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KR101875199B1 - Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｂｃｒ-ａｂｌ 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법 및 키트 - Google Patents

Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｂｃｒ-ａｂｌ 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법 및 키트 Download PDF

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KR101875199B1
KR101875199B1 KR1020100112072A KR20100112072A KR101875199B1 KR 101875199 B1 KR101875199 B1 KR 101875199B1 KR 1020100112072 A KR1020100112072 A KR 1020100112072A KR 20100112072 A KR20100112072 A KR 20100112072A KR 101875199 B1 KR101875199 B1 KR 101875199B1
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gene
abl fusion
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Abstract

본 발명은 BCR-ABL 융합 유전자중 ABL 유전자 엑손 6의 315번 야생형 코돈(T315)과 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 이용하여 야생형의 증폭을 억제함으로써 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

ＰＮＡ 기반의 실시간 ＰＣＲ 클램핑을 이용한 ＢＣＲ-ＡＢＬ 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법 및 키트{Methods and kits for the detection of BCR-ABL fusion gene mutant using PNA mediated Real-time PCR clamping}
본 발명은 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid, 이하 'PNA'라 함) 프로브를 이용한 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, BCR-ABL 융합 유전자 중 ABL 유전자 엑손 6 코돈 315의 돌연변이 검출을 위하여 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브가 야생형의 증폭을 억제함으로써 소량의 돌연변이형만을 높은 민감도로 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
암의 발생에 암유전자(oncogene) 및 종양억제유전자(tumor suppressor gene)의 돌연변이가 관여한다는 사실이 알려지면서 여러 암유전자 및 종양억제유전자의 돌연변이를 검출하는 연구가 다양하게 진행되고 있다. 이에 따라, 암의 발생 및 약물의 예후판단에 관여하는 많은 돌연변이가 발견되고 있다.
BCR-ABL은 다른 염색체에 존재하는 유전자가 융합된 유전자로서, 타이로신 키나제(tyrosine kinase) 유전자의 일종이다. 즉, 22번 염색체 장완부위에 존재하는 BCR 유전자와 9번 염색체의 장완부위에 존재하는 ABL 유전자가 서로 전좌되면서 22번 염색체 장완부위에 ABL 유전자가 융합된 유전자로서, BCR-ABL 융합 유전자가 존재하는 염색체를 '필라델피아 염색체'라고 부른다(Nowell PC et al., Science 1960;132:1497, Rowley JD et al., Nature 1973;243:293). 필라델피아 염색체는 만성 골수성 백혈병(chronic myeloid leukemia, CML) 환자의 90% 이상에서 나타나고 있으며, 다른 골수성 백혈병에서도 발견된다는 보고가 있다. 필라델피아 염색체, 즉 BCR-ABL 융합 유전자가 만성 골수성 백혈병의 발생 및 진행과 관련되어 있다는 연구결과는 수차례 보고된 바 있다. 이러한 결과를 바탕으로 BCR-ABL 융합 유전자의 발현을 억제하여 만성 골수성 백혈병의 진행을 막는 표적치료가 수행되고 있다. 표적 치료제로서는 이마티닙(Imatinib, Gleevec)이 대표적으로, 이 약제의 원리는 BCR-ABL 유전자의 발현으로 생성되는 BCR-ABL 타이로신 키나제의 활성화를 주도하는 ATP와의 결합을 억제함으로써 BCR-ABL 타이로신 키나제 활성을 억제하여 결국 BCR-ABL 타이로신 키나제에 의한 신호전달 경로로 암세포 성장을 일으키는 시스템을 막는 것이다. 이때 BCR-ABL 유전자의 키나제 도메인 부위의 돌연변이는 약제내성을 야기한다(Druker BJ et al., Nat Med. 1996;2:561-6). c-ABL 키나제 도메인의 ATP-결합 포겟에서 트레오닌(threonine)의 이소류신(isoleucine)으로의 단일 아미노산 치환(Thr315Ile, T315I)이 이마티닙에 대한 후천적 내성과 관련이 있는 것으로 제안되었다(Gorre ME et al., Science 2001;293:876-80). 따라서 BCR-ABL 유전자의 키나제 도메인 부위에서의 돌연변이, 특히 T315I의 검출은 이를 표적으로 치료하는 데 있어서 치료효과를 예측할 수 있는 중요한 지표이며, 좋은 예후에 결정적인 역할을 할 수 있다.
BCR-ABL 돌연변이의 검출 방법으로는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 후 염기서열분석을 통한 변이 검출 방법, 야생형과 돌연변이 유전자의 3차원적인 구조(conformation) 차이에 따른 전기영동상 이동 거리의 변화를 통해 검출하는 방법인 중합효소연쇄반응-단일쇄 형태구조 다형성(Polymerase chain reaction-single strand conformational polymorphism; PCR-SSCP) 방법 등이 사용되어 왔다(EI-Habr EA et al., Clin Neuropathol. 2010;29(4):239-45). 그러나 상기 방법들은 PCR 이후 제한효소로 절단하는 과정 및 전기영동의 과정, 염기서열분석의 단계를 거쳐 돌연변이를 검출하는 방법이므로 반응시간이 오래 소요되고 번거로우며 많은 비용이 소요된다. 또한 임상 시료내에는 돌연변이가 야생형에 비해 아주 극소량 존재하는 경우가 많기 때문에, 소량의 돌연변이를 검출하는 것이 매우 중요함에도 불구하고, 상기의 방법은 낮은 검출 민감도를 가지므로 극소량의 돌연변이 검출이 어렵다(EI-Habr EA et al., Clin Neuropathol. 2010;29(4):239-45).
