KR101918526B1

KR101918526B1 - 초석잠 및 멸치 혼합물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 조성물

Info

Publication number: KR101918526B1
Application number: KR1020160093873A
Authority: KR
Inventors: 조영수; 안희영; 김만도
Original assignee: 지에스피주식회사
Priority date: 2016-07-25
Filing date: 2016-07-25
Publication date: 2018-11-14
Anticipated expiration: 2036-07-25
Also published as: KR20180011488A

Abstract

본 발명에 따라 초석잠 및 멸치 혼합물이 포함된 사료를 마우스에 급이하면, 손상된 기억력 및 학습능력에 대해 개선 효과가 있다고 알려진 초석잠이 포함된 사료를 급이하였을 때보다 아세틸콜린의 함량 증가 및 아세틸콜린 분해효소(AChE) 억제 효과가 더 우수하며, 수중 미로시험 및 Y-maze 미로시험에서도 인지 및 학습 능력의 회복효과가 현저하게 우수하므로, 인지기능 또는 기억능력 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 더 유용하게 사용할 수 있다.

Description

초석잠 및 멸치 혼합물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 조성물{Composition for improvement of learning and memory function comprising mixture of Stachys sieboldii and Engraulis japonius as effective component}

본 발명은 초석잠 및 멸치 혼합물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 조성물에 관한 것이다.

의학 기술의 발달과 생활수준의 향상으로 인간의 평균수명은 지난 반세기 동안 두 배 가까이 연장되었으며, 이로 인하여 전체인구에 대한 노인 인구의 비율이 급속하게 증가되었다. 통계청이 발표한 2005년 자료에 의하면, 현재 우리나라 사람의 평균수명은 78.5세이고 2000년도에 이미 65세 이상의 인구 비율이 약 7%에 달하는 등 급속하게 노령화 사회로 진입하고 있음을 알 수 있다. 또한, 우리나라는 2018년에는 고령사회, 2026년에는 노인 인구의 비율이 20% 이상인 초고령화 사회로 진입할 것으로 예측되고 있다. 그리고 2004년에 12.1%이었던 노년 부양비(65세 이상 인구수/15~64세 인구수)는 2020년에는 21.3%, 2030년에는 35.7%로 높아질 전망이며, 2004년에 생산 가능인구 8.2명당 노인 1명을 부양했다면, 2010년에는 6.8명당 노인 1명, 2020년에는 4.7명당 노인 1명, 2030년에는 2.8명당 노인 1명을 부양하는 셈이 된다. 이는 국가적으로 경제 성장 저하, 국가경쟁력 감소 및 세대간 갈등 심화로 인한 사회적 부담의 가능성이 커지는 것을 의미한다.

이러한 사회적 전망과 현실을 반영하듯 최근에는 노인들에게 많이 이환되는 질환에 관심이 집중되고 있다. 특히, 치매(dementia)는 고령일수록 발병률이 두드러지게 높아 75~84세의 노인의 경우, 발병률이 약 20%, 85세 이상의 노인에게는 약 50% 정도에 육박하는 것으로 알려져 있고 질병의 특성상 타인의 보살핌에 절대적으로 의존해야 하므로 중대한 사회적 관심사로 떠오르고 있다. 또한, 치매로 인한 경제적 손실액이 매우 커지고 있으며, 근로 손실 등의 제반 사항을 모두 고려할 때 우리나라의 경우 치매 치료로 인한 사회적 비용은 연간 3조 4000억~4조 4000억 원으로 추산되고 있다. 그리고 미국의 경우, 치매 치료로 인한 손실 비용이 매년 약 1000~1200억 달러에 달하는 것으로 추정된다. 즉, 사회가 점차 고령화되면서 노인성 치매는 21세기 인류가 해결해야 할 최대의 보건문제로 등장하고 있다. 이에 따라, 치매를 비롯한 인지기능장애의 예방 및 치료가 가능한 기능성 물질 및 식품 등의 개발에 대한 요구가 커지고 있는 실정이다.

