KR20170003159A - 난소암 치료 또는 예방용 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비타민 D를 유효 성분으로 함유하는, 난소암 치료 또는 예방용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 난소암 세포 내의 VDUP1(Vitamin D up-regulated protein 1) 단백질 발현 증가제를 유효성분으로 함유해 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.

Description

난소암 치료 또는 예방용 약학 조성물{ANTICANCER COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING OVERIAN CANCER}

본 발명은 비타민 D를 유효 성분으로 함유하는 난소암 치료 또는 예방용 약학조성물에 대한 것이다. 또한, 본 발명은 난소암 세포 내의 VDUP1(Vitamin D up-regulated protein 1) 단백질 발현 증가제를 유효성분으로 함유하여 난소암 예방 또는 치료용으로 적용가능한 약학조성물에 관한 것이다.

난소암은 대부분 상피성 암종으로서 진단 당시에 75%의 환자에서 병기 III 또는 IV의 진행성 병변을 보이고, 전체의 85%의 환자가 사망한다는 보고가 있다 (Modugno et al., 2012; Siegel, Ward, Brawley, & Jemal, 2011). 또한 전 세계 여성 암 중에 여섯 번째로 흔하고 가장 사망률이 높다 (Gui & Shen, 2012; Romero & Bast, 2012). 난소암의 원인으로는 BRCA1과 BRCA1 유전자 변이가 대표적이며 그 외에 불임, 고령, 가족력, 유방암, 자궁내막암, 미산부, 비만 등의 위험 인자만이 알려져 있을 뿐 대부분 원인을 알 수 없다. 복강 내 전이가 가장 흔하며, 그 외에 혈관이나 림프관 전이도 일어난다 (Lancaster, Carney, & Futreal, 1997).

경계성 난소 종양은 세포는 악성의 형태를 띠나 기질 침윤이 없고 예후가 좋은 종양으로 아직까지도 분류되나 이 역시 치료면에서 명확하게 정립이 되지 않은 질환이다. 초기 증상으로는 무증상이 대부분이며 그 외에 복수 등에 의한 복부 팽만감 등이 있을 수 있으나 대부분 환자들은 병이 상당히 진행된 상태에서 내원한다. 조기 발견을 위한 검진으로서 혈액 CA-125 검사나 질 초음파 등이 있으나 큰 효과가 없고 예방도 경구 피임약 외에는 알려진 것이 없다 (Buys et al., 2011).

현재까지 고전적인 치료 방법은 종양의 잔류 병변을 최소화시키는 개복술 (staging laparotomy)과 종양 용적 축소술(tumor debulking)을 시행한 이후에 플래티늄-탁산 기반 항암화학요법을 시행하는 것이다. 하지만 이러한 적극적인 치료에도 불구하고 약 70-80%의 난소암 환자는 첫번째 항암 치료 후에 재발한다. 결국 난소암은 심한 부작용과 높은 재발률을 보이는 난치성 질환이다.

최근 난소암에 대한 기초연구가 활발해지면서 종양의 발생과 성장에 관한 분자기전이 밝혀지고 있고, 유전적인 변화가 세포의 성장, 분화 등을 관장하는 신호 전달체계 상의 변화를 유발하여 종양의 진행을 유발한다는 사실이 밝혀졌다. 따라서 예후 예측에 관련이 있는 생물학적 표지자의 개발과 관련하여 분자표적치료 (molecular targeted therapy)가 새로운 치료법으로서 기능할 수 있다 (Smolle et al., 2013). 특히, 난소암은 여러 다른 종류로 이루어진 (heterogeneous) 질병이고 분자학적 특성을 기반으로 섬세한 접근이 이상적인 치료방법의 중요 핵심이 될 수 있을 것이고, 이러한 치료법, 치료제에 대한 요구가 끊이지 않고 있다.

본 발명의 목적은 악성 종양, 특히 난소암을 치료하기 위한 항암 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시예에 따른 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은, 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유한다.

상기 비타민 D는 1,25-다이하이드록시비타민 D₃(1,25-dihydroxyvitamin D3, 1α,25(OH)₂-비타민 D₃)일 수 있다.

상기 난소암은 상피성 난소암일 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 난소암 세포 내의 VDUP1(Vitamin D up-regulated protein 1) 단백질 발현 증가시키는 VDUP1증가제를 유효성분으로 함유한다.

상기 VDUP1 단백질 발현 증가제는, 생체내(in vivo) 또는 생체외(in vitro)에서 p27^kip1(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B)의 발현을 증가시키고, Jab1(Jun activation domain-binding protein 1)의 발현을 감소시키며, 난소암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 것일 수 있다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "예방"은 본 발명의 조성물의 투여로 암을 억제시키거나 진행을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.

