KR101773456B1

KR101773456B1 - 다단발효를 통한 생약복합발효추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101773456B1
Application number: KR1020170029332A
Authority: KR
Inventors: 이종은; 최성규; 선우철; 박은정; 이대우
Original assignee: 주식회사 더마랩
Priority date: 2017-03-08
Filing date: 2017-03-08
Publication date: 2017-08-31
Anticipated expiration: 2037-03-08

Abstract

본 발명은 피부 노화에 효과적인 삼을 이용한 5단 발효추출물의 제조에 관한 것이다. 구체적으로는 항노화 효과가 있는 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼을 혼합하고 5종의 미생물을 이용하여 순서대로 발효시킨 후, 삼나무 저온 숙성시켜 항산화, 피부주름개선 및 피부염증완화 효과가 우수한 생약복합발효추출물을 제조하는 방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

다단발효를 통한 생약복합발효추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 피부 개선용 화장료 조성물{Method for preparing complex fermented extract of crude drugs and cosmetic composition comprising the same}

본 발명은 생약복합발효추출물의 제조방법 및 이를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로는 항노화 활성 성분을 함유하는 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼 복합물을 다단발효시켜 피부개선활성이 우수한 생약복합추출물을 제조하고 이를 화장료로 사용하는 기술에 관한 것이다.

노화란 세월이 지나감에 따라 신체의 구조와 기능이 점진적으로 저하되고 질병과 사망에 대한 감수성이 급격히 증가하면서 쇠약해지는 과정으로 신체에 생리적 변화가 발생하여 신체 전반적으로 현저한 퇴화현상이 나타나게 되는 것을 말한다.

노화는 특히 외부 환경과 직접적으로 접촉하는 피부에서 쉽게 나타난다. 피부는 크게 표피층, 진피층, 피하조직으로 이루어져 있으며 표피층에는 주로 케라티노싸이트와 멜라노싸이트, 랑게한스 세포로 이루어져 있다. 진피층에는 주로 섬유아세포종에 의해 생성되는 세포 외 조직 단백질로 이루어져 있으며, 피하조직은 지방세포로 구성되어 결합조직의 틀을 담당한다. 그 중 콜라겐은 피부결합조직의 약 70%를 차지하며 나이가 들면서 콜라겐 합성 저하와 분해 및 촉진에 의해 피부 결합조직 내의 콜라겐 함량이 감소한다. 일반적으로 콜라겐 분해는 Collagenase와 MMP-1의 발현으로 인해 이루어지며 외부 환경적인 요인에 의해 콜라겐의 변형이 가속화되면서 피부노화 현상을 야기한다.

최근 이러한 피부 노화현상을 억제하기 위한 기능성 화장품에 관한 개발이 활발하게 이루어지고 있으며, 그 중에서도 인체에 안전한 생약추출물을 제조하고 이를 화장료로 이용하고자 하는 시도가 계속되고 있다.

본 발명자들은 산삼배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼을 전통주 발효기법에 따라 발효시킨 후, 다시 삼나무 통에서 저온 숙성 과정을 거쳐 제조하는 혼합발효추출물의 제조에 관하여 연구한 바 있으며, 이에 관하여 특허등록 받은 바 있다(특허등록 10-1525873).

본 발명자들은 추가적으로 새로운 발효방법에 관하여 연구하였으며, 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼 복합물을 특정한 발효균주를 사용하여 순차적으로 다단발효함으로써 항산화, 피부주름개선, 염증완화효과가 우수한 추출물을 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0132066호(2015.11.25) 대한민국 등록특허 제10-1525873호(2015.05.29)

