드로의 처리가 PBS 대조군과 비교하여 체중에서의 유의한 변동을 초래할 수 있는 동물 건강에서의 어떠한 불리한 변화도 야기하지 않았음을 가리킨다. 제55일에 동물을 안락사시키고 간, 신장 및 지라를 수확한 후, 장기 중량을 측정하였다. 결과가 체중의 백분율로서 표현되어 표 150에서 제시되고, 지라 중량에서 증가를 나타낸 ISIS 449711을 제외하고는, PBS 대조군과 비교하여 중량에서 유의한 변동이 없음을 또한 나타낸다.
Figure 112017082589307-pat00183
Figure 112017082589307-pat00184
간 기능
간 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 효과를 평가하기 위해, ALT 및 AST의 혈장 농도를 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였다. 알라닌 트랜스아미나제 (ALT) 및 아스파르테이트 트랜스아미나제 (AST)의 혈장 농도를 측정하였고, 결과가 IU/L로 표현되어 표 152 및 153에서 제시된다. 빌리루빈의 혈장 수준을 또한 측정하였고, 결과가 ㎎/㎗로 표현되어 표 154에서 제시된다. 표 152-154에서 관찰되는 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후 어떠한 간 대사 마커에서도 유의한 증가가 없었다.
Figure 112017082589307-pat00185
Figure 112017082589307-pat00186
Figure 112017082589307-pat00187
신장 기능
신장 기능에 대한 ISIS 올리고뉴클레오티드의 영향을 평가하기 위해, 소변 샘플을 여러 날짜에 수집하였다. BUN 수준을 여러 시점에 자동 임상 화학 분석기 (Hitachi Olympus AU400e (Melville, NY))를 사용하여 측정하였고, 결과가 표 155에 제시된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후의 소변 샘플 내의 소변 단백질 대 크레아티닌 비율을 제49일에 대해 또한 계산하였고, 결과가 표 156에서 제시된다. 표 155 및 156에서 관찰되는 바와 같이, 안티센스 올리고뉴클레오티드 처리 후 어떠한 신장 대사 마커에서도 유의한 증가가 없었다.
Figure 112017082589307-pat00188
Figure 112017082589307-pat00189
혈액학 검정
모든 원숭이 군으로부터 수득된 혈액을 HCT, MCV, MCH, 및 MCHC 측정, 뿐만 아니라 다양한 혈액 세포, 예컨대 WBC (중성구 및 단핵구), RBC 및 혈소판, 뿐만 아니라 전체 헤모글로빈 함량의 측정을 위해 <Korea Institute of Toxicology> (KIT)로 보냈다. 결과가 표 157-166에서 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00190
Figure 112017082589307-pat00191
Figure 112017082589307-pat00192
Figure 112017082589307-pat00193
Figure 112017082589307-pat00194
Figure 112017082589307-pat00195
Figure 112017082589307-pat00196
Figure 112017082589307-pat00197
Figure 112017082589307-pat00198
Figure 112017082589307-pat00199
시토카인 및 케모카인 검정
모든 원숭이 군으로부터 수득된 혈액 샘플을 케모카인 및 시토카인 수준의 측정을 위해 <Pierce Biotechnology> (Woburn, MA)로 보냈다. IL-1β, IL-6, IFN-γ, 및 TNF-α의 수준을 각각의 영장류 항체를 사용하여 측정하였고, IL-8, MIP-1α, MCP-1, MIP-1β 및 RANTES의 수준을 각각의 교차-반응 인간 항체를 사용하여 측정하였다. 처리를 시작하기 14일전 및 원숭이가 안락사된 제55일에 측정하였다. 결과가 표 167 및 168에서 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00200
Figure 112017082589307-pat00201
실시예 47: 인간 인자 11을 표적으로 하는 ISIS 안티센스 올리고뉴클레오티드의 점도의 측정
165-185 ㎎/㎖의 농도에서 점도가 40cP를 초과하는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 스크리닝하여 제거하려는 목적으로, 인간 인자 11을 표적으로 하는 안티센스 올리고뉴클레오티드의 점도를 측정하였다.
ISIS 올리고뉴클레오티드 (32-35 ㎎)를 유리 바이알 내로 칭량하고, 120 ㎕의 물을 첨가하고, 바이알을 50℃로 가열함으로써 안티센스 올리고뉴클레오티드를 용액으로 용해시켰다. 예비-가열된 샘플의 일부분 (75 ㎕)을 마이크로-점도계 (Cambridge)로 파이펫팅하였다. 마이크로-점도계의 온도를 25℃로 설정하였고, 샘플의 점도를 측정하였다. 예비-가열된 샘플의 또 다른 일부분 (20 ㎕)을 85℃에서 260 nM에서의 UV 판독 (Cary UV 설비)을 위해 10 ㎖의 물 내로 파이펫팅하였다. 결과가 표 169에서 제시된다.
Figure 112017082589307-pat00202
SEQUENCE LISTING <110> Isis Pharmaceuticals, Inc. Freier, Susan M. Monia, Brett P. Zhang, Hong Zhao, Chenguang Crosby, Jeffrey R. Siwkowski, Andrew M. <120> MODULATION OF FACTOR 11 EXPRESSION <130> BIOL0107WO <150> 61/105,772 <151> 2008-10-15 <150> 61/174,461 <151> 2009-04-30 <160> 274 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 3278 <212> DNA <213> H. sapiens <400> 1 aggcacacag gcaaaatcaa gttctacatc tgtccctgtg tatgtcactt gtttgaatac 60 gaaataaaat taaaaaaata aattcagtgt attgagaaag caagcaattc tctcaaggta 120 tatttctgac atactaagat tttaacgact ttcacaaata tgctgtactg agagagaatg 180 ttacataaca ttgagaacta gtacaagtaa atattaaagt gaagtgacca tttcctacac 240 aagctcattc agaggaggat gaagaccatt ttggaggaag aaaagcaccc ttattaagaa 300 ttgcagcaag taagccaaca aggtcttttc aggatgattt tcttatatca agtggtacat 360 ttcattttat ttacttcagt ttctggtgaa tgtgtgactc agttgttgaa ggacacctgc 420 tttgaaggag gggacattac tacggtcttc acaccaagcg ccaagtactg ccaggtagtc 480 tgcacttacc acccaagatg tttactcttc actttcacgg cggaatcacc atctgaggat 540 cccacccgat ggtttacttg tgtcctgaaa gacagtgtta cagaaacact gccaagagtg 600 aataggacag cagcgatttc tgggtattct ttcaagcaat gctcacacca aataagcgct 660 tgcaacaaag acatttatgt ggacctagac atgaagggca taaactataa cagctcagtt 720 gccaagagtg ctcaagaatg ccaagaaaga tgcacggatg acgtccactg ccactttttc 780 acgtacgcca caaggcagtt tcccagcctg gagcatcgta acatttgtct actgaagcac 840 acccaaacag ggacaccaac cagaataacg aagctcgata aagtggtgtc tggattttca 900 ctgaaatcct gtgcactttc taatctggct tgtattaggg acattttccc taatacggtg 960 tttgcagaca gcaacatcga cagtgtcatg gctcccgatg cttttgtctg tggccgaatc 1020 tgcactcatc atcccggttg cttgtttttt accttctttt cccaggaatg gcccaaagaa 1080 tctcaaagaa atctttgtct ccttaaaaca tctgagagtg gattgcccag tacacgcatt 1140 aaaaagagca aagctctttc tggtttcagt ctacaaagct gcaggcacag catcccagtg 1200 ttctgccatt cttcatttta ccatgacact gatttcttgg gagaagaact ggatattgtt 1260 gctgcaaaaa gtcacgaggc ctgccagaaa ctgtgcacca atgccgtccg ctgccagttt 1320 tttacctata ccccagccca agcatcctgc aacgaaggga agggcaagtg ttacttaaag 1380 ctttcttcaa acggatctcc aactaaaata cttcacggga gaggaggcat ctctggatac 1440 acattaaggt tgtgtaaaat ggataatgag tgtaccacca aaatcaagcc caggatcgtt 1500 ggaggaactg cgtctgttcg tggtgagtgg ccgtggcagg tgaccctgca cacaacctca 1560 cccactcaga gacacctgtg tggaggctcc atcattggaa accagtggat attaacagcc 1620 gctcactgtt tctatggggt agagtcacct aagattttgc gtgtctacag tggcatttta 1680 aatcaatctg aaataaaaga ggacacatct ttctttgggg ttcaagaaat aataatccat 1740 gatcagtata aaatggcaga aagcgggtat gatattgcct tgttgaaact ggaaaccaca 1800 gtgaattaca cagattctca acgacccata tgcctgcctt ccaaaggaga tagaaatgta 1860 atatacactg attgctgggt gactggatgg gggtacagaa aactaagaga caaaatacaa 1920 aatactctcc agaaagccaa gataccctta gtgaccaacg aagagtgcca gaagagatac 1980 agaggacata aaataaccca taagatgatc tgtgccggct acagggaagg agggaaggac 2040 gcttgcaagg gagattcggg aggccctctg tcctgcaaac acaatgaggt ctggcatctg 2100 gtaggcatca cgagctgggg cgaaggctgt gctcaaaggg agcggccagg tgtttacacc 2160 aacgtggtcg agtacgtgga ctggattctg gagaaaactc aagcagtgtg aatgggttcc 2220 caggggccat tggagtccct gaaggaccca ggatttgctg ggagagggtg ttgagttcac 2280 tgtgccagca tgcttcctcc acagtaacac gctgaagggg cttggtgttt gtaagaaaat 2340 gctagaagaa aacaaactgt cacaagttgt tatgtccaaa actcccgttc tatgatcgtt 2400 gtagtttgtt tgagcattca gtctctttgt ttttgatcac gcttctatgg agtccaagaa 2460 ttaccataag gcaatatttc tgaagattac tatataggca gatatagcag aaaataacca 2520 agtagtggca gtggggatca ggcagaagaa ctggtaaaag aagccaccat aaatagattt 2580 gttcgatgaa agatgaaaac tggaagaaag gagaacaaag acagtcttca ccattttgca 2640 ggaatctaca ctctgcctat gtgaacacat ttcttttgta aagaaagaaa ttgattgcat 2700 ttaatggcag attttcagaa tagtcaggaa ttcttgtcat ttccatttta aaatatatat 2760 taaaaaaaat cagttcgagt agacacgagc taagagtgaa tgtgaagata acagaatttc 2820 tgtgtggaag aggattacaa gcagcaattt acctggaagt gataccttag gggcaatctt 2880 gaagatacac tttcctgaaa aatgatttgt gatggattgt atatttattt aaaatatctt 2940 gggaggggag gctgatggag atagggagca tgctcaaacc tccctaagac aagctgctgc 3000 tgtgactatg ggctcccaaa gagctagatc gtatatttat ttgacaaaaa tcaccataga 3060 ctgcatccat actacagaga aaaaacaatt agggcgcaaa tggatagtta cagtaaagtc 3120 ttcagcaagc agctgcctgt attctaagca ctgggatttt ctgtttcgtg caaatattta 3180 tctcattatt gttgtgatct agttcaataa cctagaattt gaattgtcac cacatagctt 3240 tcaatctgtg ccaacaacta tacaattcat caagtgtg 3278 <210> 2 <211> 26001 <212> DNA <213> H. sapiens <400> 2 atgccctcca taggctttca gaccttcttc aaggccaaag ggaaggcctt catggaaata 60 taattatgtg aaacacccca gaattttttc acaaactttc ctgcctataa acgccaggtc 120 ctaccactgt ccagtgtccc acttcccact gtccagtggg aagactccct ccaggacaaa 180 accacccttt ccttcaggga tgtgacgtgc tgtgctttcg ttgacagtca tgcagctgct 240 agacatgtca cttcctagct ctccattcgg gtctgtgtcc caggacctaa agaaagctaa 300 aagaagccgg gcgtggtggc tcatgcctgt catcccagca ttttgggagg ctgaggctgg 360 cggatcactg gagatcagga gtttgagacc agtctgacca gcatggtgaa accctgtctc 420 tactaaaaat acaaaaaaag aaaagaaaaa agaaaaaaaa ataagctggg cgtggtggcg 480 cgggcctgta gtcccagcta ctccggaggc ggaggcagga caatcacttg aacctggaag 540 gcggaggttg cagtgagctg agatcgcgtc attgcactcc agcctgtgcg acgagagact 600 ctgtctcaaa agaaagaaag aaagagagaa agaaagaaag aaagaaaaga aagaaagaaa 660 gaagaaagaa agaaaagaaa gaaagtaaga agcaagcaag ctgaaatagc ttatttttct 720 gttttaaaaa atagactttt agtgttcaca agtaagaata aaaaaaaaaa aagcttggcc 780 ttaggaggaa tcctatctgc ttaggcctct gagaggcagc gtcacctgaa gggaaactga 840 ctgggcaaga gccaggctct taggagctgt ctgtactttg cttcccatcc gtccgctctc 900 ccccagcagc caaagtctcc tccctccatt atattgcaaa tcaatgaatc cattagactt 960 tccatgtttt ctttttagac tttgagattc aaggtcagct agaattaatg gttaacagct 1020 gacaggtgaa agtgtggtta aatgcagctt tggctagcag gcacacaggc aaaatcaagt 1080 tctacatctg tccctgtgta tgtcacttgt ttgaatacga aataaaatta aaaaaataaa 1140 ttcagtgtat tgagaaagca agcaattctc tcaaggtata tttctgacat actaagattt 1200 taacgacttt cacaaatatg ctgtactgag agagaatgtt acataacatt gagaactagt 1260 acaagtaaat attaaagtga agtgaccatt tcctacacaa gctcattcag aggaggatga 1320 agaccatttt ggaggaagaa aagcaccctt attaagaatt gcagcaagta agccaacaag 1380 gtcttttcag gtacagtttc agaacttact atttaacatt cctctcaagc aaatacgcct 1440 tgaaatgctt tttttaaatc ataggaattt aaaaacactt tacaatagag aatgattgat 1500 ttttaaaatg tgtctgattt agctttgtag agatgttccg ctaatatcca taactaatct 1560 gagaggaaat gtggaacaac agaagagtaa cagtgtctac tcagtaacaa gcgttttacg 1620 agttaaaaag acatccaaat gcagtactga aaaatcagaa gtcttgattt gtctcactga 1680 tgactccgtt tttcctagag cagtctgttt aatgcttact ggagataaat agatttatag 1740 gtgaccaaga caatcgatta atgtatcagc cacagacttt tttaaataga aaattttcta 1800 agtaggaaat cattcatagc tctttgaaag atatagggag aggcctcaag gaaagaaaga 1860 aaggaaaaaa attgggaaag gaaacaaaga tgaaaaattg gggtggggag agcggtcaga 1920 tggtggccat gagaaggatc tgaacacaga gagcggcggg gccggcgggg aaggagggag 1980 gaggggagag cgctgcttcc ctgtgggttc cggcttctgc agagctgtaa gagttgaatg 2040 ccacacacag tcacactaag gaatgctcca ggattgggaa agaaaattca acattataat 2100 gagaacactg tgaatgctat tgaattaact actcccctct ctccctattt cttgtaagtc 2160 ttagtgtcag taaactaatt ataaatttac attttatgtt ctaaaagcat gcaccttttt 2220 ctcattgtag gatgattttc ttatatcaag tggtacattt cattttattt acttcagttt 2280 ctggtggtaa gtagagtgtt atcttaacta tgggctggga gagggaaatc acactgcaat 2340 ctccacacat gtgggagaat cccacaccat ttatgccggg aaggaaataa aatgttttta 2400 ttaacttcct gcctgaggct ccagaggttt tcaaagcagg gtaggaattg aggtgaaaaa 2460 attgtttgta ctggtaggaa tctgtgtcta tatgtgtacc atatctacat ccatgcctac 2520 atacatcatt catttaaatg atatttaaaa gcaatattaa aaagaagaaa tcttgatttg 2580 cctcactaat tagttggttt ttcataaagc agtcagttca atggaacata cacacacaca 2640 taaaatagga attttgtact gaaaaatgtt atgtaactat tcatacacag tttatgcatt 2700 tcaataattt aactaccctg ttaattctcc accctatgtc acatctgcta aatttgttta 2760 taaattactt agccaatatt aagtaggata tatcagtaca ggtattgttt agttccatga 2820 ccattcttta tttaaaatga aagctgaagc attcctttag aaaaatagct tatgtctaca 2880 tgttatattt aatttctgat actattgcta gcattttaag catagtaaat tctttttgct 2940 ggcctatgtg aaaaaaggca aacctaggtg aagatattaa aagtaaattc cacttaatat 3000 attaaattac acagctcata atttcaattt tctctgtgac aagactactg ctcaggttat 3060 aatattcctt tgttataatt atctggaaat tgtattgtta tttcattgat aaatatgtca 3120 gcgctaaata atttgatata ttttgaacac tggacccaat aactacataa acaattgacc 3180 ctgaatcagg ggttccacat ccatggattt aaacaacatt gaagtgaaat tttttaaaaa 3240 aaattatatc tgcactcaac atgtgcagag ttttttcttg tcattattcc cgaaacaaca 3300 cagtataaca acaatttgca tagtatttac attgtactag gtattataag taatctagag 3360 atgatttaaa gtacacagga ggctgtgagt aggttatatg taaatactat gccattttct 3420 atcagggact tgagcgttca tggattttgg tatctgcagg aggtctggca gccaatccct 3480 catagatatc aaggaatgat agtgtacata tttaggtcct ttatacatgc acatggaaca 3540 tttacaaata ttgaccacac acaagcctct gaaacaaggc tcaacaaatt ttaaggggtt 3600 aaaattatac tgatcatgtt attcaatcac cgtgaatggg agctagaata ataataaaaa 3660 gggaattgaa aatctgcaaa cgtttgaaaa ttgagtattt ataatcaccg tgaatgggag 3720 ctagaataat aataaaaagg gaattgaaaa tctgcaaatg tttgaaaatt gagtatttat 3780 acctttttag attaagatga atcagagatg aaatcacaat ggtaattaga aaaggaattg 3840 tacaataatg aaagtacagt atatcaaaac tttgagatgt aaccgaatca gtgttgagat 3900 caaatgtata gatttacatg tatacattag aatacagaaa agggaaaaat taatgatata 3960 agatgacaag aagatagaga atagcaactt aagtgctaag aaattagaag gcagaaagaa 4020 gaaatcgcag aaattaatta aatggaagac acacatattt gagaggtcaa cataacccct 4080 ttctagccca ttttataagg tcagggtaat cttgacacca aaatctgata ggaaaattct 4140 gaggaaaaaa agtcacaggt cttttatctt atgaacatat gtacaaatgt cctaaacaaa 4200 atattatcca acttaaccca gtagattgtt aaaaaaatta aaggatgatt acattgtgat 4260 attgtgacaa agttgggttt attccaggaa tgaaaagttg atttaacatt caaaaatcaa 4320 tagatgtgtg acttcggggt acataccgaa aaaaaagaag ggaaagcagg aactcacaca 4380 gatatacttg tacacccatc tcatagcagc attattcaca ctaacccaaa ggtggaagca 4440 gcccatgtgt ttatcaacag gtgactggat aaagtgtggt acatacatac aaaggaatat 4500 tactcaaccc taaaaagaaa ggaaattctg acacatgcta tgacatggat gaaccttgag 4560 gacattacgc taagtgaaat aagccagtca caaaagaaca aatactgtgg gatctcactg 4620 ataggaggta cttagggtag tcaatttcat caagacggaa attagaacag aggttgccag 4680 gggccgaggg gccaggggaa gggctgaggg ttggtgttta atgggcacag agcatcagct 4740 ggcgaagttg aaaagttctg gaggtggatg gtgctgatgg ttgcacagca atgtaaatac 4800 ccttagtgcc acagaactgt acactcaaga tggctacatg gcacatggta tgctatctgt 4860 cataataaaa aataaaaata attttaaatg ttaatatgtg ccgaaaaatg cttgctaaaa 4920 ttctattaat gatcaaaact ttaaataaac tggaaatgga agagaacttt catcagctat 4980 taaacgatat tttaaacaaa agcaaacaaa aatccaaacc aaaaatcttc aagaaacata 5040 atacgtaata gcggaatatt gaaagctttc ccaagggatt gagaatagga caagaatact 5100 tcccattatt tccatttact cttgactgga ggtactcgtt ggtgcggtaa ggaagggaaa 5160 taaaaggaaa acgattagga ggaacataag ctctcgtttt tcacagatga tgtgattgag 5220 tacctagaaa aatccaaaat taaccatcac ataaattatt tgagccaatt aattaaatga 5280 gtaagaagtc tcgatacaac gtcaatatac aacagcaagc acttgctcgt tcgcaaaagc 5340 agatgaacta gtttttactg acactagaag cagcatgtgt tccatgtgtt ccacatccat 5400 gcactcaaac aaccttgacg tgaaatattt tttaaaaaat tgtatctgta ctcaacgtgt 5460 gcagagtttt tttccaaaat tgttttccaa aaatttttaa atgtttatat gtttaggggg 5520 tgtaagtgca gatttcttac atacatatat tatgcggcgg tgaagtgccg gcttttggtg 5580 tacccatcac ccaagtagtg aacacagcct ccaacaggta atttttcaac gctcacccca 5640 ctcccatcct cccatctagt ggcatattga aaatcaattt gtcttgtaaa attaaataat 5700 ccaattagga gggggatata ttctaaggaa attagtgcat gatgcacaca cacacacaca 5760 cacagaacac gtgtgtgcgc atgtgcacat gagagagagt gagagagaaa ctgggtcttg 5820 ctctgtcgcc caggctggat tgcagtggta aaatcacagc tcactgcagc ctcaaactcc 5880 caggctcagg agatcctcct acctcagcct cccgagtagc tgggattaca ggtggaaaca 5940 accatgccca gctagtattt tttttttttt ttgtattttt tatagagaca gggtcttgcc 6000 atgttgccca ggctggtctt gaactcctca gctcaagcaa tctacctacc ttagcctccc 6060 aaagtgctgg gattacacgc atgagccact gcgcccactc cgcattatta aatatagaac 6120 atttatttga ttcatcagtt aatattcttc ttaaaagtac tattttaatg tagcaagatt 6180 gctttccacc aaaaggtggg gtttccacgg tggggtttcc aaattattct caatggggtg 6240 aggatgtgtg ttatcacacc cccgagccat cagatgctgt cagaaagtga tcactctgaa 6300 gtctttgttt caaataagca cagggtttgg ataaagagac gcaattagga aaggaaaaag 6360 cagaaggctc gttccagacc tggatgagat cctaaaaagc agcagctttt gccagtaaag 6420 atccttgaaa tgattcaatt accctcaaag cactccttgt ctccaagaca atcactcata 6480 agcacaattc cattgaagcc aacgtaccat tttgtgattt tcgtttccac ctgaggctgt 6540 tcattcaata aactcacata aaagtgttta ttgccttgat ttccaaattc aggcgtattt 6600 cctggtaagt agagctactt gccttgcctt tatgagatta ccacctaact agatgtatgc 6660 ccagtaaaat ccaacataac gcatgccatg tactacatca cagaatgtgt gactcagttg 6720 ttgaaggaca cctgctttga aggaggggac attactacgg tcttcacacc aagcgccaag 6780 tactgccagg tagtctgcac ttaccaccca agatgtttac tcttcacttt cacggcggaa 6840 tcaccatctg aggatcccac ccgatggtaa atgcttatgt ttctacatcg aggagacaga 6900 tttttaaagg gagattgcta ttcttaacac atttccatct aacattttat aaaatttaac 6960 attaacaact ggaagataaa ttgtctttca gttgaaatat tgttacagaa agaagtgatg 7020 gtgtttacgc aatttagaaa agaataaata tgcctccaag tgtagacttt ccagcctctc 7080 ctatagtctc atattaatgg tatgtttctt ctgtttgtct caatttttac acttcttaaa 7140 catttcacac tttgcttttc tatcgattat taatttttgt cgtgcttctc aacaaactgg 7200 aacttctccc aactatttta ttagaaaaaa ataaaatatt taaaaagaaa atttgaaaaa 7260 aagtacagta cagtgatccc cctgccacca ccaaaaccgc aatgtttgct atatttgtac 7320 agcaatatac aatatacaat acctatattt gtatacatgt ttaaccgttt gaaataattt 7380 taaaacatga cactttaccc ctaaatactt cagcatgcac tatcctacac aaaagacata 7440 cgaaatttaa caagaattcc tttatattat ttcagttttc cctcaaatat aatttatagt 7500 aattaaccag aatcttacca agagtcactc actgcattgg gtggtttgtc aggtttaaaa 7560 cattttaaac agtccaccaa ccatttgtat tcccatcctg agcttgaaaa tttaataata 7620 agcctttctg tagaattaag ttttcaacat ctttattatt gctacattca caggcattta 7680 tgtagcaccc agaacttata aaatttacta ttccagaacc tagagcaggg attggcaaat 7740 gtcttcttaa taacgcagag taaatatgtt aggctttgtg ggcaaaaccc acagtaaagc 7800 caaggatatt atttaagtat ttatgtcacc acttaaaatg taacaatttg aaaatataaa 7860 aatcattttg tatagctaac aggctaaaca gaaacacaca gatttttggt tgcattttac 7920 caacaggtcc tagttgacac attcctgttt gttcctatta gaaaggagta ttacatgcag 7980 tctcttaagt gtagggatat tgaagtaaaa aacaaactca gaatcttgct aagaaaatat 8040 ttgttttggc atgagataaa gtagtttgtt tccttctttt tggctttctg tgtgctgact 8100 tttaagatcc attattttaa aaacataaat tcctattcat taatatgtat tttttaaaaa 8160 aacaggttta cttgtgtcct gaaagacagt gttacagaaa cactgccaag agtgaatagg 8220 acagcagcga tttctgggta ttctttcaag caatgctcac accaaataag cggtaagata 8280 tgttctcaga atcaacaaat accagctgtg atgtacacat atcgccacat cggatgtggt 8340 tttaaggcta tgaaatgaaa cactgctatg tggaaataaa cccccttaat gaagttcttt 8400 cagtgtagag tataaactag tatacataca tgcctgccct ccaacacact gtaaaaacct 8460 ctttacctca tagaaagaca tatcttacta cctcacttcc catcatttat