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KR101960016B1 - 호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법 - Google Patents

호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법 Download PDF

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KR101960016B1
KR101960016B1 KR1020180041250A KR20180041250A KR101960016B1 KR 101960016 B1 KR101960016 B1 KR 101960016B1 KR 1020180041250 A KR1020180041250 A KR 1020180041250A KR 20180041250 A KR20180041250 A KR 20180041250A KR 101960016 B1 KR101960016 B1 KR 101960016B1
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KR
South Korea
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primer
nucleic acid
seq
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sequence
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KR1020180041250A
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한재익
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전북대학교 산학협력단
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Abstract

일 양상에 따른 호흡기 질병의 원인체들을 검출하기 위한 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 이용한 검출 방법에 따르면, 호흡기 질병의 원인체들, 특히 만헤이미아 헤몰라이티카, 히스토필루스 솜니, 마이코플라즈마 보비스를 구분하여 검출할 수 있다. 따라서, 호흡기 질병을 일으키는 원인체를 적은 양의 시료로 신속하게 검출할 수 있다.

Description

호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 조성물 및 이를 이용한 방법{Composition for detecting pathogens of respiratory disease, and using the same}
동물의 호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 이용한 방법에 관한 것이다.
동물의 호흡기 질병은 밀집 사육, 다두 집단 사육에 따른 스트레스와 환절기의 낮과 밤의 큰 일교차와 이런 일교차를 막기 위해 외부공기의 유입차단으로 밀폐된 우사 내에 암모니아가스와 탄산가스, 먼지 등에 의한 호흡기계 점막의 손상으로 기본 면역체계가 약화되어 항병력이 떨어지게 되고, 또 여기에 박테리아 또는 바이러스가 복합감염되어 발생하게 된다.
이러한 호흡기 질병은 원인체에 따라서 박테리아성과 바이러스성 질병으로 분류할 수 있는데, 호흡기 질병을 유발하는 주요 원인체는 만헤이미아 헤몰라이티카(Mannheimia haemolytica), 히스토필루스 솜니(Histophilus somni), 및 마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis)와 같은 박테리아이다. 만헤이미아 헤몰라이티카는 소 및 양의 유행성 폐렴(Enzootic pneumonia) 및 양에서 불규칙한 유방염을 일으키는 주요 원인체이며, 히스토필루스 솜니는 다른 박테리아성 원인체와 함께 혈류를 통해 확산되어 호흡기 뿐만 아니라 생식기, 신경계, 순환계 및 근골격계에 영향을 미치는 원인체이다. 마이코플라즈마 보비스는 또한, 소의 호흡기 질환뿐만 아니라 유방염의 원인체로 작용한다.
호흡기 질병은 그 감염성으로 인하여 심각한 경제적 손실을 야기하기 때문에, 빠르고 저렴한 검사가 요구되지만, 동물 사육장의 특성상 한정된 시료 채취만이 가능하므로 그 한계가 있다. 따라서, 호흡기 질병의 원인체에 대한 신속한 검출 통하여 조기에 원인체를 확인하여 호흡기 질환을 예방 또는 치료하는 것이 가축의 폐사율을 줄이고, 농가의 생산성을 높이는 데에 반드시 필요하다.
일 양상은 호흡기 질병의 원인체들을 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
다른 양상은 호흡기 질병의 원인체들을 검출하기 위한 프라이머 세트를 포함하는 조성물 및 키트를 제공한다.
다른 양상은 호흡기 질병의 원인체들을 검출하는 방법을 제공한다.
일 양상은 서열번호 1의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프라이머; 및 서열번호 2의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 프로브를 더 포함할 수 있다.
상기 제1 프라이머 세트는 만헤이미아 헤몰라이티카(Mannheimia haemolytica)를 검출하기 위한 것일 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브는 만헤이미아 헤몰라이티카의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 프라이머, 제2 프라이머, 및 제1 프로브는 만헤이미아 헤몰라이티카의 SodA 유전자의 일부분과 특이적으로 결합하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 따라서, 상기 프라이머는 만헤이미아 헤몰라이티카의 유전자 서열 일부를 증폭하기 위한 것이고, 상기 프로브들은 만헤이미아 헤몰라이티카의 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브일 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브는 증폭 반응액에 동시에 존재하여 각각의 표적 핵산과의 혼성화 및 연장이 이루어질 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머 세트 또는 그 외의 다른 핵산이 포함된 조성물을 사용하는 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaciton: PCR)에서 서로의 반응에 간섭을 일으키지 않고 표적 핵산을 증폭하여 검출할 수 있는 것일 수 있다.
상기 용어 "폴리머라제 연쇄 반응(PCR)" 이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법으로서, 혼성화와 변성을 위한 열순환 (thermal cycle)을 포함하는 것일 수 있다. 이러한 PCR 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 PCR 키트를 이용할 수도 있다. PCR 방법에는 한 번에 하나의 표적만을 증폭하는 단일 PCR과 한 번에 복수의 표적을 증폭하는 다중 PCR이 포함된다. 다중 PCR에서는 복수의 프라이머 쌍이 이용된다. 또한 다중 PCR에서 어느 한 표적 서열의 증폭에 이용되는 프라이머는 그 표적 서열의 증폭에만 이용되는 것이 아니라, 의도적으로 다중 PCR 중의 어느 다른 표적 서열의 증폭에 중복적으로 이용되는 것일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프라이머 및 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프로브를 더 포함할 수 있다.
