KR101841748B1

KR101841748B1 - 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101841748B1
Application number: KR1020160019310A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 이응지; 김잔디
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2016-02-18
Filing date: 2016-02-18
Publication date: 2018-05-08
Anticipated expiration: 2036-02-18
Also published as: JP6868724B2; EP3495383B1; ES2943393T3; US10526373B2; US20190119321A1; CN109071603A; JP6672483B2; EP3418292A4; EP3418292A1; CN109071603B; JP2019508488A; ES2796401T3; JP2020105198A; KR20170097832A; EP3418292B1; WO2017142264A1; EP3495383A1

Abstract

본 발명은 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 티로시나아제의 활성 및 발현을 증가시키고, 멜라닌 형성에 관여하는 인자들의 발현을 증가시킴으로써 멜라닌 생성에 있어서 우수한 효과를 나타낸다. 본 발명의 펩타이드는 멜라닌 저색소증의 예방, 개선 및 치료용도로 이용될 수 있다. 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.

Description

멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도{Peptides Having Activity for Promoting Melanin Synthesis and Uses Thereof}

본 발명은 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

피부세포는 자외선이나 환경오염, 그 밖의 외부 요인의 자극에 대해 방어기전으로 표피기저층에 존재하는 멜라닌 세포(melanocyte)의 멜라닌소체(melanosome)에서 멜라닌을 생성한다. 멜라닌은 동물들의 피부, 눈동자, 머리카락의 색을 결정하는 중요한 요인이다. 저색소증은 피부암의 위험인자로도 알려졌다. 동양인들은 멜라닌이 과다로 생성되는 것에 민감하여 멜라닌 생성을 억제하는 미백관련이 연구가 많이 수행되었다. 하지만 최근에는 멜라닌 생성이 억제되어 나타나는 백반증(Vitiligo)에 대한 요구도 증가하고 있어 이에 대한 연구도 진행되고 있다.

백반증은 멜라닌 세포의 사멸이나 괴사로 인한 여러 가지 크기 및 형태의 백색반이 피부에 나타나는 후천성 탈색소 질환이다. 전세계적으로 인구의 약 1%에서 나타나는 비교적 흔한 질환으로, 인종이나 지역에 따른 차이는 없다. 발생 연령은 10~30세에 가장 많고, 95%의 경우 40세 이전에 발병하고, 환자의 30%에서 가족력이 있다. 백반증이 생기는 원인에 대해서 아직 정확히 밝혀진 바는 없으나, 자가 면역설, 신경체액설, 멜라닌 세포 자가 파괴설 등 여러 가지 설이 제시되고 있다. 자가 면역설은 멜라닌 세포계 항원에 대한 자가항체의 발현으로 멜라닌 세포의 파괴 또는 기능 이상이 초래되거나 세포 독성 림프구나 활성화된 림프구가 분비한 림포카인에 멜라닌 세포가 파괴된다는 설이다. 신경체액설은 카테콜아민 생합성의 이상과 모노아민 산화효소의 증가 등으로 인하여 스트레스와 관련된 과산화수소가 만들어지고 이로 인해 멜라닌 세포가 파괴된다는 설로, 백반증이 신경절을 따라 발생하거나 신경 손상이나 스트레스 후에 발병할 수도 있다. 멜라닌 세포 자가 파괴설은 멜라닌 형성 과정에서 생기는 중간대사 물질이나 최종대사 물질인 페놀 복합체가 멜라닌 세포 내에 축척되어 세포를 파괴한다는 설이다. 그 외 고유세포 결손(inherent cellular defect), 유전요인, 세포사멸, 칼슘대사 이상 등의 다양한 인자들이 제시되고 있다.