ttatattctt 8520 tctatttccc agcctaaaat cttaaatgaa agtctttttt tttttgagac agggtctcac 8580 tctgttgtcc aggctggagt gcagtggtgc aatcacagct cactccagcc tcaacctcct 8640 gggttcaagt gatcttcctg ccttagcctc tggagtagct gggaccagag gcatgcacca 8700 acattcccag ctaatttgtt catttttcct agagacaggg tctcactgta ttgcccaggc 8760 tggtctcaaa ctcttggcct caagtgatct gcccgcctcg gccttccaga gtgccgggat 8820 tccatggtgc ccagtcgaaa ttctttatta aacgtattaa tccaaattga aaggagcaaa 8880 tataaaggtt gaagtgacac ttgtcttaat agtgaataga tacttgaatc agttaattag 8940 cgaaataatc agtgcagtta gggagaagag aggctaggtc agaaaatcaa aatgtgaatt 9000 tacaagtcta aaattgttac agtgtaagaa ggacattggc attcttttac tgcttccatt 9060 caagaataag aattttgcag attaatataa cgaaagacct ctgaggaaag gtgggtgaaa 9120 aagttgaaag gatgagtcag gagggacagt tgcttaggtc attgccccta gaatctggaa 9180 ggtactcatg tcttctgctt ttatttccag cttgcaacaa agacatttat gtggacctag 9240 acatgaaggg cataaactat aacagctcag ttgccaagag tgctcaagaa tgccaagaaa 9300 gatgcacgga tgacgtccac tgccactttt tcacgtacgc cacaaggcag tttcccagcc 9360 tggagcatcg gtgagtgagt cccaggacat tcgagtggtc gatgaaaaac agaatcgtga 9420 tttactaaaa agcttttgcc atcaacttta tgccagaatt tattttgaac ccctaaaaga 9480 catttctata atagtactcc tagttttctt catgaaaaat acacttaaag cctaatttgg 9540 atgcatttca tttatggtaa ggagtctatc ttttaataac actgtcagaa aaatatatat 9600 acttggctaa tttcaaaagc gctacacttt taaattggca cttttgaaac agctgcaatt 9660 ggtatgattg tcagtgccct tcccagtcta aaaaatgtta cagtctaaca gaataaaaat 9720 aaaaacctac tctctctctc tctaaataac agttccttac ctaagacaaa atactcatgt 9780 aaaaagtctt atcctgctcc atactggatt ttgaaatatt tcaaggataa atctatcaca 9840 taaggattta aaaattatct gatctctaat aaccaaatct gtgttctcat ctttaaaaat 9900 ttactaggga aatagattat taatttgtat attcagaaat atttgagatg atttagattt 9960 tcatagtaaa ctgcatttat ctggaatcaa cagaaaagtg aaaaacattc aaattactaa 10020 tacttgcgtt ttaacattgg attttaacat tctgctctcc acattcacaa agaggagtga 10080 acagaaagca aacaaagcat caacgagtta tttcaaaaac aacagtggtg aaaaacacac 10140 acaccaaacc cctaaattca tgatttgact tgtaaggctt atctttagct cagctcagac 10200 gacagctttt atgtctaaga cttaacagaa tgtgaactgc aagacaagaa attggaggtt 10260 tctaagcaag ataaagttaa gtcattaaaa gtaagaagga cttagccagg cgcggtggct 10320 cacacctgta atcccagcac tttgggaggc cgaggcgggc agatcacctg aggtcaggag 10380 ttcgacacca gcctgaccaa tatggtgaaa ccccgtctct actaaaaaag aatacaaaaa 10440 ttagccaggc gcggtggtgg gcgcttgtaa tcccagctac ttgggaggct gagacaagag 10500 aatcgcttga acccaggagg cggaggttgc agtgagccaa gatcgtgcca ttgcactcca 10560 acctgggcaa cagagtgaga ctccgtctca aataaaaaaa aacaaaaaat gagaagggct 10620 tgagaagtca ttcattcatg cactctcctt cttcatgtgg tcactctctc aagctgtcat 10680 tatactgaag aagaaataaa cttacacaat tcacaggtgc ttagcaacac tgctgggacc 10740 atgcccagcc attcagcctc ccagatggat gcttcggggt ctcgcaggtc ctctctccaa 10800 aggggacttt cttaatatct catgtttttt cctccttgca gttggaagaa taagacactt 10860 ttcctttttc tttttattca gtaacatttg tctactgaag cacacccaaa cagggacacc 10920 aaccagaata acgaagctcg ataaagtggt gtctggattt tcactgaaat cctgtgcact 10980 ttctaatctg ggtaattatc gacttcttga tgatgtaatt caaccattaa atatgctgat 11040 gattacagta gatctcactc aggataccag cttatgctca cgatgaaacg gacccaaaga 11100 tctttacctt cttcatgtga tagatttcat catgtcctat acagttagat cctctattta 11160 aatttccagt ttaaaataat catgccattt tcttctaaat aaaaaaaaat taaaagatct 11220 tgggatacac ttaaattttt taatatggaa tttacacata ctgtgaccgg aattttcctg 11280 atagctggtg aattgagtcc ctgacatagt tcttccgtcg cgcagcttgt attagggaca 11340 ttttccctaa tacggtgttt gcagacagca acatcgacag tgtcatggct cccgatgctt 11400 ttgtctgtgg ccgaatctgc actcatcatc ccggttgctt gttttttacc ttcttttccc 11460 aggaatggcc caaagaatct caaaggtaag gagttaacaa gtaaggataa tttgttatct 11520 tctaaaaata gctgatcaaa atccatcatt aaaaattcca agtaactaaa aatttactct 11580 aaatgtcagt ataggataaa agttgcaaag aatttctagc ccctctccct ttctattccc 11640 cacctactta ccacaaaccc aacattaccg aggactcttt tttttttttt tttttttttg 11700 agatggagtc tcgctctgct gcccaggctg gagtgcggtg gcatgatttc agctcactgc 11760 aaccttcgcc tcccaggtcc aagcgattct cctgcctcag cctcctgagt agctgggact 11820 acaggcatgg gacaccacgc ccagtaattt tttttgtatt tttagtagag atggggtttc 11880 accatgttgg ccaggctggt ctcaaactcc tgacttcagg tgatccacct gcctcggcct 11940 cccaaagtgc tgagattaca gggttgggcc accgtgcccg gccagtaaat tttaaaataa 12000 atataaatat tacttcacct aaataaattt taggtacagg tacagttgtg ttacatggat 12060 atactgtgta gtggtgaagt ctgggctttc agtgtagcca aatagtatac attattccca 12120 ttagataatt tctcctgcct caccctcctc tatcctccca actctctgag tctccaatag 12180 ctttcattcc actgtctctg tgcctgtgta cactttattt agctcccact taaaagtgag 12240 aatctacaat atttgacttt ctgtttctga gttgtttcac ttgagataat agcctccagt 12300 tctatccatg ttgctgcaaa agatatgatt ttatgatttt tttatggcta agtaacattc 12360 tatagtatat tctatacacc acattttctt tatccattca tttgctgata gactcttagg 12420 ttgatccata tctttgttat tgtgaatagt gctgcagtaa acatgtgagt gtaggtatct 12480 ttgtgacatg attttttttt ctttcttttc ctttggctat gtacccagta gtgggattgc 12540 tggaggtctc caccttggca aaggggcagt tgtctagttc taaatgaaat gaagagattc 12600 catttccatt tcatgacaac taaaagacaa ttcagtccaa tgctttgttt aaaataattg 12660 aaccaggaac agaaagagct gaaaatgtca gtgaaatgtc aaacccaaag tggagagaga 12720 gagagaggtg gaaatgaatg tctccatcaa gtgggttagg gtggtggtgg agggaggttt 12780 gagaattgag tccctgtttc cttaccaatg gaaattaaca taggacatca gaaacagcat 12840 ggaaaatttc tttgattatc aaaagtacac tagctaaggt tgctgtccct cttttattta 12900 tttatttatt tgagacaggg tcttgctctg tcactcagat ttggttgcac tgggtgtgat 12960 ctcagcccac tgcagcctcc acttcctagg ctcaagcaat ccacccgtct catcctccca 13020 agttgctggg accacaggtg tgcaccacca cccccagcta atgtttgttt ttttgtagag 13080 acagagtttc gccatgttgg ccaggctggt ctagaactcc tggcctcaag caatccacct 13140 gccttggtct cccacagtgc agggattaca agcctgagcc actatgccca gcttgctatt 13200 cctcattgac aacattcact taaacaagca aacaaatatc cgtaaaatta agtcagcttt 13260 aaaacctggc ttgtatatat ctctgaattg gaactctcag agccctcagc acttgcctga 13320 ttggcctcct gttgatgaaa agttgtcctc cagacaactc agccaaggga ggccctgtgt 13380 gccttgccta tcacatgagc ctcactttcc actgagtgag gctgtcattt cagaagcacc 13440 gggtctgtca catgaaaata tatctgttac catcacttac taaacaaatt tagtagaatt 13500 tgtttggtgc ttattatgta tcaggcattg ttctgaaggc tggggatacc atttagtgaa 13560 ctaaatcgac aaaaactttg cctattggac cagagtggag atgagagaga agtgaccaga 13620 tcgatctgtg ttatcagcag acagccaata agatttgctg ataggttgga ccacggattg 13680 tgaaggagtc agtgatagca ccaagacttt tggcccaagg aactggaaag atggaaatgt 13740 caatgacaga atgtggagga tttcgcaagc agcagagtgt aggagaagca atgcccttgg 13800 ctcatctagg gcaaagggtt gaattggcaa ctggaaatag aagtcaaatt cagaagagag 13860 gtttatgtgg acatctgtgt ttaggtgtca ccaatataca gctgatactt tttaaaaatc 13920 tagtgaaatt atcaaagggt taaatgcaga gagggaagaa agtaggtcca aagatcaagc 13980 cttgggacat tggaagttta gaaataagaa agatgtcatt gtcacttgta attttgtgct 14040 agtcactgct ctttttcttt gtcttattac cttactgacc aattcctaga ataggaataa 14100 cacatttgat ctttaataca gtatgtgata ggaacatggc ttctataagc ccaaacttgg 14160 caatttaaat ttaaatttat taaaattaaa taaaactggc tgggtgcagt ggctcacgcc 14220 tgtaatccca gcactttggg aggccgaggc ggtgaatcac gaggtcagga gtacgagacc 14280 atcctggcca acatggtgaa accccgtctc tactaaaaat acaaaagtta gccaggtgtg 14340 gtggcatgtg cctgtaatcc cagctactca agaggctgag gcaggagaat cacttgaacc 14400 cgggaggcgg aggttgcagt gagccaagat cgcgacactg cactccagcc tgggtgacaa 14460 gagaaagact atgtctcaaa aaaaaaaaaa attttaaata aaactaaaaa ttcaccttcc 14520 cagctgtgtt agccacattt caagtgccca atagccacat gtagttggca gttactgtat 14580 tggatggcac aggcatagaa tatttccatc actgcagaaa gatctatgga cagtcttgct 14640 ctagactgtg attttgtcta cttaggaaaa gtcactcttt tccaggaaga tgcttccagg 14700 gtgtggagta aacgacggac ttcacccatc tccttataaa cctattgcaa ccctggatag 14760 gaggtttcta ggtagcatga agactcttga atctttaaga taggctggga gtgttgaaag 14820 gaaggaaatg aaaagggaag atactaggaa gactgacaat agagcaagct cagaaaattt 14880 ttatggaggt gatttagtta gaaaatttgt ctgcaaccta agggccatgg agtgtgactc 14940 catggtttat gggtgtaact ccgtggttta tgaagagtac tttcaaaata ggaaaatctt 15000 cacaactaag tgctagcatg agctgacttt actttctcta ggtgctgtaa aaatgttttt 15060 atgtgtttga tatgatatat ttctacttcc cttttgtttt tgttagaaat ctttgtctcc 15120 ttaaaacatc tgagagtgga ttgcccagta cacgcattaa aaagagcaaa gctctttctg 15180 gtttcagtct acaaagctgc aggcacagca tcccaggtaa actgagagtt ctgcattctg 15240 gctgagagtg accagccccg aggaggctga tacatgctga gggagggtct cactctgaca 15300 tgtggtctgc tgtctagtgt tctgccattc ttcattttac catgacactg atttcttggg 15360 agaagaactg gatattgttg ctgcaaaaag tcacgaggcc tgccagaaac tgtgcaccaa 15420 tgccgtccgc tgccagtttt ttacctatac cccagcccaa gcatcctgca acgaagggaa 15480 gtaagccata tgaagggtta tgcagacacc cttgtcccgt ctgcctgtga ggtgcattat 15540 gtttataccg ttttgtttcc aactgcaggg gcaagtgtta cttaaagctt tcttcaaacg 15600 gatctccaac taaaatactt cacgggagag gaggcatctc tggatacaca ttaaggttgt 15660 gtaaaatgga taatggtgag tataatgtca cttgaaaaaa tatagctgaa ggaattattc 15720 catgcttcat acatcacaat caagactgtc agttatagcc acagaaggga gaacattcag 15780 gaaataacaa attttgcaat tttctattat tttcactcct gtcactcaag ctgaccatgt 15840 tttaaaggta aatattgagg cttgactaaa ctgtacattg cctagtatta actaaatata 15900 tgctttaatt tgacacattt atacacctgg catttctgtt ttctttcttt cttttttttt 15960 tttttttttt tgagacacag tctcactctg ttgcccaggc tggagtgcag tgatgtggtc 16020 agtgttcact gcagcctctg gcttgaactc ctggactcga acaatcctcc caccttagct 16080 ccctgagtag ctggggctac aggcgtgcac cacaacactc ggctaatttg ttgtagagat 16140 gggatcttgc catgttgccc aggctggtct tgaactcctg ggctcaagca atcctcccgc 16200 tttggcctcc caaagttctg ggattacagg cttcagccac tgcacccagc cacaactggc 16260 atttcctaat gagacccaga ctctgccaac actcctgtta tcaaggccag taatctttcc 16320 tattatcctt tgtaagggaa ttatcgatca gcactttggt tagtcaaatt actaattttc 16380 ttccaaaaat tgtgtatcta ttcaagaaat actggagcac ctccttttta gggtctttat 16440 tcagattcca tgcagggttc tggagactta gggattggca aaggttaagg taaaacttta 16500 ctagtaacaa tgagtgtggt aggatggaaa taagtgttta gattacacga gacctgtaat 16560 aacataaaag ttacaataaa aatccaacca gcagtgtttc catcccagtg gccaatttct 16620 gagcatagtc acgagagatg ctttgtaggc aaacagaatt gttctaaggg acaaaatccc 16680 caacaggaaa gaacacacca caaacactcc tgcttaaatt accatagtaa cttaggatgg 16740 ctttactata tattgattta cataaagctg catgttctta tactgtttat tgccaaatgt 16800 ccaatattac aatacactat aaggtgcaac tgagatttaa tgaataaaat ggaagtaaca 16860 atcctgcctc gtgatagttt tagaagcaca aaaacattct gtgtcagatt atctgctgta 16920 ccgagaaggc gaatcaatcc ttaatttctg agaacttgtt ttgtagaaca taaagacgtt 16980 atattgcctc caacactggt atcctaacta acagactatg ccttcctaga gcttagaggc 17040 gctccgatga aaatctctgg atggctcaag acttcttaaa aagcaagtca attacgtcgt 17100 atctcataca ttctgttttc ctcacaataa atttccctaa gacaagaagg agcattcggc 17160 accattctgt tgtctttctt ctacttctaa gcgttagaag ggacacttag caaatgttgc 17220 tgttaagtaa tgttgacatg gtttaataaa atgggaatga gcacgtatac ctcaatacat 17280 tgcagactgc attttccccc ttccttcttc attatggttt tctctgttgg atttatagac 17340 tctggcctgt agaagttaca gaatatgcca ggtatagatt gatagctaca ggagaaaatg 17400 taagataaag gaaaataaag tcttacgtct tttcagtgca actttggagg gagtgaatta 17460 gataactagg tttttactgc gctgtatttg atgaaataac cccctaatgt gaaagggaat 17520 agctgcgtga gatatttatg gtgccttgtc tgtcactggt ctacaatgta acttaacttt 17580 ctgaagatag atagcagcac cattaaaata aacatttctt accacaaaat atgattctaa 17640 acacatattt tcagcatttc gtttaaactg agaaacagca taggatgaac ctcaaggcct 17700 ctcacctgga ccttgagtta tttctaaaat atcttagtta ctatttacct attaattttc 17760 ctaaaattta cctttatgac gcttcccacc ttgcagaaat tccagaatag atggccctcc 17820 aaaatgaatg ttcacccttc cggctctaaa atgagagcct ctgttcaggc ttccgaagtc 17880 acatcgtgct cgttctcacc tcagttgctg ttagctgctg tttccttccg aactccttct 17940 ctcatcctct cctcctattt gaaatctgcc ccagaattat acactcattt tcctaccaag 18000 gaaaaaaagg cctagaaagg ttgttttaca cccacaaaac tagtgaatgg accttctagg 18060 acccggcttc tcatcagtga ttcttctgtt aacttagact cctcccttag ctcaggacgc 18120 ggagccttct gagcacctga gcctggttat tctaaatgtg atctgggcac agcacattga 18180 catcacctgg gagcttgtta gaaagaattt caggacccac acagatgtta ctgagtcaga 18240 atctgcattt tgaaagctac acaggcaacc cacaggcaca taaattttga gtcgcatagg 18300 tgtgtgcgtg tgtgtgcgca tgtatgtgtg cgtgtgtttg tgtgcacgtg tgtgtgtgtg 18360 tgtctagaat actgctgtct acgaacaccc tattcccatc catctgtgtt ccatggctcc 18420 aaccgggagg gtgggttctt gtgtcgggca tccagtaagt agaaatagag ggcactgtcc 18480 tgtctaggca gccccaagag aaaagaaaca gagggatgag cctgagtcaa agtccctgaa 18540 aagtaccaag gaccccagag aatcccaaac tgtcaacaag gccaaaggtc agaggaagtt 18600 catagcagat cagtcttact ttggacgtgg gtggagcagg agtgactggg atcatggtca 18660 gcagagtcac tgggacaggg caggaactgg acaatggctg cagcctgcgg gcaaggtgct 18720 tgccttttct ttctaagagc agttctcaaa cgccagcagg gctggttcaa acacagatgg 18780 ctgagcttcc aggctggagt ttctcattca ctggatctga ggttgggctg aagaatgtgc 18840 atttctaaca cgttcccagg tgacgctgtt ggtctggaga ctgcacttga caaccactgg 18900 tttaaaaaca ccattcacgt tatcatttga aggagggtaa gacagccttg tagtaccaca 18960 caaggagggc tacattctta ggggtgtgta attacaagat gacttagtca attccatttt 19020 tcatgtgcat gttttgcttt ggcagcttga ttataaagtc tctgtaactc agggtcatga 19080 taaactattg acttgaggaa aggttttctt cttgttcctg aaggagcata attactgatg 19140 gaaaggaaga tgtaggaagc tgctcatcac aatgcttctg ttgcagagtg taccaccaaa 19200 atcaagccca ggatcgttgg aggaactgcg tctgttcgtg gtgagtggcc gtggcaggtg 19260 accctgcaca caacctcacc cactcagaga cacctgtgtg gaggctccat cattggaaac 19320 cagtggatat taacagccgc tcactgtttc tatgggtcag taccacggct gtttttatta 19380 gttcatcttc ttcacacatt tataaaaaat attactagca tgttaggaaa taaatacttt 19440 aaccaattag attgtcttat ttgcaaaatt aattaattgc ttcagtggta aaaaacgcaa 19500 aaaggaagag ctcatggtct cccagcatca gaacaggtgc aggtacaagg ctgcttgact 19560 gcctgctatt ccgcttccca tttaaccgca ttcacatccc caagggcctt catgttattc 19620 cctgcaagag catacctccc tctgtgcctc gctctgtgca ctgtgcccgg aactaaactc 19680 acagaggatt taccattgtc tgaatcaaat ttctaatatg tgtgtgtgtg tgtgtgcgtg 19740 tgtgtttaaa tacagaaagt ggccaggtgt ggtggttcac gcctgtcatc tcagcacttt 19800 gggtggctga ggtgggagga ttgctcaatg ccaggagtct gaggtcagcc tgggcaacat 19860 agtgagacct cgtctctaaa aaatatttaa aaactagcct ggcatggtgt tttgtgtgcc 19920 tgtagcacca gctgctcaga agtctgaggt aggaggattg cttgagccca agagttcaag 19980 ggtgcagtga gttactacag tgccactgtg ctccagcctg agcaacagag caagacccta 20040 tctctaagta aataaataaa atacagaacg agttcggtat gcatcctcac attggattcc 20100 ttacttaggt cactttcagc gttggccaaa caaaaaggct ccagctgggg gtatatatat 20160 tccagggaag ttaagttggc caaactttcc gtttgctact tcagtatcct ccgagttgtt 20220 tccagacaca gttttgtgtg ctttttagtt ttggttttct tttttaatca atctgcagca 20280 cactcatgtt aaactcaaga acacatgtga ggccaagagt tcccgttacc tgtcacatat 20340 gggaatggag tagcagaaag cctagtttct gtcacagcta gttactggcg agattgagac 20400 tgagtccagc ggtcttcgtg tgtgtgtgtg cgtgtgtgtc tgtgcagtgt gcgtgtgtgt 20460 gcgtgtctgt gtgtgcgtgt gcgggtgtgt gcgtgtgtgt gtgttggagc acggagggag 20520 tgctcattca ttttttgtgt ataatggatt ttctttatag ggtgaatatg ttttttatcc 20580 cgaaaaatct taggataaaa tcactttttt ctacctaaat gtccatcatt ggcagaaaat 20640 attagtaata attaaacagc cacacacttc acaatgtctg ggaattattt ttagtaaagg 20700 aaatttcttt ccctctgttg tttgctcctt agggtagagt cacctaagat tttgcgtgtc 20760 tacagtggca ttttaaatca atctgaaata aaagaggaca catctttctt tggggttcaa 20820 gaaataataa tccatgatca gtataaaatg gcagaaagcg ggtatgatat tgccttgttg 20880 aaactggaaa ccacagtgaa ttacacaggt acggagaatt ttatccggaa agttgtctcc 20940 aatggtgaac tggataaaat gtttaacact actagactta cggcctgacc ctgccaatct 21000 ctccatgcgt tatcatcatg aaagggagag ggcctggaat gctagtcatt cactctgcta 21060 aggctgacac actttcctgg ctattgaaac ttattttggg aatgtgggta aagagatacg 21120 ttttcctgag tcttcttcag gtgcatagaa tgacataatt tcataatact ttggaatagt 21180 aaagataatt tagtctaaag ataatttatt aaagataatt tagggatgaa ggattgaagg 21240 ttagaacaat taagcaactt gtgcaggatc aaagtgagtt ggatgaggag ttagcggtga 21300 gggtgaggct tgtctctctc tcgccctctc atcctggcac atgtgcgata tcgtgctgaa 21360 cctgagggag gaaaatacac gacaacaagg caaaaaatga atatagtaaa caaagaaaac 21420 acagataatg tacagtggaa gaagagtctc ttctggaaaa gaggatatat tttgcgtctc 21480 atatttaaac cacgattttt taaatttaga ttctcaacga cccatatgcc tgccttccaa 21540 aggagataga aatgtaatat acactgattg ctgggtgact ggatgggggt acagaaaact 21600 aagaggtaaa aatgatgttg ttatatgtgc tccatcctag aaatgaagag cggaaccttt 21660 tctgccctgt caagtcatgt agctgaagca caactcgagt cacactactc agttgcagga 21720 agcggattaa taaagatgga gaggcaaaaa tcacccaagt gaggctggtg cctcatatgt 21780 ttgattggaa attttaaatg tgactaaatc tctttaaaga ctaattatat ttaatgaagt 21840 ttaatgtgaa gcctagcact tttcagtaaa tgttctagcc tgctatccaa ttactttctt 21900 gggaagtcat tccagttaga gtcataatta atttttgaac ttaattaaca ttaacaaaat 21960 ggtacacgca atagtgggaa taatgtcttc ttcatacttg taattataaa aggtctgtga 22020 agtaaatcta acattttttc cttctagatt tttatataga catgagtttt gtgttgttgt 22080 tgttttgaga tggactctcg ctctgtcgcc caggctggag tgcagtggca cgatctcggc 22140 tcactgttac ctccacctcc cgggttcaag tgattctcct gcctcagcct cccgagtagc 22200 tgggattata ggtacccaac caccacccca agctaatttt ttgtattttt agtagagacg 22260 gggtttcatc atgttagcca ggatggtctc aatctcctga cctcgtgatc cacctgcctc 22320 ggccttccaa agtgctggaa ttacaggcgt gagcccccac acccgtccat gatttttatt 22380 ttaaatatat gtggcccagc accactggtg gctcacgcct gtaatcccag cactttggga 22440 ggccaagatg ggtggatcac ttgaggtcag gagttcaaga ctggcctggc caacatggtg 22500 aaaccctgtc tctactaaaa atacaaaaat tagctgggca tggtggtgtg tgcctgtaat 22560 cccagctact cgggaggctg aggcaagata atcgcttgaa cttgggaggt ggaggtagca 22620 gtgagctgag attgcaccac tgcactccag cctgggcgac agaaagagac tccgtctcaa 22680 ttaaaaatat atatatatat