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KR101923632B1 - Hla g-변형된 세포 및 방법 - Google Patents

Hla g-변형된 세포 및 방법 Download PDF

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KR101923632B1
KR101923632B1 KR1020157005165A KR20157005165A KR101923632B1 KR 101923632 B1 KR101923632 B1 KR 101923632B1 KR 1020157005165 A KR1020157005165 A KR 1020157005165A KR 20157005165 A KR20157005165 A KR 20157005165A KR 101923632 B1 KR101923632 B1 KR 101923632B1
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바질 엠. 한타쉬
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이스케이프 테라퓨틱스, 인코퍼레이티드
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Abstract

HLA-G(예를 들어, 세포 표면 HLA-G)를 지속적으로 발현하는 유전자 변형된 세포, 및 이러한 유전자 변형된 세포를 생성하기 위한 핵산 조성물이 본원에 개시되어 있다. HLA-G를 지속적으로 발현하는 유전자 변형된 세포를 이용한 세포 치료 방법이 또한 개시되어 있다. 본원에 기재된 HLA-G 유전자 변형은 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제의 특징을 세포에 제공하여, 이 세포는 장기이식, 세포 및 조직 재생 또는 복원, 및 다른 치료에 대한 보편적 또는 개선된 공여 세포가 될 가능성을 갖는다.

Description

HLA G-변형된 세포 및 방법{HLA G-MODIFIED CELLS AND METHODS}
본원은 2012년 7월 31일에 출원된 미국 가출원 제61/677,739호(본원에 그 전문이 참조문헌으로 포함됨)에 대한 우선권을 주장한다.
세포 이식 형태의 재생 의약은 난치성 의학 병증, 예컨대 당뇨병, 심장 질환, 및 신경퇴행성 질환의 치료를 위한 가장 유망한 치료 접근법 중 하나이다. 그러나, 클리닉에서 세포 이식의 실행에 대한 주요한 장애물은 특히 공여 세포가 외래 호스트로부터 유래할 때 이 세포의 면역 거부이다. 면역억제 약물을 투여함으로써 부분적으로 면역 거부를 해결하는 것이 가능하지만, 이는 심각한 부작용을 수반한다. 따라서, 세포 이식 치료에 대한 개선된 기술을 개발하고자 하는 계속적인 수요가 존재한다.
공여 세포를 필요로 하는 대상체에 이식하고자 하는 이러한 공여 세포에서의 적어도 외인성 HLA-G 단백질의 장기간 강제 발현에 기초한 세포 이식 치료 방법 및 세포 기반 조성물이 본원에 개시되어 있다. 본 발명은 본원에 기재된 방식으로 외인성 HLA-G를 발현하도록 변형된 세포(다능성이든 또는 분화되든)가 감소된 면역원성 및/또는 증가된 면역억제를 갖는다는 것을 나타내는 데이터를 제공한다. HLA-G 유전자 변형에 의해 제공된 감소된 면역원성 및/또는 증가된 억제 능력은 안정하고 분화 과정을 비롯하여 오래 지속한다. 이 의미는 본 발명의 HLA-G 변형된 세포가 다양한 손상, 질환 또는 장애에 대한 보편적 공여 세포 또는 조직(즉, 공여 세포와 수혜자 사이의 전통적인 인간 백혈구 항원(HLA) I형 및 II형 분자의 유형을 일치시키기 요건을 감소시키거나 제거함)으로 작용할 수 있다는 것이다.
따라서, 일 양상에서 감소된 면역원성을 갖고/갖거나 상기 유전자 변형이 없는 포유동물 세포와 비교하여 동종이계 수혜자에서 증가된 면역억제를 제공할 수 있는 유전자 변형된 포유동물 세포(HLA-G 변형된 세포)가 본원에 기재되어 있고, 여기서 (i) 유전자 변형된 포유동물 세포는 (a) 인간 HLA-G와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 갖고, 소포체-골지 재순환 경로에서 HLA-G의 보유를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 HLA-G 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 외인성 핵산(예를 들어, 발현 벡터) 및/또는 (b) 마이크로RNA 결합 부위를 포함하지 않는 3' UTR(비번역 구역) 서열, 예컨대 서열 번호 3 또는 서열 번호 4를 포함하지 않는 서열을 포함하고; (ii) 코딩된 HLA-G 단백질은 적어도 7주(예를 들어, 적어도 20주 또는 적어도 50주) 동안 유전자 변형된 포유동물 세포에 의해 발현된다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 유전자 변형이 없는 포유동물 세포와 비교하여 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제를 갖는 유전자 변형된 포유동물 세포를 제공하고, 여기서 (i) 유전자 변형된 포유동물 세포는 (a) 공통 야생형 인간 HLA-G(예컨대, 서열 번호 1)와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 갖고, 소포체-골지 재순환 경로에서 HLA-G의 보유를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 HLA-G 단백질을 코딩하는 핵산 서열(예컨대, 서열 번호 2); 및 (b) 공통 야생형 인간 HLA-G 유전자의 3' 비번역 구역 서열과 적어도 85% 동일하고, 서열 번호 4를 포함하지 않는 3' 비번역 구역(UTR)(예컨대, 서열 번호 3)을 포함하는 외인성 핵산을 포함하고; (ii) 코딩된 HLA-G 단백질은 적어도 7주 동안 유전자 변형된 포유동물 세포에 의해 발현된다.
몇몇 실시양태에서, 유전자 변형된 세포는 (1) 상기 유전자 변형이 없는 포유동물 세포와 비교하여 유전자 변형된 세포의 NK-92 세포독성의 감소, (2) 상기 유전자 변형이 없는 포유동물 세포와 비교하여 유전자 변형된 세포의 실험실내 말초 혈액 단핵 세포 증식의 감소 및/또는 (3) 인간화 NSG 마우스에서 상기 유전자 변형이 없는 포유동물 세포와 비교하여 유전자 변형된 세포에 의한 종양 형성의 크기 및 중량의 증가를 나타내는 경우 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제를 갖는다.
몇몇 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 동종이계 수혜자와 비교하여 하나 이상의 HLA 항원에서 매치를 갖지 않고(즉, 동일한 대립유전자(들)), HLA 항원은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 소정의 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 동종이계 수혜자와 비교하여 하나 이상의 HLA 항원에서 오직 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 매치를 갖고, HLA 항원은 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ 및 HLA-DR과 관련하여 동종이계 수혜자와 매치를 갖지 않는다.
몇몇 실시양태에서, 유전자 변형된 세포는 소포체-골지 재순환 경로에서 HLA-G의 보유를 감소시키는 하나 이상의 아미노산 돌연변이가 없는 HLA-G 전이유전자(즉, HLA-G 야생형 공통 서열, 예컨대 서열 번호 1)를 포함하지만, 마이크로RNA 결합 부위를 포함하지 않는 3' UTR(비번역 구역) 서열, 예컨대 서열 번호 3 또는 서열 번호 4를 포함하지 않는 서열을 포함하는 HLA-G 전이유전자를 갖는다.
몇몇 실시양태에서, 소포체-골지 재순환 경로에서 HLA-G의 보유를 감소시키는 하나 이상의 돌연변이는 디-리신(KK) 모티프 돌연변이를 포함한다. 몇몇 실시양태에서, KK 모티프 돌연변이는 K334A 돌연변이, K335A 돌연변이, 또는 돌연변이 둘 다를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 유전자 변형된 세포에서 발현시키고자 하는 외인성 핵산은 서열 번호 4를 포함하지 않는 3' UTR 서열을 포함한다. 외인성 핵산의 3' UTR 서열이 서열 번호 4를 포함하지 않는 일 실시양태에서, 핵산 서열은 서열 번호 3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 발현된 HLA-G는 유전자 변형된 포유동물 세포의 세포 표면에 존재한다.
몇몇 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 인간 세포, 마우스 세포, 랫트 세포, 원숭이 세포, 또는 돼지 세포이다.
몇몇 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 줄기 세포, 전구 세포, 또는 줄기 세포 또는 전구 세포의 지시된 분화에 의해 얻은 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 외인성 HLA-G 전이유전자의 도입 전에 이미 분화된(천연이든 또는 실험실내이든) 세포이다. 몇몇 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 줄기 세포(예를 들어, 다능성 줄기 세포)이다. 유전자 변형된 포유동물 세포가 줄기 세포인 몇몇 실시양태에서, 줄기 세포는 배아 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포, 또는 전능성 줄기 세포이다. 일 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 배아 줄기 세포이다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 유도 다능성 줄기 세포이다. 추가로 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 면역계 세포 유형이 아니다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 줄기 세포 또는 전구 세포의 실험실내 분화에 의해 얻은 세포이고, 줄기 세포 또는 전구 세포는 유전자 변형되고 이후 실험실내 분화된다.
다른 실시양태에서, 유전자 변형된 세포는 완전 분화된 세포, 표피 전구 세포, 췌장 전구 세포, 조혈모 세포, 다능성 줄기 세포의 분화에 의해 얻은 세포, 케라틴세포, 섬유아세포, 중간엽 줄기 세포, 심근세포, 신경 줄기 세포, 뉴런, 성상교세포, 또는 췌장 β 세포 전구자이다.
유전자 변형된 포유동물 세포에서의 외인성 핵산이 발현 벡터인 몇몇 실시양태에서, 발현 벡터는 트랜스포손 벡터 또는 레트로바이러스 벡터이다. 외인성 핵산이 발현 벡터인 몇몇 실시양태에서, 발현 벡터는 표적화 벡터이고, 유전자 변형된 포유동물 세포는 표적화 벡터의 상동성 재조합에 의해 얻어진다. 몇몇 실시양태에서, 발현 벡터는 리포터 단백질, 예컨대 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 외인성 핵산은 또한 (i) 인간 HLA-G 유전자의 3' 비번역 구역 서열에 적어도 85% 동일하고; (ii) 3' 비번역 구역 내의 돌연변이된 결합 부위를 포함하는 mRNA 내의 돌연변이된 부위로의 동족 마이크로RNA의 결합을 저해하는 적어도 하나의 돌연변이를 핵산 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, 이러한 핵산 서열은 서열 번호 3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 유전자 변형된 세포를 포함하는 인공 조직이 제공된다.
또 다른 양상에서, (i) 인간 HLA-G와 적어도 85% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 제1 핵산 서열 ; 및 (ii) 인간 HLA-G 유전자의 3' 비번역 구역 서열과 적어도 85% 동일하고 제1 핵산 서열에 작동적으로 연결된 제2 핵산 서열을 포함하는 단리된 핵산이 본원에 제공되고, 여기서 아미노산 서열은 소포체-골지 재순환 경로에서 HLA-G의 보유를 감소시키는 돌연변이를 포함하고, 제2 핵산 서열은 3' 비번역 구역 내의 돌연변이된 결합 부위를 포함하는 mRNA로의 동족 마이크로RNA의 결합을 저해하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 핵산에서 3' 비번역 구역 서열은 서열 번호 4를 포함하지 않는다. 3' 비번역 구역 서열이 서열 번호 4를 포함하지 않는 일 실시양태에서, 3' 비번역 구역 서열은 서열 번호 3을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, 단리된 핵산 및 제1 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 포유동물 발현 벡터가 제공되고, 프로모터는 줄기 세포에서 침묵화되지 않는다. 몇몇 실시양태에서, 프로모터는 중국 햄스터 EF-1α(CHEF-1α) 프로모터 또는 인간 EF-1α 프로모터의 핵산 서열을 포함한다. 일 실시양태에서, CHEF-1α 프로모터는 서열 번호 7을 포함한다. 다른 실시양태에서, HLA-G 전이유전자의 발현을 추진하는 데 사용되는 프로모터는 조직 또는 세포 유형 선택적 프로모터이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터는 리포터 단백질을 코딩하는 제3 핵산 서열을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터는 트랜스포손 벡터이다. 몇몇 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터를 포함하는 유전자 변형된 포유동물 세포가 제공된다.
몇몇 실시양태에서, (i) 인간 HLA-G와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 제1 핵산 서열(여기서, 아미노산 서열은 소포체-골지 재순환 경로에서 HLA-G의 보유를 감소시키는 돌연변이를 포함함); 및 (ii) 인간 HLA-G 유전자의 3' 비번역 구역 서열과 적어도 95% 동일하고 제1 핵산 서열에 작동적으로 연결된 제2 핵산 서열(여기서, 제2 핵산 서열은 3' 비번역 구역 내의 돌연변이된 결합 부위를 포함하는 mRNA로의 동족 마이크로RNA의 결합을 저해하는 적어도 하나의 돌연변이를 포함함)을 포함하는 단리된 핵산이 제공된다. 일 실시양태에서, 제1 핵산 서열은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코딩한다. 또 다른 실시양태에서, 제2 핵산 서열은 서열 번호 4를 포함하지 않는다. 일 실시양태에서, 제2 핵산 서열은 서열 번호 3을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 상기 제1 핵산 서열 및 제2 핵산 서열을 포함하고, 제1 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함하는 포유동물 발현 벡터가 제공되고, 여기서 프로모터는 줄기 세포 또는 줄기 세포의 분화에 의해 생성된 세포에서 침묵화되지 않는다. 이러한 프로모터는 중국 햄스터 EF-1α 프로모터의 핵산 서열을 포함할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터는 리포터 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터는 트랜스포손 벡터이다. 또 다른 실시양태에서, 포유동물 발현 벡터는 도 1에 도시된 구성요소 모두를 포함한다.
일 실시양태에서, (a) 중국 햄스터 EF-1α 프로모터, (b) 프로모터에 작동적으로 연결되고 서열 번호 2의 아미노산 서열을 갖는 인간 HLA-G를 코딩하는 핵산 서열, 및 (c) 서열 번호 3을 포함하는 3' UTR 서열을 포함하는 포유동물 발현 벡터가 제공된다. 몇몇 실시양태에서, 이러한 발현 벡터를 포함하는 유전자 변형된 포유동물 세포가 제공된다.
다양한 실시양태에서, HLA-G 변형된 포유동물 세포(예를 들어, 인간 HLA-G 변형된 세포)는 심혈관 질환, 눈 질환(예를 들어, 황반변성), 청각 질환(예를 들어, 난청), 당뇨병, 신경퇴행성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 골다공증, 간 질환, 신장 질환, 자가면역 질환, 관절염, 잇몸 질환, 구강 병증, 또는 증식성 장애(예를 들어, 암)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는, 임의의 다수의 병증을 겪는 대상체에 투여된다. 다른 경우에, 대상체는 급성 건강 병증, 예를 들어, 뇌졸중, 척수 손상, 화상 또는 상처를 겪거나 이를 겪을 높은 위험에 있다. 다른 경우에, 대상체는 조직 소실, 예컨대 지방위축병 또는 노화 관련 콜라겐 소실을 겪는다. 다른 경우에, 대상체는 비치유 궤양을 겪거나, 요도하혈 및 요도상혈과 같은 결함의 봉합을 돕는 물질이 필요하다. 다른 경우에, 대상체는 상처 치유 또는 피부 대체를 위한 영구적 또는 일시적 피부 이식편이 필요하다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명은 세포 또는 조직 회복 또는 재생을 필요로 하는 대상체에 대한 세포 또는 조직 회복 또는 재생의 보편적 방법을 제공하고, 상기 방법은 eHLA-G 변형된 세포의 집단을 포함하는 세포 또는 조직 조성물을 대상체에 주사하거나 이식하는 단계를 포함하고, 대상체는 eHLA-G 변형된 세포의 집단과 비교하여 적어도 하나의 불일치하는 전통적인 HLA I형 또는 HLA II형 분자를 갖고, eHLA-G 변형된 세포의 집단은 eHLA-G 변형이 없는 동일한 유형의 세포와 비교하여 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제를 나타낸다. 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제는 예를 들어 NK-92 세포독성 검정, 인간화 NSG 종양 성장 검정 및/또는 PBMC 증식 검정에서 eHLA-G 변형된 세포를 eHLA-G 변형이 없는 동일한 유형의 대조군 세포와 비교함으로써 결정될 수 있다. 일 실시양태에서, 유전자 변형된 세포의 집단은 eHLA-G 유전자 변형된 인간 진피 섬유아세포의 집단을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변형된 세포의 집단은 eHLA-G 유전자 변형된 인간 표피 전구세포의 집단을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변형된 세포의 집단은 eHLA-G 유전자 변형된 인간 중간엽 줄기 세포의 집단을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변형된 세포의 집단은 eHLA-G 유전자 변형된 인간 배아 줄기 세포의 집단을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유전자 변형된 세포의 집단은 eHLA-G 유전자 변형된 인간 배아 줄기 세포로부터 실험실내 분화된 세포의 집단을 포함한다. 다른 실시양태에서, 유전자 변형된 세포의 집단은 적어도 2주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 14주, 16주, 18주, 20주, 24주, 36주, 48주, 또는 52주 동안 대상체의 면역계에 의해 거부되지 않는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 피부 재생을 필요로 하는 대상체에서의 피부 재생 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에서 피부 손상 부위에 eHLA-G 변형된 진피 섬유아세포 및/또는 eHLA-G 변형된 배아 표피 전구세포의 집단을 주사하는 단계를 포함하고, 대상체는 eHLA-G 변형된 진피 섬유아세포 및/또는 eHLA-G 변형된 배아 표피 전구세포의 집단과 비교하여 적어도 하나의 불일치한 전통적인 HLA I형 또는 HLA II형 분자를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 eHLA-G 전이유전자 및 외인성 인간 β2-마이크로글로불린(β2m) 분자를 포함하는 유전자 변형된 포유동물 세포의 집단을 이를 필요로 하는 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 세포 치료 방법이 제공된다.
