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KR101951968B1 - 세포 조작용 나노피펫 장치 - Google Patents

세포 조작용 나노피펫 장치 Download PDF

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KR101951968B1
KR101951968B1 KR1020137025738A KR20137025738A KR101951968B1 KR 101951968 B1 KR101951968 B1 KR 101951968B1 KR 1020137025738 A KR1020137025738 A KR 1020137025738A KR 20137025738 A KR20137025738 A KR 20137025738A KR 101951968 B1 KR101951968 B1 KR 101951968B1
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보아즈 빌로즈니
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더 리전트 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본원은 나노피펫을 이용하여 표면 상으로의 단일 세포를 비롯한 목적하는 물질의 제어된 방출, 뿐만 아니라 세포로의 방출을 위한 방법 및 시스템을 개시한다. 일부 시스템은 제어된 세포 부착 및 성장을 위한 목적으로 임의적인 기판 상에서 사용자 정의된 패턴을 침착시키기 위해 xyz 제어기와 조합된 나노피펫을 포함하는 방법 및 시스템에 관한 것이다. 대안적인 실시양태는 고효율 방식으로 세포 손상을 최소화시키도록 전기삼투적으로 물질을 세포에 주입하는 나노피펫의 구경에서 압력차의 전자 제어 및 xyz 제어기와 조합된 나노피펫을 포함하는 방법 및 시스템에 관한 것이다. 또 다른 실시양태는 살아있는 단일 세포 내부에서 분자 상호작용의 연구 및 생체분자의 검출을 위해 주사 이온 전도 현미경 관찰과 조합된 관능화된 나노피펫을 포함하는 방법 및 시스템에 관한 것이다.

Description

세포 조작용 나노피펫 장치{NANOPIPETTE APPARATUS FOR MANIPULATING CELLS}
발명자: 알. 아담 세거(R. Adam Seger), 파올로 액티스(Paolo Actis), 보아즈 빌로즈니(Boaz Vilozny), 및 나더 푸어맨드(Nader Pourmand)
관련 출원에 대한 교차 참고
본 출원은 2011년 3월 3일에 출원된 미국 가출원 제61/448,998호 (전문이 본원에 참고로 포함됨)를 우선권으로 주장한다.
정부 지원의 선언
본 발명은 미국 항공 우주국 (NASA)에 의해 수여된 계약 번호 NCC9-165 및 NNX08BA47A, 미국 국립 보건원에 의해 수여된 계약 번호 P01-HG000205, NASA에 의해 수여된 계약 번호 NNX09AQ44A 및 미국 국립 암 연구원에 의해 수여된 계약 번호 U54CA143803 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정한 권리를 갖는다.
서열목록, 컴퓨터 프로그램, 또는 컴팩트 디스크에 대한 참고
없음
본 발명의 분야
본 발명은 생체분자의 단일 세포 주입, 패턴화 및 검출을 위한 나노기기 및 나노센서의 분야에 관한 것이다.
관련 분야
본 발명의 특정 측면에 대한 배경 정보가 하기에 제시되며, 이는 발명의 상세한 설명에 인용된 기술적 특징에 관한 것일 수 있으나, 반드시 상세하게 기재되는 것은 아니다. 즉, 본 발명에 사용된 개별 부분 또는 방법은 하기 논의된 물질에서 더욱 상세하게 기재될 수 있으며, 상기 물질은 청구된 본 발명의 특정 측면을 만들거나 사용하기 위해 당업자에게 추가의 지침을 제공할 수 있다. 하기 논의는 본원에서 임의의 청구항에 대한 정보의 관련성 또는 기재된 물질의 선행 기술 효과에 대해 인정하는 것으로 해석되어서는 안된다.
나노피펫 기술은 여러 적용을 위한 플랫폼일 수 있는 것으로 확인되었다 (액티스 등의 문헌 (본 발명의 발명자 중 두명을 포함함)은 STING ("이온 나노 게이팅에 의한 신호 변환(Signal Transduction by Ion Nano Gating)"으로 명명되는 감지 플랫폼을 개발하였으며, 여기서 석영 나노피펫의 팁은 화학적 또는 생물학적 수용체로 관능화된다 (문헌 [Actis, P., O. Jejelowo, and N. Pourmand, Ultrasensitive mycotoxin detection by STING sensors . Biosensors & Bioelectronics, 2010. 26(2): p. 333-337]). 상기 팁에서 나노미터 규모의 개구부는 부착된 수용체와 결합하는 분석물에 대해 감수성인 구역을 생성한다. 추가로, 로돌파(Rodolfa) 등은 나노피펫이 관능화된 표면 상에서 제어된 침착을 위해 사용될 수 있음을 밝혀내었다 (문헌 [Rodolfa, K.T., et al., Two-component graded deposition of biomolecules with a double - barreled nanopipette . Angewandte Chemie-International Edition, 2005. 44(42): p. 6854-6859]). 추가의 작업에서 무기 용매 중에서 표면 상에 물질의 침착을 입증하였다 (문헌 [Rodolfa, K.T., et al., Nanoscale pipetting for controlled chemistry in small arrayed water droplets using a double-barrel pipet. Nano Letters, 2006. 6(2): p. 6]). 개별 분자를 나노피펫을 사용하여 세포 혈장 막에 전달하였다 (문헌 [Bruckbauer, A., et al., Nanopipette delivery of individual molecules to cellular compartments for single-molecule fluorescence tracking. Biophysical Journal, 2007. 93: p. 3120-3131]).
라포지(Laforge) 등은 나노피펫 개구부에 형성된 액체/액체 계면을 가로질러 전압을 인가함으로써 액체를 전달하는 나노피펫에 기초하여 전기화학적 아토시린지(attosyringe)를 개발하였다 (문헌 [Laforge, F.O., et al., Electrochemical attosyringe. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007. 104(29): p. 11895-11900]). 생성된 힘은 피펫 안팍으로 액체의 유동을 유도하기에 충분히 강력하다. 이들은 이 효과를 이용하여 펨토미터량의 수용액을 배양물 중의 포유동물 세포로 성공적으로 전달하였다. 탄소 나노피펫은 세포 주입에서의 효능 또한 입증되었다. 형광 염료의 경구 편평 상피암종 세포로의 압력 유도된 주입이 슐라우(Schrlau) 등에 의해 입증되었다 (문헌 [Carbon nanopipettes for cell probes and intracellular injection . Nanotechnology, 2008: p. 015101-1-4]).
세포 패턴화
세포 부착 및 성장의 제어가 신경과학에서부터 줄기 세포 연구에 이르는 생물학적 분야에서 중요한 주제로 부각되었다 (문헌 [James, C.D., et al., Aligned microcontact printing of micrometer-scale poly-L-lysine structures for controlled growth of cultured neurons on planar microelectrode arrays. Ieee Transactions on Biomedical Engineering, 2000. 47(1): p. 17-21]; [Welle, A., et al., Photo - chemically patterned polymer surfaces for controlled PC -12 adhesion and neurite guidance . Journal of Neuroscience Methods, 2005. 142(2): p. 243-250]). 세포가 어디로 어떻게 성장하고 성숙하는지를 제어함으로써, 세포 성장 동안에 특이적인 특성들이 유도될 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Oliva, et.al., Patterning axonal guidance molecules using a novel strategy for microcontact printing . Neurochemical Research, 2003. 28(11): p. 1639-1648]에 의해, 뉴런 분화를 화학적 신호에 의해 제어하여 액손 성장의 방향을 기정하고 특정 실험을 위해 맞춤화할 수 있음이 밝혀졌다. 유사하게, 잉크젯 인쇄가 신경 줄기 세포 분화를 제어할 수 있음이 밝혀졌다 (문헌 [Ilkhanizadeh, S., et al., Inkjet printing of macromolecules on hydrogels to steer neural stem cell differentiation. Biomaterials, 2007. 28(27): p. 3936-3943]).
세포 패턴화는 다수의 방법을 이용하여 연구되었다. 반도체 제작 기술로 이루어진 진보를 이용함으로써 단일 세포를 인도하기에 충분히 작은 특징적인 크기를 갖는 패턴을 만들 수 있었다. 가장 널리 이용되는 세포 패턴화 기술은 미세접촉 인쇄 (μCP)이며, 이로써 마스터 주형은 전형적인 포토리소그래피를 이용하여 제작되며, 상기 마스터로부터 엘라스토머 스탬프가 생성된다. 이어서, 상기 스탬프는 생체분자에 의해 인킹될 수 있고, 상기 패턴은 임의적인 기판에 적용될 수 있다 (문헌 [Wilbur, J.L., et al., Microfabrication by microcontact printing of self-assembled monolayers. Advanced Materials, 1994. 6(7-8): p. 600-604]). 이 방법은 세포 성장을 제어하는데, 특히 제어된 뉴런 성장의 분야에서 널리 성공적임이 확인되었다 (문헌 [Park, T.H. and M.L. Shuler, Integration of cell culture and microfabrication technology. Biotechnology Progress, 2003. 19(2): p. 243-253]). 포토리소그래피 자체 또한 패턴화를 위해 사용될 수 있다. 기판을 마스크를 통해 조사에 노출시킴으로써, 표면 화학을 개질시킬 수 있으며, 이로써 특정한 부착 분자가 적절한 구역에 위치될 수 있다 (문헌 [Welle, A., et al., Photo-chemically patterned polymer surfaces for controlled PC-12 adhesion and neurite guidance. Journal of Neuroscience Methods, 2005. 142(2): p. 243-250]). 형태학적 신호 또한 세포 성장을 제어하는 것으로 확인되었다. 세포가 세포와 계면하는 표면 조도를 변화시킴으로써 부착을 제어할 수 있다. 화학적 및 형태학적 부착 신호의 조합은 개선된 세포 분화를 유도하는 것으로 입증되었다 (예를 들어, 문헌 [Stenger, D.A., et al., Microlithographic determination of axonal/dendritic polarity in cultured hippocampal neurons . Journal of Neuroscience Methods, 1998. 82(2): p. 167-173]). 이들 방법의 단점은, 일단 패턴이 고안되고 제작되면 새로운 마스크를 고안하거나 전체 공정을 스크래치로부터 재시작하지 않고서는 패턴을 변화시킬 수 없다는 것이다. 표준 반도체 제작 기술에 의존하지 않는 패턴화를 위한 일부 방법이 개발되었고, 따라서 제작 공정에 의해 제한되지 않는다. 문헌 [Gustavsson, et al., Neurite guidance on protein micropatterns generated by a piezoelectric microdispenser. Biomaterials, 2007. 28(6): p. 1141-1151]은 6-8 ㎛의 정확도로 100 pL의 액적을 침착시킬 수 있는 압전 작동식 마이크로디스펜서를 입증하였다. 문헌 [Schmidt, R.C. and K.E. Healy (Controlling biological interfaces on the nanometer length scale) in Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2009. 90A(4): p. 1252-1261]에서 밝혀진 바와 같이, 딥 펜(Dip pen) 및 파운틴 펜(fountain pen) 리소그래피는 40 nm만큼 작은 크기의 스팟이 임의적인 사용자 정의된 패턴으로 침착될 수 있게 한다. 그러나, 이 기술은 주어진 시간에 단일 패턴의 침착에만 제한된다.
하기 기재된 석영 나노피펫 기술을 이용함으로써, 기판 상에 침착된 패턴을 컴퓨터로 제어하여, 사용자에 의해 임의의 시간에 변형시킬 수 있으며, 서로에 대해 등록된 다중 패턴을 용이하게 침착시킬 수 있다. 상기 패턴을 이용하여 도 2에 도시된 바와 같이 기판 (216)으로의 세포 부착을 달성할 수 있으며, 여기서 세포 (212)는 부착 물질이 침착된 기판 상에 점으로 부착된다.
세포 주입
세포 주입을 위한 방법은 역사적으로 풀링형 유리 마이크로피펫을 사용하였다. 전형적인 마이크로피펫은 통상적인 세포에 비해 큰 크기, 낮은 세포 생존율, 피드백의 결여, 및 숙련된 작업자의 필요를 비롯한 몇몇 단점을 갖고 있다 (문헌 [Pillarisetti, A., et al., Evaluating the effect of force feedback in cell injection. Ieee Transactions on Automation Science and Engineering, 2007. 4(3): p. 322-331]; [Stephens, D.J. and R. Pepperkok, The many ways to cross the plasma membrane. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2001. 98(8): p. 4295-4298]).
이들 단점을 완화시키기 위해 세포 주입을 위한 다수의 다른 방법들이 개발되었다. 물질을 세포로 수동 전달하기 위해 전기천공, 및 공극 형성 독소 스트렙토리신-O (SL-O)의 사용과 같은 방법이 개발되었다 (문헌 [Wang, M.Y., et al., Single-cell electroporation. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2010. 397(8): p. 3235-3248; Knight, D.E. and M.C. Scrutton, Gaining access to the cytosol - the technique and some applications of electropermeabilization. Biochemical Journal, 1986. 234(3): p. 497-506]; [Giles, R.V., et al., Selecting optimal oligonucleotide composition for maximal antisense effect following streptolysin O-mediated delivery into human leukaemia cells. Nucleic Acids Research, 1998. 26(7): p. 1567-1575]). 전기천공은 고전압의 인가에 의해 세포에서 일시적인 투과성을 유도하여, 그 후에 물질이 확산될 수 있는 것으로 입증되었다. 세포는 특정 상황 하에서는 SL-O 병변을 치유하는 능력을 갖는 것으로 확인되었다. 두 경우에서, 스트레스가 세포에 도입되고, SL-O 병변의 경우에는 흡수율이 대략 100 kDa으로 제한된다.
직접적인 세포 주입 방법은 관련이 없는 다른 나노제작된 구조체를 이용하는 것으로 입증되었다. AFM 팁 상에서 제작되고 DNA로 코팅된 나노니들을 단일 세포에 삽입하였다. 나노니들로부터 DNA의 확산에 의해 주입이 달성되었다 (문헌 [Sung-Woong, H., et al., High-efficiency DNA injection into a single human mesenchymal stem cell using a nanoneedle and atomic force microscopy. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine, 2008: p. 215-25]). 유사하게, 양자점을 연결하는 디술파이드 결합을 절단함으로써 양자점을 세포 내부의 나노니들로 전달하였다 (문헌 [Chen, X., et al., A cell nanoinjector based on carbon nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2007. 104(20): p. 8218-8222]).
