KR101911003B1 - 비수리의 초음파 추출물 및 이의 추출방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비수리의 초음파 추출물 및 이의 추출방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 초음파추출법을 이용하여 항산화, 항염 및 항암 효과가 있는 비수리 추출물 및 이를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 비수리 초음파 추출물의 제조방법은 비수리에 용매를 첨가한 후 특정 조건 하에서 초음파를 처리함에 따라 비수리 내에 포함되어 있는 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있으며, 이러한 추출공정을 통해 추출된 비수리 초음파 추출물의 경우 항산화, 항염, 항암 활성이 우수한 효과를 가진다. 따라서 본 발명의 상기 방법을 통해 제조된 비수리 초음파 추출물의 경우 다양한 기능성을 가진 소재로서 의약품, 식품, 화장품 등 다양한 산업분야에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 비수리는 천연 약용식물로서 식용이 가능하므로 이로부터 유래한 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기간 사용에도 안전한 이점을 가진다.

Description

비수리의 초음파 추출물 및 이의 추출방법{Ultrasonic extract of Lespedeza cuneate and method for extracting the same}

본 발명은 비수리의 초음파 추출물 및 이의 추출방법에 관한 것이며, 보다 상세하게는 초음파추출법을 이용하여 항산화, 항염 및 항암 효과가 있는 비수리 추출물 및 이를 효과적으로 제조하는 방법에 관한 것이다.

비수리는 전국 각처의 산과 들에서 자라는 다년생 초본 혹은 초본성 아관목이다. 생육환경은 햇볕이 잘 드는 곳이면 어디든지 자란다. 키는 약 1m이고, 잎은 어긋나고 잎 표면에는 털이 없으며 뒷면에 잔털이 있고 잎의 길이가 1~2㎝, 폭이 0.2~0.4㎝이다. 줄기는 가늘게 위로 올라가며 잔털이 많이 있다. 꽃은 잎보다 짧게 잎겨드랑이에 나비 모양으로 붙어 백색으로 피는데 중앙부에 자주색 줄무늬가 있다. 열매는 암갈색으로 10월에 달리고 안에는 황록색 바탕에 적색 반점이 있는 1개의 씨가 들어 있다. 뿌리를 포함한 전초는 약용으로 이용한다. 생약명으로는 야관문이라 하며 최근에 술을 담가 먹는 경우가 많아졌다.

한편 플라보노이드는 그리스어로 노란색을 의미하는 플라부스(flavus)에서 유래된 말로, 플라본(flavone)을 기본 구조로 갖는 식물색소를 일컫는다. 비타민 P(투과성 비타민) 또는 비타민 C2(비타민 C의 상승제)라고도 한다. 동물에는 비교적 적고 식물의 잎꽃뿌리열매줄기 등에 많이 들어 있다. 또한 항균항암항바이러스항알레르기 및 항염증 활성을 지니며, 독성은 거의 나타나지 않는 것으로 보고되고 있다. 또한 생체 내 산화작용을 억제한다는 사실이 알려지면서 플라보노이드계(系) 물질의 개발 및 활용에 관한 관심이 지속적으로 커지고 있다.

비수리의 페놀성 화합물과 플라보노이드, 토코페롤과 같은 물질은 활성산소종의 작용을 억제하여 암, 심혈관계 질환 등 성인병을 예방하고 노화의 지연과 방지에 기여할 수 있다. 폴리페놀(polyphenols)에 존재하는 다수의 히드록시기(-OH)는 여러 화합물과 쉽게 결합하는 특성을 가지고 있어 항산화 효과 및 항암, 항염 효과가 뛰어나고, 플라보노이드는 활성산소종을 효과적으로 제거하여 항산화능이 높다고 알려져 있으며 폴리페놀과 마찬가지로 항바이러스, 항염증, 항암 효과가 있는 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 비수리 추출물을 효과적으로 제조하는 방법에 대하여 연구가 필요한 실정이다.

일반적으로 비수리 중의 유효성분은 물이나 에탄올 등의 용매를 이용하여 추출할 수 있는데, 물을 사용하여 추출할 경우 높은 온도 및 장시간 추출 조건을 필요로 하여 비수리에 함유된 성분이 분해될 수 있으며, 에피머화 현상으로 인하여 생리활성이 떨어지는 비수리 추출물을 얻게 되는 단점이 있다. 한편, 에탄올 추출의 경우, 추출온도 및 추출시간을 낮춰 추출될 수 있으나, 유기용매를 사용하므로 비용이 증가하며, 환경오염 등의 문제점이 있다.

이에, 본 발명자는 비수리의 유효성분을 효과적이며 빠르게 추출할 수 있는 방법을 찾고자 연구한 결과, 비수리에 에탄올을 첨가한 후 특정조건 하에서 초음파를 처리하는 경우 단순한 에탄올 용매 추출법에 비하여 항산화, 항염 및 항암 활성이 우수한 비수리 추출물을 제조할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국공개특허 제10-2008-0079134호

따라서 본 발명의 목적은 비수리 초음파 추출물을 이용하여 염증질환이나 암과 같은 질환을 예방 또는 치료할 수 있는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 비수리 초음파 추출물을 이용하여 염증질환이나 암과 같은 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비수리 초음파 추출물을 이용하여 염증질환이나 암과 같은 질환을 예방 또는 개선할 수 있는 건강기능식품을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비수리 초음파 추출물을 이용하여 항산화 또는 항염 기능성을 통해 피부를 개선할 수 있는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 비수리의 유효성분을 효과적이며 빠르게 추출할 수 있는 비수리 초음파 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 비수리 초음파 추출물을 제공한다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서,

비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 암질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 비수리 초음파 추출물은 비수리에 에탄올을 첨가한 후 초음파를 처리하여 추출되는 추출물일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 대장암 또는 폐암일 수 있다.

