[go: up one dir, main page]

KR101754091B1 - 단일 뉴클레오티드 검출 방법 - Google Patents

단일 뉴클레오티드 검출 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101754091B1
KR101754091B1 KR1020177001507A KR20177001507A KR101754091B1 KR 101754091 B1 KR101754091 B1 KR 101754091B1 KR 1020177001507 A KR1020177001507 A KR 1020177001507A KR 20177001507 A KR20177001507 A KR 20177001507A KR 101754091 B1 KR101754091 B1 KR 101754091B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
oligonucleotide
region
stranded
nucleotide
detectable elements
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
KR1020177001507A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170018066A (ko
Inventor
바너비 밤포스
카메론 알렉산더 프레일링
Original Assignee
베이스4 이노베이션 엘티디
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 베이스4 이노베이션 엘티디 filed Critical 베이스4 이노베이션 엘티디
Publication of KR20170018066A publication Critical patent/KR20170018066A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101754091B1 publication Critical patent/KR101754091B1/ko
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/10—Nucleotidyl transfering
    • C12Q2521/101—DNA polymerase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/30—Phosphoric diester hydrolysing, i.e. nuclease
    • C12Q2521/319—Exonuclease
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2521/00—Reaction characterised by the enzymatic activity
    • C12Q2521/50—Other enzymatic activities
    • C12Q2521/501—Ligase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/10—Modifications characterised by
    • C12Q2525/125—Modifications characterised by incorporating agents resulting in resistance to degradation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2525/00—Reactions involving modified oligonucleotides, nucleic acids, or nucleotides
    • C12Q2525/30—Oligonucleotides characterised by their secondary structure
    • C12Q2525/307—Circular oligonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2533/00—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used
    • C12Q2533/10—Reactions characterised by the enzymatic reaction principle used the purpose being to increase the length of an oligonucleotide strand
    • C12Q2533/107—Probe or oligonucleotide ligation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/149—Sequential reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2537/00—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature
    • C12Q2537/10—Reactions characterised by the reaction format or use of a specific feature the purpose or use of
    • C12Q2537/162—Helper probe
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/107—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties fluorescence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/159—Microreactors, e.g. emulsion PCR or sequencing, droplet PCR, microcapsules, i.e. non-liquid containers with a range of different permeability's for different reaction components
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
    • C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
    • C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)

Abstract

DNA 또는 RNA와 같은 핵산의 염기서열 분석 방법을 제공한다.
본 실시예는 (1) 상기 핵산의 점진적인 피로인산분해에 의해 단일 뉴클레오시드 3인산 스트림을 생성하는 단계; (2) 중합효소 및 리가아제의 존재 하에 적어도 하나의 상기 단일 뉴클레오시드 3인산과 상응하는 프로브 시스템을 반응시킴으로써 적어도 하나의 실질적인 이중 가닥 올리고 뉴클레오티드 사용 프로브(used probe)를 생성하는 단계로, 상기 상응하는 프로브 시스템은, (a) 검출 불가능한 상태의 특이적 검출가능요소들로 표지된 단일가닥 제1 올리고뉴클레오티드 및 (b) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 상의 상보적 영역에 혼성화할 수 있는 단일가닥 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단계; (3) 이중가닥 엑소뉴클레오리틱(exonucleolytic) 활성을 갖는 효소로 상기 사용 프로브를 분해(digesting)하여, 검출 가능한 상태의 상기 검출가능요소들 및 적어도 부분적으로 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 서열 보체인 단일가닥 제4 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계; (4) 상기 제4 올리고뉴클레오티드를 다른 제1 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 상기 사용 프로브에 상응하는 실질적인 이중가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 생성하는 단계; (5) 상기 단계 (3) 및 (4)를 주기적으로 반복하여 수행하는 단계; 및 (6) 상기 단계 (3)의 매 반복마다 방출되는 상기 특이적 검출가능요소들을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 검출가능요소들은 형광단이다. 본 발명의 방법은 종래 개시된 방법보다 단일 뉴클레오시드 3인산으로부터 더 강한 형광 신호를 생성한다. 또한, 바람직한 프로브 시스템 역시 개시한다.

