KR101796163B1 - 재조합 단백질 - Google Patents
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Abstract
에리트로포이에틴 및 고도로 글리코실화된 단편을 포함하는 재조합 단백질이 제공된다. 재조합 단백질은 에리트로포이에틴의 생물활성을 보유하며 비교적 긴 반감기를 갖는다. 재조합 단백질은 인간 융모성 고나도트로핀의 카르복실 말단 펩티드 및 트롬보포이에틴의 카르복실 말단 펩티드를 또한 포함할 수 있다.
Description
본 발명은 재조합 단백질에 관한 것이고, 특히 보다 긴 반감기를 갖는 고도로 글리코실화된 에리트로포이에틴 (EPO)에 관한 것이다.
에리트로포이에틴 (EPO)은 당단백질 호르몬, 또는 골수 중 적혈구 전구체의 시토카인이다. 인간에서, 에리트로포이에틴은 적혈구의 처리 및 호르몬의 조절에 관여된다. 동시에, 에리트로포이에틴은 또한 다른 생물학적 기능도 보유하고 있다. 예를 들어, 에리트로포이에틴은 신경 손상이 존재하는 경우에 상처 치유의 과정에 관여된다.
적혈구생성은 적혈구의 생산이며, 이러한 생산이 일어나서 세포 파괴를 상쇄시킨다. 적혈구생성은 충분한 적혈구가 적당한 조직 산소화에 이용될 수 있도록 해주는 제어된 생리학적 메카니즘이다. 자연 발생 인간 에리트로포이에틴 (hEPO)은 신장에서 생산되며, 적혈구 생산을 자극하는 체액성 혈장 인자이다 (Carnot, P and Deflandre, C (1906) C. R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, A J (1953 Blood 8: 349; Reissmann, K R (1950) Blood 5: 372; Jacobson, L O, Goldwasser, E, Freid, W and Plzak, L F (1957) Nature 179: 6331-4). EPO는 골수 중 수임된 적혈구 전구세포의 분열과 분화를 자극하고, 적혈구 전구체 상의 수용체에 결합함으로써 그의 생물학적 활성을 발휘한다 (Krantz, B S (1991) Blood 77: 419).
에리트로포이에틴은 재조합 DNA 기술을 이용하여 생합성적으로 제조되어 왔으며 (Egrie, J C, Strickland, T W, Lane, J et al. (1986) Immunobiol. 72: 213-224), 차이니즈 햄스터의 난소 조직 세포 (CHO 세포) 내로 삽입되어 거기에서 발현된 클로닝된 인간 EPO 유전자의 생성물이다. 당 모이어티가 없는 EPO의 폴리펩티드 쇄의 분자량은 18,236 Da이다. 무손상 EPO 분자의 경우에, 분자량의 대략 40%는 단백질 상의 글리코실화 부위에서 단백질을 글리코실화시키는 탄수화물 기가 차지한다 (Sasaki, H, Bothner, B, Dell, A and Fukuda, M (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).
인간 에리트로포이에틴은 적혈구 형성에 필수이기 때문에, 그 호르몬은 낮은 또는 결함있는 적혈구 생산을 특징으로 하는 혈액 장애의 치료에 유용하다. 임상적으로, EPO는 만성 신부전 환자 (CRF)에서의 빈혈 치료 (Eschbach, J W, Egri, J C, Downing, M R et al. (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, J W, Abdulhadi, M H, Browne, J K et al. (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, J C, Eschbach, J W, McGuire, T, Adamson, J W (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, V S, Degowin, R L, Zavala, D et al. (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114) 및 화학요법을 받고있는 AIDS 및 암 환자에서의 빈혈 치료 (Danna, R P, Rudnick, S A, Abels, R I In: M B, Garnick, ed. Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. New York, N.Y.: Marcel Dekker; 1990: p. 301-324)에 사용된다. 그러나, EPO 단백질 치료제의 생체이용률은 그의 짧은 혈장 반감기 및 프로테아제 분해에 의해 제한되며 그에 따라 양호한 임상 효능을 달성하기가 어렵다.
본 발명은 장시간 반감기를 갖는 고도로 글리코실화된 에리트로포이에틴 (EPO)을 제공한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 에리트로포이에틴 및 고도로 글리코실화된 펩티드를 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 단백질을 발현하도록 상기 뉴클레오티드로 형질감염되는 세포를 또한 제공한다.