또한, 본 발명은 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 암질환의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 암질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 본 발명은 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 항산화 또는 항염 활성을 갖는 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 화장료 조성물은 유연 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 수중유 형 에멀젼, 유중수 형 에멀젼, 페이스크성 무수 생성물, 고체 무수 생성물, 소구체를 사용한 수성 상에서의 오일 분산물, 이온성 지질 소포체, 비이온성 지질 소포체, 연고, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 팩, 보디오일, 수중유 형 메이크업베이스, 유중수 형 메이크업베이스, 파운데이션, 스킨커버, 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이섀도우, 마스카라, 치크칼라 및 아이브로우펜슬류로 이루어진 군 중에서 선택되는 1종의 제형일 수 있다.

또한, 본 발명은 a) 비수리에 용매를 첨가한 후 초음파를 처리하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계를 거친 용액을 원심분리하고, 분리한 상층액을 여과하는 단계를 포함하는, 비수리 초음파 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 용매는 에탄올일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계는 비수리를 20~60w/v%의 에탄올 수용액에 침지시키고, 20~30℃에서 1~24시간 동안 초음파를 처리할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계는 상기 a) 단계를 거친 용액을 0~10℃에서 3000~5000rpm의 속도로 5~30분간 원심분리하고, 분리한 상층액을 공극이 0.2~10㎛인 멤브레인으로 여과하는 단계일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 b) 단계 이후에 c) 여과된 추출물을 분말화하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 초음파 처리에서 초음파의 주파수는 20~30kHz일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조되는 비수리 초음파 추출물을 제공한다.

본 발명에 따른 비수리 초음파 추출물의 제조방법은 비수리에 용매를 첨가한 후 특정 조건 하에서 초음파를 처리함에 따라 비수리 내에 포함되어 있는 유효성분을 효과적으로 추출할 수 있으며, 이러한 추출공정을 통해 추출된 비수리 초음파 추출물의 경우 항산화, 항염, 항암 활성이 우수한 효과를 가진다. 따라서 본 발명의 상기 방법을 통해 제조된 비수리 초음파 추출물의 경우 다양한 기능성을 가진 소재로서 의약품, 식품, 화장품 등 다양한 산업분야에 유용하게 사용될 수 있다. 특히 비수리는 천연 약용식물로서 식용이 가능하므로 이로부터 유래한 추출물을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 조성물은 장기간 사용에도 안전한 이점을 가진다.

도 1은 추출조건별 비수리 추출물의 총 플라보노이드 함량을 측정한 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 2는 추출조건별 비수리 추출물의 DPPH 라디칼 소거능 측정 결과를 그래프로 나타낸 것이다(IQ: 이소퀘르세틴 처리군, R: 루틴 처리군).
도 3은 추출조건별 비수리 추출물의 NO 생성 억제능 측정한 결과에 그래프로 나타낸 것이다(P3: 이소퀘르시트린 처리군).
도 4는 TNF-α에 의해 산화적 스트레스가 증가한 HUVEC 세포에 추출 조건이 다른 비수리 추출물 각각을 처리하여 NF-κB 프로모터 바인딩 활성억제 효능을 측정한 결과를 나타낸 것이다(P3: 이소퀘르시트린 처리군).
도 5는 비수리의 추출 조건에 따른 수율, 항산화 특성, 항염활성, 항동맥경화활성, 항암활성을 주성분 분석한 결과에 관한 것이다.

본 발명은 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 항산화, 항염 또는 항암 활성이 요구되는 다양한 목적 및 용도로 사용될 수 있으며, 구체적으로는 의약품, 화장품, 식품 및 동물 사료 등 다양한 산업분야에서 적용되는 물품에 항산화 활성을 부여할 수 있는 기능성 소재로 사용할 수 있으며, 또한 의약품 보존제, 화장품 보존제, 식품 보존제, 의약품 첨가제, 화장품 첨가제, 식품첨가제 및 사료첨가제 등의 소재로도 사용될 수 있다.

아래에서는 본 발명의 조성물이 적용될 수 있는 의약품, 식품, 화장품 형태로 자세히 살펴보았다.

본 발명의 조성물은 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 암질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물일 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등을 사용할 수 있다.

상기 약제학적 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

상기 약제학적 조성물의 제제 형태는 과립제, 산제, 정제, 피복정, 캡슐제, 좌제, 액제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효 성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화 할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 비수리 초음파 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.00001 ~ 99 중량%로 포함될 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 있어서, 본 발명의 비수리 초음파 추출물은 조성물에 대해 0.1 내지 1000Oμg/ml의 농도로 포함될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 염증관련 질환으로는, 비염, 천식, 급성통증, 만성통증, 치주염, 치은염, 염증성 장질환, 통풍, 심근경색, 동맥경화, 울혈성 심부전, 고혈압, 협심증, 위궤양, 알츠하이머병, 뇌경색, 다운증후군, 다발성 경화증, 비만, 당뇨, 치매, 우울증, 정신분열증, 결핵, 수면장애, 패혈증, 화상 또는 췌장염 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약제학적 조성물이 치료효과를 나타낼 수 있는 암의 종류로는 위암, 간암, 대장암, 폐암, 유방암, 자궁암, 식도암, 췌장암, 피부암, 혈액암 등을 들 수 있되, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 약학적 조성물을 염증 또는 암 관련 질환의 의심 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 염증 또는 암 관련 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 염증 또는 암 관련 질환의 의심 개체는 염증 또는 암 관련 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하며, 본 발명의 비수리 초음파 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 염증 또는 암 관련 질환 의심 개체에 투여함으로써, 개체를 효율적으로 치료할 수 있다. 염증 또는 암 관련 질환에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는, 어떠한 적절한 방법으로 염증 또는 암 관련 질환 의심 개체에게 본 발명의 약학적 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.