다단발효에 의해 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼 복합발효추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 방법에 의하여 제조되어 안정성이 높고, 피부 보습효과, 주름개선효과, 염증완화 효과가 우수한 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼의 복합발효추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, (A) 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 곡물 및 정제수를 혼합하는 단계; (B) 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼을 혼합하여 삼베포에 싸서 상기 혼합물에 묻어 28~32℃에서 10~20시간 발효시키는 단계; (C) 상기 발효물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 혼합하여 40~50℃에서 20~30시간 발효시키는 단계; (D) 상기 발효물에 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)를 혼합하여 35~45℃에서 20~30시간 발효시키는 단계; (E) 상기 발효물에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 혼합하여 20~30℃에서 45~55시간 발효시키는 단계; (F) 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)을 혼합하여 38~42℃에서 10~20시간 발효시키는 단계; (G) 상기 발효물을 용매로 추출하는 단계; 및 (H) 상기 추출물을 삼나무통에서 2~8℃에서 7~10일간 숙성하는 단계를 포함하는 생약복합발효추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 (A)단계에서 곡물 및 정제수는 각각 25~45중량% 및 정제수 55~75중량%의 비율로 사용하는 것이 바람직하며, 상기 곡물로는 쌀, 보리, 밀 중 적어도 한 가지를 사용할 수 있다.

상기 (B)단계에서, 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼은 건조중량으로 각각 1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2로 혼합하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 동일중량비로 혼합하는 경우에 피부개선활성이 우수하였다.

상기 (G)단계에서 추출용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 용매를 사용한다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 상기 생약복합발효추출물을 조성물 전체 중량에 대하여, 0.001~10중량% 함유하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 화장료 조성물은 항산화용, 피부주름 개선용 또는 피부 염증 완화용임을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 제조방법에 의하여 제조되는 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼 복합발효추출물은 제형 내에서 우수한 항산화 효과, 피부 주름개선효과 및 염증완화효과를 나타내므로 항노화용 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 생약복합발효추출물의 콜라겐 생합성 촉진효과를 나타내는 그래프이고,
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 생약복합발효추출물의 MMP-1 생성억제효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 항노화 활성을 가지는 생약재인 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼을 5단계로 다단발효하고, 이후 삼나무 통에서 저온 숙성시켜 항노화 활성이 우수한 복합발효추출물을 제조하는 기술에 관한 것이다.

현삼(Scrophularia burgeriana)은 약재용으로 가꾸기도 하는 여러해살이 풀이다. 네모진 줄기는 곧게 1.5m 안팎의 높이로 자라며 윗부분에서 약간의 가지를 친다. 잎은 계란 꼴로서 마디마다 2장이 마주 자리한다. 잎 끝은 뾰족하고 밑동은 둥글며 잎자루를 가지고 있다. 잎 가장자리에는 날카로운 톱니가 규칙적으로 배열된다. 줄기 끝과 끝에 가까운 부분의 잎 겨드랑이로부터 기다란 꽃대가 자라나 많은 꽃이 피어나는데 꽃차례는 홀쭉한 원뿌리꼴로 생겼다. 꽃은 단지와 같은 외모를 가지고 있으며, 입술과 같은 모양으로 끝이 갈라지고 아래의 입술은 뒤로 말린다. 꽃의 길이는 6~7mm 정도이며 빛깔은 황록색이다. 식물체 전체에 헤스페리딘(Hesperidin)과 디오스민(Diosmin)등의 배당체를 함유한다.

단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)은 뿌리줄기는 짧고 거칠며 끝부분에 보통 줄기 자국이 남아 있다. 뿌리는 긴 원통형으로 여러 개로 갈라져 있으며 바깥 면은 적갈색 또는 어두운 적갈색이고 거칠고 세로 주름이 있다. 오래된 것은 자갈색을 띠며 보통 비늘 모양의 것이 떨어져 나온다. 특이한 향기가 있고, 약성은 쓰고 떫으며 약간 차다. 약리작용은 관상동맥 확장, 콜레스테롤 강하, 혈압 강하, 간기능 활성화, 진정 항염, 항암, 항균작용이 보고되었다.

고삼(Sophora flavescens)은 도둑놈의 지팡이, 너삼, 뱀의 정자나무라고도 한다. 양지 바른 풀밭에서 자란다. 높이 80~100cm로 녹색이지만 어릴 때는 검은빛을 띤다. 줄기는 곧고 잎은 어긋나며 홀수깃꼴 겹잎이다. 작은 잎은 15~40개이고 긴 타원형 또는 긴 달걀 모양이며 길이 2~4cm, 너비 7~15mm이다. 잎자루가 길며 가장자리는 밋밋하다. 한방에서는 뿌리를 말린 것을 고삼이라 한다.

