KR101791526B1

KR101791526B1 - 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101791526B1
Application number: KR1020160019292A
Authority: KR
Inventors: 정용지; 김은미; 이응지; 김민웅
Original assignee: (주)케어젠
Priority date: 2016-02-18
Filing date: 2016-02-18
Publication date: 2017-11-01
Anticipated expiration: 2036-02-18
Also published as: JP2020105196A; CN116333039A; CN108699109B; EP3418291A1; CN116333044A; KR20170097830A; WO2017142254A1; JP2020105197A; JP6866518B2; ES2870470T3; JP6868723B2; JP2019507187A; CN108699109A; US10568828B2; EP3418291A4; EP3418291B1; JP6672482B2; US20190046427A1

Abstract

본 발명은 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다. 본 발명의 펩타이드는 모낭 세포 성장을 촉진하며, 발모 관련 성장인자 및 발모 관련 인자들의 발현을 증가시킴으로써 발모에 우수한 효과를 나타낸다. 본 발명의 펩타이드는 탈모 방지 또는 개선, 발모 촉진 및 모발 성장 개선용도로 이용될 수 있다. 또한, 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.

Description

발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도{Peptides having Hair Growth Activity and Uses Thereof}

본 발명은 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

모낭은 포유동물 피부의 독특한 기관으로서 원시 표피의 하부가 성장하여 보다 깊은 피부 층으로 신장된 기관이다. 모낭의 기부에는 소낭 또는 진피 유두 세포로서 알려진 세포의 플러그가 존재 하며(Stenn and Paus, Physiol . Rev., 81: 449 (2002)) 유두는 모낭의 정상적인 순환(Oliver, Embryol . Exp . Morph. 15: 3311 (1966); Oliver, Embryol . Exp . Morph. 16: 231 (1966)) 및 모간의 성장에 필수적이다. 모간은 케라틴 필라멘트와 필라멘트 응집 단백질로 충전된 단단하게 밀착된 상피 세포로 제조된 트레드 형상의 구조이다.

인간의 모발은 주기적으로 생장기, 퇴행기, 휴지기를 반복하며 모발이 빠지고 다시 생성되는 과정을 거치게 된다. 모발 주기의 결정은 호르몬 조절이나 많은 성장인자 등의 조절을 통하여 이루어진다. 한편, 모발은 심한 스트레스나 영양 결핍 등에 의해 일찍 퇴행기를 거쳐 휴지기로 접어들어 심한 탈모가 유발될 수 있다(American Journal of Pathology, 162(3)(2003), (Arck, Petra Clara; Handjiski, Bori)). 남성형 대머리에 있어서 두피의 전면 및 상부의 모낭은 안드로겐에 대해 감수성을 나타낸다. 그래서 남성형 대머리의 경우, 모낭의 파괴보다는 모낭의 소형화에 해당되는데 남성 호르몬인 안드로겐의 과도한 분비가 원인이다. 안드로겐 과다 분비로 인해 5-알파 환원효소가 활성화 되어 테스토스테론이 디하이드로테스토스테론(dihydrotestosterone,DHT)으로 변형되며, 이렇게 생성된 디하이드로테스토스테론은 모발이 자라는 기간을 단축시키고, 모낭을 소형화시켜 굵고 튼튼한 성모의 수를 감소시킴으로써 탈모를 유발시킨다.

일반적으로 나이가 들어감에 따라 탈모가 확산된다. 예를 들면, 흉터 탈모증, 화상 또는 압박 상해와 관련된 흉터형성 상태와 같은 상이한 질환 상태가 현저한 탈모를 일으킬 수 있다. 이런 탈모현상을 치료하기 위해 지금까지는 의약품으로 여러 가지 물질 등이 사용되어 왔으나 가격이 너무 비싸고, 여러 가지 부작용들이 유발된다. 또한, 이런 의약품들은 지속적인 사용을 필요로 하며 사용을 중단하였을 때에는 다시 탈모가 유발되고 효능에 대한 개개인의 차이가 심하며, 부작용도 개개인 마다 차이가 난다는 단점이 있다.