본 발명은 상기 재조합 단백질 및 제약상 허용되는 담체 또는 아주반트를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
전술한 목적 및 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 특징과 이점은 보다 더 자명하고 이해가능할 수 있으며, 바람직한 실시양태가 상세한 해석을 지원하기 위하여 첨부 도면과 함께 하기에 예시된다.
도 1은 본 발명의 실시양태에 따른 EPO-NNCT, NNCT-EPO, EPO-N1N2, N1N2-EPO, EPO-N1 및 EPO-N2의 플라스미드 구축을 도해한다.
도 2는 본 발명의 EPO-NNCT와 시판 에프렉스(Eprex)®간의 활성 수준 비교를 도해한다.
도 3은 본 발명의 EPO-NNCT와 시판 에프렉스® (정맥내 주사)간의 약동학적 특성 (PK)의 비교를 도해한다.
도 4는 본 발명의 EPO-NNCT와 시판 에프렉스® (피하 주사)간의 약동학적 특성 (PK)의 비교를 도해한다.
도 5는 본 발명의 EPO-N1N2, N1N2-EPO, NNCT-EPO와 시판 에프렉스® (피하 주사)간의 약동학적 특성 (PK)의 비교를 도해한다.
도 2는 본 발명의 EPO-NNCT와 시판 에프렉스(Eprex)®간의 활성 수준 비교를 도해한다.
도 3은 본 발명의 EPO-NNCT와 시판 에프렉스® (정맥내 주사)간의 약동학적 특성 (PK)의 비교를 도해한다.
도 4는 본 발명의 EPO-NNCT와 시판 에프렉스® (피하 주사)간의 약동학적 특성 (PK)의 비교를 도해한다.
도 5는 본 발명의 EPO-N1N2, N1N2-EPO, NNCT-EPO와 시판 에프렉스® (피하 주사)간의 약동학적 특성 (PK)의 비교를 도해한다.
본 발명은 장시간 반감기를 갖는 재조합 에리트로포이에틴 및 그의 제조 방법을 제공한다.
한 실시양태에서, 본 발명은 에리트로포이에틴 및 고도로 글리코실화된 펩티드를 포함하는 재조합 단백질을 제공한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 본원에서 사용되는 어구 "에리트로포이에틴 (EPO)"은 모든 기원의 EPO, 특히 인간 또는 동물 EPO를 포함한다. 본원에서 사용되는 상기 용어는 자연 발생, 즉 야생형 형태의 EPO 뿐만 아니라, 야생형 에리트로포이에틴의 생물학적 효과를 나타내는 한 그의 유도체, 유사체, 변형, 돌연변이체 등도 포함한다.
EPO의 활성을 보유하는 임의의 단백질, 예컨대 뮤테인 또는 다른 방법으로 변형된 단백질 또한 포함된다. 재조합 EPO는 재조합 DNA 기술에 의해 CHO, BHK, COS, HeLa 또는 PER.C6 세포주 또는 다른 적당한 세포주에서의 발현을 통해 제조될 수 있으며, 관련 내용은 미국 특허 번호 5,733,761, 5,641,670, 5,733,746, 5,994,122, 5,733,761, 5,641,670, 5,981,214 및 5,272,071을 참조할 수 있다. 그의 제조와 치료적 적용에 대해서는 미국 특허 번호 5,547,933과 5,621,080, 문헌 [Huang, S. L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712], 뿐만 아니라 문헌 [Lai, P. H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121]와 문헌 [Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076]을 참조할 수 있다. 바람직한 EPO 종은 인간 EPO 종이다.
본원에 사용되는 바와 같이, 어구 "고도로 글리코실화된 펩티드"는 약 10 내지 30개의 아미노산 잔기를 보유하고 적어도 1개의 글리코시드를 갖는 폴리펩티드를 언급한다. 본 발명의 고도로 글리코실화된 펩티드는 1개 이상의 글리칸(들)을 생성하기 위한 1개 이상의 N- 또는 O-연결 글리코실화 부위(들)를 포함한다. 예를 들어, 서열 1 및/또는 2의 서열, 또는 서열 1 또는 2에 대해 적어도 60%, 65%, 70% 및 80% 서열 동일성, 바람직하게는 90%, 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열.
