JP2003511682A

JP2003511682A - 膜透過電圧測定でのネルンスト電圧感知性染料の使用

Info

Publication number: JP2003511682A
Application number: JP2001530458A
Authority: JP
Inventors: ジャヴィア・アニバル・ファリナス; エイチ・ガレット・ワダ
Original assignee: カリパー・テクノロジーズ・コープ．
Priority date: 1999-10-08
Filing date: 2000-10-06
Publication date: 2003-03-25
Also published as: AU783191B2; US6537771B1; US20040009545A1; WO2001027253A1; EP1222257A1; AU1330401A; CA2385618A1; EP1222257A4; US20040048239A1; US6759191B2; US6979553B2

Abstract

(57)【要約】カチオン染料及びアニオン染料を用いた膜透過電位の測定法を提供する。カチオン染料及びアニオン染料の組成物、並びにこれらの染料及び膜を含む微小流体システムを膜透過電位測定用の処理用エレメントと一緒に提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】関連出願の相互参照：この出願は、通常の米国出願番号第６０／１５８，３２３号（１９９９年１０
月８日提出）のＦａｒｉｎａｓ及びＷａｄａによる“膜透過電位測定でのネルン
スト電圧感知性染料の使用”（ＵＳＥＯＦＮＥＲＮＳＴＥＩＮＶＯＬＴＡ
ＧＥＳＥＮＳＩＴＩＶＥＤＹＥＳＩＮＭＥＡＳＵＲＩＮＧＴＲＡＮＳ
ＭＥＭＢＲＡＮＥＰＯＴＥＮＴＩＡＬ）、米国出願番号第６０／１６８，７９
２号（１９９９年１２月２日提出）のＦａｒｉｎａｓ及びＷａｄａによる“膜透
過電位測定でのネルンスト電圧感知性染料の使用”（ＵＳＥＯＦＮＥＲＮＳ
ＴＥＩＮＶＯＬＴＡＧＥＳＥＮＳＩＴＩＶＥＤＹＥＳＩＮＭＥＡＳＵ
ＲＩＮＧＴＲＡＮＳＭＥＭＢＲＡＮＥＰＯＴＥＮＴＩＡＬ）、及び米国出願
番号第６０／２２９，９５１号（２０００年９月１日提出）のＦａｒｉｎａｓ及
びＷａｄａによる“膜透過電位測定でのネルンスト電圧感知性染料の使用”（Ｕ
ＳＥＯＦＮＥＲＮＳＴＥＩＮＶＯＬＴＡＧＥＳＥＮＳＩＴＩＶＥＤＹ
ＥＳＩＮＭＥＡＳＵＲＩＮＧＴＲＡＮＳＭＥＭＢＲＡＮＥＰＯＴＥＮＴ
ＩＡＬ）である。本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９、その他の適用可能な法令
又は規則に従って、これらの各先出願による優先権及び利益を主張する。

【０００２】著作権通知：３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．７１（ｅ）に従って、出願人は、この開示の一部が著
作権の保護を受ける資料を含むことを通知する。著作権所有者は、特許庁の特許
ファイル又は記録にあるような該特許文書又は特許開示のファクシミリ複写する
誰にも反対しないが、さもなければ、全ての著作権の権利を保有する。

【０００３】発明の分野：本発明は、例えば微小流体システムでネルンスト（Ｎｅｒｎｓｔｉａｎ）染料
を用いる膜透過電位測定の分野である。

【０００４】発明の背景：生物学的活性化合物の最初のスクリーニングには、細胞の迅速な被スクリーニ
ング能力と組合せた細胞による生体内システムの接近（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉ
ｏｎ）のため、細胞をベースとしたアッセイが多く好まれている。細胞死、輸送
機能、化学的刺激に対する反応等、刺激に対する各種の細胞反応が検出できる。

【０００５】細胞又は小胞の内部と外部との間の浸透性イオンの分布は、細胞膜の膜透過電
位に依存する。特に半浸透性膜によって分離されたイオンについては、該膜を越
えて存在する電気化学的電位差（Δμ_j）は、Δμ_j＝２．３ＲＴｌｏｇ［ｊ_I ］／［ｊ₀］+ ｚＥ_RＦで示される。ここでＲは普遍的ガス定数、Ｔは該組成物
の絶対温度、Ｒはファラデー定数（クーロン）、［ｊ_I］は少なくとも１つの該
膜の内部又は細胞内側のイオン（ｊ）の濃度、［ｊ₀］は少なくとも１つの該膜
の外部又は細胞外側のｊの濃度、Z はｊの原子価、Ｅ_Rは膜透過電位の測定値で
ある。したがって、イオンｊ＝−２．３ＲＴ（ｚＦ）^-1ｌｏｇ［ｊ_I］／［ｊ₀ ］（これは、ネルンスト方程式ということが多い）についての該平衡電位差の計
算値（Ｅ_j）。膜透過電位の入門及びネルンスト方程式の膜透過電位への応用に
ついては、Ｓｅｌｋｕｒｔ編（１９８４）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ第５編、第１〜
２章、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ（ＩＳＢＮ０−３１６
−７８０３８−３）；Ｓｔｒｙｅｒ（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第４編第１１〜１２章，Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎａｎｄＣｏｍｐａｎｙ，ＮＹ，
（ＩＳＢＮ０−７１６７−２００９−４）；Ｈａｕｇｌａｎｄ（１９６６）ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ第６編，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ
，Ｉｎｃ．（ＥｕｇｅｎｅＯＲ）第２５章，（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂ
ｅｓ，１９９６）及びｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｒｏｂｅｓ，ｃｏｍ／ｈａｎｄ
ｂｏｏｋ／ｓｅｃｔｉｏｎｓ／２３００．ｈｔｍｌ（ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＣｈｅｍｉｃａｌｓ第６編，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．のオンライン
１９９９年版の第２３章）並びにＨｉｌｌｅ（１９９２）ＩｏｎｉｃＣｈａｎｎｅｌｓｏｆＥｘｃｉｔａｂｌｅＭｅｍｂｒａｎｃｅｓ，第２編、Ｓｉｎ
ａｕｅｒＡｓｓｏｃｉａｔｅｓＩｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（Ｉ
ＳＢＮ０−８７８９３−３２３−９）（Ｈｉｌｌｅ）参照。ネルンスト式の他
に、イオンの膜浸透性ファクターやオームの法則を用いて、更に膜透過電位差の
モデル、例えば“Ｇｏｌｄｍａｎ”又は“一定場”（ｃｏｎｓｔａｎｔｆｉｅ
ｌｄ）式やＧｉｂｂｓ−Ｄｏｎｎａｎ式を改良できる。Ｓｅｌｋｕｒｔ編（１９
８４）Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ第５編、第１章、Ｌｉｔｔｌｅ，Ｂｒｏｗｎ，Ｂｏ
ｓｔｏｎ，ＭＡ（ＩＳＢＮ０−３１６−７８０３８−３）及びＨｉｌｌｅ、例
えば第１０〜１３章参照。

【０００６】静止膜透過電位の増加及び減少（それぞれ膜の脱分極（ｄｅｐｏｌａｒｉｚａ
ｔｉｏｎ）及び過分極という）は、神経−インパルス伝搬、筋肉の収縮、細胞の
信号送り（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、イオンチャネルのゲート操作等、多くの生理
学的方法において中心的役割を果たす。電位差計測型（ｐｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔ
ｒｉｃ）光学プローブ（通常、電位差計測型染料）は、細胞小器官（ミトコンド
リア、葉緑体等）、細胞、及び生体外の膜のプレパラート（ｐｒｅｐａｒａｔｉ
ｏｎ）のような構造を有する膜において、膜透過電位及び経時による膜透過電位
の変化を測定する道具を提供する（例えば膜透過電位は、膜透過電位に影響を与
える組成物の添加に従って応答する）。プローブ画像化技術（例えば関係する染
料の視覚化）と組合せて、これらのプローブは、興奮性細胞や灌流組織にかかる
（ａｃｒｏｓｓ）膜透過電位の変化量を測定するために使用される。例えば、静止時の細胞のプラズマ膜は、活性輸送法によって維持されるＫ⁺、
Ｎａ⁺及びＣｌ^-濃度勾配（及び更に低濃度のＨ⁺、Ｃａ²⁺及びＨＣＯ₃ ^-）の
結果として、約−２０〜−７０ｍＶ（内部マイナス）（ｎｅｇａｔｉｖｅｉｎ
ｓｉｄｅ）の膜透過電位を持っている。電位差計測プローブは、これらの方法を
研究したり、例えばミトコンドリア（約−１５０ｍＶ、細胞間質内部マイナス（
ｎｅｇａｔｉｖｅｉｎｓｉｄｅｍａｔｒｉｘ）という大きな膜透過電位を示
す）を視覚化したり、また細胞の成長性を評価するのに重要な道具である。Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（１９９６）第２５章及びそこに引用された文献
参照。

【０００７】電位計測用プローブとしては、カチオン性又は両性のスチリル染料、カチオン
性ローダミン、アニオン性オキソノール、混成オキソノール及びメロシアニン５
４０がある。この種の染料は、細胞内の蓄積、応答機構及び細胞毒のようなファ
クターを決定する。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ１９９９及びそこに引
用された文献；Ｐｌａｓｅｋ等（１９９６）“ＩｎｄｉｃａｔｏｒｓｏｆＴ
ｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ：ａＳｕｒｖｅｙｏｆＤ
ｉｆｆｅｒｅｎｔＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏＰｒｏｂｅＲｅｓｐｏｎｓ
ｅＡｎａｌｙｓｉｓ．”ＪＰｈｏｔｏｃｈｅｍＰｈｏｔｏｂｉｏｌ；Ｌｏ
ｅｗ（１９９４）“ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＰｏｔｅｎｔｉ
ｏｍｅｔｒｉｃＭｅｍｂｒａｎｅＤｙｅｓ．”ＡｄｖＣｈｅｍＳｅｒ
２３５，１５１（１９９４）；Ｗｕ及びＣｏｈｅｎ（１９９３）“ＦａｓｔＭ
ｕｌｔｉｓｉｔｅＯｐｔｉｃａｌＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆＴｒａｎ
ｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌ”ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｄＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｃｔｉｖｉｔｙ，Ｍａｓｏｎ，Ｅｄ．，ｐｐ．３８９−４０４；Ｌｏｅｗ（１９９
３）“ＰｏｔｅｎｔｉｏｍｅｔｒｉｃＭｅｍｂｒａｎｅＤｙｅｓ．”ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔａｎｄＬｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔＰｒｏｂｅｓｆｏｒＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＡｃｔｉｖｉｔｙ，Ｍａｓｏｎ，Ｅｄ．，ｐｐ．１５０
−１６０；Ｓｍｉｔｈ（１９９０）“Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓｉｎＭｅｍｂｒａｎｅｓｏｆＢｉ
ｏｅｎｅｒｇｅｔｉｃＲｅｌｅｖａｎｃｅ．”ＢｉｏｃｈｅｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１０１６，１；Ｇｒｏｓｓ及びＬｏｅｗ（１９８９）“Ｆｌｕｏ
ｒｅｓｃｅｎｔＩｎｄｉｃａｔｏｒｓｏｆＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ
ｐｏｔｅｎｔｉａｌ：Ｍｉｃｒｏｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｙａｎ
ｄＩｍａｇｉｎｇ．”ＭｅｔｈＣｅｌｌＢｉｏｌ３０，１９３；Ｆｒｅ
ｅｄｍａｎ及びＮｏｖａｋ（１９８９）“ＯｐｔｉｃａｌＭｅａｓｕｒｅｍｅ
ｎｔｏｆＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｉｎＣｅｌ
ｌｓ，Ｏｒｇａｎｅｌｌｅｓ，ａｎｄＶｅｓｉｃｌｅｓ”ＭｅｔｈＥｎｚｙｍｏｌ１７２，１０２（１９８９）；Ｗｉｌｓｏｎ及びＣｈｕｓｅｄ（１９８
５）“ＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａ
ｌａｎｄＣａ⁺²−ＳｅｎｓｉｔｉｖｅＰｏｔａｓｓｉｕｍＣｈａｎｎｅ
ｌｓＤｅｓｃｒｉｂｅｄｂｙＯｘｏｎｏｌＤｙｅＦｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｃｅＭｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ”ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｅｌｌｕｌａｒＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙ１２５：７２−８１；Ｅｐｐｓ等（１９９３）“Ｃｈ
ａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＳｔｅａｄｙＳｔａｔｅａ
ｎｄＤｙｎａｍｉｃＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓｏ
ｆｔｈｅＰｏｔｅｎｔｉａｌＳｅｎｓｉｔｉｖｅｄｙｅｂｉｓ−（１
，３−ｄｉｂｕｔｙｌｂａｒｂｉｔｕｒｉｃａｃｉｄ）ｔｒｉｍｅｔｈｉｎｅ
ｏｘｏｎｏｌ（ＤｉＢＡＣ₄(３）ｉｎｍｏｄｅｌｓｙｓｔｅｍａｎｄ
ｃｅｌｌｓ”ＣｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆＰｈｙｓｉｃｓａｎｄＬｉｐｉｄｓ６９：１３７−１５０、及びＴａｎｎｅｒ等（１９９３）“ＦｌｏｗＣ
ｙｔｏｍｅｔｒｉｃＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＡｌｔｅｒｅｄＭｏｎｏｎｕ
ｃｌｅａｒＣｅｌｌＴｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｌＩ
ｎｄｕｃｅｄｂｙＣｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ”Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１４：５
９−６９参照。

【０００８】電位計測用染料は、通常、その応答機構に基づいて少なくとも２つのカテゴリ
ーに分類される。第一分類の染料（速応答染料という。例えばスチリルピリジニ
ウム染料；例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（１９９９）のＳｅｃｔｉ
ｏｎ２３．２参照）は、染料の電子構造の変化、したがって染料の蛍光特性の
変化によって、即ち、染料を囲む電場の変化に応答して作用する。これら染料の
光応答は、充分速いので、興奮性細胞、例えば孤立したニューロン、心臓細胞、
及び更には健全な（ｉｎｔａｃｔ）脳の一時的な（ミリ秒）電位変化を検出でき
る。このような電位依存性の蛍光変化の程度は、小さいことが多く、速応答プロ
ーブでは、蛍光変化は通常、１００ｍＶ当り２〜１０％である。第二分類の染料（遅応答又はネルンスト染料という。例えばＭｏｌｅｃｕｌａ
ｒＰｒｏｂｅｓ（１９９９）のＳｅｃｔｉｏｎ２３．３参照）は、蛍光変化
を伴う膜分布の電位依存性変化を示す。これら染料の光応答の程度は通常、速応
答染料の場合よりも大きい。カチオン性カルボシアニン、ローダミン及びアニオ
ン性オキソノールのような遅応答プローブは、例えば呼吸活性、イオンチャネル
浸透性、薬剤結合性、その他のファクターのような各種生物学的現象によって生
じる非興奮性細胞の各種膜透過電位の変化を検出するのに好適である。各種の利
用可能な遅応答染料の構造は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（１９
９６）の表２５．３に記載されている。

【０００９】カルボシアニン、ローダミン及びオキソノールのような多くの遅速ネルンスト
染料は、電圧依存性染料の再分布及びこの再分布で生じる蛍光変化によって膜透
過電位を測定するのに使用される。再分布によって起こり得る蛍光変化としては
、細胞又は小胞内の蛍光団（ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅ）の濃度変化、凝集による
染料の蛍光変化、或いは細胞又は小胞内の部位（ｓｉｔｅ）との結合による染料
の蛍光変化が挙げられる。通常、膜透過電位の変化後、染料を、プラズマ膜に亘
って（ａｃｒｏｓｓ）再分布するため、１０〜１５分の平衡時間が使用される。膜透過電位感知性の組成物及びアッセイが利用できるにも拘わらず、なお別の
種類の染料を必要とする上、電位計測用染料を生物アッセイに使用するための新
たなアッセイ及び方法を必要としている。本発明は、これら及び他の各種の要求
を満足させるもので、以下の完全な再検討で明らかとなる。

【００１０】発明の概要：膜透過電位の変化を測定するための電位計測用染料として、意外にも膜浸透性
カチオン性核酸染色性（ｓｔａｉｎｉｎｇ）染料が発見された。しかも、膜透過
電位の変化を監視（ｍｏｎｉｔｏｒ）するため、カチオン染料（カチオン染料で
あれば、膜浸透性カチオン性核酸染色性染料に限定されない）及びアニオン性膜
浸透性再分布性染料を併用すると、膜透過電位測定のダイナミックレンジ及び感
度が増大することが発見された。これら２種類の染料及び膜からなる組成物、並
びに膜透過電位の測定に該染料を用いる微小流体システムを提供する。更に、該
染料の平衡分布よりもむしろ染料吸収（ｕｐｔａｋｅ）の時間経過を測定すると
、信号対ノイズ比、アッセイ速度、及び他の利点を向上できることが発見された
。したがって本発明は、膜透過電位又は膜透過電位の１つ以上の変化に依存して
光信号を発生させる複数の方法を提供する。例えば、一例の実施態様では、これ
らの方法は、１種以上の膜を含む第一成分を供給し、該第一成分にカチオン性膜
浸透性核酸染色性染料を添加し、次いで該カチオン性膜浸透性核酸染色性染料か
らの第一信号出力を監視するというものである。膜透過電位の変化を監視するた
め、第一信号出力の変化を経時的に監視する。次に、膜透過電位又は膜透過電位
の変化についての指示（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）を与えるため、第一信号出力を
膜透過電位と相関させる。通常、アッセイの感度及びダイナミックレンジを増大
させるため、第一組成物は、アニオン性膜浸透性再分布性染料とも接触させる。

【００１１】或る共通するフォーマットでは、関係する成分は微小流体システム中に供給さ
れる。例えば膜透過電位に依存する信号の発生方法として、１種以上の膜と１種
以上の電圧感知性染料とを含む第一混合物を第一チャネル領域に流す方法が提供
される。電圧感知性染料の少なくとも１種からの少なくとも第一信号を監視し、
これにより該１種以上の膜にかかる膜透過電位に依存する信号を発生させる。例
えば電圧感知性染料は、１種以上のイオン染料からなる１種以上の膜浸透性再分
布性染料であってよい。１種以上の膜浸透性染料は、通常、供給源から第一チャ
ネル領域まで流して１種以上の膜と接触させ、また該膜を越える膜浸透性標識の
流れは、通常、平衡に達する前に、膜浸透性標識からの１つ以上の信号出力を監
視することにより検出する。混合物は、カチオン染料、カチオン性膜浸透性核酸
染色性染料、アニオン染料及び／又は中性染料を含むことができる。１種以上の
電圧感知性染料は、例えばＯｘｏｎｏｌＶ、ＯｘｏｎｏｌＶＩ、ＤｉＢＡＣ
４（３）、ＤｉＢＡＣ４（５）、ＤｉＢＡＣ２（３）、カチオン染料、カチオン
性膜浸透性核酸染色性染料、及びＳＹＴＯ６２のようなＳＹＴＯ染料のいずれ
か又は全てを含むアニオン染料又はカチオン染料（或いは両者）であってよい。