상기 제2 프라이머 세트는 히스토필루스 솜니(Histophilus somni)를 검출하기 위한 것일 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브는 히스토필루스 솜니의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 제3 프라이머, 제4 프라이머, 및 제2 프로브는 히스토필루스 솜니의 16S rDNA의 일부분과 특이적으로 결합하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 따라서, 상기 프라이머는 히스토필루스 솜니의 유전자 서열 일부를 증폭하기 위한 것이고, 상기 프로브들은 히스토필루스 솜니의 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브일 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브는 증폭 반응액에 동시에 존재하여 각각의 표적 핵산과의 혼성화 및 연장이 이루어질 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머 세트 또는 그 외의 다른 핵산이 포함된 조성물을 사용하는 PCR에서 서로의 반응에 간섭을 일으키지 않고 표적 핵산을 증폭하여 검출할 수 있는 것일 수 있다.
다른 양상은 서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 5프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제6 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프로브를 더 포함할 수 있다.
상기 제3 프라이머 세트는 마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis)를 검출하기 위한 것일 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브는 마이코플라즈마 보비스의 유전자 서열에 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 가질 수 있다. 구체적으로, 상기 제1 프라이머, 제2 프라이머, 및 제1 프로브는 만헤이미아 헤몰라이티카의 uvrC 유전자의 일부분과 특이적으로 결합하는 뉴클레오티드 서열을 가질 수 있다. 따라서, 상기 프라이머는 마이코플라즈마 보비스의 유전자 서열 일부를 증폭하기 위한 것이고, 상기 프로브들은 마이코플라즈마 보비스의 증폭 산물을 검출하기 위한 프로브일 수 있다.
상기 프라이머 및 프로브는 증폭 반응액에 동시에 존재하여 각각의 표적 핵산과의 혼성화 및 연장이 이루어질 수 있는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 프라이머 세트 또는 그 외의 다른 핵산이 포함된 조성물을 사용하는 PCR에서 서로의 반응에 간섭을 일으키지 않고 표적 핵산을 증폭하여 검출할 수 있는 것일 수 있다.
상기 용어, "뉴클레오티드(nucleotide) 서열"은 이중 가닥 DNA 또는 cDNA, 또는 단일 가닥 DNA 또는 RNA이며, 달리 기재되어 있지 않은 한, 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 서열는 당업계에 알려진 방법에 따라, 적절한 방법(예를 들면, 화학적 합성)에 의해 합성되고 제조될 수 있다. 또한, 뉴클레오티드 서열은 상업적으로 구입할 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 당해 기술분야에 공지된 다양한 방법을 통해 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 예는 메틸화, 탈아미노화, 캡화, 천연 뉴클레오티드의 하나 이상의 동족체로의 치환, 또는 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체 (예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형을 포함할 수 있다. 따라서 상기 뉴클레오티드는 아데닌, 시토신, 티민, 구아닌, 및 우라실 이외에도, 이노신(inosine) 등의 리보뉴클레오시드를 포함할 수 있다. 또한 상기 뉴클레오티드는 검출 가능한 표지가 부착된 것일 수 있다. 검출 가능한 표지는 광학적 표지, 전기적 표지, 방사능 표지, 기질을 검출 가능한 물질로 전환할 수 있는 효소, 리포터 및 ?처 FRET 쌍 염료, 또는 이들에 부착된 물질, 또는 그 조합일 수 있다. 상기 리포터는 당업계에서 통상적으로 이용되는 임의의 물질일 수 있으며, 예를 들면 HEX, FAM, JOE, 또는 Cy5를 포함한다. 상기 ?처는 당업계에서 통상적으로 이용되는 임의의 물질일 수 있으며, 예를 들면 TAMRA, BHQ1, 또는 BHQ2 등을 포함한다.
상기 용어 "뉴클레오티드 서열"는 일부 경우에서, "핵산 서열", "프라이머", "올리고뉴클레오티드" 또는 "폴리뉴클레오티드"와 혼용될 수 있다.
상기 용어 "프라이머(primer)"는 적합한 온도에서 적합한 버퍼 내에서 적합한 조건(예를 들면, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소)에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예를 들어, 온도와 프라이머의 용도에 따라 차이가 있지만 전형적으로 15-35개의 뉴클레오티드이다. 짧은 프라이머는 주형과 충분히 안정된 혼성화 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구할 수 있다. 용어 "정방향 프라이머(forward primer)" 및 "역방향 프라이머(reverse primer)"는 중합 효소 연쇄 반응에 의해 증폭되는 주형의 일정한 부위의 3' 말단 및 5' 말단에 각각 결합하는 프라이머를 의미한다.