민감도를 증가시키기 위해 야생형과 돌연변이간의 용융온도 차이를 이용하여 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 고감도 용융온도분석(high-resolution melting curve analysis, HRMA) 방법, 스코피언(scorpion) 프로브를 이용하여 돌연변이를 선택적으로 검출하는 스코피언 실시간 대립형질 특이적 PCR(scorpion Real-time allele specific PCR)(DxS' scorpions® and ARMS®) 방법 등이 사용되고 있다(Simi L et al., Am J Clin Pathol. 2008;130(2):247-53, Board RE et al., Clin Chem. 2008;54(4):757-60). 이러한 기술은 쉽고 빠르게 다양한 진단에 적용이 가능하며, 암 관련 유전자의 변이 진단 및 분석을 위해 좋은 기술이 되고 있다(Bernard PS et al., Clin Chem. 2002;48(8):1178-85). 그러나 상기한 방법은 돌연변이를 검출하기 위하여 돌연변이가 발생하는 부위에 각각 프로브나 프라이머를 모두 사용해야 하기 때문에 하나의 돌연변이를 검출하기 위하여 여러 반응이 요구되는 번거로움이 있다(Simi L et al., Am J Clin Pathol. 2008;130(2):247-53, Board RE et al., Clin Chem. 2008;54(4):757-60).
최근에는 돌연변이형을 선택적으로 검출하는 기술로 상기한 방법과는 달리 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 이용하여 다량 존재하는 야생형의 증폭을 억제하는 방법으로 돌연변이를 선택적으로 검출하는 PNA 클램핑(clamping) 기술이 개발되었다. PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다(Nielsen PE et al., Science 1991;254(5037):1497-500). PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥보다, PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다. PNA 클램핑 기술은 상기한 PNA의 장점을 이용하여 PNA 프로브가 완벽하게 결합되면 효소 등이 인지하지 못하여 증폭반응이 일어나지 않고, 점 돌연변이가 있는 경우에는 PNA 프로브가 완벽하게 결합하지 못하기 때문에 증폭반응이 일어나게 되는 원리를 이용하는 방법으로, 야생형에 비해 극소량 존재하는 돌연변이를 빠르고 정확하게 검출할 수 있어 많이 이용되고 있다(Oh JE et al. J Mol Diagn. 2010;12(4):418-24.)
문헌 [Kreuzer KA et al., Ann Hematol., 2003;82(5):284-9]에 c-ABL cDNA의 엑손 4 내지 6 부위를 증폭시키는 프라이머 세트(ABLx4 F, ABLx56 FM, ABLx6 R)와 야생형(T315, Y253E255)과 완벽하게 결합하는 PNA 프로브(STI-T315, Y253E255) 존재 하에 실시간 PCR을 수행하고, 얻어진 PCR 산물에 대해 용융곡선 분석(DNA melting analysis)을 수행하여 BCR-ABL 돌연변이를 검출하는 방법이 보고되어 있다. 이 방법은 증폭반응의 사이클 수가 아닌 용융곡선의 차이로 돌연변이형을 구별하는 것으로서, 야생형 서열에 상보적인 PNA 클램핑 프로브 이외에 용융곡선을 측정하기 위한 형광을 검출할 수 있는 공여체 형광물질(donor fluorophore)이 부착되어 있고 야생형 서열에 상보적인 프로브(앵커 프로브)와 수용체 형광물질(acceptor fluorophore)이 부착되어 있고 돌연변이형 서열에 상보적인 프로브(센서 프로브)를 필요로 한다(프라이머들 및 프로브들의 종류 및 위치를 나타낸 도 6 참조). 따라서, 상기 방법은 다량의 형광 표지된 프로브를 이용하여 검출하게 되므로 분석 비용이 높아지는 문제점이 발생한다. 또한, 상기 문헌은 PNA 프로브와 함께 5'-말단에 LC 레드 640으로 표지된 앵커 프로브와 3'-말단에 LC 레드 705로 표지된 센서 프로브를 이용하는 방법만을 개시하고 있을 뿐, PNA 프로브만을 이용한 ABL 유전자의 돌연변이 검출에 대해서는 어떠한 교시나 암시도 하지 않았다. 또한, 야생형인 T315와 완벽하게 결합하는 PNA 클램핑 프로브로서 특정 서열(TTCTATATCATCACTGAGTT; 서열번호 15)의 20mer만을 개시하고 있을 뿐, 다른 길이나 서열의 PNA 클램핑 프로브는 전혀 기재하고 있지 않다.