본 발명에서 사용되는 용어 "치료”는 본 발명의 조성물의 투여로 암이 호전 또는 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하며, 임상적 결과를 포함하는 유용한 결과 또는 바람직한 결과를 얻기 위한 시도를 의미한다. 유용한 또는 바람직한 임상적 결과는 검출 가능하거나 가능하지 않더라도, 하나 이상의 증상 또는 상태의 완화 또는 개선, 질병 범위의 축소, 질병 상태의 안정화, 질병 발생의 억제, 질병 확산의 억제, 질병 진행의 지연 또는 늦춤, 질병 발병의 지연 또는 늦춤, 질병 상태의 개선 또는 경감, 및 감퇴 (부분 또는 전체)를 포함할 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 "약학적으로 허용되는 염" 이라는 용어는, 모계 화합물 (parent compounds)의 생물학적 유효성 및 특성을 보유하고, 1회 용량 (dosage)이 투여될 때, 생물학적으로 또는 다른 방향으로 해롭지 않은 염들을 의미할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은, 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유한다.

비타민 D는 막에 부착된 비타민 D 수용체와 결합하여 장관에서 칼슘과 인의 섭취를 담당하며 골의 세포 성장과 기능에 중요한 역할을 하는 비타민이다. 그 동안의 연구 결과, 비타민 D가 유방, 전립샘, 대장 등에 발생하는 암종에서 세포 증식의 억제 효과가 있고(Agic et al., 2007), 비타민 D의 활성화 형태인 비타민 1,25-디하이드로비타민 D₃ 또는 1α,25(OH)₂D₃, 즉 칼시트리올은 종양의 예방과 치료에 효과가 있는 것으로 알려져 있으나, 난소암과 비타민 D와 혈중 수치 사이에는 유의한 관련이 없다고 보고된 바 있다(Toriola et al., 2010). 그럼에도 불구하고, 본 발명의 발명자들은 난소암에서 비타민 D가 항암 효과를 나타낼 수 있을 것이란 가능성에 주목하였다.

한편, VDUP1의 발현은 산화 스트레스(Oxidative stress), 자외선(Ultraviolet Ray), 열충격인자(heat shock factor, HSF) 등 다양한 세포 스트레스 환경에서 조절된다고 알려져 있다(Junn et al., 2000; Kim et al., 2004). VDUP1은 산화 환원 조절(redox regulation)에 관여하고, 티오레독신의 발현을 억제하여 섬유아세포에서 활성 산소를 증가시킨다. 티오레독신 체계는 티오레독신(Trx)과 NADPH, 그리고 티오레독신 환원효소(TrxR)로 이루어지는데, 이는 거의 모든 살아있는 세포에 존재하여 세포 내의 산화환원적 환경, 세포 성장, 산화적 스트레스 또는 세포자멸사에 대한 방어, 그리고 암의 발달에 있어 중요한 역할을 한다. 티오레독신 체계는 ROS(reactive oxygen species)의 공격으로부터 몸을 보호하고 손상된 단백을 복구시키는 생리적인 항산화 방어인자라고 할 수 있으나 세포의 성장, 자멸사, 무한 증식, 혈관 생성, 조직 침습 등의 측면에서는 암의 성장을 촉진하는 성향이 있다. 그 기전으로는 복제와 복구 등의 DNA 합성, 전사 인자의 DNA 결합의 활성화 등이 있다. TrxR에 의해 환원된 형태의 Trx만이 ASK 1(apoptosis signal-regulation kinase 1)과 결합하여 아폽토시스 기능을 억제한다(Tonissen, 2007). VDUP1은 티오레독신의 촉매적 활성 센터와 상호작용하여 세포를 산화적 스트레스에 의해 매개된 아폽토시스에 민감하도록 만든다 (Gui & Shen, 2012; Wang, De Keulenaer, & Lee, 2002).

또한, 악성 종양에서는 사이클린-의존성 인산화효소 억제제(cyclin-dependent kinase inhibitors)가 없거나 감소된 것을 확인할 수 있으며 그 중에 하나가 p27^kip1(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B)이다. p27^kip1 단백은 사이클린 E/CDK2 복합체에 결합하여 이들을 억제함으로써 세포 주기 중 G1기에서 S기로 이행되는 과정을 차단하여 세포 분열을 중단시키는 기능을 갖고 있다(Polyak et al., 1994). 따라서, p27^kip1 단백의 소실은 암세포의 세포 분열 억제 능력의 소실을 의미하며, 암의 급속한 성장 및 암세포 전이의 촉진과 관련이 있다.