고도로 글리코실화된 펩티드는 EPO와 융합되어 본 발명의 재조합 단백질을 형성한다. 고도로 글리코실화된 펩티드는 EPO의 N-말단 단부 (N-ter) 또는 카르복시-말단 단부 (C-ter)에 위치할 수 있으며, 고도로 글리코실화된 펩티드의 수는 제한되지 않는다. 예를 들어, 1개 이상의 동일하거나 상이한 고도로 글리코실화된 펩티드(들)가 EPO의 N-말단 단부 및/또는 C-말단 단부에 부착될 수 있다. 고도로 글리코실화된 펩티드를 함유하는 재조합 단백질은 보다 긴 반감기 및 보다 높은 활성을 보유한다. 한 실시양태에서, 도 1에 도시된 바와 같이 고도로 글리코실화된 펩티드 (서열 1 및/또는 2)는 EPO의 N-ter 또는 C-ter에 위치할 수 있다.
고도로 글리코실화된 펩티드는 서열 1 및/또는 2를 포함하나 이에 제한되지 않는다. 1개 이상의 동일하거나 상이한 고도로 글리코실화된 펩티드(들)는 EPO의 C-ter에 부착될 수 있다. 예를 들어, 서열 1 또는 2가 EPO의 C-ter에 부착되거나; 또는 2개 이상의 서열 1 또는 2가 EPO의 C-ter에 부착되거나; 또는 서열 1 및 2가 순차적으로 EPO의 C-ter에 부착되거나; 또는 서열 2 및 1이 순차적으로 EPO의 C-ter에 부착된다. 또 다른 실시양태에서, 서열 1 및 2가 순차적으로 EPO의 C-ter에 부착된다.
본 발명의 재조합 단백질은 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG)의 카르복시 말단 펩티드를 추가로 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 어구 "hCG의 카르복시 말단 펩티드 (이하 "CTP"로서 호칭)"는 C-말단에서 아미노산 112-118에서부터 잔기 145에 걸쳐 있는 인간 융모성 고나도트로핀 β 서브유닛의 카르복시 말단에서 발견되는 아미노산 서열을 언급하거나 또는 동등한 생물학적 활성을 보유하는 그의 일부, 또는 변이체 또는 유사체를 언급한다. CTP 서열 펩티드는 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34개의 아미노산 길이이며 hCG 아미노산 서열의 위치 112, 113, 114, 115, 116, 117 또는 118에서 개시한다.
본 발명의 CTP는 서열 3, 또는 서열 3에 대해 적어도 65%, 70%, 80%, 90% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 CTP는 EPO에 (N-ter 또는 C-ter에서) 및/또는 고도로 글리코실화된 펩티드에 (N-ter 또는 C-ter에서) 부착될 수 있다. CTP의 양은 제한되지 않는다. 예를 들어, hCG의 1개 이상의 동일하거나 상이한 CTP가 EPO의 N-ter 또는 본 발명의 고도로 글리코실화된 펩티드(들)의 C-ter에 부착될 수 있다.
본 발명의 CTP는 단백질 또는 펩티드의 분해에 대한 보호제로서 작용할 수 있다. 본 출원에서, hCG의 CTP는 재조합 단백질의 순환 반감기를 연장할 수 있고, 재조합 단백질의 효능을 증진시킬 수 있다.
본 발명은 트롬보포이에틴 (TPO)의 카르복시 말단 펩티드를 추가로 포함한다.
본원에 사용되는 바와 같이, 어구 "트롬보포이에틴의 카르복시 말단 펩티드 (이하 "TpS"로서 호칭)"는 트롬보포이에틴의 위치 176 내지 353에서의 아미노산, 특히 트롬보포이에틴의 위치 337 내지 353에서의 아미노산, 또는 동등한 생물학적 활성을 보유하는 그의 변이체 또는 유사체를 언급한다.
본 발명의 TpS는 서열 4, 또는 서열 4에 대해 적어도 65%, 70%, 80% 또는 90% 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 TpS는 EPO에 (N-ter 또는 C-ter에서), 고도로 글리코실화된 펩티드에 (N-ter 또는 C-ter에서) 및/또는 CTP에 (N-ter 또는 C-ter에서) 부착될 수 있고, TpS의 양은 제한되지 않는다. 한 실시양태에서, 1개 이상의 동일하거나 상이한 TpS가 EPO의 N-ter 또는 고도로 글리코실화된 펩티드의 C-ter에 부착될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 1개 이상의 동일하거나 상이한 TpS가 EPO의 N-ter 또는 CTP의 C-ter에 부착될 수 있다.
본 출원의 TpS는 단백질 또는 그로부터 유래한 펩티드의 분해에 대한 보호제로서 작용할 수 있다. TpS는 재조합 단백질의 순환 반감기를 연장할 수 있고, 재조합 단백질의 효능을 증진시킬 수 있다.