atatttatat gtatgcatat atgtttatgt gtattgtgta 22740 tggttattct acaaacgaac caaaaaaatt tttttcagac aaaatacaaa atactctcca 22800 gaaagccaag atacccttag tgaccaacga agagtgccag aagagataca gaggacataa 22860 aataacccat aagatgatct gtgccggcta cagggaagga gggaaggacg cttgcaaggt 22920 aacagagtgt tcttagccaa tggaatatat gcaaattgga atgcttaatg cgttggggtt 22980 tttttgtttg ttttgttttt tttgtttgtt tttttttgag acagagtctc gctctgttgc 23040 ccaggctgga gtgcagtggc tcgatctcag ctcactgcaa gctctgcctc ccaggttcac 23100 gccattctcc tgcctcagcc tcccaaatag ctgggactac aggcgccagc taccaagccc 23160 agctagcgtc tttttttttt ttagttttag tagagacggg gtttcaccat gttggccagg 23220 atggtctcga tctcctgacc tcatgatctg cctgcctggg cctcccaaag tgctgggatt 23280 acaggcgtga gccaccgcgc cgggccgctt aatgcatttt aaaaagcagt cttctgccaa 23340 tgagcaggga acacagtgta tttgtttgac ttagactgaa atcaaaagca aggagattga 23400 ctggatgaac gcaagcaccc aggttctctg cagtatatta aggggccaag acaacatttt 23460 aggcaaaatc agcctgagca agatgtgctg aagatgggaa gcgtctgagt tgatctgtgc 23520 accttttctt gtctcccctc gttctaggga gattcgggag gccctctgtc ctgcaaacac 23580 aatgaggtct ggcatctggt aggcatcacg agctggggcg aaggctgtgc tcaaagggag 23640 cggccaggtg tttacaccaa cgtggtcgag tacgtggact ggattctgga gaaaactcaa 23700 gcagtgtgaa tgggttccca ggggccattg gagtccctga aggacccagg atttgctggg 23760 agagggtgtt gagttcactg tgccagcatg cttcctccac agtaacacgc tgaaggggct 23820 tggtgtttgt aagaaaatgc tagaagaaaa caaactgtca caagttgtta tgtccaaaac 23880 tcccgttcta tgatcgttgt agtttgtttg agcattcagt ctctttgttt ttgatcacgc 23940 ttctatggag tccaagaatt accataaggc aatatttctg aagattacta tataggcaga 24000 tatagcagaa aataaccaag tagtggcagt ggggatcagg cagaagaact ggtaaaagaa 24060 gccaccataa atagatttgt tcgatgaaag atgaaaactg gaagaaagga gaacaaagac 24120 agtcttcacc attttgcagg aatctacact ctgcctatgt gaacacattt cttttgtaaa 24180 gaaagaaatt gattgcattt aatggcagat tttcagaata gtcaggaatt cttgtcattt 24240 ccattttaaa atatatatta aaaaaaatca gttcgagtag acacgagcta agagtgaatg 24300 tgaagataac agaatttctg tgtggaagag gattacaagc agcaatttac ctggaagtga 24360 taccttaggg gcaatcttga agatacactt tcctgaaaaa tgatttgtga tggattgtat 24420 atttatttaa aatatcttgg gaggggaggc tgatggagat agggagcatg ctcaaacctc 24480 cctaagacaa gctgctgctg tgactatggg ctcccaaaga gctagatcgt atatttattt 24540 gacaaaaatc accatagact gcatccatac tacagagaaa aaacaattag ggcgcaaatg 24600 gatagttaca gtaaagtctt cagcaagcag ctgcctgtat tctaagcact gggattttct 24660 gtttcgtgca aatatttatc tcattattgt tgtgatctag ttcaataacc tagaatttga 24720 attgtcacca catagctttc aatctgtgcc aacaactata caattcatca agtgtgattt 24780 tttttttttt tttttgagat gaagtctcac cctgttgccc aagctggagt gcagtggtgt 24840 gatctcggct cactgtaaac tctacctcct ggattcaagc gattgtcctg cctcagtctc 24900 ccaagtagct gagattacag gcacatgcca ccatgcccgg ctaatttttg tatttttagt 24960 agagacgggg tttcactatg ttggccaggc tggtcttgaa ctcctgacct cgtgatctgc 25020 ccacctcggc ctctcaaagt gctgggatta caggtgtgag tcactgcgtc tggccatgga 25080 aaatatttat tgagcacaat tatgtgagag catcatgctg agctttgaag atacagtggt 25140 gagcaaacat atatcctggc ttcatgaaga ttatactcta gttaacatga gcaacaaaat 25200 aaaataatca cacaaaatat ataggttcaa gctgaaatga gtggctgcac cagattctat 25260 gagataagaa aggaagaagg acatttttca ccaagttcaa agactgggat acaaaggaat 25320 ttgtcctgac aaaggcaaaa caaaaacaac aacaaacaaa aaacccaaaa gagcaaaatg 25380 acagtagaac ataacggggc cagatcaaaa atgctgacag gttcccaaaa gaataaaatg 25440 acggtaggac atgacggggc cagatccaaa atgctgacag gttcaaacaa aattggaatt 25500 gaaaatcaga gtgcgttcaa gagtatcaaa caatactatc ttgttacttg cttattacct 25560 tagtagactg gaagcaacac ttcacacaaa aaaagggttt ggatgtaatt tcggataaga 25620 agagatgttt ctgtaaagtc tttcctgaga agcatattat ttgagaaaaa cacatatttc 25680 tgtttttagt atttcacttt gtataatgtc ttaatttttg aagagctggt atattcctat 25740 gattcattaa tgaaagttct ataagatata aaatatacaa tgaggagatc tcctcttctg 25800 taccagaaga gtgcacattc tacacactgc gtagcacctt tctcacttac gttctgtctg 25860 ggcacacttc tgattgacac gcagagggct ctctctgtct ggggatattt ctgatgggta 25920 ccgagagagc ttcctctatc ttgggttatt tctgatgcgt agagaagggc tgcctctgtc 25980 cattatggaa ggctggtgtt c 26001 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 cagcctggag catcgtaaca 20 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 tttatcgagc ttcgttattc tggtt 25 <210> 5 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 5 ttgtctactg aagcacaccc aaacaggga 29 <210> 6 <211> 2246 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 ggataccggc tcacgtagaa aaaggacaag actataggaa agaaagcaaa cactccgccg 60 aggactacag caaagacaga aagtatctgc aggatgacct cattacatca ggtgttatat 120 tttatctttt ttgcctcagt ttctagtgaa tgcgttacta aggtcttcaa agacatcagc 180 tttcaaggag gtgacctgag tactgttttc acaccgagcg ccacatactg ccgcttggtc 240 tgcactcacc acccacggtg cttgctcttc acgttcatgg ctgagtcatc ttcggatgat 300 cctaccaaat ggtttgcctg catcctgaag gacagcgtca cagaaatatt gccaatggta 360 aacatgacag gcgcgatctc tggatattcc ttcaagcaat gccctcagca attaagtact 420 tgcagcaaag atgtgtacgt gaacctagac atgaagggca tgaactataa cagctctgtc 480 gtgaagaatg ctcgagaatg ccaggagaga tgcacagacg atgcccactg ccagtttttc 540 acatacgcaa cagggtattt tcccagtgtg gaccatcgta aaatgtgtct tttgaagtac 600 acccgaacgg ggacgccaac cacaataacg aagctcaatg gcgtggtatc tggattttca 660 ctgaagtcct gtggactttc aaacttggct tgtatcaggg acattttccc taacacggtg 720 ctggcagacc ttaacattga cagcgtggtg gccccagatg cttttgtctg tcgtcgcatc 780 tgcacgcatc accccacttg tttgttcttc acattctttt cccaagcatg gccgaaagaa 840 tctcagagac atctttgtct ccttaaaacc tctgaaagtg gattaccaag cacacgcatt 900 acaaagagcc acgccctttc gggcttcagt ctccagcact gcaggcacag tgtcccagta 960 ttctgccatc cgtcctttta caacgacact gatttcttgg gagaagagct ggacatcgtc 1020 gatgtgaaag gccaagaaac ctgtcagaaa acgtgtacca ataacgcccg ctgccagttc 1080 tttacctact atccatcgca cagactgtgc aatgagagga accgcagggg cagatgttac 1140 ctaaagcttt cctccaatgg atctccaacg agaatacttc atgggagggg aggcatctct 1200 ggatactcac tgaggctgtg caaaatggat aatgtgtgca caactaaaat caaccccaga 1260 gtggtaggag gagctgcgtc tgttcacggt gagtggccat ggcaggtgac tctgcacatc 1320 agccagggac acctgtgtgg aggctccatc attggaaacc aatggatact gacagcagct 1380 cattgtttct ctgggataga gacacctaaa aagctgcgtg tctacggtgg cattgtaaat 1440 caatcagaaa taaatgaagg gactgctttc ttcagggttc aagaaatgat aattcatgat 1500 cagtatacga cagcagaaag tgggtatgat attgccctgt taaaactgga atcagccatg 1560 aattacacag attttcagcg gccaatatgc ctgccttcca aaggagatag aaacgcagtg 1620 cacacagaat gctgggtgac tggatggggg tacacagcac taagaggtga agtacaaagt 1680 actcttcaga aagccaaggt tccattggtg tcaaatgaag aatgtcagac aagatacaga 1740 agacacaaaa taaccaataa gatgatctgt gcaggctaca aagaaggagg gaaggatacg 1800 tgcaagggag attctggagg gcccctgtcc tgcaaataca atggggtctg gcacttggtg 1860 ggcatcacaa gctggggtga aggctgtggt cagaaggaga gaccgggggt ctacacgaac 1920 gtggccaagt acgtggactg gattctggag aaaactcaaa cagtctgaaa gagttcaact 1980 ggtatcactt tgtggccctg gaagattatt ccatagaaat gagcttgacg tctctgatga 2040 agacactggg atactgactc ttccactgta accaattgaa tggccttgat gtacgtaaga 2100 acacccagaa agaaaactat tattttcaga attcctgatc tgggagaacc actggttgtt 2160 ttctgcatcc agctactact caaggaaaca aatacagcaa ggagatttta aaaataaaaa 2220 cacatcagat atataaggaa aatatc 2246 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 acatgacagg cgcgatctct 20 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tctaggttca cgtacacatc tttgc 25 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 ttccttcaag caatgccctc agcaat 26 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 10 tcctggcatt ctcgagcatt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 11 tggtaatcca ctttcagagg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 12 aaggacctac actatggaat 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 13 cctctgaaag tggattacca 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 14 tcggaagcga ctcttatatg 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 15 ttcaaacaag tgacatacac 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 16 tgagagaatt gcttgctttc 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 17 aaatatacct tgagagaatt 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 18 agtatgtcag aaatatacct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 19 ttaaaatctt agtatgtcag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 20 cagcatattt gtgaaagtcg 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 21 tgtgtaggaa atggtcactt 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 22 tgcaattctt aataagggtg 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 23 aaatcatcct gaaaagacct 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 24 tgatataaga aaatcatcct 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 25 acacattcac cagaaactga 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 26 ttcaggacac aagtaaacca 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 27 ttcactcttg gcagtgtttc 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 28 aagaataccc agaaatcgct 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 29 cattgcttga aagaataccc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 30 ttggtgtgag cattgcttga 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 31 aatgtctttg ttgcaagcgc 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 32 ttcatgtcta ggtccacata 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 33 gtttatgccc ttcatgtcta 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 34 ccgtgcatct ttcttggcat 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 35 cgtgaaaaag tggcagtgga 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 36 agacaaatgt tacgatgctc 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 37 gtgcttcagt agacaaatgt 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 38 tgcacaggat ttcagtgaaa 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 39 gattagaaag tgcacaggat 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 40 ccgggatgat gagtgcagat 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 41 aaacaagcaa ccgggatgat 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 42 tcctgggaaa agaaggtaaa 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 43 attctttggg ccattcctgg 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 44 aaagatttct ttgagattct 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 45 aatccactct cagatgtttt 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 46 aaccagaaag agctttgctc 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 47 ggcagaacac tgggatgctg 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 48 tggtaaaatg aagaatggca 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 49 atcagtgtca tggtaaaatg 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 50 aacaatatcc agttcttctc 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 51 acagtttctg gcaggcctcg 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 52 gcattggtgc acagtttctg 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 53 gcagcggacg gcattggtgc 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 54 ttgaagaaag ctttaagtaa 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 55 agtattttag ttggagatcc 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 56 atgtgtatcc agagatgcct 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 57 gtacactcat tatccatttt 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 58 gattttggtg gtacactcat 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 59 tcctgggctt gattttggtg 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 60 ggccactcac cacgaacaga 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 61 tgtctctgag tgggtgaggt 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 62 gtttccaatg atggagcctc 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 63 atatccactg gtttccaatg 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 64 ccatagaaac agtgagcggc 20 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 65 tgactctacc ccatagaaac 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 66 cgcaaaatct taggtgactc 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 67 ttcagattga tttaaaatgc 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 68 tgaaccccaa agaaagatgt 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 69 tattatttct tgaaccccaa 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 70 aacaaggcaa tatcataccc 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 71 ttccagtttc aacaaggcaa 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 72 gaaggcaggc atatgggtcg 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 73 gtcactaagg gtatcttggc 20 <210> 74 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 74 agatcatctt atgggttatt 20 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 75 tagccggcac agatcatctt 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 76 ccagatgcca gacctcattg 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 77 cattcacact gcttgagttt 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 78 tggcacagtg aactcaacac 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 79 ctagcatttt cttacaaaca 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 80 ttatggtaat tcttggactc 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 81 aaatattgcc ttatggtaat 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 82 tatctgccta tatagtaatc 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 83 gccactactt ggttattttc 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 84 aacaaatcta tttatggtgg 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 85 ctgcaaaatg gtgaagactg 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 86 gtgtagattc ctgcaaaatg 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 87 ttttcaggaa agtgtatctt 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 88 cacaaatcat ttttcaggaa 20 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 89 tcccaagata ttttaaataa 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 90 aatgagataa atatttgcac 20 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 91 tgaaagctat gtggtgacaa 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 92 cacacttgat gaattgtata 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 93 taccttgaga gaattgcttg 20 <210> 94 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 94 gtcagaaata taccttgaga 20 <210> 95 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 95 atcttagtat gtcagaaata 20 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 96 gagtcacaca ttcaccagaa 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 97 gtgagcattg cttgaaagaa 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 98 cttatttggt gtgagcattg 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 99 acataaatgt ctttgttgca 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 100 ggtccacata aatgtctttg 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 101 gtctaggtcc acataaatgt 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 102 tgcccttcat gtctaggtcc 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 103 gttatagttt atgcccttca 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 104 tcagtagaca aatgttacga 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 105 tgggtgtgct tcagtagaca 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 106 agccagatta gaaagtgcac 20 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 107 agcaaccggg atgatgagtg 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 108 gccattcctg ggaaaagaag 20 <210> 109 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 109 ttgagattct ttgggccatt 20 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 110 actgaaacca gaaagagctt 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 111 agaatggcag aacactggga 20 <210> 112 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 112 tgtcatggta aaatgaagaa 20 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 113 aagaaatcag tgtcatggta 20 <210> 114 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 114 ggtgcacagt ttctggcagg 20 <210> 115 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 115 ggacggcatt ggtgcacagt 20 <210> 116 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 116 aactggcagc ggacggcatt 20 <210> 117 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 117 ccttaatgtg tatccagaga 20 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 118 tggtggtaca ctcattatcc 20 <210> 119 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 119 ggcttgattt tggtggtaca 20 <210> 120 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 120 aacgatcctg ggcttgattt 20 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 121 acaggtgtct ctgagtgggt 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 122 cactggtttc caatgatgga 20 <210> 123 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 123 ctaccccata gaaacagtga 20 <210> 124 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 124 ttaggtgact ctaccccata 20 <210> 125 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 125 agacacgcaa aatcttaggt 20 <210> 126 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 126 tttcttgaac cccaaagaaa 20 <210> 127 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 127 gtggtttcca gtttcaacaa 20 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 128 ttggctttct ggagagtatt 20 <210> 129 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 129 ggcacagatc atcttatggg 20 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 130 gattcctgca