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KR101835860B1 - 난소암 또는 경계성 난소종양의 예방 또는 치료용 조성물 및 진단용 마커 조성물 - Google Patents

난소암 또는 경계성 난소종양의 예방 또는 치료용 조성물 및 진단용 마커 조성물 Download PDF

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KR101835860B1
KR101835860B1 KR1020150152290A KR20150152290A KR101835860B1 KR 101835860 B1 KR101835860 B1 KR 101835860B1 KR 1020150152290 A KR1020150152290 A KR 1020150152290A KR 20150152290 A KR20150152290 A KR 20150152290A KR 101835860 B1 KR101835860 B1 KR 101835860B1
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ovarian cancer
sphingomyelinase
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ovarian
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김준모
황지영
황선용
김미진
염승래
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순천향대학교 산학협력단
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Abstract

오메가-3 지방산을 함유하는 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 활성화제를 유효성분으로 포함하는, 난소암 또는 경계성 난소종양의 예방 또는 치료용 조성물, 생물학적 시료 내의 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 활성화 정도를 검출하는 제제를 함유하여 난소암 또는 경계성 난소종양의 진단을 위한 정보를 제공하는 마커 조성물 등을 제공한다.

Description

난소암 또는 경계성 난소종양의 예방 또는 치료용 조성물 및 진단용 마커 조성물{ANTICANCER COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OVARIAN CANCER AND BIOMARKER COMPOSITION FOR DIAGNOSING OF THE SAME}
본 발명은 난소암과 경계성 난소 종양을 치료하기 위한 항암 조성물, 난소암과 경계성 난소 종양의 조기 진단 및 예후 예측을 위한 바이오마커 조성물, 그리고 난소암과 경계성 난소 종양의 치료제 스크리닝을 위한 방법에 대한 것이다.
난소암은 여성에 있어서 생식기 암 중 가장 나쁜 예후를 보이고 있는 질환으로서 대부분 상피성 암종이다. 난소암의 발생률은 1.2 % 정도이지만, 진단 당시에 60 에서 70 % 의 환자에서 병기 III 또는 IV의 진행성 질환을 보이고, 5 년 생존률이 전체의 50 % 미만이다(Siegel R, Ward E, Brawley O, Jemal A. Cancer statistics, 2011). 또한, 전 세계 여성 암 중에 여섯 번째로 흔하고 가장 사망률이 높다(Gui & Shen, 2012;Romero & Bast, 2012).
난소암의 원인으로는 BRCA1과 BRCA1 유전자 변이가 대표적이며 그 외에 불임, 고령, 가족력, 유방암, 자궁내막암, 미산부, 비만 등의 위험 인자만이 알려져 있을 뿐 대부분 원인을 알 수 없다. 복강 내 전이가 가장 흔하며, 그 외에 혈관이나 림프관 전이도 일어난다(Lancaster, Carney, & Futreal, 1997).
경계성 난소 종양은 세포는 악성의 형태를 띠나 기질 침윤이 없고 예후가 좋은 종양으로 아직까지도 분류되나 이 역시 치료 면에서 명확하게 정립이 되지 않은 질환이다. 초기 증상으로는 무증상이 대부분이며 그 외에 복수 등에 의한 복부 팽만감 등이 있을 수 있으나, 대부분 환자들은 병이 상당히 진행된 상태에서 내원한다. 조기 발견을 위한 검진으로서 혈액 CA-125 검사나 질 초음파 등이 있으나 큰 효과가 없고 예방도 경구 피임약 외에는 알려진 것이 없다(Buys et al., 2011).
현재까지 고전적인 치료 방법은 종양의 잔류 병변을 최소화시키는 개복술 (staging laparotomy)과 종양 용적 축소술(tumor debulking)을 시행한 이후에 플래티늄-탁산 기반 항암화학요법을 시행하는 것이다. 하지만, 이러한 적극적인 치료에도 불구하고 약 70-80%의 난소암 환자는 첫 번째 항암 치료 후에 재발한다. 결국, 난소암은 심한 부작용과 높은 재발률을 보이는 난치성 질환이다.
최근 난소암에 대한 기초연구가 활발해지면서 종양의 발생과 성장에 관한 분자기전이 밝혀지고 있고, 유전적인 변화가 세포의 성장, 분화 등을 관장하는 신호전달체계 상의 변화를 유발하여 종양의 진행을 유발한다는 사실이 밝혀졌다.