도 1은 포스포글리세린산키나제(PGK) 프로모터에 의해 추진된 선택 마커(네오마이신 포스포트랜스퍼라제); "INS" 플랭킹 격리자 구성요소; eHLA-G의 발현을 추진시키는 중국 햄스터 EF-1α 프로모터; EGFP의 발현을 추진시키는 PGK 프로모터; 및 5' 말단 반복부(TR) 전위 구성요소를 포함하는 증대된 HLA-G(eHLA-G) 전이유전자 발현 트랜스포손 벡터의 비제한적인 실시양태의 개략적 도시를 나타낸다. eHLA-G 전이유전자는 돌연변이 및/또는 HLA-G 단백질의 발현, 특히 세포 표면 발현을 증대시키는 비코딩 구성요소(예를 들어, 프로모터 또는 변형된 3' UTR 등)의 조합을 포함한다. 본원에 기재된 실험을 위해, eHLA-G 전이유전자는 상기 구성요소이고, 더 구체적으로 HLA-G의 ER 레트로바이러스 모티프(K334A/K335A)의 돌연변이; 및 2) HLA-G의 3' UTR 마이크로RNA 결합 부위의 돌연변이(여기서, 이 변형된 3' UTR은 서열 번호 3에 기재된 서열을 가짐)를 갖는 서열 번호 2에 기재된 인간 HLA-G 코딩 서열을 포함하였다. 추가의 설명에 대해 실시예 3을 참조한다.
도 2는 동시형질감염된 트랜스포손 발현 벡터의 게놈 통합을 추진하는 데 사용된 트랜스포사제 발현 보조 벡터의 비제한적인 실시양태의 개략적 도시를 나타낸다.
도 3은 eHLA-G 및 EGFP의 발현을 추진시키는 트랜스포손 발현 벡터에 의한 안정한 형질감염 후 다양한 시점에 인간 ES 세포 콜로니의 형광 현미경사진을 나타낸다.
도 4(상부 패널)는 EGFP 함유 발현 벡터에 의해 형질감염된 hES 세포의 시작 숫자와 형질감염 10일 후 세포 집단에서 검출된 EGFP+ 세포의 비율 사이의 관계를 도시한 막대 그래프를 나타낸다. x축의 숫자는 5 x 105개의 세포당 GFP+ 콜로니의 수이다. y축의 숫자는 세포수이다. (하부 패널)은 (상이한 프로모터를 사용하는) 다양한 트랜스포손 벡터와 세포 집단에서 검출된 EGFP+ 세포의 분획 사이의 관계를 도시한 막대 그래프를 나타낸다. x축의 숫자는 5 x 105개의 세포당 GFP+ 콜로니의 수이다. 하부 패널의 경우, 왼쪽으로부터 오른쪽으로: 대조군(con), GFP-퓨로(형질감염된 벡터의 크기는 7.3kb임); eHLA-G(MSCV)-GFP-퓨로(형질감염된 벡터의 크기는 8.6kb임); 및 eHLA-G(EF-1α)-GFP-퓨로(형질감염된 벡터의 크기는 9.2kb임). 추가의 eHLA-G(EF-1α)-GFP-퓨로 형질감염 효율 실험(비도시)을 수행하였고, 이는 형질감염 10일 후, 최고 효율(5 x 105개의 세포당 ~500개의 GFP+ 콜로니)을 10일 동안 퓨로마이신에 의한 선택 후의 솔루션 V 및 프로그램 B16에서 얻었다는 것을 나타낸다.
도 5는 HLA-G 발현의 HLA-G 변형된 인간 ES 세포에서의 발현 및 DAPI 염색(상부 이미지); Oct 3/4 및 DAPI(중간 이미지); 및 SSEA-4 및 DAPI(하부 이미지)를 보여주는 일련의 면역형광 현미경사진을 나타낸다.
도 6(상부 패널)은 eHLA-G-변형된 hES 세포의 집단에서 SSEA-4+/GFP+ 이중 양성 세포의 분포를 보여주는 유세포 분석법 산포도를 나타낸다. (하부 패널)은 eHLA-G-변형된 hES 세포의 집단에서 Oct 3/4+ 세포의 분포를 나타낸다. SSEA-4 및 Oct 3/4는 다능성 마커이다. 이 데이터는, 도 5와 함께, eHLA-G-변형된 hES 세포가 이의 특징적인 자가 재생 다능성 마커를 유지한다는 것을 나타낸다. 추가로, eHLA-G(EF-1α)-GFP-hESC는 생체내 이의 다능성 및 정상 핵형을 유지하였다. 인간화 NSG 마우스에 eHLA-G(EF-1α)-GFP-hESC를 피하로 주사하고, 기형종 형성이 관찰되었고, 이는 hESC가 감소된 면역원성 및/또는 증가된 면역억제를 나타내면서 주사된/이식된 세포가 거부되지 않는다는 것을 나타낸다. 기형종 세포의 핵형은 정상이었다.
도 7(상부 패널)은 15일에 야생형(왼쪽 사진) 및 eHLA-G 변형된 hESC 생성된(오른쪽 사진) 배양체(EB)의 위상차 현미경사진을 나타낸다. (하부 패널)은 상부 패널에 보여준 EB의 형광 현미경사진을 나타낸다. 야생형 hESC EB에서 GFP 신호가 검출되지 않은 반면, eHLA-G 변형된 hESC EB의 둘 다에서 강한 GFP 발현이 검출되었다. 이 데이터는 eHLA-G+ hESC가 EB 형성을 유지시킨다는 것을 나타낸다.
도 8은 eHLA-G+ hESC가 침묵화 저항이라는 것을 나타낸다. (상부 패널)은 eHLA-G 변형된 hESC 세포주에서 GFP의 발현에 대한 유세포 분석법 분포 히스토그램을 나타내고, 이는 6회 및 16회 계대배양 후 GFP의 유사한 강한 발현을 나타낸다. (하부 패널)은 동일한 hESC 세포주에서 HLA-G의 발현에 대한 유세포 분석법 분포 히스토그램을 나타내고, 이는 다시 6회 및 16회 계대배양 둘 다에서 eHLA-G 전이유전자의 지속적 발현을 나타낸다.
도 9a(상부 패널)는 야생형(왼쪽 히스토그램), GFP 변형된(중간 히스토그램), 및 eHLA-G(EF-1α)-GFP 변형된 hESC(오른쪽 히스토그램)에서 전체 (세포내) 발현 HLA-G에 대한 유세포 분석법 분포 히스토그램을 나타낸다. (하부 패널)은 야생형(왼쪽 히스토그램), GFP-변형된(중간 히스토그램), 및 eHLA-G(EF-1α)-GFP 변형된 hESC(오른쪽 히스토그램)에서 표면 발현 HLA-G에 대한 유세포 분석법 분포 히스토그램을 나타낸다. 도 9b(상부 패널)는 eHLA-G(MSCV)-GFP 변형된 hESC에서 전체 발현 HLA-G에 대한 유세포 분석법 분포 히스토그램을 나타낸다. 도 9b(하부 패널)는 eHLA-G(MSCV)-GFP 변형된 hESC의 표면 HLA-G 발현을 나타낸다. 이 데이터는 전이유전자가 MSCV 프로모터의 제어 하에 있을 때의 최소 발현과 비교하여 전이유전자가 EF-1α 프로모터에 작동적으로 연결될 때 HLA-G가 고도로 발현된다는 것을 나타낸다. HLA-G 전이유전자 발현이 프로모터 활성에 의해 상당히 영향을 받는다는 것을 나타내는 추가의 데이터에 대해 또한 도 15를 참조한다.
도 10은 HLA I형 및 II형의 발현이 야생형 및 eHLA-G+ hESC에서 유사하다는 것을 나타낸다. 표는 야생형 대 HLA-G 변형된 hESC에서 다양한 HLA 변이체 및 β2 마이크로글로불린의 발현 수준을 비교한다.
도 11은 NK92 세포독성 효과가 eHLA-G+ hESC에 의해 크게 억제된다는 것을 나타낸다. (추가의 설명에 대해 실시예 6을 참조한다.) 도면은 NK92 세포 세포독성 검정의 결과를 보여주는 막대 그래프를 나타낸다. 1:10 및 1:30 값은 표적 세포에 대한 이팩터(NK92)의 비율을 나타낸다(GFP 전이유전자는 단독으로 야생형 세포 또는 eHLA-G-GFP 전이유전자 변형된 세포를 제어한다). 이는 야생형 hESC(회색 막대; GFP)와 비교하여 eHLA-G 변형된 hESC(검정색 막대; eHLA-G-GFP)의 면역원성을 결정하기 위한 실험실내 검정이다. eHLA-G 변형된 hESC는 야생형 hESC에 대한 경우와 비교하여 NK92 세포의 존재 하에 실질적으로 감소된 세포독성을 나타낸다. NK92 세포의 존재 하의 감소된 세포독성이 이러한 유전자 변형된 세포가 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제를 갖는다는 것을 나타내므로, 이 데이터는 외인성 HLA-G 발현이 이러한 유전자 변형된 세포에 개선된 공여 역량을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 결과는 4회 실험의 평균이다. 추가의 설명을 위해 실시예 6을 참조한다.
도 12는 실험실내 배아 표피 전구세포(EEP)로의 hESC의 지시된 분화 동안 몇몇 다능성 마커 및 표피 전구세포 마커의 유전자 발현 수준의 시간 경과를 도시한 일련의 막대 그래프를 나타낸다. y축 값은 반정량적 RT-PCR에 의해 결정된 상대 mRNA 발현 수준이다. x축은 발현이 평가되는 일자이다. 추가의 설명을 위해 실시예 2를 참조한다. 도 12 데이터는 표피 분화 마커 K14, Tap63, 및 ΔNp63이 분화 동안 점차 증대된다는 것을 나타낸다. 본원에 도시되지 않은 데이터에서, K14 및 추가의 표피 마커 p63, CD29, 및 CD49f의 면역형광 연구를 수행하였다. 분화된 eHLA-G(EF-1a)-GFP hEEP는 면역형광에 의해 표시된 바대로 K14, p63, CD29, 및 CD49f 단백질 발현에 대해 양성이었다.
도 13(상부 패널)은 eHLA-G의 EF-1α 프로모터 추진된 발현에 의해 안정하게 형질감염된 hESC 세포주에서의 eHLA-G 전이유전자 발현의 시간 경과를 나타낸다. (하부 패널)은 GFP-변형된 hESC 세포주(음성 대조군), MSCV-프로모터 추진된 eHLA-G hESC 세포주, 및 EF-1α 추진된 eHLA-G hESC 세포주에서의 HLA-G(mRNA) 발현의 시간 경과(검정색 막대는 0일째를 나타내고; 수평 줄무늬 막대는 7일째를 나타내고; 회색 막대는 14일째를 나타냄)의 비교를 나타낸다. 더 높고 더 지속적인 수준의 eHLA-G 발현이 EF-1α 프로모터에 의해 추진된다는 것에 유의한다.
도 14(NK 세포의 세포독성 활성에 대한 K562-HLA-G1 14개의 염기쌍(bp) 삽입/결실 다형의 효과.) 도면은 야생형 K562 세포(회색 막대), 3' UTR에서 14개의 bp 삽입을 갖는 HLA-G 변이체를 발현하는 K562 세포(Ins14bp)(검정색 막대), 및 3' UTR에서 14개의 bp 결실을 갖는 HLA-G 변이체를 발현하는 K562 세포(Del14bp)(회색 막대)에 대해 NK 세포 중재 세포독성(특이적 용해(%))을 비교하는 막대 그래프를 나타낸다. 상이한 이팩터(NK 세포) 대 표적 세포(K562 세포) 비를 갖는 4개 세트의 데이터가 있다.
도 15는 HLA-G 전이유전자 발현이 프로모터 활성에 의해 상당히 영향을 받는다는 것을 나타내는 데이터를 제공한다. RT-PCR은 GFP 및 HLA-G 전사체 둘 다가 eHLA-G(EF-1α)-GFP-hESC 세포주에서 고도로 발현된다는 것을 나타낸다. 면역형광은 또한 GFP 및 HLA-G 단백질 둘 다가 HLA-G(EF-1α)-GFP-hESC 세포주에서 고도로 발현된다(본원에서 비도시)는 것을 나타낸다. 그러나, HLA-G 전사체 또는 단백질은 GFP 발현이 이 세포에서 높더라도, RT-PCR이든 또는 면역형광이든, HLA-G(pMSCV)-GFP-hESC 세포주에서 거의 검출되지 않았다(본원에서 데이터 비기재.) 따라서, EF-1α 프로모터는 HLA-G 전이유전자 발현의 소정 실시양태에서 바람직하다.
도 16. 정제된 hEEP는 위상차 현미경 검사에 의해 나타난 바대로 상동성 케라틴세포 형태를 나타냈다. eHLA-G-GFP-hEEP 클론 18 및 21은 실시예 2에 기재된 바대로 변형된 eHLA-G(EF-1α)-GFP-hESC로부터 분화되었다.
도 17. 분화된 hEEP에서의 HLA-G 전이유전자의 안정성은 유세포 분석법에 의해 확인되었다. HLA-G 전체 발현(상부 패널) 및 표면 발현(하부 패널) 둘 다는 외인성 HLA-G(GFP 오직 hEEP) 및 야생형 hEEP가 없는 대조군 세포와 비교하여 분화된 eHLA-G(EF-1a)-GFP-hEEP(90% 초과의 세포)에 튼튼하다.
도 18. 도 11의 결과는 반복되고 추가의 NK 세포독성 실험에서 확인되었다. 공지된 바대로, eHLA-G(EF-1α)-GFP-hESC의 사멸은 GFP 전이유전자를 오직 포함하는 대조군 hESC (HLA-G 전이유전자 없음)와 비교하여 100% 초과 감소하였다. (주의: 본원에서 사용된 바대로, "mHLA-G(EF-1α)-GFP" 전이유전자는 "eHLA-G(EF-1α)-GFP"와 동의어이다.) 이 데이터는 HLA-G 전이유전자 발현이 hESC에서 면역억제 및/또는 감소된 면역원성 특징을 부여한다는 것을 나타낸다. 추가의 설명에 대해 실시예 6을 참조한다.
도 19. hESC로부터 분화된 hEEP에서 NK 세포독성 실험을 수행하였다. 도시된 바대로, eHLA(EF-1α)-GFP-hEEP의 사멸은 대조군 hEEP와 비교하여 100% 훨씬 초과(약 3배)로 감소하였다. 이 데이터는 HLA-G 전이유전자 발현이 분화된 세포에서 면역억제 및/또는 감소된 면역원성 특징을 부여한다는 것을 나타내고, 또한 eHLA-G 전이유전자를 통한 HLA-G 발현의 이 증대된 기능적 면역 회피 특징이 지시된 분화 과정에 생존하였다는 것을 나타낸다. 추가의 설명에 대해 실시예 6을 참조한다.
도 20은 인간화 마우스에서의 hESC 이형이식의 결과를 나타낸다. "G0" hESC는 eHLA-G 전이유전자를 포함하지 않지만, 오히려 오직 GFP를 포함하는 대조군 야생형 hESC이다. "mG1(#1)" 및 "mG1(#2)"은 2개의 상이한 eHLA-G(EF-1α)-GFP 뉴클레오펙션된 hESC 클론을 의미한다. 도시된 G0, mG1(#1) 및 mG1(#2) 종양을 측정하고 칭량하였다. G0 hESC는 126.9 입방 밀리미터의 용적 및 32밀리그램의 중량을 갖는 종양을 형성하였다. mG1(#1) hESC는 748.4 입방 밀리미터의 용적 및 318밀리그램의 중량을 갖는 종양을 형성하였다. mG1(#2) hESC는 1116.7 입방 밀리미터의 용적 및 675밀리그램의 중량을 갖는 종양을 형성하였다. 추가의 설명에 대해 실시예 7을 참조한다.
도 21은 5마리의 인간화 NSG 마우스에 대한 hESC 이형이식으로부터의 종양의 평균 결과를 나타낸다. 상부 패널은 종양 중량(㎎) 결과를 나타낸다. 하부 패널은 종양 용적(입방 밀리미터) 결과를 나타낸다. 데이터는 HLA-G 뉴클레오펙션된 hESC("mG1")가 인간화 NSG 마우스로 이식된 야생형 hESC("G0")보다 훨씬 더 크고(3배 초과의 용적) 더 무거운(2배 초과의 중량) 종양을 형성한다는 것을 나타낸다. 이는 HLA-G 전이유전자 발현이 이형이식 인간 환경(즉, NSG 인간화 마우스)에서 감소된 면역원성 및/또는 증가된 면역억제를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 이 데이터는, NK92 세포독성 연구와 함께, 치료, 이식, 조직 회복, 세포 및 조직 대체 등을 위한 보편적 또는 더 우수한 동종이계 공여로의 임의의 원하는 세포 유형을 변형하기 위한 본원에 기재된 eHLA-G 전이유전자 작제물의 일반 적용을 지지한다. 추가의 설명에 대해 실시예 7을 참조한다.