Description

단일 뉴클레오티드 검출 방법{SINGLE NUCLEOTIDE DETECTION METHOD}
본 발명은 특히 DNA 또는 RNA 염기서열 분석에 사용되기 적합한 단일 뉴클레오티드의 검출 및 특성화(characterising) 방법에 관한 것이다.
염기서열 분석장치의 속도가 점점 빨라지고 이러한 장치가 시장에서 저렴한 단가로 공급되면서, 유전물질의 염기서열을 분석하는 차세대 염기서열분석 방법은 이미 일반적인 생명과학 분야 및 의료 분야에서 상당한 영향을 끼치고 있다.
본 출원인의 이전 출원 WO2014/053853, WO2014/053854, WO2014/167323, WO2014/167324 및 WO2014/111723에는, 폴리뉴클레오티드 분석물질을 점진적으로 분해(digestion)하여 정렬된 단일 뉴클레오티드 스트림을 생성하는 것을 포함한 새로운 염기서열 분석방법에 대하여 기재하고 있다. 바람직하게는 단일 디옥시리보뉴클레오시드 3인산 스트림을 생성하며, 각각의 단일 디옥시리보뉴클레오시드 3인산은 마이크로 드롭릿(microdroplet) 스트림 내에서 대응하는 드롭릿(droplet)에 하나씩 포획될 수 있다. 그런 다음, 드롭릿 각각은 화학적 및/또는 효소적으로 조작되어 본래 함유하고 있던 특정 단일 뉴클레오티드를 드러낸다. 일 실시예에서, 이러한 화학적 및/또는 효소적 조작들은 하나 이상의 2성분 올리고뉴클레오티드 프로브 유형들의 사용을 수반하는 방법을 포함하고, 각각의 2성분 올리고뉴클레오티드 프로브는 분석물질을 구성하는 단일 뉴클레오티드 유형들 중 하나를 선택적으로 포획할 수 있도록 적합하게 조정된다. 일반적으로, 전술한 프로브 유형들 각각에서는 2가지 올리고뉴클레오티드 성분들 중 하나가 특징적인 형광단들(fluorophores)을 포함하고, 프로프 미사용 상태에서는 이러한 형광단들의 형광 발광 능력이 자기소광(self-quenching) 또는 인접하게 위치한 소광물질(quencher)들의 존재로 인하여 소멸하게 된다. 프로브 사용 시에는, 프로브가 상응하는 단일 뉴클레오티드를 포획하였을 때, 이후의 외부핵 분해(exonucleolysis)에 영향 받기가 쉬워지므로, 소광물질들로부터 형광단들을 유리화(liberating) 및/또는 서로 그들이 자유롭게 형광을 발하도록 한다. 이런 식으로 각 드롭릿에 본래 존재하는 단일 뉴클레오티드는 분광 수단에 의해 간접적으로 식별될 수 있다.
Nature Reviews Genetics 7(8) 632-644 (2006)에서 Fan et al은 유전자형 분석(genotyping), 카피 수(copy-number) 측정, 염기서열 분석 및 이형접합성 소실 검출, 및 대립유전자 특이적 발현(allele-specific expression)을 위한 고도의 병렬 게놈 분석을 가능케 하는 방법 및 플랫폼 개발에 대한 일반적인 평가를 제공한다. Fan et al의 그림 2a는 3' 및 5' 말단을 갖는 원형화 가능한(circularizable) 프로브의 사용에 대해 개략적으로 보여준다. 여기서, 3' 및 5' 말단은 분석물질 상의 단일 뉴클레오티드 다형성(SNP: Single Nucleotide polymorphism) 부분의 업스트림과 다운스트림을 어닐링(annealing)함으로써, 갭(gap)을 남겨두고 이어서 SNP의 보체인 뉴클레오티드로 채워져 방출 후에 증폭될 수 있는 완전 원형 프로브를 형성한다. 그러나 우리의 방법과 달리, 채우기 과정 중에 포획된 뉴클레오티드는 분석물질 자체로부터 직접 얻어지지 않는다.
WO03/080861은 방출될 때 뉴클레오티드에 직접 부착되는 뉴클레오티드-특이적 반응성 표지의 존재 하에서 핵산 분석물질이 점진적인 피로인산분해가 되는 과정을 개시한다. 이것은 우리가 사용하는 방법과는 매우 상이한 방법일 뿐만 아니라, 표지된 뉴클레오티드들이 추후 분석될 때 측정된 형광 신호가 너무 약해서 관련 배경 잡음 이상에서는 실제로 안정적인 식별을 할 수 없을 수도 있다.
마지막으로, WO94/18218은 DNA 염기서열 분석방법을 교시하고 있는데, 여기서 분석물질은 점진적인 외부핵 분해(exonucleolysis)가 되어 단일 뉴클레오티드 2인산 또는 1인산 스트림을 생성하고, 이들이 검출되기 전에 형광 강화 매트릭스(fluorescence-enhancing matrix)에 결합된다. 이것은 우리가 기술한 것과는 완전히 다른 접근법을 취할 뿐만 아니라, 생성된 모든 신호가 너무 약해서 안정적으로 검출 및 식별될 수 없다는 것을 다시 말하는 바이다.
본 발명의 발명자들은 이전 특허출원에 기재된 방법보다 개선된 방법으로서, 각각의 단일 뉴클레오티드가 이전에 획득된 것보다 더 많은 자유 형광단(free fluorophores)을 발생시켜, 배경 잡음 이상에서도 관련 형광 신호를 훨씬 용이하게 검출할 수 있는 장점이 있는 방법을 개발하였다. 결과적으로, 본 발명의 방법을 이용하는 임의의 서열분석장치의 감도가 현저히 향상되고 큰 핵산 분자(예: 인간 DNA 단편)의 염기서열을 정확히 분석하는데 소요되는 시간을 상당히 감축할 수 있다. 게다가, 검출에 필요한 계측장비가 더 간소해지므로 제작 비용도 역시 더욱 저렴해진다.
본 발명의 실시예에 의하면, 핵산의 염기서열 분석방법에 있어서, (1) 상기 핵산의 점진적인 피로인산분해에 의해 단일 뉴클레오시드 3인산 스트림을 생성하는 단계; (2) 중합효소 및 리가아제의 존재 하에 적어도 하나의 상기 단일 뉴클레오시드 3인산과 상응하는 프로브 시스템을 반응시킴으로써 적어도 하나의 실질적인 이중가닥 올리고 뉴클레오티드 사용 프로브(used probe)를 생성하는 단계로, 상기 상응하는 프로브 시스템은, (a) 검출 불가능한 상태의 특이적 검출가능요소들로 표지된 단일가닥 제1 올리고뉴클레오티드 및 (b) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 상의 상보적 영역에 혼성화할 수 있는 단일가닥 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단계; (3) 이중가닥 엑소뉴클레오리틱(exonucleolytic) 활성을 갖는 효소로 상기 사용 프로브를 분해(digesting)하여, 검출 가능한 상태의 상기 검출가능요소들 및 적어도 부분적으로 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 서열 보체인 단일가닥 제4 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계; (4) 상기 제4 올리고뉴클레오티드를 다른 제1 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 상기 사용 프로브에 상응하는 실질적인 이중가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 생성하는 단계; (5) 상기 단계 (3) 및 (4)를 주기적으로 반복하여 수행하는 단계; 및 (6) 상기 단계 (3)의 매 반복마다 방출되는 상기 특이적 검출가능요소들을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명의 실시예에 의하면, 다성분의 생물학적 프로브 시스템에 있어서, (a) 검출 불가능한 상태의 하나 이상의 형광단으로 표지된 단일가닥 제1 올리고뉴클레오티드; 및 (b) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 상에서 단일 뉴클레오티드 포획 영역의 각 측면에 병렬로 배치된 상보적인 3' 측 및 5' 측 인접영역들에 각각 혼합화할 수 있는 표지되지 않은 단일가닥 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템을 제공한다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 본 발명의 방법을 이용하는 임의의 서열분석장치의 감도가 현저히 향상되고 큰 핵산 분자(예: 인간 DNA 단편)의 염기서열을 정확히 분석하는데 소요되는 시간을 상당히 감축할 수 있다. 게다가, 검출에 필요한 계측장비가 더 간소해지므로 제작 비용도 역시 더욱 저렴해진다.
도 1은 반응 혼합물의 dNTP 성분의 존재 및 부재 하에서 시간에 따른 형광의 세기를 나타내는 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 미소유체 서열분석장치의 개략적인 구성도이다.
이하, 본 발명의 실시예를 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다.
즉, 본 발명의 제1 측면에 따르면, 핵산의 염기서열 분석방법에 있어서, (1) 핵산의 점진적인 피로인산분해(progressive pyrophosphorolysis)에 의해 단일 뉴클레오시드 3인산 스트림을 생성하는 단계, (2) 중합효소 및 리가아제의 존재 하에 적어도 하나의 상기 단일 뉴클레오시드 3인산과 상응하는 프로브 시스템을 반응시킴으로써 적어도 하나의 실질적인 이중가닥 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 사용 프로브(used probe)를 생성하는 단계로, 상기 상응하는 프로브 시스템은, (a) 검출 불가능한 상태의 특이적 검출가능요소들로 표지된 단일가닥 제1 올리고뉴클레오티드 및 (b) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 상의 상보적 영역에 혼성화할 수 있는 단일가닥 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단계, (3) 이중가닥 엑소뉴클레오리틱(exonucleolytic) 활성을 갖는 효소로 상기 사용 프로브를 분해(digesting)하여, 검출 가능한 상태의 상기 검출가능요소들 및 적어도 부분적으로 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 서열 보체인 단일가닥 제 4 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계, (4) 상기 제4 올리고 뉴클레오티드를 다른 제1 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 상기 사용 프로브에 상응하는 실질적인 이중가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 생성하는 단계, (5) 상기 단계 (3) 및 단계 (4)를 주기적으로 반복하여 수행하는 단계, 및 (6) 상기 단계 (3)의 매 반복마다 방출되는 상기 특이적 검출가능요소들을 검출하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