따라서, 예후 예측에 관련이 있는 생물학적 표지자의 개발과 관련하여 분자표적치료(molecular targeted therapy)가 새로운 치료법으로서 기능할 수 있다 (Smolle et al., 2013). 특히, 난소암은 여러 다른 종류로 이루어진 (heterogeneous) 질병이고 분자학적 특성을 기반으로 섬세한 접근이 이상적인 치료방법의 중요 핵심이 될 수 있을 것이고, 이러한 치료법, 치료제에 대한 요구가 끊이지 않고 있다.
본 발명의 목적은 난소암과 경계성 난소 종양을 치료하기 위한 항암 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 다른 목적은 난소암과 경계성 난소 종양의 조기 진단 및 예후 예측을 위한 바이오마커 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 난소암과 경계성 난소 종양의 치료제 스크리닝을 위한 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 난소암 또는 경계성 난소종양의 예방 또는 치료용 조성물은 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 단백질 발현 증가제를 유효성분으로 포함한다.
상기 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 단백질 발현 증가제는 오메가-3 지방산을 함유하는 것일 수 있다.
상기 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 단백질 발현 증가제는 DHA(docosa hexaenoic acid)를 함유하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 난소암 또는 경계성 난소종양 진단용 마커 조성물은, 생물학적 시료 내의 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 활성화 정도를 검출하는 제제를 함유하여 난소암 또는 경계성 난소종양의 진단을 위한 정보를 제공한다.
상기 진단용 마커 조성물은, 생물학적 시료 내의 중성 스핑고미엘리나아제 발현이 감소하였다는 점을 확인할 수 있는 제제를 함유하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따른 난소암 또는 경계성 난소 종양의 치료제를 스크리닝하는 방법은, 난소암 또는 경계성 난소 종양 세포를 배양하는 단계(1); 상기 세포에 약물을 처리하는 단계(2); 그리고 상기 약물이 처리된 세포 내의 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 활성화 정도를 약물이 처리되지 않은 세포 내의 중성 스핑고미엘리나아제 활성화 정도와 비교하는 단계(3);을 포함하여, 난소암 또는 경계성 난소 종양의 치료 활성을 갖는 물질을 스크리닝할 수 있다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어 "치료”는 본 발명의 조성물의 투여로 암이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, 임상적 결과를 포함하는 유용한 결과 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 시도를 의미한다. 유용한 또는 바람직한 임상적 결과는 검출 가능하거나 가능하지 않더라도, 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선, 질병 범위의 축소, 질병 상태의 안정화, 질병 발생의 억제, 질병 확산의 억제, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 발병의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 감퇴 (부분 또는 전체)를 포함할 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 "약학적으로 허용되는 염"이라는 용어는, 모계 화합물 (parent compounds)의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고, 1회 용량 (dosage)이 투여될 때, 생물학적으로 또는 다른 방향으로 해롭지 않은 염들을 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 난소암 또는 경계성 난소종양의 발명 여부를 확인하는 것이다.
본 발명에서 용어, "진단용 (바이오)마커, 진단하기 위한 (바이오)마커 또는 진단 마커"는 난소암 또는 경계성 난소종양을 정상 난소 세포 또는 비종양성 난소 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 난소암 또는 경계성 난소종양을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등의 수준을 정상 세포와 구분할 수 있거나 그 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함한다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"는 난소암 또는 경계성 난소종양에 의해 난소암 또는 경계성 난소종양의 마커 단백질 발현 수준에 차이가 나타나는 조직, 세포, 타액, 혈액, 생리혈과 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 난소암 또는 경계성 난소종양(이하, 난소암으로 약칭한다.)의 예방 또는 치료용 조성물은 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 발현 증가제를 유효성분으로 포함한다.
스핑고미엘리나아제(Sphingomyelinase)는 스핑고마이엘린(sphingomyelin, SM)이 세라미드(ceramide)가 되게 하는 가수분해를 촉매 하는 단백질이다. 세라미드는 세포 스트레스 시에 생산되고 세포 자멸사와 관련된다는 사실이 알려져 있다(Haimovitz-Friedman A, 1997).