상기 프라이머 또는 프로브는 10 내지 35, 10 내지 30, 10 내지 25, 10 내지 24, 10 내지 23, 10 내지 22, 10 내지 21, 10 내지 20, 10 내지 19, 10 내지 18, 10 내지 17, 10 내지 16, 10 내지 15, 12 내지 25, 12 내지 24, 12 내지 23, 12 내지 22, 12 내지 21, 12 내지 20, 12 내지 19, 12 내지 18, 12 내지 17, 12 내지 16, 12 내지 15, 14 내지 25, 14 내지 24, 14 내지 23, 14 내지 22, 14 내지 21, 14 내지 20, 14 내지 19, 14 내지 18, 14 내지 17, 14 내지 16, 14 내지 15, 15 내지 25, 15 내지 20, 15 내지 17, 17 내지 25, 17 내지 23, 또는 17 내지 20 nt의 길이를 갖는 것일 수 있다.
상기 제1 프라이머, 제3 프라이머 및 제5 프라이머는 표적 서열을 증폭하기 위한 정방향 프라이머로 이용되는 것일 수 있다. 상기 제2 프라이머, 제4 프라이머 및 제6 프라이머는 표적 서열을 증폭하기 위한 역방향 프라이머로 이용되는 것일 수 있다. 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제3 프라이머 및 제4 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다. 상기 제5 프라이머 및 제6 프라이머는 각각 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머로서 특정 표적 핵산을 증폭하기 위한 프라이머 쌍으로서 기능할 수 있다.
상기 프라이머들은 RFLP(restriction fragment length polymerphism), APD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(intersimple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism)와 같은 DNA 분석에 이용될 수 있다.
다른 양상은 상기 제1 프라이머 및 제2 프라이머를 포함하는 제1 프라이머 세트, 상기 제3 프라이머 및 제4 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트, 상기 제5 프라이머 및 제6 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트 중 어느 하나 이상을 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 제1 프라이머 세트 내지 제3 프라이머 세트는 서로 섞이지 않도록 구분되어 있는 것일 수 있다. 상기 프라이머 세트는 시료 내 호흡기 질병의 원인체를 검출할 수 있다. 바람직하게, 만헤이미아 헤몰라이티카, 히스토필루스 솜니, 및 마이코플라즈마 보비스를 검출할 수 있고, 더욱 바람직하게, 동시에 다중으로 검출할 수 있다. 상기 제1 프라이머 세트, 제2 프라이머 세트, 및 제3 프라이머 세트를 모두 포함하는 조성물은 호흡기 질병의 원인체를 동시에 검출하기 위한 것일 수 있다.
상기 호흡기 질병은 인간을 제외한 동물의 호흡기 질병일 수 있다. 상기 인간을 제외한 동물은 예를 들어, 양, 토끼, 돼지, 염소, 또는 소 등을 포함할 수 있다. 바람직하게, 소가 포함될 수 있다.
상기 조성물은 PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소들을 포함하는 것일 수 있다. 상기 조성물은 상기 프라이머 세트 외에도, 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시리보뉴클레오티드(dNTPs), Taq-폴리머라제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-수(dEPC-water), 또는 멸균수를 포함할 수 있다. 또한, 정량 대조군으로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 상기 조성물은 검출 가능한 표지 물질 및 표지 물질의 검출에 필요한 시약을 포함하거나, 뉴클레오티드를 염색하기 위한 물질을 포함할 수 있다.
상기 프라이머 각각의 농도는 약 0.1 내지 약 0.8 μM, 약 0.2 내지 약 0.7 μM, 약 0.3 내지 약 0.6 μM, 약 0.3 내지 약 0.5 μM, 약 0.35 내지 약 0.45 μM, 약 0.38 내지 약 0.42 μM, 또는 약 4 μM일 수 있다. 상기 프로브 각각의 농도는 약 0.1 내지 약 0.3 μM, 약 0.15 내지 약 0.25 μM, 약 0.18 내지 약 0.22 μM, 또는 약 0.2 μM일 수 있다.
다른 양상은 상기 제1 프라이머 세트를 포함하는 만헤이미아 헤몰라이티카를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 또한 다른 양상은 상기 키트에 2 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 또는 이들의 조합을 더 포함하는 호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 키트를 제공한다. 상기 호흡기 질병의 원인체는 만헤이미아 헤몰라이티카, 히스토필루스 솜니, 및 마이코플라즈마 보비스일 수 있다.
상기 키트는, 예를 들면 만헤이미아 헤몰라이티카, 히스토필루스 솜니, 및 마이코플라즈마 보비스의 표적 서열을 검출할 수 있는 마이크로어레이일 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상기한 프라이머 세트 또는 조성물을 이용하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 따라 당업자가 용이하게 제조할 수 있다. 상기 마이크로어레이는 상술한 프라이머 세트 또는 그와 상보적인 서열, 또는 그에 대응되는 핵산 서열이 기판 또는 막 등의 고정상에 부착되어 있는 것일 수 있다. 또는 상술한 프로브, 결합 물질 또는 표지 물질이 기판 또는 막 등의 고정상에 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 키트는 상기 고정상을 2개 이상 포함할 수 있다. 상기 고정상에 부착된 물질에 따라, 상기 표적 서열이 상기 고정상에 부착될 수 있다. 예를 들면, 상기 고정상에 상기 표지 물질이 부착되어 있는 경우, 상기 결합 물질이 부착된 상기 증폭된 표적 서열은 상기 고정상에 부착될 수 있고, 또한 상기 고정상에 상기 프로브가 부착된 경우, 상기 프로브에 상보적인 서열을 갖는 상기 증폭된 표적 서열이 상기 고정상에 부착될 수 있다.