본 발명의 방법에 따른 단계 (1)은 피로인산분해 핵산 분석물질로부터 단일 뉴클레오시드 3인산 스트림을 생성하는 단계를 포함한다. 단계 (1)에서 사용되는 분석물질은 적절하게는, 원칙적으로 인간 게놈 단편에서 발견되는 최대 수백만 개의 뉴클레오티드 염기를 포함하여 길이가 무한할 수 있는 이중가닥 폴리뉴클레오티드이다. 하지만 일반적으로, 폴리뉴클레오티드의 길이는 적어도 50개의 뉴클레오티드 쌍, 바람직하게는 적어도 150 개의 뉴클레오티드 쌍의 길이가 될 것이다. 적절하게는, 500개 이상, 1000개 이상, 많은 경우엔 수천 개의 뉴클레오티드 쌍의 길이를 가질 것이다. 본 방법은 합성하여 생성된 RNA 또는 DNA나, 자연에서 흔히 마주하지 않는 뉴클레오티드 염기들로 전부 또는 일부가 구성된 기타 핵산들의 염기서열 분석에도 이용될 수 있으나, 분석물질 자체는 천연 RNA 또는 DNA(예를 들어, 식물, 동물, 박테리아 또는 바이러스에서 유래한 것)가 적절하다. 즉, 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신 및 우라실 이외의 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 이러한 뉴클레오티드 염기의 예로는, 4-아세틸시티딘(4-acetylcytidine), 5-(카복시하이드록실메틸) 우리딘(5- (carboxyhydroxylmethyl)uridine), 2-O- 메틸시티딘(2-O-methylcytidine), 5-카복시메틸아미노메딜-2-티오우리딘(5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine), 5-카복시메틸아미노-메틸우리딘(5-carboxymethylamino-methyluridine), 디하이드로우리딘(dihydrouridine), 2-O-메틸수도우리딘(2-O-methylpseudouridine), 2-O-메틸구아노신(2-O-methylguanosine), 이노신(inosine), N6-이소펜틸아데노신(N6-isopentyladenosine), 1-메틸아데노신(1-methyladenosine), 1-메틸수도우리딘(1-methylpseudouridine), 1-메틸구아노신(1-methylguanosine), 1-메틸이노신(1-methylinosine), 2,2-디메틸구아노신(2,2-dimethylguanosine), 2-메틸아데노신(2-methyladenosine), 2-메틸구아노신(2-methylguanosine), 3-메틸시티딘(3-methylcytidine), 5-메틸시티딘(5-methylcytidine), N6-메틸아데노신(N6-methyladenosine), 7-메틸구아노신(7-methylguanosine),5-메틸아미노메틸우리딘(5-methylaminomethyluridine), 5-메틸옥시아미노메틸-2-티오우리딘(5-methoxyaminomethyl-2-thiouridine), 5-메톡시우리딘(5-methoxyuridine), 5-메톡시카보닐메틸-2-티오우리딘(5-methoxycarbonylmethyl-2-thiouridine), 5-메톡시카보닐메틸우리딘(5-methoxycarbonylmethyluridine), 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데노신(2-methylthio-N6-isopentenyladenosine), 우리딘-5-옥시아세트산-메틸에스테르(uridine-5-oxyacetic acid-methylester), 우리딘-5-옥시아세트산(uridine-5-oxyacetic acid), 와이부톡소신(wybutoxosine), 와이부토신(wybutosine), 수도우리딘(pseudouridine), 쿠에오신(queuosine), 2-티오시티딘(2-thiocytidine), 5-메틸-2-티오우리딘(5-methyl-2-thiouridine), 2-티오우리딘(2-thiouridine), 4-티오우리딘(4-thiouridine), 5-메틸우리딘(5-methyluridine), 2-O-메틸-5-메틸우리딘(2-O-methyl-5-methyluridine), 및 2-O-메틸우리딘(2-O-methyluridine)이 있다. DNA의 경우, 생성된 단일 뉴클레오티드 3인산이 디옥시리보뉴클레오시드(deoxyribonucleoside) 3인산인 한편, RNA인 경우에는 리보뉴클레오시드(ribonucleoside) 3인산이다.
본 발명의 일 실시예에서, 단계 (1)은 기판에 분석물질을 부착하는 제1 서브 단계를 포함한다. 일반적으로, 기판은 미소유체(microfluidic) 표면, 마이크로-비드(micro-bead) 또는 투과성 막을 포함한다. 예를 들어, 유리나 비분해성 중합체로 제조될 수 있다. 바람직하게는, 기판은 분석물직을 수용하기에 적합한 표면을 더 포함한다. 원칙적으로 이 서브 단계에서 사용될 수 있는 표면에 분석물질을 부착할 수 있는 방법은 많이 있다. 예를 들어, 하나의 방법은 에폭시 실란(epoxysilane), 아미노하이드로카빌실란(aminohydrocarbylsilane) 또는 메르캅토실란(mercaptosilane)과 같은 관능화된 실란(functionalised silane)으로 유리 표면을 프라이밍(priming)하는 것을 포함한다. 이와 같이 생성된 반응 부위는 터미널 아민(terminal amine), 숙시닐(succinyl), 또는 티올(thiol)기를 갖도록 변형된 분석물질의 유도체로 처리될 수 있다.
단계 (1)의 일 실시예에서, 분석물질은 피로인산분해되어 단일 뉴클레오티드 3인산 스트림을 생성하고, 단일 뉴클레오티드 3인산 스트림의 서열은 분석물질의 서열에 상응한다. 피로인산분해는 중합효소를 포함한 반응 매질(reaction medium)의 존재 하에 20 to 900 C° 범위의 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게는, 이러한 과정은 연속 흐름의 조건 하에서 수행되어 단일 디옥시뉴클리오시드 3인산이 유리되면서 지속적으로 반응 영역으로부터 제거된다. 가장 바람직하게는, 효소 및 기타 일반적인 첨가물들을 포함하는 수성 완충 매질(aqueous buffered medium)이 분석물질과 결합된 표면 위를 연속적으로 흐르게 함으로써 피로인산분해가 수행된다.
본 발명의 일 실시예에서, 사용되는 효소는 분석물질의 점진적인 3'-5' 피로인산분해로 인해 고충실도(high fidelity) 및 적절한 반응 속도로 뉴클레오시드 3인산 스트림이 생성되도록 할 수 있는 효소이다. 바람직하게는, 이러한 분해의 속도는 가능한 한 빠르며, 일 실시예로 초당 1 내지 50개의 뉴클리오시드 3인산 범위에 속한다. 폴리뉴클레오티드 분해에 적용되는 피로인산분해 반응에 대한 추가적인 정보는 J. Biol. Chem. 244(1969) pp. 3019-3028에서 알 수 있다. 적절하게는, 피로인산분해는 피로인산 음이온 및 마그네슘 양이온(바람직하게는 밀리몰 농도)을 더 포함하는 매질의 존재 하에 수행된다.
본 발명의 방법에 따른 단계 (2)에서는, 적어도 하나의 단일 뉴클레오시드 3인산, 바람직하게는 스트림 내 개개의 단일 뉴클레오시드 3인산이 중합효소 및 리가아제의 존재 하에 프로브 시스템과 반응하여 실질적인 이중가닥 사용 프로브를 생성한다. 바람직하게는, 단계(2)가 수행되기 전에 단일 뉴클레오시드 3인산을 포함하는 단계 (1)의 산물이 피로인산 가수분해효소(pyrophosphatase)로 처리되어 잔여 피로인산을 인산 음이온으로 가수분해한다.
단계(2)에서 이용되는 중합효소는 적절하게는, 반응 조건 하에서 필수적으로 엑소(exo)- 및 엔도뉴클라아제(endonuclease) 활성을 나타내지 않는 중합효소들로 구성된 군에서 선택된다. 적절하게 사용될 수 있는 중합효소의 예로는 대장균(예를 들어, 클레나우(Klenow) 단편 중합효소), 테르무스 아쿠아티쿠스(Thermus aquaticus, 예를 들어, 타크(Taq) 중합효소), 바실러스 스테아로써모필러스(Bacillus stearothermophilus), 바실러스 칼도벨록스(Bacillus caldovelox), 및 바실러스 칼도테낙스(Bacillus caldotenax)와 같은 박테리아로부터 획득된 원핵 중합효소 1 또는 효소 유도체가 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 원칙적으로, 적합한 어떤 리가아제도 이 단계에서 사용될 수 있다.
단계 (2)에서 사용되는 프로브 시스템은 3개의 구성요소로 구성된다. 즉, (a) 검출 불가능한 상태의 특이적 검출가능요소들로 표지된 단일가닥 제1 올리고뉴클레오티드 및 (b) 제1 올리고 뉴클레오티드 상의 상보적 영역에 혼성화할 수 있으며 표지되지 않은 단일가닥 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 일 실시예에서, 제2및 제3 올리고뉴클레오티드는 불연속적인 엔티티들이지만 다른 한편으로는, 링커 영역(linker region)에 의하여 서로 연결된다. 일 실시예에서 후자의 경우, 링커 영역은 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드의 말단들을 연결한다. 바람직하게는, 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 제3 올리고 뉴클레오티드의 3' 말단을 연결한다. 링커 영역은 원칙적으로 임의의 2가 그룹(divalent group)이 될 수 있지만, 간편하게는 또 다른 단일가닥 또는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 단편이다. 일 실시예에서, 링커 영역은 실질적으로 제1 올리고뉴클레오티드에 혼성화할 수 없다.