스핑고미엘리나아제(Sphingomyelinase)로는 산성 스핑고미엘리나아제와 중성 스핑고미엘리나아제가 있는데, 산성 스핑고미엘리나아제는 세포 당단백질로 리소좀 스핑고마이엘린(lysosomal sphingomyelin) 회전률에 기여하는 것으로 알려져 있고, 중성 스핑고미엘리나아제는 최적 pH가 7.4로 세포막(plasma membrane)에 존재하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 발명자들은, 난소암 세포의 치료와 진단에 활용할 수 있는 바이오 마커 단백질에 대해 연구하던 중, 스핑고미엘리나아제(Sphingomyelinase)의 일종인 중성 스핑고미엘리라아제가 난소암 세포에서 특이적으로 그 발현 정도가 낮고, 이를 활성화시키는 제제를 적용하면 난소암 세포의 사멸을 유도할 수 있다는 점을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
중성 스핑고미엘리나아제 단백질 발현 증가제는 오메가-3 지방산을 함유할 수 있다. 오메가-3 지방산은 탄소 사슬의 끝에서 세 번째 탄소에서부터 이중 결합(C=C)이 시작되는 필수 불포화 지방산이다. 인체 내에서 합성되지 않지만 대사활동에 필수적인 분자로, 오메가 3 지방산의 구체적인 예시로는 DHA(cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid, DHA), EPA(cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid, EPA) 등이 있다. 오메가 3 지방산 이외에 추가적으로 Vitamin D(1,25-dihydroxyvitamin D3 [1,25(OH)2D3), 메트포민(metformin) 등도 중성 스핑고미엘리나아제 단백질 발현 증가 활성을 가질 수 있다.
상기 난소암은 상피성 난소암, 또는 전이성 난소암일 수 있고, 좋게는 상피성 난소암일 수 있다.
본 발명의 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물에서 유효성분의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물에서 유효성분인 중성 스핑고미엘리나아제 발현 증가제의 용량은, 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율등 다양한 요인들을 고려하여 결정될 수 있으며, 상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.
본 발명의 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 질환의 정도나 암세포의 기원에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 비경구 투여 시에는 상기 약학 조성물은 중성 스핑고미엘리나아제 발현 증가제 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여할 수 있고, 경구 투여 시에는 상기 약학 조성물은 중성 스핑고미엘리나아제 발현 증가제 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 50 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 상기 중성 스핑고미엘리나아제 발현 증가제를 0.01 내지 100 mg/체중 kg 용량으로 포함하여 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 이러한 범위에서 상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 난소암의 세포자살을 효과적으로 유도하여 난소암 치료 및 예방에 유효하게 적용될 수 있다. 상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 상기 중성 스핑고미엘리나아제 발현 증가제를 0.05 내지 50 mg/체중 kg 용량으로 포함하여 상피세포 난소암에 적용할 수 있다.
또한, 상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물의 유효성분을 과다증식성 난소암 세포에 노출하는 경우, 상기 유효성분이 항증식제 및 분화 유발제로서 작용하도록 하는 투여량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 환자의 체중 kg당 중성 스핑고미엘리나아제 발현 증가제의 일일 유효투여량의 범위는 약 0.01 μg/㎏/day 내지 약 2.0 μg/㎏/day, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 1.0 μg/kg/day일 수 있다. 또한, 이러한 조성물을 2 내지 6 일에 1회 또는 1 주일에 1회, 일일 투여량 또는 에피소딕(episodic) 투여량으로 제공될 수 있는데, 각 일일 투여량은 한번에 투여되거나, 모두 투여될 때까지, 예를 들면 1 시간 간격으로 2 내지 4회로 나누어 투여될 수 있다.
상기 중성 스핑고미엘리나아제 발현 증가제는, 난소암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 역할을 하여 난소암 치료 또는 예방의 효과를 가질 수 있다.
상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물의 유효 성분의 바람직한 함량은, 사용된 유효 성분의 효능, 제형화된 특정 조성물, 적용 방식 및 특정 계(situ) 및 치료되는 생체에 따라 변화될 수 있다. 예를 들면, 환자에 대한 특정 투여량은, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 식이요법, 투여 시기와 투여 방식, 배설 속도, 및 배합되어 사용되는 약물 및 치료법이 적용되는 특정 장애의 심각성에 따라 변경되어 적용될 수 있다.