【００１２】例えばカチオン性膜浸透性核酸染色性染料のようなカチオン染料及び第一成分
は、少なくとも第一微小流体チャネルに流通させる。この場合は、カチオン性膜
浸透性核酸染色性染料を第一又は第二の微小チャネルに流通させて少なくとも１
つの膜と接触させるものである。アニオン性膜浸透性再分布性染料を第一又は第
二の微小チャネルに流通させて少なくとも１つの膜と接触させてもよい。こうして、微小流体フォーマットでは、膜透過電位の変化を測定又は監視する
複数の方法が提供される。これらの方法では、１種以上の膜を含む第一成分を供
給源から第一チャネル領域まで流す。膜浸透性標識を含む標識用組成物を流して
該膜と接触させる。この膜は、例えば膜の片側（例えば細胞の内側又は外側）で
イオン組成物を変えるか、或いは膜のイオンに対する浸透性を変えることにより
、膜透過電位の変化を起こすような方法で変える。膜を越える膜浸透性標識の流
れは、該膜浸透性標識からの第一信号出力を監視することにより監視し、これに
より膜透過電位の変化を測定する。

【００１３】上記方法は、膜を１種以上の膜透過電位モジュレータ組成物に接触させ、次い
で膜透過電位に対する１種以上の膜透過電位モジュレータ組成物の効果を監視し
（例えば第一信号を監視することにより）、これにより膜透過電位に対する１種
以上の膜透過電位モジュレータ組成物の効果を監視するというものでよい。この
方法は、電位モジュレータ化合物の膜透過電位モジュレータ活性をテストするた
めの薬剤スクリーニング方法として使用できる。モジュレータ組成物の例として
は、過分極緩衝剤、脱分極緩衝剤、膜のイオン浸透性を変える化合物等が挙げら
れる。更に、コントロールモジュレータ（関係するアッセイにおいて、膜透過電
位に対し既知の効果を有するモジュレータ）を、未知の効果を有するテストモジ
ュレータと比較して、テストモジュレータの膜モジュレータ活性を決定すること
ができる。コントロールモジュレータ又はテストモジュレータについての用量応
答曲線を決定できるし、またこれらの曲線を比較できる。コントロールモジュレータ及びテストモジュレータは、例えば輸送活性、イオ
ンチャネル活性、又は膜透過電位及び膜透過電位の変化に対し効果を有する他の
ファクターに影響を与えることができる。コントロールモジュレータ及びテスト
モジュレータの例としては、膜のイオン浸透性又はイオン電位等に作用する各種
の化合物があり、神経毒素（例えばパリトキシン）、複数組の神経毒素、神経伝
達物質、複数組の神経伝達物質、蛋白質、複数組の蛋白質、ペプチド、複数組の
ペプチド、脂質、複数組の脂質、炭水化物、複数組の炭水化物、有機分子、複数
組の有機分子、薬剤、複数組の薬剤、レセプタ配位子、複数組のレセプタ配位子
、抗体、複数組の抗体、サイトカイン、複数組のサイトカイン、ケモカイン（ｃ
ｈｅｍｏｋｉｎｅ）、複数組のケモカイン、ホルモン、複数組のホルモン、細胞
、複数組の細胞等が挙げられる。

【００１４】一般に、膜を越える染料転位の時間経過は、膜にかかる膜透過電位に依存する
。こうして、膜に染料を添加した後の選択された時間（ｔ）での染料からの信号
量は、膜透過電位に相関する。通常、（ｔ）は約１００秒未満であってよい。普
通、（ｔ）は、約０．１〜８０秒、例えば約１０〜７０秒である。膜透過電位の
変化を更に厳密に評価するため、上記（例えば経時による）カチオン染料及びア
ニオン染料からの第一信号と第二信号との比を測定できる。有用な染料の例としては、環状置換の非対称シアニン染料、その他のカチオン
性膜浸透性核酸染色剤（ｓｔａｉｎ）がある。有用な染料としては、ＳＹＴＯ
６２、Ｐｕｒ−１、チアゾール、アリール、２ＤＳ−７ＪＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２及びヨウ化ヘキシジウム（ｈｅｘｉｄ
ｉｕｍ）のような、青色蛍光ＳＹＴＯ染料、緑色蛍光ＳＹＴＯ染料、オレンジ色
蛍光ＳＹＴＯ染料、赤色蛍光ＳＹＴＯ染料がある。普通のアニオン性膜浸透性再
分布性染料としては、アニオン性ビス−イソオキサゾロンオキソノール染料、ビ
ス−オキソノール染料等がある。例えばアニオン性膜浸透性再分布性染料は、例
えばＯｘｏｎｏｌＶ、ＯｘｏｎｏｌＶＩ、ＤｉＢＡＣ₄(３）、ＤｉＢＡＣ₄(
５）及び／又はＤｉＢＡＣ₂(３）であってよい。関係するシステム中の例示染料
の濃度は、通常、約０．０１〜約５０μＭである。例えばカチオン染料は、第一
成分に約０．０１〜約５０μＭの濃度まで添加したＳＹＴＯ６２であってよく
、またアニオン染料は、第一成分又は第二成分に約０．０１〜約５０μＭの濃度
で添加したＤｉＢＡＣ４（３）であってよい。

【００１５】上記のように、関心のある膜の例としては、細胞、細胞小器官、人工膜、人工
又は天然産膜供給源の膜のプレパラート等がある。膜のプレパラートは、いかな
る好適な緩衝剤、例えばＮａ⁺、Ｋ⁺、Ｃｌ^-、Ｈ⁺、Ｃａ²⁺又はＨＣＯ₃ ^-の
ような膜浸透性イオンを含む液体中に懸濁させてよい。一実施態様では、膜は動
物細胞、植物細胞、菌糸細胞又は細菌細胞等のような健全な又は生の（ｌｉｖｅ
）細胞中に存在する。例えば細胞は、霊長目動物の細胞、けつ歯目動物の細胞、
イヌ科動物の細胞、ネコ科動物の細胞又は家畜類の細胞のような哺乳動物の細胞
であってよいし、或いは例えば虫又は他の動物細胞であってよい。細胞は、ＴＨ
Ｐ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ジャーカット（ｊｕｒｋａ
ｔ）細胞、βＲＬ細胞、ＨｅＬＡ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞又はＲＢＬ−２Ｈ３
細胞等の培養細胞であってよい。また細胞は内胚葉、外胚葉、中胚葉、分化組織
、未分化組織、部分分化組織、血液、末梢血液、神経、筋肉、皮膚又は骨等から
単離した細胞のような一次細胞であってもよい。通常、染料からの信号出力は、関係する染料によって生じた１つ以上の蛍光発
光を監視することにより検出する。これは、分光測光法、光学、又は例えば顕微
鏡使用により達成できる。

【００１６】一面では、本発明は、膜透過電位を監視するための微小流体システムを提供す
る。この微小流体システムは、内部に少なくとも１つの微小規模のキャビティ（
例えば微小チャネル又は微小チャンバー等）を配置した本体構造を有する。少な
くとも１つの膜を有する第一組成物の標的供給源は、少なくとも１つの微小規模
のキャビティ（例えば微小規模のチャネル、チャンバー、ウエル又はカラム等）
に流動可能に接続している。１種以上のカチオン性膜浸透性核酸染色性染料を含
むカチオン性膜浸透性染色性染料供給源は、少なくとも１つの微小規模のキャビ
ティに流動可能に接続している。或いは、又は更には、１種以上のアニオン再分
布性染料を含むアニオン性膜浸透性再分布性染料供給源は、少なくとも１つの微
小規模のキャビティに流動可能に接続している。装置の操作中、第一組成物は、
カチオン性膜浸透性染色性染料及び／又はアニオン性膜浸透性再分布性染料の存
在下で少なくとも１種の膜透過電位モジュレータ組成物に接触させる。装置を用いてモジュレータ組成物の効果をスクリーニングする用途では、装置
は、少なくとも１つの微小規模のキャビティに流動可能に接続した少なくとも１
種の電位膜モジュレータ組成物を含むことができる。電位膜モジュレータ組成物
は、例えば膜の過分極緩衝剤、膜の脱分極緩衝剤、又は膜のイオン浸透性を変え
る化合物であってよい。

【００１７】装置は通常、微小規模のキャビティに近接して配置した信号検出器を有する。
信号検出器は、例えば選択された長さの時間（ｔ）の間、検出可能な信号を検出
する。例えば検出器は、分光測光器又は光検出エレメントを含むことができる。
普通、信号検出器は、コンピューターに操作可能に接続し、検出信号を脱回旋し
て（ｄｅｃｏｎｖｏｌｖｅ）膜透過電位についての指示、例えば経時による電位
変化についての指示を与える。通常の一実施態様では、装置の操作中、少なくとも１つの膜を含む第一組成物
は、標的供給源からキャビティ中、例えば微小チャネル中に流す。電位膜モジュ
レータ組成物は、標的供給源から流れて第一組成物と接触する。カチオン性膜浸
透性染色性染料及び／又はアニオン性膜浸透性再分布性染料は流れて、第一組成
物と接触し、検出信号は、この第一組成物とカチオン性膜浸透性染色性染料及び
／又はアニオン性膜浸透性再分布性染料との接触後、選択された時間（ｔ）で監
視される。

【００１８】一面では、本発明は、例えば前述した方法を実施するための組成物を提供する
。この組成物は、膜を含む第一成分、カチオン性膜浸透性核酸染色性染料及びア
ニオン性膜浸透性再分布性染料を含有する。膜成分としては、例えば細胞、ミト
コンドリア、葉緑体、細胞の小胞、細胞又は細胞成分の膜プレパラート、或いは
人工膜が挙げられる。細胞は、健全な細胞、例えば動物細胞、植物細胞、菌糸細
胞又は細菌細胞であってよい。例えば細胞は、ここで示した細胞のいずれであっ
てもよい。同様に、カチオン性膜浸透性核酸染色性染料及びアニオン性膜浸透性再分布性
染料は、本発明方法に関連して前述した染料のいずれであってもよい。組成物と
しても例えばここで示したような緩衝剤、イオン等であってよい。例えば本発明
の組成物は、キット又は微小流体プロセッサー中に存在してよい。キットは更に
、例えば本発明を実施するための使用説明書、コントロール化合物、テスト化合
物、試剤を収納するための容器又は包装材料等を含むことができる。

【００１９】発明の詳細な説明：細胞又は小胞の内部及び外部間の、或いは膜の小葉の内部及び外部間の浸透性
イオンの分布は膜透過電位に依存する。分布の電圧依存はネルンスト方程式によ
り本質的により支配される。カルボシアニン、ローダミン及びオキソノールのよ
うな多くの遅速ネルンスト染料は、電圧依存染料再分布及び再分布から生じる蛍
光変化による膜透過電位の測定に使用される。再分布により生じる蛍光変化とし
ては、細胞又は小胞内の蛍光団の濃度変化、凝集による染料蛍光の変化又は細胞
内又は小胞内の溶質との結合による染料蛍光の変化がある。通常は、膜透過電位
（ＴＭＰ）の変化の後に染料を原形質膜に亘って再分布させるために、１０〜１
５分の平衡時間が使用される。

【００２０】本発明はＴＭＰに依存して光学信号を発生させるために好適であることが新た
に発見された染料の種類に関する。染料の種類は、ＳＹＴＯ６２のようなカチ
オン性膜浸透性核酸染料である。本発明はＴＭＰの変化を測定するために使用さ
れる方法にも関する。細胞懸濁液へのＳＹＴＯ６２添加後、ＳＹＴＯ６２蛍
光の時間経過は、細胞原形質膜にかかる膜透過電位に依存することが見出された
。他のカチオン性プローブに比べてこの新規な種類のプローブの重要な利点は、
蛍光変化の大きなフラクションがミトコンドリアの外側に位置する蛍光団から発
生することである。これらのカチオン性染料における起電力もアニオン性染料と
反対であり、この２タイプの染料がＴＭＰアッセイにおいて一緒に使用される場
合、重要な利益を導く。この種の染料を使用するための好適な方法は、ＤｉＢＡＣ₄(３）のような、あ
りきたりのアニオン性ネルンスト染料とともに新規な種類の染料を使用し、そし
てそれらの蛍光強度の比を測定することである。このアプローチは、それらの染
料が別々に使用された場合に比べて高い信号対ノイズ比のような幾つかの利点を
有する。他の利点は過分極及び脱分極の両方を含む電圧変化をより効率的に検出
する能力である、なぜなら脱分極はアニオン性染料蛍光を誘発し（カチオン性染
料蛍光を減少させ）そして過分極はカチオン性染料蛍光を誘発するからである（
アニオン性染料蛍光を減少させる）。

【００２１】さらに好ましい方法は、細胞と染料が接触した後であるが、染料の平衡分布が
達成される前に、染料の細胞に付随する蛍光を測定することである。この動的な
アプローチは感度を増大させ、アッセイに対してより大きなダイナミックレンジ
を提供し、与えられた感度レベルにてより早い測定を行うことができる。このア
プローチはラン−トゥ−ラン（ｒｕｎｔｏｒｕｎ）及びウィズインラン（ｗ
ｉｔｈｉｎｒｕｎ）アッセイ変化又は細胞毒のソースとなり得る染料を使用し
た細胞の手動のプレロード（ｐｒｅｌｏａｄ）を排除するような操作上の利益を
有する。この方法は試験試料及び染料の自動添加、引き続き短いインキュベーシ
ョン及び１又は２色の蛍光を読むことが可能な微小流体プロセッサフォーマット
にも非常に適している。カチオン性核酸（例えばＤＮＡ及び／又はＲＮＡ）染料の特定の化学物質は、
アニオン性ネルンスト染料の特定の化学物質が可能であるように、変化すること
ができる。本方法は微小流体装置又は複数の試薬添加能力を有する蛍光ミクロプ
レートリーダのようなより伝統的なアッセイフォーマットを利用できる。

【００２２】定義：「膜透過電位」とは、膜にかかる単位電荷を移動させるのに必要な仕事量であ
る。「カチオン性膜浸透性核酸染色性染料」とは、特定のｐＨ（例えば生理学的な
ｐＨ）のもとで正電荷を有し、そして核酸と結合、さもなければ結合している染
料であり、健全な細胞の膜のような選択された膜を越える（ｃｒｏｓｓ）ことが
できる染料である。「アニオン性ネルンスト染料」又はアニオン性膜浸透性再分布性染料とは、特
定のｐＨ（例えば生理学的なｐＨ）のもとで負電荷を有し、膜浸透性であり、そ
して膜により結合した空間の内部と外部との間又は膜の内部と外部との間の分布
が、膜にかかる膜透過電位に依存する染料である。「中性染料」とは、組織における適切な条件下で全体的に中性な電荷、例えば
特定のｐＨ（例えば生理学的なｐＨ）を有する。「電圧感知性組成物」とは、蛍光染料を含む膜透過電位指示薬である。本発明
の通常の電圧感知性組成物は、１種以上のカチオン性膜浸透性核酸染色性染料又
は随意に１種以上の他のカチオン性電位差測定型染料、及び随意にアニオン性膜
浸透性再分布性染料である。膜にかかる膜透過電位が０である場合、膜は「脱分極」される。膜透過電位が
膜の静止電位よりも低い場合、膜は「過分極」である。約２４時間以下、及び通
常は約１２、５、１又は０．５時間或いはそれ未満において、膜を越える所定成
分（染料、イオン等）が平衡である場合は、その成分に対し膜は浸透性である。
浸透性は適切な条件、例えば温度、イオン条件、電圧電位等に依存し得る。

【００２３】膜浸透性カチオン性染料：前述のとおり、本発明の好ましい電圧感知性組成物は、種々のカチオン性膜浸
透性核酸染色性染料の任意のものを含む。このような染料は入手でき、本発明の
分析、組成物及び装置において使用できる。本発明の特徴は、細胞浸透性核酸染料が電位差ＴＭＰ測定に使用するのに好適
であることの発見である。例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓから入手
できるシアニン核酸染色性ＳＹＴＯ染料（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂ
ｅ１９９９、８章参照）である。これらの染料は、通常、電位差ＴＭＰ測定に
使用するのに好適である。ＳＹＴＯオレンジ色蛍光核酸染料（例えばＳＹＴＯ
８０−８５）；ＳＹＴＯ青色蛍光核酸染料（例えばＳＹＴＯ４０−４５）；Ｓ
ＹＴＯ緑色蛍光核酸染料（例えばＳＹＴＯ１１−１６、１８及び２０−２５）
；ＳＹＴＯ赤色蛍光核酸染料（例えばＳＹＴＯ１７及び５９−６４）を含む。
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓＰｒｏｄｕｃｔｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ＳｈｅｅｔＭＰ１１３６０、ＭＰ１１３５０、ＭＰ０７５７２及びＭＰ１１
３４０をそれぞれ参照、またそこで引用された文献も参照。

【００２４】多数のＳＹＴＯ染料は、殆どの細胞の膜を通って受動的に拡散する核酸染料で
ある。これらの細胞浸透性で紫外又は可視光励起が可能な染料が、グラム陽性又
はグラム陰性バクテリアと同様に、生物又は真核細胞におけるＤＮＡ及びＲＮＡ
を染色することに伝統的に使用された。これらの染料は、哺乳動物の細胞及びバ
クテリアを含む実際の全ての細胞膜に対する浸透性；可視吸収最大値における＞
５０，０００ｃｍ^-1Ｍ^-1の吸光係数を有する高い分子吸光度；及び通常＜０．０
１未満の収量を有する本質的な低い蛍光を含む数種の特性を共有する。示したよ
うに、染料は青、緑、オレンジ又は赤色蛍光染料として入手できる。ＳＹＴＯ染
料は細胞浸透性、結合する核酸における蛍光増幅、励起及び発光スペクトル及び
ＤＮＡ／ＲＮＡ選択性並びに結合親和力を含む１種以上の特性においてそれぞれ
異なる（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，１９９９，表８．７参照）。ＳＹ
ＴＯ染料はレーザー励起又は慣用のブロードバンド照明源（例えば水銀及びキセ
ノン−アークランプ）を使用する種々の蛍光ベースの道具と融和する。

【００２５】シアニン染料は浸透性及び核酸特異性のような数種の物理的特性にける差異を
示し、異なるクラスへのそれらの分布を許容する。ＳＹＴＯ染料に加え、本発明
の状況においてＨｏｅｃｈｓｔ３３２５８及びＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２染料並
びに他のものも有用である。細胞染色性のために推奨される染料濃度はアッセイに依存し広く変化できるが
、典型的にはバクテリアについて０．１−５０μＭ、酵母について０．１−１０
０μＭ、他の真核生物について１０−５０μＭである。本発明の好適な電圧感知性組成物は、任意の種々の他の膜浸透核酸染色性染料
を随意に含む。例えばヨウ化ヘキシジウム試薬（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂ
ｅｓカタログ第Ｈ−７５９３号）は適度な脂肪親和性のフェナントリジニウム染
料であり、哺乳動物の細胞に対して浸透性でかつグラム陰性バクテリアの存在下
においてほとんど全てのグラム陽性バクテリアを選択的に染色する。通常は、真
核細胞の細胞質及び核の両方がヨウ化ヘキシジウムを使用して染色性を示す；し
かしミトコンドリア及び仁（ｎｕｃｌｅｏｌｉ）も染色され得る。