사삼(Adenophora triphylla var. japonica Hara)은 생김새는 방추형이나 긴 원추형이며 구부러졌고 간혹 가지뿌리가 있다. 위쪽에 윤상의 가로주름이 있는 뿌리줄기가 있다. 뿌리는 가볍고 꺾어지기 쉬우며 꺾은 면은 유백색을 띠고 빈틈이 많다. 이 약은 특이한 방향이 있고 씹으면 점액성이 있으며, 맛은 조금 달고 성질은 조금 차다. 약리작용으로 거담작용, 항균작용, 용혈작용, 강심작용 등이 보고되었다.

만삼(Codonopsis pilosula)은 깊은 산속에서 자란다. 자르면 즙이 나온다. 뿌리는 도라지 모양이며 길이 약 30cm이다. 잎은 어긋나지만 짧은 가지에서는 마주나고, 달걀 모양 또는 달걀 모양 타원형이며 양면에 잔털이 나고 뒷면은 흰색이다. 잎 길이 1~5cm, 너비 1~3.5cm이고 잎자루는 길이 2~3cm로 털이 난다. 뿌리를 당삼(黨蔘) 또는 삼이라고 하며 거담제로 사용하거나 식용한다.

단너삼(Hedysarum ussuriensis)은 산지의 바위틈에서 자란다. 높이 40~70cm이며 전체에 흰색의 부드러운 잔털이 있다. 줄기는 총생(叢生)하며, 잎은 6~11쌍의 작은 잎으로 이루어진 홀수 1회 깃꼴 겹잎이다. 작은 잎은 길이 약 1~2 cm로 달걀 모양의 타원형이며 잎 가장자리는 밋밋하다. 일반적으로 약초로서 재배하며 한방에서는 가을에 채취하여 노두(蘆頭)와 잔뿌리를 제거하고 햇빛에 말린 것을 한약재의 황기라 하며, 강장, 이뇨(利尿), 소종(消腫)등의 효능이 있다.

본 발명에서 사용되는 상기 생약재들은 정제수로 깨끗이 세척한 후 사용한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 다음과 같은 방법으로 복합발효추출물을 제조한다.

(A) 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 곡물 및 정제수를 혼합하는 단계; (B) 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼을 혼합하여 삼베포에 싸서 상기 혼합물에 묻어 28~32℃에서 10~20시간 발효시키는 단계; (C) 상기 발효물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 혼합하여 40~50℃에서 20~30시간 발효시키는 단계; (D) 상기 발효물에 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)를 혼합하여 35~45℃에서 20~30시간 발효시키는 단계; (E) 상기 발효물에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 혼합하여 20~30℃에서 45~55시간 발효시키는 단계; (F) 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)을 혼합하여 38~42℃에서 10~20시간 발효시키는 단계; (G) 상기 발효물을 용매로 추출하는 단계; 및 (H) 상기 추출물을 삼나무통에서 2~8℃에서 7~10일간 숙성하는 단계를 포함하는 생약복합발효추출물의 제조방법이 제공된다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 먼저 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 곡물, 정제수를 혼합한다. 이때 곡물 및 정제수는 각각 25~45중량% 및 정제수 55~75중량%의 비율로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 곡물로는 쌀, 보리, 밀 또는 그 혼합물을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 쌀을 사용할 수 있다.

이어서, 세척한 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼을 세척, 건조 후 일정한 간격으로 슬라이스한다. 준비된 생약제를 건조중량으로 각각 1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2:1~2로 혼합하고 삼베포에 싼다. 생약재를 싼 삼베포를 상기 혼합물에 묻어 28~32℃에서 10~20시간 발효시킨다. 이때 상기 생약재를 동일중량비로 혼합하는 경우에 피부개선활성이 더욱 우수하였다.

이어서, 상기 발효물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 혼합하여 40~50℃에서 20~30시간 다시 발효시킨다. 이와 같은 발효에 의해서 발효물 내의 고분자물질이 분해된다.