제1, 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드는 단계(2)에서 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드가 제1 올리고뉴클레오티드 상의 3'측 및 5'측 인접영역에 각각 혼성화할 수 있도록 선택되며, 단일 뉴클레오티드를 포함하는 포획 영역(capture region)의 양 측면에 병렬로 배치된다. 여기서, 단일 뉴클레오티드의 뉴클레오티드 염기는 검출될 뉴클레오시드 3인산이 갖는 염기에 상보적이다. 이것은 3가지 구성요소의 프로브 시스템이 특정 뉴클레오시드 3인산에 대하여 매우 선택적이게 한다. 즉, 예를 들어, 분석물질이 DNA로부터 유도되고 제1, 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드가 디옥시리보뉴클레오티드인 경우, 포획 영역은 그것이 포함하는 뉴클레오티드가 티민 염기를 가진다면 디옥시아데노신(deoxyadenosine) 3인산에 대해 고도의 선택성을 가질 것이다. 본 발명의 유용한 실시예에서, 단계 (2)는 복수의 프로브 시스템 유형의 존재 하에 수행될 수 있다. 예를 들어, 제1, 제2, 제3 또는 제4 프로브 시스템 각각은 제1 올리고뉴클레오티드를 포함하고, 제1 올리고뉴클레오티드는 다양하게 탐색되는 여러 가지 뉴클레오티드 염기에 특이적인 여러 가지 포획 영역 및 그에 부착된 다양한 검출가능요소들을 갖는다.
일반적으로, 제1 올리고뉴클레오티드는 최대 150 개 뉴클레오티드의 길이이고, 바람직하게는 20개 내지 100 개 뉴클레오티드의 길이이다. 일 실시예에서, 제2 올리고뉴클레오티드는 제1 올리고뉴클레오티드의 상보적인 3' 측 인접영역보다 최대 10개 뉴클레오티드, 바람직하게는 1개 내지 5개 뉴클레오티드 만큼 길다. 또한, 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단과 이의 반대편인 제2 올리고뉴클레오티드 상의 뉴클레오티드 사이에 단일 뉴클레오티드의 불일치(mismatch)가 존재하여 바로 이 지점에서 뉴클레오시드 3인산이 중합효소에 의해 포획되는 것을 방지한다. 또 다른 실시예에서, 제3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 엑소뉴클레오리틱 분해(exonucleolytic degradation)에 저항성을 갖는 요소를 포함하여 단계 (3)에서 생성된 제4 올리고뉴클레오티드가 뒤이어 스스로 분해되지(digested) 않도록 보장한다. 이것은 예를 들어, 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합(phosphorothioate linkages), G-사중체(G-Quadruplex), 붕소화된 뉴클레오티드(boronated nucleotide), 역전된 dT/ddT, C3 스페이서(C3 spacer), 또는 인산기(phosphate group)를 그 특정 말단 또는 그 근처에 결합시키는 식으로 이루어질 수 있다.
제1 올리고뉴클레오티드의 특징은 고유한 유형의 검출가능요소(들)로 다중 표지되고 이러한 검출가능요소들은 프로브 시스템이 사용되지 않는 상태에서는 실질적으로 검출되지 않는다는 것이다. 적절하게는, 이러한 검출가능요소들은 광학 이벤트가 발생한 후에 검출되도록 적응된 요소들이다. 바람직한 일 실시예에서, 검출가능요소들은 형광단들을 포함하고, 미사용된 각각의 제1 올리고뉴클레오티드는 형광단들이 검출되도록 설계된 파장들에서는 실질적으로 비형광성을 나타낸다. 즉, 형광단은 전자기 스펙트럼의 넓은 영역에 걸쳐 일반적인 낮은 레벨의 배경 형광(background fluorescence)을 나타낼 수 있지만, 일반적으로 형광의 강도가 최대인 하나 또는 소수의 특정 파장 또는 파장 엔벨로프(envelope)가 존재할 것이다. 형광단이 특징적으로 검출되는 이러한 하나 이상의 최대 강도 지점에서는 실질적으로 비 형광성을 나타낸다. 본 발명에서 사용되는 ‘실질적으로 비형광’이라는 용어 또는 이와 동등한 문구는 관련된 특징적인 파장(characteristic wavelength) 또는 파장 엔벨로프에서의 제1 올리고뉴클레오티드에 부착된 전체 형광단의 형광 강도가 자유 형광단(free fluorophore)의 당량수에 상응하는 형광 강도의 25 % 미만이라는 것을 의미한다. 바람직하게는 10 % 미만, 더욱 바람직하게는 1 % 미만, 그리고 가장 바람직하게는 0.1 % 미만이다.
원칙적으로, 제1 올리고뉴클레오티드가 사용되지 않은 상태에서 형광단이 실질적으로 비형광성임을 확실히 하기 위해 어떠한 방법이라도 이용할 수 있다. 한 방법으로, 형광단에 가깝게 소광물질을 추가적으로 부착할 수 있다. 또 다른 방법은, 복수 개의 형광단이 제1 올리고뉴클레오티드에 서로 근접하게 부착될 때 이들은 서로 충분히 잘 소광시키는 경향이 있어서, 이전 문단에서 설명한 기준은 소광물질 없이도 만족될 수 있다는 관측에 기초한다. 본 발명의 내용에서, 형광단 간의 또는 형광단과 소광물질 간의 "근접"에 해당하는 것은, 사용되는 특정 형광단 및 소광물질, 및 아마도 제1 올리고뉴클레오티드의 구조적인 특징에 따라 달라질 것이다. 따라서, 이 용어는 다양한 요소들의 어떤 특정한 구조적인 배열을 의미한다기보다는 요구되는 결과와 관련되도록 구성될 것이다. 그러나, 인접한 형광단들 또는 인접한 형광단 및 소광물질이 특징적인 Forster distance(일반적으로 5 nm 이하)에 상응하는 거리만큼 이격될 때, 일반적으로 충분한 소광(quenching)이 이루어질 수 있음을 주목해야 하며, 이는 단지 예를 들어 설명한 것이다.
적절하게는, 제1 올리고뉴클레오티드가 적어도 1개, 바람직하게는 최대 20개의 형광단으로 표지된다. 최대 효과를 얻기 위해서는, 제1 올리고뉴클레오티드가 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개의 형광단으로 표지되는 것이 바람직하다. 따라서, 이러한 최대 또는 최소의 어떤 순열(permutation)로 구성되는 범위들은 본 발명에서 구체적으로 파악된다. 소광물질이 사용될 때, 제1 올리고뉴클레오티드는 최대 20개, 바람직하게는 최대 10개, 더욱 바람직하게는 최대 5개의 형광단으로 표지된다.
전술한 형광단 자체와 관련하여, 이들은 원칙적으로 본 기술분야에서 일반적으로 사용되는 것들로부터 선택될 수 있으며, 이에 대한 예는 크산텐 모이에티(xanthene moiety, 예를 들어, 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine), 및 플루오레세인 이소티오시아네이트(fluorescein isothiocyanate)와 같은 이의 유도체, 로다민 B(rhodamine B) 등), 쿠마린(coumarin) 모이에티(예를 들어, 하이드록시(hydroxy-), 메틸(methyl-), 및 아미노 쿠마린(aminocoumarin)), 및 Cy2, Cy3, Cy5, 및Cy7와 같은 시아닌(cyanine) 모이에티를 포함하며, 본 발명이 이로 한정되는 것은 아니다. 구체적인 예는 후술할 통상적으로 사용되는 염료에서 기인한 형광단을 포함한다. 예컨대, 알렉사(Alexa) 염료, 시아닌(cyanine) 염료, Atto Tec 염료, 및 로다민(rhodamine) 염료 등이 있다. 또한, 이들의 예로 Atto 633(ATTO-TEC GmbH), Texas RedTM, Atto 740(ATTO-TEC GmbH), Rose Bengal, Alexa FluorTM 750 C5-maleimide (Invitrogen 사), Alexa FluorTM 532 C2-maleimide(Invitrogen 사), 및 Rhodamine Red C2-maleimide 및 Rhodamine Green, 뿐만 아니라 Quasar 570과 같은 포스포라마디트(phosphoramadite) 염료를 포함한다. 또한, LI-COR Biosciences사에 의해 공급되는 것들과 같은 양자점 또는 근적외선 염료를 사용할 수 있다. 본 실시예의 형광단은 일반적으로 본 기술분야에서 알려진 화학적 방법을 사용하여 뉴클레오티드 염기에 의해 제1 올리고 뉴클레오티드에 부착된다.
적절한 소광물질은 FRET(Forster resonance energy transfer) 메커니즘에 의해 작동하는 것들을 포함한다. 전술된 형광단과 관련되어 사용될 수 있는 시중에서 구입 가능한 소광물질의 예는 DDQ-1, Dabcyl, Eclipse, Iowa Black FQ 및 RQ, IR Dye-QC1, BHQ-0, BHQ-1, -2 및 -3, 및 QSY-7 및 -21을 포함하며, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
일 실시예에서, 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드는 검출가능요소로 표지되지 않는다.
단계 (2)는 바람직하게는 전술한 20 내지 800 C° 범위의 온도에서 스트림 내 각각의 단일 뉴클레오티드 3인산을 하나 이상의 프로브 시스템과 접촉시킴으로써 수행된다.
본 발명의 방법에 따른 단계(2)의 생성물은 전술한 바와 같이 실질적인 이중가닥 사용 프로브이고, 이를 구성하는 사슬들은 각각 제1 올리고뉴클레오티드 및 상보적인 제4 올리고뉴클레오티드이며, 이의 5'-3' 방향으로 판독될 때는 제2 올리고뉴클레오티드, 이어서 단일 뉴클레오티드 3인산으로부터 유도된 뉴클레오티드, 그리고 마지막으로 제3 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드가 이전에 링커 영역(linker region)에 의해 함께 결합되었다면, 제4 올리고뉴클레오티드는 외부핵 분해(exonucleolysis)에 고도로 저항성있는 폐루프 사슬을 포함할 것을 쉽게 이해할 것이다.
