[go: up one dir, main page]

KR101933622B1 - 소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 모니터링하는 방법 - Google Patents

소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 모니터링하는 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101933622B1
KR101933622B1 KR1020120112094A KR20120112094A KR101933622B1 KR 101933622 B1 KR101933622 B1 KR 101933622B1 KR 1020120112094 A KR1020120112094 A KR 1020120112094A KR 20120112094 A KR20120112094 A KR 20120112094A KR 101933622 B1 KR101933622 B1 KR 101933622B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
acetoxymethyl ester
vesicles
vesicle
label
converted
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
KR1020120112094A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20140045844A (ko
Inventor
강현주
용예령
이묘용
Original Assignee
삼성전자주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 삼성전자주식회사 filed Critical 삼성전자주식회사
Priority to KR1020120112094A priority Critical patent/KR101933622B1/ko
Priority to US13/785,945 priority patent/US10024795B2/en
Publication of KR20140045844A publication Critical patent/KR20140045844A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101933622B1 publication Critical patent/KR101933622B1/ko
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6486—Measuring fluorescence of biological material, e.g. DNA, RNA, cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

시료 중 소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용한 시료 중 소포를 모니터링하는 방법에 의하면, 프로세스 모니터링이 가능하고, 내부 대조군으로 이용가능하며, 시료의 품질 관리에 이용가능하고, 소포의 위치를 추적할 수 있다.