도 22. eHLA-G(EF-1α)-GFP 전이유전자에 의해 안정하게 형질감염된 인간 진피 섬유아세포("HFD-m1-GFP" 세포) 또는 GFP 단독 대조군 작제물("HFD-G0-GFP" 세포)을 PBMC 증식을 저해하는 이의 능력에 대해 평가하였다. 도시된 바대로, HFD-mG1-GFP 클론 "mG1-R1"은 대조군 및 다른 클론보다 크게 PBMC 증식을 억제하였고, 이는 외인성 HLA-G 발현이 분화된 세포, 예컨대 섬유아세포에 대해 면역억제를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. HFD-m1-GFP 및 대조군에 의한 NK-92 세포독성 연구의 요약을 포함하는 추가의 설명에 대해 실시예 9를 참조하고, 이 요약에서는 인간 진피 섬유아세포에 대한 eHLA-G 변형이 이의 면역원성을 감소시킨다는 것을 나타낸다. 따라서, 이 데이터는 치료, 이식, 조직 회복, 세포 및 조직 대체 등을 위한 보편적 또는 더 우수한 동종이계 공여로의 임의의 원하는 세포 유형(다능성, 다분화능 또는 완전 분화이든)을 변형하기 위한 본원에 기재된 eHLA-G 전이유전자 작제물의 용도를 추가로 지지한다.
본 개시내용은 외인성 HLA-G(HLA-G 변형된 세포)를 지속적으로 발현하는 유전자 변형된 포유동물 세포, 및 이러한 변형된 포유동물 세포를 생성하는 핵산 조성물을 특징으로 하는. 본원에 기재된 eHLA-G 유전자 변형은 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제의 특징을 세포에 제공하여, 이 세포는 장기이식, 세포 및 조직 재생 또는 복원, 및 다른 치료에 대한 보편적 또는 개선된 공여 세포가 될 가능성을 갖는다.
I. 조성물 :
A. 외인성 HLA -G를 발현하는 유전자 변형된 포유동물 세포
본원에 기재된 바대로, 외인성 HLA-G(HLA-G 변형된 세포)를 발현하는 광범위한 포유동물 세포 유형이 생성될 수 있다. 이러한 세포 유형은 전능성 세포, 배아 줄기 세포(예를 들어, 인간 배아 줄기 세포), 유도 다능성 줄기 세포(예를 들어, 인간 유도 다능성 줄기 세포), 다분화능 줄기 세포, 표피 전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 췌장 β 세포 전구자, 췌장 β 세포, 심장 전구자, 심근세포, 간 전구자, 간세포, 근육 세포 전구자, 근육 세포, 신장 세포, 조골세포, 조혈 전구자, 치낭 세포, 모공 세포, 망막 색소 상피 세포, 신경 줄기 세포, 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포, 내이 세포, 및 섬유아세포(인간 진피 섬유아세포(HFD)를 포함)를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 몇몇 실시양태에서, HLA-G 변형된 세포는 면역계 세포 유형을 갖는 세포가 아니다. 이러한 포유동물 세포는, 예를 들어, 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 또는 돼지를 포함하는 몇몇 종 중 하나로부터 유래할 수 있다. 본질적으로, 임의의 세포 유형은 본원에 기재된 작제물로 형질감염되고 이후 HLA-G 발현 및 이러한 발현이 어떻게 변형된 세포에 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제를 부여할 수 있는지에 대해 시험될 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 원하는 세포 유형의 HLA-G 변형된 세포의 실질적으로 풍부한 집단을 얻기 위해, HLA-G를 발현하는, 유전자 변형된 다능성 줄기 세포주, 예컨대 인간 배아 줄기 세포주, 또는 인간 유도 다능성 줄기 세포주, 또는 중간엽 줄기 세포 및 면역계 전구 세포를 포함하는 다분화능 특질을 갖는 임의의 세포주를 생성하고 이후 지시된 분화로 처리하여 HLA-G를 발현하고 원하는 세포 유형이 실질적으로 풍부한 세포 집단을 얻는다. 몇몇 실시양태에서, 실질적으로 풍부한 세포 집단은 적어도 약 2% 내지 약 100%의 원하는 세포 유형, 예를 들어, 적어도 약 3%, 4%, 5%, 7%, 8%, 10%, 20%, 22%, 25%, 35%, 40%, 45%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 또는 적어도 약 2% 내지 약 100%의 다른 백분율의 원하는 세포 유형을 포함한다. 원하는 세포 유형의 세포를 풍부하게 하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 제12/532,512호를 참조한다.
인간 배아 줄기 세포 또는 유도 다능성 줄기 세포를 얻는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제6,200,806 및 제7,217,569호(인간 배아 줄기 세포 유도의 경우) 및 제8,048,999호, 제8,058,065호, 및 제8,048,675호(인간 유도 다능성 줄기 세포의 생성의 경우)에 기재된 바대로 당해 분야에 공지되어 있다.
본원에 기재된 핵산 중 하나에 의해 코딩된 HLA-G 단백질을 안정하게 발현하는, 유전자 변형된 포유동물 다능성 또는 다분화능 줄기 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 유도 다능성 줄기 세포 등 및 또한 완전 분화된 유전자 변형된 포유동물은 당해 분야에 공지된 다수의 방법에 의해 생성된다. 몇몇 실시양태에서, 세포주는 본원에 기재된 HLA-G 단백질의 발현을 위한 발현 카세트, 선택 마커, 및 임의로 리포터 단백질을 포함하는 하나 이상의 핵산 발현 벡터(예를 들어, 플라스미드 벡터 또는 미니서클 벡터)에 의한 안정한 형질감염에 의해 유전자 변형된다. 이러한 벡터에 의해 코딩된 적합한 선택 마커의 예는 선택 물질에 내성을 부여하는 단백질을 포함한다. 이러한 단백질 및 이것의 상응하는 선택 물질은, 제한 없이, 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제(퓨로마이신), 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(하이그로마이신), 블라스티시딘-S-데아미나제(블라스티시딘), 및 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(네오마이신)를 포함한다. 적절한 선택 물질에 의한 선택은 내성 콜로니가 나타날 때까지 적어도 약 3일 내지 약 14일, 예를 들어, 약 4일, 5일, 6일, 7일, 8일, 9일, 10일, 12일, 13일, 또는 약 3일 내지 약 14일의 다른 기간 동안 지속할 수 있다.
적합한 형광 리포터 단백질의 예는 EGFP 및 이것의 변이체, 예컨대 YFP, 시안(Cyan), 및 dEGFP; DS-레드(Red), 단량체 오렌지(Orange), 근적외선 형광 단백질 "카투스카(Katushka)"(Shcherbo et al (2007), Nat Methods, 4:741-746), 또는 임의의 상기의 변이체를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 다른 실시양태에서, 리포터는 각각 형광성 또는 발광성 기질의 존재 하에 이 과정에서 검출 가능한 신호, 예를 들어, 형광 또는 발광 신호를 생성하는 기질을 전환시키는 효소이다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, 선택 마커 효소는 루시퍼라제, 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제, 방아벌레 루시퍼라제, 또는 레닐라 루시퍼라제의 아미노산 서열을 포함한다. 루시퍼라제 활성은 적절한 발광성 기질, 예를 들어, 반딧불이 루시퍼라제에 대한 반딧불이 루시퍼린 또는 레닐라 루시퍼라제에 대한 코엘렌테라진(coelenterazine)을 제공함으로써 검출될 수 있다. 적절한 기질의 존재 하의 루시퍼라제 활성은 발광법에 의해 배양 접시 웰에서 전체 세포 집단의 검정 전체 루시퍼라제 활성으로 정량화될 수 있거나, 대안적으로, 개개의 세포 또는 콜로니의 루시퍼라제 활성은 현미경을 광자 계측 카메라와 함께 사용하여 검출될 수 있다. 고속 방법을 포함하는 루시퍼라제 검정의 상세내용은 예를 들어 미국 특허 제5,650,135호, 제5,744,320호, 및 제6,982,431호에 개시되어 있다. 다른 실시양태에서, 리포터 효소는 변형된 베타-락타마제의 아미노산 서열을 포함하고, 이의 발현은 예를 들어, 미국 특허 제5,741,657호, 제6,031,094호, 및 미국 특허 공보 제20070184513호에 기재된 형광원 베타.-락탐 기질의 분해에 대한 비율계량 형광 검정에 의해 살아있는 세포에서 검출되고 정량화될 수 있다. 또한 검토를 위해 문헌[Qureshi (2007), Biotechniques, 42(1):91-96]을 참조한다. 다른 적합한 리포터 효소는 할로-태그(Halo-Tag)® 하이드롤라제(Promega(위스콘신주 매디슨), 예를 들어, 미국 특허 제7,238,842호 및 특허 공보 제20080026407호 및 제20080145882호에 기재됨) 및 베타.-갈락토시다제를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 실시양태에서, 유전자 변형된 포유동물 세포는 또한 인간 β2 마이크로글로불린(젠뱅크 수탁 번호 AY187687.1)을 발현하도록 유전자 변형된다. 이론에 매이고자 원하지 않으면서, 인간 β2 마이크로글로불린의 발현이 유전자 변형된 포유동물 세포에서 형질전환 HLA-G의 표면 발현을 증대시킬 것이라고 생각된다.
몇몇 실시양태에서, 핵산 발현 벡터는, 예를 들어 미국 특허 출원 제12/728,943호에 기재된 바대로, 동족 트랜스포사제(예를 들어, piggyBAC 트랜스포사제)의 존재 하에 호스트 세포로 도입될 때 호스트 게놈으로의 트랜스포손 벡터의 전위의 통합을 촉진하는 전위 구성요소를 포함하는 트랜스포손 벡터이다. 트랜스포손 발현 벡터(예를 들어, PiggyBac 벡터), 및 트랜스포사제 발현 벡터는 예를 들어 시스템 바이오사이언시스(System Biosciences)(캘리포니아주 마운틴 뷰)로부터 상업적으로 구입 가능하다. 트랜스포손 벡터가 사용되는 몇몇 실시양태에서, 이러한 벡터에 의한 형질감염의 효율이 선택 마커의 필요를 제거하기에 충분히 높으므로, 안정하게 형질감염된, HLA-G 변형된 세포주를 생성하는 데 선택 마커 또는 리포터 단백질 발현 카세트가 필요하지 않다. 대안적으로, 발현 벡터는 호스트 세포 게놈에서 eHLA-G 전이유전자의 부위 특이적 통합을 허용하는 표적화 벡터일 수 있다. 표적화 벡터의 설계 및 사용은 미국 특허 제5,464,764호에 예시된 바대로 당해 분야에서 일상적이다.
형질감염 등급 핵산 발현 벡터의 제조 방법 및 형질감염 방법을 훌륭히 확립되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook and Russell (2001), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," 3rd ed, (CSHL Press); 및 Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (2005), 9.1-9.14]을 참조한다. 고효율 형질감염 효율 방법의 예는, 예를 들어, 문헌[Trompeter (2003), J Immunol. Methods, 274(1-2):245-256] 및 미국 특허 제7,332,332호, 제8,003,389호; 제8,039,259호 및 제8,192,990 9호에 기재된 "뉴클레오펙션", 지질 기반 형질감염 시약, 예컨대 퓨겐(Fugene)®(로슈), DOTAP, 및 리포펙타민(Lipofectamine)™(인비트로겐)에 의한 형질감염을 포함한다.
다른 실시양태에서, 유전자 변형된 세포, 예를 들어, 분화된, 다분화능, 다능성, 또는 전능성 줄기 세포주는 재조합 바이러스에 의한 형질도입에 의해 생성된다. 적합한 재조합 바이러스의 예는 레트로바이러스(렌티바이러스를 포함); 아데노바이러스; 및 아데노 연관 바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 대개, 재조합 레트로바이러스는 쥐과 몰로니 백혈병 바이러스(murine moloney leukemia virus: MMLV)이지만, 다른 재조합 레트로바이러스, 예를 들어, 조류 백혈증 바이러스, 소과 백혈병 바이러스, 쥐과 백혈병 바이러스(Murine Leukemia Virus: MLV), 밍크 세포 초점 형성 바이러스, 쥐과 육종 바이러스, 세포내피증 바이러스, 긴팔원숭이(Gibbon Ape) 백혈병 바이러스, 메이슨 화이저 원숭이 바이러스, 또는 라우스 육종 바이러스를 또한 사용할 수 있고, 예를 들어, 미국 특허 제6,333,195호를 참조한다.
다른 경우에, 재조합 레트로바이러스는 렌티바이러스(예를 들어, 인간 면역결핍 바이러스-1(HIV-1); 유인원 면역결핍 바이러스(SIV); 또는 고양이과 면역결핍 바이러스(FIV))이고, 예를 들어, 문헌[Johnston et al., (1999), Journal of Virology, 73(6):4991-5000 (FIV); Negre et al., (2002), Current Topics in Microbiology and Immunology, 261:53-74 (SIV); Naldini et al., (1996), Science, 272:263-267 (HIV)]을 참조한다.
재조합 레트로바이러스는 표적 세포로의 진입을 보조하기 위한 바이러스 폴리펩타이드(예를 들어, 레트로바이러스 env)를 포함할 수 있다. 이러한 바이러스 폴리펩타이드는 당해 분야에 널리 확립되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 제5,449,614호를 참조한다. 바이러스 폴리펩타이드는 원래 호스트 종의 외부의 세포를 포함하는 다수의 종으로부터 유래한 세포로의 진입을 보조하는 엠포트로픽(amphotropic) 바이러스 폴리펩타이드, 예를 들어, 엠포트로픽 env일 수 있다. 예를 들어, 상기 참조. 바이러스 폴리펩타이드는 원래 호스트 종의 외부의 세포로의 진입을 보조하는 이종지향성(xenotropic) 바이러스 폴리펩타이드일 수 있다. 예를 들어, 상기 참조. 몇몇 실시양태에서, 바이러스 폴리펩타이드는 원래 호스트 종의 세포로의 진입을 보조하는 동종지향성(ecotropic) 바이러스 폴리펩타이드, 예를 들어, 동종지향성 env이다. 예를 들어, 상기 참조.
세포의 바이러스 형질도입을 당해 분야에 공지된 임의의 방법에 의해 달성할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Palsson, B., et al., (1995), WO95/10619; Morling, F. J. et al., (1995), Gene Therapy, 2:504-508; Gopp et al., (2006), Methods Enzymol, 420:64-81]을 참조한다. 예를 들어, 세포에 대한 바이러스의 첨가 후 가까운 기간 동안 세포를 원심분리하는 것을 수반하는 스핀 감염 또는 "스핀 접종" 방법에 의해 감염을 달성할 수 있다. 몇몇 경우에, 바이러스는 감염 전에, 예를 들어, 초원심분리에 의해 농축될 수 있다.
유전자 변형하고자 하는 세포를 형질도입하기 위해 이용되는 감염 다중도(m.o.i.)는 약 1 m.o.i. 내지 약 50 m.o.i., 예를 들어, 약 1 m.o.i., 약 5 m.o.i., 약 7.5; m.o.i., 약 10 m.o.i., 약 15 m.o.i., 약 20 m.o.i., 약 30 m.o.i., 약 40 m.o.i., 또는 약 50 m.o.i. 범위일 수 있다.
지시된 분화에 의해 다능성 줄기 세포(예를 들어, 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 유도 다능성 줄기 세포)로부터 다양한 세포 유형을 생성하는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제7,955,849호, 제7,763,466호, 제7,264,968호; 및 미국 특허 출원 제12/179,462호, 및 제12/187,543호에 기재된 바대로 당해 분야에 공지되어 있다.
예시적인 일 실시양태에서, 인간 배아 표피 전구세포(hEEP)는 하기한 바대로 인간 다능성 줄기 세포주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 유도 다능성 줄기 세포로부터 유래한다.
다능성 줄기 세포를 20%의 넉아웃 혈청 대체물, 0.1mM MEM 비필수 아미노산, 1mM 글루타맥스(GlutaMax), 0.1mM β-머캅토에탄올(Sigma)로 보충된 DMEM/F12(1:1)를 포함하는 배아 줄기 세포(ESC) 성장 배지에서 유지하였다. 5 x 104개의 세포/㎠의 밀도로 유사분열로 불활화된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)(CF-1, ATCC)를 평판배양하고 18-24시간 동안 항온처리하여 ESC 성장 배지를 컨디셔닝한다. 컨디셔닝 후, 4ng/㎖의 bFGF를 첨가하고, 완전한 순화 배지를 무균 여과시킨다. hESC를 1㎎/㎖의 디스파제(Dispase)를 사용하여 마트리겔(Matrigel)®(BD Biosciences) 코팅된 플레이트에서 매 5-6일 동안 (1:3 또는 1:4 분할로) 계대배양하여 세포 콜로니를 제거한다. ESC 성장 배지에서 4일 동안 6웰 플레이트에서 다능성 줄기 세포를 처음에 배양하고 이후 1μM 올-트랜스 레티노산(Sigma) 및 25ng/㎖의 BMP4를 포함하는 비순화 hESC 성장 배지로 이루어진 2㎖/웰의 분화 배지에 걸쳐 변화시킴으로써, K14+/p63+ hEEP로의 다능성 줄기 세포의 hEEP 분화. 7일 동안 매일 배지 변경 후, 세포를 디스파제로 처리하고 원심분리하고 제한된 케라틴세포 혈청 비함유 배지(DSFM)에서 재현탁시키고 1:3의 분할비로 젤라틴 코팅된 플레이트에 시딩한다. DSFM은 3-4주 동안 격일로 변화될 것이다. 이후, 세포를 트립신처리(trypsinization)를 이용하여 계대배양하고 원심분리하고 세척하고 DSFM에서 젤라틴 코팅된 조직 배양 플레이트에 1㎠당 10,000개의 세포로 평판배양한다. 상피 단층이 90% 이상의 순도이고 K14를 발현하는지를 검증하기 위해, 세포를 문헌[Metallo et al (2010), Methods Mol Biol 585:83-92]의 방법에 따라 유세포 분석법으로 처리한다. 단리된 hEEP의 순도를 증대시키기 위해, 세포를 CD29 항체에 의한 자기 활성화 세포 분류(MASC)를 이용하여 분류한다. eHLA-G(EF-1α)-GFP 변형된 hESC로부터 세포 분화된 CD29 MASC 분류된 hEEP 세포 배양물 중 약 92%는 특이적 케라틴세포 마커인 K14에 양성이었다.
