[go: up one dir, main page]

WO2018199137A1 - ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法 - Google Patents

ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法 Download PDF

Info

Publication number
WO2018199137A1
WO2018199137A1 PCT/JP2018/016749 JP2018016749W WO2018199137A1 WO 2018199137 A1 WO2018199137 A1 WO 2018199137A1 JP 2018016749 W JP2018016749 W JP 2018016749W WO 2018199137 A1 WO2018199137 A1 WO 2018199137A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
bcr
base sequence
gene
nucleic acid
abl1
Prior art date
Application number
PCT/JP2018/016749
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
粛典 葛城
田中　秀明
隆太 伊藤
古賀　大輔
Original Assignee
大塚製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 大塚製薬株式会社 filed Critical 大塚製薬株式会社
Priority to JP2019514563A priority Critical patent/JPWO2018199137A1/ja
Priority to US16/607,314 priority patent/US12018324B2/en
Priority to CN201880026977.7A priority patent/CN110546274A/zh
Priority to EP18791478.3A priority patent/EP3617326A4/en
Publication of WO2018199137A1 publication Critical patent/WO2018199137A1/ja
Priority to JP2022166992A priority patent/JP7569828B2/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2561/00—Nucleic acid detection characterised by assay method
    • C12Q2561/113—Real time assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the BCR-ABL1 fusion gene is a chromosomal abnormality found in chronic myelogenous leukemia (CML) and Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia (Ph + ALL).
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • Ph + ALL Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia
  • Translocation t (9; 22) between chromosome 9 and chromosome 22 causes fusion of c-ABL1 gene located in the q34 band of chromosome 9 and bcr gene located in the q11 band of chromosome 22. Formed.
  • BCR-ABL1 a chimeric protein encoded by the BCR-ABL1 fusion gene, has tyrosine kinase activity, constantly stimulates cell proliferation signals and suppresses apoptosis, thereby allowing hematopoietic stem cells to proliferate indefinitely.
  • tyrosine kinase inhibitors targeting BCR-ABL1, such as imatinib have been developed, and the therapeutic results of CML and Ph + ALL have been improved.
  • BCR-ABL1 is mainly classified into Major type (M-BCR-ABL1) and minor type (m-BCR-ABL1) according to the difference of BCR cutting points.
  • M-BCR is found in about 95% of CML patients and m-BCR is found in about 20-30% of Ph + ALL patients. Therefore, by measuring the expression level of each BCR-ABL1 gene, diagnosis of CML and Ph + ALL can be assisted, and the therapeutic effect can be monitored.
  • a kit for measuring the expression level of M-BCR-ABL1 is sold by the applicant as “Major BCR-ABL1 mRNA measurement kit”. This kit measures the expression level of M-BCR-ABL1 by one-step quantitative real-time RT-PCR.
  • m-BCR-ABL1 As a method for measuring the expression level of m-BCR-ABL1, the method described in Non-Patent Document 1 is known.
  • the present application aims to provide a method for detecting a minor BCR-ABL1 gene with higher accuracy than the conventional method.
  • the application is a method of detecting a minor BCR-ABL1 gene in a subject comprising: (1) In the presence of a modified nucleic acid having a partial base sequence of exons 2 to 14 of the BCR gene or a base sequence complementary thereto, a nucleic acid sample obtained from the subject is used as a template, and one of the exons 1 of the BCR gene A step of performing PCR using a forward primer having a partial base sequence and a reverse primer having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene; and (2) a step of determining that the subject has a minor BCR-ABL1 gene when the nucleic acid is amplified by PCR; A method comprising:
  • the present application provides a modified nucleic acid having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 14 of the BCR gene, a reverse primer having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene, and BCR
  • a kit for detecting a minor BCR-ABL1 gene in a subject comprising a forward primer having a partial base sequence of exon 1 of the gene.
  • the minor BCR-ABL1 gene in a subject can be detected with higher accuracy than in the conventional method. This is expected to provide useful information for diagnosing or treating the subject CML or Ph + ALL.
  • FIG. 2 is a schematic diagram of the structures of the m-BCR gene and the M-BCR gene and the method described herein.
  • the base sequence of SEQ ID NO: 1 is shown. This shows the base sequence of SEQ ID NO: 1 (continued). This shows the base sequence of SEQ ID NO: 1 (continued).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 2 is shown. This shows the base sequence of SEQ ID NO: 2 (continued). This shows the base sequence of SEQ ID NO: 2 (continued). This shows the base sequence of SEQ ID NO: 2 (continued).
  • the base sequence of SEQ ID NO: 3 is shown. This shows the base sequence of SEQ ID NO: 3 (continued). This shows the base sequence of SEQ ID NO: 3 (continued).
  • FIG. 3 shows an RT-PCR amplification curve of minor BCR-ABL1 mRNA in the presence of PNA in Test 1.
  • FIG. 2 shows an RT-PCR amplification curve of ABL1 mRNA in the presence of PNA in Test 1.
  • FIG. 2 shows an RT-PCR amplification curve of 1.0 ⁇ 10 7 copies of Major BCR-ABL1 mRNA in the presence of PNA in Test 2.
  • FIG. 2 shows an RT-PCR amplification curve of 1.0 ⁇ 10 6 copies of Major BCR-ABL1 mRNA in the presence of PNA in Test 2.
  • FIG. FIG. 3 shows an RT-PCR amplification curve of ABL1 mRNA in the presence of PNA in Test 2.
  • BCR-ABL1 gene is a fusion gene of ABL1 gene and BCR gene found in chronic myelogenous leukemia and Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia. This is caused by a translocation t (9; 22) between chromosome 9 and chromosome 22.
  • the BCR-ABL1 gene is mainly classified into a minor type and a Major type according to the difference in the breakpoint of BCR.
  • the “minor BCR-ABL1 (m-BCR-ABL1) gene” is a gene in which exon 1 of the BCR gene and exons 2 to 11 of the ABL1 gene are fused.
  • the “Major BCR-ABL1 (M-BCR-ABL1) gene” is a gene in which exons 1 to 13 or 1 to 14 of the BCR gene and exons 2 to 11 of the ABL1 gene are fused.
  • the structures of the m-BCR-ABL1 gene and the M-BCR-ABL1 gene are shown in FIG.
  • the inventors of the present application have been developing a method for measuring m-BCR-ABL1 mRNA and tested it using the same method as the existing kit for measuring m-BCR-ABL1 mRNA.
  • M-BCR-ABL1 mRNA was also detected, and it was found that accurate m-BCR-ABL1 mRNA could not be measured (see Test 2 in Examples).
  • a forward primer designed based on the base sequence of BCR gene exon 1 and a reverse primer designed based on the base sequence of ABL1 gene exon 2 were used to amplify m-BCR-ABL1 cDNA. PCR was performed. As shown in FIG.
  • M-BCR-ABL1 cDNA contains BCR gene exons 2 to 13 (about 1428 base length) or 2 to 14 (about 1503 base length) between BCR gene exon 1 and ABL1 gene exon 2. Due to the presence of the region, conventionally, it has been thought that M-BCR-ABL1 cDNA is not amplified under PCR conditions for amplifying m-BCR-ABL1 cDNA, which is much shorter than this. However, as shown in Test 2, it has been found that the conventional method may actually amplify M-BCR-ABL1 cDNA, which has a serious disadvantage of possibility of erroneous measurement. The present application eliminates this drawback, and provides a method and a kit for the detection of an accurate m-BCR-ABL1 gene or its expression or the measurement of the expression level of m-BCR-ABL1.
  • the base sequence of the m-BCR-ABL1 gene is typically represented by SEQ ID NO: 1, but many mutants are known.
  • the base sequence of the M-BCR-ABL1 gene is typically represented by SEQ ID NOs: 2 and 3, but many mutants are known.
  • the m-BCR-ABL1 gene and the M-BCR-ABL1 gene include a polynucleotide having a sequence complementary to a polynucleotide having a sequence represented by SEQ ID NO: 1, and SEQ ID NO: 2 or 3, respectively, and stringent Also included are genes having polynucleotide sequences that hybridize under mild conditions. Regarding “hybridize under stringent conditions”, the hybridization used here is in accordance with the usual method described in, for example, Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) etc. It can be carried out.
  • Stringent conditions means, for example, 6 ⁇ SSC (a solution containing 1.5M NaCl, 0.15M trisodium citrate is 10 ⁇ SSC), 45 ° C. in a solution containing 50% formamide. Under the conditions of washing with 2 ⁇ SSC at 50 ° C. (Molecular Biology, John John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6), and The conditions that bring about the same stringency can be mentioned.
  • each of the m-BCR-ABL1 gene and the M-BCR-ABL1 gene includes at least 70%, 80%, 85%, 90%, the base sequence represented by SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 or 3, A gene having a base sequence having a sequence identity of 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more is included.
  • Sequence identity means the degree of sequence similarity between two oligonucleotides. Two sequences that are aligned in an optimal state (a state that maximizes the sequence match) over the region of the base sequence to be compared. Determined by comparison.
  • the sequence identity value (%) determines the same base present in both sequences to determine the number of matching sites, and then divides this number of matching sites by the total number of bases in the sequence region to be compared. It is calculated by multiplying the obtained numerical value by 100.
  • Algorithms for obtaining optimal alignment and sequence identity include various algorithms commonly available to those skilled in the art (eg, BLAST algorithm, FASTA algorithm, etc.).
  • sequence identity of the base sequence is determined using sequence analysis software such as BLAST and FASTA.
  • the subject is a human.
  • the subject may be a subject suffering from or suspected of having leukemia, eg, chronic myelogenous leukemia (CML) or Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia (Ph + ALL).
  • CML chronic myelogenous leukemia
  • Ph + ALL Philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia
  • nucleic acid sample refers to DNA obtained from a subject or cDNA obtained by reverse transcription of RNA obtained from a subject.
  • the RNA may be total RNA or purified mRNA.
  • the nucleic acid sample is obtained from a sample containing hematopoietic stem cells, leukocytes or leukemia cells derived from a subject, for example, blood, bone marrow fluid, lymph fluid.
  • Nucleic acid samples may be obtained from isolated hematopoietic stem cells, blood cells, leukocytes or leukemia cells.
  • the nucleic acid sample is obtained from peripheral blood leukocytes or bone marrow nucleated cells.
  • the nucleic acid sample is obtained from peripheral blood leukocytes.
  • Any known method may be used for extracting DNA or RNA from a sample.
  • PCI phenol / chloroform / isoamyl alcohol extraction
  • a modified nucleic acid having a partial base sequence of exons 2 to 14 of the BCR gene or a base sequence complementary thereto is used. This can bind to a region corresponding to exons 2 to 14 of the BCR gene in a PCR amplification product derived from Major BCR-ABL1 mRNA.
  • the modified nucleic acid is referred to as “M-BCR clamp”.
  • Modified nucleic acid is a nucleic acid containing one or more artificial nucleotides, and forms a complementary strand stronger than DNA having the same base sequence as that of the modified nucleic acid for mRNA or DNA having a certain sequence, and reverse transcription.
  • the M-BCR clamp binds to a polynucleotide derived from the M-BCR-ABL1 gene containing a nucleotide sequence corresponding to exons 2 to 14 of the BCR gene and suppresses the extension reaction using this as a template. It does not bind to a polynucleotide derived from the m-BCR-ABL1 gene that does not contain a nucleotide sequence corresponding to 2 to 14, and does not suppress an extension reaction using this as a template.