세포내 분자종의 단일 세포 생체내 검출
세포내 리코딩을 허용하는 몇몇 방법이 개발되었다. 코펠만(Kopelman) 및 동료들은 pH 및 산화질소의 세포외 모니터링을 위해 화학적으로 개질된 테이퍼링된 광섬유를 적용하는 것을 개척하였다 (문헌 [Tan, W., et al., Submicrometer intracellular chemical optical fiber sensors. Science 258, 778-781, doi:10.1126/science.1439785, 1992]; [Barker, S. L. R., et al., Cellular Applications of a Sensitive and Selective Fiber-Optic Nitric Oxide Biosensor Based on a Dye-Labeled Heme Domain of Soluble Guanylate Cyclase. Analytical Chemistry 71, 2071-2075, doi:10.1021/ac9901081, 1999]). 보-딘(Vo-Dihn) 및 동료들은 단일 세포에서 형광 분석물의 측정을 위해 항체 개질된 광섬유의 분석학적 적용을 보고하였다 (문헌 [Vo-Dinh, T., et al., Antibody - based nanoprobe for measurement of a fluorescent analyte in a single cell. Nat Biotech 18: 764-767, 2000]). 테이퍼링된 광섬유를 이용하는 것의 이점 중 하나는 주사형 근접장 광학 현미경 관찰을 이용하여 달성가능한 높은 공간 분해능에 의존한다. 센서는 세포에 손상을 주지 않기 위해 현미경 하에서 주의하여 조작되어야 한다. 이들 물리적 제약 외에도 친화도 방법에 의한 생체분자의 선택적인 검출은 세포질 내부의 여러 간섭종으로 인해 그 자체가 도전적이다. 더욱 최근에, 효소적 샌드위치 면역검정을 통해 단일 세포 내로 암 생체마커를 검출하기 위해 광섬유 나노바이오센서를 제작하였다 (문헌 [Zheng, X. T. & Li, C. M. Single living cell detection of telomerase over-expression for cancer detection by an optical fiber nanobiosensor. Biosensors and Bioelectronics 25: 1548-1552, 2010]). 전기 검출 방법은 개선된 내구성, 감수성, 신속한 반응, 및 다른 장치 성분과의 일체화로 인해 다른 방법들에 비해 더욱 적합한 것으로 알려져 있다. 그럼에도, 세포내 측정을 위한 전기-기재 센서는 여러 도전에 직면한다. 미소전극은 일반적으로 통상적인 포유동물 세포 (5 내지 10 ㎛)를 손상시키기에 충분히 크며, 절차가 종종 적어도 10배 더 큰 난모세포 및 배아세포에서의 측정으로 제한된다. 최근에, 세포 내부를 관통하는 미소전극을 이용하여 역치 아래의 시냅스 전위를 측정하였다 (문헌 [Hai, A., et al. (In-cell recordings by extracellular microelectrodes.) in Nature Methods (2010) 7, 200-202]). 이온-선택적인 막으로 코팅된 미소전극을 이용하는 성공적인 세포내 양이온 및 pH 센서에도 불구하고 (문헌 [Bakker, E. & Pretsch, E. (Nanoscale potentiometry.) in TrAC Trends in Analytical Chemistry 27, 612-618]), 생체분자의 세포내 전기 검출은 달성하기 힘든 것으로 남아있다. 리버(Lieber) 및 동료들은 인지질 이중층으로 개질된 나노 규모의 전계 효과 트랜지스터 (nanoFET)가 단일 세포를 관통할 수 있고 세포내 전위를 리코딩할 수 있는 새로운 접근법을 개발하였다 (문헌 [Tian, B. et al. Three-Dimensional, Flexible Nanoscale Field-Effect Transistors as Localized Bioprobes. Science 329, 830-834, doi:10.1126/science.1192033, 2010]). 그러나, 단일 세포 내부에서 생체분자 상호작용을 검출하기 위해 전기 센서를 사용하지는 않았다.
STING ("이온 나노-게이팅에 의한 신호 변환") 기술 또한 샘플에서 DNA, 단백질 및 진균독을 검출할 수 있는 것으로 확인되었다 (문헌 [Fu, Y., et al., Nanopore DNA sensors based on dendrimer-modified nanopipettes. Chem Commun (Camb), (2009), 4877-4879, doi:10.1039/b910511e]; [Umehara, S., et al., Label-free biosensing with functionalized nanopipette probes. Proceedings of the National Academy of Sciences (2009) 106, 4611-4616, doi:10.1073/pnas.0900306106]; [Actis, P., et al., Ultrasensitive mycotoxin detection by STING sensors. Biosensors and Bioelectronics (2010)26, 333-337]). 관능화된 석영 나노피펫에 기초하여, STING 기술은 임의의 나노제작 설비를 필요로 하지 않으며; 각각의 프로브는 용이하고 저렴하게 벤치에서 맞춤화될 수 있다. 수용체 분자는 잘 정립된 표면 화학을 이용하여 도입될 수 있다. 생체감지 외에도, 나노피펫 플랫폼을 이용하여, 단일 분자 생물 물리학을 연구하고 개별 세포 내부에서 전달을 제어하고 나노 규모에서 세포를 영상화하였다 (문헌 [Clarke, R. W., et al., Trapping of proteins under physiological conditions in a nanopipette. Angew Chem Int Ed Engl (2005), 44, 3747-3750, doi:10.1002/anie.200500196]; [Laforge, F. O., et al., Electrochemical attosyringe. Proceedings of the National Academy of Sciences (2007), 104, 11895-11900, doi:10.1073/pnas.0705102104]; [Klenerman, D. & Korchev, Y. Potential biomedical applications of the scanned nanopipette. Nanomedicine (Lond) (2006), 1, 107-114, doi:10.2217/ 17435889.1.1.107]). 바이톨(Vitol) 및 동료들은 세포내 분석을 위해 SERS 활성 탄소 나노피펫을 개발하였다 (문헌 [Singhal, R. et al. Small diameter carbon nanopipettes. Nanotechnology, (2010), 015304]). 외부 표면 피펫 팁 상에 금 나노입자를 도입함으로써 SERS 관능성이 부가되었다. 핵 내부에 삽입된 나노피펫에 의해 수득된 SERS 스펙트럼은 DNA와 관련된 전형적인 특징을 보여준다.
그러나, 당업계에서는 살아있는 세포 내부에서 작동할 수 있는 나노피펫 바이오센서가 여전히 요구되고 있다.
구체적인 특허 및 공보
2010년 3월 25일에 간행된 카하넥(Karhanek) 등의 US 특허 출원 공보 2010/0072080은 펩티드 및 단백질을 비롯한 생체분자 검출을 위해 관능화된 나노피펫을 포함하는 방법 및 장치를 개시한다.
문헌 [Umehara et al. in Proceedings of the National Academy of Sciences, vol 106, pages 4611-4616, March 24, 2009]는 관능화된 나노피펫 전극을 사용하여 표지-무함유 실시간 단백질 검정을 개시한다.
문헌 [Ying, Liming in Biochemical Society Transactions, vol 37, pages 702-706, 2009]은 나노피펫, 및 이온, 분자 (생체분자 포함) 및 세포의 나노감지 및 나노조작에서의 그의 용도를 고찰하였다.
문헌 [Actis, P., et al. in Bioanalytical Reviews 1, 177-185, doi:10.1007/s12566-010-0013-y (2010)]는 핵산 및 소형 단백질을 위한 전기화학적 바이오센서로서 나노피펫 기술의 적용을 고찰하였다.
1990년 5월 8일에 허여된 한스마(Hansma) 등의 US 4,924,091 (발명의 명칭 "주사 이온 전도 현미경")은 표면으로부터 일정한 전도도 거리에서 마이크로피펫 프로브를 유지시킴으로써 전극으로 덮힌 연질의 비-전도성 표면의 형태를 영상화할 수 있는 주사 이온 전도 현미경, SICM을 기재한다.
본 발명의 간단한 개요
하기 간단한 개요는 본 발명의 모든 특징 및 측면을 포함하는 것으로 의도되지 않으며, 본 발명이 이 개요에서 논의된 모든 특징 및 측면을 포함해야 하는 것을 의미하는 것이 아니다.
특정 측면에서, 본 발명은 (a) 다중-배럴형 나노피펫으로서, 2개의 배럴이 그들 내부에 제1 및 제2 전극을 갖고, 배럴 중의 상기 제1 전극은 그 배럴 중의 전극과 접촉하게 액체를 보유하도록 적용되고, 사용하는 동안 상기 제1 전극과 제2 전극 사이의 전압을 제어하기 위한 회로에 연결된 것인 다중-배럴형 나노피펫; (b) 나노피펫의 기계적 움직임을 서브마이크론 x 및 y 단계로 실행하고 상기 나노피펫의 움직임을 z 방향으로 실행하기 위해 상기 나노피펫에 부착되고, 사용자 정의된 제어에 따라 상기 기계적 움직임을 제어하기 위한 전자 제어를 추가로 갖는 xyz 제어기; 및 (c) 상기 나노피펫 중의 액체가 침착될 상기 기정 위치의 목적하는 위치에서 방출 전압을 상기 액체에 인가하도록 상기 전자 제어에 연결된 전압을 제어하고, xyz 제어기가 액체가 침착될 상기 기정 위치의 목적하는 위치로부터 멀어지는 나노피펫의 기계적 움직임을 실행할 때 상기 방출 전압을 제거하기 위한 회로를 포함하는, 서브마이크론 특징부를 갖는 기정 위치에서 기판 상에 액체를 침착시키기 위한 장치에 관한 것이다.
본 발명의 특정 측면에서, 기판은 패턴화 물질이 침착되는 균일한 층을 가질 수 있다. 상기 패턴화 물질은 세포 성장을 위한 부착 물질을 정의할 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 상기 장치는 피펫 바이어스 및 제1 배럴을 통한 이온 전류의 전류 측정을 위한 저 노이즈 증폭기를 포함하는, 전압을 제어하기 위한 회로를 포함한다. 상기 장치는 xyz 제어기의 서브마이크론 제어를 위한 압전 작동기를 추가로 포함할 수 있다. 상기 장치는 프로그래밍가능한 기기, 예컨대 상기 기정 위치의 사용자 입력을 위한 컴퓨터 또는 FPGA를 추가로 포함할 수 있다. FPGA는 스팟을 패턴으로 침착시키기 위해 프로그래밍될 수 있으며, 이로써 세포가 기정 패턴으로 성장한다. FPGA는 기정 위치에서 세포를 주입하도록 프로그래밍될 수 있다. 이 위치는 스캐닝되고 주입될 수 있도록 개별 세포를 그 자리에서 보유하도록 적용될 수 있다. 기정 위치는 세포 내부의 소기관, 예컨대 핵 또는 미토콘드리아일 수 있다.
본 발명의 특정 측면에서, 세포 기판은 그 안에 단일 공동 내로 개별 세포를 수용하도록 정의된 공동을 가짐으로써 세포를 보유하도록 적용된다. 공동은 공동에서 세포를 보유하기 위해 음의 압력을 인가하기 위한 관통 구멍을 가질 수 있다. 공동은 공동으로 세포를 유인하기 위한 전극을 포함할 수 있다. 나노피펫이 세포와 접촉하는 동안 또한 세포로 주입되는 동안에, 공동은 고정된 위치에서 개별 세포를 보유하는 역할을 할 수 있다.
본 발명의 특정 측면은 (a) 침착시키고자 하는 액체를 다중-배럴형 나노피펫에 두는 단계이며, 상기 다중-배럴형 나노피펫의 2개 이상의 배럴은 그들 내부에 제1 및 제2 전극을 갖고, 배럴 중의 상기 제1 전극은 그 배럴 중의 전극과 접촉하게 액체를 보유하도록 적용되고, 사용하는 동안 상기 제1 전극과 제2 전극 사이의 전압을 제어하기 위한 회로에 연결된 것인 단계; (b) 나노피펫의 기계적 움직임을 서브마이크론 x 및 y 단계로 실행하고 상기 나노피펫의 움직임을 z 방향으로 실행하기 위해 상기 나노피펫에 부착되고, 사용자 정의된 패턴에 따라 상기 기계적 움직임을 제어하기 위한 전자 제어를 추가로 갖는 xyz 제어기를 작동시켜, 상기 기정 패턴으로 나노피펫을 움직이는 것인 단계; 및 (c) 상기 나노피펫 중의 액체가 침착될 상기 기정 패턴의 목적하는 위치에서 방출 전압을 상기 액체에 인가하도록 상기 전자 제어에 연결된 전압을 제어하고, xyz 제어기가 액체가 침착될 상기 기정 패턴의 목적하는 위치로부터 멀어지는 나노피펫의 기계적 움직임을 실행할 때 상기 방출 전압을 제거하기 위한 회로를 사용하는 단계를 포함하는, 서브마이크론 특징부를 갖는 기정 패턴으로 기판 상에 액체를 침착시키기 위한 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 상기 정의된 장치의 구체적인 실시양태에 따라 추가로 수행될 수 있다.
본 발명의 특정 측면은 상기 정의된 장치를 사용하여 기판 상에서 물질을 세포에 주입하는 방법을 포함한다. 이들 방법은 기판에서 상기 세포를 공동에 두어서 상기 기판 상에서 상기 세포를 고정시키는 단계를 포함할 수 있으며, 상기 공동은 개별 세포만을 보유하도록 하는 크기를 갖는다. 고정화는 세포를 그 자리에서 보유하도록 세포에 전압을 인가하거나 상기 세포를 고정시키는데 도움이 되도록 상기 공동을 가로질러 압력차를 인가하는 것을 포함할 수 있다. 상기 세포는 폴리핵산, 항체 및 염료를 비롯하여 나노피펫의 구경에 있는 다양한 물질로 주입될 수 있다.
본 발명의 특정한 측면은 (a) 개별 세포와 접촉하는 액체 중에서 제2 참고 전극과 접촉하게 분석물을 보유하도록 적용되고, 사용하는 동안 상기 제1 전극과 제2 전극 사이의 전압을 제어하기 위한 회로에 연결된 제1 전극을 함유하는 배럴을 갖는 나노피펫; (b) 나노피펫의 기계적 움직임을 서브마이크론 x 및 y 단계로 실행하고 상기 나노피펫의 움직임을 z 방향으로 실행하기 위해 상기 나노피펫에 부착되고, 사용자 정의된 제어에 따라 상기 기계적 움직임을 제어하기 위한 전자 제어를 추가로 갖는 xyz 제어기; 및 (c) 상기 세포 내의 내부 표면 상에 고정된 분석물 결합 물질을 팁 가까이에 갖는 나노피펫 팁을 포함하는, 단일 세포 내에서 분석물을 측정하기 위한 장치에 관한 것이다. 관능화된 나노피펫 팁을 이용하여 분석물을 감지하는 이러한 유형은 개별 세포 내로 또는 그 근처로 팁을 삽입하는 것과 관련이 있다. 상기 팁은 검출 또는 측정 중인 분석물에 특이적으로 결합하도록 의도된 단백질 또는 폴리핵산과 같은 분석물 결합 물질로 관능화된다. 분석물의 결합은 나노피펫의 팁에서 나노공극을 통한 전류 유동에 영향을 미친다. 분석물을 감지하기 위한 단백질을 나노피펫의 내부 표면 상에서 PLL 코팅에 연결된 술포-SMCC에 의해 팁에서 고정될 수 있다. 나노피펫 팁은 항체 또는 압타머, 또는 검출하고자 하는 리간드에 대한 수용체로 관능화될 수 있다. 상기 장치는 살아있는 단일 세포의 내부에서의 면역검정에 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 장치는 상이한 적용을 위해 수많은 방식으로 생성될 수 있다. 각각의 경우, 상기 장치는 감수성 xyz 제어기에 부착된 나노피펫을 함유한다.