알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease)는 점진적인 인지기능 및 기억능력의 상실을 초래하는 신경퇴행성 질환(neurodegenerative disease)으로서, 대뇌 기저부의 아세틸콜린(acethylcholine)성 신경세포의 손상에서 비롯된다는 연구결과에 의해 무스카린성 아세틸콜린 수용체(muscarine acetylcholine receptor)에 대한 효능제(agonist), 아세틸콜린 생성촉진제, 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase, AChE)의 활성 저해제 등 여러 가지 작용기전에 따라 아세틸콜린성 신경세포의 기능을 강화시켜줄 수 있는 약물들이 개발되어 왔다. 실제로 현재 각국에서 사용되고 있는 알츠하이머병 치료제는 이러한 아세틸콜린 분해효소 억제제가 대부분이며, 타크린(tacrine)과 도네페질(donepezil) 등이 이에 속한다. 이 밖에도 리바스티그민(rivastigmin), 갈라타민(galatamine) 등이 사용되고 있다.

한편, 초석잠(Stachys sieboldii MIQ.)은 석잠풀의 뿌리를 제외한 식물체 전체를 지칭하는 약용식물이며, 한국·중국 동북부·일본·시베리아 동부·캄차카반도 등지의 산과 들의 습지에서 널리 분포하고 크기는 보통 30-60cm이다. 초석잠에는 항산화, 항노화, 항암 성분 등이 풍부하고, 한방에서도 뇌력증진, 노인성 치매 방지, 뇌경색 예방 및 장수채로서의 효능이 인정되어 한약재로 이용되고 있다.

칼슘은 한국인의 식생활에서 가장 부족하기 쉬운 영양소로 연령대가 올라갈수록 권장섭취량에 대한 섭취비율이 낮아져 65세 이상 노인에서는 60% 수준으로 매우 낮은 것으로 조사되었다. 칼슘의 섭취가 부족하면 뼈 건강 문제뿐만 아니라 순환기계 질환, 동맥경화, 고혈압 및 각종 성인병과도 깊은 연관이 있는 것으로 연구되고 있다. 신경전달 분야에서 대부분의 관심은 신경전달 물질에 국한되어 있지만, 신경전달 과정에서 칼슘은 고리형 AMP(cyclic adenosine monophosphate, c-AMP) 등과 함께 2차 전령의 하나로서 작용하고 있다는 사실을 감안하면 신경전달에서 칼슘의 중요성은 적다고 할 수 없어 1990년대 중반부터 많은 주목을 받아오고 있다. 칼슘의 주요한 공급원 중 하나인 멸치(Engraulis japonicus)는 몸길이가 1∼15㎝에 이르는 다획성, 소형 및 적색육 어류로서 전 세계 해역에서 고루 분포하지만, 한국 연안에서는 연중 생산되는 주요 연근해 어류자원이다. 멸치류의 어육은 일반적으로 다량의 칼슘을 함유하고 있어 대표적인 고칼슘 식품소재로만 인식되는 경향이 있으나 칼슘 이외에도 양질의 단백질과 EPA 및 DHA를 포함한 비교적 다량의 지방을 함유하고 있을 뿐 아니라 각종 유용한 비타민과 무기질 및 핵산 등 좋은 맛을 내는 정미성분들도 다량 함유하고 있어 영양 및 기호성을 특성으로 한 가공식품의 원료로서 잠재적 이용가치가 매우 높은 수산자원이다.