aaatggtgaa 20 <210> 131 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 131 gcagagtgta gattcctgca 20 <210> 132 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 132 atcatttttc aggaaagtgt 20 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 133 gtgagacaaa tcaagacttc 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 134 ttagtttact gacactaaga 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 135 ctgctttatg aaaaaccaac 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 136 atacctagta caatgtaaat 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 137 ggcttgtgtg tggtcaatat 20 <210> 138 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 138 tgggaaagct ttcaatattc 20 <210> 139 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 139 atggaattgt gcttatgagt 20 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 140 tttcaagctc aggatgggaa 20 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 141 gttggtaaaa tgcaaccaaa 20 <210> 142 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 142 tcaggacaca agtaaacctg 20 <210> 143 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 143 tgcaagctgg aaataaaagc 20 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 144 tgccaattta aaagtgtagc 20 <210> 145 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 145 atatttcaaa atccagtatg 20 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 146 ttctgaatat acaaattaat 20 <210> 147 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 147 tttactatga aaatctaaat 20 <210> 148 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 148 ggtatcctga gtgagatcta 20 <210> 149 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 149 ccagctatca ggaaaattcc 20 <210> 150 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 150 aaagctattg gagactcaga 20 <210> 151 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 151 atggaatctc ttcatttcat 20 <210> 152 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 152 atggagacat tcatttccac 20 <210> 153 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 153 gctctgagag ttccaattca 20 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 154 ctgggaaggt gaatttttag 20 <210> 155 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 155 tcaagagtct tcatgctacc 20 <210> 156 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 156 tcagtttacc tgggatgctg 20 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 157 gacattatac tcaccattat 20 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 158 gtataaatgt gtcaaattaa 20 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 159 gtaaagtttt accttaacct 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 160 ccataatgaa gaaggaaggg 20 <210> 161 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 161 ttaagttaca ttgtagacca 20 <210> 162 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 162 tgtgtgggtc ctgaaattct 20 <210> 163 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 163 atcttgtaat tacacacccc 20 <210> 164 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 164 gtacactctg caacagaagc 20 <210> 165 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 165 agggaataac atgaaggccc 20 <210> 166 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 166 atccagttca ccattggaga 20 <210> 167 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 167 ttttccagaa gagactcttc 20 <210> 168 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 168 gtcacattta aaatttccaa 20 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 169 ttaatatact gcagagaacc 20 <210> 170 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 170 agaaatatcc ccagacagag 20 <210> 171 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 171 aaatgtcttt gttgcaagcg 20 <210> 172 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 172 taaatgtctt tgttgcaagc 20 <210> 173 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 173 ataaatgtct ttgttgcaag 20 <210> 174 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 174 cataaatgtc tttgttgcaa 20 <210> 175 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 175 cacataaatg tctttgttgc 20 <210> 176 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 176 ccacataaat gtctttgttg 20 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 177 tccacataaa tgtctttgtt 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 178 gtccacataa atgtctttgt 20 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 179 aggtccacat aaatgtcttt 20 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 180 taggtccaca taaatgtctt 20 <210> 181 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 181 ctaggtccac ataaatgtct 20 <210> 182 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 182 tctaggtcca cataaatgtc 20 <210> 183 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 183 tgtctaggtc cacataaatg 20 <210> 184 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 184 atgtctaggt ccacataaat 20 <210> 185 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 185 catgtctagg tccacataaa 20 <210> 186 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 186 tcatgtctag gtccacataa 20 <210> 187 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 187 cttcatgtct aggtccacat 20 <210> 188 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 188 ccttcatgtc taggtccaca 20 <210> 189 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 189 cccttcatgt ctaggtccac 20 <210> 190 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 190 gcccttcatg tctaggtcca 20 <210> 191 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 191 atgcccttca tgtctaggtc 20 <210> 192 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 192 tatgcccttc atgtctaggt 20 <210> 193 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 193 ttatgccctt catgtctagg 20 <210> 194 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 194 tttatgccct tcatgtctag 20 <210> 195 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 195 tccgtgcatc tttcttggca 20 <210> 196 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 196 atccgtgcat ctttcttggc 20 <210> 197 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 197 catccgtgca tctttcttgg 20 <210> 198 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 198 tcatccgtgc atctttcttg 20 <210> 199 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 199 gtcatccgtg catctttctt 20 <210> 200 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 200 accgggatga tgagtgcaga 20 <210> 201 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 201 aaccgggatg atgagtgcag 20 <210> 202 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 202 caaccgggat gatgagtgca 20 <210> 203 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 203 gcaaccggga tgatgagtgc 20 <210> 204 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 204 gattctttgg gccattcctg 20 <210> 205 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 205 agattctttg ggccattcct 20 <210> 206 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 206 gagattcttt gggccattcc 20 <210> 207 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 207 tgagattctt tgggccattc 20 <210> 208 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 208 tttgagattc tttgggccat 20 <210> 209 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 209 ctttgagatt ctttgggcca 20 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 210 tctttgagat tctttgggcc 20 <210> 211 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 211 ttctttgaga ttctttgggc 20 <210> 212 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 212 tttctttgag attctttggg 20 <210> 213 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 213 cacagtttct ggcaggcctc 20 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 214 gcacagtttc tggcaggcct 20 <210> 215 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 215 tgcacagttt ctggcaggcc 20 <210> 216 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 216 gtgcacagtt tctggcaggc 20 <210> 217 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 217 tggtgcacag tttctggcag 20 <210> 218 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 218 ttggtgcaca gtttctggca 20 <210> 219 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 219 attggtgcac agtttctggc 20 <210> 220 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 220 cattggtgca cagtttctgg 20 <210> 221 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 221 ggcattggtg cacagtttct 20 <210> 222 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 222 cggcattggt gcacagtttc 20 <210> 223 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 223 acggcattgg tgcacagttt 20 <210> 224 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 224 gacggcattg gtgcacagtt 20 <210> 225 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 225 cggacggcat tggtgcacag 20 <210> 226 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 226 gcggacggca ttggtgcaca 20 <210> 227 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 227 agcggacggc attggtgcac 20 <210> 228 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 228 cagcggacgg cattggtgca 20 <210> 229 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 229 ggcagcggac ggcattggtg 20 <210> 230 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 230 tggcagcgga cggcattggt 20 <210> 231 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 231 ctggcagcgg acggcattgg 20 <210> 232 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 232 actggcagcg gacggcattg 20 <210> 233 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 233 tgcttgaagg aatatccaga 20 <210> 234 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 234 tagttcatgc ccttcatgtc 20 <210> 235 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 235 tgttatagtt catgcccttc 20 <210> 236 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 236 aatgtccctg atacaagcca 20 <210> 237 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 237 gggaaaatgt ccctgataca 20 <210> 238 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 238 tgtgcagagt cacctgccat 20 <210> 239 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 239 ttcttgaacc ctgaagaaag 20 <210> 240 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 240 tgaattatca tttcttgaac 20 <210> 241 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 241 tgatcatgaa ttatcatttc 20 <210> 242 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 242 agtttctggc aggcctcg 18 <210> 243 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 243 cagtttctgg caggcctc 18 <210> 244 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 244 acagtttctg gcaggcct 18 <210> 245 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 245 cacagtttct ggcaggcc 18 <210> 246 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 246 gcacagtttc tggcaggc 18 <210> 247 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 247 gtgcacagtt tctggcag 18 <210> 248 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 248 ggtgcacagt ttctggca 18 <210> 249 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 249 tggtgcacag tttctggc 18 <210> 250 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 250 ttggtgcaca gtttctgg 18 <210> 251 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 251 attggtgcac agtttctg 18 <210> 252 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 252 cattggtgca cagtttct 18 <210> 253 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 253 gcattggtgc acagtttc 18 <210> 254 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 254 ggcattggtg cacagttt 18 <210> 255 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 255 cggcattggt gcacagtt 18 <210> 256 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 256 acggcattgg tgcacagt 18 <210> 257 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 257 gacggcattg gtgcacag 18 <210> 258 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 258 ggacggcatt ggtgcaca 18 <210> 259 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 259 cggacggcat tggtgcac 18 <210> 260 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 260 gcggacggca ttggtgca 18 <210> 261 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 261 agcggacggc attggtgc 18 <210> 262 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 262 cagcggacgg cattggtg 18 <210> 263 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 263 gcagcggacg gcattggt 18 <210> 264 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 264 ggcagcggac ggcattgg 18 <210> 265 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 265 tggcagcgga cggcattg 18 <210> 266 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 266 ctggcagcgg acggcatt 18 <210> 267 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 267 tgcacagttt ctggcagg 18 <210> 268 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 268 cacagtttct ggcagg 16 <210> 269 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 269 acagtttctg gcag 14 <210> 270 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 270 gcgtttgctc ttcttcttgc gtttttt 27 <210> 271 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 271 acacgcatta aaaagagcaa agc 23 <210> 272 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 272 cagtgtcatg gtaaaatgaa gaatgg 26 <210> 273 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 273 tgcaggcaca gcatcccagt gttct 25 <210> 274 <211> 3275 <212> DNA <213> Macaca mulatta <220> <221> misc_feature <222> (1)...(3275) <223> n = A,T,C or G <400> 274 aggcacacag acaaaatcaa gctctacagc tgtctgtgtg tatgtcactt gtttgaatat 60 gaattaaaat taaaatataa attcaatgta ttgagaaagc aagcaattct ctcaaggtat 120 atttctgaca tactaagatt ttaacgactt tcacaaatat gctgcaccga gagacaatgt 180 tacacaacac tgagaaccag tacaagtaaa tattaaagtt aagtgaccat ttcctacaca 240 cgctcattca gaggaggatg aggatcaatt tggaagaaga aaaacaccct tattaagaat 300 tgcagcaaat aagcaaacga ggtcttttca ggatgatttt cttatatcaa atggtacatt 360 tcattctatt tacgtcagtt tctggtgaat gtgtgactcg gttgttcaag gacatccact 420 ttgaaggagg ggacattgct acggttttca caccaagcgc caagcactgc caggtggtct 480 gcactcacca cccacgatgt ctgctcttca ctttcacggg ggaatctgca tctgaggatc 540 ctacccagtg gtttacttgt gtcctgaagg acagtgttac agaaacactg ccaagagtga 600 ataggacagg agcgatttct gggtattctt tcaagcaatg ctcacaccaa ataagcgctt 660 gcaacaaaga catttatgtg gacctagaca tgaagggcat aaactataac agctcacttg 720 ccaagagtgc tcaagaatgc caagaaagat gcacggatga catccactgc cactttttca 780 cgtatgccac aaggcagttt cccagtctgg agcatcgtaa catttgtcta ctgaagcaca 840 cccaaacggg gacaccaacc ggaataatga agctcgataa agtggtgact ggattttcac 900 tgaaatcctg tgcactttct aatctggctt gtatcaggga cgttttcccc aacacggtgt 960 ttgcggacag caacatcgat agtgtcatgg ctccagatgc ctttgtctgt cgccggatct 1020 gcactcatca tcccggttgc ttgtttttta ccttcttttc ccaggaatgg cccaaagaat 1080 ctcaaagaaa tctttgtctc cttaaaacat ctgagagtgg attacccagt acacgcatta 1140 aaaagagcaa agctctttct ggtttcagtc tccaaagctg caggcacagc atcccagtgt 1200 tctgccattc ttcattttac catgacactg atttcttggg agaagaactg gatattgttg 1260 ctgtgaaagg tcacgaggcc tgccagaaac tgtgcaccaa tgccgtccgc tgccagtttt 1320 ttacctatgc cccagctcaa gcatcttgca acgaagggaa gggcaaatgt tacttaaagc 1380 tttcttcaaa tggatctcca actaaaatac ttcgcgggac aggaggcatc tctggataca 1440 cattaaggct gtgtaaaatg gataatgagt gtaccaccaa aatcaagccc aggatcgttg 1500 gaggaactgc atctgttcgt ggtgagtggc catggcaggt gactctgcac accacctcac 1560 ccactcagag acacctgtgt ggaggctcca tcattggaaa ccagtggata ttaacggccg 1620 ctcactgttt ctatggggta gagtcaccta agattttgcg tgtctacatt ggcattttaa 1680 atcaatctga aataaaagag gatacatctt tctttggggt tcaagaaata ataatccatg 1740 atcaatataa aatggcagaa agtgggtatg atattgcctt gttgaaactg gaaaccacag 1800 tgaattacac agattctcaa cgacccatat gcctgccttc aaaaggagat agaaatgtga 1860 tatacactga ctgctgggtg actggatggg ggtacagaaa attaagagac aaaatacaga 1920 atactctcca gaaagccaag atacccttag tgaccaatga cgagtgccag aagagataca 1980 gaggacataa aataacccat aagatgatct gtgccggcta cagggaagga gggaaggatg 2040 cttgcaagnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2100 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2160 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2220 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn 2280 nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnggc ttggtgctgg taggaaaatg 2340 ccagaagaaa acaaactgtc acaagctgtt atgtccaaag ctcccgttct atgatcattg 2400 tagtttgttt cagcatccag tgtctttgtt tctgatcacg cttctaagga gtccaagaat 2460 taccataagg caatatttct gatgattact atataggcag atatatcaga aaataaccaa 2520 gtagtggcag cagggatcag gtagaagaac tgataaaaga aaccaccata aatagatttg 2580 ttcaatgaaa aatgaaaact ggaagaaagg ataacaaaga cagtcttcac cattttgcag 2640 gaatctacac tctgcctgtg tgaacacatt tctttgtaaa gaaagaattt gattgcattt 2700 actggcagat tttcagaata gtcaggaatt catgttattt ccattttaaa acatgtttaa 2760 aaaaatcagt ttgagtagac acaagctaag agtgaatgtg aaggtaccag aatttctgta 2820 tggaagaggg tgacaagcag caatgtacct ggaagtggta ccttaggacc aatcttaaag 2880 atacactttc ctgaaaaatg atttgtgatg gatcgtatat ttatttaaaa tatcttggga 2940 gggagaggct gatggcgata gggaggcaag ctgaagcctc cataagacaa gctgctactg 3000 cgactgtggc ccccaaagag ctacaccgca tatttatttg acaaaagtca ccattgacta 3060 catccgtact acagagaaaa aacaatttgg gcacaaatgg atggttacag taaagtcttc 3120 agcaagcagc tccctgtatt ctaagtactg ggcttttctg tttggtgcaa atatttatct 3180 cattattgct gtgatctagt ccagtaacct agaatttgat ttgtcaccac atagctttca 3240 acctgtgcca acaattatac aattcatcaa gtgtg 3275