특정 측면에서, 본 발명은 (a) (i) 제1 배럴 중의 액체와 접촉하도록 배열된 제1 전극을 함유하는 제1 배럴; (ii) 제2 배럴 중의 액체와 접촉하도록 배열된 제2 전극을 함유하는, 제1 배럴에 인접한 제2 배럴; 및 (iii) 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 전압을 제어하기 위해 상기 제1 전극에 연결된 증폭기를 갖는 다중-배럴형 나노피펫; (b) 다중-배럴형 나노피펫의 기계적 움직임을 서브마이크론 x 및 y 단계로 실행하고 상기 다중-배럴형 나노피펫의 움직임을 기판을 향하거나 기판으로부터 멀어지는 z 방향으로 실행하기 위해 상기 다중-배럴형 나노피펫에 부착되고, 사용자 정의된 제어에 따라 상기 기계적 움직임을 제어하기 위한 전자 제어를 추가로 갖는 xyz 제어기; 및 (c) 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 전압을 제어하며, 상기 나노피펫 중의 액체가 방출될 목적하는 위치에서 제1 배럴로부터 액체가 방출되도록 충분한 방출 전압을 상기 제1 전극에 인가하고, 적어도 xyz 제어기가 목적하는 위치로부터 멀어지는 나노피펫의 기계적 움직임을 실행할 때 상기 방출 전압을 제거하도록 하기 위한 회로를 포함하는, 기판 상에서 개별 세포를 조작하기 위한 장치를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 상기 검출이 살아있는 단일 세포에서 특이적 종양단백질의 검출인 장치를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 전압을 제어하기 위한 상기 회로가 피펫 바이어스 전압의 제공 및 제1 배럴을 통한 이온 전류의 전류 측정을 위한 저 노이즈 증폭기를 포함하는 것인 장치를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 xyz 제어기의 서브마이크론 제어를 위해 압전 작동기를 갖는 장치를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 상기 목적하는 위치를 결정하도록 사용자 입력을 위한 필드-프로그래밍가능한 게이트 어레이 (FPGA)를 포함하는 장치를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 상기 FPGA가 상기 기판 상에 스팟을 패턴으로 침착시키기 위해 프로그래밍된 것인 장치을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 상기 FPGA가 상기 기판 상의 기정 위치에 있는 세포를 주입하도록 프로그래밍된 것인 장치를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 상기 FPGA가 상기 세포 내의 소기관을 주입하도록 프로그래밍된 것인 장치를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 개별 위치들에서 다수개의 개별 세포들을 각 위치마다 한 세포씩 함유하도록 적용된 기판에 작동가능하게 연결된 장치를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 그 안에 단일 공동 내로 개별 세포를 수용하도록 정의된 공동을 갖는 기판을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 상기 기판이 세포를 공동에 보유시키도록 음의 압력을 인가하기 위한 관통 구멍을 포함하는 것인 장치를 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 상기 공동이 세포를 공동으로 유인하기 위한 전극을 포함하는 것인 장치를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 (a) 침착시키고자 하는 액체를 (i) 제1 배럴 중의 액체와 접촉하도록 배열된 제1 전극을 함유하는 제1 배럴; (ii) 제2 배럴 중의 액체와 접촉하도록 배열된 제2 전극을 함유하는, 제1 배럴에 인접한 제2 배럴; 및 (iii) 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 전압을 제어하기 위해 상기 제1 전극에 연결된 증폭기를 갖는 다중-배럴형 나노피펫에 두는 단계; (b) 다중-배럴형 나노피펫의 기계적 움직임을 서브마이크론 x 및 y 단계로 실행하고 상기 다중-배럴형 나노피펫의 움직임을 기판을 향하거나 기판으로부터 멀어지는 z 방향으로 실행하기 위해 상기 다중-배럴형 나노피펫에 부착되고, 사용자 정의된 제어에 따라 상기 기계적 움직임을 제어하기 위한 전자 제어를 추가로 갖는 xyz 제어기를 작동시키는 단계; 및 (c) 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 전압을 제어하며, 상기 나노피펫 중의 액체가 방출될 목적하는 위치에서 제1 배럴로부터 액체가 방출되도록 상기 제1 전극에 방출 전압을 인가하고, xyz 제어기가 목적하는 위치로부터 멀어지는 나노피펫의 기계적 움직임을 실행할 때 상기 방출 전압을 제거하여, 상기 액체가 기정 패턴으로 침착되도록 하기 위한 회로를 사용하는 단계를 포함하는, 서브마이크론 특징부를 갖는 기정 패턴으로 액체를 침착시키는 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 상기 액체가 기판 상에서 침착된 세포 부착 물질의 영역에서만 세포의 부착을 허용하는 세포 부착 물질을 포함하는 것인 상기 기재된 방법을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 상기 세포 부착 물질이 라미닌인 상기 기재된 방법을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 상기 기판이 균일한 중합체 상단 표면을 포함하는 것인 상기 기재된 방법을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 상기 액체가 기판 상에서 침착된 세포 부착 물질의 영역에서만 세포의 부착을 허용하는 세포 부착 물질을 포함하며, 배양하고자 하는 기판 부착된 세포에 적용하는 단계를 추가로 포함하고, 이로써 상기 세포만이 세포 부착 물질을 갖는 구역에 부착하는 것인 상기 기재된 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 세포 부착 물질을 갖는 구역이 100 평방 마이크로미터당 약 10개 이상의 스팟의 밀도를 갖는 것인 상기 기재된 방법을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은 나노피펫의 상이한 배럴로부터 상이한 물질을 침착시키기 위해 이용되는 것인 상기 기재된 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 상기 나노피펫이 석영으로 제조되고, 약 20 내지 100 nm의 개구부를 갖는 것인 상기 기재된 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은 (a) 주입하고자 하는 액체를 (i) 제1 배럴 중의 액체와 접촉하도록 배열된 제1 전극을 함유하는 제1 배럴; (ii) 제2 배럴 중의 액체와 접촉하도록 배열된 제2 전극을 함유하는, 제1 배럴에 인접한 제2 배럴; 및 (iii) 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 전압을 제어하기 위해 상기 제1 전극에 연결된 증폭기를 갖는 다중-배럴형 나노피펫에 두는 단계; (b) 다중-배럴형 나노피펫의 기계적 움직임을 서브마이크론 x 및 y 단계로 실행하고 상기 다중-배럴형 나노피펫의 움직임을 기판을 향하거나 기판으로부터 멀어지는 z 방향으로 실행하기 위해 상기 다중-배럴형 나노피펫에 부착되고, 사용자 정의된 제어에 따라 상기 기계적 움직임을 제어하기 위한 전자 제어를 추가로 갖는 xyz 제어기를 작동시키는 단계; 및 (c) 상기 제1 전극과 상기 제2 전극 사이의 전압을 제어하며, 상기 나노피펫 중의 액체가 방출될 목적하는 위치에서 제1 배럴로부터 액체가 방출되도록 상기 제1 전극에 방출 전압을 인가하고, xyz 제어기가 목적하는 위치로부터 멀어지는 나노피펫의 기계적 움직임을 실행할 때 상기 방출 전압을 제거하여, 상기 액체가 상기 세포에 주입되도록 하기 위한 회로를 사용하는 단계를 포함하는, 물질을 기판 상의 선택된 세포에 주입하는 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은, 기판의 공동에 상기 세포를 두어서 상기 기판 상에 상기 세포를 고정시키는 단계를 추가로 포함하며, 여기서 상기 공동은 개별 세포만을 보유하도록 하는 크기를 갖는 것인, 상기 기재된 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은, 상기 세포의 고정을 보조하기 위해 상기 공동을 가로질러 압력차를 인가하는 단계를 추가로 포함하는 상기 기재된 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은, 주입된 상기 물질이 폴리핵산, 항체 및 염료로 이루어진 군으로부터 선택된 것인, 상기 기재된 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은, (a) 개별 세포와 접촉하는 액체 중에서 제2 참고 전극과 접촉하게 분석물을 보유하도록 적용되고 사용하는 동안 제1 전극과 제2 전극 사이의 전압을 제어하기 위한 회로에 연결된 제1 전극을 함유하는 배럴을 갖는 나노피펫; 및 (b) 나노피펫의 기계적 움직임을 서브마이크론 x 및 y 단계로 실행하고 상기 나노피펫의 움직임을 z 방향으로 실행하기 위해 상기 나노피펫에 부착되고, 사용자 정의된 제어에 따라 상기 기계적 움직임을 제어하기 위한 전자 제어를 추가로 갖는 xyz 제어기; 및 (c) 상기 세포 내의 내부 표면 상에 고정된 분석물 결합 물질을 팁 가까이에 갖는 나노피펫 팁을 포함하는, 기판 상에서 개별 세포 중의 분석물을 검출하기 위한 장치를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은, 분석물 결합 물질이 단백질 또는 폴리핵산인 장치를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은, 분석물 결합 물질이 상기 내부 표면 상에서 술포숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)에 의해 폴리-L-리신 (PLL) 코팅에 결합된 단백질인 장치를 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은, (a) 관능화된 나노피펫을 세포 내의 정의된 깊이로 위치시키는 단계; (b) 세포막 가까이로 나노피펫의 정밀한 위치를 제어하기 위해 전류를 모니터링하는 단계; (c) 나노피펫을 고속으로 세포 내로 삽입하는 단계; (d) 고전압을 인가하는 단계; 및 (e) 세포에서 생체분자를 검출하기 위해 전류 변화를 측정하는 단계를 포함하며, 상기 관능화된 나노피펫이 피펫 바이어스 및 전류 측정을 위한 증폭기, X, Y 및 Z 방향의 제어를 위한 현미조작기, X, Y 및 Z 방향의 미세 제어를 위한 압전-작동기, 구성가능한 집적 회로, 고전압원, 및 저전압과 고전압 사이의 변환을 위한 계전기를 추가로 포함하는 시스템으로 이루어진 것인, 살아있는 단일 세포에서 생체분자를 검출하는 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은, 나노피펫이 항체로 관능화된 상기 기재된 방법을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은, 나노피펫이 압타머로 관능화된 상기 기재된 방법을 포함한다.
특정 측면에서, 본 발명은, 살아있는 단일 세포에서의 면역검정에 이용되는 상기 기재된 바와 같은 방법을 포함한다. 특정 측면에서, 본 발명은, 나노피펫이 수용체 리간드로 관능화된 상기 기재된 방법을 포함한다.
도 1은 본 발명의 침착 및 세포 주입 시스템의 도식도이다.
도 2는 본 발명의 시스템을 이용하여 이중-배럴형 피펫을 사용한 세포 침투의 도식도이다.
도 3은 시간 경과에 따른 나노피펫 팁으로부터 방출된 액체의 부피를 나타낸 그래프이다. 그래프에 나타낸 바와 같이, 방출 속도는 시간에 따라 선형이다.
도 4a는 패턴화된 스팟 어레이를 나타낸 상면(top view) 사진이다.
도 4b는 술포로다민을 사용한 패턴화된 스팟 어레이의 형광 영상의 모의-3-D 그래프이다.
도 5는 본 발명의 나노주입 기기를 나타낸 일련의 사진이다. 도 5a는 카르복시플루오레세인의 HeLa 세포로의 주입을 나타낸 사진이다. 세포 및 나노피펫의 명시 야상(brightfield image)이다. 화살표는 나노피펫의 팁을 나타낸다. 도 5b는 또한 도 5a에서와 같은 세포 주입의 사진이다. 도 5b는 주입 후의 HeLa 세포 및 나노피펫의 형광 영상을 나타낸다.
도 6은 세포 체(sifter) 제작을 나타낸 일련의 도면이다. 도 6a는 규소 웨이퍼 상에 침착된 질화규소 층을 나타낸 도면이다. 도 6b는 질화물 층을 통과하는 심도 반응성 이온 에칭을 나타낸 도면이다. 도 6c는 후방 KOH 에칭을 나타낸 도면이다. 도 6d는 유리 웨이퍼에 결합된 규소 웨이퍼를 나타낸 도면이다. 도 6e는 최종 기기에서 가소성 고리가 표면에 부착된 것을 나타낸 도면이다.
도 7은 배양 챔버 및 진공을 적용하기 위한 기구를 나타낸 최종 기기의 사진이다. 페니는 기기의 상대적 크기가 페니보다 작다는 것을 설명하기 위해 도시된다. 상기 기기를 이용하여 세포를 배양 고리에서 배양하고 음의 압력을 인가하여 관통 구멍 상에 고정시킬 수 있다.
도 8은 세포 체 상에 고정된 10 mm 폴리스티렌 비드의 형광 영상을 나타낸 사진이다.
도 9a는 주사 이온 전도 현미경 (SICM)을 이용한 지형 맵핑을 나타낸 카툰(cartoon)이다. 도 9b는 세포 상 위치에 대한 나노피펫 팁의 높이 변화를 나타낸 지형 맵핑의 그래프이다.
도 10은 나노피펫 센서에 의한 HPV18E6 항원의 선택적 검출을 나타낸 선 추적이다. 인가된 전압: -400 mV. 항원은 0 시간에 첨가하였다.
도 11은 HeLa 세포 용해물에 대한 나노피펫 센서의 반응을 나타낸 막대 그래프이다.
도 12는 나노피펫 센서를 이용한 단일 세포 내부에서의 종양단백질의 검출을 나타낸 막대 그래프이다.