【００２６】同様に、ジヒドロエチジウムは化学的に還元されたエチジウム誘導体であり生
物細胞に浸透する。ジヒドロエチジウムは細胞質内で青い蛍光を示す。多くの生
存能力のある細胞は、エチジウムに対するプローブを酸化する。そしてそれから
ＤＮＡ挿入物上で赤く蛍光する。ＬＤＳ７５１（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（１９９９）カタログＬ−
７５９５）は細胞浸透性染料である。ＬＤＳ７５１は、ｄｓＤＮＡにおいて−
５４３ｎｍにおけるそのピーク励起を有し、４８８ｎｍにおいてアルゴン−イオ
ンレーザーにより励起され、その長い発光波長最大値（−７１２ｎｍ）のため、
マルチカラー分析に有用である。ＡＣＭＡ（９−アミノ−６−クロロ−２−メトキシアクリジン，Ａ−１３２４
）は、ポリ（ｄ（Ａ−Ｔ））に選択的に結合するＤＮＡ挿入物である。ＡＣＭＡ
はエネルギーを与えられた状態にて膜に結合し、そしてｐＨ勾配が生じた場合は
消光する。ＡＣＭＡは本発明において使用すること又は除外されることができる
。例えばある具体例において、ＡＣＭＡ以外の核酸染料は電位差測定に利用され
る。ＡＣＭＡも電位差測定に利用され得る。

【００２７】さらに、核酸染料以外の種類のカチオン性膜浸透性染料は、例えば上記カチオ
ン性膜浸透性核酸染色性染料と結合して、及び／又はＴＭＰの変化の非平衡測定
においてアニオン性染料と組み合わせて本発明の電圧感知性組成物又はここで記
載するような他の適用において使用できる。このような染料はインドカルボシア
ニン染料、チオ−カルボシアニン染料、オキサ−カルボシアニン染料を含む（２
，０００年８月１０日に更新されたＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓオンラ
インカタログ、セクション２３．３、タイトル「Ｓｌｏｗ−Ｒｅｓｐｏｎｓｅ
Ｄｙｅｓ；」、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ／ｐｒｏｂｅｓ．ｃｏｍ／ｈａｎｄｂｏｏ
ｋ／ｓｅｃｔｉｏｎｓ／２３０３．ｈｔｍｌ参照）。Ｓｉｍｓ等、（１９７４）
「ＳｔｕｄｉｅｓｏｎｔｈｅＭｅｃｈａｎｉｓｍｂｙＷｈｉｃｈＣ
ｙａｎｉｎｅＤｙｅｓＭｅｓｕｒｅＭｅｍｂｒａｎｅＰｏｔｅｎｔｉａ
ｌｉｎＲｅｄＢｌｏｏｄＣｅｌｌｓａｎｄＰｈｏｓｐｈａｔｉｄｙ
ｌｃｈｏｌｉｎｅＶｅｓｉｃｌｅｓ」Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３，３
３１５；Ｃａｂｒｉｎｉ及びＶｅｒｋｍａｎ（１９８６）「Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ
−ＳｅｎｓｉｔｉｖｅＲｅｓｐｏｎｓｅＭｅｃｈａｎｉｓｍｏｆＤｉＳ
−Ｃ３（５）ｉｎＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｍｂｒａｎｅｓ」ＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌ９２，１７１；Ｇｕｉｌｌｅｔ及びＫｉｍｍｉｃｈ（１９
８１）「ＤｉＯ−Ｃ３−（５）ａｎｄＤｉＳ−Ｃ３−（５）：Ｉｎｔｅｒａ
ｃｔｉｏｎｓｗｉｔｈＲＢＣ，ＧｈｏｓｔｓａｎｄＰｈｏｓｐｈｏｌｉ
ｐｉｄＶｅｓｉｃｌｅｓ」ＪＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌ５９，１；Ｒ
ｏｔｔｅｎｂｅｒｇ及びＷｕ（１９８８）「ＱｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅＡｓｓ
ａｙｂｙＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙｏｆｔｈｅＭｉｔｏｃｈｏｎ
ｄｒｉａｌＭｅｍｂｒａｎｅＰｏｔｅｎｔｉａｌｉｎＩｎｔａｃｔＣ
ｅｌｌｓ」ＢｉｏｃｈｉｍＢｉｏｐｈｙｓＡｃｔａ１４０４，３９３（
１９９８）も参照。

【００２８】他の有用な染料は、アミノナフチルエチレニルピリジニウム染料及びジアルキ
ルアミノフェニルポリフェニルピリジニウム染料を含む。アミノナフチルエチレ
ニルピリジニウム染料は、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓカタログに
列挙される（Ｄｉ−４−ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＰＳ、Ｄｉ−２−Ａ
ＮＥＰＥＱ、Ｄｉ−８−ＡＮＥＰＥＱ及びＤｉ−１２−ＡＮＥＰＥＱ）ＡＮＥＰ
型染料を含む。ジアルキルアミノフェニルポリフェニルピリジニウム染料は、Ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓカタログに列挙されるＲＨ型染料（ＲＨ１６０
、ＲＨ２３７、ＲＨ４２１、ＲＨ７０４、ＲＨ４１４及びＲＨ４６１）を含む。

【００２９】本発明のカチオン性膜浸透性核酸染色性染料とともに、又は本発明のアニオン
性染料と組み合わせて、例えばＴＭＰの変化の非平衡測定において、又はここで
記載される他の適用において使用することができるカチオン性プローブの他の種
類は、ローダミンプローブである。ローダミン１２３（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰ
ｒｏｂｅｓ１９９９カタログＲ−３０２番）はミトコンドリアについての構
造マーカとして及びミトコンドリアの活性の指示薬として広く使用される。テト
ラメチルローダミンのメチル及びエチルエステルは、定量的なイメージングによ
る膜透過電位の測定用染料として使用される。ネルンスト方程式を利用する定量
的な膜透過電位測定は、染料の膜分布が膜透過電位に依存し並びに染料の凝集及
び細胞内成分との電位非依存相互作用のような他のプロセスが最小限に寄与する
ことを意味する。テトラメチルローダミンのメチル及びエチルエステル、例えば
ＴＭＲＭ及びＴＭＲＥは、これらの基準を満たす（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏ
ｂｅｓ，１９９９上参照）。それらはローダミン１２３よりもより膜浸透性
であり、それらの強い蛍光はそれらが低濃度でも使用でき、そしてそれゆえ凝集
を避けることができることを意味する。なぜなら、それらの蛍光は環境に対して
比較的鈍感であるため、ＴＭＲＭ及びＴＭＲＥの空間的に消滅した蛍光は、ネル
ンストの方程式を介して膜透過電位に直接関係し得る膜分布の不偏な輪郭（ｕｎ
ｂｉａｓｅｄｐｒｏｆｉｌｅ）を与えるからである。これは特に、非平衡染料
分布条件下でのＴＭＰの変化を監視する際、これらのカチオン性染料をアニオン
性染料と組合せて使用する具体例において有用である。

【００３０】アニオン性膜浸透性再分布性染料：前述したように、本発明の好ましい電圧感知性組成物は、種々のアニオン性膜
浸透性再分布性染料であり、入手可能でかつ本発明のアッセイ、組成物及び装置
において使用できる任意のものを含む。膜浸透性であり改良された更なる新しい
アニオン性染料も、ここで方法及びシステム中において使用できる。入手できるアニオン性染料の例としては、細胞外の溶液からのネルンストの方
程式に依存する吸収により脱分極された細胞の細胞質中に蓄積されたアニオン性
ビス−イソキサゾロンオキソノールを含む。ある参考文献（「Ｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｏｆｔｈｅＰｏｔｅｎｔｉａｌ−ＳｅｎｓｉｔｉｖｅＥｘｔｒｉｎｓｉ
ｃＰｒｏｂｅＯｘｏｎｏｌＶＩｉｎＢｅｅｆＨｅａｒｔＳｕｂｍ
ｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌＰａｒｔｉｃｌｅｓ」，Ｊ．Ｃ．Ｓｍｉｔｈ，Ｂ．
Ｃｈａｎｃｅ．ＪＭｅｍｂｒａｎｅＢｉｏｌ４６，２５５（１９７９））
において研究されたオキソノールにて、オキソノールＶＩが６０３ｎｍにおける
等吸収点を有する最も大きいスペクトルのシフトを与える。オキソノールＶＩは
オキソノールＶよりもより電位の変化に対して迅速に応答する。しばしば、ＤｉＢＡＣ染料とも呼ばれる３つの通常のビス−バルビツール酸オ
キソノールは、およそ４９０ｎｍ（ＤｉＢＡＣ₄(３））、５３０ｎｍ（ＤｉＳＢ
ＡＣ₂(３））及び５９０ｎｍ（ＤｉＳＢＡＣ₄(５））における励起最大値を有す
るスペクトル識別電位差プローブの組を形成する。ＤｉＢＡＣ₄(３）は「ビス−
オキソノール」（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ，１９９９２３章）の使
用を引用した多くの刊行物において使用されている。これらの染料は脱分極され
た細胞に入り、そこでそれらは細胞内の蛋白質又は膜と結合し、そして増強され
た蛍光及び赤のスペクトルのシフトを示す。増加した脱分極はアニオン性染料の
より多くの流入を生じ及びそれゆえ蛍光の増加を生じる。ＤｉＢＡＣ₄(３）は特
に高い電圧感度を有する。長い波長のＤｉＳＢＡＣ₂(３）は、頻繁に膜透過電位
及びＣａ²⁺濃度を同時に測定するためのＵＶ光励起Ｃａ²⁺指示薬インド−１又は
フラ−２と組み合わせて使用された（表２３．２にて）。

【００３１】非平衡ＴＭＰ変化測定：カチオン性、アニオン性及び中性染料組成物本発明の１つの実施態様は、膜を越える染料の平衡前の染料吸収の測定が、Ｔ
ＭＰの変化の測定の正確な手段を生ずるという驚くべき発見である。特に膜を越
える染料の平衡前の１つ以上の時点において、カチオン性及びアニオン性染料の
両方の検出することは、アニオン性染料に対する信号及びＴＭＰの変化の測定に
ついてのダイナミックレンジを増加させる。しばしば、単一の時点の測定はＴＭ
Ｐの変化の指示を提供するに十分である。それゆえ、１種以上の膜を含む第一の成分は、少なくとも第一の膜浸透性再分
布性染料と混合され、そして平衡染料再分布前に測定された第一再分布性染料か
らの１種以上の信号出力が確立され、非平衡染料再分布測定を提供する。この非
平衡染料再分布測定は膜透過電位の変化に依存する。通常、少なくとも第二の膜
浸透性再分布性染料が１種以上の成分に加えられ、平衡染料再分布前が確立され
る前の第二の膜浸透性再分布性染料からの１種以上の信号出力も測定される。カ
チオン性染料からの第一信号及びアニオン性染料からの第二信号は、１種以上の
時点で測定され、それにより膜透過電位の少なくとも１種の変化の指示を与える
。

【００３２】任意の上記膜浸透性核酸染色性染料は、ここの方法によりＴＭＰの変化を測定
するのに好適である。さらに、カチオン性ローダミン及びここで示される他のカ
チオン性染料のような他のカチオン性及び／又はアニオン性膜再分布性染料が、
ＤｉＢＡＣ₄(３）及びここで記載される他の染料と同様に、本発明の方法に使用
することができる。カチオン性及びアニオン性染料の両方を使用する適用におい
て、任意の上記カチオン性及びアニオン性染料がＴＭＰに依存する信号を発生さ
せるのに使用することができる。示された種々の染料を使用し、ここで測定され
る任意のＴＭＰアッセイを単に行うことにより、当業者が最適な染料の組み合わ
せを選択し得ることが予想される。例えば、非平衡ＴＭＰアッセイにおけるＳＹ
ＴＯ（登録商標）６２及びＤｉＢＡＣ₄(３）の組み合わせは、ＴＭＰアッセイに
おける監視変化についての拡張されたダイナミックレンジを提供し、そしてアッ
セイにおける高い信号対ノイズ比を提供する。アニオン性及びカチオン性染料はプレミックスされそして膜調製物（ｐｒｅｐ
ａｒａｔｉｏｎ）に、例えば微小流体装置内で加えることができ、そして染料は
膜調製物に別々に加えてもよい。染料をプレミックスするか否かの決定は、例え
ば染料のソース、ユーザの好み、使用される装置のタイプ及び混合される染料の
相溶性に依存する。別の具体例において、アニオン性及びカチオン性染料は別々
のアッセイにおいて、同じ又は異なる膜調製物において、アニオン性及びカチオ
ン性から類似の又は異なる時点において採られる信号測定或いはデータのセット
、グラフ等を生成する任意の数学的方法により結合されたデータを使用して、使
用される。それゆえ、染料は膜調製物と接触する前に組み合わされ、或いは独立
して同じ又は異なる膜調製物と独立して接触し得る。別個の染料からの信号測定
から生成されたデータセットは、別々に分離することができ又は結合することが
できる。

【００３３】中性染料は、本方法にて及び本発明の組成物の実施態様として使用することが
できる。特に、中性染料はここでの多くの方法において有用な対照物である。例
えば、中性染料は膜浸透性を監視するのに使用することができ、電圧依存でない
浸透における変化を含む。例えば温度、ｐＨ、溶媒等の浸透性における効果は、
中性染料を使用して監視でき、そして温度効果による浸透性の変化は、カチオン
性及び／又はアニオン性染料について得られるデータを標準化し又はさもなくば
翻訳することに使用できる。同様に細胞又は他の膜含有構造は、中性染料からの
信号出力を監視することにより無傷であるため、監視することができる。通常、
中性染料はアッセイの他の成分（カチオン性又はアニオン性染料、膜等）を実質
的に妨げないように選択される。前述のようなアッセイにおける中性染料の使用の観点から、ここでの種々の微
小流体装置は、中性染料のソース、膜調製物等と接触する染料を流す手段も含む
ことができる。種々の中性染料は、ここでＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ（１９９９）を
含む参考文献中に述べられる。このような染料としては、極性又は無極性である
ことができ、ニュートラルレッド、無極性ピレンプローブ、無極性ＢＯＤＩＰＹ
プローブ、ニールレッド、種々のローダミンの両親媒性誘導体、フルオレセイン
及びクマリン並びに他の多くのものがある。

【００３４】膜調製物：当業者は、入手可能な細胞、膜調製物及び他の試薬を、細胞、膜調製物及び他
の試薬をここで記載されたような微小流体装置へ提供することにより本発明に適
合させることができる。アッセイ条件及び緩衝剤、並びに染料、モジュレータ、
細胞、膜調製物等を利用する試薬パラメータは、確立されたＴＭＰ活性レベル、
公知の試薬の組、濃度及び公知のＴＭＰモジュレータについてのダイナミック情
報に基づき選択されることができ、それらは選択されたモジュレータ及びシステ
ムに対して推定のモジュレータにより修飾される。特定のモジュレータ又は推定
のモジュレータの初期のスクリーンは、システムにおける単一の濃縮物又は複数
のモジュレータ濃縮物にて行われる。通常、初期のスクリーンに基づくモジュレ
ータ活性を有する化合物は、膜と接触して増加又は減少した量にて滴定され、モ
ジュレータについて用量作用曲線を確立する。数種の条件の組の下でのモジュレータに対するＴＭＰ応答を自然に表示する細
胞を単に使用するよりも、所望のＴＭＰ応答活性を組み込んだ組換え細胞も構成
することができる。これは、所定の細胞は確立された方法を使用する培養物にお
いて容易に維持されるので有利である。

【００３５】通常は、組換え細胞の作成及び膜チャネル蛋白質及び輸送体レセプタのような
細胞蛋白質を表現する方法は当業界で公知である。組換え方法に関する紹介につ
いては、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ，ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙＶｏｌ．１５２ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａ
ｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２版），Ｖ
ｏｌ．１−３，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮｅｗＹｏｒｋ，１９８９（「Ｓ
ａｍｂｒｏｏｋ」）；及びＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ等編．，Ｃｕｒｒｅｎ
ｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａｊｏｉｎｔｖｅｎｔｕｒｅｂｅｔｗｅｅｎ
ＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．及びＪ
ｏｈｎＷｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９９年中に増刊）（「Ａ
ｕｓｕｂｅｌ」）を参照。

【００３６】さらに、セルラインの培養物及び組織又は血液試料からの培養された初期細胞
は当業界で公知である。Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（ＣｕｌｔｕｒｅｏｆＡｎｉｍａｌＣｅｌｌｓ，ａＭａｎｕａｌｏｆＢａｓｉｃＴｅｃｈｎｉｑｕｅ，
３版Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮｅｗＹｏｒｋ（１９９４））及びここで引用
される参考文献は、動物細胞の培養物に対する通常のガイドを提供する。哺乳動
物の細胞の培養物は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，同上，並びにＤｏｙｌｅ及びＧｒｉｆ
ｆｉｔｈｓ（１９９７）ＭａｍｍａｌｉａｎＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ：ＥｓｓｅｎｔｉａｌＴｅｃｕｎｉｑｕｅｓＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏ
ｎｓ，ＮＹに記載される。植物細胞の培養物は、Ｐａｙｎｅ等（１９９２）ＰｌａｎｔｃｅｌｌａｎｄｔｉｓｓｕｅｃｕｌｔｕｒｅｉｎｌｉｑｕｉｄｓｙｓｔｅｍｓＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅ
ｗＹｏｒｋ，ＮＹに記載される。原核生物の培養物を含む更なる細胞培養物の
情報は、上記Ａｕｓｕｂｅｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＢｅｒｇｅｒにおいて見出
すことができる。細胞培養物の培地は、Ａｔｒａｓ及びＰａｒｋｓ編ＴｈｅＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｏｃａｌＭｅｄｉａ（１９
９３）ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｍ，ＦＬに記載される。更な
る情報は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（ＳｔＬｏｕｉｓ，ＭＯ）製
、ＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅカ
タログ（１９９８）、及び例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）製ｔｈｅＰｌａｎｔＣｕｌｔｕｒｅＣａｔａｌｏｇｕ
ｅａｎｄｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（１９９７）のような市販の文献中に見出せ
る。多くの細胞が、選択されたモジュレータに対するＴＭＰ応答について試験さ
れることができる。本発明の状況において試験し得る細胞は、使用される染料が
透過可能な細胞壁及び／又は細胞膜を有するものである。