본원에 기재된 바대로 형질전환 eHLA-G를 발현하는 유전자 변형된 포유동물 세포는 HLA-G를 발현하지 않는 상응하는 포유동물 세포에 비해 감소된 면역원성을 갖는다. 예를 들어, 면역원성은 외인성 HLA-G를 발현하지 않는 상응하는 세포 유형에 비해 적어도 약 5% 내지 약 95%, 예를 들어, 약 6%, 7%, 10%, 12%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 65%, 70%, 80%, 85%, 90% 감소할 수 있거나, 면역원성은 외인성 HLA-G를 발현하지 않는 동일한 세포 유형의 세포에 비해 다른 퍼센트로 감소할 수 있다.
세포의 면역원성을 결정하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 몇몇 실시양태에서, HLA-G 변형된 포유동물 세포(예를 들어, 인간 배아 줄기 세포, 또는 HLA-G 변형된 배아 줄기 세포로부터 분화된 세포, 또는 변형 전에 이미 완전 분화된 세포 등) 또는 비변형된 포유동물 세포를 동종이계 자연 살해 세포주(예를 들어, NK-92)의 존재 하에 배양하고, 이후 NK-92 세포에 의해 유도되는 비변형된 세포에 대한 HLA-G 변형된 세포에 대한 세포독성은 임의의 다수의 표준 세포 생육 검정에 의해 결정된다.
증대된 HLA -G( eHLA -G) 전이유전자를 포함하는 핵산
본원에 기재된 HLA-변형된 포유동물 세포를 생성하기 위해 사용되는 단리된 핵산(예를 들어, 포유동물 플라스미드 발현 벡터)은 야생형 HLA-G 전이유전자에 의해 추진된 세포 표면 발현에 비해 증가된 세포 표면 발현 및/또는 HLA-G의 분비를 추진시키는 증대된 HLA-G "eHLA-G" 전이유전자를 포함한다. 이러한 전이유전자는 전형적으로 적어도 3개의 명확한 성분: 프로모터 및 5' 비번역 구역(5' UTR) 서열; 코딩 서열; 및 3' 비번역 구역(3' UTR) 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, eHLA-G 전이유전자 발현을 추진하기 위해 사용되는 프로모터는 적어도 약 7주 내지 약 50주, 예를 들어, 8주, 9주, 10주, 12주, 15주, 20주, 25주, 30주, 35주, 40주, 42주, 45주, 47주, 48주의 기간, 또는 적어도 약 7주 내지 약 50주의 다른 기간 동안 관심 있는 세포 유형에서 eHLA-G 전이유전자의 발현을 추진시킬 수 있는 것이다. 이러한 연장 기간 동안 발현을 추진할 수 있는 프로모터는, 예를 들어, 줄기 세포 예컨대 배아 줄기 세포, 유도 다능성 줄기 세포, 또는 중간엽 줄기 세포를 포함하는 다수의 세포 유형에서 발생하는 침묵화를 회피하는 데 효과적이다.
적합한 침묵화 저항 프로모터는 중국 햄스터 연장 인자-1 알파(CHEF-1α) 프로모터(문헌[Running Deer et al (2004), Biotechnol. Prog., 20:880-889] 참조; 및 젠뱅크 수탁 번호 AY188393.1), 쥐과 줄기 세포 바이러스(MSCV) 프로모터의 M-U3/R-변이체 프로모터(문헌[Swindle et al (2004), J Biol Chem, 279:34-41]에 기재된 바와 같음), 포스포글리세레이트 키나제(PGK) 프로모터, 인간 β-액틴 프로모터, 및 유비퀴틴 C 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
몇몇 실시양태에서, eHLA-G 전이유전자의 발현을 추진하기 위해 사용되는 프로모터는 하나 이상의 원하는 세포 유형에서 다른 세포 유형에서보다 높은 수준으로 발현된다. 당해 분야의 당업자는, 예를 들어, HLA-G 변형된 줄기가 특정한 세포 유형으로 분화되는 경우, 그 특정한 세포 유형 내에 활성이거나 심지어 이에 대해 선택적인 프로모터를 선택하는 것이 유리할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들어, 소정의 조직 또는 세포 유형 선택적 프로모터의 경우, 발현 수준은 다른 세포 유형과 비교하여 원하는 세포 유형에서 약 2배 내지 100배, 예를 들어, 약 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 25배, 30배, 40배, 50배, 70배, 80배, 90배 높거나, 다른 세포 유형과 비교하여 원하는 세포 유형에서의 발현 수준보다 다른 배수로 높을 수 있다. 조직 및/또는 세포 유형 선택적 프로모터의 예는 뉴런 특이적 에놀라제(뉴런성), 시냅신(뉴런성), CamKII(전뇌 뉴런), HB9(운동 뉴런), 및 도파민 트랜스포터(도파민 작동성 뉴런); 신경교 섬유질 산성 단백질(성상교세포); 알부민(간); α-미오신 중쇄(αMHC-심근세포); 뉴로제닌 3 및 췌장-십이지장 호메오박스 1(췌장); 케라틴 14(피부); 및 베스트로핀1(망막 색소 상피)에 대한 프로모터를 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다.
전형적으로, eHLA-G 전이유전자 서열은 인간(젠뱅크 번호 NP_002118.1), 또는 침팬치 공통 서열에 비해 적어도 1개 내지 약 10개의 점 돌연변이 , 예를 들어, 상기 언급된 HLA-G 단백질 공통 서열에 비해 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개의 점 돌연변이를 포함하는 HLA-G 단백질을 코딩한다.
인간 공통 야생형 서열(서열 번호 1)은 하기와 같다:
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSS LPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWRKKSSD
몇몇 실시양태에서, 적어도 1개 내지 약 10개의 점 돌연변이는 단백질의 처리 및 성숙 동안 소포체에서의 HLA-G의 보유를 감소시킴으로써 발현하는 호스트 세포의 세포 표면에서의 HLA-G 단백질의 발현 수준을 증가시킨다. 이러한 돌연변이는 예를 들어 HLA-G "KK" 모티프 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 문헌[Park et al (2001), Immunity, 15:213-224]을 참조한다. 몇몇 경우에, KK 모티프 돌연변이는 K334A 돌연변이, K335A 돌연변이, 또는 치환 돌연변이 둘 다를 포함한다. 다른 경우에, 치환은 상이한 지방족 아미노산(예를 들어, 루신) 또는 비염기성인 아미노산의 유형의 다른 유형으로 이루어질 수 있다.
일 예에서, 코딩된 HLA-G 단백질은 야생형 서열에 비해, K334A 및 K335A 치환이 도입(밑줄)된 (서열 번호 2)의 아미노산 서열을 갖는다:
MVVMAPRTLFLLLSGALTLTETWAGSHSMRYFSAAVSRPGRGEPRFIAMGYVDDTQFVRFDSDSACPRMEPRAPWVEQEGPEYWEEETRNTKAHAQTDRMNLQTLRGYYNQSEASSHTLQWMIGCDLGSDGRLLRGYEQYAYDGKDYLALNEDLRSWTAADTAAQISKRKCEAANVAEQRRAYLEGTCVEWLHRYLENGKEMLQRADPPKTHVTHHPVFDYEATLRCWALGFYPAEIILTWQRDGEDQTQDVELVETRPAGDGTFQKWAAVVVPSGEEQRYTCHVQHEGLPEPLMLRWKQSS LPTIPIMGIVAGLVVLAAVVTGAAVAAVLWR AA SSD
몇몇 실시양태에서, eHLA-G 전이유전자는 아미노산 서열이 서열 번호 2와 적어도 75% 내지 100% 동일한, 예를 들어, 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 서열 번호 2의 아미노산 서열과 다른 퍼센트로 동일한 HLA-G 단백질을 코딩한다.
본원에 개시된 eHLA-G 전이유전자는 또한 HLA-G 전사체의 발현/번역 효율에 영향을 미치는 다수의 조절 구성요소를 포함하는 3' 비번역된(3' UTR) 구역을 포함한다. 몇몇 실시양태에서, eHLA-G 전이유전자 3' UTR 서열은 (서열 번호 3)의 서열과 적어도 75% 동일한 , 예를 들어, 적어도 77%, 80%, 82%, 85%, 87%, 88%, 90%, 92%, 94%, 95%, 96%, 97%, 또는 HLA-G 3' UTR(서열 번호 3)의 서열과 다른 퍼센트로 동일한 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열이다:
TGTGAAACAGCTGCCCTGTGTGGGACTGAGTGGCAAGTCCCTTTGTGACTTCAAGAACCCTGACTTCTCTTTGTGCAGAGACCAGCCCA A CCCTGTGCCCACCATGACCCTCTTCCTCATGCTGAACTGCATTCCTTCCCCAATCACCTTTCCTGTTCCAGAAAAGGGGCTGGGATGTCTCCGTCTCTGTCTCAAATTTGTGGTCCACTGAGCTATAACTTACTT CTGTATTAAAATTAGAATCTGAGT G
이러한 서열은 전이유전자 코딩된 HLA-G의 발현을 증가시키는 2개의 마이크로RNA 결합 부위의 결합을 감소시키는 돌연변이(밑줄)를 포함한다. 이 서열은 일부 HLA-G 대립유전자의 엑손 8에 존재하는 14개의 염기쌍 서열의 결실을 포함한다. 이 14개의 염기쌍 서열은 서열 번호 4로서 하기 기재되어 있다:
서열 번호 4: HLA 3' UTR 에서의 14 bp 삽입 서열
ATTTGTTCATGCCT
하기 기재된 서열 번호 5는 이 14개의 염기쌍 서열(소문자)의 삽입을 갖는 서열 번호 3에 상응한다:
서열 번호 5(+14 BP HLA -G 3' UTR 변이체 )
TGTGAAACAGCTGCCCTGTGTGGGACTGAGTGGCAAGatttgttcatgcctTCCCTTTGTGACTTCAAGAACCCTGACTTCTCTTTGTGCAGAGACCAGCCCA A CCCTGTGCCCACCATGACCCTCTTCCTCATGCTGAACTGCATTCCTTCCCCAATCACCTTTCCTGTTCCAGAAAAGGGGCTGGGATGTCTCCGTCTCTGTCTCAAATTTGTGGTCCACTGAGCTATAACTTACTTCTGTATTAAAATTAGAATCTG AGT G
3' UTR을 갖는 HLA-G 대립유전자는 상기 언급된 14개의 염기 삽입을 포함하여(서열 번호 4 참조), 더 안정한 HLA-G mRNA 전사체를 생성하는 것으로 보고되었다. 문헌[Rouseau et al (2003), Human Immunology, 64:1005-1010]을 참조한다. 놀랍게도, 본 개시내용의 몇몇 실시양태에 대한 하나의 기초로서, 14개의 염기쌍 결실(서열 번호 3에 기재됨)을 갖는 대립유전자의 발현이 14개의 염기 삽입을 포함하는 대립유전자보다 더 면역보호성인 것으로 보인다는 것이 예상치 못하게 발견되었다. 도 13을 참조한다. 이론에 매이고자 원하지 않으면서, HLA-G의 발현 수준에 대한 14 bp 결실의 효과가 세포 유형 특이적일 수 있고, 예를 들어, 14 bp 결실이 적어도 hESC, hEEP, 및 인간 진피 섬유아세포세포를 포함하는 인간 세포에서 eHLA-G의 발현을 명확히 증대시키는 것으로 생각된다.
몇몇 실시양태에서, eHLA-G 전이유전자를 포함하는 핵산 서열은 또한 eHLA-G 발현 카세트를 플랭킹하는 절연인자 서열을 포함한다. 절연인자 서열은 통합된 외인성 발현 카세트의 발현에 부정하게 영향을 미치는 게놈 위치 효과를 완화시킨다. 몇몇 실시양태에서, 사용되는 절연인자 서열은 닭 β-글로불린 HS4 코어 절연인자 서열을 포함한다.
몇몇 실시양태에서, eHLA-G 전이유전자를 포함하는 핵산은 또한 본원에 기재된 선택 마커를 포함할 것이다. 임의로, eHLA-G 전이유전자를 포함하는 단리된 핵산은 본원에 기재된 리포터 단백질을 추가로 포함할 수 있다.
몇몇 실시양태에서, eHLA-G-변형된 세포주의 생성은 eHLA-G 발현 카세트를 포함하지만, 선택 마커 또는 리포터 단백질에 대한 발현 카세트를 포함하지 않는 트랜스포손 벡터의 사용에 의해 생성된다. 벡터는 트랜스포사제 발현 벡터와 함께 변형하고자 하는 세포로 도입된 후, 한계 희석 클로닝된다. 형질감염된 세포의 집단이 매우 효과적으로 변형되므로, 선택 마커 또는 리포터 단백질을 사용하고자 하는 필요가 회피될 수 있다. 이는 특히 인간 환자에서 세포 치료의 문맥에서 사용하고자 하는 세포의 경우 중요한 고려사항이다. 트랜스포손 기반 안정한 형질감염 방법에 의해 성공적으로 변형된 세포의 백분율은 약 0.5% 내지 약 50%, 예를 들어, 1%, 2%, 3%, 5%, 7%, 8%, 15%, 20%, 22%, 30%, 40%의 범위, 또는 형질감염된 세포의 약 0.5% 내지 약 50%의 다른 백분율일 수 있다.
몇몇 실시양태에서, 2개 이상의 단백질을 코딩하는 핵산에 의해 코딩된 단백질의 발현은 별개의 프로모터에 의해 추진된다. 다른 실시양태에서, 폴리시스트론 발현 카세트는 폴리시스트론 발현 카세트에 편입된 오픈 리딩 프레임 사이에 하나 이상의 내부 리보솜 진입 부위(IRES) 서열을 편입할 수 있다. IRES 서열 및 이의 용도는 예를 들어 문헌[Martinez-Salas (1999), Curr Opin Biotechnol, 10(5):458-464]에 예시된 바대로 당해 분야에 공지되어 있다. 대안적으로, 다수의 오픈 리딩 프레임은 구제역 바이러스(F2A)의 개재하는 2A 펩타이드 서열 또는 다른 바이러스로부터의 2A 유사 서열에 의해 서로에 연결될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Hasegawa et al (2007), Stem Cells, 25:1707-1712 및 Symczak et al (2004), Nat Biotechnol, 589-594]을 참조한다. 2A 펩타이드 서열의 포함은 eHLA-G 및 다른 서열(예를 들어, 리포터 단백질 서열 또는 선택 마커 단백질 서열)을 포함하는 인접 폴리펩타이드의 별개의 단백질로의 번역 후 개열을 허용한다.
비교적 짧은 아미노산 또는 핵산 서열 사이의 식별이 육안 검사에 의해 쉽게 결정될 수 있지만, 컴퓨터 소프트웨어를 통해 전형적으로 수월해지는 적절한 알고리즘에 의한 분석은 더 긴 서열 사이의 식별을 결정하기 위해 흔히 사용된다. 서열 비교 알고리즘을 이용할 때, 시험 및 기준 서열은 전형적으로 컴퓨터로 입력되고, 하위서열 좌표가 필요한 경우 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 매개변수가 지정된다. 서열 비교 알고리즘은 이후 지정된 프로그램 매개변수에 기초하여 기준 서열에 대비한 시험 서열(들)에 대한 서열 동일성(%)을 계산한다. 최적 정렬을 신속히 얻고 2개 이상의 서열 사이의 동일성을 계산하기 위한 다수의 수학적 알고리즘이 공지되어 있고 다수의 이용 가능한 소프트웨어 프로그램으로 통합된다. 이러한 프로그램의 예는 아미노산 서열 분석을 위한 매치-박스(MATCH-BOX), 물타인(MULTAIN), GCG, 파스타(FASTA), 및 로부스트(ROBUST) 프로그램, 및 뉴클레오타이드 서열을 위한 SIM, GAP, NAP, LAP2, GAP2, 및 핍마커(PIPMAKER) 프로그램을 포함한다. 아미노산 및 폴리뉴클레오타이드 서열 분석 둘 다에 대한 바람직한 소프트웨어 분석 프로그램은 ALIGN, CLUSTALW(예를 들어, 버전 1.6 및 이의 이후 버전), 및 BLAST 프로그램(예를 들어, BLAST 2.1, BL2SEQ, 및 이의 이후 버전)을 포함한다.