한편, 한국공개특허 제2016-0078054호에는 초석잠 성분에 포함된 기능성 물질 분석방법 및 초석잠을 포함하는 식품 제조방법에 대해 개시하고 있으며, 한국공개특허 제2009-0121689호에는 초석잠 파우더 및 그 제조방법 그리고 이를 첨가한 기능성고추장과 기능성 면류에 대해 개시하고 있다. 하지만, 본 발명의 초석잠 및 멸치 혼합물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 조성물에 대해 아직까지 개시된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명에서는 스코폴라민(scopolamine)을 복강 주사하여 치매가 유도된 마우스에 본 발명의 초석잠 및 멸치 혼합물이 포함된 사료를 급이한 결과, 치매 치료 효과가 있다고 알려진 초석잠이 포함된 사료를 급이한 마우스보다 뇌조직에서 아세틸콜린(acetylcholne) 함량이 더 증가되었으며, 아세틸콜린 분해효소(acetylcholnesterase) 활성의 저해효과도 더 우수하였다. 또한, 수중 미로시험 및 Y-maze 미로시험에서도 본 발명의 초석잠 및 멸치가 포함된 사료를 급이한 마우스가 초석잠이 포함된 사료를 급이한 마우스보다 인지 및 학습 능력의 회복효과가 현저하게 더 뛰어난 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 초석잠 및 멸치 혼합물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 초석잠 및 멸치 혼합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 동물실험 방법에 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 스코폴라민(scopolamine)을 이용한 치매 유도 마우스에 초석잠 및 멸치 혼합물이 포함된 사료를 급이하였을 때, Y-maze 미로시험 결과를 나타낸 것이다. N(Normal)은 정상군이며, C(Control)는 치매 유도물질인 5mg/kg의 스코폴라민을 복강 주사한 것이며, PC(Positive control)는 5mg/kg의 스코폴라민과 치매 치료제인 2mg/kg의 타크린을 복강 주사한 것이며, S(시료군)는 5mg/kg의 스코폴라민을 복강 주사한 후 5중량%의 초석잠이 포함된 사료를 급이한 것이며, 1CS(시료군)는 5mg/kg의 스코폴라민을 복강 주사한 후 4.5중량%의 초석잠과 0.5중량%의 멸치가 포함된 사료를 급이한 것이며, 5CS(시료군)는 5mg/kg의 스코폴라민을 복강 주사한 후 2.5중량%의 초석잠과 2.5중량%의 멸치가 포함된 사료를 급이한 것이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 스코폴라민(scopolamine)을 이용한 치매 유도 마우스에 초석잠 및 멸치 혼합물이 포함된 사료를 급이하였을 때, 모리스 수중 미로시험 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 스코폴라민(scopolamine)을 이용한 치매 유도 마우스에 초석잠 및 멸치 혼합물이 포함된 사료를 급이하였을 때, 아세틸콜린(acetylcholne, ACh)의 함량을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 스코폴라민(scopolamine)을 이용한 치매 유도 마우스에 초석잠 및 멸치 혼합물이 포함된 사료를 급이하였을 때, 아세틸콜린 분해효소(acetylcholnesterase, AChE)의 활성을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 스코폴라민(scopolamine)을 이용한 치매 유도 마우스에 초석잠 및 멸치 혼합물이 포함된 사료를 급이하였을 때, H&E 염색을 통해 마우스 해마부위의 병리조직학적 변화를 분석한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 초석잠 및 멸치 혼합물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물에서, 상기 초석잠 및 멸치 혼합물은 초석잠 및 멸치 분말이 각각 1~10:10~1, 바람직하게는 1:1의 중량 비율로 혼합된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물은 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase)의 활성을 저해할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 건강기능식품 조성물은 인지기능 또는 기억능력을 개선 시키기 위해 섭취할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않는다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함시킬 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등),디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로오스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에서, 인지기능 또는 기억능력의 퇴화로 인해 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 유발되는 질환은 퇴행성 뇌신경 질환으로, 대표적인 퇴행성 뇌신경 질환에는 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 선조체-흑질 퇴행증(Striatonigral degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis: ALS), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico-basal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨슨-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam) 또는 픽병(Pick's disease)이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수도 있다.

본 발명에 따른 조성물의 약학적 투여 형태는 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토스, 텍스트로스 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조 혼합물을 들 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위탭솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우진지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다를 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

재료 및 방법

1. 실험재료 및 식이조성

본 발명에 사용한 초석잠 분말은 지리산홍화인(함양, 경남)에서 2015년 9월에 구입하였고, 멸치 분말은 ㈜ GSP(부산)로부터 제공받아 사용하였다. 식이 조성은 하기 표 1에 개시한 바와 같이 제조하였고, 기억손상을 유발하기 위해 인지시험 24시간 전에 정상군(N)을 제외한 대조군(C), 양성대조군(PC), 시료군(S, 1CS 및 5CS)에 아세틸콜린 수용체 길항제로 작용하여 기억력을 억제시키는 것으로 알려진 스코폴라민 히드로브로마이드(scopolamine hydrobromide, Sigma-Aldrich Co., USA)를 5mg/kg 용량으로 복강 주사하였다. 양성대조군(PC)은 알츠하이머병 치료제로 시판되고 있는 타크린(tacrine)을 2mg/kg 용량으로 복강 주사하였다.