상기 발효공정 후에 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)를 상기 발효물에 혼합하여 35~45℃에서 20~30시간 발효시킨다. 이를 통해서 잡균 번식이 억제된다.

이어서, 상기 발효물에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 혼합하여 발효과정을 종결하기 위하여 20~30℃에서 45~55시간 발효시킨다.

마지막으로 상기 발효물에 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)을 혼합하여 38~42℃에서 10~20시간 발효시켜 유효물질을 유지시킨다.

이와 같은 5단 발효공정을 거친 후, 삼베포를 꺼내어 상기 발효물을 용매로 추출한다. 이때, 추출용매로는 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종 이상의 용매를 사용한다. 통상의 추출방법에 따라 추출할 수 있으며, 본 발명의 일구체예에 따르면, 1~80배 부피량의 30%(V/V) 에탄올을 부가하여 90~95℃에서 2~3시간 중탕시켜 추출한다.

삼나무는 일본 원산의 상록교목으로 제주도 지방과 남부지방에 분포하며 생리활성 연구 등 부가가치를 높이기 위한 연구가 활발이 진행되고 있다. 삼나무의 주요성분으로는 15개의 탄소로 이루어진 세스키테르펜류가 있으며 피부사상균에 대한 항진균, 항바이러스 작용을 하는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 상기 생약재 복합발효추출물의 항노화 활성을 증진시키기 위하여, 발효가 끝난 상기 추출물을 삼나무통에 담아 7~10일간 2~8℃에서 숙성한다.

이와 같이 다단 발효 및 삼나무 통에서의 숙성과정을 거침으로서 본 발명의 상기 생약복합발효추출물은 항노화 활성성분이 증대되어, 항산화, 콜라겐 생성, TNF-α 생성억제, MMP-1의 발현 억제 효과가 우수함을 확인하였다.

상기 생약복합발효추출물을 조성물 전체 중량에 대하여, 0.001~10중량% 함유된다.

본 발명의 화장료를 함유하는 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형의 형태로 제조할 수 있다. 유화 제형의 화장품으로는 영양화장수, 크림, 에센스 등이 있으며, 가용화 제형의 화장품으로는 유연화장수가 있다.

본 발명에서 상기 화장료 조성물의 제형은 제한되지는 않으나 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징 폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 및 아이섀도로 구성된 그룹에서 선택된 어느 하나의 제형으로 적용되어질 수 있다.

[실시예]

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 시험예에 의거하여 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명은 하기 실시예에 의해 한정되는 것이 아니다.

실시예 1: 생약복합발효추출물 제조

도기 항아리에 쌀 700g, 정제수 1050g을 넣고, Aspergillus oryzae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL을 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 슬라이스된 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼, 단너삼을 건조중량 1:1:1:1:2:2:2로 혼합하고, 삼베보자기에 싸서 상기 혼합물에 묻고 30℃에 12시간동안 발효 시켰다. 획득한 발효물에 Bacillus subtilis(1×10⁶ CFU/mL) 10mL을 혼합하여 45℃에서 24시간동안 발효시켰다. 이어서 Lactobacillus bulgaricus(2×10⁶ CFU/mL) 10mL을 혼합하여 잡균번식을 억제하기 위하여 40℃에서 24시간 동안 발효시켰다. 획득한 발효물에 Saccharomyces cerevisiae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL을 혼합하여 발효과정을 종결하기 위하여 27℃에서 48시간 동안 발효시켰다. 이어서 Bifidobacterium bifidum(5×10⁶CFU/mL) 10mL을 혼합하여 유효물질을 유지하기 위하여 40℃에서 12시간 동안 발효시켰다.

발효물을 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 추출물을 삼나무 통에서 7일간 5℃에서 저온숙성 시켰다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍와트만 GFC 150mm여과지로 2번 여과하여 복합발효추출물을 제조하였다.

