KR101525873B1 - 산삼 배양근, 단너삼, 고삼 및 사삼을 포함하는 2단 발효추출물 제조방법 및 이를 이용한 피부 개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼 혼합발효추출물의 제조에 관한 것으로, 본 발명에 따른 혼합발효추출물은 콜라겐 및 TIMP-1의 발현, 트로포엘라스틴의 발현, MMP-1의 발현 억제 효과가 우수하여 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 항노화 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

산삼 배양근, 단너삼, 고삼 및 사삼을 포함하는 2단 발효추출물 제조방법 및 이를 이용한 피부 개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition containing Manufacturing method and Cultured wild Ginseng Roots, Hedysarum ussuriensis, Sophora flavescens and Adenophora triphylla by two-stage fermentation for improving skin}

본 발명은 안전성이 우수하면서 항노화 효과가 있는 혼합발효추출물의 제조에 관한 것으로, 구체적으로는 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼을 전통주 발효기법에 따라 발효시킨 후, 다시 삼나무 통에서 저온 숙성 과정을 거쳐 제조하는 혼합발효추출물의 제조방법 및 이를 유효성분으로 포함하여 우수한 항노화 활성을 가지는 항노화 화장료 조성물에 관한 것이다.

생체 내에서 발생하는 hydroxyl radical(·OH), superoxide anion(·O₂ ^-), hydrogen peroxide(H₂O₂) 등과 같은 활성산소종(Reactive Oxygen Species;ROS)에 의한 산화적 대사 부산물은 노화의 중요한 원인이 된다는 것이 알려져 있다(Comporti 1993). 이들 ROS는 세포막 지방질을 과산화시키고 세포막투과성의 변화를 초래하여 DNA 손상을 유발시켜 노화를 일으킨다(Meneghini et al., 1993). 사람 피부의 노화는 나이가 많아짐에 따라 섬유아세포 수가 감소하게 되면서 나타나게 된다. 또한 자외선, 기후, 흡연 등에 의해 여러 가지 신호체계가 활성화됨으로써 염증반응이 일어나고 피부 구성성분이 손상되면서 피부노화가 진행된다(Parrado et al., 1999). 자외선에 의해 손상 받은 피부는 콜라겐의 양이 감소되어 있는데, 이는 자외선에 의해 피부 내에서 MMPs(matrix metalloproteinase)의 발현이 증가하기 때문이며, 이러한 MMPs는 피부 광노화 발생에 중요한 역할을 한다(Fisher et al., 1999). MMPs는 피부의 세포들(keratinocytes, fibroblasts)로부터 분비되어 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)과 기저막(basement membrane, BM)을 구성하는 대부분의 단백질 성분을 분해함으로써 피부 탄력을 유지하는 결합조직을 파괴하여 주름과 탄력저하 및 피부 처짐의 원인이 되는 것으로 알려져 있다(Wang et al., 1999). 최근에 노화에 따른 MMPs의 증가와 관련된 세포 신호 전달 경로는 주로 MAP 키나제 경로(stress-activated mitogen-activated protein(MAP) kinase pathway)가 관여 한다고 보고되어 있으며(Hearing VJ. 1999), MAP 키나제 경로(MAP kinase pathway)에서 가장 많은 영향을 받는 AP-1(activator protein-1) 인자는 세포의 성장과 분화에 관련되는 많은 유전자의 발현을 조절하고 몇몇 MMPs의 발현을 강력하게 조절한다(Fisher et al., 1996). MMPs는 활성 중심부에 아연을 가지는 금속단백분해효소로 생체 내에서 잠재성 전효소(zymogen) 형태로 분비되고, 효소활성을 가지기 위해서 구조적 변형이 일어나 아미노 말단 부위가 절단, 활성화 되며 α2-macroglobulin이나 TIMPs(tissue inhibitors of metalloproteinase) 같은 저해제에 의해 활성이 조절된다(Fisher et al., 1999). 최근 연구에서 주름형성에 있어서 콜라겐 이외에 탄력섬유인 엘라스틴(elastin)과 엘라스틴 분해에 관여하는 효소인 엘라스타제(elastase)에 대해서도 많은 연구가 진행되고 있는 것으로 보고되고 있다(Antonicelli et al., 2007; Isenburg et al., 2004; Seite et al., 2006). 특히, 만성적인 UV 조사에 의해 사람의 피부 표피의 각질형성세포(keratinocytes)에서도 엘라스틴의 전구체인 tropoelastin mRNA 발현이 증가한다는 보고가 있었으며(Seo et al., 2001), 선택적인 엘라스타제 활성의 억제를 통한 주름형성에서 엘라스타제의 역할이 보고되기도 하였다(Tsuji et al., 2001).

멜라닌은 피부와 머리카락의 색상을 결정하는 주요한 인자이며 자외선으로부터 피부세포를 보호하기 위한 역할을 하며, 태양 광선으로부터 들어오는 자외선을 차단하는 색소이다. 이러한 멜라닌의 생성은 기저층의 멜라닌세포(melanocyte)내 멜라닌소체(melanosome)라는 소기관에서 합성된다(Hearing, 1999). 합성된 멜라닌색소는 멜라닌세포의 수지상돌기(dendrite)를 통하여 인접세포인 각질세포(keratinocyte)로 전달되며, 전달된 멜라닌색소는 각질세포를 통하여 피부 내 여러 부위에 분포하게 된다(Lowell, 1991). 그러나 멜라닌이 비정상적으로 소량 생산되면 백반증과 같은 피부병변이 유발되고, 반대로 일광, 호르몬 변화, 염증 또는 약제 등 여러 가지 환경적 요인에 의해 멜라닌이 과도하게 합성되거나 색소가 침착되면 기미, 주근깨를 형성한다 (Lim et al., 2010; Park et al., 1998). 이와 같은 병변으로부터 나아가 피부암의 원인이 되기도 한다. 그러므로 이러한 색소 침착 현상을 방지하고 미백효과를 얻기 위해서는 멜라닌 생성 과정의 일 부분을 저해하여 멜라닌의 생성을 감소시켜야 한다. 이 멜라닌 생성에 있어서 가장 중요한 역할을 하는 효소가 바로 티로시나제(tyrosinase)이며, 멜라노좀(melanosome) 내의 티로신(tyrosine)을 산화시켜 DOPA(3,4-dihydroxyphenylalanine)를 만드는 티로신 수산화효소(tyrosine hydroxylase)로 DOPA를 산화시켜 도파크롬(dopachrome)을 만드는 DOPA 옥시다제(oxidase)로 작용하여 최종적으로 멜라닌 폴리머(melanin polymer)를 합성하게 된다. 따라서 피부 미백제의 개발에 있어서 티로시나제(tyrosinase)활성 억제 실험은 유용한 일차 평가법으로 인정되고 있다(Pavel and Muskiet 1980; Prota 1990).