아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 "동일성"(본원에 추가로 기재된 "국소 동일성"과 반대로 때때로 "전체 동일성"이라 칭함)은 이러한 2개의 아미노산 서열 또는 이러한 2개의 뉴클레오타이드 서열이 서로 최적으로 정렬될 때 2개의 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열에서 동일한 각각 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드 염기의 백분율을 의미한다. 최적 정렬에서, 제1 서열에서의 위치가 상응하는 제2 아미노산 또는 뉴클레오타이드 서열에서의 상응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드 잔기에 의해 점유될 때, 이 서열은 그 잔기 위치와 관련하여 동일성을 나타낸다. 2개의 서열 사이의 동일성의 수준(또는 "서열 동일성(%)")은 분석된 서열의 크기와 관련하여 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 비로서 측정된다(즉, 서열 동일성(%) = (동일한 위치의 수/위치의 전체 수)×100).
낮은, 중간 또는 높은 엄격도 조건 하에 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 핵산으로부터 또는 서열 번호 3 또는 서열 번호 5의 핵산 서열로 적어도 100개의 뉴클레오타이드의 탐침에 특이적으로 하이브리드화하는 핵산이 본 개시내용에 또한 포함된다.
본원에 사용되는 낮은 엄격도 하이브리드화 조건은, 예를 들어, 2X SSC 및 0.1% SDS 중에 42℃에서 약 40% 내지 약 70% GC 함량의 100개의 뉴클레오타이드 탐침과의 하이브리드화를 포함한다. 중간 엄격도 하이브리드화 조건은 예를 들어 0.5X SSC 및 0.1% SDS 중의 50℃에서를 포함한다. 높은 엄격도 하이브리드화 조건은, 예를 들어, 0.2X SSC 및 0.1% SDS 중의 65℃에서의 상기 언급된 탐침과의 하이브리드화를 포함한다. 이 조건 하에, 하이브리드화 온도가 상승하면서, 더 높은 서열 상동성을 갖는 핵산을 얻는다.
eHLA -G 유전자 변형된 세포를 포함하는 조성물
약학 조성물, 국소 조성물, 세포 이식편, 및 하나 이상의 HLA-G 변형된 포유동물 세포 유형을 포함하거나 이것을 사용하여 생성된 인공 조직이 본원에 또한 포함된다. 본원에 기재된 바대로, eHLA-G 변형된 hESC는 심지어 hEEP로의 지시된 분화를 통해 안정하고 지속적인 HLA-G 발현을 디스플레이한다. 더욱이, 안정하고 지속적인 HLA-G 발현은 유전자 변형된 세포에 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제를 제공한다. 또한, 완전 분화된 세포인 eHLA-G 변형된 인간 진피 섬유아세포가 또한 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제를 제공하는 안정하고 지속적인 HLA-G 발현을 갖는다는 것이 본원에서 밝혀졌다. 따라서, 본원에 기재된 eHLA-G 작제물은, 유전자 변형된 다능성 또는 다분화능 세포의 지시된 분화로부터이든 또는 완전 분화된 세포의 유전자 변형으로부터이든, 임의의 유형의 보편적 공여 세포를 생성하기 위해 사용될 수 있다.
일 양상에서, 본원에 기재된 eHLA-G 전이유전자를 포함하는 유전자 변형된 진피 섬유아세포 세포를 포함하는 피부 재생 또는 회복을 위한 국소 조성물이 제공된다. 또 다른 양상에서, 본원에 기재된 eHLA-G 전이유전자를 포함하는 유전자 변형된 진피 섬유아세포 세포를 포함하는 주사용 약학 조성물이 제공된다. 또 다른 양상에서, 본원에 기재된 eHLA-G 전이유전자를 포함하는 유전자 변형된 진피 섬유아세포 세포를 포함하는 피부 이식편 조성물이 제공된다. 또 다른 양상에서, 본원에 기재된 eHLA-G 전이유전자를 포함하는 유전자 변형된 배아 표피 전구 세포를 포함하는 영구적인 피부 이식편 조성물이 제공된다.
또 다른 양상에서, 인공 조직을 위한 생체적합성 합성 스캐폴드 및 이것의 생성을 위한 방법은 당해 분야에 기재되어 있고, 외인성 HLA-G를 발현하지 않는 세포를 포함하는 조직과 비교하여 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제를 갖는 인공 조직을 생성하기 위해 본원에 기재된 HLA-G 변형된 세포와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 발명의 명칭이 "마이크로제작된 조성물 및 다수의 세포 유형을 포함하는 조직을 조작하기 위한 방법(Microfabricated compositions and processes for engineering tissues containing multiple cell types)"인 미국 특허 제7,960,166호를 참조한다.
II . 방법
세포 치료법 치료
본원에 기재된 방식으로 외인성 HLA-G를 안정하게 발현하도록 변형된 세포가 감소된 면역원성 및/또는 증가된 면역억제를 가지므로, 이 특질은 변형된 세포가 보편적 또는 개선된 공여 세포 또는 조직으로서 작용하도록 한다. 이는 세포에 제공된 HLA-G 중재되는 면역원성 감소 및/또는 면역억제 개선이 다양한 손상, 질환, 또는 장애에 대해 공여 세포와 수혜자 사이의 전통적인 인간 백혈구 항원(HLA) I형 및 II형 분자의 유형을 매칭시키는 필요를 감소시키거나 제거할 수 있기 때문이다.
따라서, 본원에 기재된 eHLA-G(및 임의로 또한, 외인성 인간 β2 마이크로글로불린)를 안정하게 발현하는 HLA-G 변형된 세포를 치료에 대해 사용할 수 있다. 치료는 질환의 원인을 치료하는 데 지시될 수 있거나; 대안적으로, 치료는 질환 또는 병증의 영향을 치료하는 것일 수 있다. 유전자 변형된 세포는 대상체에서 손상 부위로 이동되거나 이것에 가까울 수 있거나; 세포가 손상 부위로 이동하게 하거나 제자리에 있게 하는 방식으로 세포는 대상체에 도입될 수 있다. 이동된 세포는 유리하게는 손상되거나 상해 입은 세포를 대체하고 대상체의 전체 상태의 개선을 허용할 수 있다. 몇몇 경우에, 이동된 세포는 피부 재생 또는 피부 회복을 포함하는 조직 재생 또는 회복을 자극할 수 있다.
다양한 실시양태에서, HLA-G 변형된 포유동물 세포(예를 들어, 인간 HLA-G 변형된 세포)는 심혈관 질환, 눈 질환(예를 들어, 황반변성), 청각 질환(예를 들어, 난청), 당뇨병, 신경퇴행성 질환, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 골다공증, 간 질환, 신장 질환, 자가면역 질환, 관절염, 잇몸 질환, 구강 병증, 또는 증식성 장애(예를 들어, 암)을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는, 임의의 다수의 병증을 겪는 대상체에 투여된다. 다른 경우에, 대상체는 급성 건강 병증, 예를 들어, 뇌졸중, 척수 손상, 화상 또는 상처를 겪거나 이를 겪을 높은 위험에 있다. 다른 경우에, 대상체는 조직 소실, 예컨대 지방위축병 또는 노화 관련 콜라겐 소실을 겪는다. 다른 경우에, 대상체는 비치유 궤양을 겪거나, 요도하혈 및 요도상혈과 같은 결함의 봉합을 돕는 물질이 필요하다. 다른 경우에, 대상체는 상처 치유 또는 피부 대체를 위한 영구적 또는 일시적 피부 이식편이 필요하다.
일 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에 대한 세포 또는 조직 이식의 보편적 방법을 제공하고, 상기 방법은 eHLA-G 변형된 세포의 집단을 포함하는 세포 또는 조직 조성물을 대상체에 주사하거나 이식하는 단계를 포함하고, 대상체는 eHLA-G 변형된 세포의 집단과 비교하여 적어도 하나의 불일치한 전통적인 HLA I형 또는 HLA II형 분자를 갖고, eHLA-G 변형된 세포의 집단은 eHLA-G 변형이 없는 동일한 유형의 세포와 비교하여 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제를 나타낸다. 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제는 예를 들어 NK-92 세포독성 검정, 인간화 NSG 종양 성장 검정 및/또는 PBMC 증식 검정에서 eHLA-G 변형된 세포를 eHLA-G 변형이 없는 동일한 유형의 대조군 세포와 비교함으로써 결정될 수 있다.
또 다른 양상에서, 또 다른 양상에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에 대한 세포 재생의 보편적 방법을 제공하고, 상기 방법은 대상체에서 피부 손상 부위에 eHLA-G 변형된 진피 섬유아세포 및/또는 eHLA-G 변형된 배아 표피 전구세포의 집단을 주사하는 단계를 포함하고, 대상체는 eHLA-G 변형된 진피 섬유아세포 및/또는 eHLA-G 변형된 배아 표피 전구세포의 집단과 비교하여 적어도 하나의 불일치한 전통적인 HLA I형 또는 HLA II형 분자를 갖는다.
이를 필요로 하는 대상체에 투여하고자 하는 HLA-G 변형된 세포 유형은 표피 전구 세포, 중간엽 줄기 세포, 췌장 β 세포 전구자, 췌장 β 세포, 심장 전구자, 심근세포, 간 전구자, 간세포, 근육 세포 전구자, 근육 세포, 신장 세포, 조골세포, 조혈 전구자, 치낭 세포, 모공 세포, 망막 색소 상피 세포, 신경 줄기 세포, 뉴런, 성상교세포, 희소돌기아교세포, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하지만, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 포유동물 세포는, 예를 들어, 인간, 마우스, 랫트, 원숭이, 또는 돼지를 포함하는 몇몇 종 중 하나로부터 유래할 수 있다.
치료는 질환의 원인을 치료하는 데 지시될 수 있거나; 대안적으로, 치료는 질환 또는 병증의 영향을 치료하는 것일 수 있다. HLA-G 변형된 세포는 대상체에서 손상 부위로 이동되거나 이것에 가까울 수 있거나; 세포가 손상 부위로 이동하게 하거나 제자리에 있게 하는 방식으로 세포는 대상체에 도입될 수 있다. 이동된 세포는 유리하게는 손상되거나 상해 입은 세포를 대체하고 대상체의 전체 상태의 개선을 허용할 수 있다. 몇몇 경우에, 이동된 세포는 조직 재생 또는 회복을 자극할 수 있다
이동된 세포는 HLA-G 변형된 다능성(또는 전능성) 줄기 세포로부터 분화된 세포일 수 있다. 이동된 세포는 또한 다능성, HLA-G 변형된 세포로부터 분화된 다분화능 줄기 세포일 수 있다.
대상체에 대한 치료의 투여의 수는 변할 수 있다. 대상체에 HLA-G 변형된 및/또는 분화된 세포를 도입하는 것은 1회 사건일 수 있지만; 소정의 상황에서, 이러한 치료는 한정 기간 동안 개선을 발생시키고 계속되는 일련의 반복 치료를 필요로 할 수 있다. 다른 상황에서, 세포의 다수의 투여가 효과가 관찰되기 전에 필요할 수 있다. 당해 분야의 당업자가 이해하는 것처럼, 정확한 치료 프로토콜은 질환 또는 병증, 질환의 병기 및 치료되는 각자의 대상체의 매개변수에 따라 변할 것이다.
HLA-G 변형된 세포는 비경구, 정맥내, 동맥내, 근육내, 피하, 경피, 기관내, 복강내 또는 into 척수액의 임의의 경로를 통해 대상체에 도입될 수 있다.
HLA-G 변형된 세포는 세포로 분화하고 이후 광범위한 질환 또는 장애를 겪는 대상체에 전달될 수 있다.
췌장 소도 세포(또는 랑게르한스섬의 1차 세포)는 당뇨병(예를 들어, 1형 당뇨병)을 겪는 대상체에 이식될 수 있고, 예를 들어, 문헌[Burns et al., (2006) Curr. Stem Cell Res. Ther., 2:255-266]을 참조한다. 따라서, 몇몇 실시양태에서, HLA-G 변형된 세포로부터 유래한 췌장 베타 세포는 당뇨병(예를 들어, 1형 당뇨병)을 겪는 대상체에 이식된다.
다른 예에서, HLA-G 변형된 세포로부터 유래한 간 세포 또는 간 줄기 세포는 간 질환, 예를 들어, 간염, 간경변 또는 간 부전을 겪는 대상체에 이식된다.
퇴행성 심장 질환, 예컨대 허혈성 심근병증, 전도 질환 및 선천성 결함은 줄기 세포 치료로부터 유리할 수 있다. 예를 들어, 문헌[Janssens et al., (2006), Lancet, 367:113-121]을 참조한다.
HLA-G 변형된 세포로부터 유래한 조혈 세포 또는 조혈모 세포(HSC)는 혈액암, 또는 다른 혈액 또는 면역 장애를 겪는 대상체에 이식될 수 있다. 조혈 세포 또는 HSC에 의해 가능하게 치료되는 혈액암의 예는 급성 림프아구성 백혈병, 급성 골수아구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병(CML), 호치킨 질환, 다발성 골수종 및 비호치킨 림프종을 포함한다. 대개, 이러한 질환을 겪는 대상체는 신속히 분열하는 혈액 세포를 사멸하기 위해 방사선 치료 및/또는 화학치료를 받아야 한다. HLA-G 변형된 세포로부터 유래한 HSC를 이 대상체에 도입하는 것은 세포의 고갈된 저장소를 재생성하는 것을 도울 수 있다.
신경학적 질환 또는 장애를 겪는 대상체는 특히 혈액 뇌 장벽이 손상될 수 있을 때 특히 HLA-G 변형된 세포 치료로부터 유리할 수 있다. 몇몇 접근법에서, HLA-G 변형된 세포는 신경 줄기 세포 또는 뉴런으로 분화되고 이후 신경학적 병증, 예를 들어, 알츠하이머병, 파킨슨병, 다발성 경화증, 뇌경색, 척수 손상, 또는 다른 중추 신경계 장애를 치료하기 위해 손상 부위로 이식될 수 있고, 예를 들어, 문헌[Morizane et al., (2008), Cell Tissue Res., 331(1):323-326; Coutts and Keirstead (2008), Exp. Neurol., 209(2):368-377; Goswami and Rao (2007), Drugs, 10(10):713-719]을 참조한다.
파킨슨병의 치료를 위해, HLA-G 변형된 세포는 도파민 작동성 뉴런으로 분화되고 이후 파킨슨병을 갖는 대상체의 선조체에 이식될 수 있다. 다발성 경화증의 치료를 위해, 신경 줄기 세포는 희소돌기아교세포 또는 희소돌기아교세포의 전구자로 분화될 수 있고, 이것은 이후 MS를 겪는 대상체로 이동된다.
임의의 신경학적 질환 또는 장애의 치료를 위해, 신경 줄기 세포를 대상체에 도입하기 위해 성공적인 접근법이 있을 수 있다. 예를 들어, 알츠하이머병, 뇌경색 또는 척추 손상을 치료하기 위해, HLA-G 변형된 세포는 신경 줄기 세포로 분화하고 이후 손상 부위로 이식될 수 있다. HLA-G 변형된 세포는 또한 뇌 및 척수 회복을 위한 병변으로의 이것의 이동을 표적화할 수 있는 신호에 반응하도록 조작될 수 있고, 예를 들어, 문헌[Chen et al., (2007), Stem Cell Rev., 3(4):280-288]을 참조한다.
임의로, 세포 치료 방법에 있는 HLA-G 변형된 세포는 또한 본원에 기재된 리포터 단백질을 발현한다. 몇몇 실시양태에서, 사용되는 리포터 단백질은 도입된 세포의 생체내 검출(예를 들어, 영상화)을 수월하게 하는 것이다. 예를 들어, 세포는 적외선 발광 형광 단백질, 예컨대 카투스카(이것의 오랜 여기 및 방출 파장은 조직에서 영상화에 매우 적합함)를 발현할 수 있다. 카투스카는 상표명 "TurboFP635"(Evrogen, Moscow, Russia) 하에 상업적으로 구입 가능하다.
실시예
하기 구체적인 실시예는 단지 예일 뿐이고 어떠한 방식으로든 본 개시내용의 나머지를 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 추가적인 복잡함 없이, 당해 분야의 당업자는 본원의 기재내용에 기초하여 이의 가장 완전한 정도로 본 발명을 이용할 수 있는 것으로 생각된다. 본원에 인용된 모든 공보는 본원에 그것의 전문이 참조문헌으로 포함된다. URL 또는 다른 이러한 식별자 또는 주소가 언급되더라도, 이러한 식별자는 변할 수 있고 인터넷 상의 특정한 정보는 유입되고 유출될 수 있지만, 동등한 정보가 인터넷을 조사함으로써 확인될 수 있는 것으로 이해된다. 이에 대한 언급은 이러한 정보의 이용 가능성 및 공중 보급을 입증한다.
실시예 1 암 세포의 면역 관용과 관련된 유전자 발현 패턴의 확인
인간 연조직 암 어레이는 추정상 면역 감시 기전의 회피로 인해 전이 상태로의 암 진행으로 발현 증가를 나타내는 후보 면역 관용 유전자의 조사에서 초기에 스크리닝되었다. 데이터는 이전에 면역 관용에서 연루된 몇몇 유전자의 발현 수준과 성공적인 전이 사이의 강한 양성 상관관계를 나타냈다. MSC가 면역 관용 및 이형이식 허용을 유도할 수 있는지를 평가하기 위해, MSC를 RT-PCR에 의해 교차 스크리닝하여 이 후보 유전자 및 몇몇 항원성 HLA의 발현 수준을 검사하였다. 표 1은 1회 계대배양 MSC가 CD200, CD47 및 인돌아민 2,3-디옥시게나제(IDO) 이외의 HLA Ia형, HLA-G 및 II 마커를 발현했다는 것을 나타낸다. MSC의 집단은 공격적인 전이 가능성을 갖는 암 세포주인 Jeg-3에 관찰된 것보다 낮지만 보통의 수준으로 HLA-G를 발현하는 것으로 밝혀졌다.