Jab1(Jun activation domain-binding protein 1)은 c-Jun유전자의 활성을 강화시켜 세포 증식을 유발하며, 유비퀴틴/프로테아좀 경로를 통하여 p27^kip1을 핵에서 세포질로의 이동을 촉진하여 파괴하는 역할을 한다 (Tomoda et al., 1999).

상기 비타민 D, VDUP1, p27^kip1 및 Jab1의 관계를 종합하여 고찰하여 보면, VDUP1은 Jab1과 상호작용하여 이를 직접적으로 억제하고 Jab1의 p27^kip1파괴 작용과 세포의 증식을 방해하며, 비타민D 치료가 p27^kip1를 상승시키는 과정에 있어서 비타민 D 수용체(Vitamin D receptor)가 연관된다. 따라서, 본 발명에서는 비타민 D가, 악성 난소 종양에서 서로 역의 상관관계가 있도록 Jab1 단백 및 p27^kip1 단백의 발현을 조절하고, 이는 VDUP1의 발현과 연관되어 있어서, 난소암의 진행 및 예후에 영향을 미친다는 점을 밝혔다.

상기 비타민 D는 비타민 D의 활성화 상태인 1,25-다이하이드록시비타민 D₃(1,25-dihydroxyvitamin D3, 1α,25(OH)₂-비타민 D₃)일 수 있다.

또한, 상기 난소암은, 장액성 난소암, 점액성 난소암, 자궁내막양 난소암, 투명세포암, 악성 브레너 종양, 미분화세포암, 미분류 난소암 등을 포함할 수 있으나 이에 한정되지 아니하고, 상기 난소암에는 난소에 악성 종양이 발생하는 기타 병태 역시 포함된다. 상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은, 특히 상피성 난소암에 상기 난소암 예방 및 치료용 약학조성물의 약리활성이 우수하다.

이하 실시예에서 구체적으로 설명되는 바와 같이, 비타민 D, 특히 활성 형태인 D₃의 처리는 난소암 세포주인 SK-OV-3, OVCAR-3에서도 VDUP1과 p27^kip1의 안정성과 발현을 증가시키는 것을 확인할 수 있었다. 실시예의 결과를 바탕으로 하였을 때, 난소암 세포주 SK-OV-3과 OVCAR-3 각각에 비타민 D(1,25 (OH)₂ vitamin D₃)를 처리하면, VDUP1이 상승하게 되고 Jab1에 부조절자(negative regulator)로 작용하게 되어 세포주기 조절 단백 p27^kip1가 핵으로부터 이동하여 분해되는 것을 막는 작용을 한다. 즉, 난소암에서 비타민 D 치료, 또는 본 발명에서와 같은 비타민 D를 함유하는 조성물이 VDUP1를 과발현하게 하여 난소 종양 형성하는 과정에 영향을 미쳐 암 형성 예방과 치료에 중요 인자로서 활용될 수 있는 것이다. 이와 같이 난소암 특이적으로 분자적 메커니즘 관점에서 비타민 D를 유효 성분으로 하는 항암 효과를 확인하였다.

상기 본 발명의 항암 조성물은 난소암 세포 내의 VDUP1(Vitamin D up-regulated protein 1) 단백질의 발현을 증가시키는 것일 수 있다. 난소암 세포 내의 VDUP1 단백질 발현이 증가하면, Jab1에 부조절자(negative regulator)로 작용하게 되어, 세포주기 조절 단백 p27^kip1가 핵으로부터 이동하여 분해되는 것을 막는 작용을 하고, 난소 종양 형성하는 과정에 영향을 미쳐 암 형성 예방과 치료에 중요 인자로 난소암의 예방 또는 치료 효과를 가질 수 있다.

상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물에 포함된 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 함량은 0.1 μM 내지 20 μM의 농도일 수 있고, 5 μM 내지 15 μM일 수 있는데, 이 범위 내에서 본 발명에서 적용하는 약학조성물의 유효성분이 난소암에 대한 항암 특성이 안정적으로 확보될 수 있다. 다만, 상기 농도 범위는 약학적 활성, 투여방법, 환자의 상태 등의 다양한 요인에 의하여 변경될 수 있다.

본 발명의 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물에서 유효성분의 총 유효량은 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)으로 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물에서 유효성분인 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 용량은, 약학적 조성물의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 질환의 중증도, 식이 및 배설율 등 다양한 요인들을 고려하여 결정될 수 있으며, 상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 본 발명의 효과를 보이는 한 그 제형, 투여 경로 및 투여 방법에 특별히 제한되지 아니한다.