피부노화와 같은 미용과 건강에 관한 관심이 생활수준 향상으로 급증하는 가운데 기능성 화장품을 개발하려는 연구가 활발해지고 있다. 식품의약품안전청의 기능성화장품 고시 품목으로서 주름개선 소재로 대표적으로 사용되는 레티놀(비타민 A), AHA(a-hydroxy acid), 아데노신 등은 콜라겐의 합성을 증가시키고 표피 각화 과정을 정상화시켜 피부재생에 기여하는 물질로 많이 사용되고 있지만 빛과 열에 불안정하고 피부에 자극이 있는 것으로 알려져 있다. 그리고 미백 기능성화장품의 경우 닥나무추출물, 알부틴(arbutin), 에칠아스코빌에텔, 유용성 감초추출물, 아스코빌글루코사이드와 마그네슘아스코빌포스페이트가 있다.

이에 본 발명자들은 상기한 문제점을 해결하고자 천연소재로부터 항노화 효능을 평가 확인하고 이에 따라 피부 안전성이 확보된 새로운 천연 항노화 화장료 조성물을 개발하고자 하였으며, 이에 본 발명을 완성하였다.

(0001) 대한민국 공개특허 10-2011-0063269 (2011.06.10) (0002) 대한민국 공개특허 10-2014-0055049 (2014.05.09) (0003) 대한민국 공개특허 10-2013-0059640 (2013.06.07)

본 발명은 항노화 활성이 우수한 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼의 혼합발효추출물 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조되어 항노화 활성이 우수한 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼의 혼합발효추출물을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, (A)누룩, 곡물 및 정제수를 혼합하는 단계; (B)건조된 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼을 혼합하여 삼베포에 싸서 상기 혼합물에 묻는 단계; (C)35~60℃에서 2~3일간 발효시키는 단계; (D)상기 발효물을 추출하는 단계; 및 (E)상기 추출물을 삼나무 통에 담아 7~10일간 2~8℃에서 숙성하는 단계를 포함하는 혼합발효추출물의 제조방법이 제공된다.

상기 (A)단계에서 누룩, 곡물 및 정제수의 혼합물은 누룩 1~6중량%, 곡물 30~50중량% 및 정제수 45~65중량%로 이루어지는 것이다. 상기 곡물로는 쌀, 보리 및 밀로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 쌀이 사용된다.

상기 (B)단계에서, 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼은 건조 중량으로 1 : 1 : 1 : 1 : 1~1.5 : 1~1.5 : 1~1.5의 비율로 혼합되는 것이며, 더욱 바람직하게는 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1 : 1로 혼합되는 것이다.

상기 (D)단계에서, 추출은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것이다.

상기 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명에 따르면, 상기 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼의 혼합발효추출물이 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001 ~ 10 중량% 포함되는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 화장료 조성물은 피부주름개선, 피부미백용으로 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.

본 발명에 따른 혼합발효추출물은 DPPH free radical, Superoxide radical, Alkyl radical 및 Hydroxyl radical의 소거능과 콜라겐 생성효과, TIMP-1의 발현, 트로포엘라스틴의 발현 및 MMP-1의 발현 억제 효과가 우수하여 이를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 항노화 화장료로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 추출물들의 Collagen mRNA 유전자 발현에 대한 활성을 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 추출물들의 TIMP-1 mRNA 유전자 발현에 대한 활성을 나타내는 그래프이다.
도 3은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 추출물들의 Tropoelastin mRNA 유전자 발현에 대한 활성을 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 추출물들의 MMP-1 mRNA 유전자 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 추출물들의 MITF mRNA 유전자 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 실시예 및 비교예에 따른 추출물들의 Tyrosinase mRNA 유전자 발현 억제 효과를 나타내는 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명은 항노화 활성을 가지는 생약재인 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼을 1차적으로 전통주 발효기법에 따라 발효시키고, 다시 2차적으로 삼나무 통에서 저온 숙성시켜 항노화 활성이 우수한 혼합발효추출물을 제조하는 기술에 관한 것이다.

본 발명 혼합발효추출물의 원료인 산삼 배양근은 천연 야생산삼으로부터 조직을 분리하여 세포괴(callus)와 부정근을 단계별로 유도하고, 이들 뿌리 중에서 건실한 것을 선별한 후, 생물반응기를 이용하여 45~60일 가량 배양하여 생산되는 것이다. 이렇게 생산된 산삼 배양근은 야생 산삼과 매우 유사한 성분을 함유하고, 대체로 인삼보다 사포닌 함량이 높고, 인삼에서는 볼 수 없는 다양한 약리 성분을 함유하고 있다(Son et al., 1999).