  • the M-BCR clamp has about 10-30, about 15-25, about 19-23, or about 20-22, for example about 21, contained in exons 2-14, preferably 2-13 of the BCR gene. It can be designed as a modified nucleic acid having a base sequence of a continuous nucleotide or a base sequence complementary thereto. Exons 2 to 14 of the BCR gene have the base sequence of SEQ ID NO: 4, for example. Exons 2 to 13 of the BCR gene have the base sequence of SEQ ID NO: 5, for example. In one embodiment, the M-BCR clamp is designed to bind to a region close to the binding region of the forward primer or reverse primer in the PCR amplification product of step (1).
  • the BCR gene is designed to bind to a region within about 300, about 200, about 150 or about 100 nucleotides from the binding region of the forward primer or reverse primer.
  • the BCR gene is designed to bind to a region corresponding to exons 12 and 13 (eg, SEQ ID NO: 6), for example, a region corresponding to exon 13 (eg, SEQ ID NO: 7).
  • the M-BCR clamp comprises the base sequence of AGGGAGAAGCTTCTGAAACAC (SEQ ID NO: 8) or a base sequence complementary thereto.
  • the M-BCR clamp consists of the base sequence of SEQ ID NO: 8 or a base sequence complementary thereto.
  • the M-BCR clamp contains one or more artificial nucleotides.
  • the artificial nucleotide one having a structure different from that of the natural nucleotide and enhancing the nuclease resistance and the binding affinity with the target sequence can be selected. For example, Deleavey, G. F., & Damha, M. J. (2012). Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing. Chemistry & biology, 19 (8), 937 Artificial nucleotides described in -954 can be used.
  • artificial nucleotides include, for example, abasic nucleosides; arabino nucleosides, 2′-deoxyuridines, ⁇ -deoxyribonucleosides, ⁇ -L-deoxyribonucleosides, nucleosides with other sugar modifications; peptide nucleic acids (PNA) ), A peptide nucleic acid to which a phosphate group is bound (PHONA), a cross-linked artificial nucleic acid (LNA), a 2′-O, 4′-C-ethylene cross-linked nucleic acid (ENA), a constrained ethyl (cEt), a morpholino nucleic acid, etc. .
  • PNA peptide nucleic acids
  • Artificial nucleotides having sugar modifications include substituted pentose monosaccharides such as 2'-O-methylribose, 2'-O-methoxyethylribose, 2'-deoxy-2'-fluororibose, 3'-O-methylribose 1 ', 2'-deoxyribose; arabinose; substituted arabinose sugars; those having hexose and alpha-anomeric sugar modifications.
  • artificial nucleotides having modified bases include pyrimidines such as 5-hydroxycytosine, 5-methylcytosine, 5-fluorouracil, 4-thiouracil; purines such as 6-methyladenine, 6-thioguanosine; Those having a heterocyclic base and the like can be mentioned.
  • the artificial nucleotides in the M-BCR clamp may all be of the same type, or two or more different artificial nucleotides may be present.
  • the M-BCR clamp includes one or more PNAs as artificial nucleotides.
  • PNA generally has a structure in which a phosphate bond of DNA is replaced by a peptide bond by N- (2-aminoethyl) glycine binding to a peptide (Nielsen et al. 1991 Science 254, 1457-1500).
  • PNA is resistant to various nucleolytic enzymes and forms complementary strands with DNA or RNA by molecular recognition similar to DNA or RNA.
  • the affinity between PNA and DNA is higher than the affinity between DNA and DNA or between DNA and RNA.
  • the nucleotides in the M-BCR clamp are all PNA.
  • the nucleic acid sample is cDNA obtained by reverse transcription of the RNA sample of interest, and in this case, the expression of the minor BCR-ABL1 gene in the subject is detected by the above method.
  • Reverse transcription may be performed in the presence of a modified nucleic acid (M-BCR clamp) having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 14 of the BCR gene. This can bind to a region corresponding to exons 2 to 14 of the BCR gene in Major BCR-ABL1 mRNA.
  • M-BCR clamp modified nucleic acid
  • the M-BCR clamp used in reverse transcription is about 10-30, about 15-25, about 19-23 or about 20-22 contained in exons 2-14, preferably 2-13 of the BCR gene, For example, it can be designed as a modified nucleic acid having a base sequence complementary to about 21 contiguous nucleotides.
  • the M-BCR clamp used for reverse transcription binds to a region close to the binding region of the reverse primer for reverse transcription in M-BCR-ABL1 mRNA, ie, to BCR exons 2-14. It is designed to bind to a region near the 3 ′ end in the corresponding region.
  • the M-BCR clamp used for reverse transcription comprises the base sequence of AGGGAGAAGCTTCTGAAACAC (SEQ ID NO: 8).
  • the M-BCR clamp used for reverse transcription consists of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8. The M-BCR clamp used in reverse transcription can be produced and used in the same manner as the M-BCR clamp used in the above PCR.
  • the M-BCR clamp used for reverse transcription may be the same as or different from the M-BCR clamp used for PCR. In some embodiments, the M-BCR clamp used for reverse transcription is the same as the M-BCR clamp used for PCR.
  • the amount of M-BCR clamp added in reverse transcription or PCR may be any amount that can inhibit reverse transcription or PCR, for example, about 0.01 ⁇ M to 10 ⁇ M, about 0.1 ⁇ M in the final volume molarity of the reaction solution. It can be 01 ⁇ M to 5 ⁇ M, about 0.01 ⁇ M to 1 ⁇ M, or about 0.01 ⁇ M to 0.1 ⁇ M, such as about 0.025, about 0.050, or about 0.075 ⁇ M.
  • a reverse primer having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene is used. This can bind to m-BCR-ABL1 mRNA and M-BCR-ABL1 mRNA in a reverse transcription reaction and cause an elongation reaction.
  • Exons 2 to 11 of the ABL1 gene have, for example, the base sequence of SEQ ID NO: 9, and a reverse primer for reverse transcription can be designed based on the base sequence.
  • a reverse primer for reverse transcription can be designed based on the base sequence of exon 2 of the ABL1 gene (for example, SEQ ID NO: 10).
  • the reverse primer for reverse transcription comprises the base sequence of CCTGAGGCTCAAAGTCAGATGCTAC (SEQ ID NO: 11). In one embodiment, the reverse primer for reverse transcription consists of the base sequence of SEQ ID NO: 11. Methods for designing primers suitable for reverse transcription are well known to those skilled in the art.
  • reagents such as reverse transcriptase, dNTP, and buffer that are commonly used in this field can be used.
  • Conditions such as the amount of each reagent, reaction time, and temperature are attached to the reverse transcriptase. It can be appropriately determined by a known method such as the description of a manual or a commonly used protocol.
  • the reverse transcriptase is any known reverse transcriptase that can be used in molecular biology experiments, such as Tth DNA polymerase, rTth DNA polymerase, AMV reverse transcriptase, MMLV reverse transcriptase, HIV reverse transcriptase, etc. Derivatives can be used.
  • the forward primer and the reverse primer for PCR have a length suitable for amplification and quantification of the PCR product derived from m-BCR-ABL1 mRNA, for example, about 10 to 1000, about 20 to 500, about 50 to 300, about 100 to 200. It may be designed to have a nucleotide length of about 130-180 nucleotides, about 150-160 nucleotides, eg, about 155 nucleotides. Methods for designing primers suitable for PCR are well known to those skilled in the art.
  • a forward primer having a partial base sequence of exon 1 of the BCR gene is used. This can bind to a region corresponding to BCR gene exon 1 of single-stranded DNA which is a complementary strand of m-BCR-ABL1 mRNA and M-BCR-ABL1 mRNA in the PCR reaction, and can cause an elongation reaction.
  • Exon 1 of the BCR gene has, for example, the base sequence of SEQ ID NO: 12, and the forward primer can be designed based on the base sequence.
  • the forward primer comprises the base sequence of TCGCAACAGTCCTTCGACAG (SEQ ID NO: 13).
  • the forward primer consists of the base sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the reverse primer used in PCR has a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene, and can be designed according to the reverse primer used in reverse transcription.
  • the reverse primer used for PCR may be the same as or different from the reverse primer used for reverse transcription. In one embodiment, the reverse primer used in reverse transcription and the reverse primer used in PCR are the same.
  • the PCR may be quantitative PCR, such as quantitative real time PCR.
  • Various fluorescent PCR techniques can be used for quantitative real-time PCR.
  • the fluorescent PCR technique include an intercalator method using a fluorescent nucleic acid labeling agent such as SYBR GREEN I (for example, LightCycler (registered trademark) (Roche), ABI Prizm 7700 Sequence Detection System (registered trademark) (Perkin Elmer, Applied Biosystems), TaqMan probe method for monitoring amplification in real time using 5 ′ exonuclease activity of DNA polymerase, RNase activity of RNase H enzyme and cycling probe using dedicated chimeric RNA probe Law, etc., but is not limited to this.
  • SYBR GREEN I for example, LightCycler (registered trademark) (Roche), ABI Prizm 7700 Sequence Detection System (registered trademark) (Perkin Elmer, Applied Biosystems)
  • TaqMan probe method for monitoring amplification in
  • quantitative real-time PCR is performed by the TaqMan probe method.
  • an oligonucleotide in which the 5 'end is modified with a fluorescent substance and the 3' end with a quencher substance is added to the PCR reaction system.
  • the TaqMan probe specifically hybridizes to the template DNA at the annealing stage. However, since a quencher is present on the probe, the generation of fluorescence is suppressed even when irradiated with excitation light.
  • the fluorescent dye is separated from the quencher and emits fluorescence.
  • the TaqMan probe can bind to either strand of the PCR product derived from m-BCR-ABL1 mRNA, can bind to it anywhere, and can be designed by methods well known in the art. Also, any combination of fluorescent material and quencher material can be used.
  • the TaqMan probe comprises the base sequence of ATCGTGGGCGTCCGCAAGAC (SEQ ID NO: 14). In one embodiment, the TaqMan probe consists of the base sequence of SEQ ID NO: 14.
  • a standard solution containing a known concentration of cDNA and an unknown concentration of cDNA are amplified simultaneously, and the horizontal axis represents the number of amplification cycles, and the vertical axis represents the fluorescence intensity (logarithmic conversion value) of the reporter dye.
  • An amplification curve may be created. A line parallel to the horizontal axis is drawn near the central value of the fluorescence intensity where the amplification curve becomes linear, and the number of amplification cycles when the line and each amplification curve intersect can be obtained.
  • the sample amplification cycle number is applied to this standard curve.
  • the concentration of can be calculated.
  • the same M-BCR clamp and reverse primer can be used in reverse transcription and PCR. Therefore, the reaction can be performed by adding reagents necessary for PCR to all or part of the reverse transcription product.
  • reverse transcription and PCR can be performed in one step, that is, in the same container, simultaneously or sequentially.
  • step (1) can be performed as quantitative real-time RT-PCR.
  • reagents such as DNA polymerase, dNTP, and buffer that are commonly used in the art can be used, and conditions such as the amount of each reagent, reaction time, and temperature are attached to the enzyme. It can be appropriately determined by a known method such as a written description or a commonly used protocol.
  • the DNA polymerase any known DNA polymerase that can be used for molecular biology experiments and the like, for example, rTth DNA polymerase, Taq polymerase, and derivatives thereof can be used.
  • step (2) of the above method when the nucleic acid is amplified by PCR in step (1), it is determined that the subject has the m-BCR-ABL1 gene.
  • the amplification of the nucleic acid may be determined using any method as long as it is known as a method for detecting the nucleic acid. For example, the determination can be made by electrophoresis of nucleic acid after amplification, hybridization method using a nucleic acid probe bound with a detectable label, staining of double-stranded DNA with an intercalating fluorescent dye, fluorescent probe method and the like. As described above, nucleic acid amplification may be detected in quantitative PCR.