【００３７】イオンチャネルは、膜（例えば細胞膜）内の孔であり、適切な膜を越える多く
のイオンの通過を媒介する。Ｈｉｌｌｅ（１９９２）ＩｏｎｉｃＣｈａｎｎｅｌｓｏｆＥｘｃｉｔａｂｌｅＭｅｍｂｒａｎｅｓ，２版，Ｓｉｎａｕｅｒ
ＡｓｓｏｃｉａｔｅｓＩｎｃ．Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（ＩＳＢＮ０
−８７８９３−３２３−９）（Ｈｉｌｌｅ）はイオンチャネルに対する導入を提
供する。イオンチャネル型の例としてはＮＡ⁺、Ｋ⁺、Ｃａ⁺⁺又は他のイオンが
膜を通過することを許容するものである。これらの及び他のイオンチャネルの構
造及び機能に関する詳細は、Ｈｉｌｌｅ内に見出される。イオンチャネルを含む
膜調製技術は、Ｈｉｌｌｅ及びここで引用される他の参考文献内に見出される。ＴＭＰ応答に影響を与え得る他の蛋白質の組は、輸送体蛋白質である。これら
の蛋白質は、活発にイオン及び他の分子を細胞の内又は外へ輸送する。輸送体の
クローニング及び表現に関する詳細は、ＮｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ（１９９７）Ｍ．Ｅ．ＡＲｅｉｔｈ編ＨｕｍａｎＰ
ｒｅｓｓ，ＴｏｗａｔａＮＪ；ＮｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒＭｅｔｈｏｄｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅ７２（１９９７）Ｒ．Ｒａｙｎｅ編ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ，Ｔｏｗ
ａｔａＮＪ；ＮｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙＶｏｌｕｍｅ７３：Ｉｒｖ
ｉｎｅ及びＷｉｌｌｉａｍｓ編ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ，ＴｏｗａｔａＮＪ
；Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ，第２版（１９９７）Ｔｕｒｎｅｒ及びＢａｃｈｅｌａｒｄ編Ｏｘｆｏｒｄ
Ｐｒｅｓｓ，ＯｘｆｏｒｄＥｎｇｌａｎｄ；及び，ＮｅｕｒａｌＣｅｌｌＣｕｌｔｕｒｅ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）Ｃ
ｏｈｅｎ及びＷｉｌｋｉｎｓ編ＯｘｆｏｒｄＰｒｅｓｓ，ＯｘｆｏｒｄＥ
ｎｇｌａｎｄに見出せる。

【００３８】上記参考文献は本発明に有用な種々の膜調製物を製造するための、多数の膜調
製プロトコルも提供する。これらは細胞調製、リポソーム調製等を含む。種々の
更なる参考文献は、種々のそのような膜調製技術、例えばＧｒａｈａｍ及びＨｉ
ｇｇｉｎｓ（１９９７）ＭｅｍｂｒａｎｅＡｎａｌｙｓｉｓＢｉｏｓ，Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｃｏ
ｕｌｄ編（１９９４）ＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ：ＡＵｓｅｒ’ｓＧｕｉｄｅＰｏｒｔｌａｎｄＰｒ
ｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｇｕｍｓｔｏｎｅ（１９９６）ＦａｔｔｙＡｃｉｄＬｉｐｉｄＣｈｅｍｉｓｔｒｙＢｌａｃｋｉｅＡｃａｄ
ｅｍｉｃａｎｄＰｒｏｆｒｓｓｉｏｎａｌ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ
；Ｙｅｈｕｄａ及びＭｏｓｔｏｆｓｋｙ編（１９９７）ＨａｎｄｂｏｏｋｏｆＥｓｓｅｎｔｉａｌＦａｔｔｙＡｃｉｄＢｉｏｌｏｇｙ：ＰｈｙｓｉｏｌｏｇｙａｎｄＢｅｈａｖｉｏｒａｌＮｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙＨｕｍ
ａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｗａｔａ，ＮＪ；Ｒｉａｆａｉ及びＷａｒｎｉｃｋ（
１９９４）ＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭｅｓｕｒｍｅｎｔｏｆＬｉｐｉｄｓ，ＬｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＡｐｏｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎＡＡＣＣ
Ｐｒｅｓｓ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，及びＮｅｗ編（１９９０）Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈＩＲＬＰｒ
ｅｓｓａｔＯｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ、を教示する。

【００３９】ＴＭＰ測定：電位差測定を経時的に行い、経時的な（例えばＴＭＰモジュレータに応答した
）ＴＭＰの変化を測定した。測定は、例えば経時的な蛍光の変化を測定すること
により行った。数種の異なる発光波長を同時に測定することができる。前に議論
したとおり、種々の微小流体装置は、本発明の状況にて使用可能な蛍光検出器を
組み込むことができる。さらに、蛍光は標準的なキュベット及び／又はミクロ滴
定板内で、当業界で公知な分光光度計及びプレートリーダを使用して監視するこ
とができる。通常は、蛍光変化が監視され、そしてＴＭＰの変化に相関させる。しかし、統
計的な測定（例えば単一時点における測定）もまた行われ、そして例えば較正の
目的のために、（集められた（例えば作表された）蛍光情報と比較して）予想さ
れる蛍光測定に相関させる。

【００４０】ＴＭＰモジュレータ：種々のイオンチャネル活性モジュレータが公知である。例えば、多くの神経毒
は特定のイオンチャネルをブロックし、及び／又はチャネルゲーティングを改変
する。Ｈｉｌｌｅの１７章を参照。例えばプロナーゼを用いた処理はＮａ⁺不活
性化の遅延又は損失を生ずる。Ｈｉｌｌｅの１７章、表１に列挙されたもののようなＮＡ⁺及び他のイオンチ
ャネルにおけるゲーティングを改良する種々の試薬は、公知でありかつ入手可能
である。例としては、プロナーゼ、トリプシン、ＮＢＡ、ＮＢＳ、ＴＮＢＳ、Ｓ
ＩＴＳ、ＩＯ₃、トリニトロフェノール、グリオキサル、タンニン酸、ホルムア
ルデヒド、グルタルアルデヒド、ｐＨ_i＜６，ｐＨ_i，＞９、アクリジンオレン
ジ（Ａｃｒｉｄｉｎｅｏｒａｎｇｅ）、エオシンＹプラスライト及びＤＰＩ−
２０１−１０６のような、ＴＭＰ不活性化を除去する化学試薬が挙げられる。他
の例としては、Ｌｅｉｕｒｕｓｑｕｉｎｑｕｅｓｔｒｉａｔｕｓ（北アメリカ
）、Ｂｕｔｈｕｓｅｕｐｅｕｓ；Ｂ．ｔａｍａｌｕｓ（アジア）、Ａｎｄｒｏ
ｃｔｏｎｕｓａｕｓｔｒａｌｉｓ（北アフリカ）、Ｃｅｎｔｒｕｒｏｉｄｅｓ
ｓｃｕｌｐｔｕｒａｔｕｓ；Ｃ．ｓｕｆｆｕｓｕｓ（北アメリカ）、Ｔｉｔｙ
ｕｓｓｅｒｒｕｌａｔｕｓ（南アメリカ）、Ａｎｅｍｏｎｉａｓｕｌｃａｔ
ａ（地中海）、Ａｎｔｈｏｐｌｅｕｒａｘａｎｔｈｏｇｒａｍｍｉｃａ（カリ
フォルニア）及びＣｏｎｄｙｌａｃｔｉｓｇｉｇａｎｔｅａ（バミューダ）か
らのもののような、膜の不活性化を遅らすサソリ及び腔腸動物のペプチドα毒が
挙げられる。他の例としては、Ｃｅｎｔｔｕｒｏｉｄｅｓｓｃｕｌｐｔｕｒａ
ｔｕｓ、Ｃ．ｓｕｆｆｕｓｕｓ及びＴｉｔｙｕｓｓｅｒｒｕｌａｔｕｓのよう
な膜の活性をシフトさせるサソリペプチドβ毒が挙げられる。他の例としては、
アコニチン、ベラトリジン及びバトラコトキシンのような活性化をシフトし、及
び不活性化を遅らせる脂質溶解性毒が挙げられる。同様に、アレトリン、ジエル
ドリン、アルドリン、及びテトラメトリンのようなピレスロイドは、ＴＭＰにお
ける効果及び／又はＴＭＰにおける代替を有する。同様に、グレイアノトキシン
（ｇｒａｙａｎｏｔｏｘｉｎ）、ＤＤＴ、及び類似化合物はＴＭＰ及びＴＭＰの
変化に影響を及ぼす。外部二価イオン、及びｐＨ、外部及び内部一価イオンの存
在、並びにリオトロピックアニオン、サリチレート、フロリジンのような荷電し
た又は極性の吸着物の存在のような種々のイオン条件は、ゲーティングの電圧依
存に影響する。

【００４１】ここでの方法を使用して、多くの分子がＴＭＰモジュレータ活性について試験
できる。好ましくは、試験される分子はアッセイに使用される染料と直接的に相
互作用をしない、なぜならそのような相互作用は観察される任意の結果の解釈を
複雑化するのからである。同様に、種々の化学化合物が本発明のアッセイにおい
て電位差モジュレータとして使用でき、これらの化合物はアッセイで使用される
染料と直接相互作用しないものが非常に多いが、通常は、例えばアッセイを微小
規模システムにおいて行なう場合、水又は有機（例えばＤＮＳＯベース）溶液に
溶解し得る化合物が流れを容易にするために使用される。ここでアッセイはアッ
セイ工程を自動化し、そしてアッセイに対して任意の便利なソースから化合物を
供給することにより多くの化学ライブラリを随意にスクリーンするように設計さ
れている。Ｓｉｇｍａ（セントルイスＭＯ）、Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイスＭ
Ｏ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（セントルイスＭＯ）、ＦｌｕｋａＣｈｅ
ｍｉｋａ−ＢｉｏｃｈｅｍｉｃａＡｎａｌｙｔｉｋａ（ブークス、スイス）等
を含む化学及び生物化合物のサプライヤは多く存在することが理解できるであろ
う。

【００４２】ある好適な具体例において、スループット（ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）スクリー
ニング法は多数の電位差ＴＭＰ活性モジュレータ化合物（「電位差モジュレータ
化合物」）を含む組み合わせのライブラリを提供することを含む。このような「
組み合わせの化学ライブラリ」はここで記載される１種以上のアッセイにおいて
スクリーンされ、所望の特徴的な活性を表すこれらのライブラリのメンバー（特
に化学種及びサブクラス）を特定する。こうして特定された化合物は、慣用のリ
ード化合物として使用でき、そしてそれら自身が、ＴＭＰ活性をモジュレートす
ることによる処理に対し影響を受け得る治療条件についての潜在的及び実際的な
治療として使用することができる。例えばパニック、ストレス、強迫疾患、憂鬱
、慢性的な痛み及び他の肉体的及び心理的な疾患を含む種々の病気は、輸送モジ
ュレータのようなＴＭＰモジュレータを施すことにより治療される。ＮｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ＦｕｎｃｔｉｏｎａｎｄＲｅｇｕｌａｔｉｏｎ（１９９７）Ｍ．Ｅ．ＡＲｅ
ｉｔｈ編ＨｕｍａｎＰｒｅｓｓ，ＴｏｗａｔａＮＪ、及びそこで引用され
た文献参照。通常の組合せの化学ライブラリは、化学合成又は生物学的合成のいずれかによ
り発生した種々のライブラリであり、試薬のような化学的な「基礎単位（ｂｕｉ
ｌｄｉｎｇｂｌｏｃｋｓ）」の多数を組合せることによるものである。例えば
、ペプチドライブラリのような線状の組合せの化学ライブラリは、全ての可能な
方法、又は与えられた化合物（即ちポリペプチド化合物中のアミノ酸の数）の長
さに関して選択された方法において化学的な基礎単位（アミノ酸）のセットを組
合せることにより形成される。１００万個の化学化合物が、このような化学的基
礎単位を組合せの混合によって合成することができる。

【００４３】組合せ化学ライブラリの調製及びスクリーニングは当業者に公知である。この
ような組合せ化学ライブラリとしては、制限するものではないが、ペプチドライ
ブラリ（例えば米国特許第５，０１０，１７５号、Ｆｕｒｋａ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．３７：４８７−４９３（１９９１）及びＨｏｕｇｈ
ｔｏｎ等，Ｎａｔｕｒｅ３５４：８４−８８（１９９１）がある。化学種ライ
ブラリを発生させる他の化学物質を使用することもできる。このような化学物質
は、制限するものではないが、ペプトイド（ｐｅｐｔｏｉｄｓ）（ＰＣＴ公報第
ＷＯ９１／１９７３５）、エンコードされたペプチド（ＰＣＴ公報第ＷＯ９３／
２０２４２）、ランダムバイオオリゴマー（ＰＣＴ公報第ＷＯ９２／０００９１
）、ベンゾジアゼピン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベ
ンゾジアゼピン及びジペプチドのようなディバーソマー（ｄｉｖｅｒｓｏｍｅｒ
）（Ｈｏｂｂｓ等、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：６９０
９−６９１３（１９９３））、ビニログポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａ等、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８（１９９２））、α−Ｄ−グ
ルコース骨格を有する非ペプチドのペプチド類似物（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ等、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：９２１７−９２１８（１９９２））
、小さい化合物ライブラリのアナログ有機合成物（Ｃｈｅｎ等、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２６６１（１９９４））、オリゴカルバメート（Ｃ
ｈｏ等、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６１：１３０３（１９９３））及び／又はペプチジ
ルホスホネート（Ｃａｍｐｂｅｌｌ等、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８（
１９９４）、核酸ライブラリ（Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ，ＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙｖｏｌｕｍｅ１５２Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍ
ｂｒｏｏｋ等（１９８９），ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ−ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ（２版）Ｖｏｌ．１−３，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎ
ｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂ
ｏｒＰｒｅｓｓ，ＮＹ，（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；及びＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ、Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕ
ｂｅｌ等編、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａｊｏｉｎｔｖｅｎｔ
ｕｒｅｂｅｔｗｅｅｎＧｒｅｅｎｅＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＡｓｓｏｃｉ
ａｔｅ，Ｉｎｃ及び．ＪｏｈｎＷｉｌｅｙａｎｄＳｕｎｓ，Ｉｎｃ．，（
例えば１９９９年現在、少なくとも補遣３７における）（Ａｕｓｕｂｅｌ）参照
）、ペプチド核酸ライブラリ（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号参照）
、抗体ライブラリ（例えばＶａｕｇｈｎ等、ＮａｔｕｒｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４（３）：３０９−３１４（１９９６）及びＰＣＴ／ＵＳ９６／１
０２８７参照）、炭水化物ライブラリ（例えばＬｉａｎｇ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，
２７４：１５２０−１５２２（１９９６）及び米国特許第５，５９３，８５３号
参照）、小有機分子ライブラリ（例えばｂｅｎｚｏｄｉａｚｏｐｉｎｅｓ，Ｂａ
ｕｍＣ＆ＥＮ，１月１８日，３３頁（１９９３）；ｉｓｏｐｒｅｎｏｉｄｓ，
米国特許第５，５６９，５８８号；ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｏｎｅｓａｎｄ
ｍｅｔａｔｈｉａｚａｎｏｎｅｓ，米国特許第５，５４９，９７４号；ｐｙｒｒ
ｏｌｉｄｉｎｅｓ，米国特許第５，５２５，７３５号及び第５，５１９，１３４
号；ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，米国特許第５，５０６，３３
７号；ｂｅｎｚｏｄｉａｚｅｐｉｎｅｓ，５，２８８，５１４等）。核酸の異な
る混ぜられたライブラリが、例えば５，６０５，７９３、５，８１１，２３８、
５，８３０，７２１、５，８３４，２５２及び５，８３７，４５８のように、例
えば迅速に実行される発展技術を使用して随意に提供される。

【００４４】組合せライブラリを調製するための装置は、市販品として入手できる（例えば
３５７ＭＰＳ，３９０ＭＰＳ，ＡｄｖａｎｃｅｄＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｌｏｕ
ｉｓｖｉｌｌｅＫＹ，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ，Ｒａｉｎｉｎ，Ｗｏｂｕｒｍ，ＭＡ
，４３３ＡＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ
，ＣＡ，９０５０Ｐｌｕｓ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）。
さらに多大な核酸組合せライブラリがそれら自身市販品として入手できる（例え
ばＣｏｍＧｅｎｅｘ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．，Ａｓｉｎｅｘ，Ｍｏｓｃ
ｏｗ，Ｒｕ，Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＣｈｅｍＳｔ
ａｒ，Ｌｔｄ，ＲＵ，３ＤＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｅｘｔｏｎ，Ｐ
Ａ，ＭａｒｔｅｋＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ等参照）
。アッセイが一定の様式にて実行できるとき、ＴＭＰ又はモジュレータを含まな
い選択されたＴＭＰモジュレータの活性を測定する対照反応は任意である。この
ような任意の対照反応は、通常、適切であるがアッセイの信頼性を増加させる。
従って、ある具体例において、本発明の方法は対照反応を含む。記載されるそれ
ぞれのアッセイフォーマットについて、モジュレータを含まない「モジュレータ
なし」の対照反応は、輸送体活性のバックグラウンドレベルを提供する。特定の
活性におけるＴＭＰの公知の活性を有する「対照モジュレータ」反応も、運転す
ることができる。数種のアッセイにおいて、明確な対照を有し、アッセイの成分が適当に作用す
ることを確保することが望ましい。少なくとも２種の明確な対照が適当である。
第一に、イオンチャネル、イオン透過担体（ｉｏｎｏｐｈｏｒｅ）、又はイオン
輸送体の公知の活性体は、輸送体活性を含む膜成分と接触して流れることができ
、結果物は監視されるＴＭＰ活性に影響する。第二に公知のイオンチャネル又は
輸送体の公知の抑制剤を加えることもでき、ＴＭＰにおける結果として生ずる効
果も同様に検出される。モジュレータはアッセイにおいて公知の活性剤又は抑制
剤と組合せ、公知の活性剤又は抑制剤により活性化又は抑制を抑えるモジュレー
タを発見することができるものと認められる。

【００４５】ＴＭＰアッセイ：本発明の方法に関して、組成物の蛍光レベルの変化が検出される、ここで蛍光
レベルの変化は膜透過電位の変化を示す。通常、ここで記載されるアッセイ方法
は、細胞システムの機能における数種の刺激の影響を検出することに使用できる
。ここで、イオンフラックス、輸送、膜浸透性等を通した細胞の膜透過電位にお
けるある刺激の影響を測定する場合は、細胞をその刺激に曝し、以前に存在しな
かった蛍光信号の存在（以前に存在した蛍光信号の不存在）について検査するこ
とのみが必要である。特に興味深いのは、化学化合物、例えば薬品候補のＴＭＰ
測定から測定できる細胞の機能上の効果である。

【００４６】例えば、あるアッセイフォーマットにおいて、染料は膜組成物と接触する。こ
れらの方法に関して、膜組成物は通常、微小流体チャネルのような反応容器内に
配置され、随意に経時的な組成物からの蛍光レベルが測定される。これは細胞集
団について存在する膜透過電位の蛍光表示の出発又はバックグラウンドレベルを
提供するために使用できる。試験される特定の刺激は細胞集団に悪影響する（ｉ
ｎｆｌｉｃｔｅｄ）。例えば、薬剤候補又は試験化合物が細胞集団に加えられる
。この刺激に続いて、細胞の蛍光レベルは（通常、経時的に）再び測定され、そ
して出発蛍光レベル又は（例えば対照ＴＭＰモジュレータに曝される）対照細胞
集団における蛍光レベルと比較される。（適切な対照から測定されるものとして
の）試験化合物による希釈に対して特徴付けられない蛍光レベルにおける任意の
変化は、それから試験化合物が細胞の膜透過電位において有する効果、又は脱分
極或いは過分極に応答したＴＭＰ変化の速度に対して特徴付けられる。前により詳しく説明したように、通常、これらの型の反応は元の場所での蛍光
の測定ができる適切な反応容器内で実行される。そのように容器は通常、試験管
、キュベット、マルチウエルプレート内の反応ウエル、又は例えばキャピラリー
、微小チャネル又はチューブのような透明な管のような、透明の反応容器である
。特に好適な実施態様において、前に詳しく説明したように、アッセイ方法はチ
ャネル及び微小流体装置のチャネル内において実行される。