식이 조성

	N	C	PC	S	1CS	5CS
수크로오스(Sucrose)	45	45	45	45	45	45
카제인(Casein)	20	20	20	20	20	20
α-Corn starch	15	15	15	10	10	10
옥수수 오일(Corn oil)	10	10	10	10	10	10
셀룰로오스(Cellulose)	5	5	5	5	5	5
미네랄 믹스(Mineral mix¹ ⁾)	3.5	3.5	3.5	3.5	3.5	3.5
비타민 믹스(Vitamin mix² ⁾)	1	1	1	1	1	1
L-메티오닌(L-methionine)	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3	0.3
콜린 비타트레이트 (Choline bitartrate)	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
초석잠 (Stachyssieboldii MIQ.)	-	-	-	5	4.5	2.5
멸치	-	-	-	-	0.5	2.5
총량(%)	100	100	100	100	100	100

N : 정상군(Normal)

C : 대조군(Control), 치매 유도물질인 5mg/kg의 스코폴라민 복강 주사

PC : 양성대조군(Positive control), 5mg/kg의 스코폴라민 및 2mg/kg의 타크린 복강 주사

S : 시료군, 5mg/kg의 스코폴라민을 복강 주사한 후 5중량%의 초석잠이 포함된 사료 급이

1CS : 시료군, 5mg/kg의 스코폴라민을 복강 주사한 후 4.5중량%의 초석잠 및 0.5중량%의 멸치가 포함된 사료 급이

5CS : 시료군, 5mg/kg의 스코폴라민을 복강 주사한 후 4.5중량%의 초석잠 및 0.5중량%의 멸치가 포함된 사료 급이

¹⁾AIN 93 M-MX mineral mix, MP biomedicals, Illkirch, France

²⁾AIN 93 VX vitamin mix, MP biomedicals, Illkirch, France

2. 실험동물 및 사육조건

실험동물은 ㈜ 대한바이오링크(충북 음성, 한국)로부터 5주령의 Sprague-Dawley계 수컷 흰 마우스를 구입하여 온도 22±2℃, 습도 50±5% 및 명암주기 12시간(9:00~21:00) 조건으로 동물 사육실에서 사육하였다. 1주일간 시판 고형 사료를 급이하면서 사육실 환경에 적응시킨 후, 각 군에서 체중이 동일하게 난괴법(randomized complete block design)으로 분류하여 정상군(N), 대조군(C: 치매 유도물질인 5mg/kg의 스코폴라민 복강 주사), 양성대조군(PC: 5mg/kg의 스코폴라민 및 2mg/kg의 타크린 복강 주사), 시료군(S: 5mg/kg의 스코폴라민을 복강 주사한 후 5중량%의 초석잠이 포함된 사료 급이, 1CS: 5mg/kg의 스코폴라민을 복강 주사한 후 4.5중량%의 초석잠 및 0.5중량%의 멸치가 포함된 사료 급이, 5CS: 5mg/kg의 스코폴라민을 복강 주사한 후 2.5중량%의 초석잠 및 2.5중량%의 멸치가 포함된 사료 급이)으로 총 6군으로 나누었으며, 도 1에 개시한 바와 같이 실험을 진행하였다. 실험동물은 각 군마다 7마리씩 나누고 식이와 물은 자유급이 시켰으며, 사육 기간 중 식이 섭취량은 매일, 체중은 7일을 주기로 일정한 시간에 측정하였다. 이 실험은 동아대학교 동물윤리위원회의 승인(DIACUC-승인-15-13)을 받아 시행하였다.

3. 동물실험, 시료 채취 및 분석시료 조제

동물실험은 3주간 각 군별로 조제 시료를 급이하면서 사육하였고, 실험 최종일 12시간 이상 절식시킨 후 CO₂로 가볍게 마취시켜 해부하였다. 개복 후 복부 대동맥으로부터 채혈하여 혈액을 채취하고, 약 30분간 실온에 방치시킨 후 3,000rpm에서 20분간 원심분리하여 얻은 혈청에 대해 생화학적 분석을 수행하였다. 실험동물의 뇌조직은 적출하고 10배의 균질화 버퍼(12.5mM sodium phosphate buffer pH7.0, 400mM sodium chloride)로 균질화(homogenization)하여 1,000×g에서 10분간 원심 분리한 후 상등액 일부를 효소원으로 사용하였다.

4. 모리스 수중 미로 실험

수중 미로 실험은 모리스의 방법(Morris, R., 1984., J. Neurosci Meth., 11, 47-60)에 따라 수행하였다. 수중 미로 측정 장치는 공간학습 및 기억력을 측정하는 장비로서 지름이 140cm, 높이가 45cm인 원형수조 안에 물을 약 70% 채우고 우유를 넣어 안이 보이지 않도록 하였다. 지름이 15cm, 높이가 35cm인 원형 플랫폼을 수면 아래 1.5cm가 되도록 물 높이를 조절하였으며, 물의 온도는 23~27℃가 되도록 하였다. 원형수조는 4개의 동일한 사분원으로 나누어져서 북동(NE), 북서(NW), 남동(SE) 및 남서(SW)로 구분되고 이중 북동 사분원의 중심부에 원형 플랫폼을 놓고, 나머지 중 하나를 출발위치로 사용하였다.