바람직한 실시양태의 상세한 설명
개관
3차원 움직임을 위해 로봇 기구에 부착되고, 세포 성장을 제어하기 위해서 나노피펫으로부터의 물질을 기판 상에 제어 침착하거나, 개별 세포 표면 또는 세포 내부에서 나노피펫 팁을 이용하여 생화학적 마커를 감지하거나, 또는 나노피펫 내용물을 단일 세포로 주입하는데 유용한 나노피펫을 포함하는 시스템이 본원에 개시된다. 화학적 침착에 이용되는 경우, 작은 크기의 나노피펫 개구부로 인해 단일 세포 수준보다 낮은 해상도를 갖는 패턴 정의가 얻어진다. 시스템은 추가로 패턴 침착에 대한 기초로서 주사 이온 전도 현미경 (SICM)을 이용하는 것을 포함한다. 따라서, 패턴은 사용자에 의해 기정될 수 있고, 후속적으로 포토리소그래피 또는 임의 유형의 패턴 전처리를 필요로 하지 않으면서 소프트웨어를 제어하여 기공될 수 있다. 이는 임의의 사용자 정의된 패턴의 일정하고 빠른 개발을 가능하게 하여, 시험관내 세포 배양과 함께 해상도의 손실 없이 빠르고 효율적으로 평가된다. 본원에 개시된 시스템은 생물학적 연구에서 세포 부착 및 성장을 제어하기 위해 이용된다.
SICM 기기는 연질의 비-전도 표면의 지형을 영상화하기 위해 이전에 고안되었다. 예를 들어, 문헌 [Hansma, P.K., et al., The Scanning Ion-Conductance Microscope. Science, 1989. 243(4891): p. 641-643]을 참조한다. 이러한 선행 기술 기기는 XYZ 스캐닝, Z 피드백 및 제어 로직을 이용한다 (Z는 스캐닝되는 표면에 대해 직각 방향인 것으로 고려됨).
본 발명의 또 다른 측면은, 세포 고정 및 주입 방법을 포함한 고효율 세포 주입용 나노피펫을 포함하는 시스템에 관한 것이다. 본 발명의 실시양태는 나노피펫 및 전기삼투 주입을 이용하여 세포 손상을 최소화한 임의 물질의 세포로의 세포 주입에 관한 것이다. 전기삼투 주입은 나노공극 개구부를 가로지르는 전압 및 이온 전류를 변화시켜 나노피펫으로부터 관심 화합물을 배출시키는 것을 포함한다. 또한, 방출 및 세포 주입의 보다 높은 효율을 위한 이중-배럴형 나노피펫을 개시한다.
또한, 세포로의 완전 자동화 주입을 위해 기정된 어레이에서의 세포 고정용으로 제작된 세포 체를 개시한다. 세포 체는 3차원 특징부, 예컨대 기정 위치, 바람직하게는 각각 단일 세포를 함유하는 위치의 어레이에서 보유될 수 있는 단일 세포의 배치를 가능하게 하는 오목한 개구부를 함유한다. 상기 기술의 실시양태는 살아있는 단일 세포로의 확실한 물질 투입 또는 세포 내부의 면역검정을 포함한 고효율 단일-세포 연구를 위한 도구로서 이용될 수 있다. 다른 실시양태는 중합체 비드를 포함한 구조물의 고정화를 포함한다.
또한, 본 발명의 나노피펫 센서를, 생물학적 물질의 도처에서 나노피펫을 스캐닝하는 장치와 통합하는 방법 및 기기가 개시된다. 본원에 기재된 나노피펫 센서를 주사 이온 전도 현미경 (SICM)과 연결하여 살아있는 개별 세포 내부에서 분자 상호작용을 연구할 수 있다. 고정화 또는 사전처리를 전혀 필요로 하지 않으면서 성장 배지 내부에서 세포 정보를 얻을 수 있다. 세포 크기에 비해 작은 크기의 나노피펫은 침투 조건을 제어하면서 세포 생존력을 최대화한다. 상기 기술의 적용은 단일 세포 수준에 이르기까지의 생체내 검정을 포함한다. 또 다른 적용은 개별 세포 내부에서의 생체분자의 연속 모니터링, 예를 들어 단백질 발현을 모니터링하는 면역검정을 가능하게 한다. 추가로, 상기 기술을 이용하여 단일 세포로부터 분비된 분자를 기능적으로 맵핑할 수 있다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속한 분야의 당업자에 의해 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기재된 바와 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 실제로 또는 본 발명의 시험에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법 및 물질을 기술한다. 일반적으로, 세포 및 분자 생물학 및 화학과 관련하여 이용되는 명명법 및 이들의 기술은 당업계에 널리 공지되고 통상 사용되는 것들이다. 구체적으로 정의되지 않은 특정 실험 기술은 일반적으로 당업계에 널리 공지된 통상적인 방법에 따라서, 및 본 명세서 전반에 걸쳐 언급 및 논의된 다양한 일반적인 및 보다 특정한 참고문헌에 기재된 바와 같이 수행된다. 명확히 하기 위해, 다음 용어를 하기에 정의한다.
용어 "나노피펫"은 나노규모, 즉, 0.05 nm 내지 약 500 nm, 바람직하게는 약 (+ 또는 - 20%) 50 nm의 원뿔형 팁 개구부 (즉, 나노공극)를 갖는 공동 자립형의 불활성 비-생물학적 구조를 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 공동 구조는 유리 또는 석영일 수 있고, 이는 그의 내부에 또는 나노공극의 한 측면 상에 나노공극 개구부를 통과하는 유체를 보유하기에 적합하다. 나노피펫의 내부는 분석물의 비특정 결합을 최소화하기 위해 선택 또는 변형된다. 내부는 나노피펫 내 용액과 접촉하는 전극의 삽입을 가능하게 하는 크기이다. 나노피펫은 바람직하게는 유리 또는 석영 모세관의 레이저 흡인(laser pulling)에 의해 제작된다. 나노피펫은 대략 10-100 nm의 내경, 대략 200-800 nm의 외경, 및 약 10 ㎛의 전형적인 길이를 갖는다. 이러한 치수는 특정 용도에 적합하게 하는 크기이며, 나노공극 크기의 제어는 중요한 고려사항이다. "다중- 배럴형 나노피펫"은 통상 공통의 벽을 공유하는 둘 이상의 평행한 구경을 갖는 나노피펫이다. 상기 구경은 통상 방사상 간격을 갖는 동축이지만, 동심일 수 있다. 이는 시판되는 다중구경 모세관으로부터 제작될 수 있다.
용어 "나노공극"은 단일-분자 검출기로 사용될 수 있는 전기 절연막 내 작은 구멍을 나타내기 위해 본원에서 사용된다. 검출 원리는, 막을 가로질러 전압을 인가할 때 나노공극을 통과하는 이온 전류를 모니터링하는데 기초한다. 바람직한 나노공극 개구부는 약 20 및 100 nm (이들의 10% 이내)이다.
용어 "전류 검출 회로" 또는 "전압 제어용 회로"는 제어가능한 증폭기, 및 민감한 전압 및 전류 검출기를 포함하는 공지된 전자 회로 및 기기를 나타낸다. 이는 10-10000 피코암페어의 기준 전류에 기초하여 대략 1-10 피코암페어의 전류 변화를 검출하기 위한 임의의 민감한 기기를 포함할 수 있다. 상기 용어는 추가로 시간 반응성이며, 상대적으로 온도에 무관하거나 또는 보완될 온도 변화를 허용하는 회로를 나타낸다. 공지된 전압이 제공되는, 회로 내 입력물을 가져야 한다. 전압 클램프 증폭기 및 트랜스임피던스 증폭기를 비롯한 민감한 검출 회로가 공지되어 있다. 용어 "전압 클램프"는 본원에서 가변 지령 전압과 관련된 하나의 입력물, 측정 전압과 관련된 또 다른 입력물, 및 피드백 회로를 갖는 차등 증폭기를 이용하는 회로를 나타낸다. 전압 클램프는 음성 피드백을 이용하여 시스템을 지령 전압으로 유지시키는데, 이 경우에서는 기정된 교차 신호, 예컨대 신호 발생기로부터의 교차 전압 신호이다. 출력 전류는 입력 전압의 변화에 따르고, 전류의 작은 변화가 관찰될 수 있다.
용어 "전기삼투 유동" 또는 "전기-삼투 유동"은 나노피펫의 표면에 형성된 전기 이중 층 상에서의 인가된 전기장의 실행을 나타내기 위해 통상적인 의미로 본원에서 사용된다. 나노피펫 팁의 내부 표면에 배열된 이온은 충분히 강한 전기장 하에 나노피펫으로부터 나오게 되고, 이와 동시에 작은 부피의 용액이 팁으로부터 나온다. 전기삼투는 액체를 방출하는 반면에, 전기영동은 액체 또는 겔과 같이 배지 내부에서 하전된 입자를 이동시킨다. 전기삼투는 모세관 또는 임의의 다른 유체 도관을 가로질러 인가된 전위에 의해 유도된다.
용어 "라미닌"은 기저판 (이전에는 부적절하게 "기저막"이라 불림), 즉, 대부분의 세포 및 기관에 대한 단백질 네트워크 기반에서의 주요 단백질을 나타내기 위해 그의 통상적인 의미로 본원에서 사용된다. 라미닌은 중요하고 생물학적으로 활성인 기저판의 일부이고, 이는 세포 분화, 이동, 부착, 및 또한 표현형 및 생존에 영향을 미친다. 라미닌은 각각 5종, 3종 및 3종의 유전자 변이체에서 발견된 α-쇄, β-쇄 및 γ-쇄를 함유하는 삼량체 단백질이다. 라미닌은 조직의 유지 및 생존에 매우 중요하다. 결함이 있는 라미닌은 근육을 부적절하게 형성시켜 근이영양증, 치사 피부 수포성 질환 (연접부 수포성 표피박리증) 및 신장 여과기의 결함 (신증후군)을 유발할 수 있다. 라미닌은 세포 배양에서 및 세포외 환경과의 세포 상호작용을 연구하는데 이용된다. 예를 들어, 라미닌-111은 생체내 및 시험관내 둘 다에서 신경 축삭을 성장시킬 주요 기질이다. 예를 들어, 이는 개발중인 망망 신경절 세포가 망막으로부터 덮개까지의 길을 따르게 하는 방향을 정한다. 또한, 종종 세포 배양 실험에서 기질로 사용된다.
용어 "종양단백질"은 종양유전자에 의해 코딩되는 단백질을 나타내기 위해 그의 통상적인 의미로 본원에서 사용되며; 이는 암과 관련된 것으로 공지된 바이러스 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 문헌 [Clemens et al., "Dimerization of Human Papillomavirus E7 Oncoprotien in Vivo," Virology 214, 289-293 (1995)]을 참조한다. 세포 종양단백질이 통상 더 크고, 정상 세포에 소량 존재하지만, 바이러스 종양유전자에 의해 코딩되는 단백질 및 숙주 세포 내부의 이에 상응하는 동족 단백질도 모두 본원에서 종양단백질로 지칭되므로, 신생물 상태와만 연관될 필요는 없다. 여기에는 myc, bcl-2, 돌연변이된 p53, DEK, HPV E6, HPV E7 등이 포함된다.
용어 "세포 부착 물질"은, 예를 들어 사실상 세포외 기질에서 세포를 특정 화합물에 부착시키는 단백질과 같은 물질을 나타내기 위해 본원에서 사용된다 (세포부착으로 공지된 방법). 기질 부착 분자 (SAM) 내 아미노산 중 일부는 세포외 기질의 성분과 결합하는 반면에, 나머지는 세포 표면 상의 인테그린과 결합한다. 인테그린 분자는 2개의 아미노산 쇄로 이루어져 있고, 이들 중 하나는 세포골격의 액틴 필라멘트와 연결된 반면에, 다른 하나는 SAM과 연결된다. 이는 세포외 기질의 외부 활성이 세포의 모양 및 움직임에 영향을 미치게 할 수 있다. SAM은 이들과 결합하는 세포에 의해 만들어져서는 안된다. 또한, 이는 다른 SAM과 연결되어 서로의 거동에 영향을 미칠 수 있다.
용어 "필드- 프로그래밍가능한 게이트 어레이"는 제조 후 소비자 또는 설계자에 의해 배열되도록 고안된, 따라서 "필드-프로그래밍가능한" 집적 회로를 지칭하기 위해 본원에서 사용된다. 필드-프로그래밍가능한 게이트 어레이 (FPGA) 배열은 일반적으로 주문형 집적 회로 (ASIC)에 사용되는 것과 유사한 하드웨어 기술 언어 (HDL)를 이용하여 특정된다. FPGA는 "로직 블록"이라 불리는 프로그래밍가능한 로직 요소, 및 블록을 "함께 연결시키는" 것을 가능하게 하는 재구성가능한 인터커넥트의 집단을 함유한다-(다수의) 다양한 배열로 서로-연결될 수 다수의 (변화가능한) 로직 게이트와 다소 유사함. 로직 블록은 복잡한 조합 기능, 또는 AND 및 XOR과 같이 단지 간단한 로직 게이트를 수행하도록 배열될 수 있다. 대부분의 FPGA에서, 로직 블록은 또한 간단한 플립-플롭 또는 보다 완전한 메모리 블록일 수 있는 메모리 요소를 포함한다.
용어 "xyz 제어기"는 통상 편평한 표면인 x 및 y 치수, 및 통상 수직인 z 방향으로 알려진 3차원으로 움직이는 기계적 기기를 나타낸다. xyz 제어기는 다양한 마이크로-규모의 사용, 예컨대 원자 탐침 현미경에서의 사용으로 알려져 있다; 예를 들어, 예시적인 xyz 제어기에 대한 추가 설명을 위해 US 5,394,741 (Kajimura et al., "Atomic probe microscope")을 참조한다.
하기 추가 기재된 용어 "방출 전압"은 용액을 함유한 구경과 외부 용액 사이에서 본 발명의 나노피펫에 인가되는 전압을 나타내며, 상기 전압은 구경으로부터 이온 유동을 일으키고, 즉, 용액 내부에서 원자종을 방출한다. 즉, 본 발명의 기기에서 나노피펫 구경으로부터의 방출은 전기삼투로 인해 일어나고, 이는 방출된다기보다는 나노피펫의 특성에 따른 것임을 의미한다. 다른 구경에 존재하는 반대 전극에 비해 유체는 양으로 바이어스된 전극을 함유하는 구경으로부터 방출된다. 하기 예시된 바와 같이, 0.1 내지 100V 사이의 전압을 이중 배럴형 나노피펫의 2개의 구경을 가로질러 인가함으로써 방출을 유도한다. 방출된 물질의 양은 인가된 전압의 시간 및 규모에 따라 달라진다. 예시를 위해, 저전압은 0.01-1V이고, 고전압은 1-100V이다. 단일 구경 피펫을 사용하고, 세포 외부 전극에 비해 고전압을 인가하는 경우, 전압은 세포막을 통과해야 할 것이며, 이는 손상을 일으킬 수 있다. 따라서, 이중 구경 피펫은 단일 구경 피펫의 사용에 비해 바람직하다.