본 발명자들은 BCR-ABL 융합 유전자에 대하여, PNA 클램핑 프로브를 이용하여 야생형과의 증폭 사이클 차이만으로 변이형을 검출함으로써 용융곡선의 차이를 이용한 변이형 검출 기술보다 간편할 뿐만 아니라, 다량의 야생형의 증폭을 완벽하게 저해하여 변이형의 검출 민감도를 향상시킴으로써 극소량 섞여있는 돌연변이를 높은 민감도로 신속·정확하게 검출할 수 있는, PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 BCR-ABL 융합 유전자 돌연변이 검출 기술을 완성하였다.
본 발명의 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 일 면은
BCR-ABL 융합 유전자중 ABL 유전자의 엑손 6 부위를 증폭시키는 BCR-ABL 융합 유전자 클램핑 프라이머 세트와, BCR-ABL 융합 유전자 중 ABL 유전자 엑손 6 코돈 315의 야생형과 완전하게 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, BCR-ABL 융합 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 BCR-ABL 융합 유전자의 코돈 315의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는:
단계를 포함하는, BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바람직한 태양에서는, 실시간 PCR의 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정한다.
본 발명에 사용되는 PNA 클램핑 프로브는 바람직하게는 15 내지 30mer, 보다 바람직하게는 19 내지 23mer 길이의 염기서열로 이루어지는 것일 수 있으며, 예를 들어, 서열번호 1 내지 14의 염기서열 중 어느 하나로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에 사용되는 BCR-ABL 융합 유전자 클램핑 프라이머 세트는 ABL 유전자 엑손 6 야생형 코돈 315의 상류부분에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머와, 그의 하류부분에 특이적으로 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 것일 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 BCR-ABL 융합 유전자 클램핑 프라이머 세트는 서열번호 17의 정방향 프라이머와 서열번호 18, 19 또는 21의 역방향 프라이머로 이루어지는 것이거나, 서열번호 20의 정방향 프라이머와 서열번호 21의 역방향 프라이머로 이루어지는 것일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 BCR-ABL 융합 유전자는 대상 검체로부터 DNA 또는 RNA를 추출하여 준비될 수 있다.
본 발명에서는, DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는 바, 예를 들어 SYBR 그린 I, 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 및 SYTOX 오렌지로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다. DNA 인터컬레이션(intercalation)이 가능한 형광물질은 어느 것이라도 사용가능하며 특별한 제한은 없다.
본 발명에 따른 방법은 백혈병, 특히 골수성 백혈병의 치료를 결정하거나 진단하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 면은
서열번호 1 내지 14중 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브:
를 포함하는, 본 발명에 따른 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 암 발생, 예후 및 약제내성에 관여하는 것으로 예상되는 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이를 단시간 내에 우수한 민감도 및 특이도로 극소량 포함되어 있는 돌연변이까지 검출할 수 있다. 또한 프로브로 이용된 PNA 자체가 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하고 검출하는 방법이 매우 간단하며 단시간 내에 검출이 이루어지므로, 대량 분석 및 임상에서 사용하기에 매우 용이할 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명에 따른 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 원리를 나타낸 모식도(a: RNA를 이용한 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 원리, b: DNA를 이용한 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 원리)이고;
도 2는 본 발명에서 고안된 서열번호 17의 정방향 프라이머와 서열번호 18의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트와 서열번호 17의 정방향 프라이머와 서열번호 19의 역방향 프라이머로 이루어지는 프라이머 세트의 비교를 통해 최적의 프라이머 세트를 선별하기 위하여 프라이머에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이며;
도 3은 BCR-ABL 돌연변이를 가진 클론을 대상으로, 본 발명에서 고안된 서열번호 1 내지 3의 PNA 프로브를 이용하여 ABL 엑손 6 코돈 315 돌연변이를 검출하는 프로브의 효과를 비교 분석하기 위하여 프로브에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이고;
도 4는 BCR-ABL 돌연변이를 가진 세포를 대상으로, 본 발명에서 고안된 서열번호 1 내지 3의 PNA 프로브를 이용하여 ABL 엑손 6 코돈 315 돌연변이를 검출하는 프로브의 효과를 비교 분석하기 위하여 프로브에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이며;
도 5는 BCR-ABL 돌연변이를 가진 세포를 대상으로, 본 발명에서 고안된 서열번호 3의 PNA와 종래기술의 PNA 프로브를 이용하여 BCR-ABL 돌연변이 포함 농도에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이고;
도 6은 종래 기술에 따른 PNA 기반 PCR 클램핑을 이용한 BCR-ABL 돌연변이 검출에 사용된 프라이머들 및 프로브들의 종류 및 위치를 나타낸 모식도이다.