학습 시험(Training trial)은 흰 마우스를 수조에 넣어서 플랫폼에 도달하는 시간을 90초로 하였다. 마우스가 90초 내에 플랫폼을 찾지 못하면 꺼내어 플랫폼에 올려놓고 15초 동안 방치한 후, 30초 뒤에 흰 마우스를 수조에 넣고 플랫폼에 도달하는 시간을 기록하였다. 마우스가 15초 내에 플랫폼에 도달하게 되면 학습 시험이 완료된 것으로 간주하였다.

기억 시험(test trial)은 학습이 완료된 흰 마우스들을 정상군(N), 대조군(C), 양성대조군(PC) 및 시료군(S, 1CS 및 5CS)으로 나누어 각 군에 대하여 탈출시간(escape time)을 측정하였다. 1일 2회씩 3일 동안 측정하였으며, 측정방법은 상기 학습시험 방법과 동일하며 최대 측정시간은 90초로 하였다.

5. Y-maze 미로 실험

Y-maze 미로는 불투명 아크릴 재질로 3개의 암(arm)으로 구성되어 있으며, 각 암(arm)의 길이×높이×너비는 58cm×25cm×15cm이다. 각 암(arm)을 A, B 및 C로 정한 후 중심에 흰 마우스를 조심스럽게 놓고 10분 동안 흰 마우스가 들어간 암(arm)의 이동경로를 기록하였으며, 1일 2회씩 3일 동안 측정하였다. 3개의 서로 다른 암(arm)에 차례로 들어간 경우, 1점(실제변경, actual alternation)씩 부여하고, 변경 행동력(alternation behavior)은 총 통과횟수(total arm entry)와 점수를 이용하여 다음의 식을 통해 계산하였다.

변경 행동력(%) = (실제변경/최대변경)× 100

(최대변경 = 총 통과횟수 - 2)

6. 뇌조직의 아세틸콜린( acetylcholine ) 함량 측정

아세틸콜린 함량 측정은 헤스트린의 방법(Hestrin, S., 1949, J. Biol. Chem., 180, 249-261)에 따라 알칼리 히드록실아민(alkaline hydroxylamine)을 가진 시그마-아실(σ-acyl) 유도물의 반응을 기초로 측정하였다. 뇌 균질액 50㎕에 1% 히드록실아민 50㎕를 첨가하여 혼합한 후 FeCl₃(10% in 0.1N HCl) 500㎕를 첨가한 후, 흡광도(540nm)를 측정하여 뇌조직의 아세틸콜린 함량을 측정하였다.

7. 뇌조직의 아세틸콜린 분해효소(a cetylcholinesterase , AChE ) 활성 측정

아세틸콜린 분해효소 활성은 아세틸콜린 요오드화물(acetylcholine iodide, Sigma-Aldrich Co.)을 기질로 사용하는 엘만의 방법(Ellman, G. l. et al., Biochem. Pharmacol. 7, 88-95)을 변형하여 측정하였다. 0.1M 인산완충액(phosphate buffer, pH 8.0) 2.6mL, 10mM 엘만 용액(10mM 5,5'-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid, 15mM sodium bicarbonate) 100㎕, 효소원 0.2ml를 큐벳(cuvette)에 넣고 410nm에서 흡광도를 측정한 후, 75mM 아세틸콜린 요오드화물 20㎕를 첨가하여 2분간 흡광도 변화를 측정하여 계산하였다.

8. 뇌조직의 총 단백질 함량 측정

뇌조직의 총 단백질 함량은 로리의 방법(Lowry, O. H. et al., J. Biol. Chem. 193, 265-275)에 따라 BSA(bovine serum albumin, Sigma-Aldrich Co.)을 표준물질로 하여 측정하였다.

9. 해마( hippocampus )의 병리조직학적 관찰

동물해부 직후 적출한 뇌를 냉각 생리식염수로 관류하여 혈액을 제거시킨 상태에서 뇌조직의 해마(hippocampus) 부위를 취해 10% 중성 포르말린 용액에 고정하여 통상적인 조직처리인 파라핀 포매(embedding) 과정을 거쳐 3~4μm 두께로 절편을 H&E(hematoxylin and eosin) 염색한 후 광학현미경(Olympus BX41. Olympus Co., Tokyo, Japan)으로 관찰하였고, 오토매틱 디지털 슬라이드 스캐너(automatic digital slide scanner, 3D Histech)를 이용하여 사진 촬영하였다.