당업계에 공지된 용어 "저 노이즈 증폭기" 또는 LNA는 다양한 증폭기 중 하나를 나타내며, 여기서 증폭기는 매우 약한 신호 (예를 들어, 안테나에 의해 포획됨)를 증폭시키기 위해 사용되는 전자 증폭기이다. 보통 검출 기기와 매우 인접하게 위치하여 급전선로에서의 손실을 감소시킨다. 통상, LNA를 사용하여 수신 체인(receive chain)의 후속 단계로부터의 노이즈의 실행을 LNA의 진폭이득(gain)으로 감소시는 반면에, LNA 그 자체의 노이즈는 수신 신호로 바로 주입된다. 따라서, 가능한 적은 노이즈 및 디스토션을 부가하면서 목적하는 신호 전원을 상승시켜 상기 신호의 회복이 시스템의 후속 단계에서 가능하게 하는 LNA가 필요하다. 양호한 LNA는 낮은 NF (약 1dB), 충분히 큰 진폭이득 (약 20dB)을 갖고, 충분히 큰 상호변조 및 압축점 (IP3 및 P1dB)을 가져야 한다.
당업계에 공지된 용어 "압전 작동기"는 압전 변환기를 나타낸다. 능동 소자는 기본적으로 그의 2개의 반대면에 부착된 전극을 갖는 하나의 극성 물질 (즉, 분자의 일부가 양으로 하전되고, 분자의 다른 일부가 음으로 하전됨)이다. 전기장이 물질을 가로질러 인가될 때, 극성 분자가 전기장에 맞춰 그 자체로 정렬됨으로써 물질의 분자 또는 결정 구조 내부에 유도 쌍극자가 생성될 것이다. 이러한 분자의 정렬은 물질의 치수 변화를 유발할 것이다. 본 발명의 기기와 관련하여, 변환기를 사용하여 매우 작은 규모로 미세한 정도의 움직임을 달성한다.
용어 "폴리핵산"은 단일 또는 (일부) 이중 가닥 DNA 또는 RNA 또는 그의 합성 유사체의 임의의 올리고머 또는 중합체를 나타내고; 본원에서 사용시 폴리핵산은 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기 쌍형성에 기초하여 특이성을 갖는 상보적 가닥과 결합할 수 있다.
용어 "항체"는 항원 결합 부분을 통해 결합 특이성을 갖는 임의의 항체 또는 항체 단편을 나타낸다. 예를 들어, 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 밝혀졌다. 용어 항체의 "항원-결합 부분"에 포함된 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편, 즉, VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어진 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편, 즉, 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (문헌 [Ward et al., (1989) Nature 341:544-546]); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 포함된다.
용어 "압타머"는 특정 표적 분자와 결합하는 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드를 나타낸다. 예시적인 압타머에는, 예를 들어 문헌 [Gold et al. US 5,567,588 "Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: Solution SELEX"]에 기재된 바와 같은 SELEX 프로토콜로부터 유래된 것들이 포함되고; 변형된 뉴클레오티드를 함유한 SELEX-확인된 올리고뉴클레오티드는, 예를 들어 리보스의 2' 위치, 피리미딘의 5 위치 및 퓨린의 8 위치에서 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 유도체를 함유한 올리고뉴클레오티드를 기재하고 있는 미국 특허 제5,660,985호, 다양한 2'-변형된 피리미딘을 함유한 올리고뉴클레오티드를 기재하고 있는 미국 특허 제5,756,703호, 및 2'-아미노 (2'-NH2), 2'-플루오로 (2'-F) 및/또는 2'-O-메틸 (2'-OMe) 치환기로 변형된 하나 이상의 뉴클레오티드를 함유한 고도로 특이적인 올리고뉴클레오티드를 기재하고 있는 미국 특허 제5,580,737호에 기재되어 있다. 펩티드 압타머는 조합 인식 단백질이다. 펩티드 압타머는 효모 2-혼성 방법을 이용하여 문헌 [Colas, "The eleven-year switch of peptide aptamers," J. Biol. 7(1) 2 (2008)]에 기재된 바와 같이 다양한 조절 경로에 관여하는 다양한 세포, 바이러스 및 박테리아 표적 단백질과 결합하는 것으로 선택된다. 펩티드 압타머는 US 20090318363 ("Peptide aptamer for neutralizing the binding of platelet antigene specific antibodies and diagnostic and therapeutic applications containing the same")에 기재되어 있다.
용어 "염료"는 또 다른 조성물 물질 또는 혼합물에 색을 부여하는 조성물을 의미한다. 바람직한 염료는 형광발생 화합물이다. 또한, 이 정의에 포함되는 것은 에너지 전달 염료이다. 또한, 미국 특허 제6,335,440호 (이는 또한 그의 전문이 본원에 참조로 포함됨)에서 정의 또는 사용되는 것과 같은 크산텐 염료, 비대칭성 벤조크산텐 염료, 로다민 염료, 플루오레세인 염료, 4,7-디클로로로다민 염료, 4,7-디클로로플루오레세인 염료, 카르복시플루오레세인 염료, 카르복시로다민 염료, 카르복시 R110 염료, 카르복시 R6G 염료, 카르복시-X-로다민 염료, 시아닌 염료, 프탈로시아닌 염료, 스쿠아레인 염료 및 Cy5가 포함된다.
일반 방법 및 장치
제1 측면에서, 본 발명은 제어된 세포 부착 및 성장을 목적으로 사용자 정의된 패턴을 임의의 기판에 침착시키기 위한 시스템을 포함한다. 상기 방법은 제어된 침착이 주위 환경에서 비관능화된 표면 상에 수행될 수 있다는 이점을 갖는다. 이러한 패턴화된 기판은 기정 패턴에 대한 우수한 부착 및 생존율, 및 성공적인 세포 배양을 위해 사용된다.
기판 패턴화에 적용된 기기
시스템은 주사 이온 전도 현미경 (SICM)을 위한 시스템에 의해 예시되는 컴퓨터 제어 피드백 시스템을 포함한다. SICM의 기본적인 작동은 당업계에 잘 알려져 있다 (예를 들어, 문헌 [Hansma, P.K., et al., The Scanning Ion-Conductance Microscope. Science, 1989. 243(4891): p. 641-643]; [Prater, C.B., et al., Scanning Ion-Conductance Microscope And Atomic Force Microscope. Scanning, 1990. 12(1): p. 50-52] 참조). 요약하면, 기본 SICM은 전해질로 역충전되며 전해조에 침지되는 단일 피펫으로 구성된다. 전극을 나노피펫에 두며, 접지 전극을 조에서 약간 거리가 떨어져 둔다. 나노피펫의 개구부가 기판, 보통은 표면에 접근하기 때문에, 기재된 것에 대한 피펫 오리피스를 통한 전류 유동은 "전류 스퀴징(current squeezing)"에 의해 감소될 것이다. 이러한 전류의 감소는 나노피펫의 높이를 제어하기 위한 피드백 신호로서 작용할 수 있으며, 이는 표면 상의 기정 거리에서 제어될 수 있다. 이후, 나노피펫을 표면을 따라 스캐닝하는 경우에, 지형 이미지가 기판에 렌더링될 수 있다.
하기 설명되는 것과 같이, 이 장치의 특징을 단일 세포의 주입 또는 단일 세포 내의 분자 결합의 측정을 위한 관련된 장치에 도입할 수 있다.
도 1은 본 발명 장치의 모식도이며, 이는 본 발명에 따른 세포 주입을 위해 맞춤 제작된 변형된 SICM (주사 이온 전도 현미경)에 포함될 수 있다. 본 발명 장치는 막의 침투에 대한 미세 제어를 위해 z 방향으로의 피드백-제어 위치결정을 필요로 한다. 본 발명 장치에 따르면, 이중-배럴형 나노피펫 (102)가 압전 x,y,z 제어기 (104), 및 압전 x,y,z 제어기에 작동가능하게 연결된 압전 제어기 (106)을 포함하는 xyz 제어부에 부착된다. 압전 xyz 제어기 (104)는 매우 미세한 움직임을 위해 사용되며, 보다 거친 움직임을 위해 스텝-모터(step-motor) 현미조작기 (나타내지 않음)에 장착된다. 압전 제어 회로는 DAQ 카드 (114)를 통해 컴퓨터 (116)에 연결된다. DAQ는 나노피펫 내의 전극 (110)에 연결되는 전자 센서 및 증폭기에 연결된다 (제1 구경에 융합된 제2 구경에의 참고 전극 (122)는 나타난 바와 같이 지면에 연결됨). 추가적으로, SICM 모듈은 피펫 바이어스 및 전류 측정을 위한 저 노이즈 증폭기 (108) (예를 들어, 악소패치(Axopatch) 200B; 몰레큘러 디바이시즈(Molecular Devices; 캘리포니아주 서니베일(Sunnyvale, CA) 소재))을 포함한다. 나타낸 바와 같이, 증폭기는 DAQ 카드 (114)를 통해 나노피펫 내의 전극 (110)에 연결된다. 이는 증폭기 (108)로 공급하는 헤드스테이지(headstage) 증폭기 (112)를 포함하며, 이는 DAQ (데이터 수집) 카드 (114)에 출력한다. 적합한 DAQ 카드는 시판된다. 예를 들어, DAQ 기판 (내셔널 인스트루먼츠(National Instruments)에 의해 제조됨)은 온보드 타이머, 8 채널 입력 장치를 갖는 12 비트 아날로그 디지털 변환기 (ADC), 2 디지털 아날로그 변환기 (DAC) 및 24 TTL 단계 로직 입력 장치로 구성된 다기능 플러그-앤-플레이, 아날로그 및 디지털 입/출력 기판이다.
또한, 컴퓨터 제어기 (116)과 인터페이스로 접속된 DAQ 카드 (이는 FPGA임)가 압전 xyz 제어기를 통한 나노피펫의 움직임을 제어하기 위한 회로에 연결된다. 한 xyz 제어기는 X, Y 및 Z 방향으로의 거친 제어를 위한 현미조작기 (106) (예를 들어, MP-285)이다. 이후, 이를 X, Y 및 Z 방향으로의 미세 제어를 위한 압전 작동기 (104) (2-3 nm내에서 위치결정가능함) 및 시스템의 하드웨어 제어를 위한 FPGA와 커플링시킨다. 추가적으로, 시스템은 저 노이즈 고전압원 (118) (예를 들어, 모델(Model) 2100 격리된 펄스 자극기, A-M 시스템즈(Systems)), 및 피드백 제어에 요구되는 저전압 (약 0.01-1 V) 및 전기영동 물질 방출에 필요한 고전압 사이의 전환을 위한 맞춤형 계전기 (120)으로 변형된다 (도 2). 시스템은 예를 들어 랩뷰(LabVIEW)로 작성된 사용자 암호화 소프트웨어를 사용하여 제어된다. 랩뷰는 내셔널 인스트루먼츠 코포레이션으로부터 입수가능하며, 랩뷰는 플로우차트와 유사한 직관적인 그래픽 아이콘 및 선을 사용하는, 정교한 측정, 시험 및 제어 시스템의 개발을 위해 사용되는 그래픽 프로그래밍 환경이다. 따라서, 사용자는 기정 나노피펫 xyz 운동 패턴, 및 또한 기정 시간 길이 동안 기정 위치에서 물질의 방출을 유발하기 위한 전압 변화를 설계할 수 있다. 또한, 랩뷰는 기정 패턴이 소프트웨어에 로딩되는 것을 가능하도록 한다. 랩뷰 또는 다른 통상적인 소프트웨어가 나노피펫으로부터의 감지 및 방출, 및 나노피펫의 운동을 제어하기 위해 본 발명 장치와 함께 제공된다.
피펫의 구경으로부터의 물질 방출은 적절한 완충액 및 관심 물질로 역충전된 이중-배럴형 나노피펫을 사용하여 수행된다. 적합한 완충액에는 포스페이트, 시트레이트, 또는 분자 연구에서 일상적으로 사용되는 임의의 다른 완충액이 포함된다. 방출 전압은 전원 장치 (118)로부터 생성되는 전압의 변화에 의해 전극 (110) 및 (122) 사이에 인가된다.
다양한 전해질 용액을 나노피펫 구경에서 사용하여 관심 물질의 방출을 수행할 수 있다. 세포 패턴화의 경우에서, 관심 물질을 사용하여 세포 부착 패턴을 생성할 것이다. 하기 기재되는 것과 같이, 관심 물질은 용도에 따라 변할 수 있다. 관심 물질은 구경에서 전해질 용액에 현탁되며, 이는 알려져 있는 대로 용해된 전해질, 즉 유리 이온을 함유한다. 통상적인 이온에는 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 클로라이드, 포스페이트 및 비카르보네이트가 포함된다. 다른 이온 종을 사용할 수 있다. 통상적으로, 관심 물질은 액체일 것이며, 즉 이는 용액 내에 관심 물질 및 이온을 포함할 것이다. 관심 물질 자체는 전해질, 예컨대 인간 혈장 또는 다른 체액, 용액, 물 샘플 등일 수 있다. 전해질은 이온 전류를 보유하여야 하며, 약 10-100 mM, 바람직하게는 약 100 mM의 양이온 종 및 음이온 종이 이 기능을 위해 필요한 것으로 생각된다. 본 발명 장치는 나노피펫 내부 및 샘플 물질에서 동일하거나 상이한 전해질을 이용할 수 있다. 다양한 염을 전해질 용액에서 사용할 수 있다. 이들은 양이온 ((+) 하전된 이온) 및 음이온 ((-) 이온)으로 구성되어, 생성물이 전기적으로 중성 (순전하 없음)이 되도록 한다. 이들 성분 이온은 무기 이온, 예컨대 클로라이드 (Cl-), 및 또한 유기 이온, 예컨대 아세테이트 (CH3COO-) 및 단원자 이온, 예컨대 플루오라이드 (F-), 및 또한 다원자 이온, 예컨대 술페이트 (SO4 2 -)일 수 있다. 다양한 염이 있다. 물에 용해되는 경우에 가수분해하여 히드록시드 이온을 생성하는 염은 염기성 염이며, 물에서 가수분해하여 히드로늄 이온을 생성하는 염은 산성 염이다. 중성 염은 산성 염 및 염기성 염 둘 다 아닌 것이다. 용융된 염 및 용해된 염을 함유하는 용액 (예를 들어, 물 중 염화나트륨)은 전해질로 지칭되는데, 이들은 전기를 전도할 수 있기 때문이다.
방출되는 관심 물질에는 소분자, 대사물질, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 아미노산, 염료, 중합체, 나노입자가 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다.