본 발명은 BCR-ABL 융합 유전자 중 ABL 유전자 엑손 6 코돈 315의 돌연변이, 특히 T315I 돌연변이 검출을 위하여 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브가 야생형의 증폭을 억제함으로써 소량의 돌연변이형만을 높은 민감도로 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
도 1에 본 발명에 따른 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 방법의 원리를 모식적으로 나타내었다. 도 1의 a는 RNA를 이용한 방법의 원리를, 도 1의 b는 DNA를 이용한 방법의 원리를 나타낸 것이다.
1. PNA 클램핑 프로브의 설계 및 제작
본 발명의 PNA 프로브는 돌연변이가 발생할 수 있는 ABL 유전자 엑손 6 코돈 315의 야생형 유전자 서열에 완벽하게 결합할 수 있는(perfectly matched) 것으로서, 15개 이상, 바람직하게는 15~30개, 보다 바람직하게는 17~27개, 보다 더 바람직하게는 17~24개, 가장 바람직하게는 19~23개의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, ABL 유전자 엑손 6 코돈 315의 돌연변이는 '치환', 특히 트레오닌에서 이소류신으로의 치환(T315I)을 포함하는 것이다.
본 발명의 PNA 프로브는, 돌연변이가 발생할 수 있는 ABL 유전자 엑손 6 코돈 315의 야생형 유전자 부위가 프로브의 가운데에 위치하도록 고안된 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 PNA 프로브는 아래 표 1에 기재한 서열번호 1 내지 14중 어느 하나의 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 염기서열로부터 당업자가 통상의 지식을 이용하여 용이하게 변형할 수 있는 범위 내의 PNA 프로브 서열들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 할 것인바, 본 발명에 따른 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 증폭 사이클 차이만으로 ABL 유전자 엑손 6 코돈 315 돌연변이를 효과적으로 검출할 수 있는 것인 한, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.
구체적으로는, 서열번호 1 내지 14는 ABL 엑손 6의 야생형 코돈 315(T315)와 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브이다. 코돈 315에서의 치환은 뉴클레오티드 947의 시토신(C)이 티민(T)으로 치환되는 것으로, BCR-ABL 융합 단백질의 키나제 부분에 변이를 일으킨다. 서열번호 1 내지 14는 엑손 6 코돈 315의 947번째 염기에 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다. 서열번호 15는 문헌 [Kreuzer KA et al., Ann Hematol., 2003;82(5):284-9]에 개시된 PNA 프로브로서, 본 발명에 따른 PNA 프로브와 비교하기 위하여 제작하였다.
서열번호 이름 염기서열( 5' → 3' ) 길이
1 T315I-1 ATATCATCACTGAGTTCATG 20
2 T315I-2 TCTATATCATCACTGAGTTCATG 23
3 T315I-3 CTATATCATCACTGAGTTCATG 22
4 T315I-4 TATATCATCACTGAGTTCATG 21
5 T315I-5 TCTTTATCATCACTGAGTTCATG 23
6 T315I-AS-1 CATGAACTCAGTGATGATAT 20
7 T315I-AS-2 CATGAACTCAGTGATGATATAGA 23
8 T315I-AS-3 CATGAACTCAGTGATGATATAG 22
9 T315I-AS-4 CATGAACTCAGTGATGATATA 21
10 T315I-AS-5 CATGAACTCAGTGATGATAT 20
11 T315I-AS-6 ATGAACTCAGTGATGATAT 19
12 T315I-AS-7 AACTCAGTGATGATATAGA 19
13 T315I-ASM-2 CTTGAACTCAGTGATGATATAGA 23
14 T315I-ASM-3 CTTGAACTCAGTGATGATATAG 22
15 STI-T315 TTCTATATCATCACTGAGTT 20
본 발명의 PNA 프로브는 반응효율 및 용해도를 증가시키기 위하여 N-말단(N-terminal) 또는 C-말단(C-terminal)에 친수성 기능기를 포함할 수 있으며, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단에 친수성 링커나 아미노산, 또는 아민기를 1개 내지 여러 개 포함할 수 있다(Shakeel et al., J Chem Technol Biotechnol., 2006;81:892-9, Gildea et al., Tetrahedron Lett., 1998;39:7255-8, Demidov et al., PNAS., 2002;99:5953-8, Wang et al., Anal Chem., 1997;69:5200-2). 구체적으로, 본 발명에서는 N-말단에 라이신(lysine)이 1개 부착되거나, N-말단과 C-말단에 라이신(lysine)이 1개씩 부착된 프로브를 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464,261호의 방법에 따라 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체, 또는 공지의 Fmoc(9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl)으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수 있다(Dueholm et al., J Org chem. 1994;59(19): 5767-73, Thomson et al., Tetrahedron, 1995;51(22): 6179-94).
2. BCR - ABL 융합 유전자 클램핑 프라이머의 설계 및 제작
본 발명에서 "BCR-ABL 융합 유전자 클램핑 프라이머"라 함은 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있는 야생형 유전자의 증폭은 억제하고 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있지 않는(즉, 불일치 서열이 존재하는) 돌연변이 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를 가리킨다.