10. 통계처리

실험으로부터 얻어진 결과는 일원분산분석(one-way ANOVA)에 의한 평균과 표준오차(mean± SE)로 표시하였으며, 각 실험군 간의 유의성 검증은 던컨의 다중검증(Duncan's multiple range test)으로 분석하였다.

실시예 1. Y-maze 미로시험에서 초석잠 및 멸치 혼합물의 효과 확인

Y-maze 미로 실험은 동물인지 실험에 사용되는 가장 간단한 미로이며, 다양한 자극을 통해 기억력 및 공간 인지능력을 평가할 수 있는 방법이다. 스코폴라민(scopolamine)으로 유도된 기억력 및 학습능력이 손상된 흰 마우스 모델을 대상으로 Y자 미로 실험을 수행하였다. 10분 동안 흰 마우스의 행동을 관찰한 결과, 도 2에 개시한 바와 같이 N군(정상군, 100%)과 비교해 볼 때, 스코폴라민을 투여한 C군의 기억력 및 공간 인지능력이 현저히 저하된 현상이 관찰되었다. 스코폴라민을 투여한 후 초석잠이 포함된 사료를 급이한 S군은 C군에 비해 기억력 및 공간 인지능력이 증가하였으나, 유의적인 차이가 없었다. 반면, 스코폴라민을 투여한 후 초석잠과 멸치가 포함된 사료를 급이한 CS군(1CS 및 5CS)에서 기억력 및 공간 인지능력이 S군보다 크게 개선된 것을 확인하였으며, 멸치분말 중량%가 높은 5CS군에서 양성대조군인 PC군보다 높은 수치를 나타내어 높은 수준으로 기억력 및 공간 인지능력이 개선된 결과를 보였다.

한편, 운동능력이 변경 행동력(alternation behavior)에 미친 영향을 알아보기 위해 10분 동안 마우스가 Y자 미로의 각 암(arm)을 통과한 총 횟수를 측정하였다. 그 결과, 암(arm)을 통과한 총 횟수는 각 군이 약 20~22회 사이로 유의적인 차이를 보이지 않았다. 이러한 결과는 김 등(Kim, H. J. et al., Kor. J. Food Sci. Technol. 45, 661-665)의 연구결과와 마찬가지로 스코폴라민은 마우스의 기본적인 운동능력에는 큰 영향을 주지 않는 것으로 보이며, 결론적으로, CS군이 기억력 및 공간 인지능력 저하로부터 유발된 행동장애에 대한 개선효과가 있을 것으로 판단된다.

실시예 2. 모리스 수중 미로시험(Morris water maze test)에서 초석잠 및 멸치 혼합물의 효과 확인

스코폴라민(scopolamine)을 복강 주사하여 기억력과 학습능력을 손상시킨 흰 마우스 모델을 대상으로 초석잠 및 멸치 혼합물에 대한 효과를 확인하기 위해, 해마의 의존적 공간학습 능력을 평가하는 모리스 수중 미로 실험(Morris water maze test)을 수행하였다. 플랫폼(platform)을 찾아가는데 걸리는 시간(escape latency)에 대한 측정 결과는 장기기억과 관련된 학습능력을 나타내는 것으로, 하루 2번씩 3일 간 인지훈련을 수행한 결과, 하기 표 2 및 도 3에 개시한 바와 같이 N군(정상군)에 대비하여 C군(스코폴라민 투여)은 수중미로 상의 플랫폼의 위치를 찾아가는데 걸리는 시간(escape latency)이 증가하였으며, 이는 스코폴라민 투여를 통해 기억력 및 학습능력 손상이 정상적으로 유도된 것을 확인할 수 있었다. S군(5mg/kg의 스코폴라민을 복강 주사 + 5중량%의 초석잠이 포함된 사료 급이)은 C군과 비교해볼 때, 학습 훈련기간이 지날수록 걸리는 시간이 점점 감소하여 유의적인 차이를 보였으며 특히, CS군(1CS 및 5CS)은 S군보다 플랫폼(platform)을 찾아가는데 걸리는 시간(escape latency)이 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 5CS과 1CS군 간의 유의적인 차이는 보이지 않아 초석잠 및 멸치 함량에 따른 개선효과는 관찰되지 않았다.