나노피펫은 석영을 사용하여 제작될 수 있다. 이중-배럴형 피펫은 단일-배럴형 피펫에서와 같이 외부 접지 전극을 필요로 하지 않도록 피펫의 팁에 걸쳐 소형의 메니스커스를 형성하는 이점을 제공한다. 추가적으로, 회로가 피펫의 2개 배럴 사이에서 완성되기 때문에, 팁은 공기 중에서 SICM으로 기능할 수 있으며, 따라서 나노피펫의 팁이 건조한 표면에 접근하는 것을 가능하도록 한다. 이는 문헌 [Rodolfa et al in 2005 ("Two-component graded deposition of biomolecules with a double-barreled nanopipette." in Angewandte Chemie-International Edition, 44: p. 6854-6859)]에서 물질이 전기삼투력 및 상대적으로 고전압을 사용하여 나노피펫의 팁으로부터 방출될 수 있다는 것으로 이전에 밝혀졌다. 바람직하게는, 나노피펫은 융합된 실리카 또는 비결정질 석영으로 형성되며, 이는 결정질 석영에 비해 비용이 덜 든다. 그러나, 결정질 석영을 이용할 수 있다. 세라믹스 및 유리 세라믹스 및 붕규산염 유리 또한 이용할 수 있지만, 정확도는 석영만큼 우수하지는 않다. 용어 "석영"은 특정 물질 및 또한 적용가능한 세라믹스, 유리 세라믹스 또는 붕규산염 유리를 포함하는 것으로 정의 및 의도된다. 다양한 형태의 유리 또는 석영을 본 발명의 나노피펫 제작에서 사용할 수 있다는 것을 주목하여야 한다. 주요 고려사항은 물질이 좁은 직경의 개구부로 연신되는 능력이다. 다르게는, 나노피펫은 다른 비-전도성 물질, 예컨대 다른 산화규소, 금속 산화물 (예를 들어, 알루미늄), 탄소 (예를 들어, US 7597941의 관형 탄소 나노/마이크로 구조 및 그를 제조하는 방법 참조) 등으로부터 제작될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 시스템은 기판에서의 세포 패턴화를 위해 사용된다. 패턴화는 나노피펫 높이 및 위치를 제어하도록 프로그래밍된 소프트웨어를 사용하여 제어된다. 기정 패턴이 소프트웨어에 로딩된다. 정의된 영역에서, 나노피펫을 패턴화되는 기판의 표면으로 서서히 하강시킨다. 일단 피펫의 메니스커스가 기판과 접촉하게 되면, 계전기가 증폭기를 분리시키고, 정의된 시간 동안 고전압을 인가한다. 경과 시간 이후에, 팁을 빠르게 복귀시키고, 피펫 팁 쪽으로의 전압을 저항기를 통해 지면으로 방전시키고, 증폭기를 피펫에 재연결시킨다. 이후, 팁을 다음 위치로 이동시키고, 전체 패턴이 침착될 때까지 과정을 반복한다. 방출 속도는 인가된 전압 및 인가된 전압의 지속 시간 둘 다에 따른다 (도 3에서의 시간에 대한 방출된 부피 그래프 참조).
본 명세서에서 기재된 장치를 사용하여, 50 pL/s 내지 100 pL/s 만큼 적은 부피가 나노피펫으로부터 방출될 수 있다. 부피는 상기 양에 비해 더 적을 수도 있지만, 광학 현미경의 해상도를 벗어날 것이다. 방출 부피는 오일조, 예를 들어 미네랄 오일조에서의 적합한 중합체 표면으로의 방출에 의해 측정되었다. 팁 및 기판 사이에서의 접촉에 적합한 액체에는 유기 액체 중합체 (예를 들어, 오일) 및 규소-계 중합체, 예를 들어 실리콘이 포함된다. 실리콘의 예는 폴리디메틸실록산이다. 반구형의 오일 방울이 부피 계산을 위해 가정되었다. 방출 부피는 인가된 전압의 시간에 대하여 선형인 것으로 나타난다. 직경이 3 μm만큼 작은 스팟 크기가 침착될 수 있다. 도 4는 술포로다민의 패턴화된 스팟의 어레이의 예를 나타내며, 여기서 평균 스팟 직경은 4±0.8 μm이다. 본원에서 제시된 결과는 개개의 나노피펫을 대표하며; 파라미터는 이들 데이터에 대한 선형 피팅을 통해 얻어지며, 나노피펫 사이에서 변할 수 있다. 표준화된 어레이 프린팅에도 불구하고, 각각의 나노피펫은 오일에서의 액적의 방출에 의해 쉽게 보정될 수 있다. 추가적으로, 배럴에서의 바이어스의 반전에 의해, 상이한 물질이 상이한 배럴로부터 제어가능하게 방출될 수 있다. 각각의 배럴에의 별개의 물질의 로딩에 의해, 다층 패턴이 단일 패턴화 시행에서 미리-등록된 방식으로 쌓여질 수 있다.
세포가 배양을 위해 부착되는 기판 상의 패턴은 단백질, 유기 중합체를 비롯한 중합체, 또는 생체중합체를 사용하여 기판 상에 형성될 수 있다. 바람직하게는, 패턴화를 사용하여 다수의 개별적인 영역을 형성하며, 여기서 개별적인 세포 성장이 일어날 수 있다. 패턴화 물질의 예에는 폴리리신, 소혈청 알부민 (BSA), 및 표면 부착 분자, 예를 들어 피브로넥틴 또는 라미닌이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다. 패턴 침착은 양자점과 전해질 용액과의 혼합에 의해 확인될 수 있다. 패턴은 예를 들어 형광 현미경을 사용하여 침착을 가시화하고 프린팅에서의 오류를 점검하여 평가할 수 있다. 이후, 침착시 기판을 자가 마스킹 단계에서 세척한다. 마스킹 분자를 갖는 적합한 완충액을 세척 단계를 위해 사용할 수 있다. 마스킹을 위해 사용되는 분자의 예에는 소혈청 알부민 (BSA)이 포함된다. 패턴 형성 이후에, 기판을 세포 배양 배지에 침지시킬 수 있다. 세포가 배지에 분산되고, 기판에 정착되도록 할 수 있다. 수시간의 인큐베이션 이후에, 세포를 미리-가온된 배양 배지와 함께 조심스럽게 세정하여, 기판에 단단하게 부착되지 않은 임의의 세포를 제거한다. 세포 부착은 정성적 및 정량적으로 평가한다.
세포 주입
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 나노피펫 시스템은 세포에의 최소 손상과 함께 고효율 방식으로의 살아있는 단일 세포로의 물질의 전기삼투 주입을 위해 사용된다. 이 방법의 이점은 고도로 자동화된 종류의 주입, 주입 부피의 정확한 제어, 및 높은 세포 생존율이다. 추가적으로, 세포 체질 장치(cell sifting device)가 완전 자동화 시스템에 대한 가능성을 증가시키는 세포 고정화를 위해 하기 제시진다.
세포 주입은 적합한 완충액 및 주입되는 물질로 역충전된 이중-배럴형 나노피펫 (도　2에서 나타냄)을 사용하여 수행할 수 있다. 적합한 완충액에는 포스페이트, 시트레이트 또는 분자 생물학 연구에서 통상적으로 사용되는 임의의 다른 완충액이 포함된다. 주입되는 물질에는 소분자, 대사물질, 핵산, 올리고뉴클레오티드, 펩티드, 아미노산이 포함되지만, 이들로 제한되지는 않는다. 도 2는 배럴 (204), (206), 및 배럴 내에 전극 (208), (210) (각 배럴 당 1개)을 갖는 이중-배럴형 피펫 (202)를 사용하는 세포 침투를 예시한다. 피펫 (202)는 도 1에서 나타낸 것과 같은 압전 제어기에 부착될 것이다. 이중-배럴형 피펫은 단일-배럴형 피펫에서와 같이 외부 접지 전극을 필요로 하지 않도록 하나의 배럴이 접지 전극으로서 작용할 수 있는 다른 배럴에 대하여 편향되도록 하는 이점을 제공한다 (도 1에서의 전극 (122) 참조). 추가적으로, 이는 단일-배럴형 피펫 및 외부 접지 전극을 사용하여 발생할 수 있는 임의의 전기천공 효과를 제거한다는 이점을 갖는다. 나노피펫의 팁으로부터의 방출 속도는 인가된 전압 및 인가된 전압의 지속 시간 둘 다에 의존한다 (도 3). 방출 부피는 인가된 전압의 시간에 대해 선형이 되는 것으로 나타나며, 이는 미네랄 오일에 침지된 피펫 팁에 대하여 100 V였다. 방출된 물질의 액적 크기의 측정에 의한 보정 목적으로 미네랄 오일을 단독으로 사용하였다. 미네랄 오일은 방출된 물질을 함유하는데, 이는 수용액이 미네랄 오일에 가용성이지 않기 때문이다.
전원 장치 (118)에 연결된 배럴 (202)로부터 세포 (212)로의 물질의 주입은 도 1에서 상기 기재된 회로를 사용하여 수행되며, 맞춤형 소프트웨어를 사용하여 제어된다. 주입은 세포 (212)의 세포질 구역에서 일어나는 것으로 나타나지만, 관찰되는 핵 (214)로의 주입 또한 달성될 수 있다. 세포는 고체 지지체 (216) 상에 있으며, 이는 도 6에서 나타낸 것과 같이 생성될 수 있다. 박테리아, 진균, 동물, 포유동물 세포를 비롯한 세포, 및 세포주로부터의 세포를 주입 목적으로 사용할 수 있다. 주입은 나노피펫을 세포막의 50 내지 200 nm, 바람직하게는 약 100 nm까지 서서히 하강시켜 달성되며, 여기서 이는 피드백을 진입시키고 중지된다. 이후, 나노피펫을 0.5 내지 2 μm, 바람직하게는 0.9-1.2 μm로 재빨리 하강시켜 세포막을 침투하도록 한다. 하강시의 나노피펫의 속도는 50 내지 200 μm/s, 바람직하게는 80 μm/s 초과일 수 있다. 저전압 피드백 시스템이 나노피펫으로부터 차단되며, 고전압원이 기정 시간 동안 고전압 계전기에 의해 연결된다. 피드백을 위한 저전압은 2 V 미만, 바람직하게는 1 V 미만의 전압을 포함한다. 피드백을 위한 고전압은 0.5 V 초과, 바람직하게는 1 V 초과의 전압을 포함한다. 2개의 상이한 전원 장치가 이용되며; 하나는 -1 내지 +1 V 범위의 전원 장치를 갖는 피펫의 위치결정을 위한 것이며; 다른 하나는 -100V 내지 +100 V 범위의 주입을 위한 것이다. 통상적인 세포 주입은 약 5-30 V 범위이지만, 이들은 방출이 재현가능하며 전압이 세포에 손상을 입히지 않는 한 변화할 수 있다. 이후, 나노피펫을 저항기를 통해 방전시키고, 나노피펫을 고속으로 복귀시킨다. 도 5는 HeLa 세포로의 염료 카르복시플루오레세인의 주입의 예를 나타낸다. 세포 손상이 없음이 즉각적으로 시각화되며, 형광이 수분 동안 세포벽 내에서 국한된다 (도 5).
세포 기판 패턴화
본 발명의 또 다른 측면은 정렬된 어레이에서의 비드를 비롯한 세포 또는 분자 구조의 고정화를 위해 설계 및 제작된 세포 체(cell sifter)에 관한 것이다. 정렬된 어레이에서의 세포의 고정화에 의해, SICM은 어레이의 각각의 구성요소를 순차적으로 다루도록 제어되어, 작동자가 개별적으로 각각의 세포를 개별적으로 주입하기 위한 필요를 감소시킬 수 있다. 체는 표준 반도체 제작 기술을 사용하여 제작된다 (도 6a-e). 요약하면, 500 내지 1000 nm 층, 바람직하게는 약 750 nm 층의 규소 염 (예를 들어, 질화규소) (602)를 실리콘 웨이퍼 (604)의 표면에 침착시킨다. 실리콘 웨이퍼는 두께가 200 내지 1000 μm, 바람직하게는 300-600 μm일 수 있다. 1 내지 5 μm, 바람직하게는 2-3 μm의 구멍 (606)이 반응성 이온 에칭을 사용하여 적합한 피치를 갖는 어레이에서의 규소 염 층을 통해 에칭된다. 적합한 피치는 50 μm 초과이고, 바람직하게는 대략 100 μm 피치이다. 수탁 마크(Fiduciary mark; 나타내지 않음)가 어레이의 한 모서리에 에칭되며, 이는 SICM 정렬을 위해 사용할 수 있다. 이후, 웨이퍼 후면 (608)을 적합한 알칼리 (예를 들어, 수산화나트륨 또는 수산화칼륨)에 의해 에칭하여, 구멍 아래의 챔버 (610), 및 또한 챔버에의 음의 압력의 인가를 위한 채널 (612)를 형성한다. 이후, 실리콘 웨이퍼를 유리 웨이퍼 (614)에 결합시켜 에칭된 챔버 및 채널 둘 다를 밀봉시킨다. 장치를 대칭적으로 설계하여, 2개 어레이가 장치의 대향 단부에 존재하도록 한다. 한 어레이 상의 규소 염 층의 파괴, 및 진공 라인에 부착되는 미늘(barb) (616)의 부착에 의해 장치가 완성된다. 다른 어레이 주위에, 플라스틱 고리 (618)이 세포 배양 챔버로서 작용하는데 적합한 중합체와 함께 부착되어 세포가 세포 배양 배지에 침지되도록 한다. 적합한 중합체에는 규소 중합체, 예를 들어 실리콘을 비롯한 유기 중합체가 포함된다. 실리콘의 예는 폴리디메틸실록산이다. 장치는 중합체를 비롯한 (이로 제한되지는 않음) 분자를 고정화시키는데 사용할 수 있다. 분자는 비드 (620)에 포함될 수 있다. 세포 또는 분자는 장치 관통 구멍에의 음의 압력의 인가에 의해 고정된다. 세포는 예시적인 비드 (620)에서 나타난 것과 같이 구멍에 의해 형성되는 어레이에 위치될 것이다.
예로서, 10 μm 형광 폴리스티렌 비드 (녹황색 - 흡수: 505; 방출: 515)를 사용하여 장치를 시험하였다. 비드는 대략 포유동물 세포 크기이며, 장치의 시험에 대한 우수한 모델을 제공한다. 비드를 장치 관통 구멍에의 음의 압력의 인가에 의해 성공적으로 고정시켰다. 부드러운 세척 이후에, 모든 관통 구멍이 각 구멍을 통해 단일 폴리스티렌 비드를 고정시켰음을 확인하였다 (도 6e). 또 다른 예에서, 세포 체를 사용하여 HeLa 세포를 고정시켰다. 세포를 0.1 M PBS에 현탁시키고, 관통 구멍에의 음의 압력의 인가에 의해 성공적으로 고정시켰다.