그 외 화장품으로 이용되고 있는 원료들은 가격이 저렴하다는 장점이 있지만, 식물 추출물 유래 성분들로 구성되어 있기 때문에 실제 그 효능은 크지 않다는 단점이 있다. 따라서 효과적이면서 비용적인 측면에서도 보다 경제적인 새로운 유효성분에 대한 요구가 당업계에 대두하고 있다.

지금까지 알려진 2가지 이용 가능한 약물(미녹시딜 및 피나스테라이드)은 추가 탈모를 지연시킬 수는 있지만, 새로운 모낭의 재생을 유도하지는 못했다. 또한, 두발 화장품 중에서 식물 추출물 등을 이용한 탈모방지 제품이 많이 출시되었는데, 특히, 고삼, 고추, 당약, 상백피, 상엽, 임삼, 감초, 작약, 지황, 회향, 산수유, 마늘등의 추출물을 함유한 제품, 크산틴 및 성장호르몬을 함유하는 조성물을 첨가하여 디하이드로테스토스테론의 과잉에 따른 세포대사 억제를 개선함과 동시에 성장 호르몬이 모발성장을 촉진함으로써 탈모방지 및 모발을 재생하여 모발성장 촉진 효과를 나타내는 제품, 발모 및 모발의 성장을 촉진하기 위해 미네랄 및 비타민류, 녹차, 로즈마리, 쑥, 감초 추출액을 함유한 제품을 개발하여 두피와 모발에 영양을 공급하며 탈모의 예방 및 모발 성장 촉진에 효과가 있는 발모 촉진용 제품, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 니코틴산, 판토텐산, 비오틴 및 엽산 등의 물질과 식물추출물을 혼합하여 인체 내의 5-알파 환원효소를 억제하여 남성호르몬의 대사과정에서 디하이드로테스토스테론이 형성되지 않도록 하며 머리카락의 신진대사작용을 돕는 남성형 탈모제품들이 개발되었으나 신생모발의 생성까지 영향을 미치는 제품은 찾기 어려웠다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 우수한 발모 효능을 갖는 펩타이드를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명자들의 펩타이드 라이브러리로부터 우수한 발모 효능을 나타내는 3종의 펩타이드를 선별하였고, 이들의 발모 효능에 대하여 실험적으로 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제3서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 및 모발 성장 개선용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 서열목록 제1서열, 제2서열 및 제3서열에 기재된 아미노산 서열로 구성된 군으로부터 선택되는 1종의 아미노산 서열로 이루어진 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 본 발명자들은 우수한 발모 효능을 갖는 펩타이드를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명자들의 펩타이드 라이브러리로부터 우수한 발모 효능을 나타내는 3종의 펩타이드를 선별하였고, 이들의 발모 효능에 대하여 실험적으로 규명하였다.

본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 제3서열의 아미노산 서열들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서의 펩타이드는 서열목록 제1서열 내지 서열목록 제3서열의 아미노산 서열들로부터 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 필수적으로 구성되어 있다.

본 명세서에서 용어 “펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 본 발명의 펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성 방법, 특히 고상 합성 기술(solid-phase synthesis techniques; Merrifield, J. Amer . Chem . Soc . 85:2149-54(1963); Stewart, et al., Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd. ed., Pierce Chem. Co.: Rockford, 111(1984)) 또는 액상 합성 기술(US 등록특허 제5,516,891호)에 따라 제조될 수 있다.

본 발명의 펩타이드는 본 발명자들이 보유하고 있는 펩타이드 라이브러리 가운데 세포 증식 실험을 통해 발모 효능이 우수한 펩타이드를 스크리닝한 것으로써, 총 3종이 본 발명의 펩타이드로 제공된다.