Claims (39)

  1. 인자 11 핵산에 상보적인 15개 내지 30개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 변형된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 화합물로서,
    상기 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기(nucleobase) 서열이 서열 1의 동일한 길이의 부분에 대해 100% 상보적이고,
    상기 핵염기 서열이 서열 1의 핵염기 1018 내지 1042 중 동일한 길이의 부분에 대해 100% 상보적인 15개 이상의 인접 핵염기 부분을 포함하며,
    상기 변형된 올리고뉴클레오티드가 갭머(gapmer)인 화합물.
  2. 제1항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열이 서열 40, 107, 200, 201, 202 또는 203의 18개 이상의 인접 핵염기를 포함하는 것인 화합물.
  3. 제1항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드의 핵염기 서열이 서열 40, 107, 200, 201, 202 또는 203의 20개의 인접 핵염기를 포함하는 것인 화합물.
  4. 제1항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가 18개 내지 24개, 19개 내지 22개, 또는 20개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 것인 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단일 가닥의 변형된 올리고뉴클레오티드로 구성된 화합물.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 뉴클레오시드간(internucleoside) 연결이 변형된 뉴클레오시드간 연결인 화합물.
  7. 제6항에 있어서, 각각의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 화합물.
  8. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 뉴클레오시드가 변형된 당을 포함하는 것인 화합물.
  9. 제8항에 있어서, 1개 이상의 변형된 당이 비시클릭 당인 화합물.
  10. 제9항에 있어서, 1개 이상의 비시클릭 당 각각이 4'-(CH2)n-O-2' 다리를 포함하며, 식 중, n은 1 또는 2인 화합물.
  11. 제9항에 있어서, 1개 이상의 비시클릭 당 각각이 4'-CH(CH3)-O-2' 다리를 포함하는 것인 화합물.
  12. 제8항에 있어서, 1개 이상의 변형된 당이 2'-O-메톡시에틸 기를 포함하는 것인 화합물.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 테트라히드로피란 고리가 푸라노스 고리를 교체하는 1개 이상의 테트라히드로피란-변형 뉴클레오시드를 포함하는 화합물.
  14. 제13항에 있어서, 1개 이상의 테트라히드로피란-변형 뉴클레오시드 각각이 하기의 구조를 갖는 것인 화합물:
    Figure 112018059464427-pat00203