본 발명의 치료 방법은 비수리 초음파 추출물을 포함하는 약학적 조성물을 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "약학적으로 유효한 양"은, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 질병의 종류, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 적합한 총 1일 사용량은 올바른 의학적 판단범위 내에서 처치의에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물은 또한 식품 조성물일 수 있는데, 이러한 식품 조성물은 유효성분인 비수리 초음파 추출물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.

상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 향미제는 천연 향미제 (타우마틴), 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 상기 약제학적 조성물과 동일한 방식으로 제제화되어 기능성 식품으로 이용하거나, 각종 식품에 첨가할 수 있다. 본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등이 있다.

또한 상기 식품 조성물은 유효성분인 본 발명의 비수리 초음파 추출물 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.

이러한 본 발명의 유효성분인 비수리 초음파 추출물은 천연 약용식물로부터 추출된 물질로서 화학약품과 같은 부작용은 거의 없으므로 항산화, 항염, 항암 기능성 부여를 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명은 또한 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 염증질환 또는 암질환 예방 또는 개선용 건강기능식품일 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 염증질환 또는 암질환의 예방 또는 개선용을 목적으로, 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다.

본 발명에서 건강기능식품이라 함은 건강기능식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 말하며, 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

본 발명의 건강기능식품은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 식품 첨가물로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전청에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 식품 첨가물 공전에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼슘, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물; 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물; L-글루타민산나트륨제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류 등을 들 수 있다.

예를 들어, 정제 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분을 부형제, 결합제, 붕해제 및 다른 첨가제와 혼합한 혼합물을 통상의 방법으로 과립화한 다음, 활택제 등을 넣어 압축성형하거나, 상기 혼합물을 직접 압축 성형할 수 있다. 또한 상기 정제 형태의 건강기능식품은 필요에 따라 교미제 등을 함유할 수도 있다.

캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질 캅셀제는 통상의 경질 캅셀에 본 발명의 유효성분인 비수리 초음파 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 충진하여 제조할 수 있으며, 연질 캅셀제는 상기 추출물을 부형제 등의 첨가제와 혼합한 혼합물을 젤라틴과 같은 캅셀기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캅셀제는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

환 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 비수리 초음파 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 성형하여 조제할 수 있으며, 필요에 따라 백당이나 다른 제피제로 제피할 수 있으며, 또는 전분, 탈크와 같은 물질로 표면을 코팅할 수도 있다.

과립 형태의 건강기능식품은 본 발명의 유효성분인 비수리 초음파 추출물과 부형제, 결합제, 붕해제 등을 혼합한 혼합물을 기존에 공지된 방법으로 입상으로 제조할 수 있으며, 필요에 따라 착향제, 교미제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 비수리 초음파 추출물을 유효성분으로 포함하는 건강기능식품은 하기 실시예에서도 확인한 바와 같이 우수한 항산화, 항염, 항암 효과를 실험적으로 입증하였는바, 염증관련 질환이나 암의 예방 또는 개선에 효과적이다.

상기 건강기능식품은 음료류, 육류, 초코렛, 식품류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 사탕류, 아이스크림류, 알코올 음료류, 비타민 복합제 및 건강보조식품류 등일 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 약제학적 조성물 또는 식품 조성물 외에 화장료 조성물일 수 있다.

본 발명의 비수리 초음파 추출물은 항산화활성 및 항염 활성이 탁월함으로, 이러한 비수리 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 인간 세포의 손상을 야기하여 노화를 촉진하고 산화 관련 질환을 매개하는 활성산소종(ROS)으로부터 피부보호 및 피부치료에도 효과적이므로 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 조성물은 상술한 비수리 초음파 추출물뿐만 아니라, 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 상술한 비수리 초음파 추출물 이외에, 비수리 초음파 추출물과 반응하여 피부보호 효과를 손상시키지 않는 한도에서 종래부터 사용되어오던 항산화제를 혼합하여 사용할 수도 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액, 샴푸 등이 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 립스틱, 메이컵 베이스, 파운데이션, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

본 발명은 a) 비수리에 용매를 첨가한 후 초음파를 처리하는 단계; 및 b) 상기 a) 단계를 거친 용액을 원심분리하고, 분리한 상층액을 여과하는 단계를 포함하는, 비수리 초음파 추출물의 제조방법을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명의 상기 a) 단계는 비수리에 용매를 첨가한 후 초음파를 처리하는 단계이다.

상기 용매로는 약학적으로 허용되는 유기용매라면 어느 것을 사용해도 무방하며, 물 또는 유기용매를 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, 예를 들어, 정제수, 메탄올(methanol), 에탄올(ethanol), 프로판올(propanol), 이소프로판올(isopropanol), 부탄올(butanol) 등을 포함하는 탄소수 1 내지 4의 알코올, 아세톤(acetone), 에테르(ether), 벤젠(benzene), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 메틸렌클로라이드(methylene chloride), 헥산(hexane) 및 시클로헥산(cyclohexane) 등의 각종 용매를 단독으로 혹은 혼합하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 에탄올(주정)을 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 20~60w/v% 에탄올을 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 a) 단계는 비수리를 20~60w/v%의 에탄올 수용액에 침지시키고, 20~30℃에서 1~24시간 동안 초음파를 처리하는 단계일 수 있다.

본 발명의 다른 일실시예에 있어서, 상기 초음파 처리에서 초음파의 주파수는 20~30kHz일 수 있다.