본 발명의 펩타이드는 아미노산 서열의 일부 부위를 선정하고 그 활성을 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 변형을 유도할 수 있다. 이러한 변형을 통해 본 발명의 펩타이드는 생체내 투여시의 반감기를 증가시켜 높은 반감기를 가질 수 있다.

또한, 본 발명의 펩타이드의 C-말단은 히드록시기(-OH), 아미노기(-NH₂), 아자이드(-NHNH₂) 등으로 변형되어 있으며, 펩타이드의 N-말단은 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)로 구성된 군으로부터 선택되는 보호기가 결합될 수 있다.

상술한 아미노산의 변형은 본 발명의 펩타이드의 안정성을 크게 개선하는 작용을 한다. 본 명세서에서 용어 “안정성”은 인 비보 안정성뿐만 아니라, 저장 안정성(예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다. 상술한 보호기는 생체 내의 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 작용을 한다.

본 발명의 구현예에 따르면, 본 발명의 펩타이드는 모낭 세포 성장을 촉진하며, 모발 성장 관련 인자인 β-카테닌의 발현을 증가시키고, 발모 관련 성장인자인 KGF, bFGF, VEGF의 발현을 증가시키며, 발모 시그널링 분자인 PI3K의 발현을 증가시키고, ERK의 인산화를 증가시키며, 모발 성장 관련 인자인 MSX2 및 카라틴-14의 발현을 증가시키고, 모발 성장 지연과 관련된 TGF-β1의 발현을 억제시키며, 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2의 발현 증가 및 세포 사멸 관련 단백질인 Bax의 발현 감소를 유도한다. 이러한 결과는 본 발명의 펩타이드가 발모에 대하여 매우 우수한 효능을 가진다는 것을 의미한다. 따라서 본 발명의 펩타이드는 탈모 방지 또는 개선, 발모 촉진 및 모발 성장 개선용도로 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, “탈모 방지”는 모낭 또는 두피에서 모발이 탈락되는 현상이 저지되거나 약화되는 것을 의미한다.

본 발명의 펩타이드는 모근을 생성할 수 있게 하는 피부조직의 머리카락 난포(hair follicle)에 있는 세포의 증식을 유도하여 새로운 모낭이 생성할 수 있게 한다. 더욱이 β-카테닌(beta-catenin)의 시그널을 활성화 시켜 발모 촉진 유전자를 발현시키며, 발모에 관여하는 성장인자들의 발현을 증가시킨다. 본 펩타이드는 모발이 생성되고 성장되는 시기인 생장기를 촉진시키는 역할을 하며 여러 가지 환경적인 요인으로 인해 퇴행기로 가는 모발의 주기를 생장기에 유지하도록 함으로써 탈모억제 효과를 나타내고 정상 모발에서는 모발에 영양분을 공급하여 모발 건강을 유지할 수 있도록 한다. 따라서, 본 발명의 조성물은 탈모 방지 및 개선에 매우 효과적이다.

본 발명의 조성물은 상술한 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 및 모발 성장 개선용 조성물을 제공한다.

본 발명에서 “발모 촉진”은 모발이 생성되는 것을 의미하며, 모발 생성 속도 및 생성량을 증가시키는 넓은 의미로 사용된다. 또한 모근 기능이 강화되거나, 모발의 탈락 및 생성 주기가 짧아져 모낭에서 자라는 모발의 수가 증가되는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서, “모발 성장”은 생성된 모발(머리카락)의 굵기가 증가되거나 길이 자람 속도에 영향을 미치는 것을 의미한다.

본 발명의 조성물은 화장품 조성물로 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물이 화장품 조성물로 제조될 경우, 상술한 본 발명의 펩타이드의 화장품학적 유효량(cosmetically effective amount) 및 화장품학적으로 허용되는 담체가 포함될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “화장품학적 유효량”은 상술한 본 발명의 조성물의 효능을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 화장품 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 화장품 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서의 펩타이드류와 담체 성분 이외에, 화장품 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드를 제공한다.