본 발명에서, EPO, 고도로 글리코실화된 펩티드, CTP 및 TpS의 양 및 배치는 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 서열 1, 2, 3 및 4를 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 재조합 단백질은 서열 5 (EPO-NNCT), 6 (NNCT-EPO), 7 (EPO-N1N2), 8 (N1N2-EPO), 9 (EPO-N1) 또는 10 (EPO-N2)으로부터 선택될 수 있다.
고도로 글리코실화된 펩티드, CTP 및 TpS는 또한 결실, 치환, 삽입 및/또는 화학적 변형에 의해 변형될 수 있다. 아미노산 결실, 치환, 삽입 및/또는 화학적 변형의 방법 및 과정은 관련 기술분야에 주지이고, 고도로 글리코실화된 펩티드, CTP 및 TpS는 변형 후에도 최초의 활성을 여전히 유지한다.
한 실시양태에서, 변형은 N-말단 변형, C-말단 변형, 폴리펩티드 결합 변형, 예컨대 CH2-NH, CH2-S, CH2-S=O, O=C-NH, CH2-O, CH2-CH2, S=C-NH, CH=CH 또는 CF=CH, 백본 변형 및 잔기 변형을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 펩티드모방 화합물을 제조하는 방법은 관련 기술분야에 주지이며, 문헌 [Quantitative Drug Design, C. A. Ramsden Gd., Chapter 17.2, F. Choplin Pergamon Press (1992)]을 참조할 수 있다.
한 실시양태에서, 폴리펩티드의 펩티드 결합 (-CO-NH-)은 예컨대 N-메틸 결합 (-N(CH3)-CO), 에스테르 결합 (-C(R)H-COOC(R)-N-), 케토메틸렌 (-CO-CH2), α-아자 결합 (-NH-N(R)-CO-)에 의해 치환될 수 있고, 여기서 R은 임의의 알킬, 히드록시에틸렌 결합 (-CH(OH)-CH2-), 티오아미드 (-CS-NH-), 알켄 결합 (-CH=CH-), 아미드 결합 (-NH-CO-), 또는 폴리펩티드 유도체 (-N(R)-CH2-CO-)이다.
본 발명은 본 발명의 재조합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 제공한다.
어구 "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 RNA 서열, 상보적 폴리뉴클레오티드 서열 (cDNA), 게놈 폴리뉴클레오티드 서열 및/또는 이들의 조합 형태로 단리되고 제공될 수 있는 단일 가닥 또는 이중 가닥 핵산 서열을 언급한다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 PCR 기술, 또는 통상의 기술자에게 알려져 있는 임의의 다른 방법 또는 절차를 이용하여 제조될 수 있다. 절차는 두 상이한 DNA 서열의 라이게이션을 수반한다 (예를 들어, 문헌 ["Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992] 참조).
본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 단백질의 발현을 가능케 해줄 발현 벡터 내로 삽입될 수 있다. 한 실시양태에서, 발현 벡터는 당해 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에서의 복제 및 통합에 적합하게 해주는 추가적인 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 발현 벡터는 전사 및 번역 개시 서열 (예를 들어, 프로모터 또는 인핸서) 및 전사 및 번역 종결인자 (예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다.
각종 원핵생물 또는 진핵생물 세포가 본 발명의 폴리펩티드를 발현할 숙주 발현 시스템으로서 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 이들 발현 시스템은 미생물, 예컨대 박테리아, 효모, 식물 세포, 진핵생물 (예를 들어, 포유동물 세포, CHO 세포) 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
형질전환 방법은 다음의 문헌에서 찾아볼 수 있으며, 예를 들어 안정한 또는 일시적인 형질감염, 리포펙션, 전기천공 및 재조합 바이러스 벡터로의 감염을 포함한다: [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992), in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) 및 Gilboa et al. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986].
본 발명은 본 발명의 재조합 단백질 및 생리학상 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 조성물을 추가로 제공한다.