멜라닌은 멜라닌 생성세포(melanocytes)로부터 합성되고 자외선 조사나 독성 물질과 화학물질을 흡수함으로써 피부를 보호하는데 중요한 역할을 한다. 그러므로 멜라닌 합성이 정상적으로 일어나지 않는 사람들에서는 모든 피부가 백색으로 되기보다는 부분적으로 백색으로 변해 얼룩이 생기는 외형적인 문제점도 있고 외부 자극에 민감해지는 것이 더 문제이다.

멜라닌 합성에 중요한 효소인 티로시나아제(tyrosinase)와 TRP-1(tyrosinase related protein-1), TRP-2는 산화적 반응에 촉매로 작용한다(Pigment Cell Res. 14 (6): 43744). 티로시나아제는 티로신(tyrosine)을 DOPA(L-3,4-dihydroxyphenylalanine)로, DOPA를 DOPA 퀴논(quinone)으로 산화시키는 작용을 하고, TRP-1은 dihydroxyindole carboxylic acid oxidase로서 5,6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid(DHICA)를 indol-5,6-quinone-2-carboxylic acid로 변화시키는데 관여한다. 또한, TRP-1은 티로시나아제를 안정화시키고 활성을 조절하는 역할을 한다.

TRP-2는 DOPA 크롬 타우토머라아제로써 DOPA 크롬을 DHICA로 변화시켜 멜라닌세포를 이루는 유멜라논(eumelanon)과 페오멜라논(pheomelanon)을 형성하고 이들의 비율에 따라 피부, 머리타락, 눈동자의 색깔 등이 결정된다.

멜라닌 합성은 자외선 조사와 MSH(α-melanocyte stimulating hormone)로 인해 활성화된다. α-MSH는 펩타이드 호르몬으로 자외선에 의해 생성되며 뇌하수체 및 피부를 포함한 여러 세포에서 만들어지는 것으로 알려져 있다.

α-MSH는 측분비(paracrine)에 의해 멜라닌 생성세포의 MCR(melanocortin receptor)에 작용하여 전사인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 활성을 조절하여 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 티로시나아제, TRP-1(DHICA oxidase), TRP-2(DOPAchrome tautomerase) 등의 활성을 조절한다(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 273, No. 31, Issue of July 31, pp. 195609565, 1998).

멜라닌 형성세포가 UV 또는 α-MSH에 의해서 자극이 되면 각각 p38이나 PKA(protein kinase A)에 의해서 티로시나아제가 활성화된다고 보고되었다. 그런데 이 두 가지 경로 중 특히 α-MSH → cAMP → PKA 과정이 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는데, cAMP의 증가는 CREB(cAMP-responsive element binding protein) 인산화를 촉진시키고 이것이 전사인자인 MITF의 발현을 증가시키고, 이것은 티로시나아제의 활성을 향상시키며, 티로시나아제 mRNA 발현을 증가시킨다는 보고들이 있다(Nucleic Acids Res. 30 (14): 3096106, Pigment Cell Melanoma Res 21 (6): 66576).

한편, 우리나라를 비롯한 동양인들은 누구나 하얀 피부색을 가지기를 원하기 때문에 멜라닌 생성을 억제하는 미백 성분에 대한 연구를 많이 수행해 왔다. 그러나 멜라닌은 피부의 멜라닌 생성세포로부터 합성되며 자외선조사나 독성 물질과 화학물질을 흡수함으로써 피부를 보호하는데 중요한 역할을 한다. 멜라닌의 정상적인 합성이 나타나지 않는 경우는 피부가 외부 자극에 민감하고 외형적으로도 비정상적으로 보이므로 멜라닌 합성이 정상화될 수 있도록 치료하는 것이 필요하고 이에 대한 연구도 수행된 것들이 있다. 그러나 아직까지 멜라닌 합성을 촉진시키는 것에 대한 기술개발이 충분히 수행되지 않았다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 멜라닌 생성을 촉진시킬 수 있는 펩타이드를 개발하고자 노력하였고 그 결과, 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 우수한 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타낸다는 것을 확인하고 이들이 멜라닌 저색소증의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열목록 제1서열 내지 제2서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 또는 개선용 화장품 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 서열목록 제1서열 내지 제2서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 멜라닌 생성을 촉진시킬 수 있는 펩타이드를 개발하고자 노력하였고 그 결과, 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드가 우수한 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타낸다는 것을 확인하고 이들이 멜라닌 저색소증의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 규명하였다.