본 발명의 상기 b) 단계는 상기 a) 단계를 거친 용액을 원심분리하고, 분리한 상층액을 여과하는 단계로서, 구체적으로 상기 a) 단계를 거친 용액을 0~10℃에서 3000~5000rpm의 속도로 5~30분간 원심분리하고, 분리한 상층액을 공극이 0.2~10㎛인 멤브레인으로 여과하는 단계일 수 있다.

본 발명의 비수리 초음파 추출물의 제조방법은 상기 b) 단계 이후에 추가적으로 c) 여과된 추출물을 분말화하는 단계를 더 거칠 수 있다.

즉, 본 발명의 상기 b) 단계를 통해 추출된 1차 추출물을, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조할 수 있다. 또한 상기 1차 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등과 같은 다양한 크로마토그래피를 이용하여 추가로 정제된 분획을 얻을 수도 있다.

따라서 본 발명에 있어서 비수리 초음파 추출물은 상기 a), b) 및 c) 단계를 거쳐 추출, 분획 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 비수리 초음파 추출물을 제공한다.

본 발명의 비수리 추출물은 단순히 에탄올 용매를 이용하여 추출한 추출물과 비교하여 추출 효율이 증대되며, 더불어 항산화, 항염, 항암 활성에서 더욱 우수한 효과를 보인다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

비수리 추출물의 제조

<1-1> 비수리 분말 준비

본 실험에 사용된 비수리(학명: Lespedeza cuneata, 국내산)는 직접 채취하여 건조시켜 사용하였다. 모든 시료는 pin mill로 0.6mm의 크기로 분쇄 후 냉동보관하며 사용되었다.

<1-2> 에탄올 용매추출법을 이용한 비수리 추출물의 제조

상기 실시예 <1-1>을 통해 준비된 비수리 건조 분말에 100배량(w/v)의 에탄올(60%)을 가하여 25℃에서 24시간 동안 교반하여 추출하였다. 이렇게 제조된 비수리 에탄올 추출물은 하기 실험에서 비교 대조군 시료로 사용되었다.

<1-3> 초음파추출법을 이용한 비수리 추출물 제조

본 발명에 사용되는 초음파추출법은 초음파추출기를 사용하여 28kHz, 진폭 80% 조건에서 초음파를 발생시켜 추출하였으며, 온도를 일정하게 유지하기 위하여 25℃로 순환식 항온 수조(Circulator Water Bath)를 연결하여 사용하였다.

상기 실시예 <1-1>을 통해 준비된 비수리 건조 분말을 0, 20, 40 및 60w/v%의 에탄올 수용액에 각각 침지시키고, 초음파추출법을 이용하여 25℃에서 추출시간을 각각 1, 2, 3, 6, 9, 12 및 24시간으로 하여 비수리의 유효성분을 추출하였다. 추출물을 4℃에서 원심분리(4000rpm, 20분)하고, 분리한 상층액을 공극이 0.22㎛인 멤브레인으로 여과한 후 감압농축(Evaporator, Tokyo rikakikai co.Ltd., japan)하고, 완전히 동결건조하여 최종적인 비수리 초음파 추출물을 제조하였으며, 하기 실험에서 분석시료로 사용하였다.

<1-4> 비수리 추출물의 추출 수율(%)

상기 실시예 <1-2> 및 실시예 <1-3>을 통해 제조된 각각의 비수리 추출물의 추출 수율(%)은 동결건조 후 (건조된 추출물의 중량)/(추출물 제조에 사용된 원료 중량)×100으로 계산하였다. 그 결과 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 기존의 에탄올 60% 용매추출에서 13.5%의 추출수율이 나타난 반면, 초음파추출에서는 추출 조건에 따라 11.5~19%의 추출수율을 보여주었다.

추출조건 및 추출조건별 비수리 추출물의 추출 수율(%)

추출방법	온도 (℃)	시간 (hr)	에탄올 (w/v%)	시료 명칭	추출 수율 (%)
에탄올 용매	25	24	60	L0	13.5
초음파	25	1	0	L1	13.5
			20	L2	15.5
			40	L3	17
			60	L4	15
		2	0	L5	11.5
			20	L6	18
			40	L7	16
			60	L8	13.5
		3	0	L9	14.5
			20	L10	16.5
			40	L11	16.5
			60	L12	12.5
		6	0	L13	13
			20	L14	14.5
			40	L15	16
			60	L16	15
		9	0	L17	14
			20	L18	16
			40	L19	17.5
			60	L20	16
		12	0	L21	15.5
			20	L22	17.5
			40	L23	18.5
			60	L24	19
		24	0	L25	14
			20	L26	18
			40	L27	17.5
			60	L28	17.5

< 실험예 1>

추출조건별 비수리 추출물의 총 플라보노이드 함량

본 실험에서는 상기 실시예 <1-2> 및 실시예 <1-3>을 통해 제조된 각각의 비수리 추출물에 포함된 총 플라보노이드 함량을 측정하였다.

총 플라보노이드 함량은 Folin-Denis 법(Swain T & Hills WE 1959; The phenolic constituents of Prunus domestica I-the quantitative analysis of phenolic constituents. J Sci Food Agric 10: 63-68.)에 따라 측정하였다.

간략하게는, 시료 0.2 mL에 Folin-Ciocalteus phenol reagent 0.1 mL와 증류수 1.4 mL를 첨가하여 혼합한 후, 20% sodium carbonate 0.3 mL를 가하여 암소에서 20분간 방치한 후 765 nm에서 흡광도(microplate spectrophotometer, Epoch, Bioteck, VT, USA)를 측정하였다. 표준물질로는 루틴을 이용하여 함량을 표시하였다.