본 발명의 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 질환의 정도나 암세포의 기원에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있다. 비경구 투여 시에는 상기 약학 조성물은 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 하루에 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 50 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 30 mg의 양으로 투여할 수 있고, 경구 투여 시에는 상기 약학 조성물은 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 체중 1 kg당 바람직하게 0.01 내지 100 mg, 더 바람직하게는 0.1 내지 50 mg의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 상기 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 0.01 내지 100 mg/체중 kg 용량으로 포함하여 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 이러한 범위에서 상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 난소암의 세포자살을 효과적으로 유도하여 난소암 치료 및 예방에 유효하게 적용될 수 있다. 상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 상기 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 0.05 내지 50 mg/체중 kg 용량으로 포함하여 상피세포 난소암에 적용할 수 있다.

또한, 상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물의 유효성분을 과다증식성 난소암 세포에 노출하는 경우, 상기 유효성분이 항증식제 및 분화 유발제로서 작용하도록 하는 투여량으로 투여될 수 있다. 구체적으로, 환자의 체중 kg당 비타민 D의 일일 유효투여량의 범위는 약 0.01 μg/㎏/day 내지 약 2.0 μg/㎏/day, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 1.0 μg/kg/day일 수 있다. 또한, 이러한 조성물을 2 내지 6 일에 1회 또는 1 주일에 1회, 일일 투여량 또는 에피소딕(episodic) 투여량으로 제공될 수 있는데, 각 일일 투여량은 한번에 투여되거나, 모두 투여될 때까지, 예를 들면 1 시간 간격으로 2 내지 4회로 나누어 투여될 수 있다.

본 발명의 다른 일 실시예에 따른, 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은, 난소암 세포 내의 VDUP1(Vitamin D up-regulated protein 1) 단백질 발현을 증가시키는 VDUP1증가제를 유효성분으로 포함한다.

난소암 세포 내의 VDUP1(Vitamin D up-regulated protein 1) 단백질 발현을 증가시키는 VDUP1증가제는, 생체내(in vivo) 또는 생체외(in vitro)에서 그 활성을 가질 수 있으며, 유효성분으로 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 포함하나, 난소암 세포 내의 VDUP1 단백질 발현을 증가시키는 물질이라면 적용될 수 있다. 이때, 비타민 D는 바람직하게 1,25-다이하이드록시비타민 D₃(1,25-dihydroxyvitamin D3, 1α,25(OH)₂-비타민 D₃)일 수 있으며, 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 적용하는 경우 특히 상피세포 난소암에 효과적일 수 있다.

상기 VDUP1 단백질 발현 증가제는, p27^kip1(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B)의 발현을 증가시키고, Jab1(Jun activation domain-binding protein 1)의 발현을 감소시키며, 난소암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 역할을 하여 난소암 치료 또는 예방의 효과를 갖는다.

상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물의 유효 성분의 바람직한 함량은, 사용된 유효 성분의 효능, 제형화된 특정 조성물, 적용 방식 및 특정 계(situ) 및 치료되는 생체에 따라 변화될 수 있다. 예를 들면, 환자에 대한 특정 투여량은, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 식이요법, 투여 시기와 투여 방식, 배설 속도, 및 배합되어 사용되는 약물 및 치료법이 적용되는 특정 장애의 심각성에 따라 변경되어 적용될 수 있다.

상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은, 인간을 포함한 포유 동물 투여용 약용 제제를 제조하기 위한 통상의 약제법에 따라, 예를 들어 활성 화합물인 비타민 D와 유해하게 반응하지 않으면서 소화관(예를 들면, 경구), 비경구 또는 국소 적용에 적합한, 약제학적으로 허용되는 담체를 더 함유할 수 있다.

약제학적으로 허용되는 적합한 담체로는, 물, 염 용액, 알콜, 아라비아 고무, 식물성 오일(예를 들면, 아몬드 오일, 옥수수 오일, 면화씨 오일, 땅콩 오일, 올리브 오일, 코코넛 오일), 광유, 생선 간 오일, 폴리소르베이트 80과 같은 유성에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 탄수화물(예를 들면, 락토오스, 아밀로오스 또는 전분), 마그네슘 스테아르산염, 활석, 규산, 점성 파라핀, 지방산 모노글리세리드 및 디글리세리드, 펜타에리트리톨 지방산 에스테르, 하이드록시 메틸셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈 등을 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

약제학적 제제는 멸균될 수 있고, 경우에 따라, 보조제, 예를 들면, 윤활제, 방부제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염, 완충제, 착색제, 향료와 혼합될 수 있다.

비경구 투여용으로, 주사 가능한 무균 용액, 바람직하게는 유성 또는 수성 용액, 및 현탁액, 유화액 또는 좌약을 포함하는 형태가 특히 적합하다. 비경구 투여는 좋기로는, 피하 주사, 근내 주사 또는 정맥내 주사, 비인두 흡수 또는 점막 흡수, 또는 경피 흡수를 포함한다.