단일 세포 내에서의 분자 감지
본 발명의 또 다른 측면은 도 1에서 나타낸 것과 같이 센서로서의 작용을 위해 관능화되며 xyz 제어 주입이온 장치와 커플링되는 나노피펫의 조합에 관한 것이다. 나노피펫 센서는 점감된 광섬유와 기하학적으로 매우 유사하며; 이들은 동일한 레이저 풀링 방법(laser pulling process)으로 제작될 수 있지만, 전달 메카니즘은 본질적으로 상이하다. 광섬유 상에서의 생체검출은 형광 태그 부착된 분석물의 검출 또는 ELISA-유사 판독 중 하나에 의존하지만, 나노피펫 센서 판독은 순수하게 전기적이며 생체분자 표지화가 필요없다. 나노피펫 센서의 감도는 원뿔형의 나노피펫 팁에서 최대화되어, 팁 오리피스의 치수 및 구조가 바이오센서 성능에 중요하도록 한다. 나노규모-크기의 팁 개구부에서의 영구적인 결합으로부터의 게이트부는 나노피펫 전기 신호에 독특한 변화를 유발한다. 이후, 전기적 변화를 표지화에 대한 필요 없이 단순 전기화학적 기구로 실시간 검출한다. 광섬유와 같이, 나노피펫 센서는 압전 작동기와 통합되어 주사 이온 전도 현미경에서 활용되는 것과 같은 높은 공간 해상도를 달성할 수 있다. 이러한 나노피펫 센서 및 SICM의 조합은 다수 및 단일 세포를 포함하는 표면의 지형도 작성을 위해 사용된다. 또 다른 용도는 무-표지 바이오센서를 사용하여 살아있는 단일 세포에서의 단백질 및 핵산을 비롯한 분자 및 대사물질의 검출이다. 몇몇 실시양태에서, 면역검정은 살아있는 단일 세포 내에서 수행될 수 있다. 또 다른 용도는 단일 암세포에서의 종양단백질의 검출이다. 또 다른 용도는 실시간 및 나노규모 해상도로의 단일 세포에서의 생체활성의 측정이다. 예를 들어, 이는 단일 세포에서의 단백질-단백질 상호작용의 연구에서 사용될 수 있다.
도 9a는 본원에서 실시된 기술을 사용하여 세포의 지형도를 도시한 그림이다. 세포 (902) 내부의 분자의 검출은 고정밀 나노조작기 및 전류 피드백 루프에 의존하여, 프로브 세포 내로 정의된 깊이까지 나노피펫 센서 (904)를 삽입한다. 나노피펫 (904)이 세포의 표면에 접근함에 따라, 그 안에 단일 구경 및 전극 (906)을 갖는 피펫 (904)을 통한 이온 전류는, 주사 이온 전도 현미경에서 활용되는 널리 공지된 효과인 "전류 스퀴징"으로 인해 감소될 것이다. 이온 전류를 모니터링함으로써, 도 1에 제시된 바와 같이 피드백 회로 및 xyz 제어기를 사용하여, 세포막의 약 200nm 이내에서 나노피펫의 정밀한 위치를 측정하거나 제어할 수 있다. 추가로, 피드백 메카니즘은 나노피펫 팁이 세포막 이외의 어떤 것과도 접촉하지 않도록 하여, 팁이 다른 구조 또는 기판과 접촉하여 잠재적으로 고장나는 것으로부터 예방한다. 세포는 적합한 중합체의 층으로 코팅된 평평한 표면 (908) (예를 들어, 페트리 디쉬, 유리 슬라이드) 상에 플레이팅될 수 있다. 적합한 중합체에는 유기 중합체, 예를 들어 실리콘 중합체, 예를 들어 실리콘이 포함된다. 실리콘의 예에는 폴리디메틸실록산이 있다. 세포는, 포스페이트, 시트레이트 완충액을 포함하나 이에 제한되지는 않는 적합한 완충액으로 덮일 수 있다. 전기삼투 유동이 나노피펫 배럴으로부터 밖으로 향하는 경우, 나노피펫 센서는 양전압 (예를 들어, +100mV 내지 +1000 mV 사이, 바람직하게는 +500mV 초과의 전압)에서 편향될 수 있다. 이러한 배열은 센서와 상호작용하고 그의 성능에 영향을 미치는 배지에 존재하는 임의의 세포 파편 또는 분자를 피한다. 전류가 그의 초기 값의 70 내지 99%, 바람직하게는 99% 초과로 감소될 때까지, 피드백 루프는 약 10 nm의 단계로 센서를 낮춘다. 상기와 같이 세포막 위로 초기에 위치시킨 후, 50 내지 200 ㎛/s, 바람직하게는 80 내지 150 ㎛/s 사이의 속도에서 약 2 ㎛, 바람직하게는 1 ㎛ 초과까지 나노피펫을 세포 내로 삽입한다. 센서를 매우 빠른 속도에서 삽입하여, 세포에 대한 방해를 감소시키고, 세포 생존력을 극대화한다. 다중 침투는 나노피펫 전류 기준선 및 세포의 생존력에 있어 임의의 분명한 변화 없이 동일한 세포 상에서 수행될 수 있다. 일단 세포 내로 삽입하고 나면, 250mV 내지 500 mV 사이의 진폭, 및 1 내지 10 Hz 사이, 바람직하게는 4 Hz 초과의 진동수를 갖는 AC 전압을 나노피펫 센서에 인가하여, 감지를 수행한다.
본 발명의 나노피펫 센서는 본 발명의 기기의 감지 구성요소를 위해 사용되는 관능화된 나노피펫을 포함한다. 관능화된 나노피펫은 2명의 발명가에 의해 이전 미국 특허 출원 공보 (제US 2010/0072080호, 2010년 3월 25일 발행, 제목 "Functionalized Nanopipette Biosensor")에 기재되어 있으며, 이는 본원에 참고로 포함된다. 요컨대, 나노피펫은, 항체, 펩티드 및 생중합체를 포함하나 이에 제한되지는 않는 생체분자, 중합체 및 다당류를 비롯한 분자로의 화학적 결합에 의해 관능화될 수 있다. 폴리아크릴산 (PAA), 아크릴산 단위의 중합체를 사용하여 센서를 내부 표면 위로 코팅할 수 있다. PAA의 화학식은 (C3H4O2)n이다. 중성 pH의 수용액에서, 다수의 PAA 측쇄는 그들의 양성자를 잃고, 음전하를 얻는다. 이것은 PAA를 고분자전해질로 만든다. 표면은 추가로 관능화되어, 다당류 또는 단백질과 결합될 수 있다. 나노피펫 센서에 대한 결합의 검출은 전류 정류를 기재로 한다. 이는 대전된 나노공극이 비대칭 전류 출력을 갖는 대칭 입력 전압에 반응하는 때의 실행을 의미한다. 확산 전기 이중 층 두께가 공극 크기와 필적할만한 경우, 나노공극 표면상의 고정 대전된 종과 용액 내의 이온성 종 사이의 정전기적 상호작용은 나노피펫 선택투과성을 변경한다. 정류 계수 r은 특정 양전압에서 측정된 전류와, 동일한 전압에서 측정되지만 반대 극성을 갖는 전류 사이의 비율의 대수로서 정의된다.
Figure 112013088372354-pct00001
상기 계수는 나노피펫의 정류 특성의 유용한 지표이고, 따라서 센서 표면상의 고정 전하의 유용한 지표이다. 음으로 대전된 석영 나노공극은 음전류 정류 (r < 0)를 나타낸다. 폴리-L-리신, 덴드리머, 아미노실란 및 키토산과 같은 대전된 기능성 층으로 나노공극 표면을 변형시켜 정류를 인버트할 수 있다 (r > 0).
실시예
실시예 1: 물질 및 방법
이중- 배럴형 나노피펫 제작: 외경 1.2mm 및 내경 0.90mm인 세타 석영 모세관 (QT120-90-7.5; 셔터 인스트루먼트 컴퍼니 (Sutter Instrument Co.))으로부터 나노피펫을 조립하였다. 이어서, 배형 (two-line) 프로그램으로 프로그래밍된 P-2000 레이저 풀러 (셔터 인스트루먼트 컴퍼니)를 사용하여 모세관을 당겨, 약 50 nm의 내경을 갖는 나노피펫을 조립하였다. 사용된 파라미터는 Heat 650, Fil 4, Vel 20, Del 170, 및 Pul 0; Heat 750, Fil 4, Vel 40, Del 170, 및 Pul 200이었다. 생성된 나노피펫 팁은 약 50nm의 내경을 가졌다.
세포 배양: PDMS의 얇은 층으로 덮인 페트리 디쉬 상에서 37℃, 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청, 1% 소듐 피루베이트 및 1% Pen/Strep/Glu를 함유한 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's modified Eagle's medium; DMEM)에서 HeLa 세포 (실험실에서 유지됨)를 배양하였다 (37℃, 5% CO2).
시약: 폴리-L-리신 (PLL; 19320-A)을 일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈 (Electron Microscopy Sciences; 미국 펜실베니아주 핫필드 소재)로부터 구매하였다. 둘베코 변형 이글 배지 (MT10017CV), 소 태아 혈청 (BW14502F), 소듐 피루베이트 (BW13115E) 및 Pen/Strep/Glu (SV3008201)을 피셔 (Fisher)로부터 구매하였다. 폴리디메틸실록산을 다우 코닝 (Dow Corning; 실가드 (Sylgard)® 184 실리콘 엘라스토머 키트)으로부터 구매하였다. pH 7.4의 (BSA, Qdots) PBS 용액을 표준 방법을 사용하여 제조하였다. 18MΩcm-1 초과의 저항을 갖는 밀리큐 (MilliQ) 물을 사용하여 수성 시약을 제조하였다.
전기삼투 방출을 위한 측정 셋업: 셋업은 피펫 바이어스 및 전류 측정을 위한 저-노이즈 증폭기 (악소패치 (Axopatch) 200B, 몰레큘러 디바이스즈 (Molecular Devices), 미국 캘리포니아주 서니베일 소재), X, Y 및 Z 방향의 조제어 (coarse control)를 위한 현미조작기 (MP-285), X, Y 및 Z 방향의 미세 제어를 위한 압전 작동기, 및 시스템의 하드웨어 제어를 위한 FPGA (내셔날 인스트루먼츠 (National Instruments))로 구성되었다. 시스템은 저-노이즈 고전압원 (모델 2100 아이솔레이티드 펄스 스티뮬레이터 (Model 2100 Isolated Pulse Stimulator), A-M 시스템즈 (A-M Systems)), 및 피드백 제어에 요구되는 저전압 및 전기영동 물질 방출에 필요한 고전압 사이를 전환하기 위한 커스텀 (custom) 계전기로 변형되었다. 랩뷰 (LabVIEW)로 작성된 커스텀 코드화된 소프트웨어를 사용하여 시스템을 제어하였다.
실시예 2: 나노피펫 센서를 사용한 단일 세포 생체내 면역검정
실험 섹션
측정 셋업: 나노피펫을 통한 전류 유동이 매우 작아서 참고 전극을 분극화할 수 없기 때문에, 2개의 전극 셋업을 사용하였다. 작업 전극으로서 작용하는 나노피펫 센서를 작업 완충액으로 재충전하고, Ag/AgCl 전극을 삽입하였다. 또다른 Ag/AgCl 전극을 보조제/참고 전극으로서 작용하는 벌크 용액에 두었다. 디지데이터 (DigiData) 1322A 디지티저 (digitizer) (몰레큘러 디바이스즈) 및 피클램프 (pClamp) 10 소프트웨어를 장착한 PC (몰레큘러 디바이스즈)를 갖는 악소패치 700B 증폭기에 두 전극을 연결하였다. 실온에서 수행되는 측정 지속기간 동안에 시스템은 교반하지 않은 채 두었다.
시약: 폴리-l-리신 (PLL; 19320-A)을 일렉트론 마이크로스코피 사이언시즈 (미국 펜실베니아주 핫필드 소재)로부터 구매하였다. 폴리클로날 항체 HPV16 E6 (C-19) 및 HPV18 E6을 산타 크루즈 바이오테크놀로지, 인코포레이션 (Santa Cruz Biotechnology, Inc., 미국 캘리포니아주 산타 크루즈 소재)으로부터 구매하였다. 둘베코 변형 이글 배지 (MT10017CV), 소 태아 혈청 (BW14502F), 소듐 피루베이트 (BW13115E) 및 Pen/Strep/Glu (SV3008201)을 피셔로부터 구매하였다. 폴리디메틸실록산을 다우 코닝 (실가드® 184 실리콘 엘라스토머 키트)으로부터 구매하였다. pH 7.4의 PBS 용액을 표준 방법으로 제조하였다. 18MΩcm-1 초과의 저항을 갖는 밀리큐 물을 사용하여 수성 시약을 제조하였다.
나노피펫 센서 제작: 외경 1.0mm 및 내경 0.70mm인 필라멘트를 갖는 석영 모세관 (QF100-70-5; 셔터 인스트루먼트 컴퍼니)으로부터 나노피펫을 조립하였다. 이어서, 프로그래밍된 P-2000 레이저 풀러 (셔터 인스트루먼트 컴퍼니)를 사용하여 모세관을 당겨, 약 50 nm의 내경을 갖는 나노피펫을 조립하였다. 사용된 파라미터는 Heat 700, Fil 4, Vel 60, Del 150, 및 Pul 192이었다. 생성된 나노피펫 팁은 56nm의 평균 직경을 갖는 37 내지 82 nm 범위의 내경을 가졌다.
항체 고정: 하기 단계를 통해 항체를 고정하였다. 첫째로, 물 중의 폴리-l-리신 0.01% 용액으로 충전하여 나노피펫 내부를 코팅한 후, 3분 동안 4600 rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 단계는 용액이 나노피펫의 정밀한 (very) 팁이 되게 하였다. 초과의 PLL 용액을 제거한 후, 나노피펫을 1시간 동안 120℃에서 구워서 PLL 코팅을 안정하게 하였다. 이어서 나노피펫을 술포-SMCC 용액 (2 mg/ml, 10mM EDTA, 50mM PBS)으로 충전하고, 3분 동안 4600 rpm에서 원심분리하고, 이어서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 나노피펫을 0.01M PBS로 세정하고, 적어도 3회 동안 원심분리하여, 임의의 비반응된 술포-SMCC 분자를 제거하였다. 술포-SMCC는, PLL 아미노기와 반응하는 아민-반응성 N-히드록시숙신이미드 (NHS 에스테르)를 함유하여, 티오에테르 결합을 통해 항체의 가교를 가능하게 하는 말레이미드기를 남겼다. 이어서, 나노피펫을 항체 용액 (10 ㎍/ml IgG, PBS, 1시간, 37℃)으로 인큐베이션하였다. 이어서, 항체-관능화된 나노피펫을 PBS로 적어도 3회 세정하고 원심분리하여, 임의의 비결합 항체를 제거하고, 팁 전체에 충전하는 고른 전해질을 수득하였다.