Description

소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 모니터링하는 방법{Compositions for monitoring a vesicle, kits and methods for monitoring the vesicle using the same}
소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
생체 내 마이크로베지클은 여러 종류의 세포들에 존재하거나 세포로부터 분비되는 막 구조의 작은 소낭이다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 (ⅰ)엑소좀: 식균 기원의 직경 30 내지 100㎚의 막성 베지클, (ⅱ)엑토좀(쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함): 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1000㎚의 큰 막성 베지클, (ⅲ) 세포자살성 수포(apoptotic blebs); 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5000㎚의 베지클을 포함한다.
그 중 엑소좀은 전자 현미경을 통한 연구에서 원형질막으로부터 직접 떨어져 나가는 것이 아니라 다낭체(multivesicular bodies, MVBs)라고 불리는 세포내 특정 구획에서 기원하며 세포 밖으로 방출, 분비되는 것으로 관찰되었다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면, 그러한 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출된다. 엑소좀은 정상 상태 및 병적 상태, 이 2가지 모든 상태하에서 다수의 다른 세포 유형으로부터 분리되어 방출된다고 알려져 있다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려져 있다. 생체 내 마이크로베지클, 예를 들어 엑소좀은 마이크로RNA(microRNA, miRNA)를 포함하며 이러한 miRNA는 암 조기진단과 같은 분자진단에 있어서 유용한 마커로 활용 가능하다.
마이크로베지클을 이용한 실험을 진행하는 경우에 시료 고유의 특성 이외에 시료 수집, 핸들링 또는 보관과 같은 분석 이전의 편향, 및 실험 및 분석과 같은 분석에 의한 편향으로 인하여 실험 결과를 잘못 해석할 수 있다. 원심분리의 경우 농도 구배로 인하여 분획이 섞일 수 있고, 상층액을 제거할 때 발생하는 시료의 소실 및 상층액으로 인한 오염이 발생할 수 있으며, 재-현탁의 차이로 인한 소실일 일어날 수 있다. 면역-캡쳐의 경우 시료에 따라 수득률이 다를 수 있다. 아울러, 여과의 경우 시료 내 점도의 차이로 인하여 여과의 조건이 다를 수 있고, 여과물의 양이 다를 수 있다.
따라서, 실험간의 편향을 최소화하여 소포의 상태를 모니터링하고, 소포를 이용하는 프로세스의 모니터링하며, 시료의 품질 관리 또는 품질 보증하는 것이 필요하다.
소포를 모니터링기 위한 조성물을 제공한다.
소포를 모니터링하기 위한 키트를 제공한다.
시료 중 소포를 모니터링하는 방법을 제공한다.
소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지를 포함하는 시료 중 소포를 모니터링하기 위한 조성물이 제공된다.
소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포을 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클 (circulating microvesicle) 또는 마이크로입자 (microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀 (exosome), 엑토좀 (쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함), 세포자살성 수포(apoptotic blebs), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100㎚의 막성 베지클일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1,000㎚의 큰 막성 베지클일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5,000㎚의 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.
소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지는 소포 내에서 형광 물질로 전환되는 것일 수 있다. 형광 물질은 물리적 조건 변화, 화학적 처리에 의해 빛을 발생하는 물질을 의미한다. 마이크로베지클 밖에서는 비-형광 물질이나, 마이크로베지클 내에서는 형광물질로 전환될 수 있다. 상기 전환은 마이크로베지클 내 효소에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 효소는 에스터라제일 수 있다. 예를 들면, 상기 표지는 소수성 물질이나, 소포 내에서 친수성 물질로 전환될 수 있다. 소수성 물질인 표지는 소포를 투과할 수 있으나, 친수성 물질로 전환된 표지는 소포를 투과할 수 없을 것이다.
예를 들면, 상기 표지는 칼세인-AM(Calcein-acetoxymethyl ester), 푸라-2-AM(Fura-2-acetoxymethyl ester), 인도-1-AM(Indo-1-acetoxymethyl ester), 인도-5F-AM(Indo-5F-acetoxymethyl ester), 퀸-2-AM(Quin-2-acetoxymethyl ester), 5-CFDA-AM(5-Carboxyfluorescein Diacetate-acetoxymethyl ester), BAPTA-AM(bis(2-aminophenoxy)ethane tetraacetic acid-acetoxymethyl ester), 5,5'- 디플루오로 BAPTA-AM(5,5'-difluoro BAPTA-AM), 5,5'-디메틸 BAPTA-AM(5,5'-dimethyl BAPTA-AM), 5,5'-디니트로 BAPTA-AM(5,5'-dinitro BAPTA-AM), BCECF-AM(2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester), 디히드로칼세인-AM(dihydrocalcein-acetoxymethyl ester), EGTA-AM(EGTA-acetoxymethyl ester), 플루오-3-AM(Fluo-3-acetoxymethyl ester), 플루오-8-AM(Fluo-8-acetoxymethyl ester), 로드-2-AM(Rhod-2-acetoxymethyl ester), 로드-4-AM(Rhod-2-acetoxymethyl ester), 로드-5F-AM(Rhod-5F-acetoxymethyl ester), 로드-5N-AM(Rhod-5N-acetoxymethyl ester), X-로드-1-AM(X-Rhod-1-acetoxymethyl ester), Cal-520™ 또는 그의 조합일 수 있다.