현삼(Scrophularia burgeriana)은 약재용으로 가꾸기도 하는 여러해살이 풀이다. 네모진 줄기는 곧게 1.5m 안팎의 높이로 자라며 윗부분에서 약간의 가지를 친다. 잎은 계란 꼴로서 마디마다 2장이 마주 자리한다. 잎 끝은 뾰족하고 밑동은 둥글며 잎자루를 가지고 있다. 잎 가장자리에는 날카로운 톱니가 규칙적으로 배열된다. 줄기 끝과 끝에 가까운 부분의 잎 겨드랑이로부터 기다란 꽃대가 자라나 많은 꽃이 피어나는데 꽃차례는 홀쭉한 원뿌리꼴로 생겼다. 꽃은 단지와 같은 외모를 가지고 있으며, 입술과 같은 모양으로 끝이 갈라지고 아래의 입술은 뒤로 말린다. 꽃의 길이는 6~7mm 정도이며 빛깔은 황록색이다. 식물체 전체에 헤스페리딘(Hesperidin)과 디오스민(Diosmin)등의 배당체를 함유한다. 그리고 자음, 해열, 해독, 소종 등의 효능이 있으며, 고열이 있어 가슴이 답답하고 목이 마르는 증세, 고혈압, 편도선염, 임파선염, 혈전증, 결핵성임파선염, 인후염, 기관지염, 토혈, 식은땀을 흘리는 증세 등의 치료에 쓴다.

단삼(Salvia miltiorrhiza Bunge)은 뿌리줄기(근경)는 짧고 거칠며 끝부분에 보통 줄기 자국이 남아 있다. 뿌리는 긴 원통형으로 여러 개로 갈라져 있으며 바깥 면은 적갈색 또는 어두운 적갈색이고 거칠고 세로 주름이 있다. 오래된 것은 자갈색을 띠며 보통 비늘 모양의 것이 떨어져 나온다. 특이한 향기가 있고, 약성은 쓰고 떫으며 약간 차다. 약리작용은 관상동맥 확장, 콜레스테롤 강하, 혈압 강하, 간기능 활성화, 진정 항염, 항암, 항균작용이 보고되었다.

고삼(Sophora flavescens)은 도둑놈의 지팡이·너삼·뱀의 정자나무라고도 한다. 양지 바른 풀밭에서 자란다. 높이 80~100cm로 녹색이지만 어릴 때는 검은빛을 띤다. 줄기는 곧고 잎은 어긋나며 홀수깃꼴 겹잎이다. 작은 잎은 15~40개이고 긴 타원형 또는 긴 달걀 모양이며 길이 2~4cm, 너비 7~15mm이다. 잎자루가 길며 가장자리는 밋밋하다. 한방에서는 뿌리를 말린 것을 고삼이라 하는데, 맛이 쓰고 인삼의 효능이 있어 소화불량렘키延酉간염렸껜玭치질 등에 처방한다. 민간에서는 줄기나 잎을 달여서 살충제로 쓰기도 한다. 같은 속의 식물로 산두근(山豆根)이 있는데 생김새가 매우 비슷하다. 한국, 일본, 중국, 시베리아 등지에 분포한다.

사삼(Adenophora triphylla var. japonica Hara)은 생김새는 방추형이나 긴 원추형이며 구부러졌고 간혹 가지뿌리가 있다. 위쪽에 윤상의 가로주름이 있는 뿌리줄기가 있다. 뿌리는 가볍고 꺾어지기 쉬우며 꺾은 면은 유백색을 띠고 빈틈이 많다. 이 약은 특이한 방향이 있고 씹으면 점액성이 있으며, 맛은 조금 달고 성질은 조금 차다. 약리작용으로 거담작용, 항균작용, 용혈작용, 강심작용 등이 보고되었다. 그리고 사삼은 진액을 보충하여 폐를 윤택하게 하고 열을 식히며 담을 없애 인후건조, 마른기침, 가래, 해수, 천식 등에 쓰인다. 위음 부족으로 입안이 마르고 인후가 건조하며 대변이 굳는 변비 증상 등에 사용한다.

만삼(Codonopsis pilosula)은 깊은 산속에서 자란다. 자르면 즙이 나온다. 뿌리는 도라지 모양이며 길이 약 30cm이다. 잎은 어긋나지만 짧은 가지에서는 마주나고, 달걀 모양 또는 달걀 모양 타원형이며 양면에 잔털이 나고 뒷면은 흰색이다. 잎 길이 1~5cm, 너비 1~3.5cm이고 잎자루는 길이 2~3cm로 털이 난다. 뿌리를 당삼(黨蔘) 또는 삼이라고 하며 거담제로 사용하거나 식용한다.

단너삼(Hedysarum ussuriensis)은 산지의 바위틈에서 자란다. 높이 40~70cm이며 전체에 흰색의 부드러운 잔털이 있다. 줄기는 총생(叢生)하며, 잎은 6~11쌍의 작은 잎으로 이루어진 홀수 1회 깃꼴 겹잎이다. 작은 잎은 길이 약 1~2 cm로 달걀 모양의 타원형이며 잎 가장자리는 밋밋하다. 한국, 일본, 만주, 중국 북동부, 시베리아 동부 등지에 분포한다. 일반적으로 약초로서 재배하며 한방에서는 가을에 채취하여 노두(蘆頭)와 잔뿌리를 제거하고 햇빛에 말린 것을 한약재의 황기라 하며, 강장, 이뇨(利尿), 소종(消腫)등의 효능이 있다.

본 발명에서 사용되는 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼은 오프라인 또는 인터넷 마켓에서도 구입할 수 있다. 본 발명에서 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼은 정제수로 깨끗이 세척하여 사용하며, 추출 방법에 따라 건조시켜 세절하거나 가루로 만들어 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 구체예에 따르면, 다음과 같은 방법으로 혼합발효추출물을 제조한다.