그 결과 도 1 및 하기 표 2에서 나타낸 바와 같이, 초음파추출법을 사용한 L2(202.36uM 루틴/2mg), L3(232.7uM 루틴/2mg), L6(198.83uM 루틴/2mg), L8(248.5uM 루틴/2mg), L10(203.58uM 루틴/2mg), L24(262.4uM 루틴/2mg)의 결과가 나타났다. 한편, 초음파추출 조건에서 L8, L24가 유의적으로 가장 높은 총 플라보노이드 함량을 나타냈다(p<0.05). 총 플라보노이드 함량이 높은 추출물의 최적 추출 조건은 에탄올 60% 용매추출법보다는 초음파추출에서 에탄올 60% 용매를 사용하는 것이 바람직한 것으로 판단되었다.

추출조건별 비수리 추출물의 총 플라보노이드 함량

추출방법	온도 (℃)	시간 (hr)	에탄올 (w/v%)	시료 명칭	총 플라보노이드 함량 (%)
에탄올 용매	25	24	60	L0	224.79
초음파	25	1	0	L1	166.61
			20	L2	202.36
			40	L3	232.67
			60	L4	204.48
		2	0	L5	145.90
			20	L6	198.83
			40	L7	211.15
			60	L8	248.53
		3	0	L9	99.33
			20	L10	203.58
			40	L11	223.37
			60	L12	180.85
		6	0	L13	171.86
			20	L14	162.57
			40	L15	200.65
			60	L16	218.42
		9	0	L17	150.65
			20	L18	212.87
			40	L19	211.76
			60	L20	219.54
		12	0	L21	189.64
			20	L22	110.65
			40	L23	184.69
			60	L24	262.36
		24	0	L25	105.49
			20	L26	189.43
			40	L27	218.22
			60	L28	217.62

< 실험예 2>

추출조건별 비수리 추출물의 DPPH 라디칼 소거 활성

본 실험에서는 상기 실시예 <1-2> 및 실시예 <1-3>을 통해 제조된 각각의 비수리 추출물의 항산화 활성을 평가하기 위하여 DPPH 라디칼 소거 활성을 조사하였다.

DPPH 라디칼 소거능 측정 방법은 Llorach et al. (2002) 방법을 참고하였다. 간략하게는, DPPH (2,2-diphenyl- 1- picrylhydrazyl) 라디칼에 대한 각 시료의 환원력을 측정하였다. DPPH 용액은 80% 메탄올을 사용하여 10μM로 만들어 사용하였다. 시료 0.1mL와 DPPH 용액 2.9mL를 혼합한 다음 23℃에서 빛을 차단하여 30분 동안 반응시킨 후 spectrophotometer(Agilent 8453, Agilent technologies, CA, USA)를 사용하여 517nm에서 흡광도를 측정하였다. 시료의 활성비교를 위하여 아스코르브산을 표준물질로 사용하였으며 control은 시료 대신 50% 메탄올을 0.1mL 첨가하였고 sample blank는 DPPH 용액 대신 50% 메탄올을 2.9 mL 첨가하여 측정하였다.

DPPH 라디칼 소거능 (%) = (Abs_Blank-Abs_Sample/Abs_Blank)×100

그 결과 도 2 및 하기 표 3에서 나타낸 바와 같이, 기존의 에탄올 60% 추출법을 사용한 L0은 41.4%로 초음파추출법을 사용한 L2(43.5%), L3(59.1%), L4(51.4%), L6(49.7%), L7(48.3%), L8(68.8%), L10(45.5%), L11(54.4%), L12(48.3%), L14(45.7%), L15(49.5%), L16(49.2%), L20(54.2%), L23(47.6%), L24(65.7%), L28(48.3%)보다 낮은 항산화력을 나타냈다. DPPH 라디칼 소거능은 L8, L24, IQ(이소퀘르세틴)에서 유의적으로 가장 높게 나타났다(p<0.05). 추출용매의 에탄올 함량이 높을수록 높은 항산화력을 나타내었다. 항산화력이 높은 추출물의 최적 추출 조건은 에탄올 60% 추출법보다는 초음파추출법을 사용하여 추출용매의 에탄올 비율 20% 이상으로 하여 24시간 이내 추출하는 것이 효율적으로 나타났다.

추출조건별 비수리 추출물의 DPPH 라디칼 소거능

추출방법	온도 (℃)	시간 (hr)	에탄올 (w/v%)	시료 명칭	DPPH 라디칼 소거능 (%)
에탄올 용매	25	24	60	L0	41.38
초음파	25	1	0	L1	34.47
			20	L2	43.54
			40	L3	59.14
			60	L4	51.45
		2	0	L5	27.56
			20	L6	49.68
			40	L7	48.29
			60	L8	68.77
		3	0	L9	31.27
			20	L10	45.53
			40	L11	54.38
			60	L12	48.25
		6	0	L13	28.98
			20	L14	45.66
			40	L15	49.46
			60	L16	49.20
		9	0	L17	27.60
			20	L18	39.05
			40	L19	39.87
			60	L20	54.21
		12	0	L21	32.27
			20	L22	29.03
			40	L23	47.60
			60	L24	65.66
		24	0	L25	12.14
			20	L26	28.47
			40	L27	42.12
			60	L28	48.34

< 실험예 3>

추출조건별 비수리 추출물의 NO(일산화질소) 생성억제 효능

본 실험에서는 상기 실시예 <1-2> 및 실시예 <1-3>을 통해 제조된 각각의 비수리 추출물의 항염 활성을 평가하기 위하여 NO(일산화질소) 생성억제 효능을 조사하였다.