시료는 체액 또는 세포 배양액일 수 있다. 상기 체액은 예를 들면, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 그의 조합일 수 있다. 시료는 온전한 세포, 죽은 세포 또는 세포 잔해가 제거된 시료일 수 있다. 예를 들면, 시료는 원심분리, 투석 또는 이들의 조합으로 전처리된 것일 수 있다.
시료 중 소포를 모니터링하는 것은 검출 가능한 표지로 전환된 표지의 신호를 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 모니터링은 시료 중 소포의 양적 또는 질적 상태를 분석하는 것일 수 있다. 소포를 내부 대조군으로 사용하여 소포를 모니터링하는 경우, 프로세스 전후 형광량을 비교하여 프로세스를 모니터링할 수 있다. 또한, 초기 값과 실제 사용할 경우의 형광량을 비교함으로써 시료 내 소포의 분해와 같은 품질을 확인할 수 있다. 아울러, 형광 물질로 표지된 소포를 세포 또는 체내 투여하는 경우, 세포 내 또는 체내에서 소포의 위치를 추적할 수 있다.
상기 조성물은 유기 음이온 수송 저해제(organic anion transport inhibitor)를 더 포함할 수 있다. 유기 음이온 수송 저해제는 유기 음이온 수송계(organic anion transport system)를 저해하는 물질을 말한다. 예를 들면, 유기 음이온 수송 저해제는 술핀피라존(sulfinpyrazone), 프로베네시드(probenecid), 베타미프론(betamipron), 실라스타틴(cilastatin), 8-(노르아다만탄-3-일)-1,3-디프로필잔틴 (8-(noradamantan-3-yl)-1,3-dipropylxanthine) 또는 이들의 조합일 수 있다. 유기 음이온 수송 저해제를 이용함으로써 소포의 모니터링 효율이 증가할 수 있다.
소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지를 포함하는 시료 중 소포를 모니터링하기 위한 키트가 제공된다.
소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포을 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클 (circulating microvesicle) 또는 마이크로입자 (microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀 (exosome), 엑토좀 (쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함), 세포자살성 수포(apoptotic blebs), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100㎚의 막성 베지클일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1,000㎚의 큰 막성 베지클일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5,000㎚의 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.
소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지는 소포 내에서 형광 물질로 전환되는 것일 수 있다. 형광 물질은 물리적 조건 변화, 화학적 처리에 의해 빛을 발생하는 물질을 의미한다. 마이크로베지클 밖에서는 비-형광 물질이나, 마이크로베지클 내에서는 형광물질로 전환될 수 있다. 상기 전환은 마이크로베지클 내 효소에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 효소는 에스터라제일 수 있다. 예를 들면, 상기 표지는 소수성 물질이나, 소포 내에서 친수성 물질로 전환될 수 있다. 소수성 물질인 표지는 소포를 투과할 수 있으나, 친수성 물질로 전환된 표지는 소포를 투과할 수 없을 것이다.
예를 들면, 상기 표지는 칼세인-AM(Calcein-acetoxymethyl ester), 푸라-2-AM(Fura-2-acetoxymethyl ester), 인도-1-AM(Indo-1-acetoxymethyl ester), 인도-5F-AM(Indo-5F-acetoxymethyl ester), 퀸-2-AM(Quin-2-acetoxymethyl ester), 5-CFDA-AM(5-Carboxyfluorescein Diacetate-acetoxymethyl ester), BAPTA-AM(bis(2-aminophenoxy)ethane tetraacetic acid-acetoxymethyl ester), 5,5'- 디플루오로 BAPTA-AM(5,5'-difluoro BAPTA-AM), 5,5'-디메틸 BAPTA-AM(5,5'-dimethyl BAPTA-AM), 5,5'-디니트로 BAPTA-AM(5,5'-dinitro BAPTA-AM), BCECF-AM(2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester), 디히드로칼세인-AM(dihydrocalcein-acetoxymethyl ester), EGTA-AM(EGTA-acetoxymethyl ester), 플루오-3-AM(Fluo-3-acetoxymethyl ester), 플루오-8-AM(Fluo-8-acetoxymethyl ester), 로드-2-AM(Rhod-2-acetoxymethyl ester), 로드-4-AM(Rhod-2-acetoxymethyl ester), 로드-5F-AM(Rhod-5F-acetoxymethyl ester), 로드-5N-AM(Rhod-5N-acetoxymethyl ester), X-로드-1-AM(X-Rhod-1-acetoxymethyl ester), Cal-520™ 또는 그의 조합일 수 있다.
시료는 체액 또는 세포 배양액일 수 있다. 상기 체액은 예를 들면, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 그의 조합일 수 있다. 시료는 온전한 세포, 죽은 세포 또는 세포 잔해가 제거된 시료일 수 있다. 예를 들면, 시료는 원심분리, 투석 또는 이들의 조합으로 전처리된 것일 수 있다.
시료 중 소포를 모니터링하는 것은 검출 가능한 표지로 전환된 표지의 신호를 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 모니터링은 시료 중 소포의 양적 또는 질적 상태를 분석하는 것일 수 있다. 소포를 내부 대조군으로 사용하여 소포를 모니터링하는 경우, 프로세스 전후 형광량을 비교하여 프로세스를 모니터링할 수 있다. 또한, 초기 값과 실제 사용할 경우의 형광량을 비교함으로써 시료 내 소포의 분해와 같은 품질을 확인할 수 있다. 아울러, 형광 물질로 표지된 소포를 세포 또는 체내 투여하는 경우, 세포 내 또는 체내에서 소포의 위치를 추적할 수 있다.
검출 가능한 표지로 전환된 표지의 신호를 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 모니터링은 시료 중 소포의 양적 또는 질적 상태를 분석하는 것일 수 있다. 소포를 내부 대조군으로 사용하여 소포를 모니터링하는 경우, 프로세스 전후 형광량을 비교하여 프로세스를 모니터링할 수 있다. 또한, 초기 값과 실제 사용할 경우의 형광량을 비교함으로써 시료 내 소포의 분해와 같은 품질을 확인할 수 있다. 아울러, 형광 물질로 표지된 소포를 세포 또는 체내 투여하는 경우, 세포 내 또는 체내에서 소포의 위치를 추적할 수 있다.