    식 중, Bx는 임의적으로 보호된 헤테로시클릭 염기 모이어티(moiety)이다.
  15. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 1개 이상의 뉴클레오시드가 변형된 핵염기를 포함하는 것인 화합물.
  16. 제15항에 있어서, 변형된 핵염기가 5-메틸시토신인 화합물.
  17. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가
    연결된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 절편;
    연결된 뉴클레오시드로 구성된 5' 윙 절편;
    연결된 뉴클레오시드로 구성된 3' 윙 절편
    을 포함하고, 이때 갭 절편이 5' 윙 절편과 3' 윙 절편에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하고, 각각의 윙 절편의 각각의 뉴클레오시드가 변형된 당을 포함하는 것인 화합물.
  18. 제17항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가
    10개의 연결된 데옥시뉴클레오시드로 구성된 갭 절편;
    5개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 5' 윙 절편;
    5개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 3' 윙 절편
    을 포함하고, 이때 갭 절편이 5' 윙 절편과 3' 윙 절편에 바로 인접하여 이들 사이에 위치하고, 각각의 윙 절편의 각각의 뉴클레오시드가 2'-O-메톡시에틸 당을 포함하며, 각각의 뉴클레오시드간 연결이 포스포로티오에이트 뉴클레오시드간 연결인 화합물.
  19. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가 20개의 연결된 뉴클레오시드로 구성된 것인 화합물.
  20. 제18항에 있어서, 변형된 올리고뉴클레오티드가 하나 이상의 시토신을 포함하고, 각각의 시토신이 5-메틸시토신인 화합물.
  21. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 접합된 안티센스 화합물인 화합물.
  22. 제18항에 있어서, 접합된 안티센스 화합물인 화합물.
  23. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 제약상 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는, 동물에서 혈전색전성 합병증의 치료 또는 예방 또는 전-혈전성 응고 장애의 치료에 사용하기 위한 제약 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 제약상 허용가능한 희석제가 포스페이트-완충 염수(PBS)인 제약 조성물.
  25. 제23항에 있어서, 화합물의 변형된 올리고뉴클레오티드가 염인 제약 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 염이 나트륨 염인 제약 조성물.
  27. 제23항에 있어서, 혈전색전성 합병증이 심부 정맥 혈전증, 폐 색전증, 심근 경색증 및 졸중으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  28. 제23항에 있어서, 동물이 인간인 제약 조성물.
  29. 제23항에 있어서, 화합물이 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰, 헤파린, 레피루딘, 티클로피딘, 와파린, 아픽사반, 리바록사반, 로베녹스(LOVENOX), 및 인자 Xa 억제제로부터 선택된 군 중 어느 것과의 공동투여를 위한 것인 제약 조성물.
  30. 제23항에 있어서, 화합물이 아스피린, 클로피도그렐, 디피리다몰, 헤파린, 레피루딘, 티클로피딘, 와파린, 아픽사반, 리바록사반, 로베녹스, 및 인자 Xa 억제제로부터 선택된 군 중 어느 것과의 동시 투여를 위한 것인 제약 조성물.
  31. 제23항에 있어서, 화합물이 항-혈소판 요법과의 공동투여를 위한 것인 제약 조성물.
  32. 제31항에 있어서, 항-혈소판 요법이 ADP 수용체/P2Y12 억제제, NSAID, 포스포디에스테라제(phosphodiesterase) 억제제, 당단백질 IIB/IIIA 억제제 또는 아데노신 재흡수 억제제 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것인 제약 조성물.
  33. 제32항에 있어서, NSAID가 아스피린, 나프록센 또는 이들의 조합인 제약 조성물.
  34. 제32항에 있어서, ADP 수용체/P2Y12 억제제가 티에노피리딘인 제약 조성물.
  35. 삭제
  36. 삭제
  37. 삭제
  38. 삭제
  39. 삭제
KR1020177023938A 2008-10-15 2009-10-15 인자 １１ 발현의 조정 Active KR101979134B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US10577208P 2008-10-15 2008-10-15
US61/105,772 2008-10-15
US17446109P 2009-04-30 2009-04-30
US61/174,461 2009-04-30
PCT/US2009/060922 WO2010045509A2 (en) 2008-10-15 2009-10-15 Modulation of factor 11 expression