<3-1> 세포배양

마우스 대식세포 Raw 264.7 세포는 10% fetal bovine serum(FBS)와 100 U/mL의 penicillin, 100 mg/mL의 streptomycin을 첨가한 DMEM 배지와 Human Endothelial Growth Medium에서 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 세포는 70-80% confluent를 유지하도록 2일 간격으로 계대 배양 하여 실험에 사용하였다.

<3-2> NO 생성억제 효능 측정

Raw 264.7 세포를 10% FBS DMEM 배지를 이용하여 세포 수 2×10⁷ cells/mL로 조절한 후 96 웰 플레이트에 배양하였다. 24시간 후 추출 조건별 시료를 1시간 전 처리한 후 다시 LPS(1 μg/mL)와 시료를 포함하는 배지로 교환하여 다시 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 반응을 이용하여 측정하였다. 세포배양 상등액 50 μl와 Griess 시약[1%(w/v) sulfanilamide, 0.1%(w/v) naphtylethylenediamine in 2.5%(v/v) phosphoric acid] 50 μl 를 혼합하여 96 웰 플레이트에서 10분 동안 반응시킨 후 microplate reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였고, sodium nitrite(NaNO₂)를 단계적으로 희석하여 얻은 표준농도 곡선에 대한 값으로 정량화 하였다.

참고로, NO(일산화질소)는 NOS에 의한 L-arginine으로부터 생성되는데 그람음성 박테리아의 세포벽성분인 LPS(lipopolysaccharide)가 대식세포의 TLR(Toll like receptor) 4와 결합하면 NF-κB 전사인자를 활성화하여 iNOS의 단백질 발현을 촉진시키며 결국, 과량의 NO가 생성되게 된다. 이렇게 생성된 NO는 활성산소의 일종으로 세포독성, 조직손상에 관여하며 특히 염증유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 따라서 NO 생성을 억제하는 소재의 경우 항염증 기능성 소재로 유용하게 사용될 수 있다.

그 결과 도 3 및 하기 표 4에서 나타낸 바와 같이, 모든 조건의 추출물에서 추출물을 넣지 않은 LPS군과 비교하여 NO 생성량이 감소하였다. 또한 비수리에 함유된 대표적인 기능성 물질 중 하나인 이소퀘르시트린 20μM로 처리 하였을 때와 비교하여 비슷한 수준의 NO 형성 억제효과를 가진 추출물들을 확인할 수 있었다. 가장 높은 NO 억제 활성을 보인 추출물은 L28(24시간, 에탄올 60%, 초음파)로 약 61%의 억제활성을 보인 것으로 측정되었다.

추출조건별 비수리 추출물의 NO 생성억제능

추출방법	온도 (℃)	시간 (hr)	에탄올 (w/v%)	시료 명칭	Anti-inflammatory (NO production, % inhibition)
에탄올 용매	25	24	60	L0	54.89
초음파	25	1	0	L1	37.34
			20	L2	43.19
			40	L3	45.42
			60	L4	44.05
		2	0	L5	39.23
			20	L6	43.01
			40	L7	46.46
			60	L8	48.18
		3	0	L9	40.43
			20	L10	43.70
			40	L11	43.53
			60	L12	46.46
		6	0	L13	36.65
			20	L14	44.22
			40	L15	49.72
			60	L16	9.72
		9	0	L17	38.20
			20	L18	44.05
			40	L19	51.27
			60	L20	52.48
		12	0	L21	38.89
			20	L22	33.21
			40	L23	41.47
			60	L24	44.91
		24	0	L25	38.54
			20	L26	49.38
			40	L27	53.85
			60	L28	61.25

<실험예 4>

추출조건별 비수리 추출물의 TNF-α에 의한 NF-κB 프로모터 바인딩 활성 억제 효능

본 실험에서는 상기 실시예 <1-2> 및 실시예 <1-3>을 통해 제조된 각각의 비수리 추출물의 심혈관 건강조절효능을 스크리닝하기 위하여, TNF-α에 의해 산화적 스트레스가 증가한 혈관내피세포에 추출 조건이 다른 비수리 추출물을 처리하여 NF-κB 프로모터 바인딩 활성억제 효능을 측정하였다.

최근에는 혈관질환의 발생 원인으로 혈관 내에서의 염증반응에 대한 관심이 증가되고 있다. 염증은 조직의 손상을 비롯한 외부로 부터의 자극 등 다양한 감염원에 대한 체내 반응 중 하나로서, 다양한 면역세포가 유기적인 상호작용을 하게 된다. 동맥경화 유발은 각종 위험인자들의 반복되는 물리적 또는 화학적 자극 및 생물학적 손상에 의한 혈관 내피세포의 손상에 의한 것이며 내피세포의 손상에 산화적 스트레스와 염증이 중요한 역할을 한다는 인식이 대두되고 있다는 것이다. 활성화된 대식세포는 여러 가지 사이토카인과 활성산소종을 생성하여 염증반응의 전사인자인 nuclear factor-κB(NF-κB)를 활성화시키며 그 결과 inducible nitric oxide synthase(iNOS), cyclooxygenase-2(COX-2)를 발현시켜 염증이 일어나게 된다. 이러한 염증반응이 혈관 내에서 지속 적으로 또는 과도하게 일어나면 동맥경화의 초기반응이 활성화된다.

따라서 본 실험에서는 염증반응의 전사인자인 NF-κB의 활성억제 효능을 통해 실제 본 발명의 비수리 추출물이 심혈관 건강조절효능을 갖는지 여부를 평가하였다.