상기 조성물은 유기 음이온 수송 저해제(organic anion transport inhibitor)를 더 포함할 수 있다. 유기 음이온 수송 저해제는 유기 음이온 수송계(organic anion transport system)를 저해하는 물질을 말한다. 예를 들면, 유기 음이온 수송 저해제는 술핀피라존(sulfinpyrazone), 프로베네시드(probenecid), 베타미프론(betamipron), 실라스타틴(cilastatin), 8-(노르아다만탄-3-일)-1,3-디프로필잔틴 (8-(noradamantan-3-yl)-1,3-dipropylxanthine) 또는 이들의 조합일 수 있다. 유기 음이온 수송 저해제를 이용함으로써 소포의 모니터링 효율이 증가할 수 있다.
소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지와 시료 중 소포를 접촉시키는 단계;
검출 가능한 표지로 전환된 표지의 신호를 측정하는 단계; 및
측정된 신호로부터 소포의 상태를 분석하는 단계를 포함하는 시료 중 소포를 모니터링하는 방법이 제공된다.
상기 방법은 소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지와 시료를 접촉시키는 단계를 포함한다.
소포(vesicle) 또는 소낭은 지질 이중층으로 둘러싸인 막 구조를 말한다. 예를 들면, 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클일 수 있다. 마이크로베지클(microvesicle)은 세포로부터 유래한 막 구조의 작은 소포을 말한다. 마이크로베지클은 순환 마이크로베지클 (circulating microvesicle) 또는 마이크로입자 (microparticles)와 교환가능하게 사용된다. 마이크로베지클은 세포에 존재하거나 세포로부터 분비될 수 있다. 세포 외로 분비되는 마이크로베지클은 엑소좀 (exosome), 엑토좀 (쉐딩 마이크로베지클(shedding microvesicles, SMVs)이라고도 함), 세포자살성 수포(apoptotic blebs), 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 엑소좀은 식균 기원의 직경 30 내지 100㎚의 막성 베지클일 수 있다. 엑토좀은 원형질막으로부터 직접 흘려지고 직경 50 내지 1,000㎚의 큰 막성 베지클일 수 있다. 세포자살성 수포는 죽어가는 세포에 의해 유출된 직경 50 내지 5,000㎚의 베지클일 수 있다. 생체 내 마이크로베지클은 마이크로RNA(miRNA) 또는 mRNA(messenger RNA)를 포함할 수 있다. 마이크로베지클의 표면 단백질은 질병 특이적 마커일 수 있다.
소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지는 소포 내에서 형광 물질로 전환되는 것일 수 있다. 형광 물질은 물리적 조건 변화, 화학적 처리에 의해 빛을 발생하는 물질을 의미한다. 마이크로베지클 밖에서는 비-형광 물질이나, 마이크로베지클 내에서는 형광물질로 전환될 수 있다. 상기 전환은 마이크로베지클 내 효소에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 효소는 에스터라제일 수 있다. 예를 들면, 상기 표지는 소수성 물질이나, 소포 내에서 친수성 물질로 전환될 수 있다. 소수성 물질인 표지는 소포를 투과할 수 있으나, 친수성 물질로 전환된 표지는 소포를 투과할 수 없을 것이다.
예를 들면, 상기 표지는 칼세인-AM(Calcein-acetoxymethyl ester), 푸라-2-AM(Fura-2-acetoxymethyl ester), 인도-1-AM(Indo-1-acetoxymethyl ester), 인도-5F-AM(Indo-5F-acetoxymethyl ester), 퀸-2-AM(Quin-2-acetoxymethyl ester), 5-CFDA-AM(5-Carboxyfluorescein Diacetate-acetoxymethyl ester), BAPTA-AM(bis(2-aminophenoxy)ethane tetraacetic acid-acetoxymethyl ester), 5,5'- 디플루오로 BAPTA-AM(5,5'-difluoro BAPTA-AM), 5,5'-디메틸 BAPTA-AM(5,5'-dimethyl BAPTA-AM), 5,5'-디니트로 BAPTA-AM(5,5'-dinitro BAPTA-AM), BCECF-AM(2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester), 디히드로칼세인-AM(dihydrocalcein-acetoxymethyl ester), EGTA-AM(EGTA-acetoxymethyl ester), 플루오-3-AM(Fluo-3-acetoxymethyl ester), 플루오-8-AM(Fluo-8-acetoxymethyl ester), 로드-2-AM(Rhod-2-acetoxymethyl ester), 로드-4-AM(Rhod-2-acetoxymethyl ester), 로드-5F-AM(Rhod-5F-acetoxymethyl ester), 로드-5N-AM(Rhod-5N-acetoxymethyl ester), X-로드-1-AM(X-Rhod-1-acetoxymethyl ester), Cal-520™ 또는 그의 조합일 수 있다.
시료는 체액 또는 세포 배양액일 수 있다. 상기 체액은 예를 들면, 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 그의 조합일 수 있다. 시료는 온전한 세포, 죽은 세포 또는 세포 잔해가 제거된 시료일 수 있다. 예를 들면, 시료는 원심분리, 투석 또는 이들의 조합으로 전처리된 것일 수 있다.
접촉은 인 비트로에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 상온에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 반응물을 혼합하면서 수행될 수 있다.
상기 방법은 검출 가능한 표지로 전환된 표지의 신호를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 신호의 측정은 형광 물질의 종류에 따라 다양한 방법이 이용될 수 있다. 예를 들어, 형광 물질이 형광 단백질(fluorescent protein)일 경우, 자외선을 조사하여 발생하는 형광광도를 형광광독계(fluorophotometer)를 사용하여 측정할 수 있다.
상기 방법은 측정된 신호로부터 소포의 상태를 분석하는 단계를 포함한다.
소포의 상태는 소포의 양적 또는 질적 상태일 수 있다.