(b) 본 발명의 펩타이드는 모낭 세포 성장을 촉진하며, 발모 관련 성장인자 및 발모 관련 인자들의 발현을 증가시킴으로써 발모에 우수한 효과를 나타낸다.

(c) 본 발명의 펩타이드는 탈모 방지 또는 개선, 발모 촉진 및 모발 성장 개선용도로 이용될 수 있다.

(d) 상술한 본 발명의 펩타이드의 우수한 활성 및 안정성은 의약외품 및 화장품에 매우 유리하게 적용될 수 있도록 한다.

도 1은 본 발명의 합성예에 의하여 제조된 서열목록 제1서열(a), 제2서열(b) 및 제3서열(c) 펩타이드의 인간 모유두 세포(Human hair follicle dermal papilla cells, HHFDPC) 성장 촉진 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 서열목록 제1서열(a), 제2서열(b) 및 제3서열(c) 펩타이드에 의해 β-카테닌의 발현이 증가되는 것을 확인한 결과이다.
도 3a는 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드에 의한 KGF, bFGF의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 3b는 본 발명의 서열목록 제2서열의 펩타이드에 의한 VEGF의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 3c는 본 발명의 서열목록 제3서열의 펩타이드에 의한 VEGF, bFGF의 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 서열목록 제1서열(a) 및 제3서열(b)의 펩타이드에 의한 PI3K 발현 증가 및 ERK 인산화 증가를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명의 서열목록 제2서열(a) 및 제3서열(b)의 펩타이드에 의한 MSX2 발현 증가를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명의 서열목록 제1서열(a) 및 제2서열(b)의 펩타이드에 의한 TGF-β1 발현 억제를 확인한 결과이다.
도 7은 본 발명의 서열목록 제1서열(a) 및 제3서열(b)의 펩타이드에 의한 Bcl-2의 발현 증가 및 Bax의 발현 감소를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 서열목록 제1서열의 펩타이드에 의한 케라틴-14의 발현 증가를 확인한 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