실시예 2: 생약복합발효추출물 제조

도기 항아리에 쌀 700g, 정제수 1050g을 넣고, Aspergillus oryzae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL을 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 슬라이스된 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼, 단너삼을 건조중량 2:2:2:1:1:1:1로 혼합하고, 삼베보자기에 싸서 상기 혼합물에 묻고 30℃에 12시간동안 발효 시켰다. 획득한 발효물에 Bacillus subtilis(1×10⁶ CFU/mL) 10mL을 혼합하여 45℃에서 24시간동안 발효시켰다. 이어서 Lactobacillus bulgaricus(2×10⁶ CFU/mL) 10mL을 혼합하여 잡균번식을 억제하기 위하여 40℃에서 24시간 동안 발효시켰다. 획득한 발효물에 Saccharomyces cerevisiae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL을 혼합하여 발효과정을 종결하기 위하여 27℃에서 48시간 동안 발효시켰다. 이어서 Bifidobacterium bifidum(5×10⁶CFU/mL) 10mL을 혼합하여 유효물질을 유지하기 위하여 40℃에서 12시간 동안 발효시켰다.

실시예 3: 복합발효추출물 제조

도기 항아리에 쌀 700g, 정제수 1050g을 넣고, Aspergillus oryzae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL을 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 슬라이스된 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼, 단너삼을 건조중량 1:1:1:1:1:1:1로 혼합하고, 삼베보자기에 싸서 상기 혼합물에 묻고 30℃에 12시간동안 발효 시켰다. 획득한 발효물에 Bacillus subtilis(1×10⁶ CFU/mL) 10mL을 혼합하여 45℃에서 24시간동안 발효시켰다. 이어서 Lactobacillus bulgaricus(2×10⁶ CFU/mL) 10mL을 혼합하여 잡균번식을 억제하기 위하여 40℃에서 24시간 동안 발효시켰다. 획득한 발효물에 Saccharomyces cerevisiae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL을 혼합하여 발효과정을 종결하기 위하여 27℃에서 48시간 동안 발효시켰다. 이어서 Bifidobacterium bifidum(5×10⁶CFU/mL) 10mL을 혼합하여 유효물질을 유지하기 위하여 40℃에서 12시간 동안 발효시켰다.

발효물을 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 추출물을 삼나무 통에서 7일간 5℃에서 저온숙성 시켰다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍와트만 GFC 150mm여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

실시예 4: 복합발효추출물 제조

도기 항아리에 쌀 700g, 정제수 1050g을 넣고, Aspergillus oryzae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL을 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 슬라이스된 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼, 단너삼을 건조중량 1:1:2:2:2:1:1로 혼합하고, 삼베보자기에 싸서 상기 혼합물에 묻고 30℃에 12시간동안 발효 시켰다. 획득한 발효물에 Bacillus subtilis(1×10⁶ CFU/mL) 10mL을 혼합하여 45℃에서 24시간동안 발효시켰다. 이어서 Lactobacillus bulgaricus(2×10⁶ CFU/mL) 10mL을 혼합하여 잡균번식을 억제하기 위하여 40℃에서 24시간 동안 발효시켰다. 획득한 발효물에 Saccharomyces cerevisiae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL을 혼합하여 발효과정을 종결하기 위하여 27℃에서 48시간 동안 발효시켰다. 이어서 Bifidobacterium bifidum(5×10⁶CFU/mL) 10mL을 혼합하여 유효물질을 유지하기 위하여 40℃에서 12시간 동안 발효시켰다.

비교예 1: 발효추출물 제조

도기 항아리에 쌀 700g, 정제수 1050g을 넣고, Aspergillus oryzae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL, Saccharomyces cerevisiae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL 및 Bacillus subtilis(1×10⁶ CFU/mL) 10mL을 첨가하여 혼합물을 제조하였다.

건조 후 슬라이스된 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼, 단너삼을 건조중량 1:1:1:1:1:1:1로 혼합하여 삼베보자기에 싸서 상기 혼합물에 묻고 30℃에 24시간동안 발효시켰다.

비교예 2: 발효추출물 제조

도기 항아리에 쌀 700g, 정제수 1050g을 넣고, Aspergillus oryzae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL을 첨가하여 혼합물을 제조하였다.

건조 후 슬라이스 된 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼, 단너삼을 건조중량 1:1:1:1:1:1:1로 혼합하여 삼베보자기에 싸서 상기 혼합물에 묻고 35℃에 3일간 발효 시켰다.