시료 중 소포를 모니터링하는 것은 검출 가능한 표지로 전환된 표지의 신호를 측정함으로써 수행될 수 있다. 예를 들면, 모니터링은 시료 중 소포의 양적 또는 질적 상태, 또는 위치를 분석하는 것일 수 있다. 소포를 내부 대조군으로 사용하여 소포를 모니터링하는 경우, 프로세스 전후 형광량을 비교하여 프로세스를 모니터링할 수 있다. 또한, 초기 값과 실제 사용할 경우의 형광량을 비교함으로써 시료 내 소포의 분해와 같은 품질을 확인할 수 있다. 아울러, 형광 물질로 표지된 소포를 세포 또는 체내 투여하는 경우, 세포 내 또는 체내에서 소포의 위치를 추적할 수 있다.
상기 방법은 검출 가능한 표지로 전환된 표지의 신호를 측정하는 단계 이전에 유기 음이온 수송 저해제와 시료를 인큐베이션시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 유기 음이온 수송 저해제는 유기 음이온 수송계(organic anion transport system)를 저해하는 물질을 말한다. 예를 들면, 유기 음이온 수송 저해제는 술핀피라존(sulfinpyrazone), 프로베네시드(probenecid), 베타미프론(betamipron), 실라스타틴(cilastatin), 8-(노르아다만탄-3-일)-1,3-디프로필잔틴 (8-(noradamantan-3-yl)-1,3-dipropylxanthine) 또는 이들의 조합일 수 있다. 인큐베이션은 인 비트로에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 상온에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 반응물을 혼합하면서 수행될 수 있다. 유기 음이온 수송 저해제와 시료를 인큐베이션시키는 단계는 소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지와 시료를 접촉시키는 단계의 이전, 이후 또는 동시에 수행될 수 있다. 유기 음이온 수송 저해제와 시료를 인큐베이션시킴으로써 소포의 검출 효율이 증가할 수 있다.
시료 중 소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용한 시료 중 소포를 모니터링하는 방법에 의하면, 프로세스 모니터링이 가능하고, 내부 대조군으로 이용가능하며, 시료의 품질 관리에 이용가능하고, 소포의 위치를 추적할 수 있다.
도 1은 소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지를 이용하여 시료 중 소포를 모니터링 하는 방법의 모식도이다. (1; 지질막으로 구획된 소포, 2a; 막 투과성 표지, 2b; 검출 가능한 표지로 전환된 막 투과성 표지, 3; 검출 가능한 표지로 전환된 막 투과성 표지로부터 발생하는 신호, 4; 막 투과성 표지를 검출 가능한 표지로 전환시키는 반응, 5; 내부 대조군으로서 형광 표지된 소포, 6; 함량을 모르는 소포를 포함하는 시료, 7; 전-분석/ 분석 프로세스, 8; 프로세스 진행 후 수득된 소포)
도 2a 및 도 2b는 각각 정제된 형광 물질로 표지된 마이크로베지클의 정량성 및 안정성을 보여준다.
도 3은 형광 물질로 표지된 마이크로베지클을 이용하여 프로세스를 모니터링한 결과를 보여준다.
도 4a 및 도 4b는 형광 물질로 표지된 마이크로베지클을 이용하여 시료의 품질을 모니터링한 결과를 보여준다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 마이크로베지클을 내부 대조군으로 사용하기 위한 정량성 및 안정성의 확인
칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클을 정량적 대조군으로 안정하게 이용할 수 있는지 여부를 확인하였다.
마이크로베지클과 칼세인-AM을 혼합하고 인큐베이션시켜 칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클을 제조하였다. 칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클에 혈장 0 내지 100 ㎕를 첨가하고 세척한 다음, 형광광도계(fluorophotometer) (Beckman, DTX800)를 사용하여 형광량을 측정하였다. 그 결과, 도 2a에 나타난 바와 같이, 칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클을 혈장과 혼합한 경우에도 정량성이 있음을 확인하였다(●; 혈장 0 ㎕, ○; 혈장 20 ㎕).
한편, 칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클을 빛을 차단시킨 상태 하에서 상온에서 20 시간 동안 방치한 후 형광량을 측정하였다. 그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클을 보관한 후에도 형광량의 변화가 없었다(■; 5 분, □; 20 시간). 따라서, 칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클이 안정하여 대조군으로 사용할 수 있음을 확인하였다.
실시예 2. 프로세스 모니터링
실시예 1에서 제조한 칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클을 이용하여 시료 중 마이크로베지클의 포획 회수를 측정할 수 있는지 확인하였다.
실시예 1에서 제조한 칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클의 형광량을 측정하고, 항-CD9 항체로 마이크로베지클을 포획한 후 회수되는 칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클의 형광량을 측정하여, 항-CD9 항체로 마이크로베지클을 포획하기 전과 후의 회수율를 확인하였다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 초기의 칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클에 대비하여 항-CD9 항체로 마이크로베지클을 포획한 후 마이크로베지클의 회수율은 32.9 % 내지 79.6% 였다(□;초기, ■; 항-CD9 항체로 포획한 후, ●; 회수율)
실시예 3. 마이크로베지클을 포함한 시료의 품질 관리
전-분석적인 과정에 따라 시료 중 마이크로베지클의 변화를 모니터링하기 위해, 냉동 및 해동을 반복하여 보관 조건에 따라 마이크로베지클의 양적 및 표면 단백질의 변화를 확인하였다.
칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클과 혈장을 혼합하고 인큐베이션한 다음, 냉동 및 해동을 반복하였다. 그 후, 반응액을 여과하고, 형광량을 측정하였다. 그 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, 냉동 및 해동을 8회 반복한 경우에도 양적으로 마이크로베지클이 유의하게 변화하지 않았다.
칼세인-AM으로 표지된 마이크로베지클과 혈장을 혼합하고 인큐베이션한 다음, 항- 항-CD9 항체로 면역 침강시켰다. 그 후, 냉동 및 해동을 반복하고 형광량을 측정하였다. 그 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 냉동 및 해동을 6 내지 8회 반복한 사이에 형광량이 14.3% 내지 20.8% 감소하였다(P<0.05). 따라서, 냉동 및 해동을 6 내지 8회 반복한 경우 마이크로베지클의 표면 단백질이 유의하게 변화함을 확인하였다.