본 발명의 클램핑 프라이머는 특별히 제한되는 것은 아니나, 보다 높은 민감도 및 특이도로 돌연변이를 검출하기 위해서는 PNA 클램핑 프로브를 기준으로 하여 한 방향으로는 PNA 프로브와 일부분이 겹쳐지도록 하며 다른 한 방향으로는 검출하고자 하는 부위를 포함하되 PCR 증폭산물의 크기를 고려하여 고안하는 것이 바람직하다. 또한 PNA 프로브와의 Tm을 고려하고, 길이는 17mer에서 30mer 사이이며, PNA 프로브의 Tm 보다 낮게 설계하는 것이 바람직하다. 검출 민감도 및 특이도를 극대화할 수 있도록, 야생형과 상보적으로 결합하는 PNA 클램핑 프로브 서열 중 돌연변이가 일어나는 염기 바로 앞부분을 포함하도록 설계하는 것이 바람직하다.
구체적인 예에 따르면, 서열번호 1 내지 14의 PNA 프로브와 5 내지 12개의 염기서열이 중첩되도록 클램핑 프라이머를 설계하였다. 본 발명에서 예시된 서열번호 17의 정방향 프라이머는 서열번호 1 내지 5의 ABL 유전자 엑손 6의 코돈 315의 상류 부분 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 본 발명에서 예시된 서열번호 17의 정방향 프라이머와 조합되는 서열번호 18의 역방향 프라이머 및 서열번호 19의 역방향 프라이머는 각각 ABL 유전자 엑손 6 부위의 113~132번째 염기 및 135~152번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 서열번호 21의 역방향 프라이머는 서열번호 6 내지 14의 ABL 유전자 엑손 6의 코돈 315의 하류 부분 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 본 발명에서 예시된 서열번호 21의 역방향 프라이머와 조합되는 서열번호 20의 정방향 프라이머는 ABL 유전자 인트론 5 부위의 -76 ~ -52번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 프라이머의 길이는 18 mer에서 25 mer 사이로, 각각 프라이머 조합에 의한 증폭산물의 크기가 50 bp 내지 500 bp가 되도록 고안되었다.
한편, ABL 유전자의 엑손 6의 염기서열분석을 통한 유전자 확인을 위하여 본 발명에서 제공되는 서열번호 16의 정방향 프라이머는 ABL 유전자 엑손 5 부위의 6~26번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었고, 상기 서열번호 16의 정방향 프라이머와 조합되는 역방향 프라이머는 서열번호 19로, ABL 유전자 엑손 6 부위의 135~152번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안된 것이다. 이들 프라이머는 조합되어 증폭산물의 크기가 832 bp가 되도록 고안되었다. 아래 표 2에 본 발명의 구체 예에서 사용되는 프라이머에 대한 설명을 나타내었다.
서열번호 부위 위치 이름 방향 서열(5' → 3') 길이
16 엑손 5 6 ~ 26 SC_T315I_F3 정방향 GAGATCAAACACCCTAACCTG 21
17 엑손 6 17 ~ 36 B T315I FC 정방향 GCCCCCGTTCTATATCATCA 20
18 엑손 6 113 ~ 132 B T315I R 역방향 TCTGAGTGGCCATGTACAGC 20
19 엑손 6 135 ~ 152 S_T315I_R3 역방향 GTACTCCATGGCTGACGA 18
20 인트론 5 -76 ~-52 B T315I F-2 정방향 GGCTTTTTCTTTAGACAGTTGTTTG 25
21 엑손 6 38 ~56 F_T315I_RC3 역방향 CCCGTAGGTCATGAACTCA 19
3. PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 BCR - ABL 융합 유전자 돌연변이 검출
본 발명에 따른 BCR-ABL 융합 유전자 돌연변이 검출방법은
(a) BCR-ABL 융합 유전자 클램핑 프라이머 세트와 PNA 클램핑 프로브의 존재 하에, BCR-ABL 융합 유전자에 대해 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
(b) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는 단계:
를 포함한다.
단계 (a)에서 사용되는 BCR-ABL 융합 유전자는 대상 검체로부터 추출하여 준비된다. 본 발명에서는 핵산추출에 특별한 제한이 없으며, 일반적으로 사용하는 모든 핵산 추출방법을 사용할 수 있다. 추출되는 핵산은 DNA 또는 RNA, 예를 들어 mRNA일 수 있으며, 예를 들어, 시판중인 DNA 또는 RNA 추출키트를 사용하여 환자의 혈액 또는 골수성 세포로부터 DNA 또는 RNA를 추출하여 준비된다. 추출된 RNA는 통상적인 방법에 따라 cDNA를 합성하여 사용한다.
단계 (a)에서는, 실시간 PCR 방법을 이용하여 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이를 검출한다. 실시간 PCR 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클의 수(Cycle threshold, 이하 'Ct'라고 칭한다)로 나타내므로 보다 정확한 정량분석이 가능하며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다. 이 방법은 전기영동하여 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 증폭산물의 증폭정도를 자동화, 수치화시켜 빠르고 간편하게 검출할 수 있는 방법이다.