비교예 3: 삼나무통 숙성과정을 거치지 않은 발효추출물 제조

도기 항아리에 쌀 700g, 정제수 1050g을 넣고, Aspergillus oryzae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL을 첨가하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 슬라이스된 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼, 단너삼을 건조중량 1:1:1:1:1:1:1로 혼합하여 삼베보자기에 싸서 상기 혼합물에 묻고 30℃에 24시간동안 발효 시켰다. 획득한 발효물에 Bacillus subtilis(1×10⁶ CFU/mL) 10mL을 혼합하여 45℃에서 24시간동안 발효시켰다. 이어서 Lactobacillus bulgaricus(2×10⁶ CFU/mL) 10mL을 혼합하여 잡균번식을 억제하기 위하여 40℃에서 24시간 동안 발효시켰다. 획득한 발효물에 Saccharomyces cerevisiae(1×10⁶ CFU/mL) 20mL을 혼합하여 발효과정을 종결하기 위하여 27℃에서 48시간 동안 발효시켰다. 이어서 Bifidobacterium bifidum(5×10⁶CFU/mL) 10mL을 혼합하여 유효물질을 유지하기 위하여 40℃에서 12시간 동안 발효시켰다.

발효물을 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍와트만 GFC 150mm여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

시험예 1: DPPH free radical 소거능 측정

DPPH free radical 소거능은 Nanjo et al.(1996)의 방법에 따라 측정하였다. 시료 30 μL에 60μM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 30μL를 혼합 후, 반응액을 100μL quartz capillary tube에 옮겨 2분 후 electron spin resonance(ESR) spectrometer(JES-FA, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)로 측정하였다. 실험조건은 다음과 같다.

Magnetic field, 336.5±mT;power, 5mW; modulation frequency, 9.41 GHz; amplitude, 1×1,000; sweep time, 30 s; temperature, 298 K.

DPPH radical 소거능은 H와 H₁의 상대적인 radical signal peak 높이의 차에 의하여 계산하였다. 결과는 표 1에 나타나있다.

DPPH free radical scavenging activity( % )=(1-H/H₁)×100

시험예 2: Superoxide radical 소거능 측정

Superoxide radical은 Guo et al.(1990)에 따라 시료 10μL에 0.3mM riboflavin 10μL, 800mM DMPOμL를 첨가 후 365nm의 UV lamp에서 1분 동안 조사하였다. 반응물은 qurtz capillary tube에 옮긴 후, ESR spectrometer를 이용하여 분석하였으며 실험조건은 다음과 같다.

magnetic field, 336.5±5 mT; power, 10mW; modulation frequency, 9.41 GHz; amplitude, 1×1,000; sweep time, 30 s; temperature 298 K.

Superoxide radical scavenging activity( % )=(1-H/H₁)×100

구분	Radical scavenging activity (%) at concentration 2.5mg/mL
구분	DPPH	Superoxide radical
실시예 1	71.45±1.25	64.44±0.87
실시예 2	69.41±1.01	62.42±0.22
실시예 3	79.05±0.54	72.05±0.74
실시예 4	68.41±0.98	59.54±0.84
비교예 1	65.12±0.55	62.45±0.25
비교예 2	57.52±0.12	50.24±0.45
비교예 3	58.86±0.21	52.42±0.28

상기 표 1에서 확인되는 바와 같이 라디칼 소거능 효과에 있어서, 5단 발효공정 후 삼나무 통에서 숙성시킨 본 발명 실시예의 복합발효추출물은 복합균주에 의한 1단 발효추출물인 비교예 1, 단일 균주에 의한 발효추출물인 비교예 2, 참나무통 숙성을 거치지 않은 비교예 3에 비하여 우수한 효과를 나타내었다. 따라서 본 발명의 상기 다단발효 및 참나무통 숙성에 의하여 항산화 활성이 상승하였음을 확인할 수 있다.