본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제2서열의 아미노산 서열들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제2서열의 아미노산 서열들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다.

본 발명의 펩타이드는 본 발명자들이 보유하고 있는 펩타이드 라이브러리 가운데 유전자 및 단백질 발현 변화 등에 대한 실험을 통해 멜라닌 형성 촉진 효능이 우수한 펩타이드를 스크리닝한 것으로써, 총 2종이 본 발명의 펩타이드로 제공된다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체내 투여시의 반감기를 증가시켜 높은 반감기를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH₂), 아자이드(-NHNH₂) 등으로 변형되어 있으며, 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 멜라닌 형성 세포에서 멜라닌 생성을 증가시키며, 멜라닌 합성을 조절하는 효소인 티로시나아제의 활성 및 발현을 증가시키고, 멜라닌 형성에 관여하는 인자인 MITF, TRP1의 발현을 증가시키며, CREB의 인산화를 증가시킨다. 이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 멜라닌 생성을 증가시킴으로써 백반증이 완화되도록 하는 효과를 가진다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 멜라닌 저색소증의 예방, 개선 및 치료용도로 이용될 수 있다.

본 발명에서 멜라닌 저색소증은 백반증, 백색증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증 또는 점상 백피증이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 조성물이 약제학적 조성물로 제조될 경우, 상술한 본 발명의 펩타이드의 약제학적 유효량(pharmaceutically effective amount) 및 약제학적으로 허용되는 담체가 포함될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 펩타이드의 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 비경구로 투여하는 것이 바람직하며, 예를 들어 피부 국소 투여에 의해 투여할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물의 1일 투여량은 0.001-1000 ㎎/㎏이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 또는 개선용 화장품 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물이 화장품 조성물로 제조될 경우, 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체가 포함될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 펩타이드류와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.

(b) 본 발명의 펩타이드는 티로시나아제의 활성 및 발현을 증가시키고, 멜라닌 형성에 관여하는 인자들의 발현을 증가시킴으로써 멜라닌 생성에 있어서 우수한 효과를 나타낸다.

(c) 본 발명의 펩타이드는 멜라닌 저색소증의 예방, 개선 및 치료용도로 이용될 수 있다.

(d) 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약, 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.

도 1은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열(a) 및 제2서열(b) 펩타이드에 의한 멜라닌 형성 증가 효과를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 서열목록 제1서열(a) 및 제2서열(b) 펩타이드에 의해 티로시나아제의 활성이 증가되는 것을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 서열목록 제1서열(a) 및 제2서열(b) 펩타이드에 의해 MITF, 티로시나아제, TRP1의 mRNA 발현이 증가되는 것을 확인한 결과이다.
도 4a는 본 발명의 서열목록 제1서열 펩타이드에 의해 MITF 및 티로시나아제의 단백질 발현이 증가되는 것을 확인한 결과이다.
도 4b는 본 발명의 서열목록 제2서열 펩타이드에 의해 티로시나아제의 단백질 발현이 증가되는 것을 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드에 의한 CREB의 인산화 증가를 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: 펩타이드의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ㎖를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ㎖를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ㎖의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Asp(OtBu)-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dechloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ㎖ 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10㎖를 반응 용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Asp(OtBu)-CTL Resin을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ㎖의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Glu(OtBu)-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Glu(OtBu)-Asp(OtBu)-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Trp-OH 및 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P₂O₅ 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ㎖을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ㎖의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 Arg-Trp-Arg-Arg-Lys-Ile-Glu-Asn 펩타이드 1을 0.65 g 합성하였다(수율: 92.0 %). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 1157.3 (이론값 : 1157.33)를 얻을 수 있었다. 다른 서열2 펩타이드도 위와 같은 방법으로 합성을 진행하였다.