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117010915A Division KR101773551B1 (ko) 2008-10-15 2009-10-15 인자 １１ 발현의 조정

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170101324A KR20170101324A (ko) 2017-09-05
KR101979134B1 true KR101979134B1 (ko) 2019-05-15

Family

ID=42107256

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177023938A Active KR101979134B1 (ko) 2008-10-15 2009-10-15 인자 １１ 발현의 조정
KR1020117010915A Active KR101773551B1 (ko) 2008-10-15 2009-10-15 인자 １１ 발현의 조정

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020117010915A Active KR101773551B1 (ko) 2008-10-15 2009-10-15 인자 １１ 발현의 조정

Country Status (23)

Country Link
US (7) US8334372B2 (ko)
EP (2) EP3335715A3 (ko)
JP (4) JP5809058B2 (ko)
KR (2) KR101979134B1 (ko)
CN (4) CN102245186B (ko)
AU (2) AU2009305636A1 (ko)
BR (1) BRPI0920263B1 (ko)
CA (2) CA2740785C (ko)
CY (1) CY1119909T1 (ko)
DK (1) DK2379084T3 (ko)
ES (1) ES2657679T3 (ko)
HR (1) HRP20171969T1 (ko)
HU (1) HUE035888T2 (ko)
IL (2) IL212267A (ko)
LT (1) LT2379084T (ko)
MX (1) MX2011004097A (ko)
NO (1) NO2379084T3 (ko)
NZ (2) NZ592203A (ko)
PL (1) PL2379084T3 (ko)
PT (1) PT2379084T (ko)
RU (2) RU2535964C2 (ko)
SI (1) SI2379084T1 (ko)
WO (1) WO2010045509A2 (ko)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5809058B2 (ja) * 2008-10-15 2015-11-10 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 第１１因子発現の調節
NZ595891A (en) * 2009-04-15 2013-06-28 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of inflammatory responses by factor xi
US9150864B2 (en) * 2010-11-08 2015-10-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating factor 12 expression
TW201303013A (zh) * 2011-04-21 2013-01-16 Isis Pharmaceuticals Inc Ｂ型肝炎病毒（ｈｂｖ）表現之調節
SI3505528T1 (sl) 2011-04-21 2021-04-30 Glaxo Group Limited Modulacija izražanja virusa hepatitisa B (HBV)
WO2012170947A2 (en) 2011-06-10 2012-12-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for modulating factor 12 expression
AU2012327227A1 (en) * 2011-11-07 2013-05-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Administration of Factor XI antisense oligonucleotides
US10502737B2 (en) 2012-05-25 2019-12-10 The University Of Vermont And State Agriculture College Anti-thrombotic compositions and methods for assaying platelet reactivity and treatment selection
ES2730015T3 (es) 2013-05-01 2019-11-07 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para modular expresión de HBV y de TTR
JP6667453B2 (ja) 2014-05-01 2020-03-18 アイオーニス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッドＩｏｎｉｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ． 成長ホルモン受容体発現を調節するための組成物及び方法
WO2015179693A1 (en) 2014-05-22 2015-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated antisense compounds and their use
US9988443B2 (en) 2014-08-07 2018-06-05 Novartis Ag Angiopoetin-like 4 (ANGPTL4) antibodies and methods of use
KR102659872B1 (ko) 2014-08-07 2024-04-24 노파르티스 아게 안지오포이에틴-유사 4 항체 및 사용 방법
JOP20200312A1 (ar) 2015-06-26 2017-06-16 Novartis Ag الأجسام المضادة للعامل xi وطرق الاستخدام
TW201802121A (zh) 2016-05-25 2018-01-16 諾華公司 抗因子XI/XIa抗體之逆轉結合劑及其用途
US11400161B2 (en) 2016-10-06 2022-08-02 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Method of conjugating oligomeric compounds
WO2018102397A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
AU2017383232B2 (en) 2016-12-23 2024-09-12 Novartis Ag Factor XI antibodies and methods of use
AU2018377716B2 (en) 2017-12-01 2024-12-19 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd Nucleic acid, composition and conjugate comprising the same, and preparation method and use thereof
CN110997917B (zh) 2017-12-01 2024-04-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
WO2019105418A1 (zh) 2017-12-01 2019-06-06 苏州瑞博生物技术有限公司 双链寡核苷酸、含双链寡核苷酸的组合物与缀合物及制备方法和用途
US11414665B2 (en) 2017-12-01 2022-08-16 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Nucleic acid, composition and conjugate comprising the same, and preparation method and use thereof
AU2018394875B2 (en) 2017-12-29 2023-08-03 Suzhou Ribo Life Science Co., Ltd. Conjugates and preparation and use thereof
CA3097718A1 (en) * 2018-04-20 2019-10-24 The University Of Vermont And State Agriculture College Compositions and methods for treating cardiovascular disease in selected patients
BR112020020957B1 (pt) 2018-05-09 2022-05-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc Compostos oligoméricos, população e composição farmacêutica dos mesmos e seus usos
CN111655849B (zh) 2018-08-21 2024-05-10 苏州瑞博生物技术股份有限公司 一种核酸、含有该核酸的药物组合物和缀合物及其用途
CN111655297A (zh) 2018-09-30 2020-09-11 苏州瑞博生物技术有限公司 一种siRNA缀合物及其制备方法和用途
CN113227376B (zh) * 2019-05-22 2024-04-09 苏州瑞博生物技术股份有限公司 核酸、药物组合物与缀合物及制备方法和用途
TW202229549A (zh) * 2020-08-04 2022-08-01 大陸商上海拓界生物醫藥科技有限公司 抑制凝血因子ｘｉ表達的ｓｉｒｎａ、組成物及其醫藥用途
AU2021401424A1 (en) 2020-12-18 2023-06-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for modulating factor xii
BR112023021231A2 (pt) * 2021-04-13 2024-01-09 Sirnaomics Inc Produtos e composições
TW202340466A (zh) * 2021-12-16 2023-10-16 大陸商上海拓界生物醫藥科技有限公司 一種ｄｓｒｎａ、其製備方法及應用
WO2023109938A1 (zh) * 2021-12-16 2023-06-22 上海拓界生物医药科技有限公司 一种dsRNA、其制备方法及应用
TW202446954A (zh) * 2023-05-19 2024-12-01 大陸商上海舶望製藥有限公司 抑制凝血因子xi(fxi)表達的組合物和方法
WO2025045194A1 (zh) * 2023-08-31 2025-03-06 正大天晴药业集团股份有限公司 靶向凝血因子xi的双链核糖核酸

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060063730A1 (en) * 2004-09-17 2006-03-23 Monia Brett P Enhanced antisense oligonucleotides
US20080015162A1 (en) * 2006-05-05 2008-01-17 Sanjay Bhanot Compounds and methods for modulating gene expression
US20080219998A1 (en) * 2001-12-07 2008-09-11 Andras Gruber Anti-Thrombotic Agents