상호교환가능하게 사용될 수 있는 어구 "제약상 허용되는 담체 또는 부형제"는 유기체에 유의한 자극을 초래하지 않으며 투여된 화합물의 생물학적 활성과 특성을 폐지하지 않는 담체, 부형제 또는 아주반트를 언급한다. 담체는 유기 매질과 수성 매질 양쪽 모두에서 가용성을 갖는 생체적합성 중합체인 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 부형제는 탄산칼슘, 인산칼슘, 각종 당 및 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물성 오일 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 빈혈 보유 환자, 만성 신기능부전 보유 빈혈 환자, 말기 신장 질환 보유 빈혈 환자, 투석을 받고 있는 빈혈 환자, 만성 신부전 보유 빈혈 환자, 빈혈성 HIV 감염 환자, 암 보유 빈혈 환자, 화학요법을 받고 있는 빈혈 환자, 비-심장, 비-혈관 수술을 받을 예정인 빈혈 환자의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명 조성물의 유효량이 빈혈 환자에게 투여된 후, 빈혈 환자의 적혈구용적률 (Ht)이 유의하게 증가될 수 있으며, 본 발명의 높은 글리코실화를 갖는 재조합 EPO는 대상체에서 보다 긴 반감기를 갖는다. 본 발명의 높은 글리코실화를 갖는 재조합 EPO는 시판 EPO 제품 (예를 들어, 에프렉스® 및 아라네스프(Aranesp)®)의 것보다 긴 반감기를 갖는다. 예를 들어, 본 발명의 고-글리코실화 EPO는 시판 EPO 제품보다 적어도 약 1배, 바람직하게는 2배, 보다 바람직하게는 3배 더 긴 반감기를 갖는다. 또 다른 실시양태에서, 본 발명의 고-글리코실화 EPO는 시판 EPO 제품 (예를 들어, 에프렉스® 및 아라네스프®)의 것에 비해 보다 긴 반감기, 보다 높은 AUC (곡선하 면적)와 Cmax, 및 보다 긴 Tmax 값을 갖는다.
어구 "치료적으로 유효한"은 약 1 내지 10000 I.U./kg, 바람직하게는 약 50 내지 2000 I.U./kg, 보다 바람직하게는 약 50 내지 600 I.U./kg, 가장 바람직하게는 약 50 내지 300 I.U./kg 체중을 일반적으로 언급한다. 본 발명의 제제는 임의의 목적하는 빈도 또는 투여간 시간 간격으로 투여될 수 있다. 투여 요법에 있어서, 대상체는 본 발명의 서방성 제제를 2주3회, 주1회, 2주1회, 3주1회, 월1회, 5주1회, 6주1회, 또는 보다 빈번하거나 보다 덜 빈번한 간격으로, 또는 필요에 따라 그러한 빈도 또는 시간 간격의 임의의 조합으로 투여받는다. 요구되는 투여량은 사용된 화합물 또는 화합물들, 대상체의 종, 대상체의 크기, 및 빈혈의 연관 질환 상태의 중증도를 포함하여 (이에 제한되지 않음) 통상의 기술자에게 알려져 있는 다수의 요인에 따라 변동될 것이다. 다수의 화학치료 요법은 3주1회 일정으로 투여되므로, 바람직한 투여 요법은 특히 암 치료를 위한 화학요법을 받고 있는 대상체의 경우에 3주1회일 수 있다.
실시예
실시예 1
숙주 세포
세포는 타이완 식품산업연구개발연구소의 생물자원보존연구센터(Culture Collection and Research Center(CCRC), 60133)로부터 구입하였다. CHO dfhr- 세포를 10% 소태아 혈청 (깁코(Gibco) Cat. 10091148) + 하이포크산틴-티미딘 (깁코, Cat. 11067-030) 및 2 mM L-글루타민 (깁코 Cat. 25030-081)으로 보충한 IMDM 배지 (이소코브즈(Isocoves) 변형 둘베코 배지, IMDM, 깁코 Cat. 12200-36)에서 배양하였다. dhfr(-) 마커를 증폭 및 선택에 사용하였다. dhfr 유전자의 발현은 디히드로폴레이트 리덕타제 억제제 메토트렉세이트 (MTX, 시그마(Sigma) Cat no. M8407)로 챌린지함으로써(challenging) 증폭시킬 수 있었다. dfhr 유전자가 증폭되었을 때, 다른 인접 유전자가 종종 함께 증폭되었으며, 그에 따라 증폭의 각 라운드 후에 세포를 서브클로닝하여 증가된 생산율을 갖는 클론을 선택하였다. 세포를 37℃ 가습 95% 공기/5% CO2 인큐베이터 (모델 3326, 포마 사이언티픽(Forma Scientific))에서 배양하였다.