먼저, 생약재를 1차 발효시키기 위해, 누룩, 곡물 및 정제수의 혼합물을 제조한다. 누룩, 곡물 및 정제수의 혼합물은 누룩 1~6중량%, 곡물 30~50중량% 및 정제수 45~65중량%로 이루어진다. 상기 곡물로는 쌀, 보리 및 밀로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 것이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 쌀이 사용된다.

세척, 건조 후 세절된 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼을 삼베포에 싸서 상기 혼합물에 묻어서 발효시킨다. 상기 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼은 건조 중량으로 1:1:1:1:1~1.5:1~1.5:1~1.5의 비율로 혼합되는 것이며, 1:1:1:1:1:1:1로 혼합되는 경우에 가장 우수한 항노화활성을 나타내었다.

상기 생약재 혼합물을 삼베포에 싸서, 상기 누룩 혼합물에 묻어 35~60℃에서 2~3일간 발효시킨다.

이어 상기 삼베포를 꺼내어 발효된 상기 생약재 혼합물을 용매로 추출하여 추출물을 제조한다. 이때, 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매를 사용하여 추출한 것이다. 통상의 추출방법에 따라 추출할 수 있으며, 본 발명의 일 구체예에 따르면, 1~80배 부피량의 물, 30%(V/V) 에탄올을 부가하여 90~95℃에서 2~3시간 중탕시켜 추출할 수 있다.

상기 추출물을 그대로 사용하지 않고, 본 발명에서는 2차로 상기 추출물을 삼나무 통에 넣어 저온 숙성시킨다. 삼나무(Cryptomeria japonica)는 일본 원산의 상록교목으로 제주도 지방과 남부지방에 널리 분포되어 있는 수종이다. 현재 삼나무는 내장재, 가구재, 도로용 깔개 등으로 이용되고 있으며 추출성분에 의한 생리활성 연구 등 목재의 부가가치를 높이기 위한 연구도 활발히 진행되고 있다(Kofujita et al., 2001; Matsushita et al., 2006). 삼나무에는 다양한 종류의 테르페노이드(terpenoids)가 함유되어 있으며, 특히 탄소 15개로 이루어진 세스키테르펜(sesquiterpene) 류가 주요성분으로 함유되어 있다. 이들 성분은 그 자체로서 피부사상균에 대한 항진균 활성을 가지는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서는 상기 생약재 혼합발효추출물의 항노화 활성을 증진시키기 위하여, 삼나무로 이루어진 통에 상기 생약재 혼합발효추출물을 담아 저온에서 숙성시켰다.

산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼을 누룩 발효시킨 추출물을 삼나무 통에 담아 7~10일간 2~8℃의 저온에서 숙성시켰다. 이를 여과 또는 여과 후 감압 농축하여 본 발명의 생약재 혼합발효추출물을 제조할 수 있다.

삼나무 통에서 2차의 숙성과정을 거침으로써 항노화 활성성분의 추출이 증진되어, 본 발명의 발효추출물은 숙성시키기 않은 발효추출물이나, 일반 도기 항아리에 넣어 숙성시킨 추출물에 비하여 항산화, 콜라겐 생성활성, TIMP-1의 발현, 트로포엘라스틴의 발현 및 MMP-1의 발현 억제 효과가 우수함을 확인하였다.

상기 제조방법에 의하여 제조된 본 발명 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼 혼합발효추출물은 화장료 조성물의 총 중량에 대하여 분말형태 또는 액상형태로 0.001~10 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 0.01∼5 중량%의 양으로 화장료에 첨가될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지 크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더 또는 아이섀도의 제형으로 이루어질 수 있다.

또한, 각 제형의 화장료 조성물에 있어서, 상기의 혼합발효추출물 외에 다른 성분들을 기타 화장료의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 예를 들어, 착색제(색소), 착향제(향료), 현탁화제, 유화제, 용해보조제, 안정제, 등장제, pH조절제, 점도조절제, 용제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 혼합발효추출물 이외에 주름개선에 대한 피부노화 방지 효과를 나타내는 다른 유효 성분을 1가지 이상 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[실시예]

실시예 1 : 산삼 배양근 발효추출물 제조

도기 항아리에 누룩 70g, 쌀 700g을 넣고 정제수 1050g을 혼합하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 분쇄된 산삼 배양근 200g을 혼합하여 삼베보자기에 싸서 상기 누룩 혼합물에 묻고 35℃에서 3일간 발효시켰다. 삼베보자기를 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 상기 추출물을 삼나무 통에서 7일간 2~8℃에서 저온 숙성시켰다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

실시예 2 : 단너삼 발효추출물 제조

도기 항아리에 누룩 70g, 쌀 700g을 넣고 정제수 1050g을 혼합하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 분쇄된 단너삼 200g을 혼합하여 삼베보자기에 싸서 상기 누룩 혼합물에 묻고 35℃에서 3일간 발효시켰다. 삼베보자기를 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 상기 추출물을 삼나무 통에서 7일간 2~8℃에서 저온 숙성시켰다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

실시예 3 : 단삼 발효추출물 제조

도기 항아리에 누룩 70g, 쌀 700g을 넣고 정제수 1050g을 혼합하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 분쇄된 단삼 200g을 혼합하여 삼베보자기에 싸서 상기 누룩 혼합물에 묻고 35℃에서 3일간 발효시켰다. 삼베보자기를 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 상기 추출물을 삼나무 통에서 7일간 2~8℃에서 저온 숙성시켰다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

실시예 4 : 고삼 발효추출물 제조

도기 항아리에 누룩 70g, 쌀 700g을 넣고 정제수 1050g을 혼합하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 분쇄된 고삼 200g을 혼합하여 삼베보자기에 싸서 상기 누룩 혼합물에 묻고 35℃에서 3일간 발효시켰다. 삼베보자기를 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 상기 추출물을 삼나무 통에서 7일간 2~8℃에서 저온 숙성시켰다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