소화관 투여용으로는, 정제, 당의정, 액체, 점적제, 좌약, 로젠지 (lozenge), 분말 또는 캡슐이 특히 적합하다. 가당 비히클 (sweetened vehicle)을 목적으로 하는 경우, 시럽, 엘릭서 (elixir) 등이 사용될 수 있다.

상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물의 투여방식으로, 경구 투여가 바람직할 수 있다.

상기 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물은 1 이상의 세포독성 제제 또는 항암 제제와 함께 투여될 수 있다. 이러한 제제로는, 대사길항물질(예를 들면, 5-플루오로-우라실, 메토트렉세이트, 플루다라빈), 항미세소관제(예를 들면, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 및 파크리탁셀, 도세탁셀과 같은 탁산계), 알킬화제(예를 들면, 사이클로파스파미드, 멜팔란, 바이오코로에틸니트로스우레아, 하이드록시우레아), 백금제(예를 들면, 시스플라틴, 카보플라틴, 옥살리플라틴, JM-216, CI-973), 안트라사이클린(예를 들면, 독스루비신, 다우노루비신), 항생제(예를 들면, 미토마이신, 이다루비신, 아드리아마이신, 다우노마이신), 국소이성화효소 억제제(예를 들면, 에토포시드, 캄프토테신) 또는 기타 항신생물제(예를 들면, 에스트라무스틴 포스페이드, 프레드니무스틴)를 들 수 있다. 이렇게, 추가적인 세포 독성 제제 또는 항암 제제를 더 함유하는 경우, 본 발명의 조성물은 암성 세포에 대하여 상당히 증가된 세포독성 효과를 유발할 수 있으며, 따라서 증가된 치료 효과를 제공할 수 있다.

본 발명의 난소암 치료를 위한 비타민 D를 함유하는 항암 조성물은 VDUP1 과발현을 유도, 난소 종양 형성 과정에 영향을 미쳐 난소암 특이적으로 암 형성 예방과 치료에 유의하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 2에서 MTT 분석을 통한, 난소암 세포주(SK-OV-3)의 세포 증식에 대한 비타민 D 처리 효과를 보여주는 결과이다.
도 2은 본 발명의 실시예 2에서 MTT 분석을 통한, 난소암 세포주(OVCAR-3)의 세포 증식에 대한 비타민 D 처리 효과를 보여주는 결과이다.
도 3은 본 발명의 실시예 3에서 SK-OV-3 세포주에 비타민 D 처리시 VDUP1, p27^kip1 및 Jab1의 발현 양상을 조사한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4는 본 발명의 실시예 3에서 SK-OV-3 세포주에 비타민 D 처리시 VDUP1, p27^kip1 및 Jab1의 발현 양상을 조사한 웨스턴 블롯 결과에 대한 정량 분석 결과이다.
도 5은 본 발명의 실시예 3에서 OVCAR-3 세포주에 비타민 D 처리시 VDUP1, p27^kip1 및 Jab1의 발현 양상을 조사한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 6은 본 발명의 실시예 3에서 OVCAR-3 세포주에 비타민 D 처리시 VDUP1, p27^kip1 및 Jab1의 발현 양상을 조사한 웨스턴 블롯 결과 에 대한 정량 분석 결과이다.
도 7은 본 발명의 실시예 4에서 SK-OV-3 세포주에 비타민 D 처리시 VDUP1, p27^kip1 및 Jab1의 발현을 면역형광법으로 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 실시예 4에서 OVCAR -3 세포주에 비타민 D 처리시 VDUP1, p27^kip1 및 Jab1의 발현을 면역형광법으로 확인한 결과이다.
도 9는 본 발명의 실시예 5에서 비타민 D를 처리한 SK-OV-3 난소암 세포주에서 VDUP1, p27^kip1과 Jab1발현을 면역 세포화학염색법으로 측정한 결과를 보여주는 사진이다.
도 10은 본 발명의 실시예 5에서 비타민 D를 처리한 SK-OV-3 난소암 세포주에서 VDUP1, p27^kip1과 Jab1발현을 면역 세포화학염색법으로 측정한 결과를 H-score를 통하여 계산한 결과를 보여준다.
도 11은 본 발명의 실시예 5에서 비타민 D를 처리한 OVCAR-3 난소암 세포주에서 VDUP1, p27^kip1과 Jab1발현을 면역 세포화학염색법으로 측정한 결과를 보여주는 사진이다.
도 12는 본 발명의 실시예 5에서 비타민 D를 처리한 OVCAR-3 난소암 세포주에서 VDUP1, p27^kip1과 Jab1발현을 면역 세포화학염색법으로 측정한 결과를 H-score를 통하여 계산한 결과를 보여준다.
도 13은 본 발명의 실시예 6에서 비타민 D를 처리한 SK-OV-3 난소암 세포주에서 에서 아폽토시스를 확인하기 위한 유세포 분석(아넥신 V 염색) 결과를 보여준다.
도 14는 본 발명의 실시예 6에서 비타민 D를 처리한 OVCAR-3 난소암 세포주에서 에서 아폽토시스를 확인하기 위한 유세포 분석(아넥신 V 염색) 결과를 보여준다.