상기 키트는 표적 핵산의 PCR에 의한 증폭과 그 증폭 산물을 라인 블롯팅에 의하여 검출하기 위한 것일 수 있다. 용어 "라인 블롯팅 (line blotting)"이란 올리고뉴클레오티드와 같은 폴리뉴클레오티드 프로브가 평행선 (밴드 모양)으로 공유적으로 부착되어 있는 막에서 표적 핵산과 프로브의 혼성화를 수행하고, 그 혼성화 산물을 검출하는 것을 포함한다. 상기 검출은 프로브에 부착된 검출 가능한 표지 물질에 의하는 것일 수 있다. 표적 핵산의 구분은 각 프로브의 밴드(band)의 위치에 의하여 이루어질 수 있다.
다른 양상은 하기 단계를 포함하는, 시료 중 만헤이미아 헤몰라이티카를 검출하기 위한 방법이 제공된다:
상기 제1 프라이머 세트를 개체로부터 분리된 핵산 시료에 접촉시켜 혼성화 산물을 준비하는 단계;
혼성화 산물로부터 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및
증폭된 표적 핵산 서열을 검출하는 단계.
또한, 증폭된 핵산 서열을 상기 제1 프로브와 혼성화시키는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
상기 혼성화 산물은 상기 제2 프라이머 세트, 제3 프라이머 세트, 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 이 때, 상기 방법은 시료 중 호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 방법일 수 있다.
상기 혼성화 산물은 상기 제1 프로브, 제2 프로브, 제3 프로브 또는 이들의 조합을 더 포함할 수 있다. 또한 상기 혼성화 산물은 대조군으로 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 포함할 수 있다. 상기 대조군은 서열번호 7 및 서열번호 8을 포함하는 마이코플라즈마 보비스에 특이적인 프라이머쌍의 측면에 위치하는 비특이적 16S 리보솜 RNA 유전자 서열을 포함할 수 있다.
상기 시료는 개체로부터 유래된 생물학적 물질일 수 있다. 상기 생물학적 물질은 신선한 또는 보존된 기관 또는 조직 시료 또는 생검 (biopsy)과 같은 고체 조직 (solid tissue); 혈액 또는 혈액 구성성분; 양수 (amniotic fluid), 복수 (peritoneal fluid), 또는 세포간질액 (interstitial fluid)와 같은 체액 (body fluid); 세포 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 시료는 보존제, 항응고제, 버퍼, 고정제 (fixatives), 영양성분 (nutrients), 항생제 등과 같은 생물학적 물질과 자연적으로 혼합되어 있지 않은 화합물을 포함할 수 있다. 생물학적 시료는 예를 들면 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈액, 혈장, 혈청, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액, 직장 스왑 (swab) 또는 이들의 조합일 수 있다. 상기 핵산 시료는 분변, 솜막대로 채취한 시료, 체액 또는 조직 절편으로부터 추출된 게놈 DNA 또는 정제된 게놈 DNA일 수 있다.
상기 혼성화시키는 단계에서 용어 "혼성화(hybridization)"는 용어 "어닐링(annealing)"과 혼용될 수 있다. 혼성화는 하나의 핵산과 다른 핵산이 염기쌍 형성 상호 작용에 의해 듀플렉스, 트리플렉스(triplex), 또는 다른 고차원 구조의 형성을 야기하는 것을 의미한다. 염기쌍 형성 상호 작용은, 예를 들어, A/T 및 G/C와 같이, 왓슨/크릭(Watson/Crick) 및 후그스틴-유형(Hoogsteen-type) 수소 결합에 의한 염기 특이적인 염기쌍 형성일 수 있다. 또한, 염기-스태킹(base-stacking) 및 소수성 상호 작용이 듀플렉스 안정성에 기여할 수 있다.
상기 방법은 표적 핵산 서열을 증폭시키는 단계를 포함한다.
표적 핵산 서열은 DNA 증폭에 의해 표적이 되는 핵산을 의미한다. 표적 핵산 서열은 PCR 반응 또는 역전사-PCR 반응에서 증폭을 위한 주형으로 제공될 수 있다. 표적 핵산 서열은 천연 분자 및 합성 분자를 포함할 수 있다. 표적 핵산은 예를 들어, 게놈 DNA 또는 게놈 RNA일 수 있다.
증폭된 표적 핵산 서열의 크기는 40bp 내지 100bp로서, 증폭 및 검출에 최소한의 시간이 소요되어 빠른 검출이 가능할 수 있다.
증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭은 예를 들면, DNA 증폭 또는 RNA 증폭일 수 있다. 증폭 방법은 열순환(termal cycling)을 필요로 하는 것 또는 등온 (isothermal)에서 수행되는 것일 수 있다. 상기 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton: SDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA) 등을 포함하는 방법일 수 있다. 증폭 방법은 또한, RNA 증폭 방법을 포함할 수 있다. 예를 들면, 역전사(reverse transcription: RT) 또는 역전사-PCR을 포함할 수 있다. 증폭이란 표적 핵산 서열 또는 그에 상보적인 서열의 카피 수를 증가시키는 것일 수 있다. 상기 PCR은 다중(multiplex) PCR, 다중 실시간(real-time) PCR에 의한 것일 수 있다.