상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은, 인간을 포함한 포유 동물 투여용 약용 제제를 제조하기 위한 통상의 약제법에 따라, 예를 들어 활성 화합물인 중성 스핑고미엘리나아제 발현 증가제와 유해하게 반응하지 않으면서 소화관(예를 들면, 경구), 비경구 또는 국소 적용에 적합한, 약제학적으로 허용되는 담체를 더 함유할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 적합한 담체로는, 물, 염 용액, 알콜, 아라비아 고무, 식물성 오일(예를 들면, 아몬드 오일, 옥수수 오일, 면화씨 오일, 땅콩 오일, 올리브 오일, 코코넛 오일), 광유, 생선 간 오일, 폴리소르베이트 80과 같은 유성에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물(예를 들면, 락토오스, 아밀로오스 또는 전분), 마그네슘 스테아르산염, 활석, 규산, 점성 파라핀, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세리드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 하이드록시 메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
약제학적 제제는 멸균될 수 있고, 경우에 따라, 보조제, 예를 들면, 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 향료와 혼합될 수 있다.
비경구 투여용으로, 주사 가능한 무균 용액, 바람직하게는 유성 또는 수성 용액, 및 현탁액, 유화액 또는 좌약을 포함하는 형태가 특히 적합하다. 비경구 투여는 좋기로는, 피하 주사, 근내 주사 또는 정맥내 주사, 비인두 흡수 또는 점막 흡수, 또는 경피 흡수를 포함한다.
소화관 투여용으로는, 정제, 당의정, 액체, 점적제, 좌약, 로젠지 (lozenge), 분말 또는 캡슐이 특히 적합하다. 가당 비히클 (sweetened vehicle)을 목적으로 하는 경우, 시럽, 엘릭서 (elixir) 등이 사용될 수 있다.
상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물의 투여방식으로, 경구 투여가 바람직할 수 있다.
상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 1 이상의 세포독성 제제 또는 항암 제제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 제제로는, 대사길항물질(예를 들면, 5-플루오로-우라실, 메토트렉세이트, 플루다라빈), 항미세소관제(예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 및 파크리탁셀, 도세탁셀과 같은 탁산계), 알킬화제(예를 들면, 사이클로파스파미드, 멜팔란, 바이오코로에틸니트로스우레아, 하이드록시우레아), 백금제(예를 들면, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, JM-216, CI-973), 안트라사이클린(예를 들면, 독스루비신, 다우노루비신), 항생제(예를 들면, 미토마이신, 이다루비신, 아드리아마이신, 다우노마이신), 국소이성화효소 억제제(예를 들면, 에토포시드, 캄프토테신) 또는 기타 항신생물제(예를 들면, 에스트라무스틴 포스페이드, 프레드니무스틴)를 들 수 있다. 이렇게, 추가적인 세포 독성 제제 또는 항암 제제를 더 함유하는 경우, 본 발명의 조성물은 암성 세포에 대하여 상당히 증가된 세포독성 효과를 유발할 수 있으며, 따라서 증가된 치료 효과를 제공할 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 난소암 또는 경계성 난소종양 진단용 마커 조성물은 생물학적 시료 내의 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 활성화 정도를 검출하는 제제를 함유하여 난소암 또는 경계성 난소종양(이하, 난소암으로 약칭한다)의 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다.
상기 중성 스핑고미엘리나아제 활성화 정도를 검출하는 제제는 중성 스핑고미엘리나아제 단백 발현이 감소하였는지를 확인할 수 있는 제제로, 난소암 세포는 비난소암 세포에서와 달리 상기 단백 발현이 감소하는데, 이를 확인하여 난소암의 진단 또는 난소암 치료 경과의 예측을 위한 정보를 제공할 수 있다.
상기 단백질 (발현)수준의 측정은 난소암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 마커 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는, 상기 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다.
이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, 엘라이자(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역분석(Immunoassay), 면역화학염색분석(Immunohistochemistry Assay), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.
상기 항체란, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미하고, 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
상기한 바와 같이 마커 단백질이 규명되었으므로, 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기한 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
상기 바이오 마커 조성물은, 생물학적 시료에서 중성 스핑고미엘리나아제 단백의 활성화 수준을 검출하는 것일 수 있고, 상기 생물학적 시료는 예를 들어 난소 조직, 타액, 혈액, 생리혈 등과 같은 시료가 활용될 수 있다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따른 난소암 또는 경계성 난소종양(이하, 난소암이라 약칭한다)의 진단용 키트는 위에서 설명한 난소암 또는 경계성 난소종양의 진단용 마커 조성물을 포함한다.