본 발명에서 실시간 PCR 클램핑의 반응물 중 PNA 클램핑 프로브는 1 내지 1000nM의 최종농도를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 인터컬레이팅(intercalating)법을 이용하여 형광을 검출하는바, 이 방법은 증폭된 이중가닥 DNA에 형광표지가 인터컬레이션(intercalation)되어 형광을 발하게 되는데, 이 때의 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물의 생성량을 측정하게 된다. 이로써 어느 PCR 기기에나 적용할 수 있고 프라이머를 따로 제작하지 않아도 높은 민감도 및 특이도로 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이를 검출할 수 있다.
본 발명에서는 유전자 증폭산물을 확인하기 위한 형광물질로서 실시간 유전자 검출방법에 사용되는 DNA-결합 형광물질(DNA-binding fluorophore)을 사용하며 그 종류에 특별한 제한은 없다. 예를 들어, SYBR 그린 I 외에 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3, SYTOX 오렌지 등을 사용할 수 있다(Gudnason H et al., Nucleic Acids Res. 2007;35(19):e127, Bengtsson M et al., Nucleic Acids Res. 2003;31(8):e45).
단계 (b)에서는, 단계 (a)의 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는 바, 증폭된 Ct값을 비교하여 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 유무를 확인할 수 있다. 야생형 유전자와 혼성화되도록 고안된 PNA 프로브가 BCR-ABL 유전자의 야생형(예: T315)에 혼성화되면 증폭이 저해되어 Ct값이 높게 나타난다. 반면 BCR-ABL 유전자에 돌연변이(예: T315I)가 발생한 경우 PNA 프로브와 혼성화되지 못하고 증폭이 일어나 Ct값이 낮게 나타나게 된다. 하기 수학식 1에 나타낸 바와 같이, 양성 대조 시료로부터 얻어진 Ct값에서 미지의 시료로부터 얻어진 Ct값을 빼어 얻어진 △Ct의 값을 확인하여 각 코돈의 돌연변이 유무를 확인할 수 있다.
[수학식 1]
△Ct = 양성대조 시료로부터 얻어진 Ct값 - 미지의 시료로부터 얻어진 Ct값
[양성대조 시료: 야생형 유전자 시료, 미지의 시료: 돌연변이 유무 또는 농도를 측정하고자 하는 시료]
돌연변이형 유전자가 다량 포함되어 있을수록 Ct값이 낮게 나타나게 되므로 △Ct 차이가 클수록 돌연변이가 다량 포함되어 있는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 BCR-ABL 돌연변이 검출 방법은 백혈병, 특히 골수성 백혈병 환자의 치료 또는 진단에 이용할 수 있으며, BCR-ABL 신호 전달 체계에 관여하는 기작을 연구하는 데에도 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한 개체군-기초 연구와 같이 다량의 시료 분석을 요구하는 연구에도 효과적으로 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: BCR-ABL 융합 유전자 중 ABL 유전자의 엑손 6에 존재하는 코돈 315 야생형의 증폭을 억제하기 위한 PNA 프로브 합성
BCR-ABL 융합 유전자중 ABL 유전자의 엑손 6 코돈 315의 야생형(T315)과 완벽하게 결합하는 14개의 PNA 프로브를 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 제작하였다. 각 코돈의 야생형과 완벽하게 결합하는 프로브는 돌연변이와의 효과적인 분리를 위하여 돌연변이가 일어나는 염기서열이 프로브의 중간에 위치하도록 고안하였다. 한국등록특허 제464,261호에 기재된 방법에 따라, PNA 프로브를 합성하였다(Lee H et al., Org Lett. 2007;9(17):3291-3).
실시예 2: BCR - ABL 융합 유전자 중 ABL 유전자 엑손 6의 표적핵산 증폭 및 클램핑 PCR을 위한 프라이머 합성
BCR-ABL 융합 유전자중 ABL 유전자 엑손 6의 표적핵산의 증폭 및 클램핑 PCR을 위하여 ABL 엑손 6 부위를 분석하여 프라이머를 제작하였다. ABL 엑손 6 의 야생형 및 돌연변이 유전자를 확인하기 위한 서열번호 16(정방향) 및 서열번호 19(역방향)로 이루어진 프라이머 세트와, ABL 엑손 6 코돈 315의 클램핑 프라이머로 서열번호 17의 프라이머(정방향), 및 서열번호 18 또는 21의 프라이머(역방향)로 이루어진 프라이머 세트를 합성하였다. 또한, 엑손 6 코돈 315의 클램핑에 사용된 역방향 프라이머로는 ABL 엑손 6의 유전자를 확인하기 위하여 고안된 서열번호 19의 역방향 프라이머를 동일하게 사용하였다. ABL 엑손 6 코돈 315의 또 하나의 클램핑 프라이머로서 서열번호 21의 역방향 프라이머와 조합하여 사용되는 서열번호 20의 정방향 프라이머를 합성하였다. 사용한 프라이머의 서열은 상기 표 2에 나타낸 바와 같다. 프라이머는 ㈜바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 3: BCR-ABL 융합 유전자 중 ABL 유전자 엑손 6의 표적핵산을 제조하기 위한 돌연변이유발 및 클론제조
인간의 전체 DNA를 이용하여 서열번호 16 및 19의 프라이머 세트를 사용하여 ABL 엑손 6 부분의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 핵산을 pGEM-T 이지 벡터(Promega, USA)에 결찰하고 대장균(Escherichia coli) JM 109 세포에 형질전환하여 DNA를 대량 확보하였다. 변이 유전자를 가진 클론을 확보하기 위해 상기한 방법으로 제조된 정상 클론을 이용하여 돌연변이용 프라이머를 제작하고, 부위특이적 돌연변이유발 키트(Stratagene, USA)를 사용하여 변이 유전자를 가진 클론을 확보하였다. 확보된 클론은 염기서열분석으로 그 변이 여부를 확인하였다.