세포 유형 계대 배양 번호 HLA Ia형 HLA-G HLA Ⅱ형 IDO CD200 CD47
MSC G- 1 ++++ - -/+ + ++ +
3 ++++ - ++ + ++ +
MSC G+ 1 ++++ ++ -/+ + ++ +
3 ++++ - ++ + ++ +
Jeg3 1 ++ +++ -/+ - - +
3 ++ +++ -/+ - - +
MSC의 면역억제 효과가 생체 내 일시적인 것으로 보이므로, MSC를 연속하여 계대배양하고 선택된 유전자의 발현 수준의 변화에 대해 모니터링하였다. 3회 계대배양에 의해, 네이티브 HLA-G 발현은 MSC에서 부재했지만, 다른 후보 마커는 변하지 않았다. HLA-G 발현은 Jeg-3 세포에서 변경되지 않았다. MSC는 이후 FACS를 이용하여 세포 표면 HLA-G의 발현에 기초하여 단리되었고, 0.5-3%의 MSC가 세포 표면에서 HLA-G를 발현하는 것으로 밝혀졌다. 생체 내 공여 거부를 피하는 HLA-G+ MSC의 능력을 평가하기 위해, 1-3 x 105개의 세포를 면역적격 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다. 혈액 샘플(200㎕)을 안와정맥총으로부터 수집하고, FACS는 항-인간 HLA I형 특이적 mAb를 사용하여 분류하였다. 표 2는 이식 1주 후, HLA-G+ MSC(및 Jeg-3 세포)가 각각 HSC 및 주카트(Jurkat) 세포(HLA-G- 둘 다)에 비해 24배 및 270배의 생존 이익을 보인다는 것을 나타낸다. 2주째에, HLA-G+ MSC의 이익은 27배 및 311배로 증가하였다. HLA-G- MSC는 HSC와 동일한 속도로 생존하고, 이것은 MSC의 HLA-G+ 하위집단이 생체 내 설정에서 비분류된 MSC에 비해 증대된 관용 효과를 나타낼 수 있다는 것을 암시한다. 실제로, 검시 분석은 G+ MSC가 아닌 Jeg-3 세포에 의한 이식 12주 후 면역적격 마우스의 폐에서의 숨길 수 없는 종양을 나타냈다(데이터 비기재).
세포 유형 HLA-G 샘플링 시간 생존율(%)
100k MSC - 2주 0.51%
100k MSC + 1주 10.82%
2주 12.47%
150k Jeg-3 + 1주 13.5%
300k HSC - 1주 0.46%
300k 주카트 - 1주 0.04%
다음에, 변형된 HLA-G 작제물을 HF(인간 섬유아세포) 및 K562 세포에서 과발현하고 인간 NK 세포에 의한 용해에 대한 보호에 대해 시험하였다(표 3). NK 중재 세포독성은 HLA-G+ HF에서 75% 감소하였고 실제로 HLA-G+ K562 세포에서 제거되었다. 이것은 HLA-G+ Jeg-3의 관찰된 보호와 일치하고, 이것은 아이소타입 대조군이 아니라 중화 항-HLA-G(87G) 항체와의 항온처리에 의해 반전되었다. 이 데이터는 NK 사멸로부터의 보호가 HLA-G 독립적이라는 것을 제시한다.
프로모터 ER 인출 3'UTR HLA-G 표면 발현 세포동석 용해(3:1) 침묵화
pMSCV 야생형 부재 저-중간 32-41% 4-6주
pMSCV 야생형 야생형 저 40-60% 4-6주
pMSCV 돌연변이 야생형 중간 25-33% 4-6주
pMSCVmut 야생형 부재 저-중간 35-42% 12달에 무
pMSCVmut 돌연변이 돌연변이 고 0-8% 5달에 무
선행 연구는 돌연변이된 MSCV 프로모터, M-U3/R이 배양 10주에 걸쳐 침묵화 압박을 피한다는 것을 나타낸다. 본 발명자들의 연구는 M-U3/R이 배양 4-6주째에 침묵화된 야생형 프로모터보다 우수하게 연속 배양 1년 후 침묵화에 저항한다는 것을 나타낸다. 더욱이, 3' UTR의 돌연변이 또는 결실은 ER 인출 모티프의 돌연변이가 그런 것처럼 HLA-G 표면 발현을 증대시켰다. 더 높은 HLA-G 표면 발현은 세포독성 용해와 부정적인 상관관계를 이루어, 최적 유전자 전달 작제물을 이용하는 것의 중요성을 강화시킨다.
실시예 2 인간 배아 줄기 세포의 배양 및 인간 표피 전구세포( hEEP )로의 분화
모든 조직 배양 시약을 달리 언급되지 않은 한 라이프 테크놀로지스(Life Technologies)로부터 얻었다. ESC 성장 배지는 20%의 녹아웃(knockout) 혈청 대체물, 0.1mM MEM 비필수 아미노산, 1mM 글루타맥스, 0.1mM β-머캅토에탄올(Sigma)로 보충된 DMEM/F12(1:1)을 포함한다. 5 x 104개의 세포/㎠의 밀도로 유사분열로 불활화된 마우스 배아 섬유아세포(MEF)(CF-1, ATCC)를 평판배양하고 18-24시간 동안 항온처리하여 ESC 성장 배지를 컨디셔닝하였다. 컨디셔닝 후, 4ng/㎖의 bFGF를 첨가하고, 완전한 순화 배지를 무균 여과시켰다. hESC를 1㎎/㎖의 디스파제를 사용하여 마트리겔 코팅된 플레이트에서 매 5-6일 동안 (1:3 또는 1:4 분할로) 계대배양하여 세포 콜로니를 제거하였다. K14+/p63+ hEEP를 상기 메탈로(Metallo) 등의 문헌의 방법에 따라 생성하였다. 간단히 말하면, hESC를 4일 동안 6웰 플레이트에서 배양하고 이후 1μM 올-트랜스 레티노산(Sigma) 및 25ng/㎖의 BMP4를 포함하는 비순화 hESC 성장 배지로 이루어진 2㎖/웰의 분화 배지로 처리하였다. 7일 동안 매일 배지 변경 후, 세포를 디스파제로 처리하고 원심분리하고 제한된 케라틴세포 혈청 비함유 배지(DFSM)에서 재현탁시키고 1:3의 분할비로 젤라틴 코팅된 플레이트에 시딩하였다. DSFM은 3-4주 동안 격일로 변화시켰다. 이후, 세포를 트립신처리에 의해 계대배양 원심분리하고 세척하고 DSFM에서 젤라틴 코팅된 조직 배양 플레이트에 ㎠ 당 10,000개의 세포로 평판배양하였다. 제한된 케라틴세포 혈청 비함유 배지에서 14일 후, 표피판 구조의 형성을 특징으로 하는 현미경 검사에 의해 표피 분화의 초기 신호가 관찰되었다. 배양 4주 후, 표피판에서의 세포는 입방체 형태를 갖는 통상적인 표피 분화 표현형을 나타냈다.
세포로부터의 전체 RNA의 단리 및 역전사효소 반응은 이전에 문헌[Zhao et al (2010), Tissue Eng Part A, 16(2):725-733]에 기재되어 있다. 도 12에 도시된 관심 있는 유전자의 특이적 프라이머를 사용하여 하이바이드 옴니젠(Hybaid Omnigene) 열 순환기(Bio-rad, Hercules, CA)에서 특이적 PCR 증폭을 수행하였다. PCR 조건은 10분 동안 72℃에서의 최종 연장으로 30초 동안 94℃, 1분 동안 65℃ 및 1분 동안 72℃에서의 35회 사이클로 이루어진다. 브롬화에티듐 겔 전기영동에 의해 10㎕의 각각의 PCR 생성물을 검출하였다. 도 12 데이터는 표피 분화 마커 K14, Tap63 및 ΔNp63이 분화 동안 점차 증대된다는 것을 나타낸다. 본원에 기재되지 않은 데이터에서, K14 및 추가의 표피 마커 p63, CD29, 및 CD49f의 면역형광 연구를 수행하였다. 분화된 eHLA-G(EF-1a)-GFP hEEP는 면역형광에 의해 표시된 바대로 K14, p63, CD29, 및 CD49f 단백질 발현에 대해 양성이었다.
상피 단층이 90% 이상의 순도이고 K14를 발현한다는 것을 검증하기 위해, 세포를 상기 메탈로 등의 방법에 따라 유세포 분석법으로 처리하고, BD FACS 칸토(Canto) II에서 분석하였다. 야생형, G- 및 G+-hEEP에 대한 K14 양성의 정도를 비교함으로써 EP(표피 전구세포)로의 hESC 분화에 대한 eHLA-G 전이유전자 발현(eHLA-G(EF1-α)-GFP-hESC)의 영향을 평가하였다. 단리된 hEEP의 순도를 증대시키기 위해, CD29 항체에 의한 자기 활성화 세포 분류(MASC)를 이용하여 세포를 분류하였다. eHLA-G(EF-1α)-GFP 변형된 hESC로부터 분화된 약 92%의 CD29 MASC 분류된 hEEP 세포 배양 세포는 특이적 케라틴세포 마커인 K14에 대해 양성이었다. 정제된 hEEP는 위상차 현미경 검사에 의해 관찰되는 바와 같은 상동성 케라틴세포 형태를 나타냈다(도 16 참조).
분화된 hEEP에서의 HLA-G 전이유전자의 안정성은 유세포 분석법에 의해 확인되었다. HLA-G 전체 발현 및 표면 발현 둘 다는 외인성 HLA-G(GFP 오직 hEEP) 및 야생형 hEEP가 없는 대조군 세포와 비교하여 분화된 eHLA-G(EF-1a)-GFP-hEEP(90% 초과의 세포)에 강력하다(도 17 참조). 추가의 연구를 위해 야생형 세포로서 유사한 분화 가능성을 생성시킨 클론만을 선택하였다.
실시예 3 hESC 에서의 eHLA -G 작제물 설계 및 안정한 발현
신규한 HLA-G 작제물은 다수의 변형을 조합함으로써 설계되었다: 1) HLA-G의 ER 인출 모티프(K334A/K335A)의 돌연변이; 및 2) HLA-G의 3' UTR 마이크로RNA 결합 부위의 돌연변이. 바이러스 유전자 전달 시스템이 심각한 조절 공격에 남아 있으므로, H1 hESC에서 90%의 형질감염 효율을 성취하는 것으로 최근에 나타난 트랜스포손 기반 비바이러스 접근법인 PiggyBac 시스템을 사용하였다(Lacoste et al (2009), Cell Stem Cell, 5:332-342.). 이 시스템은 트랜스포손을 포함하는 공여 플라스미드(도 1a) 및 트랜스포사제를 발현하는 헬퍼 플라스미드(도 2)를 필요로 한다. 헬퍼 플라스미드를 생성하기 위해, ePiggyBac 코돈 인간화 트랜스포사제 cDNA를 커스텀 합성하고(GeneArt), 이후 PGK 프로모터의 하류 및 SV40 폴리아데닐화 신호 서열(pA)의 상류의 pBluescript(Stratagene)에서 클로닝하였다. eHLA-G 발현 카세트의 경우, M-U3/R 프로모터, MSCV 프로모터 및 중국 햄스터 EF1α(CHEF-1α) 프로모터를 포함하는 다수의 프로모터를 비교하고, 이들의 서열은 하기 서열 번호 6에 제공되어 있다.
(서열 번호 6) - CHEF-1α 프로모터의 일 실시양태
GAGCCCGCCCGCCCGGCACCAGTTGCGTGCGCGGAAAGATGGCCGCTCCCGGGCCCTGTAGCAAGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCAGCCCGGCGGAGCGGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAGAGGGCCTTGCCCCTCGCCGGCCGCTGCTTCCTGTGACCCCGTGGTGTACCGGCCGCACTTCAGTCACCCCGGGCGCTCTTTCGGAGCACCGCTGGCCTCCGCTGGGGGAGGGGATCTGTCTAATGGCGTTGGAGTTTGCTCACATTTGGTGGGTGGAGACTGTAGCCAGGCCAGCCTGGCCATGGAAGTAATTCTTGGAATTTGCCCATTTTGAGTTTGGAGCGAAGCTGATTGACAAAGCTGCTTAGCCGTTCAAAGGTATTCTTCGAACTTTTTTTTTAAGGTGTTGTGAAAACCACCG
공여 플라스미드를 생성하기 위해, T53C/C136T 돌연변이체 313bp의 5' 말단 반복부(TR) 및 235bp의 3' TR(상기 Lacoste 문헌에 기재된 바대로)을 커스텀 합성하고 하기 발현 카세트의 각각 상류 및 하류에서 클로닝하였다: eHLA-G, 250bp 닭 β-글로불린 HS4 코어 절연인자(Recillas-Targa et al (2002), PNAS USA, 99:6883-6888), EGFP 및 pA. HS4를 사용하여 통합된 작제물로의 억압적 염색질의 분산을 방지하였다. EGFP 발현은 포스포글리세린산키나아제(PGK) 프로모터에 의해 추진되었다(도 1a 참조). HS4 구성요소의 서열은 하기 서열 번호 7에 기재되어 있다.
(서열 번호 7) HSF 구성요소의 일 실시양태
GAGCTCACGGGGACAGCCCCCCCCCAAAGCCCCCAGGGATGTAATTACGTCCCTCCCCCGCTAGGGGGCAGCAGCGAGCCGCCCGGGGCTCCGCTCCGGTCCGGCGCTCCCCCCGCATCCCCGAGCCGGCAGCGTGCGGGGACAGCCCGGGCACGGGGAAGGTGGCACGGGATCGCTTTCCTCTGAACGCTTCTCGCTGCTCTTTGAGCCTGCAGACACCTGGGGGATACGGGGAAAAAGCTT
빈 벡터 공여 플라스미드(HLA-G-)는 eHLA-G 작제물이 제외된다는 것을 제외하고는 eHLA-G 공여 플라스미드와 동일하였다(도 1b). 유전자 운반 전에, hESC를 1시간 동안 실질적으로 해리 유도 아폽토시스를 감소시키고 클로닝 효율을 증가시키는 것으로 밝혀진 ROCK 저해제인 10μM의 Y-27632로 처리하였다(Watanabe et al (2007), Nat Biotechnol, 25:681-686). hESC를 37℃에서 5분 동안 0.25% 트립신-EDTA 중에 해리하고, 순화된 mTeSR 배지와 Y-27632 중에 세척하고, 뉴클레오펙션 용액 L(Amaxa) 중에 현탁하였다. 3㎍의 헬퍼 및 6㎍의 트랜스포손 공여 플라스미드를 1.5 x 105개의 세포마다 첨가하고, 뉴클레오펙션을 프로그램 설정 B-016으로 수행하였다. hESC를 이후 클론 선택을 위해 6㎝ 접시마다 2 x 105개의 세포로 CM와 Y-27632 중에 평판배양하였다. 24시간 후, 배양 배지를 CM 단독으로 바꾸고, 이후 매일 바꿨다. 전이유전자 침묵화가 hESC에서 흔하고 단일 형질전환 세포의 분획만이 표시된 세포주를 생성하므로, 항생제 내성 또는 유세포 분석법보다는 형광 현미경 검사를 이용하여 tdT/eHLA-G의 가장 높은 이중 발현을 갖는 클론을 선택하였다(Braam et al (2008), Nat Methods, 5:389-392).
실시예 4 ePiggyBac 유전자 전달 시스템의 평가
eHLA-G 형질감염 효율을 형질감염된 세포를 24시간 동안 6㎝ 접시마다 2 x 103개의 세포로 CM과 Y-27632 중에 평판배양함으로써 결정하고, 이후 CM 단독으로 바꿨다. 이후 배지를 7일 동안 매일 바꾸고, 콜로니를 실시예 5에 기재된 바대로 생 세포 염색 및 면역형광 현미경 검사에 의해 평가하였다. 각각의 클론의 경우, 3개의 고출력장을 계수하고 리포터 단백질+/eHLA-G+ hESC의 백분율을 계산하였다. 이 실험의 결과는 도 3-4에 도시되어 있다. eHLA-G 삽입 부위를 상기 Lacoste 등의 문헌에 기재된 플라스미드 구조 전략을 이용하여 결정하였다. 간단히 말하면, 게놈 DNA를 형질전환 hESC 클론으로부터 단리하고, BamHI/BglII/NotI로 분해하고, 16℃에서 밤새 T4 DNA 리가제와 저농도로 자가 결찰시키고, 100%의 아이소프로판올로 침전시키고, DH10B 이. 콜라이에서 형질전환 전에 70% 에탄올로 세척하고, 암피실린에서 선택하였다. eHLA-G 카피수를 SplinkTA PCR을 이용하여 결정하였다. 표준 G 밴딩을 매 20회 계대배양에서 수행하여 핵형 안정성을 평가하였다. eHLA-G 및 리포터 단백질 유전자 침묵화를 유세포 분석법을 이용하여 매 10회 계대배양에서 평가하였다. 해리 및 분석 전에, hESC를 1시간 동안 10μM Y-27632로 처리하였다. 세포를 이후 37℃에서 5분 동안 0.25%의 트립신-EDTA로 해리시키고, CM과 Y-27632 중에 세척하고, 0.1% BSA 및 0.5mM EDTA를 포함하는 매우 차가운 PBS 중에 재현탁시키고, 이후 BD FACS 칸토 II 유세포 분석기(Becton Dickinson)를 사용하여 분석하였다. 도 8 및 도 9에 도시된 바대로, 16회 계대배양에서, 본질적으로 EGFP 또는 eHLA-G 발현의 침묵화가 관찰되지 않았다. 다능성을 하기의 면역세포화학 검출에 의해 모두 레이카(Leica) CTR6500 형광 현미경을 사용하여 매 20회 계대배양에서 평가하였다: 1) 다능성 마커 Oct3/4, SSEA-4, Sox2 및 Nanog(도 5 및 도 6), 2) 리포터 단백질+/eHLA-G+ 배양체 형성(도 7) , 및 3) 분화된 형질전환 hESC에서의 내배엽 마커 가타(Gata) 6, 중배엽 마커 근육 액틴 및 외배엽 마커 신경미세섬유 중쇄(데이터 비기재). 모든 항체는 달리 기재되지 않은 한 압캠(Abcam)으로부터 얻었다.