실시예 5 : 사삼 발효추출물 제조

도기 항아리에 누룩 70g, 쌀 700g을 넣고 정제수 1050g을 혼합하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 분쇄된 사삼 200g을 혼합하여 삼베보자기에 싸서 상기 누룩 혼합물에 묻고 35℃에서 3일간 발효시켰다. 삼베보자기를 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 상기 추출물을 삼나무 통에서 7일간 2~8℃에서 저온 숙성시켰다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

실시예 6 : 만삼 발효추출물 제조

도기 항아리에 누룩 70g, 쌀 700g을 넣고 정제수 1050g을 혼합하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 분쇄된 만삼 200g을 혼합하여 삼베보자기에 싸서 상기 누룩 혼합물에 묻고 35℃에서 3일간 발효시켰다. 삼베보자기를 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 상기 추출물을 삼나무 통에서 7일간 2~8℃에서 저온 숙성시켰다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

실시예 7 : 현삼 발효추출물 제조

도기 항아리에 누룩 70g, 쌀 700g을 넣고 정제수 1050g을 혼합하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 분쇄된 현삼 200g을 혼합하여 삼베보자기에 싸서 상기 누룩 혼합물에 묻고 35℃에서 3일간 발효시켰다. 삼베보자기를 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 상기 추출물을 삼나무 통에서 7일간 2~8℃에서 저온 숙성시켰다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

실시예 8 내지 12 : 혼합발효추출물 제조

하기 표 1과 같이 중량비율을 달리하여 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼, 현삼을 혼합하여 실시예 7의 방법과 동일한 방법으로 추출물을 제조하였다. 원료만 달리하여 동일하게 실시하였다.

비교예 1 : 삼나무통 숙성과정을 거치지 않은 혼합발효추출물의 제조

도기 항아리에 누룩 누룩 70g, 쌀 700g을 넣고 정제수 1050g을 혼합하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 분쇄된 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼을 동일 중량비로 혼합하여 총 200g을 삼베보자기에 싸서 상기 누룩 혼합물에 묻고 35℃에서 3일간 발효시켰다. 삼베보자기를 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

비교예 2 : 항아리 숙성과정을 거친 혼합발효추출물의 제조

도기 항아리에 누룩 누룩 70g, 쌀 700g을 넣고 정제수 1050g을 혼합하여 혼합물을 제조하였다. 건조 후 분쇄된 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼을 동일 중량비로 혼합하여 총 200g을 삼베보자기에 싸서 상기 누룩 혼합물에 묻고 35℃에서 3일간 발효시켰다. 삼베보자기를 꺼내어 혼합용매로서 정제수 700g, 에탄올 300g을 사용하여 95℃에서 2시간 동안 중탕 추출하였다. 이 후 상기 추출물을 도기 항아리에서 7일간 2~8℃에서 저온 숙성시켰다. 300메쉬 여과지로 여과하고, 에드벤텍 5번 여과지와 와트만 GFC 150mm 여과지로 2번 여과하여 추출물을 제조하였다.

성분	실시예 8	실시예 9	실시예 10	실시예 11	실시예 12
산삼 배양근	1	1	1	1	1
단너삼	1	1	1	1	1
단삼	1	1	1	1	1
고삼	1	1	1	1	1
사삼	-	1	1.5	1.5	-
만삼	-	1	1.5	-	1.5
현삼	-	1	-	1.5	1.5

혼합발효추출물을 가지고 항노화 효과를 확인 하고자 추출물은 농축 후 동결 건조하였고, Radical 소거능 측정 및 세포 내 효능평가 샘플을 준비하였다. 그리고 DPPH free radical, Superoxide Radical, Alkyl Radical 및 Hydroxyl Radical 소거능과 in vitro에서 콜라게나제(Collagenase), Timp-1, 트로포엘라스틴(Tropoelastin)의 유전자 발현과 MMP-1의 유전자 발현 억제 효과를 확인 하였다.

시험예 1 : DPPH free radical 소거능 측정

DPPH free radical 소거능은 Nanjo et al.(1996)의 방법에 따라 측정하였다. 시료 30㎕에 60μM DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 용액 30㎕를 혼합 후, 반응액을 100㎕ quartz capillary tube에 옮겨 2분 후 electron spin resonance(ESR) spectrometer(JES-FA, JEOL Ltd., Tokyo, Japan)로 측정하였다. 실험조건은 다음과 같다.

magnetic field, 336.5±5 mT; power, 5 mW; modulation frequency, 9.41 GHz; amplitude, 1×1,000; sweep time, 30 s; temperature, 298 K.

DPPH radical 소거능은 H 와 H₀ 의 상대적인 radical signal peak 높이의 차에 의하여 계산하였다. 그 결과를 각각 표 2에 나타내었다.

DPPH free radical scavenging activity(%)=(1-H/H ₀ )×100

시험예 2 : Superoxide radical 소거능 측정

Superoxide radical은 Guo et al.(1999)에 따라 시료 10㎕에 0.3mM riboflavin 10㎕, 1.6mM EDTA 10㎕, 800mM DMPO 10㎕를 첨가 후 365nm의 UV lamp에서 1분 동안 조사하였다. 반응물을 quartz capillary tube에 옮긴 후, ESR spectrometer를 이용하여 분석하였으며 실험조건은 다음과 같다.

magnetic field, 336.5±5 mT; power, 10 mW; modulation frequency, 9.41 GHz; amplitude, 1×1,000; sweep time, 30 s; temperature 298 K.

Superoxide radical 소거능은 H과 H₀ 의 상대적인 peak를 이용하는 수식에 의해 계산되었다. 그 결과를 각각 표 2에 나타내었다.