이하, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본 발명의 실시예에 대하여 첨부한 도면을 참고로 하여 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되지 않는다.

실시예 1. 세포주 및 세포 배양

인간의 암 세포주 SK-OV-3(ATCC ® 카탈로그 번호 HTB-77 난소, 복수)와 OVCAR-3(ATCC ® 카탈로그 번호 HTB-161 난소 상피).

37℃, 5% CO₂의 습윤 분위기 하에서, OVCAR-3 세포를 20% 페탈 보바인 세럼(533-6955, Hyclone), 페니실린(100 mg/l, Invitrogen)이 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다. 37℃, 5% CO₂의 습윤 분위기 하에서, SK-OV-3 세포를 10% 페탈 보바인 세럼(533-6955, Hyclone)으로 보충 된 RPMI 1640에서 배양하였다.

실시예 2. 세포 증식 시험

3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 분석을 이용하여 세포 증식에 대한 비타민 D 처리 효과를 시험하였다.

OVCAR-3 세포와 SK-OV-3 세포를 96-웰 플레이트에서 각각 24 시간 동안 1.4 x 10⁴ 세포/웰 또는 8 x 10³ 세포/웰의 농도로 도말하여 배양하였다. 그 후, 세포들을 에탄올에 용해시킨 다양한 양(1μM, 5μM, 10μM)의 1α,25(OH)₂ 비타민 D₃(D1530; Sigma Aldrich, St.Louis, MO, U.S.A.)로 24 시간 동안 처리하였다. 생존 세포 밀도를 MTT 염료의 대사성 전환에 의하여 측정하였다. MTT(5 mg/ml)을 40 μL/웰의 농도로 96-웰 플레이트에 첨가하고, 추가 배양하였다. MTT 반응을 DMSO 100 μL를 첨가하여 종결시켰다. 이어서, MTT 분석 결과를 595 nm에서 흡광도 측정함으로써 판독하였다.

SK-OV-3 및 OVCAR-3 난소암 세포에서 세포 생존에 대한 비타민 D의 효과를 각각 도 1 및 도 2에 나타내었다.

MTT 분석에 따르면, 비타민 D는 용량 의존적으로 SK-OV-3 및 OVCAR-3 세포의 사멸을 유도하는 것으로 밝혀졌다. 24 시간 처리 후 1μM의 비타민 D₃로 처리된 SK-OV-3 세포의 생존율은, 비히클 대조군 세포의 생존과 비교하여 83%였다. 10μM을 처리한 경우 24시간 이후 약 50% 정도만 생존하였다(도 1 참고). 또한, 1μM의 비타민 D₃로 처리 OVCAR-3 세포의 생존율은 비히클 대조군 생존과 비교하여 89% 정도였고, 10μM 처리시 약 40%였다(도 2 참고).

위의 데이터는 비히클 대조군에 대한 % 및 평균 ± 표준 편차로 나타내었다. 이들 결과는 비타민 D₃ 투여량에 의존적으로 투여량이 증가함에 따라 난소암 세포의 생존율이 감소함을 보여주며, OVCAR-3 세포주에서 세포의 생존율이 SK-OV-3 세포주에서 세포의 생존율보다 더 많이 감소하여 비타민 D₃ 투여에 의한 난소암 세포의 생존율 감소 효과는 상피성 난소암이 더 효과적으로 나타났다.

실시예 3. 웨스턴 블롯 분석

제조사에서 제공한 설명서에 따라 세포 용해물을 준비하였다. 세포 용해물을 준비하는 모든 단계는 4℃에서 수행되었다.

단백질 농도는 로우리 법에 의한 염료-결합 단백질 분석을 이용하여 측정되었다. 표준 기법에 따라 세포를 SDS 시료 완충액에 용해시켜, 10% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기 영동시킨 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인 상에 전이시켰다. 1차 항체 및 HRP-컨쥬게이션된 2차 항체를 사용하였다. 각각 다음의 항체를 사용하였다 [VDUP1(sc-16623, Santa cruz Biotechnology, Inc., CA, USA), Jab1(sc-13157, Santa cruz Biotechnology, Inc., CA, USA), p27kip1(ab32044. Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)]. 면역 반응성 단백질을 X 선 필름상에 강화 화학 발광 검출 시스템을 이용하여 가시화하였다.