실시예 2
발현 벡터의 구축
2.1 EPO
-
NNCT
EPO-NNCT 유전자 단편을 조립 PCR 방법을 이용하여 수득하였고, 이어서 pcDNA3.1/Neo (+)/DHFR 벡터 내로 삽입하여 pND/EPO-NNCT를 수득하였다. 발현 벡터 구축물은 선택 마커로서 네오마이신-내성 유전자를 함유하였다. EPO-NNCT 유전자를 도 1에 도시하였으며, 거기에서 "EPO"는 에리트로포이에틴이고, "N1"은 고도로 글리코실화된 펩티드 1 (서열 1)이고, "N2"는 고도로 글리코실화된 펩티드 2 (서열 2)이고, "CTP"는 hCG의 카르복시 말단 펩티드 (서열 3)이고, "TpS"는 트롬보포이에틴의 카르복시 말단 펩티드 (서열 4)이다.
2.2 NNCT
-EPO
NNCT의 DNA 단편을 LSP-N-S1 프라이머 (3'-cctagggccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcctggctgtggcttctcctgtccctgctgtcgctccctctgg-5'), LSP-N-S2 프라이머 (3'-ctgtccctgctgtcgctccctctgggcctcccagtcctgggcgaggccgagaatatcacgacgggcggtaac-5'), 및 ENNCT1-A 프라이머 (3'-ctcggctgtcacagatgaggcgtggtggggccccttcctgagacagattctgggagtgggtgtaggatg-5')를 사용하여 PCR에 의해 pND/EPO-NNCT 플라스미드로부터 재생시켜 도 1에 도시한 바와 같은 NNCT-EPO 단편을 수득하였다. 이어서 NNCT-EPO 단편을 발현 벡터 내로 삽입하여 pPD/NNCT-EPO 벡터를 수득하였다. 발현 벡터는 선택 마커로서 퓨로마이신-내성 유전자를 함유하였다.
2.3 EPO
-
N1N2
EPO-N1N2의 DNA 단편을 E-S 프라이머 (3'-cctagggccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcc-5') 및 ENNCT2-A 프라이머 (3'-gtatacctacagctgcagagtctcgttcacctgggaagag-5')를 사용하여 PCR에 의해 pND/EPO-NNCT 플라스미드로부터 재생시켜 도 1에 도시된 바와 같은 EPO-N1N2 단편을 수득하였다. 이어서 EPO-N1N2 단편을 발현 벡터 내로 삽입하여 pPD/EPO-N1N2 벡터를 수득하였다. 발현 벡터는 선택 마커로서 퓨로마이신-내성 유전자를 함유하였다.
2.4
N1N2
-EPO
N1N2-EPO의 DNA 단편을 진위즈 인코포레이티드(GENEWIZ, Inc.)에서 합성한 다음 (도 1에 도시), 그것을 발현 벡터 내로 삽입하여 pPD/N1N2-EPO 벡터를 수득하였다. 발현 벡터는 선택 마커로서 퓨로마이신-내성 유전자를 함유하였다.
2.5 EPO-N1
EPO-N1의 DNA 단편을 E-S 프라이머 (3'-cctagggccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcc-5') 및 ENNCT4-A 프라이머 (3'-gtatacctagtctgggacagtgatattctc-5')를 사용하여 PCR에 의해 pND/EPO-NNCT 플라스미드로부터 재생시켜 도 1에 도시된 바와 같은 EPO-N1 단편을 수득하였다. EPO-N1 단편을 발현 벡터 내로 삽입하여 pPD/EPO-N1을 수득하였다. 발현 벡터는 선택 마커로서 퓨로마이신-내성 유전자를 함유하였다.
2.6 EPO-N2
EPO-N2의 DNA 단편을 E-S 프라이머 (3'-cctagggccaccatgggggtgcacgaatgtcctgcc-5') 및 ENNCT5-A 프라이머 (3'-gtatacctaca gctgcagagtctcgttcacctgggaagagttgaccaacagtctgtcccctgtcctgcaggcctccc-5')를 사용하여 PCR 방법에 의해 pND/EPO-NNCT 플라스미드로부터 재생시켜 도 1에 도시한 바와 같은 EPO-N2 단편을 수득하였다. 이어서 EPO-N2 단편을 발현 벡터 내로 삽입하여 pPD/EPO-N1 플라스미드를 수득하였다. 발현 벡터는 선택 마커로서 퓨로마이신-내성 유전자를 함유하였다.