  • a nucleic acid containing a base sequence (eg, SEQ ID NO: 9) corresponding to exons 2 to 11 of the ABL1 gene is quantified and compared with the measured value of m-BCR-ABL1.
  • Nucleic acids containing base sequences corresponding to exons 2 to 11 of the ABL1 gene can be derived from the ABL1 gene, m-BCR-ABL1 gene and M-BCR-ABL1 gene.
  • m-BCR-ABL nucleic acid is quantified, and a value obtained by dividing the measured value by the measured value of a nucleic acid containing a base sequence corresponding to exons 2 to 11 of the ABL1 gene is normalized m It can be a measured value of BCR-ABL1.
  • the measurement value of m-BCR-ABL1 may be standardized using the measurement value of a general housekeeping gene.
  • the primers, clamps and probes in Table 1 below are used. All of these may be used in combination, or at least one may be used.
  • kits for performing the above methods is at least (A) a modified nucleic acid having a partial base sequence of exons 2 to 14 of the BCR gene or a base sequence complementary thereto; (B) a reverse primer having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene; and (C) a forward primer having a partial base sequence of exon 1 of the BCR gene; including.
  • the kit may further include at least one of a second modified nucleic acid, a second reverse primer, and a probe for quantitative PCR.
  • the kit can further include a standard, eg, a known amount of minor BCR-ABL1 mRNA.
  • the kit may further comprise a primer for quantifying a control gene mRNA (for example, an mRNA comprising at least a part of a base sequence corresponding to exons 2 to 11 of the ABL1 gene).
  • the kit may further contain reagents necessary for carrying out the above method, for example, reverse transcriptase, DNA polymerase, dNTP, buffer, etc. for reverse transcription, PCR or quantitative PCR.
  • the kit may further include other components desirable from a commercial and user standpoint, such as a package insert containing instructions for use (eg, a written or storage medium).
  • kits Each component included in the kit is either separately or, if possible, mixed, dissolved in water or a suitable buffer, or lyophilized and placed in a suitable container.
  • Suitable containers include bottles, vials, test tubes, tubes, plates, multiwell plates and the like.
  • the container may be formed from at least one material such as glass, plastic, metal, and the like.
  • the container may have a label.
  • the application provides a method for detecting expression of a minor BCR-ABL1 gene in a subject comprising: (1) A first reverse having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene in the presence of a modified nucleic acid having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 14 of the BCR gene Reverse transcription of the RNA sample of interest using a primer; (2) A step of performing PCR using a forward primer having a partial base sequence of exon 1 of the BCR gene and a second reverse primer having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene , (3) a step of determining that the subject expresses the minor BCR-ABL1 gene when the nucleic acid is amplified by PCR; A method comprising: Details of this method are the same as those described above.
  • a method for detecting a minor BCR-ABL1 gene in a subject (1) In the presence of a modified nucleic acid having a partial base sequence of exons 2 to 14 of the BCR gene or a base sequence complementary thereto, a nucleic acid sample obtained from the subject is used as a template, and one of the exons 1 of the BCR gene A step of performing PCR using a forward primer having a partial base sequence and a reverse primer having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene; and (2) a step of determining that the subject has a minor BCR-ABL1 gene when the nucleic acid is amplified by PCR; Including methods.
  • nucleic acid sample is cDNA obtained by reverse transcription of a target RNA sample.
  • the first nucleic acid sample is cDNA obtained by reverse-transcription of a target RNA sample in the presence of a modified nucleic acid having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 14 of the BCR gene. 3. The method according to item 2 or 2.
  • a method for detecting the expression of a minor BCR-ABL1 gene in a subject (1) reverse transcription of a target RNA sample using a first reverse primer having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene; (2) In the presence of a modified nucleic acid having a partial base sequence of exons 2 to 14 of the BCR gene or a base sequence complementary thereto, the reverse transcription product obtained in step (1) as a template, Performing PCR using a forward primer having a partial base sequence of exon 1 and a reverse primer having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene; and (3) a step of determining that the subject expresses the minor BCR-ABL1 gene when the nucleic acid is amplified by PCR; Including methods.
  • a method for detecting the expression of a minor BCR-ABL1 gene in a subject (1) A first reverse having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene in the presence of a modified nucleic acid having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 14 of the BCR gene Reverse transcription of the RNA sample of interest using a primer; (2) Using the reverse transcription product obtained in step (1) as a template, a forward primer having a partial base sequence of exon 1 of the BCR gene and a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene Performing PCR using a second reverse primer having (3) a step of determining that the subject expresses the minor BCR-ABL1 gene when the nucleic acid is amplified by PCR; Including methods.
  • a method for detecting the expression of a minor BCR-ABL1 gene in a subject (1) A first reverse having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene in the presence of a modified nucleic acid having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 14 of the BCR gene Reverse transcription of the RNA sample of interest using a primer; (2) In the presence of a modified nucleic acid having a partial base sequence of exons 2 to 14 of the BCR gene or a base sequence complementary thereto, the reverse transcription product obtained in step (1) as a template, Performing PCR using a forward primer having a partial base sequence of exon 1 and a reverse primer having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene; and (3) a step of determining that the subject expresses the minor BCR-ABL1 gene when the nucleic acid is amplified by PCR; Including methods.
  • a modified nucleic acid having a partial base sequence of exons 2 to 14 of the BCR gene or a base sequence complementary thereto, a reverse primer having a base sequence complementary to a part of exons 2 to 11 of the ABL1 gene, and BCR A kit for detecting the expression of a minor BCR-ABL1 gene in a subject, comprising a forward primer having a partial base sequence of exon 1 of the gene.
  • the kit according to item 28 or 29, wherein the modified nucleic acid has a partial nucleotide sequence of exons 2 to 13 of the BCR gene or a complementary nucleotide sequence thereto.
  • the kit according to any one of items 28 to 30, wherein the modified nucleic acid has a partial base sequence of exon 12 of the BCR gene or a base sequence complementary thereto.
  • the modified nucleic acid comprises about 10 to about 30 nucleotides.
  • the modified nucleic acid comprises 21 nucleotides.
  • the modified nucleic acid comprises the base sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the modified nucleic acid comprises the base sequence of SEQ ID NO: 8.
  • the kit according to any one of items 28 to 35, wherein the modified nucleic acid comprises PNA.
  • the reverse primer comprises the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the reverse primer consists of the base sequence of SEQ ID NO: 11.
  • the forward primer comprises the base sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the forward primer consists of the base sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the kit according to any one of items 28 to 40 further comprising a probe for quantitative PCR.
  • the kit according to any one of items 28 to 41 further comprising a second modified nucleic acid.
  • kits according to any one of items 28 to 42 further comprising a second reverse primer.
  • the kit according to any of paragraphs 28 to 43 further comprising minor BCR-ABL1 mRNA.
  • the kit according to any one of items 28 to 44 comprising at least one of the primer, clamp and probe described in Table 1.
  • the kit according to any one of items 28 to 45 comprising the primer, clamp and probe described in Table 1.
  • RT-PCR reaction solution Reagents were prepared in the amounts shown in the table below.
  • the minor BCR-ABL mRNA fluorescently labeled probe is labeled with 6-FAM (6-carboxyfluorescein) as a reporter dye and ATTO540Q as a quencher dye, and the ABL fluorescently labeled probe is HEX (hexachlorofluorescein) and quencher dye as a reporter dye As ATTO540Q.
  • a PNA clamp Panagene
  • agene that specifically binds to mRNA encoding a part of exon 12 of the BCR gene has a final concentration of 0, 0.025, 0.05, or 0.075 ⁇ M.
  • the base sequences such as primers used were as shown in the table below.
  • RNA standard product having Major BCR-ABL1 mRNA sequence RNA synthesized in vitro containing the sequence of Major BCR-ABL1 mRNA was prepared (SEQ ID NO: 18). The concentration was adjusted to 1.0 ⁇ 10 7 and 1.0 ⁇ 10 6 copies / test.
  • RNA standard product having minor BCR-ABL1 mRNA sequence In vitro synthesized RNA containing the minor BCR-ABL1 mRNA sequence was prepared (SEQ ID NO: 19). The concentrations were adjusted to 1.0 ⁇ 10 7 , 1.0 ⁇ 10 5 , 1.0 ⁇ 10 3 , 1.0 ⁇ 10 2 , 1.0 ⁇ 10 1 copies / test.
  • RNA standard product having ABL1 mRNA sequence RNA prepared in vitro containing the sequence of ABL1 mRNA was prepared (SEQ ID NO: 20). The concentrations were adjusted to 1.0 ⁇ 10 7 , 1.0 ⁇ 10 5 , 1.0 ⁇ 10 3 , 1.0 ⁇ 10 2 copies / test.
  • RT-PCR reaction conditions RT-PCR was performed under the following conditions. ⁇ Equipment: Applied biosystems 7500 Fast realtime PCR system -Temperature conditions: After reaction at 37 ° C for 5 minutes, 65 ° C for 15 minutes, 94 ° C for 1 minute, the reaction at 94 ° C for 5 seconds and 67 ° C for 40 seconds was repeated 45 times.
  • Test 1 Effect of PNA Clamp on Minor BCR-ABL1 mRNA and ABL1 mRNA Amplification
  • An RNA standard having a minor BCR-ABL1 mRNA sequence and an RNA standard having an ABL1 mRNA sequence were subjected to the above reagents and reaction conditions. It was subjected to RT-PCR. Amplification curves for minor BCR-ABL1 mRNA (minor) and ABL1 mRNA (ABL1) are shown in FIGS. 5 and 6, respectively.
  • the number of cycles of the threshold of RT-PCR Cycle of threshold; Ct value
  • the effect of adding a PNA clamp was not observed.
  • Test 2 Effect of PNA clamp on amplification of Major BCR-ABL1 mRNA and ABL1 mRNA
  • RNA standards having Major BCR-ABL1 mRNA sequence and RNA standards having ABL1 mRNA sequence were subjected to the above reagents and reaction conditions. It was subjected to RT-PCR.
  • the RT-PCR threshold cycle number (Cycle of threshold; Ct value) is shown in the table below.
  • amplification curves are shown in FIGS.
  • the concentration of Major BCR-ABL1 mRNA detected in a system that amplifies minor BCR-ABL1 mRNA is decreased by adding a PNA clamp as compared to the case where no PNA clamp is added.
  • Major BCR-ABL1 This shows that the amplification reaction of mRNA was inhibited.
  • no effect due to the addition of the PNA clamp was observed.
  • the present application can provide a method for detecting the minor BCR-ABL1 gene or measuring the expression level thereof with higher accuracy than the conventional method. That is, by using the above method or kit, it is possible to detect the minor BCR-ABL1 gene with high accuracy or to measure the expression level thereof. Therefore, the method of the present application is useful for diagnosis of onset and recurrence of leukemia, determination of prognosis, and determination of the timing of bone marrow transplantation.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本開示は、（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、対象から得られた核酸試料を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、（２）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を有すると判定する工程、を含む方法を提供する。