상기 방법은 증폭된 표적 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함한다.
검출하는 단계는 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 검출기로 측정하는 것을 의미한다. 예를 들면, 상기 검출 가능한 표지로부터 발생하는 자기적 신호, 전기적 신호, 형광, 라만 등의 발광 신호, 산란광 신호, 및 방사능 신호로 이루어진 군으로부터 선택되는 신호를 측정할 수 있다. 검출하는 단계는 표적 서열에 표지된 검출 가능한 표지로부터 발생하는 신호를 검출하는 것일 수 있다. 예를 들면, 검출하는 단계는 형광 공명 에너지 전이(Fluorescence resonance energy transfer: FRET)에 의해 발생하는 신호를 검출하여 표적 핵산의 존재 여부를 검출할 수 있다. 예를 들면, 상기 프로브의 양 말단에 리포터와 ?처가 각각 표지되어 있고 프로브의 3차 구조상 리포터의 발색이 ?처로 인해 억제되어 있다가, 프로브가 증폭 산물에 결합하여 리포터와 ?처의 거리가 멀어지거나, 또는 폴리머레이즈 등의 효소에 의해 프로브 핵산 서열이 분해되어, ?처로부터 유리된 리포터 물질이 형광을 나타내고, 이를 검출하는 것일 수 있다.
검출하는 단계는 실시간(real time)으로 증폭되는 핵산 서열을 실시간으로 검출하는 것일 수 있다. 이에 의하여 빠른 시간 내에 표적 핵산 서열을 검출할 수 있다.
일 양상에 따른 호흡기 질병의 원인체들을 검출하기 위한 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 이용한 검출 방법에 따르면, 호흡기 질병의 원인체들, 특히 만헤이미아 헤몰라이티카, 히스토필루스 솜니, 및 마이코플라즈마 보비스의 감염을 구분하여 검출할 수 있다. 따라서, 호흡기 질병을 일으키는 원인체를 적은 양의 시료로 신속하게 검출할 수 있다.
도 1은 만헤이미아 헤몰라이티카, 히스토필루스 솜니, 및 마이코플라즈마 보비스의 검출을 위한 프라이머 및 프로브가 포함된 패널의 검출 반응 효율을 각각 나타내는 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 원인체 검출을 위한 프라이머 및 프로브 설계
만헤이미아 헤몰라이티카(Mannheimia haemolytica)의 염기서열을 바탕으로 정방향 및 역방향의 프라이머쌍(각각 서열번호 1 및 서열번호 2)을 제조하였으며, 이들 프라이머쌍은 만헤이미아 헤몰라이티카의 SodA 유전자의 일부분을 특이적으로 인식하고, 135bp크기의 증폭산물을 생성하였다. 정량적 분석을 위하여 상기 프라이머쌍과 함께 프로브(서열번호 3)를 설계하였다.
히스토필루스 솜니(Histophilus somni)의 염기서열을 바탕으로 정방향 및 역방향의 프라이머쌍(각각 서열번호 4 및 서열번호 5)을 제조하였으며, 이들 프라이머쌍은 히스토필루스 솜니의 16S rDNA 일부분을 특이적으로 인식하고, 128bp크기의 증폭산물을 생성하였다. 정량적 분석을 위하여 상기 프라이머쌍과 함께 프로브(서열번호 6)를 설계하였다.
마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis)의 염기서열을 바탕으로 정방향 및 역방향의 프라이머쌍(각각 서열번호 7 및 서열번호 8)을 제조하였으며, 이들 프라이머쌍은 마이코플라즈마 보비스의 uvrC 유전자의 일부분을 특이적으로 인식하고, 112bp크기의 증폭산물을 생성하였다. 정량적 분석을 위하여 상기 프라이머쌍과 함께 프로브(서열번호 9)를 설계하였다.
또한, 상기 프라이머쌍 및 프로브와 함께 대조군을 설계하였다. 대조군은 마이코플라즈마 보비스에 특이적인 프로브(서열번호 9)에 의한 인식을 피하고 프라이머 간의 교차 반응을 최소화하기 위해, 마이코플라즈마 보비스에 특이적인 프라이머쌍(서열번호 7 및 서열번호 8)과의 측면에 위치하는 비특이적 16S 리보솜 RNA 유전자 서열을 포함하였다. 상기 대조군의 서열번호는 TCTAATTTTT TCATATCGCT AATGCTCTTG TACACACCGC CCAGTTCATT GTAGCAAAGG CCTGA(서열번호 11)로 설계하였다.
이와 같이 설계한 프라이머쌍 및 프로브는 하기 표 1과 같다.