번호	아미노산 서열	분석값(질량분석기)
번호	아미노산 서열	분석치	이론치
서열 1 (펩타이드-1)	Arg-Trp-Arg-Arg-Lys-Ile-Glu-Asn	1157.3	1157.33
서열 2 (펩타이드-2)	Phe-Cys-Leu-Gly-Pro-Cys-Pro-Tyr-Ile-Trp-Ser-Leu	1398.7	1398.7

실시예 1: 멜라닌 형성 어세이

6-웰 배양용 평판에 멜라닌형성 세포(B16F10 세포주)를 37℃ 배양기에서 24시간 배양한 후, 각 판의 배지를 제거하고 새로운 배지로 교체 후 본 펩타이드를 농도별로 처리하였다. 72시간 동안 배양 한 후 배양액을 제거 하고 세포를 떼어 낸 뒤 1.5 ml 튜브로 옮겨 13,000 rpm에서 3분간 원심분리 하여 상층액을 제거하고, 세포 펠렛을 회수하여 멜라닌을 관찰하였다. 세포 펠렛을 2 M NaOH 150 μl씩 넣어 60℃에서 30분 동안 세포 내 멜라닌을 용해시켰다. 96-웰 평판 각 웰에 용해시켜 얻은 상층액을 100 μl씩 넣어 490 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 마우스 멜라닌 세포주 B16F10에 서열목록 제1서열 및 제2서열의 펩타이드 처리 시 멜라닌 형성 증가가 확인되었다(도 1).

실시예 2: 티로시나아제 활성 시험

흑색종 세포주(B16F10) 세포를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양하고 농도별 펩타이드를 처리하여 72시간 배양하였다. 얼음 위에 6-웰 배양용 평판을 올리고 차가운 PBS으로 세척한 후 1% Triton X-100이 함유된 0.1 M 인산 나트륨 버퍼(pH 6.8, 용해 버퍼)를 300 μL 넣고 세포를 1.5 mL 튜브에 모아 -270℃에 급속 냉동시킨 후 해동시키는 반응을 5번 반복하여 세포막을 파괴하였다. 13,000 rpm에서 20분간 원심분리 한 후 상층액을 다른 1.5 mL 튜브에 모으고 이 시료들의 단백질을 정량하였다. 시료들의 단백질 농도가 같은 농도가 되게 희석하여 96-웰 배양용 평판에 3개 웰 씩 분주하고 10 mM L-dopa 20 μL 를 첨가하여 37℃에서 1시간 배양 후 475 nm에서 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 마우스 멜라닌 세포주 B16F10에 서열목록 제1서열 및 제2서열의 펩타이드 처리 시 세포 내 티로시나아제의 활성이 증가되었다(도 2).

실시예 3: 멜라닌 생성 관련 유전자 RT-PCR

멜라닌형성 세포(B16F10 세포주)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후 펩타이드를 농도별로 처리하였다. 72시간 동안 배양된 세포의 RNA 추출 후 cDNA를 제작하였다. 멜라닌 형성에 관여 하는 인자인 MITF 및 티로시나아제에 대한 각각의 특이적인 프라이머를 이용하여 PCR하여 각 유전자의 발현 변화를 관찰하였다.

프라이머	서열(5’-3’)
MITF 정방향	CCAGCCTGGCGATCATGTCAT
MITF 역방향	GGTCTGGACAGGAGTTGCTG
티로시나아제 정방향	GGCCAGCTTTCAGGCAGAGG
티로시나아제 역방향	TGGTGCTTCATGGGCAAAAT
TRP1 정방향	TCTGTGAAGGTGTGCAGGAG
TRP1 역방향	CCGAAACAGAGTGGAAGGTT

그 결과, 마우스 멜라닌 세포주 B16F10에 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 펩타이드 처리 시 멜라닌 형성 과정에 관여하는 전사인자인 MITF, 티로시나아제 및 TRP1의 mRNA 발현이 증가되었다(도 3).