상기 난소암 진단용 키트는 의심 환자의 생물학적 시료의 분석을 통해서 난소암의 진단 또는 치료경과 예측을 도와주는 키트로, 간단한 방식으로 편리하게 난소암 진단과 치료경과 예측을 위한 자료를 제공할 수 있다.
상기 진단용 키트는 면역분석(immunoassay)키트일 수 있다. 구체적으로, 상기 진단용 키트는 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 활성화 정도를 검출하는 제제를 포함하여, 난소암 의심환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질의 발현 수준을 확인할 수 있고, 이를 진단을 위한 자료로 활용할 수 있다.
본 발명이 또 다른 일 실시예에 따른 위 난소암 또는 경계성 난소 종양의 치료제를 스크리닝하는 방법은, 난소암 또는 경계성 난소 종양 세포를 배양하는 단계(1); 상기 세포에 약물을 처리하는 단계(2); 그리고 상기 약물이 처리된 세포 내의 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 활성화 정도를 약물이 처리되지 않은 세포 내의 중성 스핑고미엘리나아제 활성화 정도와 비교하는 단계(3);을 포함하여, 난소암 또는 경계성 난소 종양의 치료제로써 활성을 갖는 물질을 스크리닝할 수 있다.
본 발명은, 난소 종양 형성 과정에 영향을 미쳐 난소암(경계성 나노종양 포함, 이하 동일함)에 특이적으로 반응할 수 있는 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase)의 활성화제 또는 이의 활성화 정도를 검출하는 제제를 포함하여 난소암의 진단, 난소암 형성 예방과 치료에 유의하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 MTT 분석을 통한, 난소암 세포주(SK-OV-3)의 세포 증식에 대한 DHA 처리 효과를 보여주는 결과이다.
도 2은 본 발명의 실시예 1에서 MTT 분석을 통한, 난소암 세포주(OVCAR-3)의 세포 증식에 대한 DHA 처리 효과를 보여주는 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 2에서 SK-OV-3 세포주에 DHA 처리시 N-Sphingomyelinase activity의 발현 양상을 Sphingomyelinase kit를 이용해 조사한 결과이다.
도 4은 본 발명의 실시예 2에서 OVCAR-3 세포주에 DHA 처리시 N-Sphingomyelinase activity의 발현 양상을 Sphingomyelinase kit를 이용해 조사한 결과이다.
이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.
<세포주 및 세포 배양>
인간의 암 세포주 SK-OV-3(ATCC ® 카탈로그 번호 HTB-77 난소, 복수)와 OVCAR-3(ATCC ® 카탈로그 번호 HTB-161 난소, 상피).
37℃, 5% CO2의 습윤 분위기 하에서, OVCAR-3 세포를 20% 페탈 보바인 세럼(533-6955, Hyclone), 페니실린(100 mg/l, Invitrogen)이 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다. 37℃, 5% CO2의 습윤 분위기 하에서, SK-OV-3 세포를 10% 페탈 보바인 세럼(533-6955, Hyclone)으로 보충 된 RPMI 1640에서 배양하였다.
< 실시예 1. 세포 증식 시험>
3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 이용하여 세포 증식에 대한 DHA 처리 효과를 시험하였다.
OVCAR-3 세포와 SK-OV-3 세포를 96-웰 플레이트에서 각각 24 시간 동안 1.4x 10４세포/웰 또는 7 x 103 세포/웰의 농도로 도말하여 배양하였다. 그 후, 세포들을 에탄올에 용해시킨 다양한 양(5μM, 15μM, 35μM)의 1α,25(OH)2 DHA(cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid ;D2534, Sigma, Saint Louis, MO, USA))로 24 시간 동안 처리하였다.
생존세포 밀도를 MTT 염료의 대사성 전환에 의하여 측정하였다. MTT(5 mg/ml)을 40 μL/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 첨가하고, 추가 배양하였다. MTT 반응을 DMSO 100 μL를 첨가하여 종결시켰다. 이어서, MTT 분석 결과를 595 nm에서 흡광도 측정함으로써 판독하였다.
이렇게 평가된 SK-OV-3 및 OVCAR-3 난소암 세포에서 세포 생존에 대한 DHA 의 효과를 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다.