Superoxide radical scavenging activity(%)=(1-H/H ₀ )×100

시험예 3 : Alkyl radical 소거능 측정

10㎕의 시료에 각각 10㎕의 PBS(Phosphate buffered saline), 40mM AAPH (2,2-azobis-(2-amidinopropane)-dihydrochloride), 40mM POBN α-(4-pyridyl-1- oxide)-N-tert-butylnitrone을 첨가한다. 그리고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 quartz capillary tube에 옮겨 ESR spectrometer를 이용하여 측정하였다. 실험조건은 다음과 같다.

magnetic field, 336.5±5 mT; power, 10 mW; modulation frequency, 9.41 GHz; amplitude, 1×1,000; sweep time, 1 min; temperature 298 K.

Alkyl radical 소거능은 아래의 식으로 계산 하였다. 그 결과를 각각 표 2에 나타내었다.

Alkyl radical scavenging activity(%)=(1-H/H ₀ )×100

시험예 4 : Hydroxyl radical 소거능 측정

Hydroxyl radical 소거능은 Rosen et al. (1984)의 방법으로 분석하였다. 시료 20㎕에 0.3M DMPO 20㎕, 10mM FeSO₄ 20㎕, 10mM H₂O₂ 20㎕을 혼합한 다음 quartz capillary tube에 옮긴 후 2.5분 후에 ESR spectrometer로 측정하였다. 실험조건은 다음과 같다.

magnetic field, 336.5±5 mT; power, 1 mW; modulation frequency, 9.41 GHz; amplitude, 1×200; sweep time, 4 min; temperature 298 K.

Hydroxy radical 소거능 은 H 과 H₀ 의 상대적인 높이에 의해 측정하는 다음 수식에 의해 계산되었다. 그 결과를 각각 표 2에 나타내었다.

Hydroxyl radical scavenging activity(%)=(1-H/H ₀ )×100

구분	Radical scavenging activity (%) at concentration 2.5㎎/㎖.
	DPPH	Hydroxyl	Alkyl	Superoxide
실시예 1	56.82 ± 0.91	59.65 ± 1.22	47.18 ± 0.86	50.01 ± 0.98
실시예 2	49.27 ± 1.26	52.17 ± 1.03	41.22 ± 1.03	46.18 ± 0.96
실시예 3	52.63 ± 1.01	56.96 ± 0.83	52.99 ± 0.54	49.09 ± 1.11
실시예 4	47.42 ± 1.18	50.25 ± 0.79	42.89 ± 0.82	45.81 ± 1.09
실시예 5	52.14 ± 0.70	59.71 ± 0.51	46.47 ± 1.16	5.045 ± 0.51
실시예 6	48.65 ± 0.46	55.23 ± 1.03	42.83 ± 0.33	45.99 ± 0.96
실시예 7	46.49 ± 1.10	50.96 ± 0.43	40.09 ± 0.54	43.32 ± 0.91
실시예 8	56.65 ± 0.46	60.23 ± 1.03	49.83 ± 0.33	51.99 ± 0.96
실시예 9	70.68 ± 0.34	77.97 ± 0.51	65.58 ± 0.74	68.12 ± 1.07
실시예 10	67.68 ± 0.61	71.97 ± 1.21	61.58 ± 0.97	63.12 ± 0.67
실시예 11	64.25 ± 1.00	68.38 ± 1.11	55.28 ± 0.91	59.25 ± 0.51
실시예 12	61.68 ± 0.61	65.97 ± 1.21	52.58 ± 0.74	58.12 ± 0.67
비교예 1	53.47 ± 1.08	58.52 ± 0.91	48.15 ± 1.18	50.08 ± 1.27
비교예 2	57.85 ± 1.08	61.10 ± 0.85	50.21 ± 1.16	52.98 ± 1.03

상기 표 2에서 확인되는 바와 같이 라디칼 소거능 효과에 있어서, 누룩발효 후 삼나무통에서 2차 숙성시킨 본 발명 실시예 9의 혼합발효추출물이 다른 발효추출물, 즉 생약재 각각의 발효추출물이나, 생약재를 혼합 발효 후 숙성시키지 않은 발효추출물이나, 생약재 혼합 발효 후 도기 항아리에서 숙성시킨 발효추출물 보다 우수한 결과를 확인할 수 있었다. 이를 통해 삼나무 통에서의 저온 숙성과정을 통하여 각 생약재로부터의 활성성분 추출이 증진되어 항노화 활성이 현저히 상승하였음을 알 수 있다.

시험예 5 : 세포독성 시험

세포 배양

추출물들의 항노화에 작용하는 유전자 발현을 확인하기 위하여 콜라게나제(Collagenase)와 TIMP-1는 HaCaT(Human keratinocyte cell line)에서, MMP-1와 트로포엘라스틴(Tropoelastin)은 CCD-986Sk(Human fibroblast cell line)에서, 미백에 작용하는 유전자 발현을 확인하기 위하여 티로시나제(Tyrosinase)와 MITF는 B16F10 melanoma cells을 사용하였다. HaCaT, CCD-986Sk 및 B16F10 melanoma 세포는 10%(v/v) FBS(fetal bovine serum, Gibco, USA), 100U/mL의 streptomycin, 100U/mL의 penicillin 항생제(Gibco, USA)가 포함된 DMEM(Dulbeco? modified eagle? medium, Gibco, USA)배지를 사용하여 5% CO₂ 및 37℃ 조건의 인큐베이터에서 배양하였다.

세포 생존율 측정 실험(MTT assay)

MTT assay법은 MTT[3-(4,5-dimethythiasol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] 시약이 세포 내로 흡수된 후 미토콘드리아의 숙신산 탈수소효소(succinate dehydrogenase)에 의해 포마잔(formazan)을 형성하는데 이 물질의 세포 내 축적은 미토콘드리아의 활성, 넓게는 세포의 활성을 의미하는 것으로써 세포의 생존율을 측정하는 대표적인 방법이다.