단계 (3)에서 사용 프로브(used probe)는 30 내지 1000 C° 범위의 온도에서 효소로 처리된다. 이 단계에서는 검출가능요소들을 서로 분리함으로써 소광되지 않아(unquenched) 검출 가능하게 하는 과정에서, 제1 올리고뉴클레오티드로부터 기인한 사용 프로브의 사슬이 이를 구성하는 뉴클레오티드들(경우에 따라 디옥시리보뉴클레오시드 1인산 또는 리보뉴클레오시드 1인산) 로 분해(digested)된다. 따라서, 검출가능요소들이 제1 올리고뉴클레오티드에서 검출 불가능한 상태로 소광되는 형광단들일 경우, 단계 (3)은 형광단들을 서로 및 임의의 소광물질들로부터 유리시켜 형광을 발하도록 할 것이다. 그러므로 관찰자는 분해(digestion) 과정이 일어나면서 단일 뉴클레오티드의 캐스케이드(cascade)가 생성됨에 따라 빠르게 증가하는 형광신호를 확인할 수 있을 것이다. 이러한 형광 특성은 관련된 프로브 시스템에 의해 본래 포획된 단일 뉴클레오시드 3인산의 특성을 간접적으로 반영한다.
과정 (3)에서 사용될 수 있는 효소는 3'-5' 엑소뉴클레오리틱(exonucleolytic) 활성을 나타내는 엑소뉴클레아제(exonuclease) 또는 중합효소를 포함한다. 이 효소의 종류로는 Q5, Q5 Hot Start, Phusion, Phusion HS, Phusion II, Phusion II HS, Dnase I (RNase-free), Exonuclease I or III (ex E.coli), Exonuclease T, Exonuclease V (RecBCD), Lambda Exonuclease, Micrococcal Nuclease, Mung Bean Nuclease, Nuclease BAL-31, RecJf, T5 Exonuclease and T7 Exonuclease가 포함된다.
일 실시예에서 단계 (3)의 말미에는 제1 및 제4 올리고뉴클레오티드로부터 남겨진 잔여 올리고뉴클레오티드 단편을 제거하고 새로운 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드가 어닐링(annealing)되도록 하기 위하여, 비교적 높은 온도와 비교적 낮은 온도 사이에서 반응 혼합물이 순환된다.
단계 (4)에서 이제 단일가닥 형태로 나타나는 제4 올리고뉴클레오티드는 또 다른 제1 올리고뉴클레오티드 분자에 혼성화되어 이로써, 상응하는 즉, 사용 프로브와 동일한 화학적 및 물리적 구조를 갖는 새로운 실질적인 이중가닥 올리고뉴클레오티드 생성물을 생성한다. 이 생성물은 이후 단계 (3)이 반복되는 과정에서 분해되고(digested), 이로써 검출 가능 상태의 검출가능요소들을 추가적으로 더 방출시키며 다시 제4 올리고뉴클레오티드를 재생산한다. 그 후, 단계 (5)에 따라, 단계 (3) 및 단계 (4)는 자유 검출가능요소들(예: 형광 신호)로부터 신호가 더욱 증대되도록 주기적으로 지속될 수 있다. 원칙적으로는, 실질적으로 모든 제1 올리고뉴클레오티드가 소모될 때까지 지속된다. 따라서, 관찰자는 이전에 획득한 것보다 훨씬 더 많이 증대된 형광 신호를 볼 수 있다.
이후, 단계 (6)에서는 단계 (3)이 여러 번 반복되는 동안 유리된 검출가능요소들이 검출되고, 단일 뉴클레오티드 3인산에 부착되는 뉴클레오티드 염기의 특성이 결정된다. 단계 (1)에서 생성된 스트림 내 모든 단일 뉴클레오시드 3인산에 대하여 본 발명의 방법을 체계적으로 수행함으로써, 최초 핵산 분석물질 서열의 데이터 특성이 생성되어 분석될 수 있다. 이것을 수행하는 방법은 본 발명이 속한 기술분야에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 다양한 형광단들의 특징적인 형광 파장/파장 엔벨로프에 맞춰진 광검출기 또는 이와 동등한 장치를 이용하여 형광물질을 발견할 수 있다. 이것은 차례로 광검출기로 하여금 이미 알려진 알고리즘들을 이용하여 컴퓨터에서 처리되고 분석될 수 있는 특성 전기 신호(characteristic electrical signal)를 생성하도록 할 수 있다. 일 실시예에서, 검출 가능한 상태의 검출가능요소의 수가 최대값까지 증가하는 것을 보장하기 위한 일정 기간의 시간이 단계 (5) 와 단계 (6) 사이에 허용된다.
특히 바람직한 일 실시예에서, 본 발명의 방법은 마이크로 드롭릿 스트림 내 전부 또는 일부분에서 수행되고, 적어도 일부 마이크로 드롭릿은 단일 뉴클레오티드 3인산을 포함한다. 바람직하게는 정렬된 스트림이다. 예를 들어, 그러한 방법은 단계 (1)에서 생성된 뉴클레오시드 3인산을 상응하는 수성 마이크로 드롭릿 스트림에 하나씩 삽입함으로써 개시될 수 있다. 여기서, 수성 마이크로 드롭릿 스트림은 탄화수소 또는 실리콘 유(silicone oil)와 같이 배열을 보존하는 데 도움이 되는 비혼합성 운반 용매(immiscible carrier solvent) 내에서 유지된다. 바람직하게는, 이 방법은 피로인산분해 반응 영역의 마이크로 드롭릿 다운스트림(downstream)을 직접 생성함으로써 이루어질 수 있다. 예를 들어, 반응 매질을 적절한 차원의 마이크로 드롭릿 헤드(head)로부터 용매의 유동 스트림으로 나오게 함으로써 이루어질 수 있다. 전술한 방법 대신에, 단계 (1)에서의 반응 매질의 작은 앨리쿼트(aliquots)가 용매에 현탁된(suspended) 기 존재하는 수성 마이크로 드롭릿의 스트림으로 주기적, 순차적으로 주입될 수 있다. 후자의 방법이 채택되는 경우, 각각의 마이크로 드롭릿은 단계 (2) 내지 (5)를 수행하는 데 필요한 효소 및 기타 그 밖의 시약들(예: 완충액)과 함께 프로브 시스템(들)의 다양한 구성요소들을 이미 함유할 수 있다. 또 다른 방법으로, 전자의 방법에 따라 생성된 마이크로 드롭릿은 이어서 기 존재하는 마이크로 드롭릿 스트림과 합쳐지게 되어 유사한 결과가 달성되도록 할 수 있다. 이러한 마이크로 드롭릿 방법들에서 바람직하게는, 이후 단계 (6)이, 유리된 검출가능 요소들 및 원래 포함된 뉴클레오시드 3인산의 성질을 확인하기 위하여 각각의 마이크로 드롭릿을 분석하는 과정을 포함한다.
주어진 마이크로 드롭릿이 하나의 뉴클레오시드 3인산보다 더 많은 뉴클레오시드 3인산을 함유할 위험을 방지하기 위해, 단계 (1)에서는, 각각의 채워진 마이크로 드롭릿(filled microdroplet)이 1개 내지 20개, 바람직하게는 2개 내지 10개의 비어있는 마이크로 드롭릿(empty microdroplet) 으로 분리되는 속도로 뉴클레오시드 3인산 각각을 방출하는 것이 바람직하다. 이후, 용매 내의 채워진 마이크로 드롭릿 및 채워지지 않은 마이크로 드롭릿의 스트림은 유로(flow path), 바람직하게는 미소유체(microfluidic) 유로를 따라 서로 분리된 상태로 응집할 기회를 갖지 않도록 하는 속도 및 방식으로 흐르게 된다. 적절하게는, 사용되는 마이크로 드롭릿은 100 미크론(micron) 미만, 바람직하게는 50 미크론 미만, 더욱 바람직하게는 20 미크론 미만, 그리고 더더욱 바람직하게는 15 미크론 미만의 유한한 지름을 갖는다. 모든 마이크로 드롭릿의 지름 중 가장 바람직한 길이는 2 내지 20 미크론의 범위 내이다. 일 실시예에서, 전체 시스템을 통하는 마이크로 드롭릿 유속은 초당 50개 내지 3000개의 마이크로 드롭릿, 바람직하게는 100개 내지 2000개의 마이크로 드롭릿의 범위 내이다.
본 발명의 제2 측면에 따르면, (a) 검출 불가능한 상태의 하나 이상의 형광단으로 표지된 단일가닥 제1 올리고뉴클레오티드 및 (b) 제1 올리고뉴클레오티드 상에서 단일 뉴클레오티드 포획 영역의 각 측면에 병렬로 배치된 상보적인 3' 측 및 5' 측 인접영역들에 각각 혼합화할 수 있는 표지되지 않은 단일가닥 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드를 포함하되, 제2 올리고뉴클레오티드의 길이는 3' 측 인접영역보다 적어도 1개의 뉴클레오티드만큼 긴 것을 특징으로 하는 프로브 시스템이 제공된다.
본 발명의 제2 측면의 제1 실시예에서, 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드는 링커 영역(linker region), 보통 단일- 또는 이중가닥 올리고뉴클레오티드 영역에 의해 연결된다. 다른 실시예에서, 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드는 제2 올리고뉴클레오티드 내 상응하는 뉴클레오티드와 불일치(mismatch)된다. 또 다른 실시예에서, 제3 올리고 뉴클레오티드는 그의 3' 말단에서 엑소뉴클레오리틱 분해(exonucleolytic degradation)에 대한 저항성을 갖는 요소를 포함한다. 본 발명의 또 다른 실시예에서, 형광단은 소광물질 또한 포함할 수도 있는 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 인접영역에 위치한다.
전술한 방법 및 프로브 시스템은 서열분석장치에 적절하게 이용될 수 있고, 이러한 장치는 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 이해될 수 있다.
이하, 본 발명의 다양한 측면들에 대하여 아래 예시들을 참조하여 후술한다.
예시 1 - 프로브 시스템의 제조 및 사용
아래의 뉴클레오티드 염기서열을 갖는 단일가닥 제1 올리고뉴클레오티드 1이 제조된다:
5'TCGTGCCTCATCGAACATGACGAGGXXQXXGGTTTGTGGT3'
여기서, A, C, G 및 T는 DNA의 관련된 특징적인 뉴클레오티드 염기를 갖는 뉴클레오티드를 나타낸다. X는 기존의 아민 부착 화학(amine attachment chemistry)을 이용하여 Atto 655염료로 표지된 디옥시티미딘(deoxythymidine) 뉴클레오티드(T)를 나타내고, Q는 BHQ-2 quencher로 표지된 디옥시티미딘 뉴클레오티드를 나타낸다. 또한, 이는 디옥시뉴클레오티드 3인산(dNTPs) 혼합물에서 디옥시티미딘 3인산 뉴클레오티드(dTTPs)를 포획하는데 선택성을 갖는 포획 영역(A 뉴클레오티드)을 더 포함한다.