<4-1> Transformation 및 DNA 추출

Competent cell에 MMP-1 plasmid DNA를 42℃로 1분 배양하고 반응액을 LB 배지 0.4 mL에 넣고 37℃에서 250 rpm으로 1시간 동안 진탕 배양하였다. 미리 만들어 놓은 LB 배지 플레이트(ampicillin 100 μg/mL)에 진탕 배양한 배지를 도말하고 37℃에서 24시간 배양하였다. 다음 날 액체 LB 배지(ampicillin 100 μg/mL) 100 mL에 single colony를 접종하고 37℃에서 진탕 배양하였다. 세포가 충분히 자라면 Plasmid midi kit(QIAGEN)을 이용하여 DNA를 추출하였다. DNA 추출은 시약 제조사가 제공한 시험법(QIAZEN) 에 따라 수행하였다.

<4-2> Transfection

293T 세포에 NF-κB-luciferase viral vector를 transfection 하여 viral particle을 얻었다. 293T 세포를 10 cm dish에 7×10⁵ cell/plate로 분주 한 후 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 transfection을 위하여 항생제가 없는 serum free 배지로 교환하고 4 μg MMP-1 plasmid DNA, psPAX2, pMD2G DNA 각각 3 μg, 100 μl Opti MEM 혼합액과 20 μl lipofectamine, 100 μl Opti MEM 혼합액을 만들어 준비하였다. 준비한 DNA 혼합물과 transfection reagent를 혼합 후 vortexing 하고 상온에서 5분간 반응시킨 후 DNA-reagent mixture를 배지에 넣어 혼합하고 24시간 배양하였다.

<4-3> Infection

혈관내피세포(Human Umbilical Vein Endothelial Cell: HUVEC)는 60% confluent가 되도록 미리 준비하였다. 새로운 배지 5 mL과 transfection 시킨 cell의 배지 5 mL을 혼합 후, 0.45 μM membrane filter로 filter하였다. 준비 된 cell의 배지를 제거하고, Polybrene 1 μl/mL를 함유하는 filteration 된 배지를 넣은 후 24시간 배양하였다. 이후 infection되지 않은 control 세포와 infection 한 세포에 puromycin이 1 μg/mL를 함유한 배지로 교환하여, infection 되지 않은 세포가 100% 사멸될 때까지 selection을 실시하였다. 선택된 배지를 배양함으로써 Nuclear factor-kappa B(NF-κB) luciferase 발현 HUVEC 세포주를 구축하였다.

<4-4> 심혈관 건강조절효능 스크리닝

NF-κB luc 발현된 HUVEC 세포를 계수 후 96 웰 플레이트에 2×10⁴ cells/mL로 분주하고 5% CO₂, 37℃ 세포 배양기에 24시간 배양하였다. Serum free 배지로 교환하여 24시간 배양하였다. 24시간 후 시료를 100 μg/mL 농도로 처리 1시간 후 Tumor Necrosis Factor-αlpha(TNF-α)를 가하고 3시간 뒤 배지를 제거하고 100 μl의 lysis buffer로 세포를 1시간 동안 용해하였다. 용해액 50 μl에 50 μl의 luciferase reagent를 첨가하여 Spectramax (Molecular devices, Silicon Valley, CA, United States)를 이용하여 측정하였다.

그 결과 도 4 및 하기 표 5에서 나타낸 바와 같이, 추출 조건별로 100μg/mL의 농도로 처리하였을 때, L0(24시간, 에탄올 60%, 진탕)에서는 64.8%, L20(9시간, 60% 에탄올, 초음파)에서 68.9%로 가장 크게 억제 효능이 나타났으며, 초음파가 더 짧은 시간에서 비슷한 수준으로 억제하였다. 이소퀘르시트린인 P3은 37.5%로 억제하였다.

추출조건별 비수리 추출물의 NF-κB 프로모터 바인딩 활성억제 효능

추출방법	온도 (℃)	시간 (hr)	에탄올 (w/v%)	시료 명칭	Anti-atherosclerosis (NF-κB transactivity, % inhibition)
에탄올 용매	25	24	60	L0	64.86
초음파	25	1	0	L1	61.00
			20	L2	43.78
			40	L3	55.01
			60	L4	50.60
		2	0	L5	53.68
			20	L6	63.89
			40	L7	38.44
			60	L8	29.85
		3	0	L9	29.64
			20	L10	65.39
			40	L11	61.00
			60	L12	54.14
		6	0	L13	56.93
			20	L14	37.36
			40	L15	42.24
			60	L16	27.31
		9	0	L17	23.32
			20	L18	46.82
			40	L19	36.73
			60	L20	36.85
		12	0	L21	52.73
			20	L22	68.94
			40	L23	45.21
			60	L24	35.97
		24	0	L25	68.01
			20	L26	66.40
			40	L27	-3.90
			60	L28	54.29

< 실험예 5>

추출조건별 비수리 추출물의 항암 효능

본 실험에서는 상기 실시예 <1-2> 및 실시예 <1-3>을 통해 제조된 각각의 비수리 추출물의 항암 효과를 살펴보기 위하여, 인간 대장암세포주 및 폐암세포주에 본 발명의 추출조건별 비수리 추출물을 처리한 후 암세포 사멸 정도를 측정하였다.

자세하게는, 인간 대장암세포(HT29, HCT116)와 폐암세포(HCC827, HCC827 GR)를 4×10⁴ cell/mL의 농도가 되도록 한 후 96 웰 플레이트에 24시간 배양하였다. 이후 추출물을 100 μg/mL의 농도로 처리한 후 다시 24시간 배양하고, MTS([3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium)와 phenazine methosulfate(PMS) 혼합액 20 μL를 가하고 1시간 후 492 nm와 690 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 추출물의 암세포의 사멸효능은 492 nm 흡광도에서 690 nm 흡광도를 빼 준 후 무처리군을 100%으로 하여 상대적인 값을 나타냈다.