실시예 3
재조합 세포주의 확립
EPO-NNCT 유전자를 함유하는 벡터를 CHO dhfr- 세포 내로 전기천공 (PA4000 펄스애자일(PulseAgile)® 전기천공기, 시토 펄스 사이언시스(Cyto Pulse Sciences))에 의해 형질감염시켰다. 세포를 먼저 트립신처리한 다음, CP-T 완충제 (시토 펄스 Cat. CP-T)에 3x106개 세포/ml의 농도로 재현탁시켰다. 200 ㎕의 세포 현탁액 (6x105개 세포)을 10 ㎍ pND/BMP2와 혼합한 다음 전기영동하였다. 전기영동한 세포를 회수 성장을 위한 선택 물질이 없는 완전 배지 (10% 소태아 혈청 및 HT 보충한 IMDM)에서 배양하였다. 선택 물질이 없는 배지에서 48시간 성장 후, 세포를 IMDM, 10% 소태아 혈청, L-글루타민 및 5 nM MTX를 함유하고 선택 물질이 들어있는 완전 배지로 옮겼다. 대략 2주 배양기간 후, 세포주를 96-웰 플레이트로 옮기고, ELISA에 의한 단백질 수준 정량화를 통하여 고-수준의 rhBMP-2를 발현하는 세포주를 선택하였다. 선택된 세포를 선택 배지에서 배양하였다. 세포를 1개 세포/100 ㎕의 농도로 희석하고, 이어서 96-웰 플레이트로 옮겨서 배양하여 세포집단으로 성장시켰다. 높은 발현 수준을 갖는 세포를 ELISA의 결과에 따라 스크리닝하였으며, MTX 농도를 0.005, 0.01, 0.02, 0.05 μM로 점진적으로 증가시켰다.
실시예 4
배치식 배양
실시예 3에서 수득한 4 x 105개 세포/ml의 재조합 세포주를 무혈청 배지가 들어있는 50 ml 플라스크에서 배치식 배양하였다. 세포를 매일 모니터링하였고, 배양 배지를 수집하여 EPO의 농도를 측정하고 0.02 μM MTX 챌린지하에 고-수율 클론을 선택하였다. 교반 배양에서, EPO-NNCT의 누적 생산성은 표 1에 나타낸 바와 같이 140.69 ㎍/ml이었다.
실시예
5
생물
활성
검정
실시예의 과정 및 절차는 유럽 약전 5.2 (에리트로포이에틴 용액 농축물)의 개시내용에 따라 수행하였다. 암컷 8주령 BALB/c 마우스를 2개 군으로 분류하여, 개별적으로 본 발명의 EPO-NNCT 및 에프렉스® 21, 42, 84, 168, 336 및 672 ng/ml로 피하 주사하였다. 주사 후, 0.25 ml 전혈을 수집하였다. 세포를 염색한 후, 그 세포를 유동 세포측정법 및 셀퀘스트 프로(CellQuest Pro) 소프트웨어로 분석하였고, 결과를 표 2에 나타내었다. 도 2를 참조하면, 동일 투여량에서, 본 발명의 EPO-NNCT로 투여한 마우스의 망상적혈구 평균수는 에프렉스®로 투여한 마우스의 것보다 높았다.
25마리의 암컷 8주령 BALB/c 마우스를 5개 군으로 분류하여, 개별적으로 EPO-NNCT 및 에프렉스® 336 ng/ml로 피하 주사하였다. 마우스 전혈을 주사 후 4 내지 9일 및 13일에 수집하였다. 망상적혈구의 백분율은 유동 세포측정법으로 측정하였고 셀퀘스트 프로 소프트웨어로 분석하였다. 표 3에 나타낸 바와 같이, 망상적혈구의 양 (평균 %)은 본 발명의 EPO-NNCT로 주사한 마우스에서 7일에 가장 높았으며 에프렉스®의 것보다 유의하게 더 높았다.
실시예
6
약동학적 검정
14마리의 암컷 8주령 BALB/c 마우스를 4개 군으로 분류하였고, 개별적으로 본 발명의 EPO-NNCT, 에프렉스® 및 아라네스프® 2000 IU/kg으로 정맥내 및 피하 주사하였다. 마우스 혈액을 주사 후 5 min, 10 min, 30 min, 1 hr, 2 hr, 5 hr, 8 hr, 24 hr, 30 hr, 48 hr, 72 hr, 96 hr, 120 hr, 168 hr, 216 hr, 264 hr 및 336 hr에서 수집하였고, 원심분리하여 혈청을 수득하였으며, 이어서 혈청을 -70℃에서 저장하였다. 퀀티킨(Quantikine)® IVD® Epo ELISA 키트를 사용하여 약동학적 검정을 수행하여 450 nm 및 600 nm에서의 광학 밀도를 측정하였고, 이어서 소프트맥스(SoftMax)® 프로(Pro) 5 소프트웨어로 분석하였다. 결과를 표 4에 나타내었다. 도 3 및 4를 참조하면, 에프렉스® 및 아라네스프®와 비교하여, 본 발명의 EPO-NNCT는 보다 긴 반감기 (약 25-26시간) 및 보다 높은 AUC (곡선하 면적) 값 (약 8387-4502 ng·hr/ml)을 가졌다.