다른 단일가닥 올리고뉴클레오티드 2도 제조된다. 이는 (1) 단일 염기 불일치(mismatch)가 있는 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단에 상보적인 서열을 갖는 제2 올리고뉴클레오티드 영역, (2) 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단에 상보적인 서열을 갖는 제3 올리고뉴클레오티드 영역, 및 (3) 76개 염기쌍의 단일가닥 링커 영역을 포함한다. 이것은 아래와 같은 뉴클레오티드 염기서열을 갖는다.
5'PCATGTTCGATGAGGCACGATAGATGTACGCTTTGACATACGCTTTGACAATACTTGAGCAGTCGGCAGATATAGGATGTTGCAAGCTCCGTGAGTCCCACAAACCAAAAACCTCG3'
추가적으로 여기서 P는 5' 인산기를 의미한다.
이어서, 프로브 시스템을 포함하는 반응 혼합물이 제조된다. 프로브 시스템은 다음 배합으로부터 도출된 것에 상응하는 조성물을 갖는다.
56uL 5x buffer pH 7.5
28uL oligonucleotide 1, 100 nM
28uL oligonucleotide 2, 10 nM
2.8uL mixture of dNTPs (including dTTP), 10 nM
0.4U Phusion II Hot Start polymerase (exonuclease)
1.6U Bst Large Fragment polymerase
20U E. coli ligase
4U Thermostable Inorganic Pyrophosphatase
Water to 280uL
여기서, 5x buffer는 아래 혼합물을 포함한다:
200uL Trizma hydrochloride, 1M, pH 7.5
13.75uL aqueous MgCl2, 1M
2.5uL Dithiothreitol, 1M
50uL Triton X-100 surfactant (10%)
20uL Nicotinamide adenine dinucleotide, 100 uM
166.67uL KCl
Water to 1mL
이후, 폐루프 사용 프로브(used probe)를 형성하기 위하여, 50분 동안 700 C°까지 온도를 증가시킨 후에 추가 50분 동안 370 C°에서 혼합물을 배양함으로써, dTTPs의 포획 및 올리고뉴클레오티드 2와 올리고뉴클레오티드 1의 연결반응이 수행된다. 반응 혼합물은 이후 헬륨-네온 레이저의 633 nm 광선으로 조사되어, 조사 결과 Atto 655 염료의 특이적 형광물질이 카메라에 의해 외부핵 분해(exonucleolysis) 주기마다 검출되고 사용 프로브의 재생성이 시작된다.
반응 혼합물의 dNTP성분의 존재 및 부재 하에서 시간 경과에 따른 형광의 세기 증가가 모니터링되고, 도 1에 그래프로 그 결과가 도시되어 있다. 도 1로부터 프로브 시스템은 dTTPs를 효과적으로 포획하고, 본 발명의 방법의 주기적 성질이 형광 신호의 급증에 이르게 함을 알 수 있다. 반면에, dNTPs가 존재하지 않는 비교실험에서는 올리고뉴클레오티드 1 상의 Atto 655 염료가 상당한 정도까지 형광을 발하지 않는다.
예시2 - 프로브 시스템을 이용한 드롭릿 미소유체(droplet microfluidic ) 방법
도 2는 미소유체 서열분석장치를 개략적으로 도시하며, 단일 뉴클레오티드 염기를 각각 포함하는 장치 내 마이크로 드롭릿들은 전술한 바와 같은 유형의 프로브 시스템과 반응하게 된다.
인간 DNA로부터 도출된 100개의 뉴클레오티드 염기를 갖는 폴리뉴클레오티드 분석물질의 점진적인 피로인산분해에 의해 수득되는 단일 뉴클레오티드 3인산 스트림을 포함하는 수성 매질 1은, PDMS 중합체로 제조된 10 미크론(micron) 직경의 미소유체 튜브를 통해 흐르게 된다. 피로인산분해 반응 자체는 720 C° 에서 완충된(pH 7.5) 수성의 반응 매질 스트림을 통과함으로써 수행되며, 이 수성 반응 매질 스트림은, 숙시닐 브릿지(succinyl bridge)에 의해 분석물질이 기 부착되어 있는 유리 마이크로 비드(glass micro bead) 상으로, 각각 리터당 2밀리몰 농도의 피로인산 나트륨 및 염화 마그네슘을 갖는 용액과 타크 중합효소(Taq Pol)를 포함한다. 1 즉, 마이크로 비드의 다운스트림에서 단일 뉴클레오티드들의 순서는 분석물질의 서열에 상응한다. 1은 드롭릿 헤드(2)에서 제1 챔버(3) 로 나가서 하나 이상의 비혼합성 경량 실리콘 유(light silicone oil) 스트림(4)과 접촉된다. 이러한 스트림의 속도는 격렬한 혼합을 피하고 실리콘 유 내 부유된 대략 8 미크론 직경의 구형(spherical) 수성 드롭릿(5)을 생성하도록 선택된다. 일반적으로, 인접한 채워진 드롭릿들(filled droplets) 간에는 10개의 비어있는 드롭릿(empty droplets)들이 존재하도록 속도가 조절된다. 5의 스트림은 이후, 동일 직경의 제2 미소유체 튜브를 따라 제2 챔버(6)로 운반되며, 5 미크론의 구형 수성 드롭릿(7)의 제2 스트림 또한 제2 드롭릿 헤드(8)에 의해 제2 챔버(6) 내로 공급된다. 드롭릿들(5 및 7)은 순차적으로 합쳐져 직경이 약 9 미크론으로 확장된 수성 드롭릿들을 형성한다. 각각의 드롭릿(7)은 피로인산 가수분해효소(pyrophosphatase)를 함유하여 각 드롭릿(5)에 존재하는 임의의 잔여 피로인산 음이온을 파괴한다.
이후, 9의 스트림은 동일 속도로 미소유체 튜빙(tubing)을 통해 제3 챔버(10) 내로 운반되고, 제3 챔버(10)에서 이 드롭릿들은 5 미크론의 구형 수성 드롭릿(11)들과 접촉한다. 구형 수성 드롭릿(11) 또한 상응하는 드롭릿 헤드(12)를 통해 제3 챔버(10) 내로 공급된다. 각 드롭릿(9)이 챔버들(6 및 10) 사이를 이동하는 데 걸리는 시간은 예컨대, 2분이다.
그 다음, 드롭릿들(9 및 11)은 제3 챔버(10)에서 합쳐져 드롭릿들(13, 대략 10 미크론의 직경)을 생성하게 된다. 드롭릿(11) 각각은 중온성 리가아제(mesophilic ligase), 3'-5' 이중가닥 엑소뉴클레아제 활성을 나타내는 고온성 중합효소, 및 예시 1에서 설명한 것과 유사한 4쌍의 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 포함하는 프로브 시스템을 포함한다. 각각의 제1 올리고뉴클레오티드는 40개 뉴클레오티드의 길이이고, DNA의 4가지 특징적인 뉴클레오티드 염기 유형들(즉, A, T, G 및 C) 특성을 갖는 상이한 20번째 뉴클레오티드(5' 말단으로부터 측정됨)를 갖는다. 제1 올리고뉴클레오티드 각각은 또한 서로 근접해있는 여러 형광단 및 소광물질들로 표지되어, 결합상태에서 그들은 실질적으로 비형광성이고 방출될 때는 그들이 유래된 제1 올리고뉴클레오티드의 특징적인 파장에서 형광을 발하게 된다. 4가지 상이한 제2 올리고뉴클레오티드들은 각각 115개 뉴클레오티드 염기의 길이이고, 제1 올리고뉴클레오티드의 20번째 염기들의 인접영역에 상보적인 두 말단들에서 상이한 종결서열(terminating sequence)를 가지며, 공통적인 76개 염기쌍 링커 영역을 갖는다.
이와 같이 형성되어 응집된 마이크로 드롭릿들(13)의 스트림은 이후, 30분 동안 370 C° 에서, 다음 30분 동안 700 C° 에서 배양(incubation)된다. 이 시간이 종료되면 마이크로 드롭릿(130)은 검출시스템(14)으로 전송된다.
검출 시스템(미도시)는 대체로 각 드롭릿을 레이저의 입사광으로 분석하는 검출 윈도우를 포함한다. 이후 입사광은 원래는 포획된 분자(또는 원래 드롭릿이 비어있던 경우에는 본질적으로 전혀 그렇지 않음)로 혼입(incorporation)되었던 단일 뉴클레오티드 염기의 특징적인 방식으로 각 드롭릿 내에서 방출된 형광단들이 형광을 발하도록 야기한다. 이러한 형광의 존재 유무는 전술한 4개의 형광단들의 4가지 특징적인 파장에서 추후 검출된다. 따라서, 드롭릿들이 차례로 분석됨에 따라 최초 폴리뉴클레오티드 분석물질 내의 뉴클레오티드 염기서열이 사실상 판독될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Base4 Innovation Limited <120> SINGLE NUCLEOTIDE DETECTION METHOD <130> P61091WO <150> GB1412977.9 <151> 2014-07-22 <160> 2 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide 1 <220> <221> misc_feature <222> (26)..(26) <223> deoxythymidine nucleotide (T) labelled with Atto 655 dye <220> <221> misc_feature <222> (27)..(27) <223> deoxythymidine nucleotide (T) labelled with Atto 655 dye <220> <221> misc_feature <222> (28)..(28) <223> deoxythymidine nucleotide labelled with a BHQ-2 quencher <220> <221> misc_feature <222> (29)..(29) <223> deoxythymidine nucleotide (T) labelled with Atto 655 dye <220> <221> misc_feature <222> (30)..(30) <223> deoxythymidine nucleotide (T) labelled with Atto 655 dye <400> 1 tcgtgcctca tcgaacatga cgaggttttt ggtttgtggt 40 <210> 2 <211> 115 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> oligonucleotide 2 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> 5' phosphate group attached to cytosine <400> 2 catgttcgat gaggcacgat agatgtacgc tttgacatac gctttgacaa tacttgagca 60 gtcggcagat ataggatgtt gcaagctccg tgagtcccac aaaccaaaaa cctcg 115