실시예 4: BCR-ABL 융합 유전자중 ABL 유전자 엑손 6의 야생형 세포주(cell line)로부터의 핵산 추출
BCR-ABL 융합 유전자중 ABL 유전자 엑손 6의 야생형 핵산을 확보하기 위하여, 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, KCLB)으로부터 세포주를 분양받았다. 야생형 세포주로 K562 인간 만성 골수성 백혈병 세포주[KCLB10243, 한국세포주은행(KCLB), 서울, 한국]를 분양 받았다. 분양 받은 세포주는 RPMI1640(Hyclone, Thermo scientific, USA) 또는 MEM(WelGENE, 한국)에 10% 열-불활성화 우태아혈청(FBS, Hyclone, Thermo scientific, USA)과 1× 페니실린-스트렙토마이신(WelGENE, 한국)이 첨가된 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO2)가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 고순도 PCR 주형 제조 키트(High Pure PCR Template Preparation Kit)(Roche, USA)를 사용하여 키트에서 제공한 매뉴얼에 의거하여 DNA 및 RNA를 추출하여 표적핵산을 확보하였다. 확보된 핵산은 나노드롭 스펙트로포토미터(ND 2000C, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량하고 -20℃ 와 -80℃에 보관하여 사용하였다. 인간 세포주로부터 각각 분리한 DNA를 상기 표 2에 기재되어 있는 서열번호 16 및 19의 프라이머 세트를 적용하여 ABL 엑손 6의 유전자를 증폭하였다. RNA는 cDNA 합성 후 동일한 프라이머 세트를 적용하여 ABL 엑손 6의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 Labopass™ PCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)를 사용하여 정제한 후 염기서열분석하여 유전자형을 확인하였다. 유전자형이 확인된 야생형 세포주는 본 발명의 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 방법의 검체로 사용하였다.
실시예 5: BCR-ABL 융합 유전자중 ABL 유전자의 엑손 6 코돈 315에 대한 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법 확립
실시예 3에서의 클론으로부터 추출된 플라스미드 DNA와 실시예 4에서의 세포주로부터 추출된 DNA 및 RNA를 대상으로 하여, 실시예 1에서 제작된 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이를 검출하는 PNA 프로브들을 이용하여 하기 조건으로 실시간 PCR 클램핑을 수행하여 결과를 비교 분석함으로써 최적의 PNA 프로브를 찾고자 하였다.
클론에서 추출된 플라스미드 DNA 용액 1 ㎕ 또는 세포주에서 추출된 주형 DNA 용액(50 ng/㎕) 1 ㎕, 표 2에 나타난 1개의 클램핑 센스 프라이머(10 pmoles/㎕) 1 ㎕, 안티센스 프라이머(10 pmoles/㎕) 1 ㎕, 표 1에 나타낸 프로브 중 1개의 클램핑 프로브(100nM) 1 ㎕, 2× IQ Sybr 그린 슈퍼믹스(Bio-Rad, USA) 10 ㎕, 증류수 6 ㎕를 가하고 실시간 DNA 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-Time PCR System, Bio-RAD사 제품)를 이용하여 95℃에서 3분 동안 반응시킨 후 95℃ 30초 그리고 PNA가 혼성화될 수 있는 70℃에서 20초 반응을 추가하고, 63℃ 30초, 72℃ 30초 반응과정을 40회 반복하였다. 형광은 72℃ 중합반응 단계에서 측정하였다.
상기 프로브들 중 서열번호 1 내지 3의 프로브를 적용하여 엑손 6의 코돈 315 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 두 세트의 프라이머(서열번호 17과 18, 및 서열번호 17과 19)로 확인한 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 서열번호 17과 서열번호 18을 이용한 정방향 클램핑에서는 서열번호 4의 PNA 프로브가 매우 우수한 효과를 나타냈으며, 서열번호 17과 19를 이용한 정방향 클램핑에서는 서열번호 1 내지 4의 PNA 프로브가 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
서열번호 1 내지 14의 프로브 중 대표적으로 서열번호 1, 2 및 3의 프로브를 적용하여 엑손 6의 코돈 315 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타난 바와 같이. 적용한 모든 프로브가 우수한 효과를 나타내며, 특히 서열번호 2의 PNA 프로브가 돌연변이를 검출하는 데 보다 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 6: PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법을 통한 BCR - ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출
실시예 5에서 확립된 실시간 PCR을 이용한 방법을 사용하여 야생형 유전자에 돌연변이 유전자를 각각 100%, 50%, 10%, 5%, 1%, 0.5% 및 0.1% 포함하도록 샘플을 제작하여 돌연변이 유전자의 농도와 Ct값 사이의 상관관계를 분석하여, 돌연변이형의 검출한계를 확인하였다.