【００４７】本発明のアッセイ方法は、例えば医薬的なリード（ｌｅａｄｓ）の調査におい
て、化学ライブラリの高スループット（１，０００化合物／日より大）及びいっ
そう超高スループット（例えば、１０，０００化合物／日より大）スクリーニン
グに特に有用である。これらの試験は別々の装置内で多数の反応混合物（例えば
ここで記載される細胞懸濁物）を供給することにより、通常はマルチウエルフォ
ーマット例えば９６ウエル、３２４ウエル、又は１５３６ウエルプレートにて並
行して行うことができる。異なる試験化合物（ライブラリメンバー）は別々のウ
エルに加えられ、そして反応混合物における化合物の影響が、例えば蛍光信号を
介して確かめられる。これらの並行化されたアッセイは、通常は特殊化された装
置を使用して実行され、多くの試料の同時処理を可能にする、即ちこれはロボッ
トピペッタシステム及び複合化された蛍光マルチウエルプレートリーダによる蛍
光検出による流体ハンドリングである。別の実施態様において、アッセイは少なくとも部分的に、シリアルフォーマッ
トにて行われ、そこで別々の試料が次々と細胞のシステムと他の膜調製の影響に
ついてスクリーンされる。出力を拡張するために、これらの個々のシリアル処理
ユニットそれ自身は、複合化或いは並行化されてもよい。特に好ましい実施態様
において、シリアルアッセイは微小流体装置或いはシステム内で行われる。これ
らの微小流体装置或いはシステムは国際特許出願公開ＷＯ９８／００２３１に記
載され、あらゆる目的のためにここに全体を参照して取り入れた。

【００４８】アッセイシステム：本発明は、本発明のアッセイ方法を実行するためのアッセイシステムを提供す
る。要するに、上述したように、これらのシステムは、本発明の組成物が配置さ
れる反応又はアッセイ容器を一般に使用する。例えば、電位の又は実際の抑制剤
又は（ＴＭＰ測定を含めて）関心のある反応の増進剤として、別の試薬を加える
ことができる。一般に、この容器は少なくとも透明な部分を含み、それにより、
染料からの蛍光信号を検出できる。もちろん、試験管又はウエルの場合には、容
器の開口、例えばウエルの頂部の開口を通して検出を行うことができる。本発明
においては、個々の試験管、キュベット、マルチウエルプレートにおけるウエル
、又はキャピラリー管を含めて、種々の容器が有用である。

【００４９】ＴＭＰ測定及びＴＭＰモジュレータの高スループット検出のための微小流体・集積システム：輸送成分、伝達成分、モジュレータなどを組み込むことにより本発明に適応さ
せ得る種々の微小規模システムが利用できる。ＴＭＰアッセイ成分を添加するこ
とにより本発明に適応させ得る微小流体装置に関しては、種々のＰＣＴ出願、及
び米国特許第５，６９９，１５７号（J. Wallace Parce）［１９９７年１２月１
６日発行］、米国特許第５，７７９，８６８号（J. Wallace Parce等）［１９９
８年７月１４日発行］、米国特許第５，８００，６９０号（Calvin Y.H. Chow等
）［１９９８年９月１日発行］、及び米国特許第５，８４２，７８７号（Anne R
. Kopf-Sill 等）［１９９８年１２月１日発行］を含めて、本発明者及びその共
同作業者による発行された米国特許、並びに例えばＷＯ９８／００２３１、ＷＯ
９８／００７０５、ＷＯ９８／００７０７、ＷＯ９８／０２７２８、ＷＯ９８／
０５４２４、ＷＯ９８／２２８１１、ＷＯ９８／４５４８１、ＷＯ９８／４５９
２９、ＷＯ９８／４６４３８、及びＷＯ９８／４９５４８などの公開されたＰＣ
Ｔ出願に記載されている。例えば、細胞ベースの微小規模アッセイを行う先駆的な技術に関し、Parce 等
によるＷＯ９８／００２３１「High Throughput Screening Assay Systems in M
icroscale Fluidic Devices 」、及び例えばMehta 等によるＰＣＴ／ＵＳ００／
０４５２２「MANIPULATION OF MICROPARTICLES IN MICROFLUIDIC SYSTEMS」［２
０００年２月２２日提出］に記載されている。流体の取扱い、信号の検出、サン
プルの保存及びサンプルへのアクセスを伴った完全に集積化されたシステムが利
用できる。例えば、Parce 等によるＷＯ９８／００２３１「High Throughput Sc
reening Assay Systems in Microscale Fluidic Devices 」は、ミクロフルイデ
ィックス(microfluidics) の集積化及びサンプルの選択と操作に対して先駆的な
技術を提示する。微小流体システムにおける細胞の操作、例えば、細胞フォーカ
シング用途や細胞分類用途における高スループットの細胞ベースアッセイなどに
ついてさらに詳しい別の文献として、Wada等によるＰＣＴ／ＵＳ００／１３２９
４「FOCUSING OF MICROPARTICLES IN MICROFLUIDIC SYSTEMS」［２０００年５月
１１日提出］、及びWada等によるＰＣＴ／ＵＳ９９／１３９１８「HIGH THROUGH
PUT METHODS, SYSTEMS AND APPARATUS FOR PERFORMING CELL BASED SCREENING A
SSAYS 」［１９９９年６月２１日提出］が挙げられる。

【００５０】一般に、細胞、モジュレータ、染料、膜成分及び他の要素は、（電気浸透又は
電気泳動のどちらかを含んだ）動電学的な技術により、又は圧力ベースのフロー
メカニズム若しくはそれらの組み合わせを用いることにより、微小規模システム
において流すことができる。特に細胞は、圧力ベースのフローメカニズムを用いて流すのが望ましい。種々
の技術のうち任意のものを用いて、圧力を微小規模要素に加えて流体の移動を実
現できる。流体の流れ（及び細胞やその他の粒子を含めて流体内に懸濁又は可溶
化した物質の流れ）は、流体変位に基づいたメカニズムのような圧力ベースのメ
カニズムにより、例えば、ピストン、圧力ダイヤフラム、真空ポンプ、プローブ
などを用いて液体を変位させて微小流体システムの一方のサイトでの圧力を上昇
又は低下させて適宜調節される。この圧力は、適宜、空圧（例えば加圧ガス）と
されたり、水圧力（例えば加圧液）が使用されたりし、別法としては、物質がチ
ャネルや他の導管を通るよう強制するための正の変位メカニズム、即ち物質リザ
バーに嵌められたプランジャが使用され、又はそれらの力の組み合わせが用いら
れる。

【００５１】他の実施態様では、チャネルの一方の端のリザバー又はウエルに真空源を接続
し、チャネルを通して懸濁液を吸引する。適宜、圧力源又は真空源を装置又はシ
ステムの外部にて供給し、例えば、外部の真空又は圧力ポンプをチャネルの入口
又は出口に密封して取り付け、又はそれらを装置の内部におき、例えば、微小製
造ポンプを装置中に集積化してチャネルに作動上連結させる。微小製造ポンプの
例は当該技術においては広く記載されてきた。例えば、公開された国際出願第Ｗ
Ｏ／９７／０２３５７号を参照されたい。細胞のような物質の流体流のために圧力を付与するのに、流体静力学の力、ウ
イッチング(wiching) 及びキャピラリーの力を使用することもできる。例えば、
Alajoki 等によるＵＳＳＮ０９／２４５，６２７「METHOD AND APPARATUS FOR C
ONTINUOUS LIQUID FLOW IN MICROSCALE CHANNELS USING PRESSURE INJECTION, W
ICKING AND ELECTROKINETIC INJECTION 」（代理人Docket No.017646-007010 ）
［１９９９年２月５日提出］を参照されたい。これらの方法では、吸着剤物質又
は分岐したキャピラリー構造が、圧力が付与される領域と流動接触して配置され
、それにより、吸着剤物質又は分岐したキャピラリー構造に向かって流体を移動
させる。

【００５２】流体ベースの流れ中における物質の吸着を抑えるためのメカニズムに関して、
Parce 等によるＵＳＳＮ０９／３１０，０２７「PREVENTION OF SURFACE ADSORP
TION IN MICROCHANNELS BY APPLICATION OF ELECTRIC CURRENT DURING PRESSURE
-INDUCED FLOW 」（代理人Docket No.01-78-0 ）［１９９９年５月１１日提出］
に記載されている。要するに、圧力ベースの流れにおいてチャネル壁や他の微小
規模の成分に対する細胞、ＴＭＰモジュレータ、染料、電位モジュレータ、及び
他の物質の吸着が、流れている物質に交流のような電界を加えることにより低減
できる。細胞や他の成分を微小規模のチャネルの中心に集めるためのメカニズムは、流
速を調節することによりアッセイのスループットを上げる上で有効であり、Garr
ett Wada等によるＰＣＴ／ＵＳ００／１３２９４「FOCUSING OF MICROPARTICLES
IN MICROFLUIDIC SYSTEMS」［２０００年５月１１日提出］に記載されている。
要するに、反対側のチャネルからの流体流を細胞を含んだ主チャネル中に強制す
ることにより、又は他の流体操作により、細胞をチャネルの中心に集める。本発
明の伝達剤(transmitter) のような拡散可能な物質も、適宜、細胞が流れる間に
Wada等により記載されたように細胞から洗い落とされ、即ち、細胞が流されるチ
ャネル中を順に緩衝剤を流し、チャネルから逆に緩衝剤を流すことにより細胞か
ら洗い落とされる。

【００５３】別の実施態様では、遠心分離機において回される遠心分離機のローター装置中
に、微小流体システムを組み込むことができる。流体と粒子は、重力及び求心的
／遠心的な圧力により装置を通って移動する。微小流体チャネルを通る染料、ＴＭＰモジュレータ、及び細胞（特に染料とモ
ジュレータ）の輸送を実現する一つの方法は、動電学的な物質輸送による。ここ
で用いられている「動電学的な物質輸送のシステム」は、微小チャネル及び／又
はチャンバーを含んだ構造内で物質を輸送及び方向付けるシステムを含み、これ
は、電界を物質に加えることでチャネル及び／又はチャンバーを通して及びそれ
らの間で物質を移動させる、即ち、アニオンが正の電極に向かって移動する間に
正イオンが負の電極に向かって移動する。例えば、カソード又はアノードに向か
う又はそれから離れる流体の移動は、流体内に懸濁した伝達剤、細胞、モジュレ
ータなどの移動を引き起こし得る。同様に、伝達剤、細胞、モジュレータなどは
帯電し得、この場合には、反対に帯電した電極に向かって移動する（実に、この
場合には、一方向への流体の流れを実現する一方で、反対方向の粒子の流れを実
現する）。この実施態様では、流体は、静止又は流れることができ、また、電気
泳動するマトリックスを含むこともできる。

【００５４】一般に、動電学的な物質の輸送及び方向付けのシステムは、構造に加えられた
電界内の帯電種(species) の電気泳動移動性を用いるシステムをも含む。このよ
うなシステムは、特に、電気泳動物質輸送システムと称される。電気泳動を適用
するために、動電学的輸送システムの内部チャネルの壁は、適宜、帯電される、
又は帯電されない。一般的な動電学的輸送システムは、ガラス、帯電ポリマー、
及び非帯電ポリマーから作られる。内部チャネルは、適宜、チャネルの表面電荷
を変える物質でコーティングされる。様々な動電学的コントローラ及びシステムが、ここに記載の他の種々の文献と
共に、例えばRamseyのＷＯ９６／０４５４７、Parce 等のＷＯ９８／４６４３８
及びDubrow等のＷＯ９８／４９５４８に記載されている。相互連結されたチャネル構造において物質の移動を制御すべく動電学的輸送を
用いることは、例えばRamseyのＷＯ９６／０４５４７及びＵＳ５，８５８，１９
５に記載されている。典型的なコントローラがＵＳ５，８００，６９０に記載さ
れている。付随的に、調節電圧を種々のリザバーに加え、所望の流体流の特性、
例えば廃棄リザバーに向かうラベル付き成分の連続的又は不連続的な流れ（例え
ば規則的なパルス電界がサンプルを移動方向に振動させる）に影響を与える。特
に、種々のリザバーにて加えられる電圧の調節により、装置における相互連結し
たチャネル構造を通して流体流を移動及び方向付けし得る。

【００５５】アッセイ成分のソース及び微小流体フォーマットを用いた集積化：細胞又は細胞片のような成分を含んだ膜のソース、染料のソース、及び電位モ
ジュレータのソースは、種々の方法のうち任意のものでここに記載の微小チャネ
ルに流動自在に連結し得る。特に、Knapp 等の「Closed Loop Biochemical Anal
yzers 」（ＷＯ９８／４５４８１；ＰＣＴ／ＵＳ９８／０６７２３）及びParce
等のＷＯ９８／００２３１「High Throughput Screening Assay Systems in Mic
roscale Fluidic Devices 」、並びに例えばMehta 等によるＰＣＴ／ＵＳ００／
０４５２２「MANIPULATION OF MICROPARTICLES IN MICROFLUIDIC SYSTEMS」に記
載の物質のソースを含んだシステムが利用できる。これらのシステムにおいて、「ピペッタチャネル」（成分がソースから微小規
模要素（例えば第２チャネルやリザバー）に移動し得るチャネル）が、物質のソ
ースに一時的に又は永久的に連結される。このソースは、ピペッタチャネルを含
んだ微小流体装置の内部又は外部に設け得る。ソースの例として、ミクロウエル
プレート、膜、又は冷凍乾燥した成分を含んだ他の固体物質、微小規模の装置自
体の本体内のウエル又はリザバーなどが挙げられる。

【００５６】例えば、細胞タイプ、成分、又はモジュレータ試薬のソースは、本体構造の外
部にてミクロウエルプレートをし得、例えば、選択した細胞タイプ又は試薬を有
する少なくとも１つのウエルを備える。別法として、本体構造の表面に配置され
たウエルが、選択された細胞タイプ、成分又は試薬を含み、本体構造内に配置さ
れたリザバーが、選択された細胞タイプ、成分又は試薬を含み、本体構造の外部
の容器が、選択された粒子タイプ又は試薬からなる少なくとも１つの区画を含み
、又は固体位相構造が、選択された細胞タイプ又は冷凍乾燥若しくは他の方法で
乾燥された形態の試薬を含む。ローディングチャネル領域は、適宜、例えば図６及び図７に示されるように、
本体構造の外部のポートによりピペッタチャネルに流動自在に連結される。ロー
ディングチャネルは、本体構造の外部のポートにより電子ピペッタチャネルに連
結でき、本体構造の外部のポートにより圧力ベースのピペッタチャネルに連結で
き、本体構造の内部のポートによりピペッタチャネルに連結でき、本体構造の表
面上のウエルに流動自在に連結された本体構造内の内部チャネルに連結でき、本
体構造内のウエルに流動自在に連結された本体構造内の内部チャネルなどに連結
できる。構成例をこれらの図に示す。

【００５７】ここに十分に記載されているように、本発明の集積微小流体システムは、評価
されるべき試薬を保存するための非常に広範囲の種類の保存要素を含み得る。こ
れらは、ウエルプレート、マトリックス、膜などを含む。試薬は、液体にて（例
えばミクロタイター(microtiter)プレート中に）保存され、又は冷凍乾燥された
形態にて（例えば膜上又は多孔性マトリックスにて乾燥されて）保存され、また
、従来のロボット工学を用い、又は微小流体システムの反応若しくは試薬チャネ
ルに流動自在に連結された電子ピペッタ若しくは圧力ピペッタチャネルを用いて
、微小流体装置のアレイ成分に輸送され得る。一般に、試験モジュレータ化合物は、ここに記載のアッセイシステムには分離
して導入され、又は相対的に扱いやすいモジュレータ物質のプールに少なくとも
導入される。次に、特定のＴＭＰ機能の相対レベルが、試験化合物の存在下にお
いて評価され、この機能の相対レベルが、導入された試験モジュレータ化合物を
欠いた制御システムと比較される。相対的な細胞機能の増大又は減少は、それぞ
れ試験化合物が特定の細胞機能の増進剤又は抑制剤であることを示す。

【００５８】検出器及び集積システム：特にここに示した装置とシステムは、少数の又は１つの特定の操作の性能に関
して一般的に記載されているが、この記載から、これらのシステムの柔軟性によ
り別の操作をこれらの装置に容易に集積化できることが容易に理解されるであろ
う。例えば、ここに記載した装置とシステムは、適宜、ここに特に記載した操作
から上流及び下流の両方にて任意の数の操作を事実上行うための構造、試薬及び
システムを含む。これらの上流の操作としては、サンプルの取扱い及び調製操作
、例えば、細胞の分離、抽出、精製、培養、増幅(amplification) 、細胞の活性
化、ラベル付け反応、稀釈、アリコート化(aliquotting) などが挙げられる。同
様に、下流の操作として、例えば、サンプル成分の分離、成分のラベル付け、ア
ッセイ及び検出操作、成分を動電学的又は圧力ベースで注入して細胞若しくは他
の膜の調製物若しくは細胞若しくは膜の調製物から開放された物質と接触させる
ことなどを含めて、同様の操作を挙げることができる。上流及び下流のアッセイ及び検出操作としては、無制限に、細胞蛍光アッセイ
、細胞活性アッセイ、プローブインテロゲーション(interrogation) アッセイ、
例えば、装置のチャネル又はチャンバー内にて自由な又は拘束された個々のプロ
ーブ及び／又は離散的に配置した多数の異なるプローブを備えたプローブアレイ
を用いる核酸交配アッセイ、レセプター／リガンドアッセイ、免疫アッセイなど
が挙げられる。これらの要素のいずれも、アレイ部材に固定でき、又は例えばチ
ャネル壁などに固定できる。

【００５９】細胞アッセイの高スループット光学的スクリーニング用の機器が利用できる。
ここに記載の多くの微小流体システムに加えて、本発明の染料及び方法を用いて
他の自動化アプローチを実行することもできる。例えば、ＦＬＩＰＲ（蛍光画像
化プレートリーダー）が、細胞ベースの動的(kinetic) アッセイのために定量的
な光学的スクリーニングを行うべく開発された（Schroder and Neagle (1996) "
FLIPR: A New Instrument for Accurate, High Throughput Optical Screening" Journal of Biomolecular Screening 1(2):75-80 ）。この装置は、例えば、示
された方法にて本発明の染料を使用することにより、本発明に適応させることが
できる。例えば、カチオンＤＮＡ膜透過染料は、電位差計の測定のために使用で
きる。同様に、カチオン及びアニオン染料の両方について平衡となる前に染料の
吸収量に関してのデータを得ることにより、システムを本発明に適応させること
ができる。

【００６０】機器：一般に本発明では、ＴＭＰ活性のような活性を求めることができるように、細
胞や染料などの物質が、適宜、監視及び／検出される。ラベル信号の測定に依存
して、次の流体操作に関する決定、例えば動的情報を求めるべく特定のモジュレ
ータを詳細にアッセイするか否かの決定が為され得る。一般に、ここに記載のシステムは、装置内での流体輸送、流量及び方向を制御
するための別の機器、システムにより行われた操作の結果を検出又は検知するた
めの機器、事前にプログラミングされた命令に従って機器制御を命令し、検出機
器からデータを受け取り、また、そのデータを分析、記憶、解釈して容易にアク
セスできる報告フォーマットにて該データと解釈を与えるためのプロセッサ（例
えばコンピュータ）と共に、上述したような微小流体装置を含む。