Claims (26)

  1. 핵산의 염기서열 분석방법에 있어서,
    (1) 상기 핵산의 점진적인 피로인산분해에 의해 단일 뉴클레오시드 3인산 스트림을 생성하는 단계;
    (2) 중합효소 및 리가아제의 존재 하에 적어도 하나의 상기 단일 뉴클레오시드 3인산과 상응하는 프로브 시스템을 반응시킴으로써 적어도 하나의 이중가닥-포함 올리고 뉴클레오티드 사용 프로브(used probe)를 생성하는 단계로, 상기 상응하는 프로브 시스템은, (a) 검출 불가능한 상태의 특이적 검출가능요소들로 표지된 단일가닥 제1 올리고뉴클레오티드 및 (b) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 상의 상보적 영역에 혼성화할 수 있는 단일가닥 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 단계;
    (3) 이중가닥 엑소뉴클레오리틱(exonucleolytic) 활성을 갖는 효소로 상기 사용 프로브를 분해(digesting)하여, 검출 가능한 상태의 상기 검출가능요소들 및 적어도 부분적으로 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 서열 보체인 단일가닥 제4 올리고뉴클레오티드를 생성하는 단계;
    (4) 상기 제4 올리고뉴클레오티드를 다른 제1 올리고뉴클레오티드와 반응시켜 상기 사용 프로브에 상응하는 이중가닥-포함 올리고뉴클레오티드 생성물을 생성하는 단계;
    (5) 상기 단계 (3) 및 (4)를 주기적으로 반복하여 수행하는 단계; 및
    (6) 상기 단계 (3)의 매 반복마다 방출되는 상기 특이적 검출가능요소들을 검출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 상기 제3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 링커(linker) 영역에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 링커 영역은 올리고뉴클레오티드 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제2항 및 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생성된 제4 올리고뉴클레오티드는 폐루프 형태인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 제1 올리고뉴클레오티드는 단일 뉴클레오티드 포획(capture) 영역을 포함하고, 상기 포획 영역은 포획될 상기 단일 뉴클레오시드 3인산에 상보적이며 상기 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역들에 인접해 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 검출가능요소들은 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 및 상기 포획 영역 사이의 상기 제1 올리고 뉴클레오티드 상에 위치하는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제5항에 있어서,
    상기 제2 올리고뉴클레오티드는,
    (a) 상기 포획 영역의 3' 측상 인접영역에 혼성화되고,
    (b) 상기 3' 측상 인접영역보다 긴 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 제3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 엑소뉴클레오리틱 분해(exonucleolytic degradation)에 저항성을 갖는 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3'말단과 상기 제2 올리고뉴클레오티드의 대응 영역 사이에 적어도 하나의 뉴클레오티드 염기 불일치가 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 제1 올리고뉴클레오티드에 부착된 상기 검출가능요소들은 형광단들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 형광단들은 적어도 하나의 소광물질의 존재에 의해 상기 제1 올리고뉴클레오티드에서 검출 불가능하게 되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (3)의 온도를 순환시켜, 상기 검출가능요소들이 방출된 후에 상기 제4 올리고뉴클레오티드에 부착된 임의의 잔여 올리고뉴클레오티드 단편들을 제거하고, 새로운 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드가 어닐링(annealing)되게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 프로브 시스템은 상이한 포획 영역 및 특징적인 검출가능요소들을 각각 제공받는 복수의 제1 올리고뉴클레오티드 유형들을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    최대 4개까지의 다양한 올리고뉴클레오티드 프로브 시스템 세트들이 사용되고,
    각 세트의 상기 제1 올리고뉴클레오티드는, 자연발생 DNA 또는 RNA의 특징적인 뉴클레오티드 염기들 중 하나에 대해 선택적인 포획 영역 및 상이한 검출가능요소들을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (1)은 각각의 단일 뉴클레오시드 3인산을 상응하는 마이크로 드롭릿(microdroplet)에 함유하는 단계를 더 포함하고 상기 단계 (2) 및 (6)은 상기 각각의 마이크로 드롭릿 상에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 단계 (6)을 상기 각각의 마이크로 드롭릿에 적용함으로써 획득되는 결과물들이 상기 핵산의 염기서열의 데이터 특성 스트림으로 조합되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 다성분의 생물학적 프로브 시스템에 있어서,
    (a) 검출 불가능한 상태의 하나 이상의 형광단으로 표지된 단일가닥 제1 올리고뉴클레오티드; 및
    (b) 상기 제1 올리고뉴클레오티드 상에서 단일 뉴클레오티드 포획 영역의 각 측면에 병렬로 배치된 상보적인 3' 측 및 5' 측 인접영역들에 각각 혼합화할 수 있는 표지되지 않은 단일가닥 제2 및 제3 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 시스템.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 제2 올리고뉴클레오티드의 5' 말단과 상기 제3 올리고뉴클레오티드의 3' 말단은 링커(linker) 영역에 의해 연결되는 것을 특징으로 하는 생물학적 프로브 시스템.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 링커 영역은 올리고뉴클레오티드 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 프로브 시스템.
  20. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 형광단들은 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 5' 측 인접영역에 위치하는 것을 특징으로 하는 생물학적 프로브 시스템.
  21. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 소광물질을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 프로브 시스템.
  22. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제2 올리고뉴클레오티드는 상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 측 인접영역보다 긴 것을 특징으로 하는 생물학적 프로브 시스템.
  23. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제3 올리고뉴클레오티드는 3' 말단에 엑소뉴클레오리틱 분해(exonucleolytic degradation)에 저항성을 갖는 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 프로브 시스템.
  24. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 올리고뉴클레오티드의 3' 말단의 뉴클레오티드는 상기 제2 올리고뉴클레오티드에서 상응하는 뉴클레오티드와 불일치하는 것을 특징으로 하는 생물학적 프로브 시스템.
  25. 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포획 영역 및 사용된 상기 형광단들에 특징적인 뉴클레오티드 염기와는 다른 1 내지 4개의 상이한 제1 올리고뉴클레오티드 유형을 포함하는 것을 특징으로 하는 생물학적 프로브 시스템.
  26. 제17항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서,
    마이크로드롭릿(microdroplet)에 함유되는 것을 특징으로 하는 생물학적 프로브 시스템.
KR1020177001507A 2014-07-22 2015-07-22 단일 뉴클레오티드 검출 방법 Expired - Fee Related KR101754091B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GBGB1412977.9A GB201412977D0 (en) 2014-07-22 2014-07-22 Single nucleotide detection method
GB1412977.9 2014-07-22
PCT/GB2015/052119 WO2016012789A1 (en) 2014-07-22 2015-07-22 Single nucleotide detection method