원인체 프라이머 또는 프로브 서열 (5'-> 3')
만헤이미아 헤몰리티카
 Man306 (정방향) AGCAGCGACTACTCGTGTTGGTTCAG(서열번호 1)
Man449 (역방향) AAGACTAAAATCGGATAGCCTGAAACGCCTG(서열번호 2)
Man 프로브 (JOE/BHQ) AAGAGGGTAAATTAGCCGTTGTTTCAACCG(서열번호 3)
히스토필루스 솜니
 Som416 (정방향) GAAGGCGATTAGTTTAAGAG(서열번호 4)
Som543 (역방향) CCCTTTACGCCCAGTCATT(서열번호 5)
Som 프로브 (Cy5/BHQ) ACGATAATCACAGAAGAAGCACCGGCTAAC(서열번호 6)
마이코플라즈마 보비스
 F2024 (정방향) TCTAATTTTTTCATCATCGCTAATGC(서열번호 7)
R2135 (역방향) TCAGGCCTTTGCTACAATGAAC(서열번호 8)
Mbov 프로브 (FAM/MGB) AACTGCATCATATCACATACT(서열번호 9)
대조군 MbovIC 프로브(NED/MGB) CTTGTACACACCGCCCAGTTC(서열번호 10)
전체서열 TCTAATTTTT TCATATCGCT AATGCTCTTG TACACACCGC CCAGTTCATT GTAGCAAAGG CCTGA(서열번호 11)
실시예 2. 원인체 DNA 분리 및 PCR
임상 검체에서 분리된 액티노바실러스 리그니어시(Actinobacillus lignieresii), 액티노바실러스 수이스(Actinobacillus suis), 액티노바실러스 플레우로뉴모니애(Actinobacillus pleuropneumoniae), 알카노박테리움 피오제네스(Arcanobacterium pyogenes), 바실러스 세레우스(Bacillus cereus), 크로스트리디움 페르프링겐스(Clostridium perfringens), 코리네박테리움 슈도투버큘로시스(Corynebacterium pseudotuberculosis), 엔테로박터 종(Enterobacter spp.), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 클렙시엘라 뉴모니애(Klebsiella pneumoniae), 만헤이미아 글로코시다(Mannheimia glucosida), 만헤이미아 글래뉴로마티스(Mannheimia granulomatis), 만헤이미아 루미니콜라(Mannheimia ruminicola), 만헤이미아 바리게나(Mannheimia varigena), 모르가넬라 모르가니(Morganella morganii), 마이코플라즈마 효르히니스(Mycoplasma hyorhinis), 마이코플라즈마 하이오뉴모니아(Mycoplasma hyopneumoniae), 프로테우스 종(Proteus spp.), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 세라티스 마르체센스(Serratia marcescens), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 코아귤러스-음성 스타필로코커스 종(coagulase-negative Staphylococcus spp.), 스트렙토코커스 아가락티애(Streptococcus agalactiae), 스트렙토코커스 디스갈락티애(Streptococcus dysgalactiae), 스트렙토코커스 우베리스(Streptococcus uberis), 및 그룹 G 스트렙토코커스(group G Streptococcus)를 이용하여 특이성을 평가하기 위한 qPCR을 진행하였다.
상기 원인체들의 DNA는 하기와 같이 추출하였다.
MagMAX™ Total Nucleic Acid Isolation Kit(Applied Biosystems, Austin, TX) 및 KingFisher®96 magnetic particle processor(Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA)를 사용하여 바이러스 또는 박테리아 핵산을 추출하였다. 구체적으로, 175 ㎕의 폐 균질액, 바이러스 현탁액 또는 박테리아 배양물을 235 ㎕의 용해/결합 용액을 함유하는 비드 튜브에 첨가하고, 15분 동안 파쇄하였다. 16,000xg에서 6분 동안 원심분리한 후, 115 ㎕의 혼합물 상등액을 65 ㎕의 이소프로판올 및 20 ㎕의 비드 혼합물을 포함하는 깨끗한 96-웰 플레이트로 옮겼다. 플레이트를 5분 동안 진탕시킨 후, 상등액을 버리고 잔여 비드를 2회 세척하였다. 세척 용액을 폐기한 후, 65℃에서 용리 완충액 50 ㎕를 각 웰에 첨가하였다. 바이러스 현탁액 또는 박테리아 배양액의 최종 농도는 각각 75 내지 250 ㎍/ml 또는 10 내지 33 ㎍/ml이었다. 모든 추출 과정에는 9 개의 양성 대조군이 포함되었다. 선택된 샘플에서 비교 목적으로 QIAamp®DNA Blood Mini Kit(Qiagen Inc., Valencia, CA)을 사용하여 추출도 수행하였다. 추출된 핵산은 다음 시험에서 사용될 때까지 -80℃에서 보관하였다.
추출된 핵산을 대상으로 표 1에서 설계한 프라이머쌍 및 프로브의 PCR을 실시하였다. PCR 증폭은 ABI7500 Fast Real-Time PCR 시스템(Applied Biosystems)상에서 수행하였다. PCR의 조건은 프라이머의 경우 0.4 μM, 프로브의 경우 0.2 μM 농도로 하였으며, PCR 반응조건은 95℃에서 15분 동안 초기 활성화 단계, 35 사이클(95℃에서 15초 및 60℃에서 90초)로 수행하였다. PCR 결과 임계 주기(threshold cycle: Ct)가 35 이하일 경우 양성으로 판정을 하였다.