마찬가지로, 에프렉스®와 비교하여, 본 발명의 EPO-N1N2, N1N2-EPO 및 NNCT-EPO는 표 5에 나타낸 바와 같이 보다 긴 반감기 (21-30시간) 및 보다 높은 AUC (곡선하 면적) 값 (370-981 ng·hr/ml)을 또한 가졌다.
또한, EPO-N1 및 EPO-N2는 약 24시간의 Tmax를 가졌다. 따라서, EPO-N1 및 EPO-N2는 시판 에프렉스®와 비교하여 보다 높은 Tmax를 가졌음을 알았다.
비록 바람직한 실시양태가 상기에서와 같이 개시되었지만, 그들은 본 발명을 제한하도록 사용될 수 없으며, 통상의 기술자라면 본 발명의 취지와 범위를 초과함이 없이 다소간의 변화와 변형을 행할 수 있으며, 따라서 본 발명의 범위는 첨부 청구범위에 의해서만 제한될 것이다.
EPO: 에리트로포이에틴
N1: 고도로 글리코실화된 단편 1
N2: 고도로 글리코실화된 단편 2
CTP: 인간 융모성 고나도트로핀의 카르복시 말단 펩티드
TpS: 트롬보포이에틴의 카르복시 말단 펩티드
N1: 고도로 글리코실화된 단편 1
N2: 고도로 글리코실화된 단편 2
CTP: 인간 융모성 고나도트로핀의 카르복시 말단 펩티드
TpS: 트롬보포이에틴의 카르복시 말단 펩티드
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Arg Val Pro Asp Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Val Asn Glu Thr Leu
195 200 205
Gln Leu
210
Claims (15)
- 에리트로포이에틴 및
에리트로포이에틴의 아미노 말단 단부 또는 카르복시 말단 단부에 위치하는 고도로 글리코실화된 펩티드를 포함하고,
상기 고도로 글리코실화된 펩티드는 10 내지 30개의 아미노산 잔기를 보유하고 적어도 1개의 글리코시드를 갖는 폴리펩티드를 의미하며, 서열 1 및 2 중 하나 이상인,
재조합 단백질. - 제1항에 있어서, 에리트로포이에틴의 카르복시 말단 단부가 고도로 글리코실화된 펩티드에 부착되는 것인 재조합 단백질.
- 제1항에 있어서, 에리트로포이에틴의 아미노 말단 단부가 고도로 글리코실화된 펩티드에 부착되는 것인 재조합 단백질.
- 제1항에 있어서, 인간 융모성 고나도트로핀의 카르복시 말단 펩티드를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
- 제4항에 있어서, 인간 융모성 고나도트로핀의 카르복시 말단 펩티드가 서열 3의 서열을 포함하는 것인 재조합 단백질.
- 제5항에 있어서, 고도로 글리코실화된 펩티드의 카르복시 말단 단부가 인간 융모성 고나도트로핀의 카르복시 말단 펩티드에 부착되는 것인 재조합 단백질.
- 제1항 또는 제4항에 있어서, 트롬보포이에틴의 카르복시 말단 펩티드를 추가로 포함하는 재조합 단백질.
- 제7항에 있어서, 트롬보포이에틴의 카르복시 말단 펩티드가 서열 4의 서열을 포함하는 것인 재조합 단백질.
- 제7항에 있어서, 인간 융모성 고나도트로핀의 카르복시 말단 펩티드의 카르복시 말단 단부가 트롬보포이에틴의 카르복시 말단 펩티드에 부착되는 것인 재조합 단백질.
- 제1항에 있어서, 서열 5를 포함하는 재조합 단백질.
- 제1항의 재조합 단백질을 코딩하는 서열을 가지는 뉴클레오티드.
- 제1항의 재조합 단백질을 발현하기 위한, 제11항에 따른 뉴클레오티드로 형질감염된 세포.
- 제1항의 재조합 단백질 및 제약상 허용되는 담체 또는 아주반트를 포함하는, 빈혈 치료용 조성물.
- 삭제
- 삭제
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