Description

ｍｉｎｏｒ　ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法
　本特許出願は、日本国特許出願第２０１７－０８７６６６号について優先権を主張するものであり、ここに参照することによって、その全体が本明細書中へ組み込まれるものとする。
　本願は、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法およびそのためのキットに関する。
　ＢＣＲ－ＡＢＬ１融合遺伝子は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）およびフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）に見られる染色体異常である。９番染色体と２２番染色体の間での転座ｔ（９；２２）によって、９番染色体のｑ３４バンドに局在するｃ－ＡＢＬ１遺伝子と２２番染色体のｑ１１バンドに局在するｂｃｒ遺伝子が融合して形成される。ＢＣＲ－ＡＢＬ１融合遺伝子でコードされるキメラタンパク質であるＢＣＲ－ＡＢＬ１は、チロシンキナーゼ活性を有し、恒常的に細胞増殖シグナルを刺激し、アポトーシスを抑制することで、造血幹細胞を無制限に増殖させる。近年、イマチニブなどのＢＣＲ－ＡＢＬ１を標的とするチロシンキナーゼ阻害剤が開発され、ＣＭＬおよびＰｈ＋ＡＬＬの治療成績は向上している。
　ＢＣＲ－ＡＢＬ１は、ＢＣＲの切断点の違いにより主にＭａｊｏｒ型（Ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１）とｍｉｎｏｒ型（ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１）に分類される。Ｍ－ＢＣＲはＣＭＬ患者の約９５％に見られ、ｍ－ＢＣＲはＰｈ＋ＡＬＬ患者の約２０～３０％に見られる。従って、それぞれのＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の発現量を測定することにより、ＣＭＬとＰｈ＋ＡＬＬの診断を補助することや、治療効果をモニタリングすることができる。Ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１の発現量を測定するためのキットは、出願人により「Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ測定キット」として販売されている。このキットは、ワンステップ定量リアルタイムＲＴ－ＰＣＲによりＭ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１の発現量を測定する。ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１の発現量を測定する方法としては、非特許文献１に記載の方法が知られている。
米国特許第６３９１５９２号
Gabert J et al. Leukemia.2003;17:2318-2357
　本願は、従来法よりも精度の高いｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の検出方法を提供することを目的とする。
　ある態様では、本願は、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、対象から得られた核酸試料を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、
（２）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を有すると判定する工程、
を含む方法を提供する。
　ある態様では、本願は、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーおよびＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーを含む、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出するためのキットを提供する。
　本発明により、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を従来法よりも高精度に検出できる。これにより、対象のＣＭＬまたはＰｈ＋ＡＬＬの診断または処置に有用な情報が得られることが期待される。
ｍ－ＢＣＲ遺伝子およびＭ－ＢＣＲ遺伝子の構造並びに本明細書に記載の方法の模式図である。 配列番号１の塩基配列を示す。 配列番号１の塩基配列（続き）を示す。 配列番号１の塩基配列（続き）を示す。 配列番号２の塩基配列を示す。 配列番号２の塩基配列（続き）を示す。 配列番号２の塩基配列（続き）を示す。 配列番号２の塩基配列（続き）を示す。 配列番号３の塩基配列を示す。 配列番号３の塩基配列（続き）を示す。 配列番号３の塩基配列（続き）を示す。 配列番号３の塩基配列（続き）を示す。 試験１における、ＰＮＡ存在下でのｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線を示す。 試験１における、ＰＮＡ存在下でのＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線を示す。 試験２における、ＰＮＡ存在下での１．０×１０７コピーのＭａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線を示す。 試験２における、ＰＮＡ存在下での１．０×１０６コピーのＭａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線を示す。 試験２における、ＰＮＡ存在下でのＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＴ－ＰＣＲの増幅曲線を示す。
　特に具体的な定めのない限り、本明細書で使用される用語は、有機化学、医学、薬学、分子生物学、微生物学等の分野における当業者に一般に理解されるとおりの意味を有する。以下にいくつかの本明細書で使用される用語についての定義を記載するが、これらの定義は、本明細書において、一般的な理解に優先する。
　本明細書では、数値が「約」の用語を伴う場合、その値の±１０％の範囲を含むことを意図する。例えば、「約２０」は、「１８～２２」を含むものとする。数値の範囲は、両端点の間の全ての数値および両端点の数値を含む。範囲に関する「約」は、その範囲の両端点に適用される。従って、例えば、「約２０～３０」は、「１８～３３」を含むものとする。
　ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子は、慢性骨髄性白血病およびフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病にみられるＡＢＬ１遺伝子とＢＣＲ遺伝子の融合遺伝子である。９番染色体と２２番染色体の間での転座ｔ（９；２２）によって生じる。ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子は、ＢＣＲの切断点の違いにより主にｍｉｎｏｒ型とＭａｊｏｒ型に分類される。「ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１（ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１）遺伝子」は、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１とＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１が融合した遺伝子である。「Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１（Ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１）遺伝子」は、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１～１３または１～１４とＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１が融合した遺伝子である。ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子およびＭ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の構造を図１に示す。
　本願発明者らは、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの測定方法の開発を進める中で、既存のｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの測定キットと同様の方法で試験したところ、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡのみならず、Ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡも検出され、正確なｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの測定ができない場合があることを見出した（実施例の試験２参照）。当該試験では、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｃＤＮＡを増幅するために、ＢＣＲ遺伝子エクソン１の塩基配列に基づいて設計されたフォワードプライマーとＡＢＬ１遺伝子エクソン２の塩基配列に基づいて設計されたリバースプライマーを用いてＰＣＲを行った。図１に示す通り、Ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｃＤＮＡには、ＢＣＲ遺伝子エクソン１とＡＢＬ１遺伝子エクソン２の間にＢＣＲ遺伝子エクソン２～１３（約１４２８塩基長）または２～１４（約１５０３塩基長）の領域が存在するため、従来は、これより大幅に短いｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｃＤＮＡを増幅するためのＰＣＲ条件下では、Ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｃＤＮＡは増幅されないと考えられてきた。しかしながら、試験２に示す通り、従来法では実際にはＭ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｃＤＮＡが増幅されることがあり、誤測定の可能性という重大な欠点があることが判明した。本願は、この欠点を解消し、正確なｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子もしくはその発現の検出またはｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１の発現量の測定を可能にする方法およびそのためのキットを提供するものである。
　ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の塩基配列は、代表的には配列番号１で表されるが、多数の変異体が知られている。Ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の塩基配列は、代表的には配列番号２および３で表されるが、多数の変異体が知られている。
　本願に関して、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子およびＭ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子には、各々配列番号１および配列番号２または３で表される配列を有するポリヌクレオチドに相補的な配列を有するポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドの配列を有する遺伝子も含まれる。「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」に関して、ここで使用されるハイブリダイゼーションは、例えば、Molecular Cloning, T. Maniatis et al., CSH Laboratory (1983) 等に記載される通常の方法に準じて行うことができる。また「ストリンジェントな条件下」とは、例えば、６×ＳＳＣ（１.５Ｍ ＮａＣｌ、０.１５Ｍ クエン酸三ナトリウムを含む溶液を１０×ＳＳＣとする）、５０％ホルムアミドを含む溶液中で４５℃にてハイブリッドを形成させた後、２×ＳＳＣで５０℃にて洗浄するような条件（Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-6.3.6）、および、それと同等のストリンジェンシーをもたらす条件を挙げることができる。