실시예 4: 멜라닌 생성 관련 단백질 웨스턴 블롯팅

멜라닌형성 세포(B16F10 세포주)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후, 본 펩타이드를 농도별로 처리하였다. 72시간 동안 배양 한 후 세포를 용해하여 멜라닌 형성에 관여 하는 인자인 MITF 및 티로시나아제의 발현을 특이적인 항체(2종류 모두 Santacruz biotechnology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

그 결과, 마우스 멜라닌 세포에 서열목록 제1서열의 펩타이드 처리 시 멜라닌 형성 과정에 관여하는 전사인자인 MITF 및 효소인 티로시나아제의 단백질 발현이 증가되었다. 또한, 서열목록 제2서열의 펩타이드 처리 시 멜라닌 형성 과정에 관여하는 티로시나아제의 단백질 발현이 증가되었다(도 4).

실시예 5: 멜라닌 생성 관련 단백질 활성 시험

멜라닌형성 세포(B16F10 세포주)를 6-웰 배양용 평판에 24시간 배양 후, 본 펩타이드를 농도별로 처리하였다. 72시간 동안 세포를 배양한 후 세포를 용해하여 멜라닌 형성에 관여 하는 신호전달 물질인 CREB의 인산화 정도를 특이적인 항체(cell Signaling Technology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯으로 확인하였다.

그 결과, 마우스 멜라닌 세포주 B16F10에 서열목록 제1서열의 펩타이드 처리 시 멜라닌 형성 과정에 관여하는 인자인 CREB의 인산화 레벨이 증가되었다(도 5).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> CAREGEN CO., LTD. <120> Peptides Having Activity for Promoting Melanin Synthesis and Uses Thereof <130> PN160022 <160> 8 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Arg Trp Arg Arg Lys Ile Glu Asn 1 5 <210> 2 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 2 <400> 2 Phe Cys Leu Gly Pro Cys Pro Tyr Ile Trp Ser Leu 1 5 10 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> MITF Forward Primer <400> 3 ccagcctggc gatcatgtca t 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> MITF Reverse Primer <400> 4 ggtctggaca ggagttgctg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Tyrosinase Forward Primer <400> 5 ggccagcttt caggcagagg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Tyrosinase Reverse Primer <400> 6 tggtgcttca tgggcaaaat 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> TRP1 Forward Primer <400> 7 tctgtgaagg tgtgcaggag 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> TRP1 Reverse Primer <400> 8 ccgaaacaga gtggaaggtt 20

Claims

서열목록 제1서열에 기재된 아미노산 서열로 이루어진 멜라닌 생성 촉진 활성을 나타내는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 티로시나아제(tyrosinase)의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 MITF(Microphthalmia-associated transcription factor) 및 TRP1(Tyrosinase-related protein 1)로 이루어진 군으로부터 선택되는 멜라닌 합성 관련 인자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 티로시나아제의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 CREB(cAMP response element-binding protein)의 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 6 항에 있어서, 상기 멜라닌 저색소증은 백반증, 백색증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증 또는 점상 백피증인 것을 특징으로 하는 멜라닌 저색소증의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 멜라닌 저색소증의 예방 또는 개선용 화장품 조성물.
제 8 항에 있어서, 상기 멜라닌 저색소증은 백반증, 백색증, 탈색소 모반, 백색 비강진, 어루러기, 염증후 탈색증, 반상 경피증, 부분 백피증, 특발성 적상 저색소증 또는 점상 백피증인 것을 특징으로 하는 멜라닌 저색소증의 예방 또는 개선용 화장품 조성물.