합성예 1: 펩타이드의 합성

클로로 트리틸 클로라이드 레진(Chloro trityl chloride resin; CTL resin, Nova biochem Cat No. 01-64-0021) 700 mg을 반응용기에 넣고 메틸렌 클로라이드(MC) 10 ㎖를 가하여 3분간 교반하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF) 10 ㎖를 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 반응기에 10 ㎖의 디클로로메탄용액을 넣고 Fmoc-Ile-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole 및 디이소프로필 에틸아민(DIEA) 400 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹이고, 1시간 동안 교반하면서 반응시켰다. 반응 후 세척하고 메탄올과 DIEA(2:1)를 DCM(dechloromethane)에 녹여 10분간 반응시키고 과량의 DCM/DMF(1:1)로 세척하였다. 용액을 제거하고 디메틸포름 아마이드(DMF)를 10 ㎖ 넣어 3분간 교반한 후 다시 용매를 제거하였다. 탈보호 용액(20%의 피페리딘(Piperidine)/DMF) 10㎖를 반응 용기에 넣고 10분간 상온에서 교반한 후 용액을 제거하였다. 동량의 탈보호 용액을 넣고 다시 10분간 반응을 유지한 후 용액을 제거하고 각각 3분씩 DMF로 2회, MC로 1회, DMF로 1회 세척하여 Ile-CTL Resin을 제조하였다. 새로운 반응기에 10 ㎖의 DMF 용액을 넣고 Fmoc-Lys(Boc)-OH (Bachem, Swiss) 200 mmole, HoBt 200 mmole 및 Bop 200 mmole을 넣은 후 교반하여 잘 녹였다. 반응기에 400 mmole DIEA를 분획으로 2번에 걸쳐 넣은 후 모든 고체가 녹을 때까지 최소한 5분간 교반하였다. 녹인 아미노산 혼합용액을 탈보호된 레진이 있는 반응용기에 넣고 1시간 동안 상온에서 교반하면서 반응시켰다. 반응액을 제거하고 DMF 용액으로 3회 5분씩 교반한 후 제거하였다. 반응 레진을 소량 취하여 카이저 테스트(Nihydrin Test)를 이용하여 반응 정도를 점검하였다. 탈보호 용액으로 상기와 같이 동일하게 2번 탈보호 반응시켜 Lys(Boc)-Ile-CTL Resin을 제조하였다. DMF와 MC로 충분히 세척하고 다시 한 번 카이저 테스트를 수행한 다음 상기와 동일하게 아래의 아미노산 부착 실험을 수행하였다. 선정된 아미노산 서열에 의거하여 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 및 Fmoc-Arg(Pbf)-OH 순으로 연쇄반응을 시켰다. Fmoc-보호기를 탈보호 용액으로 10분씩 2번 반응시킨 후 잘 세척하여 제거하였다. 무수초산과 DIEA, HoBt를 넣어 한시간동안 아세틸화를 수행한 뒤 제조된 펩티딜 레진을 DMF, MC 및 메탄올로 각각 3번을 세척하고, 질소 공기를 천천히 흘려 건조한 후, P₂O₅ 하에서 진공으로 감압하여 완전히 건조한뒤 탈루 용액[트리플로로화 초산(Trifluroacetic acid) 95%, 증류수 2.5%, 티오아니졸(Thioanisole) 2.5%] 30 ㎖을 넣은 후 상온에서 가끔 흔들어주며 2 시간 반응을 유지하였다. 필터링을 하여 레진을 거르고, 레진을 소량의 TFA 용액으로 세척한 후 모액과 합하였다. 감압을 이용하여 전체 볼륨이 절반 정도 남도록 증류하고 50 ㎖의 차가운 에테르를 가하여 침전을 유도한 후, 원심분리하여 침전을 모으고, 2번 더 차가운 에테르로 세척하였다. 모액을 제거하고 질소 하에서 충분히 건조하여 정제 전 Arg-Arg-Lys-Ile 펩타이드 1을 0.7 g 합성하였다(수율: 90.0 %). 분자량 측정기를 이용하여 측정시 분자량 571.7 (이론값 : 571.72)를 얻을 수 있었다. 다른 서열2 및 서열3펩타이드도 위와 같은 방법으로 합성을 진행하였다.

번호	아미노산 서열	분석값(질량분석기)
번호	아미노산 서열	분석치	이론치
서열 1 (펩타이드-1)	Arg-Arg-Lys-Ile	571.7	571.72
서열 2 (펩타이드-2)	Ile-Tyr-Phe-Tyr	604	604.7
서열 3 (펩타이드-3)	Lys-Lys-Phe-Ile-Gln-Gln-Val-Tyr-Leu-Ala-Ile	1350.6	1350.65

모발 성장 촉진 효능을 나타내는 펩타이드 확보를 위해 자사의 펩타이드 라이브러리 스크리닝을 세포 증식 실험을 통해 진행하였고 3종 펩타이드를 선별하였다. 이 후 이 3종 펩타이드의 모발 성장 촉진 효능을 아래의 다양한 유전자 및 단백질 발현 변화 등을 통해 관찰하였고 이들의 우수한 효능을 확인하였다.

실시예 1: DPC 증식 어세이

인간 모유두 세포(Human hair follicle dermal papilla cells)를 2x10³ 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 3일간 배양하고 4 mg/ml MTT 용액을 100 μl씩 웰에 처리하여 4시간 반응시켰다. 생성된 포마잔을 DMSO 처리를 통해 녹여낸 후 마이크로플레이트 리더를 사용하여 560 nm에서의 흡광도를 측정하였다.

그 결과, 서열목록 제1서열, 제2서열 또는 제3서열 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포의 성장이 농도 의존적으로 촉진되는 것을 확인하였다(도 1a-c).

실시예 2: β-카테닌 활성화 테스트

인간 모유두 세포를 4x10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 15, 30분 배양하고 세포를 회수하여 핵과 세포질 단백질을 각각 분리하였다. β-카테닌 항체(santacruz biotechnology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하여 핵에서의 β-카테닌 발현 양상을 비교하였다.