　さらに、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子およびＭ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子には、各々の配列番号１および配列番号２または３で表される塩基配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上の配列同一性を有する塩基配列を有する遺伝子が含まれる。配列同一性とは、２つのオリゴヌクレオチド間の配列の類似の程度を意味し、比較対象の塩基配列の領域にわたって最適な状態（配列の一致が最大となる状態）にアラインメントされた２つの配列を比較することにより決定される。配列同一性の数値（％）は両方の配列に存在する同一の塩基を決定して、適合部位の数を決定し、次いでこの適合部位の数を比較対象の配列領域内の塩基の総数で割り、得られた数値に１００をかけることにより算出される。最適なアラインメントおよび配列同一性を得るためのアルゴリズムとしては、当業者が通常利用可能な種々のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴアルゴリズム、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなど）が挙げられる。塩基配列の配列同一性は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどの配列解析ソフトウェアを用いて決定される。
　本願に関して、典型的には、対象はヒトである。対象は、白血病、例えば、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）またはフィラデルフィア染色体陽性急性リンパ性白血病（Ｐｈ＋ＡＬＬ）に罹患しているか、または、罹患している疑いのある対象であってもよい。
　本願に関して、「核酸試料」は、対象から得られたＤＮＡ、または、対象から得られたＲＮＡを逆転写することにより得られたｃＤＮＡを意味する。ＲＮＡは、ｔｏｔａｌＲＮＡであってもよく、精製されたｍＲＮＡであってもよい。核酸試料は、対象に由来する造血幹細胞、白血球または白血病細胞を含む試料、例えば、血液、骨髄液、リンパ液から得られる。単離された造血幹細胞、血液細胞、白血球または白血病細胞から核酸試料を得てもよい。ある実施態様では、核酸試料は末梢血白血球または骨髄液有核細胞から得られる。ある実施態様では、核酸試料は末梢血白血球から得られる。
　試料からのＤＮＡまたはＲＮＡの抽出には、公知のいかなる方法を用いてもよい。例えば、ＰＣＩ（フェノール・クロロホルム・イソアミルアルコール抽出）法において溶液を酸性にして水層から抽出する方法、市販のＤＮＡ抽出キットまたはＲＮＡ抽出キットを用いる方法、その他の公知の方法によることができる。
　上記方法の工程（１）において、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸を用いる。これは、Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡに由来するＰＣＲ増幅産物において、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４に相当する領域に結合し得る。本明細書において、当該修飾核酸を、「Ｍ－ＢＣＲクランプ」と称する。
　「修飾核酸」は、１個以上の人工ヌクレオチドを含む核酸であって、ある配列を有するｍＲＮＡまたはＤＮＡに対して、修飾核酸と同じ塩基配列を有するＤＮＡよりも強く相補鎖を形成し、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼのエキソヌクレアーゼ活性により分解されない核酸である。逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼは、鋳型であるｍＲＮＡまたはＤＮＡに修飾核酸が結合していると、結合部位で伸長反応を停止する。Ｍ－ＢＣＲクランプは、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４に相当する塩基配列を含むＭ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子由来のポリヌクレオチドと結合し、これを鋳型とする伸長反応を抑制するが、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４に相当する塩基配列を含まないｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子由来のポリヌクレオチドとは結合せず、これを鋳型とする伸長反応を抑制しない。
　Ｍ－ＢＣＲクランプは、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４、好ましくは２～１３に含まれる約１０～３０個、約１５～２５個、約１９～２３個または約２０～２２個、例えば約２１個の連続するヌクレオチドの塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸として設計し得る。ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４は、例えば、配列番号４の塩基配列を有する。ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１３は、例えば、配列番号５の塩基配列を有する。ある実施態様では、Ｍ－ＢＣＲクランプは、工程（１）のＰＣＲ増幅産物において、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの結合領域に近い領域に結合するように設計する。具体的には、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの結合領域から約３００、約２００、約１５０または約１００ヌクレオチド以内の領域に結合するように設計する。ある実施態様では、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２および１３に相当する領域（例えば、配列番号６）、例えばエクソン１３に相当する領域（例えば、配列番号７）に結合するように設計する。ある実施態様では、Ｍ－ＢＣＲクランプは、ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣ（配列番号８）の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を含む。ある実施態様では、Ｍ－ＢＣＲクランプは、配列番号８の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列からなる。
　Ｍ－ＢＣＲクランプは、１個またはそれ以上の人工ヌクレオチドを含む。人工ヌクレオチドは、天然のヌクレオチドと異なる構造を有し、ヌクレアーゼ耐性や標的配列との結合親和性を高めるものを選択し得る。例えば、出典明示により本明細書の一部とする Deleavey, G. F., & Damha, M. J. (2012). Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing. Chemistry & biology, 19(8), 937-954 に記載の人工ヌクレオチドを使用し得る。人工ヌクレオチドの例には、例えば、無塩基（abasic）ヌクレオシド；アラビノヌクレオシド、２'－デオキシウリジン、α－デオキシリボヌクレオシド、β－Ｌ－デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオシド；ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスフェート基が結合したペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋型人工核酸（ＬＮＡ）、２'－Ｏ,４'－Ｃ－エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、拘束エチル（ｃＥｔ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。糖修飾を有する人工ヌクレオチドには、２'－Ｏ－メチルリボース、２'－Ｏ－メトキシエチルリボース、２'－デオキシ－２'－フルオロリボース、３'－Ｏ－メチルリボース等の置換五単糖；１'，２'－デオキシリボース；アラビノース；置換アラビノース糖；六単糖およびアルファ－アノマーの糖修飾を有するものが含まれる。修飾された塩基を有する人工ヌクレオチドとしては、例えば、５－ヒドロキシシトシン、５－メチルシトシン、５－フルオロウラシル、４－チオウラシル等のピリミジン；６－メチルアデニン、６－チオグアノシン等のプリン；および他の複素環塩基等を有するものが挙げられる。Ｍ－ＢＣＲクランプ中の人工ヌクレオチドは、すべて同じ種類のものであってもよく、２種類以上の異なる人工ヌクレオチドが存在してもよい。
　ある実施態様では、Ｍ－ＢＣＲクランプは、人工ヌクレオチドとして、１個またはそれ以上のＰＮＡを含む。ＰＮＡは、一般に、Ｎ－（２－アミノエチル）グリシンがペプチド結合することにより、ＤＮＡのリン酸結合がペプチド結合で置き換えられた構造を生じる（Nielsen et al. 1991 Science 254, 1457-1500）。ＰＮＡは、各種核酸分解酵素に対して耐性であり、ＤＮＡまたはＲＮＡと同様の分子認識によりＤＮＡまたはＲＮＡと相補鎖を形成する。ＰＮＡとＤＮＡの親和性は、ＤＮＡとＤＮＡまたはＤＮＡとＲＮＡの親和性よりも高い。ある実施態様では、Ｍ－ＢＣＲクランプ中のヌクレオチドは、すべてＰＮＡである。
　ある実施態様では、核酸試料は、対象のＲＮＡ試料を逆転写することにより得られたｃＤＮＡであり、この場合、上記方法により対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の発現が検出される。ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸（Ｍ－ＢＣＲクランプ）の存在下で逆転写を行ってもよい。これは、Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡにおけるＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４に相当する領域に結合し得る。逆転写で用いるＭ－ＢＣＲクランプは、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４、好ましくは２～１３に含まれる約１０～３０個、約１５～２５個、約１９～２３個または約２０～２２個、例えば約２１個の連続するヌクレオチドに相補的な塩基配列を有する修飾核酸として設計し得る。ある実施態様では、逆転写で用いるＭ－ＢＣＲクランプは、Ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡにおいて、逆転写用のリバースプライマーの結合領域に近い領域に結合するように、即ち、ＢＣＲのエクソン２～１４に相当する領域中の３’末端に近い領域に結合するように設計する。具体的には、ＢＣＲ由来領域とＡＢＬ１由来領域との結合点から約３００、約２００、約１５０または約１００ヌクレオチド以内の領域に結合するように設計する。例えば、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２および１３に相当する領域（例えば、配列番号６）、例えばエクソン１３に相当する領域（例えば、配列番号７）に結合するように設計する。ある実施態様では、逆転写で用いるＭ－ＢＣＲクランプは、ＡＧＧＧＡＧＡＡＧＣＴＴＣＴＧＡＡＡＣＡＣ（配列番号８）の塩基配列を含む。ある実施態様では、逆転写で用いるＭ－ＢＣＲクランプは、配列番号８の塩基配列からなる。逆転写で用いるＭ－ＢＣＲクランプは、上記のＰＣＲで用いるＭ－ＢＣＲクランプと同様に製造および使用し得る。
　逆転写で用いるＭ－ＢＣＲクランプは、ＰＣＲで用いるＭ－ＢＣＲクランプと同一であっても異なっていてもよい。ある実施態様では、逆転写で用いるＭ－ＢＣＲクランプは、ＰＣＲで用いるＭ－ＢＣＲクランプと同一である。
　逆転写またはＰＣＲにおけるＭ－ＢＣＲクランプの添加量は、逆転写またはＰＣＲをそれぞれ抑制し得る量であればよく、例えば、反応液の最終体積モル濃度で、約０．０１μＭ～１０μＭ、約０．０１μＭ～５μＭ、約０．０１μＭ～１μＭまたは約０．０１μＭ～０．１μＭ、例えば、約０．０２５、約０．０５０または約０．０７５μＭとすることができる。
　逆転写のために、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを使用する。これは、逆転写反応において、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡおよびＭ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡに結合し、伸長反応を引き起こし得る。ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１は、例えば、配列番号９の塩基配列を有し、逆転写用のリバースプライマーは、当該塩基配列に基づいて設計し得る。例えば、逆転写用のリバースプライマーは、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２の塩基配列（例えば、配列番号１０）に基づいて設計し得る。ある実施態様では、逆転写用のリバースプライマーは、ＣＣＴＧＡＧＧＣＴＣＡＡＡＧＴＣＡＧＡＴＧＣＴＡＣ（配列番号１１）の塩基配列を含む。ある実施態様では、逆転写用のリバースプライマーは、配列番号１１の塩基配列からなる。逆転写に適するプライマーの設計方法は当業者に周知である。
　逆転写反応において、逆転写酵素、ｄＮＴＰ、バッファーなどの試薬は、当分野で通常用いられるものを用いることができ、各種試薬の量、反応時間、温度などの条件は、逆転写酵素に添付されている説明書の記載や通常用いられるプロトコール等の公知の手法により、適宜決定することができる。例えば、逆転写酵素は分子生物学実験等に使用可能な公知の任意の逆転写酵素、例えば、ＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、ＡＭＶ逆転写酵素、ＭＭＬＶ逆転写酵素、ＨＩＶ逆転写酵素等、またはそれらの誘導体を使用し得る。