각각의 HaCaT, CCD-986Sk 및 B16F10 melanoma 세포를 1×10⁵cell/well의 밀도로 96 well에 200㎕ 배지와 함께 분주한 뒤 5% CO₂, 37℃ incubator에서 24시간 배양한 후 배지를 버리고 PBS로 씻어준 다음, 같은 양의 배지와 PBS에 녹인 시료를 0.1%에서 5.0%까지 다양한 농도에 따라 각 well에 처리하여 24시간 배양하였다. 배양이 끝나기 4시간 전에 PBS에 녹인 5㎎/㎖ MTT를 20㎕씩 각 well에 첨가하고 알루미늄 호일로 차광시킨 후 3간 동안 5% CO₂ 및 37℃ 조건의 incubator에서 배양하였다. 배양액을 제거하고 DMSO용액 200㎕를 첨가하여 37℃ incubator에서 1시간 반응 시킨 후 ELISA reader를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다. 세포 생존율은 하기 식에 의해 산출되었고, 그 결과는 하기 표 3에 나타내었다.

세포생존율(%)=시료첨가군의 O.D at 570㎚/시료무첨가군의 O.D at 570㎚×100

구분	세포 생존율(%)
	0.1 %	0.5 %	1 %	5.0 %
실시예 8	100	100	100	101
실시예 9	101	100	101	100
실시예 10	100	100	100	100
실시예 11	100	100	101	100
실시예 12	101	101	101	100
비교예 1	100	100	100	100
비교예 2	101	101	101	101
대조군 Adenosine	100	101	100	100
대조군 Arbutin	101	100	100	101

상기 표 3에서 확인되는 바와 같이 상기 실시예, 비교예 그리고 대조군 Adenosine(아데노신) Arbutin(알부틴) 모두 세포독성을 나타내지 않았다.

시험예 6 : 세포내 Collagenase, Timp-1 및 Tropoelastin의 유전자 발현과 MMP-1의 유전자 발현 억제 효과.

HaCaT와 CCD-986Sk 세포는 세포의 수를 5×10⁵cells/㎖로 조제한 후에 페트리디쉬에 처리하여 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 페트리디쉬에서 80% 이상 자란 다음, 추출물을 세포 생존율 100% 이상으로 나타난 농도로 첨가하였다.

Free radical 소거능이 가장 우수한 것으로 확인된 혼합발효추출물 실시예 8, 9, 10, 11, 12와 비교예 1, 2 추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 COL1A1, TIMP-1 및 Tropoelastin의 발현과 MMP-1의 발현 억제를 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH을 사용하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 4에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 5분 변성후, M-MLV(Moloney murine leukemia virus) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 94℃ 5분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25㎕로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인 했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
COL1A1	Forward : AGCCAGCAGATCGAGAACAT
	Reverse : TCTTGTCCTTGGGGTTCTTG
TIMP-1	Forward : TGCTGGGTGGTAACTCTTTATTTCA
	Reverse : ATCCTGTTGTTGCTGTGGCTGATAG
Tropoelastin	Forward : AAAGCAGCAGCAAAGTTCGG
	Reverse : ACCTGGGACAACTGGAATCC
MMP-1	Forward : AAGGTTAGCTTACTGTCACACGCTT
	Reverse : CGACTCTAGAAACACAAGAGCAAGA

그 결과는 각각 도 1 내지 4에 나타내었다.

PT-PCR 수행 후 관찰결과, 본 발명 실시예 9의 혼합발효추출물은 다른 혼합발효추출물 보다 collagen 및 TIMP-1의 발현을 증가시켰다. 도 4에서 확인되는 바와 같이 실시예 9의 혼합발효추출물이 다른 혼합발효추출물 보다 MMP-1의 발현 억제 효과가 우수 했다. 대조군인 아데노신(Adenosine)과 비교했을 때 우수한 결과를 확인할 수 있었다.

또한 트로포엘라스틴(Tropoelastin)은 피부 탄력을 나타내는 탄력 섬유 중심의 엘라스틴을 형성하고 있는 인자로 도 3에서 확인되는 바와 같이 본 발명 실시예 9의 혼합발효추출물은 5%에서 대조군 Adenosine 5%보다도 우수한 결과를 나타내었다.

시험예 7 : 세포 내 Tyrosinase 및 MITF의 유전자 발현 억제 효과

B16F10 melanoma 세포는 세포의 수를 5×10⁵cells/㎖로 조제한 후에 페트리디쉬에 처리하여 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 세포가 페트리디쉬에서 80% 이상 자란 다음, 추출물을 세포 생존율 100% 이상으로 나타난 농도로 첨가하였다.

미백에 대한 효과를 알아보고자 혼합발효추출물 실시예 8, 9, 10, 11, 12와 비교예 1, 2 추출물을 처리한 후 DMED/10 FBS에서 24시간 동안 5% CO₂ 및 37℃의 조건에서 배양하였다. 24시간 후 세포에서 RNA 분리, cDNA 합성 및 RT-PCR은 Komoroski 등(Drug Metab. Dispos. 32:512-518, 2004)이 기술한 방법에 따라 수행하였다. RT-PCR에서 측정한 유전자는 Tyrosinase 및 MITF를 선택하여 발현을 확인하였다. 유전자 발현의 차이를 확인하기 위해 house keeping gene으로 GAPDH을 사용 하였다.

각각의 유전자의 프라이머 서열은 표 5에 나타냈다. 추출된 RNA를 주형으로 올리고 dT-어댑터 프라이머(Oligo dT-adaptor primer)와 DEPC water를 이용하여 총량 15㎕로 하고 70℃ 5분 변성후, Moloney murine leukemia virus(M-MLV) RNA의 역전사를 수행하여 42℃ 60분, 94℃ 5분 cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 PCR 반응을 통해 증폭하였으며, 총 반응액은 25μL로 하였다. 각 반응물의 최종 농도는 프라이머 100pmol, 1.0μM, dNTP 혼합액 0.2mM, 5x green or colorless GoTaq Reaction buffer 1x1.5 mM, MgCl₂(PCR완충액) 및 GoTaq DNA 폴리머라제 1.25units이었다. 변성(Denaturation), 어닐링(annealing) 및 익스텐션(extension)에 대한 PCR 반응 조건은 다음과 같으며, 95℃ 2분, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 1분, 72℃ 5분, 30~40 사이클로 수행하였다. PCR 반응 후 생성물의 10㎕를 2% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동 하였다. Gel Documentation system(코리아랩텍, Cat. No DGS-200D)을 이용하여 발현양을 확인했다.