도 1 및 도 2의 결과(MTT 분석)에 따르면, DHA 는 용량 의존적으로 SK-OV-3 및 OVCAR-3 세포의 사멸을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 24 시간 처리 후 5μM의 DHA 로 처리된 SK-OV-3 세포의 생존율은, 비히클 대조군 세포의 생존과 비교하여 83%로 나타났다. 35μM 을 처리한 경우 24시간 이후 약 50% 정도만 생존하였다(도 1 참고). 또한, 5μM의 DHA 로 처리 OVCAR-3 세포의 생존율은 비히클 대조군 생존과 비교하여 89% 정도였고, 35μM 처리시 약 30%였다(도 2 참고).
위의 데이터는 비히클 대조군에 대한 % 및 평균 ± 표준 편차로 나타내었다.
이들 결과는 DHA 투여량에 의존적으로 투여량이 증가함에 따라 난소암 세포의 생존율이 감소함을 보여주며, OVCAR-3 세포주에서 세포의 생존율이 SK-OV-3 세포주에서 세포의 생존율보다 더 많이 감소하여 DHA 투여에 의한 난소암 세포의 생존율 감소 효과는 상피성 난소암이 더 효과적인 것으로 나타났다.
< 실시예 2. 스핑고마이엘린 활성화 키트실험 >
스핑고마이엘린 용액(sphingomyelin working solution) 분석을 이용하여 난소암 세포 증식에 대한 DHA 처리 효과를 시험하였다.
OVCAR-3 세포와 SK-OV-3 세포를 96-웰 플레이트에서 각각 24 시간 동안 1.4x 10４세포/웰 또는 7 x 103 세포/웰의 농도로 도말하여 배양하였다. 그 후, 세포들을 에탄올에 용해시킨 다양한 양(5μM, 15μM, 35μM)의 1α,25(OH)2 DHA(cis-4,7,10,13,16,19-Docosahexaenoic acid ;D2534, Sigma, Saint Louis, MO, USA))로 24 시간 동안 처리하였다. 24시간 배양 후 준비해 둔 스핑고마이엘린 용액(sphingomyelin working solution, 50 μl)을 처리 후 스핑고마이엘리나아제 표준 용액(SMase standards) 및/또는 스핑고마이엘리나아제 테스트 샘플(SMase test samples) 50 μl를 첨가 후 37°C 인큐베이팅하고 스핑고마이엘린 분석 용액(sphingomyelinase assay mixture, 50 μl)을 넣고 상온에서 1시간 반응 후 655nm에서 흡광도 측정함으로써 판독하였다.
SK-OV-3 및 OVCAR-3 난소암 세포에서 스핑고마이엘리나아제(ssphingomyelinase) 활성화에 대한 DHA 의 효과를 각각 도 3 및 도 4에 나타내었다
도 3 및 도 4의 스핑고마이엘리나아제 키트(Sphingomyelinase kit) 활성화 분석에 따르면 SK-OV-3 및 OVCAR-3 에서 활성도가 비히클 대조군 보다 증가하는걸 볼수 있었으며 SK-OV-3 에서 OVCAR-3 보다 활성화가 더 높게 나온 것을 확인 할 수 있었다.
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이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.
위의 실험은 (주)동아에스티 (영문명 : DONG-A ST) 의 지원을 받아 진행되었습니다.

Claims (3)

  1. 삭제
  2. 난소암 또는 경계성 난소 종양 세포를 배양하는 단계(1);
    상기 세포에 약물을 처리하는 단계(2); 및
    상기 약물이 처리된 세포 내의 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 활성화 정도를 약물이 처리되지 않은 세포 내의 중성 스핑고미엘리나아제 활성화 정도와 비교하는 단계(3)를 포함하는, 난소암 또는 경계성 난소 종양의 치료제를 스크리닝하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 약물이 처리된 세포 내의 중성 스핑고미엘리나아제(N-Sphingomyelinase, N-SMYase) 활성화 정도가 약물이 처리되지 않은 세포 내의 중성 스핑고미엘리나아제 활성화 정도보다 증가하면, 상기 약물을 난소암 또는 경계성 난소 종양 체료제로 선택하는, 난소암 또는 경계성 난소 종양의 치료제를 스크리닝하는 방법.
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