제작된 프라이머쌍 및 프로브는 각각 만헤이미아 헤몰리티카, 히스토필루스 솜니, 및 마이코플라즈마 보비스 외 나머지 원인체들과는 반응하지 않았다. 각 프라이머쌍 및 프로브는 표 1에 나타낸 대로 검출을 위한 원인체들만 검출하였다.
실시예 3. 민감도 검사
상기 실시예 1에서 제조된 프라이머 및 프로브의 민감도를 검사하기 위하여 위해 각 표적 박테리아에 대하여 현탁액의 CFU(colony-forming units)를 측정하였다. 콜로니 개수는 표준 플레이트 카운팅 기술을 사용하여, 각 원인체 현탁액 각각에 대하여 수행하였다. 구체적으로, 10-1에서 10-7까지의 10배 희석액을 먼저 무균 식염수에서 만들었다. 2 개의 한천 플레이트(BD Biosciences, Sparks, MD)를 각 박테리아에 대하여 준비하고, 각 플레이트를 4개의 구역으로 나누었다. 각 박테리아의 각 희석액 10 ㎕를 플레이트의 각 구역에 접종하였다. 각각의 박테리아에 대한 분석 민감도 테스트를 위해 50 CFU/10 ㎕이하의 희석액을 선택하였다. 모든 플레이트는 37℃에서 콜로니가 형성될 때까지 배양되었고, 각 섹션의 CFU를 기록하였다.
분석 감도는 일련의 1 ㎕당 CFU를 갖는 박테리아 현탁액상의 단일 플렉스 분석(각각의 표적에 대한 qPCR) 또는 mqPCR 패널로서 3회 평가하였다. 희석 및 전체 검출 효능 사이의 반응 충실도는 단일 검사(singleplex)와 다중 검사(multiplex) 간에 비교되었다.
박테리아 PCR분석의 감도가 추출 절차와 상관없이 동일하게 유지되는지 확인하기 위해 QIAamp®DNA Blood Mini Kit(Applied Biosystems) 및 MagMAX™ Total Nucleic Acid Isolation Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하고, 각 표적에 대해 단일 검사 qPCR로 수행하였다. 샘플의 2번의 추출 과정 사이의 Ct값을 비교 하였다.
분석 특이도는 의도된 분석 표적을 제외한 개별 qPCR 분석 간의 교차 반응성의 결여를 3회 반복 시험하여 평가하였다.모든 qPCRs는 인식의 특이성을 결정하기 위해 위에 추가적으로 27개의 박테리아 종에서 실시되었다.
농도별 Ct값을 바탕으로 도 1에 나타낸 바와 같이, 반응 효율을 검량선으로 확인하였다. 만헤이미아 헤몰라이티카, 히스토필루스 솜니, 및 마이코플라즈마 보비스의 분석 효율을 나타낸 도면 1의 그래프에서 기울기는 각각 -3.17, -3.18, 및 -3.77이고, 결정 계수(coefficient of determination, R2)는 각각 0.99, 0.99, 및 0.98이었다.
qPCR의 분석 민감도(검출 한계)는 박테리아 현탁액의 1 ml 당 CFU를 가지고 측정하였다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 각 표적 원인체에 대한 qPCR의 검출 한계는 만헤이미아 헤몰라이티카, 히스토필루스 솜니, 및 마이코플라즈마 보비스에 대하여 각각 120 CFU/ml, 400 CFU/ml 및 170 CFU/ml으로 나타났다. 또한, 다중 검사 결과와 단일 검사 결과를 비교하였을 때 Ct 값이 1 정도 차이에 불과한 바, 거의 유사한 검출 한계를 가졌다.
원인체
 검출 한계(Ct)
단일 검사 다중 검사 단위
만헤이미아 헤몰라이티카 120(34) 120(35) CFU/ml
히스토필루스 솜니 400(33) 400(34)
마이코플라즈마 보비스 170(33) 170(34)
실시예 4. 다중 실시간 PCR 검사와 배양법의 비교
동물의 호흡기 질병의 원인체 검출에 있어서, 실시예 1에서 제조된 프라이머 및 프로브를 이용해 다중 실시간 PCR을 하는 경우와 전통적인 진단법인 배양법을 이용하는 경우의 검출 결과를 비교하기 위하여 하기와 같은 실험을 실시하였다.
배양법을 실시하기 위해 배지(Trypticase soy agar with 5% sheep blood 및 MacConkey agar)를 사용하여 35℃에서 콜로니가 관찰될 때까지 호기성 또는 혐기성 조건하에서 인큐베이터 중 박테리아를 배양하였다. 박테리아 동정을 위해, 모든 플레이트에서 배양된 콜로니를 그램 염색 및 API identification system(bioMerieux, Durham, NC)으로 추가 분석하였다.
다중 실시간 PCR은 상술한 실시예 2.3의 방법에 따라 실시하였다.
전통적인 진단 방법인 배양법 결과 및 다중 실시간 PCR 결과가 양성 또는 음성인 경우를 기록하여 표 3에 나타냈다.