Claims (20)

  1. 소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지 및 유기 음이온 수송 저해제를 포함하는 시료 중 소포를 모니터링하기 위한 조성물로서,
    상기 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클인 것인 조성물.
  2. 삭제
  3. 청구항 1에 있어서, 마이크로베지클은 엑소좀인 것인 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서, 소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지는 마이크로베지클 내에서 형광 물질로 전환되는 것인 조성물.
  5. 청구항 1에 있어서, 소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지는 칼세인-AM(Calcein-acetoxymethyl ester), 푸라-2-AM(Fura-2-acetoxymethyl ester), 인도-1-AM(Indo-1-acetoxymethyl ester), 인도-5F-AM(Indo-5F-acetoxymethyl ester), 퀸-2-AM(Quin-2-acetoxymethyl ester), 5-CFDA-AM(5-Carboxyfluorescein Diacetate-acetoxymethyl ester), BAPTA-AM(bis(2-aminophenoxy)ethane tetraacetic acid-acetoxymethyl ester), 5,5'- 디플루오로 BAPTA-AM(5,5'-difluoro BAPTA-AM), 5,5'-디메틸 BAPTA-AM(5,5'-dimethyl BAPTA-AM), 5,5'-디니트로 BAPTA-AM(5,5'-dinitro BAPTA-AM), BCECF-AM(2',7'-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein acetoxymethyl ester), 디히드로칼세인-AM(dihydrocalcein-acetoxymethyl ester), EGTA-AM(EGTA-acetoxymethyl ester), 플루오-3-AM(Fluo-3-acetoxymethyl ester), 플루오-8-AM(Fluo-8-acetoxymethyl ester), 로드-2-AM(Rhod-2-acetoxymethyl ester), 로드-4-AM(Rhod-2-acetoxymethyl ester), 로드-5F-AM(Rhod-5F-acetoxymethyl ester), 로드-5N-AM(Rhod-5N-acetoxymethyl ester), X-로드-1-AM(X-Rhod-1-acetoxymethyl ester), Cal-520™ 또는 그의 조합인 것인 조성물.
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 있어서, 유기 음이온 수송 저해제는 술핀피라존, 프로베네시드, 베타미프론, 실라스타틴, 8-(노르아다만탄-3-일)-1,3-디프로필잔틴 또는 이들의 조합인 것인 조성물.
  8. 소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지 및 유기 음이온 수송 저해제를 포함하는 시료 중 소포를 모니터링하기 위한 키트로서,
    상기 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클인 것인 키트.
  9. 삭제
  10. 청구항 8에 있어서, 마이크로베지클은 엑소좀인 것인 키트.
  11. 청구항 8에 있어서, 소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지는 소포 내에서 형광 물질로 전환되는 것인 키트.
  12. 청구항 8에 있어서, 소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지는 칼세인-AM, 푸라-2-AM, 인도-1-AM, 인도-5F-AM, 퀸-2-AM, 5-CFDA-AM, BAPTA-AM, 5,5’- 디플루오로 BAPTA-AM, 5,5'-디메틸 BAPTA-AM, 5,5'-디니트로 BAPTA-AM, BCECF-AM, 디히드로칼세인-AM, EGTA-AM, 플루오-3-AM, 플루오-8-AM, Rhod-2-AM, Rhod-4-AM, Rhod-5F-AM, Rhod-5N-AM, X-Rhod-1-AM, Cal-520™ 또는 그의 조합인 것인 키트.
  13. 삭제
  14. 청구항 8에 있어서, 유기 음이온 수송 저해제는 술핀피라존, 프로베네시드, 베타미프론, 실라스타틴, 8-(노르아다만탄-3-일)-1,3-디프로필잔틴 또는 이들의 조합인 것인 키트.
  15. 소포 내에서 검출 가능한 표지로 전환되는 막 투과성 표지와 시료 중 소포를 접촉시키는 단계;
    유기 음이온 수송 저해제와 상기 시료를 인큐베이션시키는 단계;
    검출 가능한 표지로 전환된 표지의 신호를 측정하는 단계; 및
    측정된 신호로부터 소포의 상태를 분석하는 단계를 포함하는 시료 중 소포를 모니터링하는 방법으로서,
    상기 소포는 리포좀 또는 마이크로베지클인 것인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 시료는 체액 또는 세포 배양액인 것인 방법.
  17. 청구항 16에 있어서, 체액은 소변, 점액, 타액, 눈물, 혈장, 혈청, 뇨, 객담, 척수액, 흉수, 유두 흡인물, 림프액, 기도액, 장액, 비뇨생식관액, 모유, 림프계 체액, 정액, 뇌척수액, 기관계내 체액, 복수, 낭성 종양 체액, 양수액 또는 그의 조합인 것인 방법.
  18. 청구항 15에 있어서, 소포의 상태 또는 위치를 모니터링하는 것인 방법.
  19. 청구항 15에 있어서, 소포를 시료의 내부 대조군으로 사용하는 것인 방법.
  20. 청구항 19에 있어서, 내부 대조군은 시료의 품질 관리를 위한 내부 대조군인 것인 방법.
KR1020120112094A 2012-10-09 2012-10-09 소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 모니터링하는 방법 Active KR101933622B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120112094A KR101933622B1 (ko) 2012-10-09 2012-10-09 소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 모니터링하는 방법
US13/785,945 US10024795B2 (en) 2012-10-09 2013-03-05 Method for monitoring vesicles using a membrane-permeable marker that is converted into a membrane-nonpermeable marker