Family Cites Families (190)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US5132418A (en) 1980-02-29 1992-07-21 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4500707A (en) 1980-02-29 1985-02-19 University Patents, Inc. Nucleosides useful in the preparation of polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4415732A (en) 1981-03-27 1983-11-15 University Patents, Inc. Phosphoramidite compounds and processes
US4973679A (en) 1981-03-27 1990-11-27 University Patents, Inc. Process for oligonucleo tide synthesis using phosphormidite intermediates
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
DE3329892A1 (de) 1983-08-18 1985-03-07 Köster, Hubert, Prof. Dr., 2000 Hamburg Verfahren zur herstellung von oligonucleotiden
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
USRE34036E (en) 1984-06-06 1992-08-18 National Research Development Corporation Data transmission using a transparent tone-in band system
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
EP0260032B1 (en) 1986-09-08 1994-01-26 Ajinomoto Co., Inc. Compounds for the cleavage at a specific position of RNA, oligomers employed for the formation of said compounds, and starting materials for the synthesis of said oligomers
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
JP2828642B2 (ja) 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
ATE151467T1 (de) 1987-11-30 1997-04-15 Univ Iowa Res Found Durch modifikationen an der 3'-terminalen phosphodiesterbindung stabilisierte dna moleküle, ihre verwendung als nukleinsäuresonden sowie als therapeutische mittel zur hemmung der expression spezifischer zielgene
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5194599A (en) 1988-09-23 1993-03-16 Gilead Sciences, Inc. Hydrogen phosphonodithioate compositions
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5721218A (en) 1989-10-23 1998-02-24 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
WO1991006556A1 (en) 1989-10-24 1991-05-16 Gilead Sciences, Inc. 2' modified oligonucleotides
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US7101993B1 (en) 1990-01-11 2006-09-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides containing 2′-O-modified purines
US6005087A (en) 1995-06-06 1999-12-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5859221A (en) 1990-01-11 1999-01-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-modified oligonucleotides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5457191A (en) 1990-01-11 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
ATE167523T1 (de) 1990-05-11 1998-07-15 Microprobe Corp Teststreifen zum eintauchen für nukleinsäure- hybridisierungsassays und verfahren zur kovalenten immobilisierung von oligonucleotiden
US5386023A (en) 1990-07-27 1995-01-31 Isis Pharmaceuticals Backbone modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through reductive coupling
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
US5223618A (en) 1990-08-13 1993-06-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5614617A (en) 1990-07-27 1997-03-25 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant, pyrimidine modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5378825A (en) 1990-07-27 1995-01-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs
ES2083593T3 (es) 1990-08-03 1996-04-16 Sterling Winthrop Inc Compuestos y metodos para inhibir la expresion de genes.
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
WO1992005186A1 (en) 1990-09-20 1992-04-02 Gilead Sciences Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
US6582908B2 (en) * 1990-12-06 2003-06-24 Affymetrix, Inc. Oligonucleotides
US5948903A (en) 1991-01-11 1999-09-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Synthesis of 3-deazapurines
US5672697A (en) 1991-02-08 1997-09-30 Gilead Sciences, Inc. Nucleoside 5'-methylene phosphonates
FR2676231A1 (fr) * 1991-05-07 1992-11-13 Aetsrn Concentre de facteur xi de la coagulation sanguine a haute activite specifique, approprie a usage therapeutique et son procede de preparation.
US7015315B1 (en) 1991-12-24 2006-03-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligonucleotides
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US5594121A (en) 1991-11-07 1997-01-14 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified purines
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
TW393513B (en) 1991-11-26 2000-06-11 Isis Pharmaceuticals Inc Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
AU3222793A (en) 1991-11-26 1993-06-28 Gilead Sciences, Inc. Enhanced triple-helix and double-helix formation with oligomers containing modified pyrimidines
US5792608A (en) 1991-12-12 1998-08-11 Gilead Sciences, Inc. Nuclease stable and binding competent oligomers and methods for their use
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
GB9304620D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Compounds
EP0691968B1 (en) 1993-03-30 1997-07-16 Sanofi Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
AU6412794A (en) 1993-03-31 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
US5801154A (en) * 1993-10-18 1998-09-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense oligonucleotide modulation of multidrug resistance-associated protein
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
EP0733059B1 (en) 1993-12-09 2000-09-13 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
WO1995017420A1 (en) * 1993-12-22 1995-06-29 Temple University - Of The Commonwealth System Of Higher Education Peptide analogs of the activated platelet binding site on factor xi
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5646269A (en) 1994-04-28 1997-07-08 Gilead Sciences, Inc. Method for oligonucleotide analog synthesis
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
AU1039397A (en) 1995-11-22 1997-06-27 Johns Hopkins University, The Ligands to enhance cellular uptake of biomolecules
US6770748B2 (en) 1997-03-07 2004-08-03 Takeshi Imanishi Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogue
USRE44779E1 (en) 1997-03-07 2014-02-25 Santaris Pharma A/S Bicyclonucleoside and oligonucleotide analogues
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
CA2303299C (en) 1997-09-12 2016-02-23 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US20030228597A1 (en) * 1998-04-13 2003-12-11 Cowsert Lex M. Identification of genetic targets for modulation by oligonucleotides and generation of oligonucleotides for gene modulation
EP1084270B1 (en) 1998-06-08 2004-08-25 The University Of Vermont And State Agricultural College Methods for assaying clotting in plasma
US6300319B1 (en) 1998-06-16 2001-10-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Targeted oligonucleotide conjugates
US6043352A (en) 1998-08-07 2000-03-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-Dimethylaminoethyloxyethyl-modified oligonucleotides
RU2292351C2 (ru) * 1999-03-18 2007-01-27 Мерк Патент Гмбх Полипептид с биологической активностью ингибитора индуцируемой коллагеном адгезии тромбоцитов, его получение и применение
KR100782896B1 (ko) 1999-05-04 2007-12-06 엑시콘 에이/에스 Ｌ-리보-ｌｎａ 유사체
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
US7491805B2 (en) 2001-05-18 2009-02-17 Sirna Therapeutics, Inc. Conjugates and compositions for cellular delivery
US6426220B1 (en) 2000-10-30 2002-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
AU2002217980A1 (en) 2000-12-01 2002-06-11 Cell Works Inc. Conjugates of glycosylated/galactosylated peptide
DE10111925A1 (de) * 2001-03-13 2002-10-02 Ogham Gmbh Herzchip
US20030158403A1 (en) 2001-07-03 2003-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
JP2005504020A (ja) 2001-07-03 2005-02-10 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド ヌクレアーゼ耐性キメラオリゴヌクレオチド
US20030175906A1 (en) 2001-07-03 2003-09-18 Muthiah Manoharan Nuclease resistant chimeric oligonucleotides
US20030040480A1 (en) * 2001-07-20 2003-02-27 Rasmus Rojkjaer Pharmaceutical composition comprising factor VII polypeptides and factor XI polypeptides
US20040142325A1 (en) 2001-09-14 2004-07-22 Liat Mintz Methods and systems for annotating biomolecular sequences
US7176303B2 (en) 2003-11-06 2007-02-13 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of STAT5 expression
EP2957568B1 (en) 2002-11-05 2016-12-21 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Compositions comprising alternating 2'-modified nucleosides for use in gene modulation
EP1562971B1 (en) 2002-11-05 2014-02-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
EP2213738B1 (en) * 2002-11-14 2012-10-10 Dharmacon, Inc. siRNA molecules targeting Bcl-2
US7144999B2 (en) * 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US20040180855A1 (en) 2003-02-19 2004-09-16 Schumacher William A. Methods of treating thrombosis with reduced risk of increased bleeding times
US7723509B2 (en) 2003-04-17 2010-05-25 Alnylam Pharmaceuticals IRNA agents with biocleavable tethers
EP1661905B9 (en) 2003-08-28 2012-12-19 IMANISHI, Takeshi Novel artificial nucleic acids of n-o bond crosslinkage type
JP5379347B2 (ja) 2003-09-18 2013-12-25 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド ４’−チオヌクレオシドおよびオリゴマー化合物
US20050181978A1 (en) * 2003-11-20 2005-08-18 Rasmus Rojkjaer Therapeutic use of factor XI
AU2005238490B2 (en) 2004-04-22 2010-11-18 Tobira Therapeutics, Inc. Improved modulators of coagulation factors
JPWO2005116204A1 (ja) * 2004-05-11 2008-06-19 株式会社アルファジェン Ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチド、および、これを用いた遺伝子発現抑制方法
US8394947B2 (en) * 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
EP1815021A2 (en) 2004-11-03 2007-08-08 Almac Diagnostics Limited Transcriptome microarray technology and methods of using the same
US20060148740A1 (en) 2005-01-05 2006-07-06 Prosensa B.V. Mannose-6-phosphate receptor mediated gene transfer into muscle cells
US7512842B2 (en) * 2005-08-29 2009-03-31 Searete Llc Multi-voltage synchronous systems
WO2007027894A2 (en) * 2005-08-29 2007-03-08 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds having enhanced anti-microrna activity
WO2007059966A1 (en) * 2005-11-23 2007-05-31 Georg Dewald Detection and treatment of drug associated angioedema
ES2453380T3 (es) * 2006-01-26 2014-04-07 Isis Pharmaceuticals, Inc. Composiciones y utilizaciones dirigidas hacia la huntingtina
PL2314594T3 (pl) 2006-01-27 2014-12-31 Isis Pharmaceuticals Inc Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
WO2007134181A2 (en) 2006-05-11 2007-11-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
US20080021999A1 (en) * 2006-07-18 2008-01-24 Aspect Software, Inc. Remote expert screen pop via data message
US20080021998A1 (en) 2006-07-20 2008-01-24 Rachel Wentink Presence-based resource locator
AU2007310989B2 (en) 2006-10-18 2014-05-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense compounds
JP2010510807A (ja) * 2006-11-27 2010-04-08 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 高コレステロール血症を治療するための方法
US7521213B2 (en) 2006-12-01 2009-04-21 Quest Diagnostics Investments Incorporated Sample processing for nucleic acid amplification
EP2125852B1 (en) 2007-02-15 2016-04-06 Ionis Pharmaceuticals, Inc. 5'-substituted-2'-f modified nucleosides and oligomeric compounds prepared therefrom
CA2688321A1 (en) 2007-05-30 2008-12-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-substituted-aminomethylene bridged bicyclic nucleic acid analogs
ES2386492T3 (es) 2007-06-08 2012-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Análogos de ácidos nucleicos bicíclicos carbocíclicos
ATE538127T1 (de) 2007-07-05 2012-01-15 Isis Pharmaceuticals Inc 6-disubstituierte bicyclische nukleinsäureanaloga
JP5572090B2 (ja) 2007-08-15 2014-08-13 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド テトラヒドロピラン核酸類似体
US8546556B2 (en) 2007-11-21 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc Carbocyclic alpha-L-bicyclic nucleic acid analogs
AU2008326348B2 (en) 2007-11-21 2014-01-30 Oregon Health & Science University Anti-factor XI monoclonal antibodies and methods of use thereof
CN102006890A (zh) 2007-12-04 2011-04-06 阿尔尼拉姆医药品有限公司 靶向脂质
EP2265627A2 (en) 2008-02-07 2010-12-29 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexitol nucleic acid analogs
WO2010036698A1 (en) 2008-09-24 2010-04-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted alpha-l-bicyclic nucleosides
JP5809058B2 (ja) 2008-10-15 2015-11-10 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド 第１１因子発現の調節
NZ595891A (en) * 2009-04-15 2013-06-28 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of inflammatory responses by factor xi
WO2011017521A2 (en) 2009-08-06 2011-02-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bicyclic cyclohexose nucleic acid analogs
US10913767B2 (en) 2010-04-22 2021-02-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides comprising acyclic and abasic nucleosides and analogs
US9290760B2 (en) 2010-09-15 2016-03-22 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Modified iRNA agents
EP3467109A1 (en) 2011-02-08 2019-04-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
DK2751270T3 (en) 2011-08-29 2018-10-29 Ionis Pharmaceuticals Inc OLIGOMER-CONJUGATE COMPLEXES AND THEIR USE
AU2012327227A1 (en) 2011-11-07 2013-05-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Administration of Factor XI antisense oligonucleotides
EP3336189A1 (en) 2012-04-20 2018-06-20 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleotides and uses thereof
US9695418B2 (en) 2012-10-11 2017-07-04 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds comprising bicyclic nucleosides and uses thereof
NZ708171A (en) 2012-11-15 2019-11-29 Roche Innovation Ct Copenhagen As Oligonucleotide conjugates
ES2730015T3 (es) 2013-05-01 2019-11-07 Ionis Pharmaceuticals Inc Composiciones y métodos para modular expresión de HBV y de TTR
WO2015188194A1 (en) 2014-06-06 2015-12-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for enhanced intestinal absorption of conjugated oligomeric compounds
BR112020020957B1 (pt) 2018-05-09 2022-05-10 Ionis Pharmaceuticals, Inc Compostos oligoméricos, população e composição farmacêutica dos mesmos e seus usos

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080219998A1 (en) * 2001-12-07 2008-09-11 Andras Gruber Anti-Thrombotic Agents
US20060063730A1 (en) * 2004-09-17 2006-03-23 Monia Brett P Enhanced antisense oligonucleotides
US20080015162A1 (en) * 2006-05-05 2008-01-17 Sanjay Bhanot Compounds and methods for modulating gene expression

Also Published As

Publication number Publication date
US11376273B2 (en) 2022-07-05
IL244116A0 (en) 2016-04-21
CN102245186B (zh) 2014-08-27
US8334372B2 (en) 2012-12-18
IL212267A (en) 2016-02-29
CN104212799B (zh) 2018-11-23
EP2379084B1 (en) 2017-11-22
CN103820450A (zh) 2014-05-28
EP2379084A4 (en) 2012-06-06
AU2017202862B2 (en) 2018-09-20
JP6397517B2 (ja) 2018-09-26
CN102245186A (zh) 2011-11-16
NZ603603A (en) 2014-06-27
RU2014134408A (ru) 2016-03-20
BRPI0920263A2 (pt) 2016-07-12
CA2966011A1 (en) 2010-04-22
PL2379084T3 (pl) 2018-04-30
BRPI0920263B1 (pt) 2021-09-21
MX2011004097A (es) 2011-07-28
NO2379084T3 (ko) 2018-04-21
US20210169921A1 (en) 2021-06-10
KR20110081294A (ko) 2011-07-13
CA2740785C (en) 2017-06-20
RU2535964C2 (ru) 2014-12-20
IL212267A0 (en) 2011-06-30
HUE035888T2 (en) 2018-05-28
US10772906B2 (en) 2020-09-15
NZ592203A (en) 2013-01-25
EP3335715A3 (en) 2018-08-08
JP2012505660A (ja) 2012-03-08
CN104212799A (zh) 2014-12-17
SI2379084T1 (en) 2018-04-30
RU2739594C2 (ru) 2020-12-28
CY1119909T1 (el) 2018-06-27
CN109797150A (zh) 2019-05-24
JP2018199700A (ja) 2018-12-20
JP2015211685A (ja) 2015-11-26
IL244116B (en) 2019-03-31
HRP20171969T1 (hr) 2018-04-06
KR101773551B1 (ko) 2017-08-31
ES2657679T3 (es) 2018-03-06
US20130274308A1 (en) 2013-10-17
DK2379084T3 (en) 2018-01-22
AU2009305636A1 (en) 2010-04-22
CA2966011C (en) 2021-10-19
AU2017202862A1 (en) 2017-05-18
PT2379084T (pt) 2018-02-19
LT2379084T (lt) 2018-03-26
KR20170101324A (ko) 2017-09-05
US20130190384A1 (en) 2013-07-25
WO2010045509A2 (en) 2010-04-22
US20170035798A1 (en) 2017-02-09
JP5809058B2 (ja) 2015-11-10
JP6084255B2 (ja) 2017-02-22
US20230263822A1 (en) 2023-08-24
EP2379084A2 (en) 2011-10-26
JP2017099395A (ja) 2017-06-08
US20200000839A1 (en) 2020-01-02
CN103820450B (zh) 2018-08-21
JP6633155B2 (ja) 2020-01-22
US20100137414A1 (en) 2010-06-03
WO2010045509A3 (en) 2010-07-15
RU2011119479A (ru) 2012-11-27
CA2740785A1 (en) 2010-04-22
EP3335715A2 (en) 2018-06-20
US8735370B2 (en) 2014-05-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2017202862B2 (en) Modulation of factor 11 expression
CN106459972B (zh) 用于调节sod-1表达的组合物
KR101840512B1 (ko) Gcgr 발현의 안티센스 조절
KR20160054595A (ko) 보체 인자 b의 조절자
KR20180026798A (ko) 트랜스티레틴 발현의 조절
KR20210008498A (ko) Fxi 발현을 감소시키기 위한 화합물 및 방법
JP2011502515A (ja) 第９因子発現の調節
KR20140014365A (ko) 인자 ｘｉ에 의한 염증 반응의 조정
HK1162320A (en) Modulation of factor 11 expression
HK1162320B (en) Modulation of factor 11 expression
KR20250113519A (ko) Sod-1 발현을 조절하기 위한 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
A107 Divisional application of patent
PA0104 Divisional application for international application

Comment text: Divisional Application for International Patent

Patent event code: PA01041R01D

Patent event date: 20170825

Application number text: 1020117010915

Filing date: 20110513

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20170922

Comment text: Request for Examination of Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20171218

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20181026

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20171218

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

AMND Amendment
PX0901 Re-examination

Patent event code: PX09011S01I

Patent event date: 20181026

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20180618

Comment text: Amendment to Specification, etc.

PX0701 Decision of registration after re-examination

Patent event date: 20190225

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PX07013S01D

Patent event date: 20190124

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20181026

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX07011S01I

Patent event date: 20180618

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

X701 Decision to grant (after re-examination)
GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20190509

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20190509

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20220329

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20230329

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20240328

Start annual number: 6

End annual number: 6