김 등(Kim, D. H. et al., Neurobiol. Learn. Mem. 87, 536-546)의 연구에서 스코폴라민으로 유도된 치매 동물모델실험에서 플라보노이드의 하나인 오록실린-A(oroxylin-A)를 처리하여 훈련기간 및 인지실험기간 동안 수중미로 상의 플랫폼의 위치를 인지하고 반복되는 훈련을 통해 걸리는 시간(escape latency)이 점점 감소된 결과를 보여주었다. 이러한 결과를 바탕으로, 본 발명의 초석잠 및 멸치 혼합물 처리가 공간지각 능력에 대한 장기기억력 개선에 이로운 효과를 미친 것으로 판단된다.

수중미로 상의 플랫폼(platform)을 찾는데 걸리는 시간(escape latency)

	1일	2일	3일
N	10.00±0.82a	8.00±1.27a	6.57±0.65a
C	30.29±2.31b	26.57±2.52b	21.71±2.31b
PC	10.86±0.74ad	8.14±0.91a	7.29±1.15a
S	22.57±1.17c	19.14±2.09c	13.29±2.11c
1CS	14.00±0.87d	12.00±1.20ac	9.14±0.83a
5CS	12.00±1.05ad	10.14±1.01ac	8.71±1.48a

단위: 초(sec)

실시예 3. 초석잠 및 멸치 혼합물 처리에 따른 뇌조직의 아세틸콜린(acetylcholine) 함량 증가 효과

아세틸콜린(acetylcholine, ACh)은 아세틸 CoA(acetyl CoA) 및 콜린 아세틸트랜스퍼라아제(choline acetyltransferase, ChAT)의 효소 작용으로 합성되며, 아세틸콜린에스테라제(acetylcholinesterase)의 작용으로 아세테이트(acetate) 및 콜린(choline)으로 분해된다. ACh은 모든 신경세포에서 발견되는 신경전달물질로 중추신경계의 콜린성 시스템과 매우 관련성이 높다. 콜린성 시스템은 뇌의 신경전달물질계에서도 주요한 시스템 중 하나로 기억, 학습 및 분화에 있어 중요한 역할을 수행한다. 그래서 알츠하이머성 치매 환자에 나타나는 학습능력 및 기억력 감퇴가 콜린성 신경 손상에 의한 것이라는 여러 연구 결과가 발표되고 있으며, ACh 함량의 감소는 인지능력 저하와 관련 있는 것으로 알려져 왔다.

본 실시예 3에서는 초석잠 및 멸치 혼합물을 처리하여 ACh 생성에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 스코폴라민을 투여한 C군의 ACh 함량은 N군(정상군)에 비해 약 31.5% 감소하였으며, 이는 기억력 및 학습능력의 손상을 유발하는 스코폴라민 투여에 의한 것이다. 스코폴라민을 복강 주사한 후 초석잠이 포함된 사료를 급이한 S군과 스코폴라민을 복강 주사한 후 초석잠 및 멸치가 포함된 사료를 급이한 CS군(1CS 및 5CS)의 ACh 함량은 C군에 비해 높은 수치를 나타내었으며, CS군은 S군에 비해 약 10% 높은 ACh 함량을 보였다. 5CS군이 0.43±0.01μmol/mg protein으로 가장 높은 수치를 보였으나, 1CS군과 유의적인 차이는 보이지 않았다. 상기 알츠하이머성 치매에서 ACh 함량이 감소한다는 결과를 통해, 본 발명의 초석잠 및 멸치 혼합물 섭취가 알츠하이머성 치매 환자에게 효과가 있을 것으로 판단된다.

실시예 4. 초석잠 및 멸치 혼합물 처리에 따른 뇌조직의 AChE(acetylcholinesterase) 활성 저해 효과

AChE(acetylcholinesterase) 활성의 증가는 아세틸콜린 함량의 감소와 마찬가지로 인지능력저하와 관련이 있으며, AChE는 아세틸콜린을 아세테이트(acetate) 및 콜린(choline)으로 분해함으로써 콜린작동성 전달(cholinergic transmission)을 저해하고 알츠하이머성 치매 발병에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한, AChE 활성이 증가되면 아세틸콜린의 함량이 감소하여 체내 신경전달이 저하되어 기억력 및 학습능력이 떨어지므로, 알츠하이머성 치매 환자의 치료에 있어 AChE를 억제하여 체내 아세틸콜린의 함량을 증가시키는 방법을 이용하고 있다.