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020120112094A KR101933622B1 (ko) 2012-10-09 2012-10-09 소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 모니터링하는 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20140045844A KR20140045844A (ko) 2014-04-17
KR101933622B1 true KR101933622B1 (ko) 2018-12-28

Family

ID=50432953

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020120112094A Active KR101933622B1 (ko) 2012-10-09 2012-10-09 소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 모니터링하는 방법

Country Status (2)

Country Link
US (1) US10024795B2 (ko)
KR (1) KR101933622B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110004110A (zh) * 2019-04-09 2019-07-12 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院） 一种肠道外泌体提取方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4912208A (en) * 1987-06-29 1990-03-27 Abbott Laboratories Fluorophores for encapsulation into liposomes
US5534416A (en) * 1993-04-13 1996-07-09 Molecular Probes, Inc. Fluorescent viability assay using cyclic-substituted unsymmetrical cyanine dyes
DE69426223T2 (de) * 1993-09-07 2001-05-23 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Verfahren und Reagenz zur Messung der Komplementaktivität
GB9801120D0 (en) * 1998-01-21 1998-03-18 Secr Defence Detection system
JP2003511682A (ja) * 1999-10-08 2003-03-25 カリパー・テクノロジーズ・コープ． 膜透過電圧測定でのネルンスト電圧感知性染料の使用
US20060073509A1 (en) 1999-11-18 2006-04-06 Michael Kilpatrick Method for detecting and quantitating multiple subcellular components
US7553632B2 (en) 2004-01-22 2009-06-30 Promega Corporation Luminogenic and nonluminogenic multiplex assay
EP3312292B1 (en) 2005-05-31 2019-09-25 Promega Corporation Luminogenic and fluorogenic compounds and methods to detect molecules or conditions
JP4009733B1 (ja) 2007-03-02 2007-11-21 国立大学法人 筑波大学 ベシクルの製造方法、この製造方法によって得られるベシクル、ベシクルの製造に用いられる凍結粒子の製造方法
US8318502B2 (en) * 2007-06-05 2012-11-27 Life Technologies Corporation Long wavelength fluorogenic intracellular ion indicators that are well retained in the cytosol
EP2144062A1 (en) * 2008-05-15 2010-01-13 Biocompatibles UK Limited Method of monitoring live cells
US20130178383A1 (en) * 2008-11-12 2013-07-11 David Spetzler Vesicle isolation methods
WO2010065765A2 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Aethlon Medical, Inc. Affinity capture of circulating biomarkers
WO2012006476A2 (en) * 2010-07-07 2012-01-12 Aethlon Medical, Inc. Methods and compositions for quantifying exosomes
US9273043B2 (en) * 2011-06-22 2016-03-01 Purdue Pharma L.P. TRPV1 antagonists including dihydroxy substituent and uses thereof
US9394293B2 (en) * 2011-08-10 2016-07-19 Purdue Pharma L.P. TRPV1 antagonists including dihydroxy substituent and uses thereof
EP2748173B1 (en) * 2011-08-26 2016-11-23 Ecole Polytechnique Federale De Lausanne (EPFL) EPFL-TTO Cell permeable, fluorescent dye