　ＰＣＲ用のフォワードプライマーおよびリバースプライマーは、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物が増幅と定量に適する長さ、例えば、約１０～１０００、約２０～５００、約５０～３００、約１００～２００ヌクレオチド、約１３０～１８０ヌクレオチド、約１５０～１６０ヌクレオチド、例えば、約１５５ヌクレオチド長を有するように設計し得る。ＰＣＲに適するプライマーの設計方法は当業者に周知である。
　ＰＣＲには、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーを用いる。これは、ＰＣＲ反応において、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡおよびＭ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの相補鎖である一本鎖ＤＮＡのＢＣＲ遺伝子エクソン１に相当する領域に結合し、伸長反応を引き起こし得る。ＢＣＲ遺伝子のエクソン１は、例えば、配列番号１２の塩基配列を有し、フォワードプライマーは、当該塩基配列に基づいて設計し得る。ある実施態様では、フォワードプライマーは、ＴＣＧＣＡＡＣＡＧＴＣＣＴＴＣＧＡＣＡＧ（配列番号１３）の塩基配列を含む。ある実施態様では、フォワードプライマーは、配列番号１３の塩基配列からなる。
　ＰＣＲで用いるリバースプライマーは、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有し、逆転写で用いるリバースプライマーに準じて設計し得る。ＰＣＲで用いるリバースプライマーは、逆転写で用いるリバースプライマーと同一であっても異なっていてもよい。ある実施態様では、逆転写で用いるリバースプライマーとＰＣＲで用いるリバースプライマーは同一である。
　ＰＣＲは、定量的ＰＣＲ、例えば定量リアルタイムＰＣＲであってもよい。定量リアルタイムＰＣＲには、各種の蛍光ＰＣＲ技術を用い得る。蛍光ＰＣＲ技術としては、例えば、ＳＹＢＲ ＧＲＥＥＮ Ｉなどの蛍光性核酸標識剤を用いるインターカレーター法（例えば、ライトサイクラー（登録商標）（ロシュ社）、ABI Prizm 7700 Sequence Detection System（登録商標）（パーキン・エルマー、アプライド・バイオシステムズ社）を用いる）、ＤＮＡポリメラーゼの５'エキソヌクレアーゼ活性を利用して増幅をリアルタイムでモニターするＴａｑＭａｎプローブ法、ＲＮａｓｅＨ酵素のＲＮａｓｅ活性および専用のキメラＲＮＡプローブを利用するサイクリングプローブ法などが挙げられるが、これに限定されない。
　ある実施態様では、ＴａｑＭａｎプローブ法により定量リアルタイムＰＣＲを行う。一般的に、ＴａｑＭａｎプローブ法では、５’末端を蛍光物質で、３’末端をクエンチャー物質で修飾したオリゴヌクレオチド（ＴａｑＭａｎプローブ）をＰＣＲ反応系に加える。ＴａｑＭａｎプローブは、アニーリング段階で鋳型ＤＮＡに特異的にハイブリダイズするが、プローブ上にクエンチャーが存在するため、励起光を照射しても蛍光の発生は抑制される。伸長反応段階でＴａｑポリメラーゼの５’エキソヌクレアーゼ活性により、鋳型にハイブリダイズしたＴａｑＭａｎプローブが分解されると、蛍光色素がクエンチャーから離れ、蛍光が発せられる。ＴａｑＭａｎプローブは、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ由来のＰＣＲ産物のどちらの鎖に結合してもよく、どこに結合してもよく、当分野で周知の方法により設計し得る。また、任意の蛍光物質とクエンチャー物質の組み合わせを使用し得る。ある実施態様では、ＴａｑＭａｎプローブは、ＡＴＣＧＴＧＧＧＣＧＴＣＣＧＣＡＡＧＡＣ（配列番号１４）の塩基配列を含む。ある実施態様では、ＴａｑＭａｎプローブは、配列番号１４の塩基配列からなる。
　定量リアルタイムＰＣＲにおいて、既知濃度のｃＤＮＡを含む標準液と未知濃度のｃＤＮＡ（検体）を同時に増幅し、横軸に増幅サイクル数、縦軸にレポーター色素の蛍光強度（対数変換値）をプロットした蛍光増幅曲線を作成してもよい。増幅曲線が直線状となる蛍光強度の中央値付近で横軸と平行な線を引き、その線と各増幅曲線が交わるときの増幅サイクル数を求め得る。さらに、横軸に各標準液の濃度（対数変換値）、縦軸に標準液の増幅サイクル数をプロットした標準曲線を作成し、この標準曲線上に検体の増幅サイクル数を当てはめることにより、検体の濃度を算出し得る。
　逆転写とＰＣＲにおいて、同じＭ－ＢＣＲクランプおよびリバースプライマーを使用し得る。従って、逆転写産物の全部または一部に、ＰＣＲに必要な試薬を添加して反応を行うことができる。例えば、逆転写とＰＣＲを、ワンステップで、即ち、同一容器内で、同時または連続して行うことができる。例えば、工程（１）を、定量リアルタイムＲＴ－ＰＣＲとして実施し得る。
　ＰＣＲのために、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファーなどの試薬は、当分野で通常用いられるものを用いることができ、各種試薬の量、反応時間、温度などの条件は、酵素に添付されている説明書の記載や通常用いられるプロトコール等の公知の手法により、適宜決定することができる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼは分子生物学実験等に使用可能な公知の任意のＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼおよびその誘導体を使用し得る。
　上記方法の工程（２）では、工程（１）においてＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を有すると判定する。核酸が増幅されたことは、核酸を検出するための方法として公知のものならば、何れの方法を用いて判定してもよい。例えば、増幅後の核酸の電気泳動、検出可能な標識を結合させた核酸プローブを用いるハイブリダイゼーション法、インターカレーター性蛍光色素による二本鎖ＤＮＡの染色、蛍光プローブ法などにより、判定し得る。上記の通り、核酸の増幅を定量的ＰＣＲにおいて検出してもよい。
　上記の工程（１）と並行して、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１に相当する塩基配列（例えば、配列番号９）を含む核酸を定量し、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１の測定値と比較してもよい。ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１に相当する塩基配列を含む核酸は、ＡＢＬ１遺伝子、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子およびＭ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子に由来し得る。例えば、工程（１）でｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬの核酸を定量し、その測定値をＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１に相当する塩基配列を含む核酸の測定値で除した値を、標準化されたｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１の測定値とし得る。同様に、一般的なハウスキーピング遺伝子の測定値を用いて、ｍ－ＢＣＲ－ＡＢＬ１の測定値を標準化してもよい。
　ある実施態様では、下表１のプライマー、クランプおよびプローブを使用する。これらのすべてを組み合わせて使用してもよく、少なくとも１つを使用してもよい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ある態様では、本願は、上記の方法を実施するためのキットを提供する。キットは、少なくとも、
（ａ）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸；
（ｂ）ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマー；および、
（ｃ）ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマー；
を含む。
　キットは、さらに、第２の修飾核酸、第２のリバースプライマーおよび定量的ＰＣＲ用のプローブの少なくとも１つを含み得る。キットは、さらに、標準品、例えば、既知量のｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡを含み得る。キットは、さらに、対照遺伝子のｍＲＮＡ（例えばＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１に相当する塩基配列の少なくとも一部を含むｍＲＮＡ）を定量するためのプライマーを含み得る。キットは、さらに、上記の方法の実施に必要な試薬、例えば、逆転写、ＰＣＲまたは定量的ＰＣＲ用の、逆転写酵素、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、バッファーなどを含んでもよい。キットは、さらに、使用のための説明を含む添付文書（例えば、書面または記憶媒体等）等の、商業的見地および使用者の見地から望ましいその他の構成要素を含んでもよい。
　キットに含まれる各構成要素は、各々別個に、あるいは可能であれば混合した状態で、水または適当な緩衝液中に溶解されるか、または凍結乾燥された状態で、適切な容器中に収容されて提供され得る。好適な容器には、ボトル、バイアル、試験管、チューブ、プレート、マルチウェルプレート等が含まれる。容器は、ガラス、プラスチック、金属などの少なくとも１つの材料から形成されていてよい。容器は、ラベルを有していてもよい。
　ある態様では、本願は、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有する第１のリバースプライマーを用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、
（２）ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有する第２のリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、
（３）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を発現していると判定する工程、
を含む方法を提供する。この方法の詳細は、先に記載した方法に準じる。
　本願は、例えば、下記の実施態様を提供する。
［１］対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、対象から得られた核酸試料を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、
（２）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を有すると判定する工程、
を含む方法。
［２］核酸試料が、対象のＲＮＡ試料を逆転写することにより得られたｃＤＮＡである、第１項に記載の方法。
［３］核酸試料が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で対象のＲＮＡ試料を逆転写することにより得られたｃＤＮＡである、第１項または第２項に記載の方法。
［４］対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出する方法であって、
（１）ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有する第１のリバースプライマーを用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、
（２）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、工程（１）で得られた逆転写産物を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、
（３）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を発現していると判定する工程、
を含む方法。
［５］対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有する第１のリバースプライマーを用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、
（２）工程（１）で得られた逆転写産物を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有する第２のリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、
（３）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を発現していると判定する工程、
を含む方法。
［６］対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出する方法であって、
（１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有する第１のリバースプライマーを用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、