그 결과 하기 표 6에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 비수리 추출물이 폐암세포 및 대장암 세포에 대한 항암 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 특히, L2, L6 및 L10에서 항암 효과가 전반적으로 우수하게 나타났으며, 폐암 세포주인 HCC 827 세포에 대한 항암 활성이 종래 에탄올 추출법으로 제조된 옥수수 에탄올 추출물 대비 3시간 또는 12시간 초음파 처리를 거친 시료(L9, L10, L11, L21, L22, L23)에서 두드러지게 높은 사멸 효과를 보임을 확인하였으며, 또한, 대표적인 항암제 내성 대장암세포인 HCT 116 세포에서 L14(6시간, 에탄올 20%, 초음파)가 36.8%로 가장 크게 생존을 억제하였다. 반면에, 비수리의 주된 기능성 물질로 알려진 이소퀘르시트린을 20 μM로 처리하였을 때는, 암세포의 생존을 14.2%로 억제하는 것으로 나타나, 본 발명의 비수리 추출물이 더욱 우수한 함암 활성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

추출조건별 비수리 추출물의 암세포 사멸효능

추출방법	온도 (℃)	시간 (hr)	에탄올 (w/v%)	시료 명칭	암세포 사멸효능
					HCC 827	HCC 827 GR	HCT 116	HT 29
에탄올 용매	25	24	60	L0	1.13	18.14	29.42	25.27
초음파	25	1	0	L1	-5.53	11.95	23.02	10.88
			20	L2	4.20	15.59	29.49	13.03
			40	L3	4.20	19.50	31.37	24.48
			60	L4	-1.87	19.85	30.34	21.57
		2	0	L5	-12.13	19.69	32.05	20.96
			20	L6	3.93	12.11	26.73	14.21
			40	L7	5.33	-28.24	27.91	24.08
			60	L8	9.40	16.67	24.13	24.54
		3	0	L9	11.33	20.46	30.79	23.93
			20	L10	14.67	21.90	27.13	21.30
			40	L11	10.67	19.34	13.49	20.84
			60	L12	2.27	10.99	14.63	7.97
		6	0	L13	2.40	14.04	31.34	12.24
			20	L14	3.20	22.36	36.88	13.97
			40	L15	4.33	23.44	36.11	24.69
			60	L16	4.73	23.71	25.19	19.57
		9	0	L17	4.20	16.02	24.88	33.57
			20	L18	4.67	20.54	25.40	-2.57
			40	L19	5.07	25.15	19.37	24.42
			60	L20	6.80	26.89	22.90	32.93
		12	0	L21	13.67	25.45	25.00	33.26
			20	L22	14.20	20.35	26.18	27.20
			40	L23	19.53	24.37	19.43	26.99
			60	L24	5.87	14.78	15.50	-3.51
		24	0	L25	7.13	13.04	33.26	15.33
			20	L26	2.20	12.03	29.89	-23.1
			40	L27	11.73	25.84	29.30	22.81
			60	L28	8.40	16.94	21.13	22.78

< 실험예 6>

추출조건별 비수리 추출물의 주성분 분석

비수리의 추출 조건에 따른 수율(Yield), 항산화 특성(DPPH 라디칼 scavenging; DPPH, Total flavonoid content; TF), 항염활성(Anti-inflammatory; AI), 항피부노화활성(Anti-photoaging; AP), 항동맥경화활성(Anti-atherosclerosis; AA), 항암활성(HCC827; H8, HCC827GR; H8G, HCT116; HCT116; 116, HT29; 29)을 주성분분석(principal component analysis; PCA)한 결과를 도 5에 나타내었다.

그 결과 제1주성분(PC1)과 제2주성분(PC2)이 각각 34.93%와 16.19%를 설명하여 총 변동의 51.12%를 설명하였다. 초음파추출 조건에서 제1주성분의 음의 방향에 위치한 시료는 주로 3시간, 9시간, 12시간, 24시간이었고 용매농도는 20%, 40%, 60% 에탄올 추출물들이었다. 그 중 L10(초음파-3시간-20% EtOH), L27(초음파-24시간-40% EtOH) 비수리 추출물에서 수율과 항암활성이 높게 부하된 것을 확인할 수 있었다. 제2주성분의 음의 방향에 위치한 시료는 주로 1시간, 2시간, 3시간, 6시간 및 60% 에탄올 추출물들로 그 중 L3(초음파-1시간-60% EtOH), L16(초음파-6시간-60%) 비수리 추출물에서 항산화 특성과 항동맥경화 활성이 높게 부하된 것을 확인할 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (7)

1. 삭제
2. 삭제
3. 삭제
4. a) 비수리를 20 w/v%의 에탄올 수용액에 침지시키고, 25℃에서 3시간 동안 20~30kHz의 주파수로 초음파 처리하는 단계; 및
   b) 상기 a) 단계를 거친 초음파 처리 용액을 원심분리하고, 분리한 상층액을 여과하는 단계를 포함하는, 비수리 초음파 추출물의 제조방법.
5. 제4항에 있어서,
   상기 b) 단계는 상기 a) 단계를 거친 초음파 처리 용액을 0~10℃에서 3000~5000rpm의 속도로 5~30분간 원심분리하고, 분리한 상층액을 공극이 0.2~10㎛인 멤브레인으로 여과하는 단계인 것을 특징으로 하는, 비수리 초음파 추출물의 제조방법.
6. 제5항에 있어서,
   상기 b) 단계 이후에 여과된 추출물을 분말화하는 단계를 추가적으로 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 비수리 초음파 추출물의 제조방법.
7. 삭제

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