본 실시예 4에서는 본 발명의 초석잠 및 멸치 혼합물이 스코폴라민(scopolamine) 투여를 통해 치매가 유도된 마우스의 AChE 활성에 미치는 효과를 확인하였다. 그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 AChE의 활성은 N군(정상군) 대비 스코폴라민을 투여한 C군에서 약 2.6배 높게 나타내었는데, 상기 실시예 3의 아세틸콜린 함량 측정결과를 참고하였을 때, 스코폴라민 투여에 의해 AChE 활성이 증가하여 아세틸콜린의 함량을 감소시킨 것으로 판단된다. 한편, 스코폴라민을 복강 주사한 후 초석잠이 포함된 사료를 급이한 S군은 C군보다 낮은 AChE 활성을 보였으나, 유의적인 차이는 나타나지 않아 초석잠 자체의 AChE 활성 저해 효과는 없는 것으로 확인되었다. 하지만, 스코폴라민을 복강 주사한 후 초석잠 및 멸치가 포함된 사료를 급이한 CS(1CS 및 5CS)군은 C군보다 AChE 활성이 현저히 감소하였으며, 기존에 치매효과가 있다고 알려진 초석잠이 포함된 사료를 급이한 S군보다 AChE 활성 저해효과가 더 우수할 뿐만 아니라, 양성대조군인 타크린(tacrine)을 투여한 PC군과 유사한 AChE 활성 저해 효과를 나타내었다. 5CS군은 가장 낮은 활성을 보였으나 1CS군과 유의적인 차이는 보이지 않았다. 이와 같은 결과를 토대로, 본 발명의 초석잠 및 멸치 혼합물이 양성대조군인 타크린(tacrine)과 같은 치매 치료제와 같이 AChE 활성을 저해시켜 아세틸콜린의 함량을 증가시키므로 기억력 및 학습능력 개선에 크게 효과가 있을 것으로 판단된다.

실시예 5. 초석잠 및 멸치 혼합물 처리에 따른 해마( Hippocampus ) 부위에서의 병리조직학적 변화 확인

스코폴라민(Scopolamine)은 무스카린 콜린성 수용체 길항제로서 작용하기 때문에 흰 마우스에 투여하면 뇌신경뿐만 아니라 해마의 신경세포들을 손상 및 위축시킨다고 알려져 있다. 따라서 본 실시예 5에서는 실험동물의 뇌조직을 해부한 직후 적출하여 H&E 염색을 통해 광학 현미경으로 해마(hippocampus)을 관찰하였으며, 응축된 신경세포는 화살표를 이용해 표시하였다.

그 결과, 도 6에 개시한 바와 같이 스코폴라민을 투여한 C군에서는 뚜렷하게 둥근 핵을 가지고 일정한 구조를 유지하고 있는 N군(정상군)에 대비하여 해마의 신경세포가 매우 응축되어 있는 것을 관찰할 수 있었으며, 스코폴라민을 복강 주사한 후 초석잠이 포함된 사료를 급이한 S군과 스코폴라민을 복강 주사한 후 초석잠 및 멸치가 포함된 사료를 급이한 CS군(1CS 및 5CS)에서는 C군에 비해 손상이나 응축 정도가 감소하였고, 특히 본 발명의 CS군은 S군보다 응축된 신경세포 수가 현저하게 감소하여 손상 정도가 미약한 것을 관찰할 수 있었다. 따라서, 스코폴라민으로 치매가 유도된 흰 마우스에 본 발명의 초석잠 및 멸치 혼합물이 기존에 치매 효과가 있다고 알려진 초석잠보다 해마의 신경세포 손상을 더 억제하는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

초석잠 및 멸치 분말이 9:1의 중량 비율로 혼합된 초석잠 및 멸치 혼합물을 유효성분으로 함유하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물.
삭제
제1항에 있어서, 상기 혼합물은 아세틸콜린 분해효소(acetylcholinesterase)의 활성을 저해하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 인지기능 또는 기억능력 개선용 건강기능식품 조성물.
초석잠 및 멸치 분말이 9:1의 중량 비율로 혼합된 초석잠 및 멸치 혼합물을 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제5항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌신경 질환은 알츠하이머성 치매(Alzheimer's disease)인 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제5항에 있어서, 상기 초석잠 및 멸치 혼합물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
제5항에 있어서, 상기 조성물은 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽 및 에어로졸 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 퇴행성 뇌신경 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.