（２）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、工程（１）で得られた逆転写産物を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、
（３）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を発現していると判定する工程、
を含む方法。
［７］修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１３の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、第１項～第６項のいずれかに記載の方法。
［８］修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２および１３の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、第１項～第７項のいずれかに記載の方法。
［９］修飾核酸が約１０個～約３０個のヌクレオチドを含む、第１項～第８項のいずれかに記載の方法。
［１０］修飾核酸が約２１個のヌクレオチドを含む、第１項～第９項のいずれかに記載の方法。
［１１］修飾核酸が配列番号８の塩基配列を含む、第１項～第１０項のいずれかに記載の方法。
［１２］修飾核酸が配列番号８の塩基配列からなる、第１項～第１１項のいずれかに記載の方法。
［１３］修飾核酸がＰＮＡを含む、第１項～第１２項のいずれかに記載の方法。
［１４］逆転写で用いる修飾核酸とＰＣＲで用いる修飾核酸が同一である、第３項または第６項～第１３項のいずれかに記載の方法。
［１５］逆転写で用いるリバースプライマーまたはＰＣＲで用いるリバースプライマーが配列番号１１の塩基配列を含む、第１項～第１４項のいずれかに記載の方法。
［１６］逆転写で用いるリバースプライマーまたはＰＣＲで用いるリバースプライマーが配列番号１１の塩基配列からなる、第１項～第１５項のいずれかに記載の方法。
［１７］逆転写で用いるリバースプライマーとＰＣＲで用いるリバースプライマーが同一である、第２項～第１６項のいずれかに記載の方法。
［１８］フォワードプライマーが配列番号１３の塩基配列を含む、第１項～第１７項のいずれかに記載の方法。
［１９］フォワードプライマーが配列番号１３の塩基配列からなる、第１項～第１８項のいずれかに記載の方法。
［２０］逆転写とＰＣＲを同じ容器中で行う、第２項～第１９項のいずれかに記載の方法。
［２１］ＰＣＲが定量的ＰＣＲである、第１項～第２０項のいずれかに記載の方法。
［２２］ＰＣＲが定量リアルタイムＲＴ－ＰＣＲである、第１項～第２１項のいずれかに記載の方法。
［２３］対象がヒトである、第１項～第２２項のいずれかに記載の方法。
［２４］核酸試料が末梢血白血球または骨髄液有核細胞から抽出されたものである、第１項～第２３項のいずれかに記載の方法。
［２５］核酸試料が末梢血白血球から抽出されたものである、第１項～第２４項のいずれかに記載の方法。
［２６］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブの少なくとも１つを使用する、第１項～第２５項のいずれかに記載の方法。
［２７］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブを使用する、第１項～第２６項のいずれかに記載の方法。
［２８］ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーおよびＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーを含む、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出するためのキット。
［２９］ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーおよびＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーを含む、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出するためのキット。
［３０］修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１３の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、第２８項または第２９項に記載のキット。
［３１］修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、第２８項～第３０項のいずれかに記載のキット。
［３２］修飾核酸が約１０個～約３０個のヌクレオチドを含む、第２８項～第３１項のいずれかに記載のキット。
［３３］修飾核酸が２１個のヌクレオチドを含む、第２８項～第３２項のいずれかに記載のキット。
［３４］修飾核酸が配列番号８の塩基配列を含む、第２８項～第３３項のいずれかに記載のキット。
［３５］修飾核酸が配列番号８の塩基配列からなる、第２８項～第３４項のいずれかに記載のキット。
［３６］修飾核酸がＰＮＡを含む、第２８項～第３５項のいずれかに記載のキット。
［３７］リバースプライマーが配列番号１１の塩基配列を含む、第２８項～第３６項のいずれかに記載のキット。
［３８］リバースプライマーが配列番号１１の塩基配列からなる、第２８項～第３７項のいずれかに記載のキット。
［３９］フォワードプライマーが配列番号１３の塩基配列を含む、第２８項～第３８項のいずれかに記載のキット。
［４０］フォワードプライマーが配列番号１３の塩基配列からなる、第２８項～第３９項のいずれかに記載のキット。
［４１］定量的ＰＣＲ用のプローブをさらに含む、第２８項～第４０項のいずれかに記載のキット。
［４２］第２の修飾核酸をさらに含む、第２８項～第４１項のいずれかに記載のキット。
［４３］第２のリバースプライマーをさらに含む、第２８項～第４２項のいずれかに記載のキット。
［４４］ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡをさらに含む、第２８項～第４３項のいずれかに記載のキット。
［４５］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブの少なくとも１つを含む、第２８項～第４４項のいずれかに記載のキット。
［４６］表１に記載のプライマー、クランプおよびプローブを含む、第２８項～第４５項のいずれかに記載のキット。
　本明細書で引用するすべての文献は、出典明示により本明細書の一部とする。
　上記の説明は、すべて非限定的なものであり、添付の特許請求の範囲において定義される本発明の範囲から逸脱せずに、変更することができる。さらに、下記の実施例は、すべて非限定的な実施例であり、本発明を説明するためだけに供されるものである。
ＲＴ－ＰＣＲ反応液の調製
　下表の分量で試薬を調製した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ ｍＲＮＡ蛍光標識プローブはレポーター色素として６－ＦＡＭ（６－カルボキシフルオレセイン）、クエンチャー色素としてＡＴＴＯ５４０Ｑを用いて標識し、ＡＢＬ 蛍光標識プローブはレポーター色素としてＨＥＸ（ヘキサクロロフルオレセイン）、クエンチャー色素としてＡＴＴＯ５４０Ｑを用いて標識した。
　このＲＴ－ＰＣＲ反応液に、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２の一部をコードするｍＲＮＡに特異的に結合するＰＮＡクランプ（パナジーン社）を終濃度０、０．０２５、０．０５または０．０７５μＭとなるように添加した。
　使用したプライマー等の塩基配列は、下表の通りであった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
測定試料の調製
（１）Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品
　Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの配列を含む、試験管内合成されたＲＮＡを調製した（配列番号１８）。濃度を１．０×１０７、１．０×１０６コピー／試験となるように調製した。
（２）ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品
　ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの配列を含む、試験管内合成されたＲＮＡを調製した（配列番号１９）。濃度を１．０×１０７、１．０×１０５、１．０×１０３、１．０×１０２、１．０×１０１コピー／試験となるように調製した。
（３）ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品
　ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの配列を含む、試験管内合成されたＲＮＡを調製した（配列番号２０）。濃度を１．０×１０７、１．０×１０５、１．０×１０３、１．０×１０２コピー／試験となるように調製した。
ＲＴ－ＰＣＲ反応条件
　ＲＴ－ＰＣＲは下記の条件で行った。
・機器：Applied biosystems 7500 Fast realtime PCR system
・温度条件：３７℃５分間、６５℃１５分間、９４℃１分間反応後、９４℃５秒間、６７℃４０秒間の反応を４５回繰り返した。
試験１：ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡおよびＡＢＬ１ ｍＲＮＡの増幅に対するＰＮＡクランプの影響
　（２）ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品およびＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品を、上記の試薬と反応条件でＲＴ－ＰＣＲに付した。
　ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ（ｍｉｎｏｒ）およびＡＢＬ１ ｍＲＮＡ（ＡＢＬ１）について、増幅曲線を各々図５および６に示す。また、ＲＴ－ＰＣＲの閾値のサイクル数（Cycle of threshold；Ｃｔ値）を下表に示す。これらの増幅においては、ＰＮＡクランプの添加による影響は見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 -：試験せず
試験２：Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡおよびＡＢＬ１ ｍＲＮＡの増幅に対するＰＮＡクランプの影響
　（１）Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品およびＡＢＬ１ ｍＲＮＡ配列を持つＲＮＡ標準品を、上記の試薬と反応条件でＲＴ－ＰＣＲに付した。
　Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ（Ｍａｊｏｒ）およびＡＢＬ１ ｍＲＮＡ（ＡＢＬ１）について、ＲＴ－ＰＣＲの閾値のサイクル数（Cycle of threshold；Ｃｔ値）を下表に示す。また、増幅曲線を図７～９に示す。ＰＮＡクランプの非存在下では、増幅産物が１６３０ｂｐまたは１７０５ｂｐと非常に長いにも拘わらず、Ｍａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの増幅が見られた。ＰＮＡクランプを添加するとＣｔ値が大きくなり、増幅が阻害された。一方ＡＢＬ１の増幅には、ＰＮＡクランプの添加による影響は見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　表５に示したＲＴ－ＰＣＲの閾値のサイクル数について、表４に示したｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡ及びＡＢＬ１ ｍＲＮＡのＲＮＡ濃度及び閾値のサイクル数から求めた標準曲線を基に、濃度を算出した結果を表６に示す。
　ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡを増幅する系において検出されるＭａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの濃度は、ＰＮＡクランプを添加することでＰＮＡクランプ未添加の場合に比べて減少しており、ＰＮＡクランプによりＭａｊｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１ ｍＲＮＡの増幅反応が阻害されたことを示している。一方、ＡＢＬ１ ｍＲＮＡを増幅する系においては、ＰＮＡクランプの添加による影響は見られなかった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　本願は、従来法よりも精度の高いｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の検出またはその発現量の測定方法を提供し得る。即ち、上記の方法またはキットを用いることで、ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を高精度に検出すること、または、その発現量を測定することが可能になる。よって、本願の方法は、白血病の発症および再発の診断、予後判断、並びに骨髄移植の時期決定などに有用である。