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Cell Calcium, 1990, Vol. 11, pp 57-62.*
J Thromb Haemost., 2009, Vol. 7, pp 1019-1028.*
Journal of Translational Medicine, 2009, Vol. 7, pp 1-13.*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20140045844A (ko) 2014-04-17
US20140099652A1 (en) 2014-04-10
US10024795B2 (en) 2018-07-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kang et al. High-purity capture and release of circulating exosomes using an exosome-specific dual-patterned immunofiltration (ExoDIF) device
Li et al. An optimized procedure for exosome isolation and analysis using serum samples: application to cancer biomarker discovery
US11684893B2 (en) Method for exosome separation and extraction by stacked centrifugal filtration
ES2666594T3 (es) Procedimiento para diagnosticar un cáncer invasivo
US9829483B2 (en) Methods of isolating extracellular vesicles
Qian et al. Rapid exosomes concentration and in situ detection of exosomal microRNA on agarose-based microfluidic chip
Salmond et al. Nanoscale flow cytometry for immunophenotyping and quantitating extracellular vesicles in blood plasma
JP2012507300A5 (ko)
KR101933621B1 (ko) 소포를 분리하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분리하는 방법
EP2715351A2 (en) Method for exosomal biomarker detection by electric field-induced release and measurement
CN113101737B (zh) 一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用
KR20150052667A (ko) 시료 중 소포를 안정화시키는 방법
Kang et al. Multiplex isolation and profiling of extracellular vesicles using a microfluidic DICE device
ITRM20130700A1 (it) Metodo per il rilevamento di cellule tumorali circolanti
KR101933622B1 (ko) 소포를 모니터링하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 모니터링하는 방법
CN112852920A (zh) Dna拉链分子修饰的脂质体囊泡及制备方法和应用
EP2711712A1 (en) Composition and kit for isolating vesicles and method of isolating the vesicles using the same
Deng et al. A facile, rapid, high-throughput extracellular vesicles analytical platform for cancer detection
CN116952811B (zh) 一种基于纳米流式检测仪检测外泌体膜完整性的方法及其应用
CN103900890A (zh) 一种采用纳米膜浓缩法提取尿微囊泡的方法
Bramhall Conductance routes for protons across membrane barriers
Khanna et al. Separation and isolation of CD9-positive extracellular vesicles from plasma using flow cytometry
CN110551680A (zh) 一种提取胸水外泌体的方法和系统
KR101933620B1 (ko) 소포를 검출하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 소포를 분석하는 방법
JP2022144722A (ja) 標的粒子の分析方法、分析試薬及び分析装置

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20121009

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20170324

Comment text: Request for Examination of Application

Patent event code: PA02011R01I

Patent event date: 20121009

Comment text: Patent Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20180316

Patent event code: PE09021S01D

AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
PE0601 Decision on rejection of patent

Patent event date: 20180928

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PE06012S01D

Patent event date: 20180316

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event code: PE06011S01I

AMND Amendment
PX0901 Re-examination

Patent event code: PX09011S01I

Patent event date: 20180928

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX09012R01I

Patent event date: 20180509

Comment text: Amendment to Specification, etc.

PX0701 Decision of registration after re-examination

Patent event date: 20181128

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event code: PX07013S01D

Patent event date: 20181026

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

Patent event date: 20180928

Comment text: Decision to Refuse Application

Patent event code: PX07011S01I

Patent event date: 20180509

Comment text: Amendment to Specification, etc.

Patent event code: PX07012R01I

X701 Decision to grant (after re-examination)
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20181221

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20181224

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20211115

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20221115

Start annual number: 5

End annual number: 5

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20241118

Start annual number: 7

End annual number: 7