【００６１】コントローラ：例えば圧力ベース又は動電学的な制御により本発明の装置内での流体及び／又
は物質の輸送及び方向付けを制御するために、上述の微小流体装置と共に種々の
制御機器が適宜使用される。例えば、多くの場合、流体流を駆動すべく外部又は内部の圧力ソースを組み込
んだ圧力ベースのフローシステムを用いて、流体の輸送及び方向付けが全体的又
は部分的に制御される。内部のソースとしては、微小製造ポンプ、例えば、当該
技術において記載されているダイヤフラムポンプ、熱ポンプ、ラム(Lamb)波ポン
プなどが挙げられる。例えば、米国特許第５，２７１，７２４号、第５，２７７
，５５６号及び第５，３７５，９７９号、並びに公開されたＰＣＴ出願ＷＯ９４
／０５４１４及びＷＯ９７／０２３５７を参照されたい。上述のように、ここに
記載のシステムも、動電学的な物質の方向付け及び輸送システムを利用できる。外部圧力ソースを使用してチャネル端のポートに接続するのが好ましい。加え
られるこれらの圧力又は真空が、チャネル長の間に差圧を発生し、それらを通る
流体流を駆動する。ここに記載の相互連結されたチャネル網では、複数のポート
に異なる圧力又は真空を適用することにより、好ましくは、共通の廃棄ポートに
単一の真空を適用し、かつ、適当な抵抗を有する種々のチャネルを構成して所望
の流量を生じさせることにより、異なる体積流量を適宜実現する。システム例が
、ＵＳＳＮ０９／２３８，４６７［１９９９年１月２８日提出］に記載されてい
る。

【００６２】一般に、コントローラシステムは、受信、即ち微小流体装置又はここに記載の
ようなシステム要素とインターフェースするように適当に構成される。例えば、
コントローラ及び／又は検出器は、適宜、ステージを含み、その上にて本発明の
装置が取り付けられて、コントローラ及び／又は検出器と本装置との適切なイン
ターフェースを容易にする。一般に、このステージは、適当な取付／位置決め構
造要素（例えば、入れ子ウエル、位置決めピン及び／又はピン、（装置の適切な
位置決めを容易にする）非対称エッジ構造など）を含む。これら多くの構成が、
ここで引用した文献に記載されている。上述の制御機器は、関心のある領域の下流で物質を動電学的に注入又は引き抜
きして上流の流量を制御するためにも使用される。上述した同じ機器及び技術が
、流体を下流のポートに注入してフロー制御要素として機能させるのにも使用さ
れる。

【００６３】検出器：ここでの装置は、例えば蛍光、燐光、放射能、ｐＨ、電荷、吸光度、ルミネセ
ンス、温度、磁性などを検出する信号検出器を適宜含む。蛍光検出が特に好まし
く、電圧を感知する化合物の検出に一般に使用される（しかしながら、上述のよ
うに、上流及び下流の操作は、細胞、染料、モジュレータなどに対して実行でき
、これは他の検出方法を含み得る）。検出器は、適宜、アッセイ混合地点の下流から１又は複数の信号を監視する。
この混合地点において、染料と細胞又は他の膜含有成分が電位モジュレータと混
合される。例えば、検出器は、「リアルタイム」アッセイの結果に対応する複数
の光信号を監視できる。検出器の例としては、光電子増倍管、スペクトル光度計、ＣＣＤアレイ、走査
検出器、顕微鏡、ガルボ(galvo) スキャナーなどが挙げられる。検出可能な信号
を発する細胞、染料又は他の成分が、流されて検出器を通過し、又は別法として
検出器がアレイに対して移動できて細胞の位置を決める（又は検出器が例えばＣ
ＣＤアレイ内のチャネル領域に対応するいくつかの空間位置を同時に監視できる
）。

【００６４】検出器は、コンピュータを含むか又はそれに接続でき、このコンピュータは、
例えば、検出器信号の情報をアッセイ結果の情報（例えば、モジュレータ活性の
動的データ）に変換するためのソフトウエアを有する。信号は、例えば既知のソースからの信号を監視することにより微小流体システ
ムを較正することによって適宜較正される。微小流体システムは、システムの出力を監視するための複数の異なる検出シス
テムを使用することもできる。本発明の検出システムは、特定のチャネル領域（
又は他の反応検出領域）における物質を検出し監視するのに使用される。一旦検
出されると、適宜、チャネル中の細胞の流量及び速度も、上述のように測定され
制御される。ＰＣＴ／ＵＳ９８／１１９６９及び６０／１４２，９８４に記載さ
れているように、流速及び他のファクターに基づいた動情報の補正が、流れてい
るシステムにおける正確な動情報を与えるのに使用できる。

【００６５】検出システムの例として、光センサー、温度センサー、圧力センサー、ｐＨセ
ンサー、導電性センサーなどが挙げられる。これらの種類のセンサーの各々が、
ここに記載の微小流体システムに容易に組み込まれる。これらのシステムでは、
これらのセンサーは、検出器が本装置、チャネル又はチャンバーとのセンサー通
信(sensory communication) 域内にあるように、本装置における微小流体装置又
は１若しくは２以上のチャネル、チャンバー又は導管の内部又はそれらの近傍に
配置される。一般に、ここで使用している特定の領域又は要素の「センサー通信
域内」なる用語は、検出器が微小流体装置、微小流体装置の一部又は微小流体装
置の一部の内容の特性（検出器が意図するもの）を検出できるような位置への検
出器の配置を意味する。例えば、微小規模チャネルとセンサー通信するよう配置
されたｐＨセンサーは、そのチャネル中に配置された流体のｐＨを決定できる。
同様に、微小流体装置の本体とセンサー通信するよう配置された温度センサーは
、装置自体の温度を決定できる。

【００６６】特に好ましい検出システムは、ここに記載の微小流体システムに組み込まれる
微小流体装置のチャネル及び／又はチャンバー内にて物質の光学特性を検出する
ための光検出システムを含む。一般に、このような光検出システムは、微小流体
装置の微小規模チャネルに隣接して配置され、装置のチャネル又はチャンバーを
横切って配置された光検出窓を介してチャネルとセンサー通信する。光検出シス
テムは、物質のスペクトル特性のみならずチャネル内の物質から放出された光、
物質の透過率又は吸光度を測定できるシステムを含む。好ましい実施態様では、
検出器は、例えば蛍光性又は化学ルミネセンス性の物質のような物質から放出さ
れる光の量を測定する。一般にそのようなものとして検出システムは、検出窓を
通して伝送される光ベースの信号を集め、その信号を適当な光検出器に伝送する
ための収集光学系を含む。屈折力、フィールド径(field diameter)及び焦点距離
を変える顕微鏡の対物レンズが、少なくともこの光学機器列の一部として容易に
利用される。光検出器は、適宜、スペクトル光度計、フォトダイオード、アバラ
ンシェフォトダイオード、光電子増倍管、ダイオードアレイ又はある場合には電
荷結合素子（ＣＣＤ）のような画像化システムである。一般に検出システムは、
検出された光信号をコンピュータに伝送して分析、記憶及びデータ操作するため
に、アナログ−デジタル又はデジタル−アナログ変換器を介してコンピュータ（
後に詳細に説明する）に連結される。

【００６７】ラベル付けされた細胞のような蛍光物質の場合、一般に検出器は、チャネル又
はチャンバーに含まれる物質に対して検出窓を通して光源を方向付ける光学系だ
けでなく、蛍光物質を活性化するのに適切な波長の光を作る光源を含む。この光
源は、レーザー、レーザーダイオード及びＬＥＤを含めて、適当な波長を与える
幾つかの任意の光源とし得る。他の検出システムでは他の光源が使用される。例
えば、一般に広帯域の光源は、光の散乱／透過率の検出などで使用される。一般
に光選択パラメータは当業者には周知である。検出器は別々の装置として存在し得るが、コントローラシステムと共に単一の
機器内に統合することもできる。単一の装置へのこれらの機能の統合は、少数又
は単一の通信ポートを使用可能にしてコントローラ、検出器及びコンピュータ間
で情報を送信することにより、これらの機器とコンピュータ（後に記載）との接
続を容易にする。

【００６８】コンピュータ：上述のように、コントローラシステム及び／又は検出システムのどちらか又は
両方が、適当にプログラミングされたプロセッサー又はコンピュータに連結され
る。このプロセッサー又はコンピュータは、事前にプログラミングされた又はユ
ーザーが入力した命令に従ってこれらの機器の動作を命令し、これらの機器から
データと情報を受け取り、この情報を解釈し、操作し、ユーザーに報告する。そ
のようなものとして、一般に、コンピュータは、（必要ならば例えばアナログ−
デジタル変換器又はデジタル−アナログ変換器を含めて）これらの機器の１つ又
は両方に適切に連結される。一般に、コンピュータは、例えばＧＵＩのセット・パラメータ・フィールドへ
のユーザー入力の形式で、又は事前にプログラミングされた命令（例えば様々な
異なる特定動作に対して事前にプログラミングされたもの）の形式でユーザー命
令を受け取るための適当なソフトウエアを含む。次に、このソフトウエアは、流
体の方向付け・伝送コントローラの動作に命令して所望の動作を実行させるため
に、これらの命令を適当な言語に変換する。次に、コンピュータは、システム内
に含まれる１又は２以上のセンサー／検出器からデータを受け取り、このデータ
を解釈し、それをユーザーが理解できるフォーマットで与えるか、又はそのデー
タを用いてプログラミングに従って別のコントローラ命令を開始し、例えば流量
、温度、適用圧力などの監視や制御を行う。本発明では、一般にコンピュータはチャネル内での物質の監視用のソフトウエ
アを含む。また、このソフトウエアは、動電学的若しくは圧力調節された注入又
は物質の引き抜きを制御するのに適宜使用される。この注入又は引き抜きは、上
述のように流量を調節したり、成分を混合したりするのに使用される。

【００６９】システム例：図６のパネルＡ、Ｂ及びＣ並びに図７は、本発明の集積システム例について、
更なる詳細を与える。図示されているように、本体構造部１０２はその中に製造
された主チャネル１０４を有する。細胞又は他の膜含有成分は、主チャネル１０
４を通して真空源１１６（及び／又は後に記載のいずれかのリザバー又はウエル
）にて真空を適用することにより、例えばリザバー１１４から流される。細胞若
しくは他の膜含有成分、又は染料、又は電位モジュレータ若しくは異なる物質（
例えば緩衝剤又はラベル）は、ウエル１１０又は１１２から主チャネル１０４中
に流すことができる。細胞、又は染料、又は電位モジュレータ若しくは任意の別
の物質を、ウエル１０６又は１０８から流すことができ、また、例えば、これら
のウエルが廃棄ウエルとして使用されるか又は真空源に連結されているときには
、物質をこれらのウエルに流し込むことができる。流体の圧力を調節することに
より、又は上述のような動電学的アプローチにより、ウエル１１４、１１２、１
１０、１０６又は１０８からの流れを実現できる。図６及び図７に記載されたチ
ャネル構成の代わりに、図５に記載のような３Ｂ５微小流体プロセッサのような
構成と置き換えることもできる。他の様々の適当な微小流体プロセッサの構成が
、ここに記載の文献に記載されている。

【００７０】図５では、装置５０１は、細胞ウエル５０３、サイドウエル５０５（例えばサ
ンプルウエル）及びサイドウエル５０７（例えば染料ウエル）及び廃棄ウエル５
０９を含む。要するに、細胞は、ウエル５０３から細胞供給チャネル５１１を通
り、主チャネル５１３を通り、廃棄ウエル５０９における真空に流される。サン
プルは、サイドウエル５０５からサンプル供給チャネル５１５を通り主チャネル
５１３に流される。染料は、サイドウエル５０７から染料供給チャネル５１７を
通り主チャネル５１３に流される。上述のように、流れは、廃棄ウエル５０９で
の真空の適用を介して検出される。この特定の装置では、おおよそのチャネル寸
法は、深さが２５μｍ、幅が１００μｍである。チャネル５１１は、長さが約５
．２ｍｍである。チャネル５１５は、長さが約１３．４ｍｍである。チャネル５
１７は、長さが約１３．４ｍｍである。チャネル５１３は、長さが約３２．３ｍ
ｍである。

【００７１】細胞、膜の調製物、染料、電位モジュレータ又は他の物質は、列挙したウエル
から流すこともできるし、又は本体１０２の外部のソースから流すこともできる
。図示したように、集積システムは、試薬の外部ソースにアクセスするため例え
ば本体１０２から突出したピペッタチャネル１２０を含むことができる。例えば
、さらに図７に示されるように、ピペッタチャネル１２０は、プレートのウエル
中に細胞、染料、活性モジュレータ、コントロールなどを含んだミクロウエルプ
レート３０８にアクセスできる。例えば、電位抑制剤化合物のライブラリは、シ
ステムによる容易なアクセスのためにプレート３０８のウエル中に保存できる。
アッセイに関するＴＭＰ変化抑制剤、活性剤又は他の試薬は、ピペッタチャネル
１２０を通ってチャネル１０４に流れ込むことができる。上述のように、検出器
３０６は、チャネル１０４とセンサー通信可能であり、例えば染料と細胞又は他
の膜の調製物との相互作用から得られる信号を検出する。検出器３０６はコンピ
ュータ３０４に動作上連結され、このコンピュータ３０４は、検出器３０６によ
り検出された信号情報をデジタル化し、記憶し、操作する。電圧／圧力コントロ
ーラ３０２は、例えばシステムのウエルにて、又はチャネル１０４（又は上述の
他のチャネル）に流動自在に連結された真空カップリングにて、電圧、圧力又は
その両方を制御する。図示されているように、適宜、コンピュータ３０４は、電
圧／圧力コントローラ３０２を制御する。実施態様のうちの１セットでは、コン
ピュータ３０４は、信号情報を用いて別の反応パラメータを選択する。例えば、
プレート３０８からウエル中の電位モジュレータによる抑制又は活性を検出する
際に、コンピュータは、適宜、ピペッタチャネル１２０を通しての電位モジュレ
ータの付加アリコートの抜き出しを指令し、例えば、異なる濃度の電位モジュレ
ータをアッセイに送り、例えば、電位モジュレータの動データ（例えば用量−応
答曲線）を求める。

【００７２】アッセイキット：本発明は、また、ここに記載のアッセイ方法を行うためのキットを提供する。
特に、これらのキットは、研究者によるアッセイ方法の実施を容易にする別の成
分のみならず、ここに記載の組成物を一般に含む。特に、このキットは、本発明
の電圧感知性組成物を一般に含む。このキットは、また、アッセイ反応が行われる容器を適宜含む。ここに記載の
ように、反応容器は、適宜、反応ベッセル（即ち試験管又はマルチウエルプレー
トにおけるウエル）又は微小流体装置内のチャネル若しくはチャンバー領域であ
る。一般に、反応混合物からの蛍光信号を検出するために、反応容器もまた少な
くとも一部透明である。一般に、本発明のキット要素は、単一のパッケージ又は関連するパッケージセ
ット中に共にパッケージ化される。このパッケージは、適宜、ここに記載の方法
に従ってアッセイを行うため記載された指示のみならず、アッセイにおいて使用
される他の試薬（例えば緩衝剤、標準試薬など）を含む。事前にパッケージ化さ
れた試薬の場合、適宜、キットは、測定なしでアッセイ方法に容易に組み込める
事前測定された又は事前ドーズされた試薬（例えば、事前測定された流体アリコ
ート）、又はキットのエンドユーザーにより容易に再構成できる事前重み付け若
しくは事前測定された固体試薬を含む。

【００７３】一般に、ここに記載の微小流体装置は、適宜、パッケージ化され、装置の好ま
しい機能を実行するための試薬を含む。例えば、キットは、アッセイ成分、試薬
、サンプル物質、制御物質などと共にここに記載のいずれかの微小流体装置を含
むことができる。一般に、このようなキットは、該装置及び試薬を使用するため
の適当な指示をも含み、また、試薬が装置自体に事前に配置されていない場合に
は、試薬を装置のチャネル及び／又はチャンバーに導入するための適当な指示を
有する。この後者の場合には、これらのキットは、物質を微小流体システム中に
導入するための特別の補助装置、例えば適当に構成されたスポイト／ポンプなど
を適宜含む（一つの実施態様では、装置自体が、装置内のチャネル及びチャンバ
ーに物質を導入するための電子ピペッタなどのようなピペッタ要素を含む）。前
者の場合には、一般に、このようなキットは、装置のチャネル／チャンバー中に
事前に配置された必要な試薬と共に微小流体装置を含む。一般に、崩壊又は引き延ばされた貯蔵中における例えばリークによるその他の
損失を防止するために、これらの試薬が安定化された形態にて与えられる。例え
ば化学安定剤（即ち、酵素抑制剤、ミクロサイド(microcides)／静菌剤、抗凝固
剤）の混入(inclusion) 、例えば固体サポートへの固定化による物質の物理的な
安定化、マトリックス（即ち、ゲル）中への閉じ込め(entrapment)、冷凍乾燥な
どのような試薬の貯蔵に対して、幾つかの安定化プロセスが広く使用される。キットは、適宜、微小流体装置、システム又は試薬要素を保持するためのパッ
ケージング物質若しくは容器、ここに記載のいずれか方法を実行するための指示
物質などをも含む。

【００７４】例：微小流体プロセッサベースの膜透過電位アッセイの開発膜透過電位の測定は、広範囲の細胞ベース微小流体アッセイに有効である。広
く使用されているタイプの膜透過電位アッセイでは、電圧感知染料が使用され、
これは、電圧に依存した細胞内外間の染料の再分布による蛍光信号を発生する。
このようなネルンスト染料を用いて微小流体プロセッサにおける膜透過電位を測
定する実行可能性が調査された。一般に、DiBAC₄(3) のようなネルンスト電圧感知染料の使用は、膜透過電位の
関数としての染料の平衡分布の測定を伴う。別法として、DiBAC₄(3) の細胞懸濁
液への添加は、染料吸収の電圧依存時間過程(course)となることが分かった（図
１）。図１に示されるように、染料吸収の時間過程は膜透過電位に依存する。THP-1
細胞（3x10⁵細胞／ml）は、高ナトリウムのヘッペス−ハンクス(Hepes-Hanks)
液(balanced salt solution)（１４３ｍＭＮａ⁺，２ｍＭＫ⁺）（線Ａ）又は１
５％Optiprep及び２００ｎＭのDiBAC₄(3) を含んだ高カリウムのヘッペス−ハン
クス液（１５ｍＭＮａ⁺，１３０ｍＭＫ⁺）（線Ｂ）のどちらかの中に懸濁させ
た。高ナトリウム及び高カリウム緩衝剤中の細胞は、それぞれ約−４０ｍＶ及び
０ｍＶの膜透過電位を有することが期待される。細胞の懸濁後のDiBAC₄(3) 蛍光
（４７５ｎｍ励起、５２０ｎｍ発光）における変化を、３０℃で分光測光にて測
定した。