Claims (17)

  1. 　対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法であって、
    （１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、対象から得られた核酸試料を鋳型とし、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、および、
    （２）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を有すると判定する工程、
    を含む方法。
  2. 　修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１３の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、請求項１に記載の方法。
  3. 　修飾核酸が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン１２および１３の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する、請求項１または２に記載の方法。
  4. 　修飾核酸が約１０個～約３０個のヌクレオチドを含む、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
  5. 　修飾核酸が配列番号８の塩基配列を含む、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
  6. 　修飾核酸がＰＮＡを含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
  7. 　核酸試料が、対象のＲＮＡ試料を逆転写することにより得られたｃＤＮＡである、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
  8. 　核酸試料が、ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で対象のＲＮＡ試料を逆転写することにより得られたｃＤＮＡである、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
  9. 　逆転写で用いる修飾核酸とＰＣＲで用いる修飾核酸が同一である、請求項８に記載の方法。
  10. 　逆転写で用いるリバースプライマーとＰＣＲで用いるリバースプライマーが同一である、請求項７～９のいずれかに記載の方法。
  11. 　逆転写とＰＣＲを同じ容器中で行う、請求項７～１０のいずれかに記載の方法。
  12. 　ＰＣＲが定量的ＰＣＲである、請求項１～１１のいずれかに記載の方法。
  13. 　ＰＣＲが定量リアルタイムＲＴ－ＰＣＲである、請求項１～１２のいずれかに記載の方法。
  14. 　対象がヒトである、請求項１～１３のいずれかに記載の方法。
  15. 　核酸試料が末梢血白血球または骨髄液有核細胞から抽出されたものである、請求項１～１４のいずれかに記載の方法。
  16. 　ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部の塩基配列またはそれに相補的な塩基配列を有する修飾核酸、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有するリバースプライマーおよびＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーを含む、対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出するためのキット。
  17. 　対象におけるｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子の発現を検出する方法であって、
    （１）ＢＣＲ遺伝子のエクソン２～１４の一部に相補的な塩基配列を有する修飾核酸の存在下で、ＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有する第１のリバースプライマーを用いて、対象のＲＮＡ試料を逆転写する工程、
    （２）ＢＣＲ遺伝子のエクソン１の一部の塩基配列を有するフォワードプライマーおよびＡＢＬ１遺伝子のエクソン２～１１の一部に相補的な塩基配列を有する第２のリバースプライマーを用いて、ＰＣＲを行う工程、
    （３）ＰＣＲにより核酸が増幅された場合に、対象がｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を発現していると判定する工程、
    を含む方法。
PCT/JP2018/016749 2017-04-26 2018-04-25 ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法 WO2018199137A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2019514563A JPWO2018199137A1 (ja) 2017-04-26 2018-04-25 ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ−ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法
US16/607,314 US12018324B2 (en) 2017-04-26 2018-04-25 Method of detecting minor BCR-ABL1 gene
CN201880026977.7A CN110546274A (zh) 2017-04-26 2018-04-25 minor BCR-ABL1基因的检测方法
EP18791478.3A EP3617326A4 (en) 2017-04-26 2018-04-25 PROCESS FOR DETECTION OF A MINOR BCR-ABL1 GENE
JP2022166992A JP7569828B2 (ja) 2017-04-26 2022-10-18 ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2017-087666 2017-04-26
JP2017087666 2017-04-26

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2018199137A1 true WO2018199137A1 (ja) 2018-11-01

Family

ID=63920424

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2018/016749 WO2018199137A1 (ja) 2017-04-26 2018-04-25 ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法

Country Status (5)

Country Link
US (1) US12018324B2 (ja)
EP (1) EP3617326A4 (ja)
JP (2) JPWO2018199137A1 (ja)
CN (1) CN110546274A (ja)
WO (1) WO2018199137A1 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113718021A (zh) * 2021-07-30 2021-11-30 广州达安基因股份有限公司 一种定量检测bcr-abl1融合基因的引物、探针及其试剂盒
WO2023230444A2 (en) * 2022-05-23 2023-11-30 Foundation Medicine, Inc. Abl1 fusions and uses thereof
CN115198004B (zh) * 2022-06-09 2023-08-15 广州血康陆道培生物技术有限公司 一种用于检测白血病患者中M-bcr基因型的试剂盒
CN117230195B (zh) * 2023-09-21 2025-02-25 武汉康圣达医学检验所有限公司 一种检测bcr-abl1 p210型融合基因的组合物及试剂盒

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2002136300A (ja) * 2000-08-25 2002-05-14 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 白血病キメラ遺伝子の検出方法
US6391592B1 (en) 2000-12-14 2002-05-21 Affymetrix, Inc. Blocker-aided target amplification of nucleic acids
US20020192645A1 (en) * 1999-12-24 2002-12-19 Tseng Richard W. BCR-ABL gene rearrangement assay method
CN103627802A (zh) * 2012-04-27 2014-03-12 南京艾迪康医学检验所有限公司 检测白血病BCR/ABL m-bcr融合基因相对表达量的引物和方法
JP2017087666A (ja) 2015-11-16 2017-05-25 王子ホールディングス株式会社 積層体及び積層体の製造方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0590090A4 (en) * 1991-06-18 1995-04-12 Univ Temple SELECTIVE INHIBITATION OF LEUKEMIC CELL PROLIFERATION BY -I (BCR-ABL) ANTISENS OLIGONUCLEOTIDES.
CA2150903A1 (en) * 1992-12-04 1994-06-23 American Home Products Corporation Compounds for the treatment of leukemias
US7700279B2 (en) * 1999-12-24 2010-04-20 Quest Diagnostics Investments Incorporated Assay for bcr/abl gene rearrangement
US20030211483A1 (en) * 2002-05-09 2003-11-13 Schroeder Benjamin G. Methods for the enrichment of low-abundance polynucleotides
KR101875199B1 (ko) * 2010-11-11 2018-07-06 주식회사 파나진 Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｂｃｒ-ａｂｌ 융합 유전자의 돌연변이 검출 방법 및 키트

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020192645A1 (en) * 1999-12-24 2002-12-19 Tseng Richard W. BCR-ABL gene rearrangement assay method
JP2002136300A (ja) * 2000-08-25 2002-05-14 Otsuka Pharmaceut Co Ltd 白血病キメラ遺伝子の検出方法
US6391592B1 (en) 2000-12-14 2002-05-21 Affymetrix, Inc. Blocker-aided target amplification of nucleic acids
CN103627802A (zh) * 2012-04-27 2014-03-12 南京艾迪康医学检验所有限公司 检测白血病BCR/ABL m-bcr融合基因相对表达量的引物和方法
JP2017087666A (ja) 2015-11-16 2017-05-25 王子ホールディングス株式会社 積層体及び積層体の製造方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Molecular Biology", 1989, JOHN WILEY & SONS, pages: 6.3.1 - 6.3.6
DELEAVEY, G. F.DAMHA, M. J.: "Designing chemically modified oligonucleotides for targeted gene silencing", CHEMISTRY & BIOLOGY, vol. 19, no. 8, 2012, pages 937 - 954, XP055107150, DOI: 10.1016/j.chembiol.2012.07.011
GABERT J ET AL., LEUKEMIA, vol. 17, 2003, pages 2318 - 2357
GABERT, J. ET AL.: "Standardization and quality control studies of'real-time'quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction of fusion gene transcripts for residual disease detection in leukemia-a Europe Against Cancer program", LEUKEMIA, vol. 17, no. 12, 9 October 2003 (2003-10-09), pages 2318 - 2357, XP002402743, ISSN: 0887-6924 *
NIELSEN ET AL., SCIENCE, vol. 254, pages 1457 - 1500
T. MANIATIS ET AL.: "Molecular Cloning", 1983, CSH LABORATORY
VAN DONGEN, JJM. ET AL.: "Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome aberrations in acute leukemia for detection of minimal residual disease. Report of the BIOMED-1 Concerted Action: investigation of minimal residual disease in acute leukemia", LEUKEMIA, vol. 13, no. 12, 1999, pages 1901 - 1928, XP000878700, ISSN: 0887-6924 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP3617326A1 (en) 2020-03-04
US20200377928A1 (en) 2020-12-03
US12018324B2 (en) 2024-06-25
EP3617326A4 (en) 2021-01-06
JP7569828B2 (ja) 2024-10-18
CN110546274A (zh) 2019-12-06
JPWO2018199137A1 (ja) 2020-03-12
JP2022189882A (ja) 2022-12-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7569828B2 (ja) ｍｉｎｏｒ ＢＣＲ－ＡＢＬ１遺伝子を検出する方法
EP2691775B1 (en) Telomere length measurement in formalin-fixed, paraffin embedded (ffpe) samples by quantitative pcr
CN107267604B (zh) 一种基于短链核酸探针和双链特异性核酸内切酶的高特异性microRNA荧光检测方法
EP4006167B1 (en) Composition for improving qpcr test performance, reaction liquid, use, and method
CA2617693A1 (en) Composition and method for determination of ck19 expression
EP3353320B1 (en) Improved detection of short homopolymeric repeats
CN104328164A (zh) 荧光探针杂交法检测人egfr基因突变试剂盒
CN105039321B (zh) 一种改进型恒温指数扩增技术及其在microRNA检测中的应用
CN105400904A (zh) 用于检测埃博拉病毒的rpa试剂盒、其专用引物和探针及其用途
CN109735623B (zh) 一种结直肠癌生物标志物
CN101875971A (zh) Braf基因突变的快速检测
JP2022130509A (ja) 分析方法及びキット
CN107513577A (zh) 一种高效检测egfrt790m突变体的方法以及用于检测的探针和试剂盒
CN104774918A (zh) 基于实时荧光pcr的il28b基因多态性检测试剂盒
CN101781677A (zh) 检测白血病广谱标记物WT1基因mRNA表达的试剂盒
JPWO2021095798A1 (ja) 未分化マーカー遺伝子高感度検出法
CN102134595B (zh) 样品中核酸质量检测方法
WO2018199136A1 (ja) Ａｂｌ１ ｔ３１５ｉ変異の発現レベルの測定方法
CN109355362B (zh) 一种高灵敏的SNPs检测体系及应用
CN101140239A (zh) 核糖核苷酸还原酶m1基因检测试剂盒及应用
JP2017175953A (ja) Ｓｙｔ−ｓｓｘ融合遺伝子検出用プローブ、ｓｙｔ−ｓｓｘ融合遺伝子検出用プローブセット、ｓｙｔ−ｓｓｘ融合遺伝子の検出方法及びｓｙｔ−ｓｓｘ融合遺伝子検出用キット
JP7007796B2 (ja) Ａｂｌ遺伝子増幅用プライマー、核酸増幅方法及び核酸増幅用キット
JP7297902B2 (ja) 分析方法及びキット
JP2020534817A (ja) 短い核酸の多重検出
CN114540503B (zh) 基于链置换和酶辅助循环信号放大的肿瘤抑制因子Let-7a检测试剂盒及其使用方法

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 18791478

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2019514563

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2018791478

Country of ref document: EP

Effective date: 20191126