시험예 3: 콜라겐 생합성 촉진 효과 시험

사람의 정상 섬유아세포(CCD-986sk cell)를 48-well plate에 1×10⁵cells/well되게 접종하고 24시간 배양하였다. 상기 실시예 및 비교예의 추출물을 serum이 없는 DMEM 배지에 농도별로 첨가하여 교체한 후 24시간 동안 더 배양하여 세포 배양액을 취하였다. 세포 배양액 내 콜라겐 양은 procollagen type I C-peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio, Japan)을 사용하여 정량하였다. 측정된 콜라겐 양은 Lowry assay로 구한 총 단백질 양으로 보정하였다. 그 결과를 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다.

시료 농도 ㎍/㎖	procollagen 발현율(%)
	실시예				비교예			TGF-β
	1	2	3	4	1	2	3	TGF-β
0	2.61	2.61	2.61	2.61	2.61	2.61	2.61	2.61
100	43.40	48.85	50.96	45.54	19.94	24.45	21.26	43.81
500	58.63	58.41	59.85	55.47	39.94	50.74	46.25	60.73
1000	89.51	96.05	98.84	90.45	68.19	58.73	63.64	98.96

실시예 2와 3에서 우수한 효과를 나타내었으며, 특히 실시예 3에서 가장 우수한 콜라겐 생합성 촉진효과를 나타내었다.

시험예 4: TNF-α 생성량

염증매개인자 발현억제 효과를 확인해 보기 위해 초기 염증성 분자 중 하나인 종양괴사인자(TNF-α) 생성에 대한 효과를 알아보았다. 실험에 사용된 세포는 HaCaT(Human Skin Keratinocytes cell line)이며 37℃, 5%의 CO₂, 10%의 Fetal bovine serum(FBS, Lonza), 50μg/mL의 streptomycin(Sigma)을 첨가한 Dulbecco's modified Eagle's medium(DMEM, Invitrogen)에서 배양하였다. 배양 후 1시간 동안 UV를 조사시켜 세포에 스트레스를 주었다. 대조구로는 시료를 처리하지 않고 UV를 조사한 세포를 사용하였다.

TNF-α는 macrophage와 fibroblast에 의해 분비되어 endothelial cell, neutrophil 및 B cell 등을 자극함으로써 chemokines, prostaglandins, proteases 및 growth factors 등의 분비를 촉진하는데, UV에 의해서 유의하게 증가된 HaCaT cell의 TNF-α를 하기 표 3에서 보는 바와 같이 실시예 3에서 가장 효과적으로 감소시킴을 확인하였다.

시

시료 농도 ㎍/㎖	TNF-α 발현율(%)
	실시예				비교예			UV 조사
	1	2	3	4	1	2	3	UV 조사
0	62.47	54.25	50.25	61.48	69.45	68.45	72.44	100
500	41.74	29.45	28.95	40.74	42.22	46.87	47.01
1000	10.04	9.44	8.76	10.89	11.04	12.17	10.09

시험예 5: MMP -1 생성 억제 효과 시험

사람의 정상 섬유아세포(CCD-986sk cell)를 48-well plate에 1×10⁵cells/well되게 접종하고 24시간 배양하였다. 상기 실시예 및 비교예의 시료를 serum이 없는 DMEM 배지에 농도 별로 첨가하여 교체한 후 24시간 동안 더 배양하여 세포 배양액을 취하였다. 세포 배양액 내 MMP-1 양은 배양액을 취하여 MMP-1 assay kit(Amersham, USA)를 사용하여 측정하고, 하기식에 따라 MMP-1 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 4 및 도 2에 나타내었다. 이때, MMP-1 생성 억제율의 양성 대조군으로 transforming growth factor-β(TGF-β)을 사용하였다.

시료 농도 ㎍/㎖	MMP-1 생성억제율(%)
	실시예				비교예			TGF-β
	1	2	3	4	1	2	3	TGF-β
50	19.8	17.0	21.7	20.2	15.8	19.7	17.8	22.6
100	40.2	46.6	47.5	45.9	45.2	32.1	42.5	48.1
500	60.8	63.5	64.8	62.9	53.1	39.4	50.8	65.3
1000	80.7	79.2	82.9	82.4	60.4	42.8	53.2	83.6

MMP-1 생성 억제 효과를 살펴본 결과, 실시예 3과 실시에 4에서 MMP-1 생성 억제 효과가 더 우수하였다.