다중 실시간 PCR에 의해 만헤이미아 헤몰라이티카를 검출하였을 때, 배양법과 비교하여 30개의 더 많은 양성 샘플을 검출하였다. 히스토필루스 솜니의 경우는 배양법과 비교하여 다중 실시간 PCR에 의해 31개의 양성 샘플을 더 검출하였다. 마지막으로, 마이코플라즈마 보비스의 경우 배양법과 비교하여 다중 실시간 PCR에 의해 26개의 양성 샘플을 더 검출하였다. 다중 실시간 PCR에 의해 각 원인체를 검출한 경우와 박테리아 배양법을 비교하였을 때, 만헤이미아 헤몰라이티카, 히스토필루스 솜니 및 마이코플라즈마 보비스는 각각 84% (156/186; κ = 0.680), 83% (156/187; κ = 0.449) 및 82% (119/145; κ = 0.642)의 일치를 보였다.
원인체 다중 실시간 PCR % 일치율
(κ값)
양성 음성 전체
만헤이미아 헤몰리티카 양성 66 0 66 84%
(κ=0.680)
음성 30 90 120
히스토필루스 솜니 양성 17 0 17 83%
(κ=0.449)
음성 31 139 170
마이코플라즈마 보비스 양성 72 0 72 82%
(κ=0.642)
음성 26 47 73
<110> INDUSTRIAL COOPERATION FOUNDATION CHONBUK NATIONAL UNIVERSITY <120> Composition for detecting pathogens of respiratory disease, and using the same <130> PN117579 <160> 11 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Man306 primer <400> 1 agcagcgact actcgtgttg gttcag 26 <210> 2 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Man449 primer <400> 2 aagactaaaa tcggatagcc tgaaacgcct g 31 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Man probe <400> 3 aagagggtaa attagccgtt gtttcaaccg 30 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Som416 primer <400> 4 gaaggcgatt agtttaagag 20 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Som543 primer <400> 5 ccctttacgc ccagtcatt 19 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Som probe <400> 6 acgataatca cagaagaagc accggctaac 30 <210> 7 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2024 primer <400> 7 tctaattttt tcatcatcgc taatgc 26 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2135 primer <400> 8 tcaggccttt gctacaatga ac 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mbov probe <400> 9 aactgcatca tatcacatac t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MbovIC probe <400> 10 cttgtacaca ccgcccagtt c 21 <210> 11 <211> 65 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal control sequence <400> 11 tctaattttt tcatatcgct aatgctcttg tacacaccgc ccagttcatt gtagcaaagg 60 cctga 65

Claims (14)

  1. 서열번호 4의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프라이머; 및
    서열번호 5의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제4 프라이머를 포함하는 제2 프라이머 세트를 포함하는 조성물로서, 상기 제2 프라이머 세트는 히스토필루스 솜니(Histophilus somni)를 검출하기 위한 것인 조성물.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 서열번호 6의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 프로브를 더 포함하는 조성물.
  3. 삭제
  4. 청구항 1의 조성물; 및
    서열번호 7의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제 5프라이머 및 서열번호 8의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제6 프라이머를 포함하는 제3 프라이머 세트를 포함하는 조성물로서, 상기 제3 프라이머 세트는 마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis)를 검출하기 위한 것인 조성물.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 제3 프라이머 세트는 서열번호 9의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 프로브를 더 포함하는 것인 조성물.
  6. 삭제
  7. 청구항 1의 제2 프라이머 세트를 포함하는 히스토필루스 솜니를 검출하기 위한 키트.
  8. 청구항 1의 제2 프라이머 세트; 및 청구항 4의 제3 프라이머 세트를 포함하는 호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 키트로서, 상기 호흡기 질병의 원인체는 히스토필루스 솜니, 또는 마이코플라즈마 보비스인 것인 키트.
  9. 청구항 1의 제2 프라이머 세트를 개체로부터 분리된 핵산 시료에 접촉시켜 혼성화 산물을 준비하는 단계;
    혼성화 산물로부터 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및
    증폭된 표적 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중 히스토필루스 솜니를 검출하기 위한 방법.
  10. 청구항 1의 제2 프라이머 세트; 및 청구항 4의 제3 프라이머 세트를 개체로부터 분리된 핵산 시료에 접촉시켜 혼성화 산물을 준비하는 단계;
    혼성화 산물로부터 표적 핵산을 증폭시키는 단계; 및
    증폭된 표적 핵산 서열을 검출하는 단계를 포함하는, 시료 중 호흡기 질병의 원인체를 검출하기 위한 방법으로서, 상기 호흡기 질병의 원인체는 히스토필루스 솜니, 또는 마이코플라즈마 보비스인 것인 방법.
  11. 청구항 10에 있어서,
    상기 혼성화 산물은 청구항 5의 제3 프로브를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 10에 있어서,
    상기 혼성화 산물은 대조군으로 서열번호 10의 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 10개 이상의 연속적인 뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로브를 포함하는 방법.
  13. 청구항 10 내지 12 중 어느 한 항에 있어서, 상기 증폭은 폴리머라제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction: PCR), 핵산 서열-기초 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 리가제 연쇄 반응(ligase chain reaction: LCR), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplificaton: SDA), 롤링 서클 증폭(rolling circle amplification: RCA)에 의한 것인 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 폴리머라제 연쇄 반응은 역전사(reverse transcription: RT)-PCR, 또는 다중(multiplex) PCR, 다중 실시간(real-time) PCR에 의한 것인 방법.





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