그 결과, 인간 모유두 세포에서 모발 성장 관련 인자인 β-카테닌의 활성 증가에 따른 핵 이동(nuclear translocation)이 서열목록 제1서열, 제2서열 또는 제3서열 펩타이드 처리에 의해 촉진되는 것이 관찰되었다 (도 2a-c).

실시예 3: KGF, bFGF, VEGF RT-PCR

인간 모유두 세포를 4x10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. RNA 정량 후 cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 PCR 프리믹스(Intron, Korea) 및 KGF, bFGF, VEGF 각각의 프라이머를 이용하여 PCR 진행 후 5% 아가로스 겔에 전기영동하여 각 샘플 처리 조건에서 상기 성장인자들의 mRNA 발현 정도를 비교하였다.

프라이머	서열(5’-3’)
KGF 정방향	TCTGTCGAACACAGTGGTACCT
KGF 역방향	GTGTGTCCATTTAGCTGATGCAT
bFGF 정방향	TGCTGGTGATGGGAGTTGTA
bFGF 역방향	CCTCCAAGTAGCAGCCAAAG
VEGF 정방향	CCATGAACTTTCTGCTGTCTT
VEGF 역방향	TCGATCGTTCTGTATCAGTCT

실험결과, 서열목록 제1서열 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포에서 모발 성장과 관련된 성장인자인 KGF, bFGF의 mRNA 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 3a).

또한, 서열목록 제2서열 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포에서 모발 성장에 영향을 주는 인자인 VEGF의 mRNA 발현이 증가되고(도 3b), 서열목록 제3서열 펩타이드 처리에 의해 VEGF, bFGF의 mRNA 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 3c).

실시예 4 : PI3K & p-ERK WB

인간 모유두 세포를 4x10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 15, 30분 배양하고 세포를 회수하여 세포 용해물을 준비하였다. PI3K 항체(santacruz biotechnology, USA) 및 phospho-ERK 항체(Cell Signaling Technology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯팅을 수행하여 단백질 발현 양상을 비교하였다.

그 결과, 서열목록 제1서열 또는 제3서열의 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포에서 발모 시그널링 분자(hair growth signaling molecule)인 PI3K 발현 증가 및 ERK 인산화 증가가 관찰되었다(도 4a-b).

실시예 5: MSX2 RT-PCR

인간 모유두 세포를 4x10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. RNA 정량 후 cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 PCR 프리믹스(Intron, Korea) 및 MSX2 프라이머를 이용하여 PCR 진행 후 5% 아가로스 겔에 전기영동하여 각 샘플 처리 조건에서 mRNA 발현 정도를 비교하였다.

프라이머	서열(5’-3’)
MSX2 정방향	AACACAAGACCAACCGGAAG
MSX2 역방향	GCAGCCATTTTCAGCTTTTC

그 결과, 서열목록 제2서열 또는 제3서열의 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포에서 모발 성장 관련 인자인 MSX2의 mRNA 발현이 촉진되는 것을 확인하였다(도 5a-b).

실시예 6: TGF-β1 RT-PCR

인간 모유두 세포를 4x10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. RNA 정량 후 cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 PCR 프리믹스(Intron, Korea) 및 TGF-β1 프라이머를 이용하여 PCR 진행 후 5% 아가로스 겔에 전기영동하여 각 샘플 처리 조건에서 mRNA 발현 정도를 비교하였다.

프라이머	서열(5’-3’)
TGF-β1 정방향	GCCCTGGATACCAACTATTGC
TGF-β1 역방향	TCAGCACTTGCAGGAGTAGCG

그 결과, 서열목록 제1서열 또는 제2서열의 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포에서 모발 성장 지연과 관련된 TGF-β1의 mRNA 발현이 억제되는 것을 확인하였다(도 6a-b).