실시예 5 eHLA -G 및 다른 HLA 단백질의 세포 표면 국재화
간 세포 염색을 이용하여 형질전환 대 야생형 hESC 및 hEEP에서 세포 표면 HLA Ia형, HLA-E, eHLA-G 및 HLA II형 발현을 검출하였다. 간단히 말하면, 세포를 수확하고 차가운 PBS 중에 세척하고, 10%의 염소 혈청 및 3%의 BSA를 포함하는 PBS 중의 상응하는 1° mAb로 4℃에서 60분 동안 염색하고, 세척하고 1%의 파라포름알데하이드로 10분 동안 고정하고, 이후 FITC와 접합된 염소 항-마우스 IgG로 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 대조군 액적 w을 아이소타입 매칭된 IgG로 염색하여 표적 세포에 대한 비특이적 결합을 평가하였다. 특이적 유일한 결합을 달성하기 위한 최적 조건을 결정하기 위해 각각의 항체(HLA-G의 경우 MEMG/9, HLA-E의 경우 MEM-E/08, HLA Ia형의 경우 Bu8 및 HLA II형의 경우 HKB1(Abbiotec(캘리포니아주 샌디에고))를 처음에 수회 희석하여 시험하였다. 염색 후, 세포를 유리 슬라이드에 바르고, 공기 건조시키고, 이후 DAPI(Vector Laboratories)를 포함하는 항-페이드(anti-fade) 배지에 탑재하였다. 레이카 CTR6500 형광 현미경 하에 슬라이드가 즉시 관찰되었다. 도 5 및 도 10에 도시된 바대로, HLA-A,B,C; HLA-E, HLA-DP, DQ, DR, 및 β-마이크로글로불린의 발현은 야생형 및 eHLA-G 변형된 인간 ES 세포에서 유사한 반면, 대략 7배 더 높은 수준의 HLA-G 발현이 eHLA-G 변형된 인간 ES 세포에서 관찰되었다.
실시예 6 NK -92 세포 유도된 세포독성에 대한 eHLA -G 발현의 평가
eHLA-G를 발현하는 hESC를 배양하고 실시예 2에 기재된 바대로 hEEP로 분화시켰다. NK-92 세포(CRL-2407, 아메리칸 타입 배양 수집(Manassas, VA))를 5% CO2 습윤 항온기에서 37℃에서 12.5%의 FBS, 12.5%의 말 혈청, 0.2mM 이노시톨, 0.1mM β-머캅토에탄올, 0.02mM 엽산 및 100IU/㎖의 재조합 IL-2(Sigma)로 보충된 최소 필수 배지 알파 배지(α-MEM, 인비트로겐)에서 배양하였다.
지시된 프로토콜대로 CytoTox96 비방사선 세포독성 검정 키트(Promega(위스콘신주 매디슨))를 사용하여 세포독성을 수행하였다. 간단히 말하면, 이팩터 세포를 U 바닥 96웰 플레이트(Costar(메사추세츠주 캠브리지))에서 다양한 NK-92(이팩터 또는 "E") 대 hESC 또는 hEEP(표적 또는 "T") E:T 세포 비율로 5 x 103개의 표적 세포와 혼합하였다. 습윤 5% CO2 항온기에서 37℃에서 4시간 후, 50㎕의 상청액을 수집하여 LDH 방출을 결정하였다. 표적 세포 자발 방출 및 LDH의 최대 방출 및 LDH의 이팩터 세포 자발 방출을 배지 단독에서 이 세포를 항온처리함으로써 결정하였다. 각각의 검정을 3회 수행하고, 결과는 용해의 백분율(%)로 표시된다. 특이적 용해의 백분율을 하기와 같이 결정하였다: (실험 방출 - 이팩터 자발 방출 - 표적 자발 방출 / 표적 최대 방출 - 표적 자발 방출)×100. 모든 실험에서 자발 방출은 최대 방출의 10% 미만이었다.
도 11에 도시된 바대로, 1:10의 E:T 비율로, eHLA-G를 발현하는 hESC의 사멸이 GFP 단독을 발현하는 야생형 세포에 비해 50% 초과로 감소하였다. 1:30의 E:T에서, eHLA-G를 발현하는 hESC의 사멸이 대략 75% 감소하였다. 야생형 hESC는 E:T 비율 둘 다에 대해 기재된 합당한 속도로 사멸되었다(GFP 단독). 추가로, K562 세포에서의 3' UTR(Del 14bp) HLA-G 대립유전자의 발현이 (Ins 14bp) HLA-G 대립유전자를 발현하는 K562 세포 및 비변형된 K562 세포에서 관찰되는 것에 비해 NK 세포 유발 세포독성을 감소시킨다는 것이 밝혀졌다. 도 13을 참조한다.
도 11의 결과는 반복되고 추가의 NK 세포독성 실험에서 확인되었다. 도 18에 도시된 바대로, eHLA-G(EF-1a)-GFP-hESC의 사멸은 GFP 전이유전자만을 포함하는(HLA-G 전이유전자 무) 대조군 hESC와 비교하여 100% 초과로 감소하였다. 이 데이터는 HLA-G 전이유전자 발현이 hESC에서 면역억제 및/또는 감소된 면역원성 특성을 부여한다는 것을 나타낸다.
NK 세포독성 실험을 또한 hESC로부터 분화된 hEEP에서 수행하였다. 도 19에 도시된 바대로, eHLA(EF-1α)-GFP-hESC로부터 분화된 eHLA(EF-1α)-GFP-hEEP의 사멸은 대조군 hEEP와 비교하여 100% 훨씬 초과(약 3배)로 감소하였다. 이 데이터는 eHLA(EF-1α)-GFP 전이유전자가 분화 과정에 걸쳐 안정하고 지속적이고, HLA-G 발현이 분화된 세포에서 면역억제 및/또는 감소된 면역원성 특징을 부여할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 7 인간화 마우스에서의 이형이식에 의한 생체내 e- HLA -G + 세포의 면역원성의 결정
야생형 면역결핍 NSG 마우스가 아닌 인간 말초 혈액 림프구(Hu-PBL-NSG)를 갖는 인간화 마우스 모델은 최근에 이식 후 1-2주 내에 불일치한 인간 소도를 거부하는 것으로 나타났다(King et al (2008), Clin Immunol, 126:303-314). 이식편 대 호스트 질환(GVHD)이 4-5주에 시작하지만, 안락사 기준이 만족될 때까지 이식편 생존은 모니터링하였다. 오직 낮은 수준의 GVHD의 존재가 본 발명자들이 관창 창을 연장하게 한다. NSG 마우스(6주령의 암컷)을 잭슨 레버러토리(Jackson Laboratory)로부터 구입하고, 국제 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 가이드라인 및 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)(Institute of Laboratory Animal Resources, National Research Council, National Academy of Sciences)의 권고사항에 따라 취급하였다. 문헌(Pearson et al (2008), Curr Protoc Immunol, Ch. 15:Unit15.21; 및 상기 킹(King) 등의 문헌)에 따라 NSG 마우스로 약 20 x 106개의 인간 PBMC의 정맥 주사에 의해 기능적 인간화 NSG 마우스를 생성하였다. EDTA 코팅된 모세관(Drummond Scientific) 및 EDTA 처리된 1.5㎖ 관(Eppendorf)을 사용하여 마취된 마우스의 안와정맥총으로부터 혈액을 수집함으로써 생착이 약 4주에 검증되었다. 이후, 세포를 상기 킹 등의 문헌에 따라 FACS 분석에 의해 인간 CD45 양성에 대해 처리하였다. 4주에 혈액 중에 0.1%에 도달하는 인간 CD45+ 세포의 수준은 성공적인 생착으로 판단되고 동종거부 연구를 허용한다.
전형적으로 사용된 hESC 및 hEEP 배양 시스템은 세포를 면역원성 동물 유도체, 예컨대 시알산 Neu5Gc에 노출시킨다(Martin et al (2005), Nat Med, 11:228-232). 따라서, Neu5Gc 수준을 상당히 감소시키는 것으로 최근에 나타난 탈오염 단계를 추가할 수 있다(Heiskanen et al (2007), Stem Cells, 25:197-202). 2개의 접근법을 이용하여 hESC를 Neu5Gc로부터 탈오염시킬 수 있다: 1) 문헌[Ludwig et al (2006), Nat Biotechnol, 24:185-187]의 방법에 따라 인간 매트릭스 코팅된 플레이트에서 bFGF, LiCl, GABA 및 피페콜산으로 보충된 TeSR1 배지에서의 배양, 및 2) 열 불활화 AB Rh- 혈액형 인간 혈청에 의한 KSR 대체(Heiskanen et al (2007), Stem Cells, 25:197-202). 두 방법 모두의 하에 배양된 hESC를 항-Neu5Gc mAb와의 항온처리에 의해 평가하고 유세포 분석법에 의해 분석할 수 있다. 루드빅(Ludwig) 등의 방법이 hESC 적용을 필요로 할 수 있으므로 제2 접근법을 채택할 수 있다. hEEP를 이것의 제조업자마다 동물 유도체가 결여된 DFSM에서 배양하였다.
HLA-G 변형된 세포에 의한 이형이식을 수행하는 것의 목적은 HLA-G 발현이 종양 크기 증가로 표시되는 것처럼 면역원성을 감소시키는지 여부를 평가하는 것이다. 이식 전에, 의도되는 주사 부위를 면도하여 임상 관찰이 수월하게 한다. 적절한 마취제 사용을 포함하는 동물 가이드라인을 항상 준수한다. 5 x 106개의 형질전환 eHLA-G+ 및 HLA-G- hESC를 주사 부위를 표시하는 인도 잉크를 포함하는 100㎕의 적절한 배지 중에 재현탁시켰다. 이것은 불충분한 형광이 관찰되어야 하는 경우에 조직학적 평가를 수월하게 한다. 세포를 5마리의 3월령 Hu-PBL-NSG 마우스의 가슴 유방 지방층에 피하로 주사하였다. 이 이형이식의 결과가 도 20 및 도 21에 도시되어 있다. "G0" hESC는 오직 GFP보다는 eHLA-G 전이유전자를 포함하지 않는 대조군 ESC이다. "mG1(#1)" 및 "mG1(#2)"은 2개의 상이한 eHLA-G(EF-1α)-GFP 뉴클레오펙션된 hESC 클론을 의미한다. 도 20에 도시된 G0, mG1(#1) 및 mG1(#2) 종양을 측정하고 칭량하였다. G0 hESC는 126.9 입방 밀리미터의 용적 및 32밀리그램의 중량을 갖는 종양을 형성하였다. mG1(#1) hESC는 748.4 입방 밀리미터의 용적 및 318밀리그램의 중량을 갖는 종양을 형성하였다. mG1(#2) hESC는 1116.7 입방 밀리미터의 용적 및 675밀리그램의 중량을 갖는 종양을 형성하였다.
도 21은 5마리의 인간화 NSG 마우스에 대한 hESC 이형이식으로부터의 종양의 평균 결과를 나타낸다. 데이터는 HLA-G 뉴클레오펙션된 hESC("mG1")가 인간화 NSG 마우스로 이식된 야생형 hESC("G0")보다 훨씬 더 크고(3배 초과의 용적) 더 무거운(2배 초과의 중량) 종양을 형성한다는 것을 나타낸다. 따라서, 데이터는 eHLA-G 전이유전자 발현이 감소된 면역원성 및/또는 증가된 면역억제를 제공할 수 있다는 것을 나타낸다. 이것은 치료, 이식, 조직 회복, 세포 및 조직 대체 등을 위한 보편적 또는 더 우수한 동종이계 공여로의 임의의 원하는 세포 유형을 변형하기 위한 본원에 기재된 eHLA-G 전이유전자 작제물의 일반 적용을 지지한다.
인간화 NSG 마우스에 의한 상기 기재된 이형이식 실험을 활발히 증식하거나 증식하도록 유도될 수 있는 임의의 eHLA-G 변형된 세포 유형으로 수행할 수 있다.
또한, 인간화 마우스에서의 이형이식을 620nm 방출 필터 및 2.5초 노출 시간을 갖는 스펙트럼 생체내 영상화 시스템(Caliper(캘리포니아주 마운틴 뷰))을 사용하여 모니터링할 수 있다. 620㎚ 이상의 파장에서, GFP에 의해 경험한 자발형광을 제거하고, 신호는 피부 표면 밑 2.5㎝ 깊이에서 관찰될 수 있다(Shaner et al (2004), Nat Biotechnol, 22:1567-1572). 마우스를 장축으로 영상화하고 주 기준으로 체중을 재었다. 4주 간격 동안 신호가 관찰되지 않는 경우, 마우스를 희생시키고 손상된 가슴 유방 지방층을 형광 현미경 검사를 이용하여 조직학적으로 평가하여 사용된 형광 리포터 단백질을 검출한다. 모든 경우에, 마우스의 희생 시, 조직을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하여 기형종 형성 및 면역 거부에 대해 평가하였다. 면역조직화학을 또한 수행하여 인간 β2 마이크로글로불린(PBMC, hESC, hEEP) 및 CD45(PBMC)를 검출하고, 후자는 이형이식의 면역 세포 침윤의 보충 측정으로 작용한다. 슬라이드를 실험 조건에 맹검인 전문 병리학자가 판독한다.
실시예 8 eHLA -G+- 및 HLA -G - - hEEP 의 종양형성의 평가
세포가 비인간화 NSG 마우스에 이식된다는 것을 제외하고는 실시예 8에 기재된 유사한 프로토콜을 이용하여 형질전환 G+ 및 비형질전환 G--hEEP에 주사함으로써 hEEP 종양형성에 대한 eHLA-G 충격의 영향을 평가한다. 9달 전까지 달 간격으로 또는 안락사 기준을 만족시키는 장축 형광 생 동물 영상화 및 중량 측정을 이용하여 전체 14마리의 마우스를 모니터링한다. 마우스를 이후 희생시키고 주사된 가슴 유선을 4% 중성 완충된 파라포름알데하이드 중에 수확한다. 고정된 조직을 70% 에탄올에 옮기고 파라핀 중에 포매한다. 절편을 헤마톡실린 및 에오신으로 염색하고 형광 리포터 단백질 현미경 검사에 처리한다. 조직 절편이 리포터 단백질 음성인 것으로 발견되는 경우, 이것을 인간 β2 마이크로글로불린 및 CD45에 특이적인 mAb를 사용하여 염색하고, 후자는 주사 부위에서 비-PBMC의 존재를 보장하도록 작용한다.
독립 평균의 통계적 유의성은 0.05 미만의 p 값에 추정된다. 스튜던트t 시험을 이용하여 2개의 샘플 비교를 결정한다. 1차원 또는 2차원 변량 분석 및 본페로니 hoc 후 시험(Bonferroni's post-hoc test)을 이용하여 3개 이상의 평균을 비교한다. 모든 변량의 측정은 평균의 표준 오차로서 제시된다. 선형 회귀를 수행하여 실험실내 데이터와 생체내 데이터 사이의 관계를 비교하여 전자가 이 연구에 사용된 Hu-PBL-NSG 마우스 모델에서 인간 이형이식 거부에 대해 예측 가능한 값을 갖는지를 결정한다. 예를 들어, 실험실내 동종증식의 증가 백분율은 생체내 단계에서 사용된 PBMC 매칭된 쌍에 대해 회귀될 것이다(결과는 이식 4주 후에 리포터 단백질 형광의 수준임). 여기서의 성공적인 결과는 높은 R2 값 및 음의 기울기 계수이고, 이것은 eHLA-G 발현이 생착 증가를 발생시킨다는 것을 제시한다. 이러한 해석은 실험실내 및 생체내 연구에서 사용된 클론에서 eHLA-G 발현과 리포터 단백질 양성 사이의 높은 상관관계에 달려 있다.