SK-OV-3 및 OVCAR-3 암세포에서 비타민 D₃ 처리 (1μM, 5μM, 10μM)에 따른 VDUP1, p27^kip1 및 Jab1의 발현을 웨스턴 블롯으로 조사하고 정량 분석한 결과를 각각 도 3 내지 6에 나타내었다. 액틴을 내적 대조군으로 사용하였다.

도 3 내지 도 6의 결과를 참고하면, OVCAR-3 및 SK-OV-3 난소암 세포주에서 각각에 이루어진 비타민 D₃ 처리는, VDUP1, p27^kip1의 발현 증가, Jab1의 발현 감소라는 결과를 가져왔다. 특히, SK-OV-3 세포주 보다는 OVCAR-3 세포주에서 더 농도의존적인 VDUP1, p27^kip1의 발현 증가, Jab1의 발현 감소 효과가 분명하게 나타나는 것으로 확인되었다.

실시예 4. 면역형광법

비타민 D₃에 각각의 농도(1μM, 5μM, 10μM)로 난소암 세포주를 노출시킨 후 각 난소암 세포에서 활성 VDUP1, p27^kip1, Jab1을 면역형광 염색으로 측정하였다. VDUP1에 대하여 녹색 염료를, p27^kip1에 대하여 적색 염료를 사용하였다.

배양된 세포를 인산 완충 염용액(PBS, pH를 7.4)으로 간단히 수세하였다. PBS를 제거하고, 실온에서 15 분간 2-3 mm의 깊이로 2-4% 포름알데히드를 이용하여 세포에 처리하였다. 세포를 PBS로 5 분 동안 3 회 수세하고, 빙냉 100% 메탄올로 처리(깊이 3~5 mm로 완전히 덮을 정도로 사용)한 후, -20℃에서 10 분간 메탄올로 처리하고, PBS로 3 회 수세하였다. 그 후, 실온에서 1 시간 동안 세포를 블로킹 완충액(PBS 중 5% 정상 고트 세럼 + 0.3% 트리톤 X-100)으로 습윤 챔버에서 반응시켰다. 4℃, 가습 챔버 내에서 1차 항체를 밤새 처리하였다.

처리한 1차 항체는 마우스 VDUP1 단일클론 항체(sc-166234, 1:250 희석, Santa ruz Biotechnology, Inc., CA, USA), 마우스 Jab1 단일클론 항체(sc-13157, 1:250 희석, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, USA), 래빗 항-p27 KIP 1 단일클론 항체(ab32034, 1:250, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)였다.

PBS로 3 회 더 수세한 후, 각각 항-래빗 IgG H&L(Alexa Fluor®647 컨쥬게이션) 항체(ab150079, 1:250, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA) 및 항-마우스 IgG H&L(Alexa Fluor®488 컨쥬게이션) 항체(ab150113, 1:250, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)를 실온의 암실에서 1 시간 동안 첨가하였다. PBS로 세척 한 후, DAPI를 함유하는 플루오로쉴드 봉입제(ab104139, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)를 이용, 커버슬립 슬라이드 처리하였다. 모든 실험은 염색되지 않은 음성 대조군을 확인하기 위해 1차 항체 없는 대조군 염색을 이용하여 시행되었다.

결과를 도 7 및 도 8에 나타내었고, 두 난소암 세포주 모두에서, 10 μM 농도 비타민 D₃ 처리시 VDUP1와 p27^kip1가 확연한 발현을 보였으며 Jab1은 비히클에서만 확연히 나타나는 양상을 보이고 비타민 D₃를 처리한 난소암 세포주에서는 국부적으로만 나타나는 것을 확인하였다.

결론적으로, 난소암 세포주에서 비타민 D₃ 처리는 VDUP1, p27^kip1의 발현 증가, Jab1의 발현 감소라는 결과를 이끌어냄을 확인하였다.

실시예 5. 면역세포화학 및 면역반응의 점수화

비타민 D를 처리한 난소암 세포주에서 VDUP1, p27^kip1과 Jab1발현을 면역 세포화학염색법(Immunocytochemistry)을 이용하여 그 H-score를 계산하였다. 구체적으로, 비타민 D₃에 노출시킨 후(1μM, 5μM, 10μM) 난소암 세포에서 활성 VDUP1, p27^kip1, Jab1의 위치를 확인하고자 하였다. EXPOSE Mouse & Rabbit Specific HRP/DAB Detection IHC 키트(ab80436, Abcam Inc., Cambridge, MA, USA)를 이용하여 Jab1(sc-13157, Santa cruz Biotechnology, Inc., CA, USA), p27(ab32044. Abcam Inc., Cambridge, MA, USA), VDUP1(sc-16623, Santa cruz Biotechnology, Inc., CA, USA)에 대한 면역염색을 수행하였다. 사용된 1차 항체는 마우스 VDUP1 단일클론 항체(1:250 희석), 마우스 Jab1 단일클론 항체(1:250 희석), 래빗 항-p27 KIP 1 단일클론 항체(1:250 희석)이었다. 음성 대조군은 1차 항체 배양을 생략한 후에 염색하였다.