【００７５】驚くべきことに、ＤＮＡ染色剤SYTO62即ち循環置換非対称シアニン染料（例え
ば米国特許第５，４３６，１３４号参照）が電圧感知染料として動作することが
分かった。特に、図２に示されるように、SYTO62吸収の時間過程は、膜透過電位に依存す
る。図１に示した実験に関しては、THP-1 細胞を、１μＭのSYTO62を含んだ高ナ
トリウム（線Ａ）又は高カリウム（線Ｂ）緩衝剤中に懸濁させた。細胞の懸濁後
のSYTO62蛍光（４７５ｎｍ励起、６７０ｎｍ発光）における変化を、３０℃で分
光測光にて測定した。このように、SYTO62のような膜浸透性カチオンリボ核酸染
色剤は、新しい種類のネルンスト電圧染料を示す。

【００７６】細胞膜透過電位における変化は、細胞と染料DiBAC₄(3) 及びSYTO62との混合に
より微小流体プロセッサにて検出した。図３に示されるように、膜透過電位アッ
セイは、微小流体プロセッサにおいて実行(run) できる。THP-1 細胞による染料
吸収は、Caliper （登録商標）3B5 微小流体プロセッサ（図５）上で測定した。
プロセッサの長いチャネルの一つが、上述の高ナトリウム緩衝剤中に懸濁したTH
P-1 細胞（３ｘ１０⁶細胞／ｍｌ）を含み、もう一方の長いチャネルが高ナトリ
ウム緩衝剤中に４００ｍＭのDiBAC₄(3) と１０μＭのSYTO62を含んでいた。膜透
過電位は、高ナトリウム又は高カリウム緩衝剤中の高ナトリウムの５０μＭのUT
P を短いアーム内に配置することにより、静止電位、過分極又は脱分極に設定し
た。静止電位、過分極した電位及び脱分極した電位は、それぞれ約−４０、−１
００及び０ｍＶに概算される。微小流体プロセッサは、室温（〜２３℃）に維持
した。細胞が接合部から約９０秒移動した後に、DiBAC₄(3) 及びSYTO62蛍光を読
み取った（ΔＰ〜１”Ｈ₂Ｏ）。パネルＡは、約８０の細胞各々の走行(runs)に
対する平均蛍光比（DiBAC₄(3) ／SYTO62）を示す。誤差バーは、標準誤差値であ
る。パネルＢに示されるように、ヒストグラムは、個々の細胞の蛍光強度におけ
る期待される電圧依存変化を、膜透過電位の関数として示す。線Ａは高ナトリウ
ム緩衝剤中の静止細胞を示し、線ＢはUTP ／高カリウム緩衝剤中の脱分極した細
胞を示し、線ＣはUTP ／高ナトリウム緩衝剤中の過分極した細胞を示す。

【００７７】微小流体プロセッサベースのアッセイの有用性が、図４に示されるようにパリ
トキシンの用量−応答曲線を作成することにより示された。K562細胞（２ｘ１０ ⁶ 細胞／ｍｌ）による染料吸収は、接合部後の約７０秒読み取りが行われたこと
を除いて、図３に示されるような３Ｂ５微小流体プロセッサ上で測定した。１条
件当たり約１００の細胞を使用し、平均値と標準誤差を計算した。変化するパリ
トキシン濃度の溶液を短いアーム中に配置し、細胞との混合後に示されたパリト
キシン濃度を生じた。パリトキシンは、大きなNa⁺電流を開き(open)、有意な膜
の脱分極に至らせる。微小流体プロセッサにおける膜透過電位の測定能力が示された。平衡染料分布
よりむしろ染料吸収の動力学(kinetics)を検出することにより、高感度の微小流
体プロセッサにてアッセイをすばやく実行できる。SYTO62のような膜浸透性カチ
オンリボ核酸染色剤が、新しい種類の電圧感知染料であることが分かった。アニ
オン及びカチオン染料の同時使用により、膜透過電位のレイショメトリック(rat
iometric) 測定が可能となり、それにより高い感度と広いダイナミックレンジが
得られる。

【００７８】例：アッセイ次の例は本発明を説明するが、本発明を何ら制限するものでもない。当業者な
らば、以下において種々の代替を行って実質的に同様の結果を得られることに気
づくであろう。この例の場合にLabChip （登録商標）システムで使用する微小流体技術は、ミ
クロタイタープレートからサンプルにアクセスできるサンプリングミクロピペッ
タに連結されたクオーツチップ中にエッチングされた微小チャネルを利用する。
LabChip システムは、ミクロプレートから順に液体サンプルにアクセスし、微小
チャネルを通って流れる細胞とサンプルを混合し、蛍光検出を用いて細胞の応答
を読み出す。このシステムを、膜透過電位の変化の測定に適用した。UTP の添加
後のカルシウム感知カリウムチャネルの開口により生じるTHP-1 細胞における過
分極、及び硫酸キニジンの添加によるカリウムチャネルのブロッキングにより生
じる脱分極を測定すべく、膜電位感知染料を用いて膜電位アッセイを行った。

【００７９】ラブ・オン・ア・チップ・システム：図８のパネルＡ及びパネルＢに示されるように、使用したlab-on-a-chip シス
テムは、Sipper（商標）キャピラリー８０７に接続された微小チャネル８０３及
び８０５を含むクオーツチップ８０１、ミクロプレート８１１を移動させるロボ
ット８０９、光源８１３、光学系８１５と蛍光読み取り機８１７、真空ポンプ８
１６、並びにシステムの機能を制御しデータを記録するコンピュータから成る。
光源８１３（例えば水銀灯（４７０ｎｍ）又はアルゴンイオンレーザー）からの
光を、対物レンズ（１０ｘ，０．３ＮＡ air）を含んだ光学系８１５を通してミ
クロチップ８０１上にフォーカスした。対物レンズで蛍光を集め、２つのチャネ
ルに分離し（５２５ｎｍ及び７００ｎｍ）、フォトダイオードを含んだ蛍光読み
取り機８１７で検出した。蛍光の読み取りは２０〜９０Ｈｚで行った。三軸ロボ
ット８０９を使用し、チップ８０１が９６又は３８４のウエル構成のミクロプレ
ート８１１をサンプリングできるようにミクロプレート８１１を位置決めした。９０ｘ２０μｍのチャネルを有するチップ８０１の概略を図８のパネルＢに示
す。細胞ウエル８１９から流れる細胞を、Sipper（商標）キャピラリー８０７（
２０μｍＩＤ）を通して導入したサンプルと混合した。廃棄ウエル８２１に適用
する真空を変えることにより、検出チャネル中の流量を２から１０ｎｌ／ｓまで
変えた。作用物質又は染料をサイドウエル８２３から加えた。加える圧力及びチ
ップ８０１に対する検出要素（例えば光学系８１５）の位置を変えることにより
、検出チャネル８０３における培養時間を１０〜７５秒の間で変えた。

【００８０】膜電位アッセイ：図９に示されるように、浸透性蛍光団の吸収は、膜電位の感度の良い指示量で
あった。パネルＡに示されるように、電位感知蛍光信号は、細胞内に事前に取り入れら
れた染料の遅い再平衡からではなく、帯電した膜浸透性染料の吸収レートから得
られた。アニオン染料であるDiBAC₄(3) とカチオン染料であるSyto62の両方を使
用することで、高い感度でレイショメトリック測定が行われた。細胞は、チップ
上の試験サンプル及びチップ上に保存した染料と混合した。検出チャネルにおけ
る短い培養の後、個々の細胞の蛍光を検出した。パネルＢに示されるように、緑（DiBAC ）及び赤（Syto62）蛍光におけるピー
クは、７５秒の染料培養の後に検出器を通って流れる緩衝剤、UTP 又は硫酸キニ
ジンと混合したTHP-1 細胞に対応した。パネルＣ及びＤに示されているように、DiBAC₄(3) （Ｃ）及びSyto62（Ｄ）の
吸収レートが、静止細胞（○）、UTP により過分極した細胞（■）及び硫酸キニ
ジンにより脱分極した細胞（▲）に対する培養時間の関数として平均蛍光ピーク
高さから求められた。静止細胞と比較して、DiBAC₄(3) ピーク高さの増加レート
は、脱分極した細胞の場合より４８±１１％（平均±se,n=5）高く、過分極の細
胞の場合より４３±５％低い。同様に、Syto62ピークの増加レートは、脱分極し
た細胞の場合より７±２％低く、過分極の細胞に場合より３７±３％高い。

【００８１】脱分極及び過分極：図１０に示されているように、脱分極及び過分極を高感度チップベースのアッ
セイで測定した。パネルＡに示されているように、THP-1 細胞のＫ＋コンダクタンスを大きくす
ること、及び細胞外Ｋ＋濃度を変えることにより、DiBAC₄(3) ／Syto62蛍光（ｎ
＝２０〜１３０細胞）の比を膜電位に関係付ける較正曲線を作成した。指数関数
曲線の適合度は、膜電位のすべての３３ｍＶ変化に対する比の二倍を示す。ハン
クス液中のTHP-1 細胞に対する平均の比は、０．１３（ｎ＝１５）であり、−５
１ｍＶの静止膜電位を生じた。パネルＢに示されるように、UTP の変化する濃度は吸収されてTHP-1 細胞を過
分極した。UTP に対するDiBAC₄(3) ／Syto62比の用量依存応答が、０．１μＭの
EC₅₀で示される。パネルＣに示されるように、硫酸キニジン用量依存脱分極を原
因とする平均DiBAC₄(3) ／Syto62比（平均±ＳＤ，ｎ＝３）の変化が示される。
分散の平均係数は、３０〜８０の細胞各々の反復測定に対し約１０％であった。
較正曲線から、これは膜電位の概算における５ｍＶの誤差に対応する。

【００８２】一次細胞の使用：図１１に示されているように、少ない細胞消費及び高いデータの質により、一
次細胞の使用が可能となった。チップを通して静止又はミトゲン活性化周辺血液
Ｔリンパ球（９０％ＣＤ３＋）を流し、Sipper（商標）キャピラリーによりアク
セスされるイオンチャネルモジュレータと混合した。平均DiBAC₄(3) ／Syto62比
±SE（ｎ＝２〜６）を示す。静止細胞は、３６μＭのマーガトキシン(margatoxi
n)（BK_Caブロッカー）の存在下であって、３０μＭのクロトリマゾール(clotrim
azole)（IK_Caブロッカー）、２００ｎＭのアパミン(apamin)（SK_Caブロッカー）
又は１５μＭのイオノミシン(ionomycin) （IK_Ca活性剤）の非存在下にて脱分極
に対応するDiBAC₄(3) ／Syto62比（^*,p＜0.05）の有意な増加を示す。対照的に
、イオノミシンの存在下での活性化細胞は、過分極に対応した静止Ｔリンパ球（ ^* ,p＜0.05）と比較して小さい比を有した。この比は、３０μＭのクロトリマゾ
ール（^**, p ＜0.05）の存在下にて有意に増加する。このように、カルシウムフラックス及び膜電位の細胞ベースのアッセイを、la
b-on-a-chip システムにて実行した。膜電位の測定に対する新規なアプローチを
用いて、高感度で過分極及び脱分極を検出した。微小流体フォーマットが、試薬
、サンプル及び細胞の消費を低減した。１回の試験において、５０〜２００ほど
の細胞と１０ｎｌほどのサンプルを使用した。少ない細胞消費により可能になっ
た一次細胞を使用する能力が、人間のリンパ球におけるイオンチャネル活性をア
ッセイすることにより示された。

【００８３】図１２は、DiBAC4(3) ／Syto62蛍光の比をRBL-2H3 細胞に対して作った膜電位
に関係付ける較正曲線を示す。RBL-2H3 細胞（ATCC CRL-2256 ）は、最小実質イ
ーグル(Eagle) 媒体中で成長し、該媒体は、２ｍＭのＬ−グルタミンとイールズ
(Earle's) BSS を有し、該BSS は、調節されて、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウ
ム、０．１ｍＭの非実質アミノ酸、及び１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１
５％の熱−非活性化胎児ウシ血清及び１００ｕ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ
／ｍｌのストレプトマイシンを５％ＣＯ２中に３７μＣにて含有する。細胞は、
トリプシニゼーション(trypsinization)により懸濁させ、１８％Optiprepを含有
するHBSS緩衝剤中にてチップ上に配置した。カリウムの大きなコンダクタンスを
利用すること、及びＫＣｌの細胞外濃度を２から６６ｍＭまで変えることにより
、膜電位を調節した。ゴールドマン−ホドキン−カズ(Goldman-Hodgkin-Katz)式
を用いて、膜電位を計算した。図１２は、較正曲線示す。データは指数関数曲線
（比＝１．２ｘexp ［０．０１９ｘpsi(mV) ］によりフィットされており、膜電
位におけるすべての３０ｍＶ変化に対する比の二倍を示した。ハンクス液中の静
止RBL-2H3 細胞に対する平均の比は０．２６であり、−８０ｍＶの静止膜電位に
対応した。

【００８４】一般に、上述の説明は、請求の範囲に記載の本発明の実施態様に適用できる。また、請求した本発明の精神と範囲から逸脱することなく、ここに記載の方法
及び装置を改変でき、また、本発明は以下のものを含めて幾つかの異なる使用に
付され得る。ここに記載のＴＭＰアッセイを行うための微小流体システムの使用。ここに記載のように、生化学システムが前記チャネルの一つを実質的に連続的
に流れて、例えば複数のＴＭＰモジュレータ化合物の連続試験を行う、微小流体
システムの使用。微小規模装置のチャネルにおける細胞、膜の調製物、染料又はほかのアッセイ
成分の流れを調節し又は実現するための、ここに記載のような微小流体装置にお
ける圧力ベースの又は動電学的な注入の使用。例えば装置のチャネル中での物質の流れを調節し又は実現するための、ここに
記載のような微小流体装置における吸着剤物質、動電学的注入及び圧力ベースの
フロー要素の組み合わせの適宜の使用。ここに記載の微小流体システム又は物質のうちの任意のものを使用するアッセ
イ。

【００８５】明瞭にし理解する目的でいくらか詳細に上記発明を記載してきたが、本発明の
真の範囲から逸脱することなく形態及び詳細における種々の変化が可能であるこ
とは、この明細書を読めば当業者には明らかとなるであろう。例えば、上述した
技術及び装置の全てが種々の組み合わせにて使用できる。この出願において引用
された全ての刊行物、特許出願、特許及びその他の文献が、あたかも各個別の刊
行物又は特許文献が個別にそのように示すのと同程度にて全ての目的のためにそ
れら全体で参考として援用される。

【図面の簡単な説明】

【図１】膜透過電位の関数としての染料吸収量の時間経過を表す線グラフ
である。線Ａは静止電位、高ナトリウムを表す。線Ｂは脱分極、高カリウムを表
す。

【図２】時間に関するＳＹＴＯ６２蛍光の変化を表す。線Ａは静止電位、
高ナトリウムを表す。線Ｂは脱分極、高カリウムを表す。

【図３】パネルＡはＳＹＴＯ６２強度に対するＤｉＢＡＣ₄(３）の蛍光比
を表す棒グラフである。パネルＢはＤｉＢＡＣ₄(３）強度及びＳＹＴＯ６２強度
に対する細胞のフラクションの２つのグラフを表す。線Ａは高ナトリウム緩衝剤
における静止細胞を表し、線ＢはＵＴＰ／高カリウム緩衝剤における脱分極細胞
を表し、そして線ＣはＵＴＰ／高ナトリウム緩衝剤における過分極細胞を表す。

【図４】用量作用曲線の棒グラフである。

【図５】カリパー（Ｃａｌｉｐｅｒ（登録商標））３Ｂ５微小流体プロセ
ッサの概略図である。

【図６】本発明の集積システムの概略図である。

【図７】本発明の集積システムの更なる詳細を表す概略図である。

【図８】本発明の集積システムの更なる詳細を表す概略図である。

【図９Ａ】パネルＡは膜電位アッセイを概略的に描写し、そしてアッセイ
からのデータを表す。

【図９Ｂ】パネルＢは膜電位アッセイを概略的に描写し、そしてアッセイ
からのデータを表す。

【図９Ｃ】パネルＣは膜電位アッセイを概略的に描写し、そしてアッセイ
からのデータを表す。

【図９Ｄ】パネルＤは膜電位アッセイを概略的に描写し、そしてアッセイ
からのデータを表す。

【図１０】パネルＡ−Ｃは脱分極及び過分極アッセイを概略的に表す。

【図１１】例えば本発明のアッセイにて一次細胞の使用中の低い細胞消費
及び高いデータの質を概略的に表す。

【図１２】膜電位に対するｄｉｂａｃ／ｓｙｔｏ６２の比を表す較正曲線
３である。

【符号の説明】

１０２本体構造部１０４主チャネル１０６１０８１１０１１２１１４ウエル１１４リザーバ１１６真空源１２０ピペッタチャネル３０２電圧／圧力コントローラ３０４コンピュータ３０６検出器３０８プレート５０１装置５０３細胞ウエル５０５５０７サイドウエル５０９廃棄ウエル５１１細胞供給チャネル５１３主チャネル５１５サンプル供給チャネル５１７染料供給チャネル８０１クオーツチップ８０３８０５微小チャネル８０７キャピラリー８０９ロボット８１１ミクロプレート８１３光源８１５光学系８１７蛍光読み取り機８１９細胞ウエル８２１廃棄ウエル８２３サイドウエル

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 37/00 １０３Ｇ０１Ｎ 37/00 １０３ (31)優先権主張番号６０／２２９，９５１ (32)優先日平成12年９月１日(2000．9．1) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷＦターム(参考） 2G043 AA06 BA16 DA02 DA05 EA01 EA13 EA14 FA02 FA03 GA07 GB19 JA01 KA09 LA01 LA02 NA01 NA05 2G054 AA08 CE02 4B029 AA07 AA08 BB01 CC01 FA07 FA12 FA15 GA03 GB02 GB03 4B063 QA01 QA20 QQ20 QR66 QR74 QS28 QS36 QS39 QX05