실시예 5: 복합발효추출물을 함유하는 로션 제조

상기 실시예 3과 비교예 1의 추출물을 포함한 크림을 하기 표 5의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성 분	함량(중량%)
성 분	대조예	실시예 5	비교예 4
복합발효추출물(실시예 3)	-	1.0	-
발효추출물(비교예 1)	-	-	1.0
밀납	1.0	1.0	1.0
폴리솔베이트 60	1.5	1.5	1.5
솔비탄세스퀴올레이트	0.6	0.6	0.6
유동 파라핀	10.0	10.0	10.0
소르비탄 스테아레이트	1.0	1.0	1.0
스테아린산	1.5	1.5	1.5
글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0	1.0	1.0
프로필렌글리콜	1.0	1.0	1.0
카르복시폴리머	3.0	3.0	3.0
트리에탄올아민	0.2	0.2	0.2
방부제, 향, 색소	미량	미량	미량
정제수	잔량	잔량	잔량
합계	100	100	100

시험예 6: 피부 주름 개선 효과 확인

7가지의 삼을 사용하여 다단발효 추출한 화장료 조성물의 피부주름 개선효과를 확인하기 위하여 건강한 35세에서 55세의 여성 30명을 대상으로 시험하였다.

피부 주름 개선 효과를 확인하기 위해, 각 10명씩 나누어 상기 대조예, 비교예 및 실시예의 제형을 안면부에 하루 2회씩(아침 및 저녁) 4주간 도포하였다. 4주 후 주름의 개선 정도를 주름의 영상 분석을 통해 평가하였다.

주름의 영상분석에 의한 평가는 실험이 시작되기 전 눈 밑의 레플리카를 채취하고 실험이 종료된 직후의 레플리카를 눈 밑의 동일 부위에서 채취하여 영상분석을 통해 주름의 2차원적 분석으로 주름의 밀도를 측정하였다. 영상분석에 의한 주름 밀도의 측정 결과는 사용 전과 비교한 주름 밀도에 대한 감소율로 하기의 표 6에 나타내었다.

구분	주름 밀도 감소율 (%)
대조예	8
실시예 5	37
비교예 4	33

상기 표 6으로부터 확인되는 바와 같이, 7가지의 삼의 다단발효복합추출물을 포함한 실시예 5의 크림에서 대조군 및 비교예 4 보다 높은 주름 개선 효과를 나타내었다

실시예 6: 유연 화장수

7가지의 삼을 사용하여 다단발효 추출한 복합발효추출물(실시예 3)을 포함하는 유연 화장수를 하기의 표 7의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분(중량%)	실시예 6
복합발효추출물(실시예 3)	2.0
1,3-부틸렌 글리콜	5.2
올레일알코올	1.5
에탄올	3.2
폴리솔베이트 20	3.2
벤조페논-9	2.0
카르복실비닐폴리머	1.0
글리세린	3.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

Claims

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(A) 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae), 곡물 및 정제수를 혼합하는 단계; (B) 인삼, 현삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 단너삼을 혼합하여 삼베포에 싸서 상기 혼합물에 묻어 28~32℃에서 10~20시간 발효시키는 단계; (C) 상기 발효물에 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 혼합하여 40~50℃에서 20~30시간 발효시키는 단계; (D) 상기 발효물에 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus)를 혼합하여 35~45℃에서 20~30시간 발효시키는 단계; (E) 상기 발효물에 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 혼합하여 20~30℃에서 45~55시간 발효시키는 단계; (F) 상기 발효물에 비피도박테리움 비피둠(Bifidobacterium bifidum)을 혼합하여 38~42℃에서 10~20시간 발효시키는 단계; (G) 상기 발효물을 용매로 추출하는 단계; 및 (H) 상기 추출물을 삼나무통에서 2~8℃에서 7~10일간 숙성하는 단계를 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 생약복합발효추출물을 조성물 전체 중량에 대하여, 0.001~10중량% 함유하는 항산화 및 피부염증 완화용 화장료 조성물.
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