면역반응성의 반정량적 분석을 위해 H-점수를 이 연구에 사용하였다. 강하게 염색된 핵(3X), 중간 정도로 염색된 핵(2X), 및 약하게 염색된 핵(1X)을 첨가하면서 0-300의 가능한 범위로 H-점수가 연속적으로 생성되었다. 이들 점수는 2명의 관찰자에 의하여 독립적으로 얻어졌다. 300개의 염색된 세포를 각각의 경우에 무작위로 선택된 장에서 계수하였다. 점수화는 5회의 독립적 측정에 의한 결과를 평균±표준편차로 나타내었다. *, ** 및 ***는 각각 P <0.05, P <0.01, 및 P <0.001에서 유의한 차이를 나타낸다. 이들을 미처리 비히클 대조군과 비교하였다.

결과를 도 9 내지 도 12에 나타내었다. 비타민 D₃를 처리한 SK-OV-3 난소암 세포주에서 비히클과 상대적으로 비교하였을 때 p27^kip1이 처리량 의존적으로 유의한 증가 추세를 보였다(도 9 및 도 10 참조). OVCAR-3 난소암 세포주에서는, 비히클과 비교하였을 때 Jab1이 10 μM에서 증가하는 것을 확인 할 수 있었고, VDUP1이 10 μM 농도에서 유의한 증가를 보였다(도 11 및 도 12 참조).

실시예 6. 아넥신 V 세포 사멸 분석

비타민 D가 난소암 세포주 SK-OV-3와 OVCAR-3에서 아폽토시스를 야기시키는지 확인하기 위해 아넥신 V 염색으로 확인하였다.

시험을 위하여 세포를 도말하고 24 시간 동안 지시된 시간에 비타민 D(10μM)로 처리하였다. 빙냉 Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline(DPBS)에 세포를 2회 수세하고 3분 동안 13000 rpm으로 스피닝 후 1X 바인딩 완충액을 함유하는 빙냉 DPBS에 재현탁하였다. 제조사 프로토콜에 따라 세포를 아넥신 V-FITC 및 프로피듐 요오다이드로 염색하고(BD Pharmingen, San Diego, CA, USA) BD FACSAria 유세포 분석기(Becton, Dickinson and Company)를 이용하여 분석하고 그 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다.　

정량 분석은 Image J를 이용하여 수행되었다. 통계 분석은 SPSS 소프트웨어 (window version 17.00; SPSS Inc. Chicago, IL, USA)를 이용하여 수행되었다. 데이터를 피셔 이그잭트 테스트 및 분산분석(ANOVA)을 이용하여 분석한 후, 던칸 사후분석하였다. 차이는 0.05 미만의 P-값으로 통계적으로 유의하였다.

AY1, AY2, AY3 및 AY4는 각각 괴사, 후기 아폽토시스, 생존 및 초기 아폽토시스 영역을 나타낸다. 비타민 D₃를 10 μM농도로 24 시간 처리한 난소암 세포주 SK-OV-3에서 후기 아폽토시스를 나타내는 AY2 영역이 늘어난 것을 보아 비히클에 비해 10 μM 농도로 비타민 D₃를 처리한 경우 아폽토시스가 발생한 것을 확인할 수 있었다. 마찬가지로 비타민 D₃를 10 μM 농도로 24 시간 처리한 난소암 세포주 OVCAR-3에서도 후기 아폽토시스 영역인 AY2 영역이 늘어난 것을 보아 아폽토시스가 발생한 것을 확인할 수 있었다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리범위에 속하는 것이다.

Claims (5)

1. 비타민 D 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효 성분으로 함유하는, 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 비타민 D는 1,25-다이하이드록시비타민 D₃(1,25-dihydroxyvitamin D3, 1α,25(OH)₂-비타민 D₃)인, 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 난소암은 상피성 난소암인, 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
4. 난소암 세포 내의 VDUP1(Vitamin D up-regulated protein 1) 단백질 발현 증가시키는 VDUP1증가제를 유효성분으로 함유하는, 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.
5. 제4항에 있어서,
   상기 VDUP1 단백질 발현 증가제는, p27^kip1(Cyclin-dependent kinase inhibitor 1B)의 발현을 증가시키고, Jab1(Jun activation domain-binding protein 1)의 발현을 감소시키며, 난소암 세포의 세포사멸(apoptosis)를 유도하는 것인, 난소암 예방 또는 치료용 약학조성물.

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