실시예 9 완전 분화된 섬유아세포로 안정하게 형질감염된 eHLA -G의 면역억제 및 면역원성 평가
eHLA-G(EF-1α)-GFP 전이유전자 및 대조군 작제물을 뉴클레오펙션을 이용하여 인간 신생 진피 섬유아세포(이미 완전 분화된 세포 유형)로 형질감염하였다. 인간 신생 진피 섬유아세포 세포(HFD)는 ATCC로부터 구입하고 10%의 FBS 및 1%의 PS(인비트로겐)가 보충된 이스코브(Iscove) 변형 둘베코 배지(IMDM)(ATCC)에서 배양하였다. 세포가 80% 포화상태(confluence)에 도달할 때, 0.25%의 트립신-EDTA(인비트로겐)를 37℃에서 3분 동안 항온처리함으로써 세포를 수확하였다. 세포를 계수하고, 0.5 x 106개를 원심분리하고, 인간 진피 섬유아세포 뉴클레오펙션 용액(카탈로그 VPD-1001호, Lonza(Walkersville, MD)) 중에 재현탁시켰다. 헬퍼 및 트랜스포손 플라스미드를 세포 현탁액에 첨가하고, 뉴클레오펙션을 제조업자의 프로토콜(Lonza)에 따라 프로그램 설정 U-020으로 설정하였다. 세포를 이후 6웰 플레이트에서 평판배양하고 습윤 37℃/5% CO2에서 24시간 동안 항온처리하였다. 24시간 후, 안정한 형질감염된 세포를 1㎍/㎖의 퓨로마이신(Sigma)으로 7일 동안 선택하였다. 안정한 GFP 양성 세포를 500ng/㎖의 퓨로마이신 중에 유지시키고, HLA-G 및 GFP 발현을 유세포 분석법으로 검출하였다. 안정한 형질전환체를 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 증식 검정 및 하기 기재된 NK-92 세포독성 검정에서 사용을 위해 배양 중에 유지시켰다.
PBMC 증식 검정. eHLA-G(EF-1α)-GFP 전이유전자("HFD-m1-GFP" 세포) 또는 GFP-단독 대조군 작제물("HFD-G0-GFP" 세포)로 안정하게 형질감염된 인간 진피 섬유아세포를 PBMC 증식을 저해하는 이것의 능력에 대해 평가하였다. HFD-G0-GFP 및 -mG1-GFP 세포를 미토마이신 C(2.5시간 동안 10㎍/㎖)으로 불활성화하고, 96웰 플레이트에서 3.0 x 103/웰로 시딩하고, 24시간 동안 유착하게 하였다. 6㎍/㎖의 PHA의 존재 하의 1 x 105개의 PBMC를 상응하는 HFD 세포에서 3회 첨가하였다. HFD-G0-GFP 및 -mG1-GFP 세포 단독은 MTT-OD 보정을 위해 포함되었다. ("MTT"는 감색의 포르마잔 생성물을 생성시키는 생 세포에 의해 개열된 담황색 기질 시약이다. 이 과정은 활성 미토콘드리아를 필요로 하고, 심지어 새로 죽은 세포는 상당량의 MTT를 개열시키지 않는다. 따라서, MTT는 증식 또는 세포독성 검정에 사용될 수 있는 비색 검정을 제공한다.) PHA를 갖지 않는 PBMC 및 6㎍/㎖의 PHA를 갖는 PBMC는 대조군으로서 포함되었다. 동시배양물을 3일 동안 항온처리하고, PBMC 증식을 하기 식을 이용하여 MTT 시약을 사용하여 예측하였다: PBMC 증식(%) = [(HFD/PBMC/PHA의 OD570 - HFD의 OD570)/(PBMC/PHA의 OD570)]×10. 도 22에 도시된 바대로, HFD-mG1-GFP 단독 "mG1-R1"은 대조군 및 다른 클론보다 PBMC 증식을 크게 억제하고, 이것은 외인성 HLA-G 발현이 분화된 세포, 예컨대 섬유아세포에 대해 면역억제 및/또는 감소된 면역원성을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다.
NK-92 세포독성 검정. 이 검정을 실질적으로 이전에 기재된 바대로 수행하였다. 간단히 말하면, 2.5 x 103개의 표적 세포(즉, HFD-m1-GFP 세포 또는 HFD-G0-GFP 세포)를 CTL 배지 중에 7시간 동안 3:1, 10:1, 30:1 E:T 비율로 NK-92 세포와 항온처리하였다. K562-WT 세포는 NK-92 세포독성에 대한 양성 대조군으로서 포함되었다. 세포독성을 CytoTox96 세포독성 검정 키트로 결정하였다. 특이적 용해의 백분율을 하기한 대로 결정하였다: 특이적 용해(%) = [(실험 LDH 방출 - 이팩터 자발 방출 - 표적 자발 방출)/(표적 최대 방출 - 표적 자발 방출)]×100. 하기 표 4에 기재된 바대로, HFD-mG1-GFP 클론 "mG1-R1" 및 "mG1-#1"은 대조군 및 다른 클론보다 NK-92 세포독성을 크게 억제하고, 이것은 외인성 HLA-G 발현이 분화된 세포, 예컨대 섬유아세포에 대해 면역억제 및/또는 감소된 면역원성을 제공할 수 있다는 것을 나타낸다.
표 4-HFD-G0 및 HFD-G1 표적 세포에 대한 NK-92의 세포 독성
표적 세포
(2.5×103)		 세포독성(%)
10:1 30:1 60:1(E:T)
HFD-G0-2 0 0 15
HFD-mG1-#1 0 1 4
HFD-mG1#3 0 0 0
HFD-mG1-R1 0 1 4
HFD-mG1-R2 2 1 9
K562-WT X 36 44
SEQUENCE LISTING <110> HANTASH, BASIL M. ZHAO, LONGMEI <120> HLA G-MODIFIED CELLS AND METHODS <130> 2200876.126WO1 <140> PCT/US2013/052767 <141> 2013-07-30 <150> 61/677,739 <151> 2012-07-31 <160> 7 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 338 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe 20 25 30 Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala 35 40 45 Met Gly Tyr Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Ser Asp Ser 50 55 60 Ala Cys Pro Arg Met Glu Pro Arg Ala Pro Trp Val Glu Gln Glu Gly 65 70 75 80 Pro Glu Tyr Trp Glu Glu Glu Thr Arg Asn Thr Lys Ala His Ala Gln 85 90 95 Thr Asp Arg Met Asn Leu Gln Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser 100 105 110 Glu Ala Ser Ser His Thr Leu Gln Trp Met Ile Gly Cys Asp Leu Gly 115 120 125 Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly 130 135 140 Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala 145 150 155 160 Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val 165 170 175 Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu 180 185 190 His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro 195 200 205 Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr 210 215 220 Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr 225 230 235 240 Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu 245 250 255 Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val 260 265 270 Val Pro Ser Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu 275 280 285 Gly Leu Pro Glu Pro Leu Met Leu Arg Trp Lys Gln Ser Ser Leu Pro 290 295 300 Thr Ile Pro Ile Met Gly Ile Val Ala Gly Leu Val Val Leu Ala Ala 305 310 315 320 Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala Ala Val Leu Trp Arg Lys Lys Ser 325 330 335 Ser Asp <210> 2 <211> 338 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polypeptide <400> 2 Met Val Val Met Ala Pro Arg 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250 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 4 atttgttcat gcct 14 <210> 5 <211> 264 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 5 tgtgaaacag ctgccctgtg tgggactgag tggcaagatt tgttcatgcc ttccctttgt 60 gacttcaaga accctgactt ctctttgtgc agagaccagc ccaaccctgt gcccaccatg 120 accctcttcc tcatgctgaa ctgcattcct tccccaatca cctttcctgt tccagaaaag 180 gggctgggat gtctccgtct ctgtctcaaa tttgtggtcc actgagctat aacttacttc 240 tgtattaaaa ttagaatctg agtg 264 <210> 6 <211> 1457 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 6 ggatggcggg gctgacgtcg ggaggtggcc tccacgggaa gggacacccg gatctcgaca 60 cagccttggc agtggagtca ggaagggtag gacagattct ggacgccctc ttggccagtc 120 ctcaccgccc cacccccgat ggagccgaga gtaattcata caaaaggagg gatcgccttc 180 gcccctggga atcccaggga ccgtcgctaa attctggccg gcctcccagc ccggaaccgc 240 tgtgcccgcc cagcgcggcg ggaggagcct gcgcctaggg cggatcgcgg gtcggcggga 300 gagcacaagc ccacagtccc cggcggtggg ggaggggcgc gctgagcggg ggcccgggag 360 ccagcgcggg gcaaactggg aaagtggtgt cgtgtgctgg ctccgccctc ttcccgaggg 420 tgggggagaa cggtataaaa gtgcggtagt cgcgttggac gttctttttc gcaacgggtt 480 tgccgtcaga acgcaggtga gtggcgggtg tggcctccgc gggcccgggc tccctccttt 540 gagcggggtc ggaccgccgt gcgggtgtcg tcggccgggc ttctctgcga gcgttcccgc 600 cctggatggc gggctgtgcg ggagggcgag ggggggaggc ctggcggcgg ccccggagcc 660 tcgcctcgtg tcgggcgtga ggcctagcgt ggcttccgcc ccgccgcgtg ccaccgcggc 720 cgcgctttgc tgtctgcccg gctgccctcg attgcctgcc cgcggcccgg gccaacaaag 780 ggagggcgtg gagctggctg gtagggagcc ccgtagtccg catgtcgggc agggagagcg 840 gcagcagtcg ggggggggac cgggcccgcc cgtcccgcag cacatgtccg acgccgcctg 900 gacgggtagc ggcctgtgtc ctgataaggc ggccgggcgg tgggttttag atgccgggtt 960 caggtggccc cgggtcccgg cccggtctgg ccagtacccc gtagtggctt agctccgagg 1020 agggcgagcc cgcccgcccg gcaccagttg cgtgcgcgga aagatggccg ctcccgggcc 1080 ctgtagcaag gagctcaaaa tggaggacgc ggcagcccgg cggagcgggg cgggtgagtc 1140 acccacacaa aggaagaggg ccttgcccct cgccggccgc tgcttcctgt gaccccgtgg 1200 tgtaccggcc gcacttcagt caccccgggc gctctttcgg agcaccgctg gcctccgctg 1260 ggggagggga tctgtctaat ggcgttggag tttgctcaca tttggtgggt ggagactgta 1320 gccaggccag cctggccatg gaagtaattc ttggaatttg cccattttga gtttggagcg 1380 aagctgattg acaaagctgc ttagccgttc aaaggtattc ttcgaacttt ttttttaagg 1440 tgttgtgaaa accaccg 1457 <210> 7 <211> 243 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic polynucleotide <400> 7 gagctcacgg ggacagcccc cccccaaagc ccccagggat gtaattacgt ccctcccccg 60 ctagggggca gcagcgagcc gcccggggct ccgctccggt ccggcgctcc ccccgcatcc 120 ccgagccggc agcgtgcggg gacagcccgg gcacggggaa ggtggcacgg gatcgctttc 180 ctctgaacgc ttctcgctgc tctttgagcc tgcagacacc tgggggatac ggggaaaaag 240 ctt 243

Claims (40)

  1. 유전자 변형이 없는 인간 세포와 비교하여 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제를 갖는 유전자 변형된 인간 세포로서,
    (i) 상기 유전자 변형된 인간 세포는 (a) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 HLA-G 단백질을 코딩하고, 연장 인자-1 알파(EF-1α) 프로모터에 작동적으로 연결된 핵산 서열; 및 (b) 서열 번호 3의 핵산 서열을 포함하는 3' 비번역 구역(UTR)을 포함하는 외인성 핵산을 포함하고;
    (ii) 상기 코딩된 HLA-G 단백질은 적어도 7주 동안 상기 유전자 변형된 인간 세포에 의해 발현되며,
    (iii) 상기 유전자 변형된 인간 세포는 배아 줄기 세포, 이로부터 분화된 배아 표피 전구 세포, 또는 섬유아세포인, 유전자 변형된 인간 세포.
  2. 제1항에 있어서, 상기 HLA-G 단백질은 적어도 20주 동안 발현된, 유전자 변형된 인간 세포.
  3. 제2항에 있어서, 상기 HLA-G 단백질은 적어도 50주 동안 발현된, 유전자 변형된 인간 세포.
  4. 제1항에 있어서, 상기 EF-1α 프로모터는 서열 번호 6의 서열을 포함하는, 유전자 변형된 인간 세포.
  5. 제1항에 있어서, 상기 발현된 HLA-G는 상기 유전자 변형된 인간 세포의 세포 표면에 존재하는, 유전자 변형된 인간 세포.
  6. 제1항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포는 인간 진피 섬유아세포인, 유전자 변형된 인간 세포.
  7. 제1항에 있어서, 상기 유전자 변형이 없는 인간 세포와 비교하여 상기 유전자 변형된 세포의 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제는, (1) 상기 유전자 변형이 없는 인간 세포와 비교하여 상기 유전자 변형된 세포의 NK-92 세포독성의 감소, (2) 상기 유전자 변형이 없는 인간 세포와 비교하여 상기 유전자 변형된 세포의 시험관내 말초 혈액 단핵 세포 증식의 감소, 및, (3) 인간화 NSG 마우스에서, 상기 유전자 변형이 없는 인간 세포와 비교하여 상기 유전자 변형된 세포에 의한 종양 형성의 크기 및 중량의 증가에 의해 결정되는, 유전자 변형된 인간 세포.
  8. 제1항의 유전자 변형된 인간 세포를 포함하는 인공 조직.
  9. 제1항 또는 제6항의 유전자 변형된 인간 세포를 포함하는 피부 이식편, 회복, 또는 재생 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 외인성 핵산은 포유동물 발현 벡터인, 유전자 변형된 인간 세포.
  11. 제10항에 있어서, 상기 포유동물 발현 벡터는 트랜스포손 벡터인, 유전자 변형된 인간 세포.
  12. 제10항에 있어서, 상기 포유동물 발현 벡터는 리포터 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 추가로 포함하는, 유전자 변형된 인간 세포.
  13. (i) 서열 번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 제1 핵산 서열; 및
    (ii) 서열 번호 3의 핵산 서열을 포함하는 3' 비번역 구역을 포함하고 상기 제1 핵산 서열에 작동적으로 연결된 제2 핵산 서열
    을 포함하는, 단리된 핵산.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제2 핵산 서열은 서열 번호 4를 포함하지 않는, 단리된 핵산.
  15. 제13항의 단리된 핵산 및 상기 제1 핵산 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 포유동물 발현 벡터로서, 상기 프로모터는 중국 햄스터 EF-1α 프로모터의 핵산 서열을 포함하고, 상기 프로모터는 인간 배아 줄기 세포 또는 상기 인간 배아 줄기 세포의 분화에 의해 생성된 세포에서 침묵화되지 않은, 포유동물 발현 벡터.
  16. 제15항에 있어서, 리포터 단백질을 코딩하는 제3 핵산 서열을 추가로 포함하는, 포유동물 발현 벡터.
  17. 제15항에 있어서, 상기 포유동물 발현 벡터는 트랜스포손 벡터인, 포유동물 발현 벡터.
  18. (a) 중국 햄스터 EF-1α 프로모터, (b) 상기 프로모터에 작동적으로 연결되고 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 인간 HLA-G를 코딩하는 핵산 서열, 및 (c) 서열 번호 3을 포함하는 3' UTR 서열을 포함하는, 포유동물 발현 벡터.
  19. 제18항의 포유동물 발현 벡터를 포함하는, 유전자 변형된 인간 세포로서, 상기 유전자 변형된 인간 세포는 인간 배아 줄기 세포, 이로부터 분화된 인간 배아 표피 전구 세포, 또는 인간 섬유아세포인, 유전자 변형된 인간 세포.
  20. 필요로 하는 대상체에게 투여하기 위한, 제1항의 유전자 변형된 세포들의 집단을 포함하는 세포 또는 조직 조성물로서,
    상기 조성물은 상기 대상체에 주사되거나, 임플란트되거나, 이식되고, 상기 대상체는 상기 유전자 변형된 세포들의 집단과 비교하여 적어도 하나의 불일치하는 전통적인 HLA I형 또는 HLA II형 분자를 갖고, 상기 유전자 변형된 세포들의 집단은 유전자 변형이 없는 동일한 유형의 세포들과 비교하여 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제를 나타내며, 상기 조성물은 이형이식으로부터 이식편 대 호스트 질환(GVHD)을 치료하는데 사용되는, 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 상기 적어도 하나의 불일치하는 전통적인 HLA I형 또는 HLA II형 분자는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, 및 HLA-DR로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 상기 대상체는 HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DP, HLA-DQ, 및 HLA-DR과 관련하여 유전자 변형된 세포들과 일치되지 않는 조성물.
  23. 제20항에 있어서, 상기 감소된 면역원성 및/또는 개선된 면역억제는 NK-92 세포독성 검정, 인간화 NSG 종양 성장 검정, 및/또는 말초 혈액 단핵 세포 증식 검정에 의해 측정되는 조성물.
  24. 제20항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포들의 집단은 인간 진피 섬유아세포들의 집단을 포함하는 조성물.
  25. 제20항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포들의 집단은 인간 표피 전구세포의 집단을 포함하는 조성물.
  26. 제20항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포들의 집단은 인간 배아 줄기 세포들의 집단을 포함하는 조성물.
  27. 제20항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포들의 집단은 시험관내 분화된 유전자 변형된 인간 배아 줄기 세포들을 포함하는 조성물.
  28. 제20항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포들의 집단은 적어도 2주, 4주, 6주, 8주, 10주, 12주, 14주, 16주, 18주, 20주, 24주, 36주, 48주, 또는 52주 동안 상기 대상체의 면역계에 의해 거부되지 않는 조성물.
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