프라이머 이름	염기서열
GAPDH	Froward : GGCATTGCTCTCAATGACAA
	Reverse : TGTGAGGGAGATGCTCAGTG
MITF	Forward : AACCGACAGAAGAAGCTGGA
	Reverse : ACAAGTTCCTGGCTGCAGTT
Tyrosinase	Forward : TTATGCGATGGAACACCTGA
	Reverse : ACTGGCAAATCCTTCCAGTG

그 결과는 도 5 및 도 6에 나타내었다.

PT-PCR 수행 후 관찰 결과, 본 발명 실시예 9의 혼합발효추출물은 다른 혼합발효추출물 보다 Tyrosinase 및 MITF의 mRNA 유전자 발현 억제 효과가 우수하게 나타났다. 따라서, 본 발명 혼합발효추출물은 다른 발효추출물 보다 미백 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

제형 실시예 1 : 스킨로션의 제조

하기 표 6의 조성에 따라, 하기의 방법으로 혼합발효추출물(실시예 9)을 함유한 스킨로션 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	혼합발효추출물(실시예 9)	1.0
2	글리세린	3.0
3	부틸렌글리콜	2.0
4	프로필렌글리콜	2.0
5	폴리옥시에칠렌 경화피마자유	1.0
6	에탄올	10.0
7	트리에탄올아민	0.1
8	방부제	미량
9	색소	미량
10	향료	미량
11	정제수	잔량

상기 표 6에서 11번 물질에 2, 3, 4, 8번 물질을 순서대로 반응용기에 투입하고 교반하여 용해시킨 후, 5번 물질을 60℃ 정도로 가열하여 용해시켰다. 이 후, 10번 물질을 투입하여 용해한 후 11번 물질에 투입하였다. 마지막으로 1, 6, 7, 9번 물질을 투입하여 충분히 교반시킨 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 스킨로션을 제조하였다.

제형 실시예 2 : 영양로션의 제조

하기 표 7의 조성에 따라, 하기의 방법으로 혼합발효추출물(실시예 9)을 함유한 하이드로좀 영양로션 1kg을 제조하였다.

번호	원 료	함량(중량%)
1	혼합발효추출물(실시예 9)	1.0
2	밀납	1.0
3	폴리솔베이트 60	1.5
4	솔비탄 세스퀴올레이트	0.5
5	유동 파라핀	10.0
6	소르비탄 스테아레이트	1.0
7	친유형 모노스테아린산 글리세린	0.5
8	스테아린산	1.5
9	글리세릴스테아레이트/피이지-400 스테아레이트	1.0
10	프로필렌글리콜	3.0
11	카르복시폴리머	0.1
12	트리에탄올아민	0.2
13	방부제	미량
14	색소	미량
15	향료	미량
16	정제수	잔량

상기 표 7에서 10, 11, 13, 16번 물질을 혼합 교반하면서, 80~85 ℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 12번 물질을 80~85℃사이로 가열 용해한 후 유화시켰다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 냉각한 뒤 15번 물질을 투입하고 45℃까지 냉각한 뒤 14번 물질을 투입하고 35℃에서 1번 물질을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 25℃에서 3일간 숙성시켜 표제의 영양로션을 제조하였다.

지금까지 본 발명에 대해서 상세히 설명하였으나, 그 과정에서 언급한 실시예는 예시적인 것일 뿐이며, 한정적인 것이 아님을 분명히 하고, 본 발명은 이하의 특허청구범위에 의해 제공되는 본 발명의 기술적 사상이나 분야를 벗어나지 않는 범위내에서, 균등하게 대처될 수 있는 정도의 구성요소 변경은 본 발명의 범위에 속한다 할 것이다.

Claims (7)

1. (A)누룩, 곡물 및 정제수를 혼합하는 단계;
   (B)건조된 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼을 혼합하여 삼베포에 싸서 상기 혼합물에 묻는 단계;
   (C)35~60℃에서 2~3일간 발효시키는 단계;
   (D)상기 발효물을 추출하는 단계; 및
   (E)상기 추출물을 삼나무 통에 담아 7~10일간 2~8℃에서 숙성하는 단계를 포함하는 혼합발효추출물의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, (A)단계에서 누룩, 곡물 및 정제수의 혼합물은 누룩 1~6중량%, 곡물 30~50중량% 및 정제수 45~65중량%로 이루어지는 것임을 특징으로 하는 혼합발효추출물의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, (B)단계에서, 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼은 건조 중량으로 1:1:1:1:1~1.5:1~1.5:1~1.5의 비율로 혼합되는 것임을 특징으로 하는 혼합발효추출물의 제조방법.
4. 제1항에 있어서, (D)단계에서, 추출은 물, 탄소수 1 내지 4의 무수 또는 함수알코올, 에틸아세테이트, 아세톤, 글리세린, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜 및 부틸렌글리콜로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 용매를 사용하여 이루어지는 것임을 특징으로 하는 혼합발효추출물의 제조방법.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 의하여 제조되는 산삼 배양근, 단너삼, 단삼, 고삼, 사삼, 만삼 및 현삼 혼합발효추출물이 화장료 조성물 전체 중량에 대하여 0.001~10 중량% 함유되는 화장료 조성물.
6. 제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부주름 및 탄력개선용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. 제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부미백용임을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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