도 4에 ABL 엑손 6 코돈 315 돌연변이를 가진 세포주를 대상으로 서열번호 1 내지 3의 PNA 프로브를 이용하여 돌연변이 유전자의 비율에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 결과를 나타내었다. 도 4에 나타난 바와 같이, 서열번호 2 및 3의 PNA 프로브는 0.5%의 돌연변이를 함유한 시료까지 검출 가능한 것으로 나타났다.
비교예 1: BCR - ABL 돌연변이 검출을 위한 종래기술과의 비교
문헌 [Kreuzer KA et al., Ann Hematol., 2003;82(5):284-9]에 개시된 PNA 프로브와 본 발명에 따른 PNA 프로브를 비교하기 위하여, 상기 표 1에 나타낸 서열번호 15의 PNA 프로브를 제작하였다.
상기 선행문헌의 프로브와 본 발명에 따른 프로브를 이용한 실시간 PCR을 수행하여 돌연변이 검출 여부를 확인하였다.
그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 돌연변이 유전자 비율에 따른 검출 민감도를 비교한 결과, 선행문헌에 개시된 PNA 프로브는 돌연변이 유전자 비율 5%까지 검출 가능한데 비해, 본 발명에 따른 PNA 프로브는 돌연변이 유전자 비율 0.5%까지 검출 가능하여 10배 정도 높은 검출 민감도를 갖는 것으로 확인되었다.
<110> Panagene Inc. <120> Methods and kits for the detection of BCR-ABL fusion gene mutant using PNA mediated Real-time PCR clamping <160> 21 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 1 atatcatcac tgagttcatg 20 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 2 tctatatcat cactgagttc atg 23 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 3 ctatatcatc actgagttca tg 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 4 tatatcatca ctgagttcat g 21 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 5 tctttatcat cactgagttc atg 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 6 catgaactca gtgatgatat 20 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 7 catgaactca gtgatgatat aga 23 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 8 catgaactca gtgatgatat ag 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 9 catgaactca gtgatgatat a 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 10 catgaactca gtgatgatat 20 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 11 atgaactcag tgatgatat 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 12 aactcagtga tgatataga 19 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 13 cttgaactca gtgatgatat aga 23 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 14 cttgaactca gtgatgatat ag 22 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA clamping probe <400> 15 ttctatatca tcactgagtt 20 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 gagatcaaac accctaacct g 21 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 gcccccgttc tatatcatca 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 tctgagtggc catgtacagc 20 <210> 19 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 gtactccatg gctgacga 18 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ggctttttct ttagacagtt gtttg 25 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 cccgtaggtc atgaactca 19

Claims (12)

  1. BCR-ABL 융합 유전자중 ABL 유전자의 엑손 6 부위를 증폭시키는 BCR-ABL 융합 유전자 클램핑 프라이머 세트와, BCR-ABL 융합 유전자중 ABL 유전자 엑손 6 코돈 315의 야생형과 완전하게 결합하고, 상기 프라이머 세트의 프라이머와는 한 방향으로 일부분이 겹쳐지는, 서열번호 1 내지 14의 염기서열 중 어느 하나로 이루어지는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, BCR-ABL 융합 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
    상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 BCR-ABL 융합 유전자의 코돈 315의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는:
    단계를 포함하는, BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  2. 제1항에 있어서, 실시간 PCR의 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는, BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, BCR-ABL 융합 유전자 클램핑 프라이머 세트는 ABL 유전자 엑손 6 야생형 코돈 315의 상류부분에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머와, 그의 하류부분에 특이적으로 결합하는 역방향 프라이머를 포함하는 것인, BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  7. 제6항에 있어서, BCR-ABL 융합 유전자 클램핑 프라이머 세트는 서열번호 17의 정방향 프라이머와 서열번호 18, 19 또는 21의 역방향 프라이머로 이루어지는 것이거나, 서열번호 20의 정방향 프라이머와 서열번호 21의 역방향 프라이머로 이루어지는 것인, BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, BCR-ABL 융합 유전자는 대상 검체로부터 DNA 또는 RNA를 추출하여 준비되는 것인, BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는, BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  10. 제9항에 있어서, DNA 인터컬레이팅 형광물질은 SYBR 그린 I, 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 및 SYTOX 오렌지로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것인, BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 백혈병의 치료를 결정하거나 진단하는데 사용하기 위한, BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법.
  12. 서열번호 1 내지 14중 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브:
    를 포함하는, 제1항에 따른 BCR-ABL 융합 유전자의 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트.
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