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】膜を含む第一成分、カチオン性膜浸透性染料及びアニオン性膜
浸透性再分布性染料を含む組成物。
【請求項２】前記カチオン性膜浸透性染料がカチオン性核酸染色性染料から
なる請求項１に記載の組成物。
【請求項３】前記第一成分が、細胞、ミトコンドリア、葉緑体、細胞の小胞
及び人工膜、の１種以上からなる請求項１に記載の組成物。
【請求項４】前記細胞が、健全な細胞、動物細胞、植物細胞、菌糸細胞、細
菌細胞、哺乳動物の細胞、霊長目動物の細胞、けつ歯目動物の細胞、イヌ科動物
の細胞、ネコ科動物の細胞、及び家畜類の細胞、培養細胞、ＴＨＰ−１細胞、Ｃ
ＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、ＨｅＬＡ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、一次
細胞、内胚葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉細胞、分化組織から誘導した細胞、未分
化組織から誘導した細胞、血液細胞、末梢血液細胞、神経細胞、筋肉細胞、皮膚
細胞及び骨細胞、の１種以上からなる請求項３に記載の組成物。
【請求項５】前記カチオン性膜浸透性染料が、青色蛍光ＳＹＴＯ染料、緑色
蛍光ＳＹＴＯ染料、オレンジ色蛍光ＳＹＴＯ染料、赤色蛍光ＳＹＴＯ染料、ＳＹ
ＴＯ６２、Ｐｕｒ−１、チアゾール、アリール、２ＤＳ−７ＪＩ、Ｈｏｅｃｈ
ｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２及びヨウ化ヘキシジウム、の１
種以上からなり、或いは前記アニオン性膜浸透性再分布性染料が、アニオン性ビ
ス−イソオキサゾロンオキソノール染料、ビス−オキソノール染料、Ｏｘｏｎｏ
ｌＶ、ＯｘｏｎｏｌＶＩ、ＤｉＢＡＣ₄(３）、ＤｉＢＡＣ₄(５）及びＤｉＢ
ＡＣ₂(３）、の１種以上からなる請求項１に記載の組成物。
【請求項６】請求項１に記載の組成物を含む容器又は微小流体プロセッサー
。
【請求項７】１種以上の膜を含む第一成分を供給し、該第一成分にカチオン
性膜浸透性核酸染色性染料を添加し、次いで、該カチオン性膜浸透性核酸染色性
染料からの第一信号出力であって、前記１種以上の膜にかかる膜透過電位に相関
する該第一信号出力を監視することを特徴とする膜電位感知性の信号出力を発生
させる方法。
【請求項８】前記方法が膜透過電位の変化を監視するものであり、前記第一
信号出力を監視することが経時による第一信号出力の変化を監視するものであり
、また前記第一信号出力を１種以上の膜にかかる膜透過電位に相関させることが
経時による第一信号の変化の速度を測定するものである請求項７に記載の方法。
【請求項９】前記供給工程が、第一成分を、第二微小流体チャネルと交差す
る第一微小流体チャネルに流通させてなり、前記カチオン性膜浸透性核酸染色性
染料は第一又は第二の微小チャネルを流通して少なくとも１種の膜と接触する請
求項７に記載の方法。
【請求項１０】前記方法が、アニオン性膜浸透性再分布性染料又は中性染料
を第一チャネル又は第二チャネルに流通させて少なくとも１種の膜と接触させる
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】更に、前記１種以上の膜を１種以上の膜透過電位モジュレー
タ組成物に曝し、次いで第一信号出力に対する１種以上の膜透過電位モジュレー
タ組成物の効果を監視し、これにより膜透過電位に対する１種以上の膜透過電位
モジュレータ組成物の効果を監視する請求項７に記載の方法。
【請求項１２】前記１種以上の膜透過電位モジュレータ組成物が過分極緩衝
剤、脱分極緩衝剤、及び細胞膜を越えるイオンの輸送を変える化合物の１種以上
からなる請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】１種以上の膜と１種以上の電圧感知性染料とを含む第一混合
物を第一チャネル領域に流通させ、次いで、該電圧感知性染料の少なくとも１種
からの少なくとも第一信号出力を監視し、これにより１種以上の膜にかかる膜透
過電位に依存する信号を発生させることを特徴とする膜透過電位に依存する信号
の発生方法。
【請求項１４】前記電圧感知性染料が、１種以上のイオン染料である１種以
上の膜浸透性再分布性染料からなり、該１種以上の膜浸透性染料を供給源から第
一チャネル領域まで流して１種以上の膜と接触させ、且つ平衡な分布に達する前
に該膜浸透性標識からの１つ以上の信号出力を監視することにより該膜を越える
膜浸透性標識の流れを検出する請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】第一混合物が、カチオン染料、カチオン性膜浸透性核酸染色
性染料、アニオン染料及び中性染料、の１種以上を含む請求項１３又は１４に記
載の方法。
【請求項１６】前記１種以上の電圧感知性染料が、アニオン染料、カチオン
染料又はカチオン性膜浸透性核酸染色性染料と、アニオン染料、Ｏｘｏｎｏｌ
Ｖ、ＯｘｏｎｏｌＶＩ、ＤｉＢＡＣ₄(３）、ＤｉＢＡＣ₄(５）、ＤｉＢＡＣ₂(
３）、ＷＷ７８１、ＲＧＡ−３０、カチオン染料、短いアルキル端部を有するイ
ンド−カルボシアニン染料、短いアルキル端部を有するチオ−カルボシアニン染
料、短いアルキル端部を有するオキサ−カルボシアニン染料、アミノナフチルエ
テニルビリジニウム染料、ジアルキルアミノフェニルポリエニルピリジニウム染
料、カチオン性膜浸透性核酸染色性染料、ＳＹＴＯ染料、ＳＹＴＯ６２及び中
性染料、の１種以上とを含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】１種以上の膜を含む第一成分を供給源から第一チャネル領域
まで流し、次いで前記１種以上の電圧感知性染料を含む標識組成物を流して該膜
と接触させることにより、前記第一混合物を第一チャネルに供給する請求項１３
に記載の方法。
【請求項１８】更に、前記膜を過分極させるか脱分極させ、或いは膜の浸透
性を変化させ、次いで第一信号出力を監視することにより膜を越える少なくとも
１種の電圧感知性染料の流れを監視し、これにより膜透過電位の変化を測定する
請求項１３に記載の方法。
【請求項１９】更に、少なくとも、１種以上の第二電圧感知性染料を含む第
二混合物を流して膜と接触させ、次いで第二電圧感知性染料からの少なくとも第
二信号出力を監視することにより、膜を越える１種以上の第二電圧感知性染料の
流れを監視する請求項１３に記載の方法。
【請求項２０】約１００秒未満の選択された時間（ｔ）に亘って前記第一又
は第二の信号出力を監視する請求項７、１３又は１９に記載の方法。
【請求項２１】ｔが約０．１〜約８０秒である請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】前記第一又は第二の信号出力が、１種以上の膜を越える、前
記第一電圧感知性染料、前記少なくとも第二電圧感知性染料又は前記カチオン性
膜浸透性核酸染色性染料の平衡前である１つ以上の時点で監視される請求項７、
１３又は１９に記載の方法。
【請求項２３】前記電圧感知性染料がカチオン性膜浸透性核酸染色性染料で
ある請求項１３に記載の方法。
【請求項２４】膜を越える染料の転位速度が、膜にかかる膜透過電位に依存
する請求項７、１３又は１９記載の方法。
【請求項２５】前記カチオン性膜浸透性核酸染色性染料が、シアニン染料、
又は環状置換の非対称シアニン染料である請求項７又は２３に記載の方法。
【請求項２６】前記カチオン性膜浸透性核酸染色性染料が、青色蛍光ＳＹＴ
Ｏ染料、緑色蛍光ＳＹＴＯ染料、オレンジ色蛍光ＳＹＴＯ染料、赤色蛍光ＳＹＴ
Ｏ染料、Ｐｕｒ−１、チアゾール、アリール、２ＤＳ−７ＪＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ
３３２５８、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２及びヨウ化ヘキシジウムから選ばれ
た染料である請求項７又は２３に記載の方法。
【請求項２７】前記染料が赤色蛍光染料ＳＹＴＯ６２である請求項７又は
２３に記載の方法。
【請求項２８】前記方法が、第一成分又は第一混合物にアニオン性膜浸透性
再分布性染料を添加し、次いで該アニオン性膜浸透性再分布性染料からの第二信
号出力を監視し、これにより膜透過電位変化についての別の指示を与える請求項
７又は２３に記載の方法。
【請求項２９】更に、前記第一信号と第二信号との比を測定する請求項２８
に記載の方法。
【請求項３０】前記アニオン性膜浸透性再分布性染料が、アニオン性ビス−
イソオキサゾロンオキソノール染料、ビス−オキソノール染料、Ｏｘｏｎｏｌ
Ｖ、ＯｘｏｎｏｌＶＩ、ＤｉＢＡＣ₄(３）、ＤｉＢＡＣ₄(５）及びＤｉＢＡＣ ₂ (３）の１種以上からなる請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】前記カチオン性膜浸透性核酸染色性染料が約０．０１〜約５
０μＭの濃度のＳＹＴＯ６２であり、前記アニオン性染料が約０．０１〜約５
０μＭの濃度のＤｉＢＡＣ₄(３）である請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】前記第一膜が、Ｎａ⁺、Ｋ⁺、Ｃｌ^-、Ｈ⁺、Ｃａ²⁺及びＨ
ＣＯ₃ ^-から選ばれた１種以上のイオンを含む液体中に懸濁された健全な細胞の
成分である請求項７又は１３に記載の方法。
【請求項３３】前記１種以上の膜が細胞膜である請求項７又は１３に記載の
方法。
【請求項３４】前記細胞膜が健全な又は生の細胞中に存在するか、或いは前
記細胞が動物細胞、植物細胞、菌糸細胞、細菌細胞、哺乳動物の細胞、霊長目動
物の細胞、けつ歯目動物の細胞、イヌ科動物の細胞、ネコ科動物の細胞、家畜類
の細胞、培養細胞、ＴＨＰ−１細胞、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ細胞、Ｈ
ｅＬＡ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、一次細胞、内胚葉細胞、外胚葉細胞、中胚葉
細胞、分化組織から誘導した一次細胞、未分化組織から誘導した一次細胞、血液
から誘導した一次細胞、末梢血液から誘導した一次細胞、神経から誘導した一次
細胞、筋肉から誘導した一次細胞、皮膚から誘導した一次細胞及び骨から誘導し
た一次細胞から選ばれる請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】健全な又は生の細胞が約−１００ｍＶ〜約１０ｍＶの膜透過
電位を有する請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】前記第一信号が光学的に検出される請求項７又は１３に記載
の方法。
【請求項３７】前記第一信号が約２０℃〜４０℃で検出される請求項７又は
１３に記載の方法。
【請求項３８】前記第一信号を監視することが、カチオン性膜浸透性核酸染
色性染料又は膜浸透性標識によって生じた１つ以上の蛍光発光を検出するもので
ある請求項７又は１３に記載の方法。
【請求項３９】更に、前記第一成分を膜透過電位モジュレータと接触させ、
次いで第一信号出力を監視することにより膜透過電位モジュレータの効果を監視
する請求項７又は１３に記載の方法。
【請求項４０】前記膜透過電位モジュレータがコントロールモジュレータ又
はテストモジュレータである請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】前記コントロールモジュレータが、分子、神経毒素、１組の
神経毒素、神経伝達物質、１組の神経伝達物質、蛋白質、１組の蛋白質、ペプチ
ド、１組のペプチド、脂質、１組の脂質、炭水化物、１組の炭水化物、有機分子
、１組の有機分子、薬剤、１組の薬剤、レセプタ配位子、１組のレセプタ配位子
、抗体、１組の抗体、サイトカイン、１組のサイトカイン、ケモカイン、１組の
ケモカイン、ホルモン、１組のホルモン、細胞、１組の細胞、細胞に結着した蛋
白質、１組の細胞に結着した蛋白質から選ばれる請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】１種以上の膜を含む第一成分を供給し、該第一成分にカチオ
ン性膜浸透性再分布性染料を添加し、該第一成分にアニオン性膜浸透性再分布性
染料を添加し、次いで、該カチオン性染料からの第一信号出力及び該アニオン性
染料からの第二信号出力を測定することからなり、前記第一及び第二の信号出力
は、光信号出力からなり、これにより膜透過電位に感知性の光信号を発生させる
ことを特徴とする膜透過電位感知性の光信号発生方法。
【請求項４３】前記カチオン性染料が膜浸透性核酸染色性染料又はカチオン
性ローダミン、インド−カルボシアニン染料、チオ−カルボシアニン染料、オキ
サ−カルボシアニン染料、アミノナフチルエチレニルビリジニウム染料、ジアル
キルアミノフェニルポリフェニルピリジニウム染料であり、前記アニオン性膜浸
透性再分布性染料がＯｘｏｎｏｌＶ、ＯｘｏｎｏｌＶＩ、及びＤｉＢＡＣ₄(
３）、ＤｉＢＡＣ₄(５）、ＤｉＢＡＣ₂(３）、の１種以上からなる請求項４２に
記載の方法。
【請求項４４】更に、前記第一成分に中性染料を添加する請求項４２に記載
の方法。
【請求項４５】更に、前記第一成分に、温度、保温時間及び全膜浸透性、の
１つ以上に依存するコントロール信号出力を生じる中性染料を添加する請求項４
２に記載の方法。
【請求項４６】１種以上の膜を含む第一成分を供給し、該第一成分に少なく
とも、イオンからなる第一膜浸透性再分布性染料を添加し、平衡染料分布の達成
前に、前記第一成分からの、少なくとも１つの光信号出力からなる１つ以上の信
号出力を測定し、これにより膜透過電位に依存する光信号を供給することを特徴
とする膜透過電位に依存する光信号の発生方法。
【請求項４７】更に、前記１つ以上の信号出力を膜透過電位の変化に相関さ
せる請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】前記１種以上の成分に少なくとも第二の膜浸透性再分布性染
料を添加し、次いで平衡染料分布の達成前に該第二膜浸透性再分布性染料からの
１つ以上の信号出力を測定する請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】前記第一染料及び第二染料が殆ど同時に第一成分に添加され
、また前記第一及び第二の膜浸透性再分布性染料からの信号出力が殆ど同時に測
定される請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】前記第一及び第二の再分布性染料が、アニオン染料及びカチ
オン染料からなる請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】前記第一及び第二の再分布性染料が、アニオン染料、カチオ
ン染料、カチオン性膜浸透性核酸染色性染料及び中性染料、の１種以上からなる
請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】更に、前記１種以上の成分に少なくとも第三の膜浸透性再分
布性染料を添加し、次いで平衡染料分布の達成前に該第三膜浸透性再分布性染料
からの１つ以上の信号出力を測定する請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】前記第一及び第二の再分布性染料が、アニオン染料及びカチ
オン染料、の１種以上からなり、また前記第三膜浸透性再分布性染料が中性染料
からなる請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】前記中性染料用の信号出力が、膜浸透性における温度に依存
する変化又は膜浸透性における時間に依存する変化に相関する請求項５３に記載
の方法。
【請求項５５】前記カチオン染料が核酸染色性染料である請求項５１に記載
の方法。
【請求項５６】前記カチオン染料が青色蛍光ＳＹＴＯ染料、緑色蛍光ＳＹＴ
Ｏ染料、オレンジ色蛍光ＳＹＴＯ染料、赤色蛍光ＳＹＴＯ染料、Ｐｕｒ−１、チ
アゾール、アリール、２ＤＳ−７ＪＩ、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３２５８、Ｈｏｅｃ
ｈｓｔ３３３４２及びヨウ化ヘキシジウムから選ばれた核酸染色性染料からな
り、或いは前記アニオン性再分布性染料がＯｘｏｎｏｌＶ、ＯｘｏｎｏｌＶ
Ｉ及びＤｉＢＡＣ₄(３）、ＤｉＢＡＣ₄(５）、ＤｉＢＡＣ₂(３）、の１種以上か
らなる請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】前記アニオン性再分布性染料がＳｙｔｏ６２からなり、ま
た前記アニオン染料がＤｉＢＡＣ₄(３）からなる請求項４２に記載の方法。
【請求項５８】膜透過電位の監視用微小流体装置であって、該装置は、内部
に少なくとも１つの微小規模のキャビティを配置した本体構造と；前記少なくと
も１つの微小規模のキャビティに流動可能に接続している、少なくとも１つの膜
を含む第一組成物の標的供給源と；前記少なくとも１つの微小規模のキャビティ
に流動可能に接続している、１種以上の電圧感知性染料の供給源とを有し、装置
の操作中、前記第一組成物は前記少なくとも１つの微小規模のチャネル中で前記
１種以上の電圧感知性染料に接触する前記装置。
【請求項５９】前記１種以上の電圧感知性染料が、１種以上のカチオン性膜
浸透性染料を含み、前記少なくとも１つの微小規模のキャビティに流動可能に接
続しているカチオン性膜浸透性染色性染料供給源；及び１種以上のアニオン性再
分布性染料を含み、前記少なくとも１つの微小規模のキャビティに流動可能に接
続しているアニオン性膜浸透性再分布性染料供給源、の１種以上からなる請求項
５８に記載の装置。
【請求項６０】前記カチオン性染料供給源が核酸染色性染料である請求項５
８に記載の装置。
【請求項６１】前記装置は前記カチオン性膜浸透性染色性染料供給源及びア
ニオン性膜浸透性再分布性染料供給源の両方を含むと共に、該装置の操作中、前
記第一組成物は該カチオン性膜浸透性染料及びアニオン性膜浸透性再分布性染料
の存在下で少なくとも１種の膜透過電位モジュレータ組成物に接触させる請求項
５８に記載の装置。
【請求項６２】更に、前記装置は、前記少なくとも１つの微小規模のキャビ
ティに流動可能に接続している、少なくとも１種の電位膜透過電位モジュレータ
組成物の供給源を含む請求項５８に記載の装置。
【請求項６３】更に、少なくとも１種の膜透過電位モジュレータ組成物の供
給源を含むと共に、装置の操作中、該少なくとも１種の膜透過電位モジュレータ
組成物は、第一組成物、カチオン性膜浸透性染料又はアニオン性膜浸透性再分布
性染料、の１つ以上に接触させる請求項５８に記載の装置。
【請求項６４】前記装置が更に、少なくとも１種の電位膜モジュレータ組成
物の供給源を複数含む請求項５８に記載の装置。
【請求項６５】前記複数の供給源が１つ以上のミクロ滴定トレーを有し、各
トレーは少なくとも１種の電位膜モジュレータ組成物を含む請求項６４に記載の
装置。
【請求項６６】前記ミクロ滴定トレーが前記本体構造に近接して移動可能に
設けられ、該本体構造は該トレーに接近するように構造的に構成された１つ以上
のピペッタチャネルを有し、該１つ以上のピペッタチャネルは前記少なくとも１
つの微小規模のキャビティに流動可能に接続している請求項６５に記載の装置。
【請求項６７】前記少なくとも１種の電位膜モジュレータ組成物が、膜の過
分極緩衝剤、膜の脱分極緩衝剤、膜浸透性を変える化合物及び前記細胞膜を越え
るイオンの輸送を変える化合物、の１種以上からなる請求項６２に記載の装置。
【請求項６８】更に、前記微小規模のキャビティに近接して又はキャビティ
内に設けた、信号を検出する信号検出器を有する請求項５８に記載の装置。
【請求項６９】前記検出器が、選択された長さの時間（ｔ）又は選択された
時点（ｔ_p）の間、検出可能な信号を検出する請求項６８に記載の装置。
【請求項７０】前記少なくとも１つの微小規模のキャビティが第一微小規模
チャネルであり、装置の操作中、少なくとも１つの膜を有する前記第一組成物は
標的供給源から微小チャネル中に流れ、前記カチオン性膜浸透性染料又はアニオ
ン性膜浸透性再分布性染料は流れて前記第一組成物と接触し、また前記検出可能
な信号は第一組成物とカチオン性膜浸透性染料又はアニオン性膜浸透性再分布性
染料との接触後、１つ以上の選択された時点で監視される請求項５８に記載の装
置。
【請求項７１】前記少なくとも１種の電位膜モジュレータ組成物が、標的供
給源から流れて第一組成物と接触する請求項７０に記載の装置。
【請求項７２】前記膜が健全な細胞の成分である請求項５８に記載の装置。