세포 용해: 성장 배지 (10% DMSO) 내의 약 106개의 세포를 함유하는 분취물 내로 HeLa 세포를 냉동시켰다. 해동 후, 세포를 펠렛으로 스핀 다운시키고, 상등액을 폐기하고, 100 ㎕ PBS 용액에서 재현탁시켰다. S-시리즈 소노랩 소프트웨어 (S-series SonoLAB software)에 의해 제어되는 코바리스 (Covaris)TM를 사용하여, 세포막을 용해시켰다. 조건: 듀티 사이클: 5%, 강도 3, 사이클/버스트 (Burst) 200, 60초 동안. 세포 용해물을 5분 동안 4000 rpm에서 원심분리하여, 생체분자 형태 세포 잔해를 분리하였다. 바이알을 얼음에 두고, 2시간 이내에 사용하여 프로테아제 억제를 최소화하였다.
주사 이온 전도 현미경: SICM을 내부에서 (in-house) 조립하였고, 이는 전류 증폭기 (몰레큘러 인스트루먼츠 (Molecular Instruments), 멀티클램프 (Multiclamp) 700B), 조제어를 위한 현미조작기 (셔터 인스트루먼트, MP-285), 및 미세 제어를 위한 압전 작동기 (피직 인스트루먼트 (Phyzik Instrumente), 나노큐브 (NanoCube))를 기재로 하였다. 특히 상기 적용을 위해 내부에 개발된 사용자 맞춤형 소프트웨어 (랩뷰)를 사용하여 셋업을 제어하였다.
세포 배양: PDMS의 얇은 층으로 덮인 페트리 디쉬 상에서 37℃, 5% CO2에서 10% 소 태아 혈청, 1% 소듐 피루베이트 및 1% Pen/Strep/Glu를 함유한 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM)에서 HeLa 세포 (실험실에서 유지됨)를 배양하였다 (37℃, 5% CO2).
세포내 단백질 검출
본 발명의 나노피펫 센서는 생체외 세포에서 종양단백질을 선택적으로 검출할 수 있었다. 첫째로, 상이한 HPV 유전자형을 구별하기 위한 나노피펫 센서의 선택성을 조사하였다. 제어 프로브가 HPV16E6을 함유하는 한편, 프로브 센서는 HPV18E6 표적 항체로 관능화시켰다. HPV-18 E6은 인간에서 "악성" 단백질로 공지되어 있다. 문헌 [Li et al., "The human papilloma virus (HPV)-18 E6 oncoprotein physically associates with Tyk2 and impairs Jak-STAT activation by interferon-alpha," Oncogene 18(42):5727-5737 (1999)]를 참조한다. HPV 16 E6은 문헌 [Gewin et al., "Identification of a novel telomerase repressor that interacts with the human papillomavirus type-16 E6/E6-AP complex," Genes Dev. 18(18):2269-2282 (2004)]에 추가로 기재되어 있다. 두 센서를 100 pg/mL HPV18E6 항원을 함유하는 용액에 담궜다. 특이적 단백질-단백질 상호작용은 단계적인 봉쇄를 통해 프로브 센서의 전류 진폭을 즉시 감소시켰다 (도 10). 근접한 나노피펫 센서 개구부에서의 이들의 순차적 결합은 국소 임피던스를 변경하고, 따라서 기록되는 이온 전류에서 단계적인 변화를 유도하였다. 이러한 영구적인 봉쇄는 제어 센서에서 관찰되지 않았고, 이들의 전기적 특성은 HPV18 단백질 E6 항원에 의해 교란되지 않았다. 게다가, 나노피펫을 이동하는 단백질 분자는 마이크로초 범위의 지속시간으로 더 짧고 일시적인 차단을 생성하면서, 이들 봉쇄는 또한 분자 전좌에 의해 생성된 것으로부터 구별가능하였다.
다음으로, 세포 용해물에서의 나노피펫 센서의 선택성을 시험하였다. 약 106개의 HeLa 세포를 함유하는 분취물의 순차적인 희석을 수행하여, 센서의 선택성을 측정하였다. 350,000x 희석은 HPV18E6 변형된 나노피펫 센서에 대해 측정된 전류에서 7% 변화가 검출된 반면, 네이키드 (naked) 및 HPV16E6 관능화된 나노피펫에서는 어떠한 변화도 초래하지 않았다 (도 11). 10배 더 많이 농축된 샘플에 대해 프로브 센서의 측정된 전류는 그의 초기 값의 23% 만큼 떨어진 반면, 제어 센서는 여전히 반응하지 않았다. 결과를 표 1에 요약하였다.
10 6 개의 HeLa 세포 용해물의 순차적인 희석에 대한 나노피펫 센서 출력 전류의 정규화된 편차
희석 나노피펫 HPV16E6 센서 HPV18E6 센서
350000X 100 100 93
35000X 100 100 77
35000x 93 86 9
3500x 2 4 4
인가된 전압은 비특이적 흡착을 피하지 않는 한 제한에 매우 중요한 역할을 하는 것으로 나타났으나, 도 11이 3500X 및 그 미만 (비특이적 흡착으로부터 신호가 두드러지게 올라감)의 세포 용해물의 희석에 대해 나타내는 바와 같이, 이러한 문제점은 농축된 용액에서 두드러지기 때문에 항상 고려되어야 한다. 도 11은 또한 상이한 농도에서 HeLa 세포 용해물을 첨가한 후에 측정된 전류에 대한 % 변화를 나타낸다. 인가된 전압은 pH 7.4의 PBS 용액에서 - 500 mV이었다.
단일 세포 내의 종양단백질 검출은 고정밀 나노조작기 및 전류 피드백 루프에 의존하여, 프로브 세포 내로 정의된 깊이까지 나노피펫 센서를 삽입하였다. 나노피펫이 세포의 표면에 접근함에 따라, 피펫을 통한 이온 전류는 주사 이온 전도 현미경에서 활용되는 널리 공지된 효과인 "전류 스퀴징"으로 인해 감소될 것이다. 이온 전류를 모니터링함으로써, 세포막의 약 200nm 이내에서 나노피펫의 정밀한 위치를 측정하거나 제어할 수 있었다. 추가로, 피드백 메카니즘은 나노피펫 팁이 세포막 이외의 어떤 것과도 접촉하지 않도록 하여, 팁이 다른 구조 또는 기판과 접촉하여 잠재적으로 고장나는 것으로부터 예방하였다. HeLa 세포는 PDMS의 층으로 코팅된 페트리 디쉬 상에 플레이팅하고, 완전 배지로 덮었다.
전기삼투 유동이 나노피펫 배럴으로부터 밖으로 향하는 경우, 나노피펫 센서는 +500mV에서 편향되었다. 이러한 배열은 센서와 상호작용하고 그의 성능에 영향을 미치는 배지에 존재하는 임의의 세포 파편 또는 분자를 피하였다. 전류가 그의 초기 값의 92%로 감소될 때까지, 피드백 루프는 10 nm의 단계로 센서를 낮추었다. 상기와 같이 세포막 위로 초기에 위치시킨 후, 100 ㎛/s 사이의 속도에서 2 ㎛까지 나노피펫을 세포 내로 삽입하였다. 센서를 매우 빠른 속도에서 삽입하여, 세포에 대한 방해를 감소시키고, 세포 생존력을 극대화하였다. 다중 침투는 나노피펫 전류 기준선 및 세포의 생존력에 있어 임의의 분명한 변화 없이 동일한 세포 상에서 수행될 수 있었다. 일단 세포 내로 삽입하고 나면, 500 mV의 진폭 및 5 Hz의 진동수를 갖는 AC 전압을 나노피펫 센서에 인가하여, 감지를 수행하였다.
도 12는 HeLa 세포 내로 삽입된 나노피펫 센서의 반응을 보여준다. HPV16E6 표적 항체로 관능화된 제어 센서에서 5% 감소가 측정된 반면, HeLa 세포 내로 베어 (bare) 나노피펫의 삽입시 기준선 전류에서의 분명한 변화가 검출되지 않았다. HeLa 세포는 HPV 18으로만 감염되는 것으로 공지되어 있다. 이는 항-HPV18E6으로 관능화된 나노피펫 센서를 사용한 HeLa 세포의 침투에 의해 확인되었다. HPV18E6 종양단백질의 특이적 검출로 인한 HeLa 세포 내로의 검출 후, 8% 전류 감소가 측정되었다. 이러한 결과는 나노피펫 기술이, 개별 세포 내의 및 임의의 표지에 대한 요구 없이, 단백질-단백질 연구를 가능하게 한다는 것을 나타낸다.
실시예 3: 석영 나노피펫을 사용한 제어된 전기삼투 방출에 의한 세포 패턴화
세포용 패턴을 폴리리신 및 소 혈청 알부민 (BSA)을 사용하여 정의하였다. 1mg/ml 라미닌을 나노피펫의 배럴에 사용하고, 35mm 페트리 디쉬에서 PDMS 기판 상에 직접 침착시켰다. 전해질 용액으로 양자점을 혼합하여 패턴 침착을 확인하였다. 이어서, 침착을 시각화하기 위해 형광 현미경을 사용하여 패턴을 평가하고, 인쇄물에서 오차를 확인할 수 있었다. 이어서, 셀프 마스킹 단계에서 1mg/ml BSA를 사용하여 기판을 세척하였다. 패턴 정의 후, 기판을 세포 배양 배지에 담궜다. 이들의 사용의 용이성 및 견고성에 대한 상기 연구에서, HeLa 세포를 모델 세포로서 사용하였다. 세포를 배지에 분산시키고, 기판 상에 침전되게 하였다. 인큐베이션 수시간 후, 세포를 예열된 배양 배지로 부드럽게 세정하여, 기판에 견고하게 부착되지 않은 임의의 세포를 제거하였다. 세포 부착을 정성적 및 정량적 둘 다로 평가하였다.
결론
상기 특정 설명은 본 발명을 예시하고 설명하는 것으로 의도되고, 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 보여져서는 안되며, 이는 첨부된 청구항의 문자적이고 동등한 범위로 정의된다. 본 명세서에서 언급된 임의의 특허 또는 공보는, 명확하게 제시되지 않을 수 있지만 당업자에게 이해되는 본 발명의 특정 측면을 수행하는 데 유용한 방법 및 물질의 세부 사항을 전달하기 위한 것이다. 이러한 특허 또는 공보는 이들 각각이 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함되거나 본원에 포함된 경우, 언급된 방법 또는 물질을 기술하고 가능하게 하는 목적을 위해 요구되는 것과 동일한 정도로 본원에 참고로 포함된다.

Claims (32)

  1. (a) (i) 제1 배럴 중의 액체와 접촉하도록 배열된 제1 전극을 함유하는 제1 배럴;
    (ii) 제2 배럴 중의 액체와 접촉하도록 배열된 제2 참고 전극을 함유하는, 제1 배럴에 인접한 제2 배럴; 및
    (iii) 상기 제1 전극과 상기 제2 참고 전극 사이의 바이어스 전압을 제공하기 위해 상기 제1 전극에 연결된 증폭기
    를 갖는 다중-배럴형 나노피펫;
    (b) 다중-배럴형 나노피펫의 기계적 움직임을 서브마이크론 x 및 y 단계로 실행하고 상기 다중-배럴형 나노피펫의 움직임을 기판을 향하거나 기판으로부터 멀어지는 z 방향으로 실행하기 위해 상기 다중-배럴형 나노피펫에 부착되고, 사용자 정의된 제어에 따라 상기 기계적 움직임을 제어하기 위한 전자 제어를 추가로 갖는 xyz 제어기; 및
    (c) 상기 제1 전극과 상기 나노피펫 중의 액체가 방출될 세포를 포함하는 목적하는 위치에서 제1 배럴로부터 액체가 방출되도록 상기 제1 전극에 방출 전압을 인가하기 위해 배열된 고전압원에 연결된 회로로서, 상기 회로는 xyz 제어기가 목적하는 위치로부터 멀어지는 나노피펫의 기계적 움직임을 실행할 때 상기 방출 전압을 제거하기 위한 제어기를 추가로 포함하며, 상기 회로는 상기 바이어스 전압과 상기 방출 전압 사이의 변환을 위한 계전기를 추가로 포함하여, 개별 세포가 방출된 액체와 접촉할 수 있도록 하기 위한 회로
    를 포함하는, 기판 상에서 개별 세포를 조작하기 위한 장치.
  2. 제1항에 있어서, 상기 증폭기가 상기 바이어스 전압의 제공 및 추가적으로 제1 배럴을 통한 이온 전류의 전류 측정을 위해 저 노이즈 증폭기를 포함하는 것인 장치.
  3. 제1항에 있어서, xyz 제어기의 서브마이크론 제어를 위해 압전 작동기를 추가로 포함하는 장치.
  4. 제1항에 있어서, 상기 목적하는 위치를 결정하도록 사용자 입력을 위한 필드-프로그래밍가능한 게이트 어레이 (FPGA)를 추가로 포함하는 장치.
  5. 제4항에 있어서, 상기 FPGA가 상기 기판 상에 스팟을 패턴으로 침착시키기 위해 프로그래밍된 것인 장치.
  6. 제4항에 있어서, 상기 FPGA가 상기 기판 상의 기정 위치에 있는 세포를 주입하도록 프로그래밍된 것인 장치.
  7. 제6항에 있어서, 상기 FPGA가 상기 세포 내의 소기관을 주입하도록 프로그래밍된 것인 장치.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 개별 위치들에서 다수개의 개별 세포들을 각 위치마다 한 세포씩 함유하도록 적용된 기판에 작동가능하게 연결된 장치.
  9. 제8항에 있어서, 상기 기판이 그 안에 단일 공동 내로 개별 세포를 수용하기 위한 크기를 갖도록 정의된 공동을 갖는 것인 장치.
  10. 제9항에 있어서, 상기 기판이 세포를 공동에 보유시키도록 음의 압력을 인가하기 위한 관통 구멍을 포함하는 것인 장치.
  11. 제10항에 있어서, 상기 공동이 세포를 공동으로 유인하기 위한 전극을 포함하는 것인 장치.
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