실시예 7: Bcl-2/Bax WB

인간 모유두 세포를 4x10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 24시간 배양하고 세포를 회수하여 세포 용해물을 준비하였다. Bcl-2 및 Bax 항체(santacruz biotechnology, USA)를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하여 단백질 발현 양상을 비교하였다.

그 결과, 서열목록 제1서열 또는 제3서열의 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포에서 세포 사멸 억제 단백질인 Bcl-2의 발현 증가 및 세포 사멸 관련 단백질인 Bax의 발현 감소가 확인되었다(도 7a-b).

실시예 8: 케라틴-14 RT-PCR

인간 모유두 세포를 5x10⁵ 세포/웰의 밀도로 6-웰 플레이트에 시딩한 후 밤새 배양하였다. 무혈청 배지로 바꿔준 후 펩타이드를 처리하여 24시간 동안 배양하고 세포를 회수하여 RNA를 분리하였다. RNA 정량 후 cDNA 합성 키트(Intron, Korea)를 이용하여 cDNA를 합성하고 PCR 프리믹스(Intron, Korea) 및 케라틴-14 프라이머를 이용하여 PCR 진행 후 5% 아가로스 겔에 전기영동하여 각 샘플 처리 조건에서 mRNA 발현 정도를 비교하였다.

프라이머	서열(5’-3’)
케라틴-14 정방향	CCACCTTTCATCTTCCCAATTCTC
케라틴-14 역방향	GTGCGGATCTGGCGGTTG

그 결과, 서열목록 제1서열의 펩타이드 처리에 의해 인간 모유두 세포에서 모발 성장 관련 인자인 케라틴-14의 mRNA 발현이 증가되는 것을 확인하였다(도 8).

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> CAREGEN CO., LTD. <120> Peptides having Hair Growth Activity and Uses Thereof <130> PN160021 <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 1 <400> 1 Arg Arg Lys Ile 1 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 2 <400> 2 Ile Tyr Phe Tyr 1 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide 3 <400> 3 Lys Lys Phe Ile Gln Gln Val Tyr Leu Ala Ile 1 5 10 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> KGF Forward Primer <400> 4 tctgtcgaac acagtggtac ct 22 <210> 5 <211> 23 <212> DNA <213> KGF Reverse Primer <400> 5 gtgtgtccat ttagctgatg cat 23 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> bFGF Forward Primer <400> 6 tgctggtgat gggagttgta 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> bFGF Reverse Primer <400> 7 cctccaagta gcagccaaag 20 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> VEGF Forward Primer <400> 8 ccatgaactt tctgctgtct t 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> VEGF Reverse Primer <400> 9 tcgatcgttc tgtatcagtc t 21 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> MSX2 Forward Primer <400> 10 aacacaagac caaccggaag 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> MSX2 Reverse Primer <400> 11 gcagccattt tcagcttttc 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> TGF-beta1 Forward Primer <400> 12 gccctggata ccaactattg c 21 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> TGF-beta1 Reverse Primer <400> 13 tcagcacttg caggagtagc g 21 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Keratin-14 Forward Primer <400> 14 ccacctttca tcttcccaat tctc 24 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Keratin-14 Reverse Primer <400> 15 gtgcggatct ggcggttg 18

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 발모 촉진 활성을 나타내는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 모낭 세포 성장을 촉진하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 β-카테닌의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 KGF(Keratinocyte Growth Factor), bFGF(Basic fibroblast growth factor) 및 VEGF(Vascular endothelial growth factor)로 이루어진 군으로부터 선택되는 발모 관련 성장인자의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 케라틴-14의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 PI3K(Phosphoinositide 3-kinase)의 발현 및 ERK(Extracellular Signal-regulated Kinase) 인산화를 증가시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 TGF-β1(transforming growth factor beta 1)의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드는 Bcl-2(B-cell lymphoma 2)의 발현을 증가시키고 Bax(BCL2-associated X protein)의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 탈모 방지 또는 개선용 조성물.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 발모 촉진 및 모발 성장 개선용 조성물.