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170018066A KR20170018066A (ko) 2017-02-15
KR101754091B1 true KR101754091B1 (ko) 2017-07-05

Family

ID=51494950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177001507A Expired - Fee Related KR101754091B1 (ko) 2014-07-22 2015-07-22 단일 뉴클레오티드 검출 방법

Country Status (12)

Country Link
US (3) US9856528B2 (ko)
EP (2) EP3013987B1 (ko)
JP (1) JP6433575B2 (ko)
KR (1) KR101754091B1 (ko)
CN (1) CN106471133B (ko)
AU (1) AU2015293706B2 (ko)
BR (1) BR112016029548A2 (ko)
CA (1) CA2951212C (ko)
DK (2) DK3013987T3 (ko)
ES (2) ES2655319T3 (ko)
GB (1) GB201412977D0 (ko)
WO (1) WO2016012789A1 (ko)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3115109A1 (en) 2015-07-06 2017-01-11 Base4 Innovation Limited Droplet sequencing device
EP3207982A1 (en) 2016-02-17 2017-08-23 Base4 Innovation Limited Improved droplet sequencing apparatus and method
EP3211092B1 (en) * 2016-02-24 2019-03-27 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method
EP3269444A1 (en) 2016-07-14 2018-01-17 Base4 Innovation Ltd Method of identifying droplets in a stack and an associated sequencer
JP2019532623A (ja) * 2016-09-02 2019-11-14 ベース４ イノベーション リミテッド 単一ヌクレオチド検出方法および関連プローブ
US20200216883A1 (en) * 2016-09-06 2020-07-09 Base4 Innovation Limited Single nucleotide detection method and associated probes
WO2018054964A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Base4 Innovation Limited Single nucleotide detection method and associated probes
JP7257334B2 (ja) * 2017-05-15 2023-04-13 ライトキャスト ディスカバリー リミテッド 単一ヌクレオチド検出方法および関連するプローブ
SG10202111850XA (en) * 2017-06-21 2021-12-30 Lightcast Discovery Ltd Method for Investigating Molecules Such as Nucleic Acids
KR20240051316A (ko) 2017-06-21 2024-04-19 라이트캐스트 디스커버리 엘티디 마이크로 유체 분석 장치
IL313689A (en) 2017-06-21 2024-08-01 Lightcast Discovery Ltd Microdroplet manipulation device
JP7230039B2 (ja) * 2017-10-23 2023-02-28 ライトキャスト ディスカバリー リミテッド 単一ヌクレオチド分析方法及び関連するプローブ
WO2019219905A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Base4 Innovation Limited Droplet manipulation device and method
WO2019243577A1 (en) 2018-06-21 2019-12-26 Base4 Innovation Limited Sequencing method using modified nucleoside polyphosphates
WO2020016590A1 (en) 2018-07-19 2020-01-23 Biofidelity Ltd Improved polynucleotide sequence detection method
PL3693086T3 (pl) 2019-02-08 2021-04-19 Lightcast Discovery Ltd Sposób manipulacji mikrokroplami
CN110938690B (zh) * 2019-11-20 2022-11-01 江西师范大学 基于目标触发的酶辅助发夹探针重塑的无标记比色传感器及其应用
GB201919186D0 (en) 2019-12-23 2020-02-05 Biofidelity Ltd Simplified polynucleotide sequence detection method

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003080861A1 (en) 2002-03-22 2003-10-02 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Single molecule sequencing using phosphate labeled nucleotides

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2575270B2 (ja) 1992-11-10 1997-01-22 浜松ホトニクス株式会社 核酸の塩基配列決定方法、単一分子検出方法、その装置及び試料の作成方法
IL108497A0 (en) 1993-02-01 1994-05-30 Seq Ltd Methods and apparatus for dna sequencing
WO1999049293A2 (en) * 1998-03-24 1999-09-30 Boston Probes, Inc. Methods, kits and compositions pertaining to detection complexes
US6515120B1 (en) * 1999-05-25 2003-02-04 Praelux Incorporated Method for sequencing and characterizing polymeric biomolecules using aptamers and a method for producing aptamers
GB201217772D0 (en) * 2012-10-04 2012-11-14 Base4 Innovation Ltd Sequencing method
US10000802B2 (en) * 2012-10-04 2018-06-19 Base4 Innovation Ltd Sequencing method
GB201217770D0 (en) * 2012-10-04 2012-11-14 Base4 Innovation Ltd Biological probes and the use thereof
GB201300957D0 (en) 2013-01-18 2013-03-06 Base4 Innovation Ltd Sequencing method
GB201306444D0 (en) * 2013-04-09 2013-05-22 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method
GB201306445D0 (en) 2013-04-09 2013-05-22 Base4 Innovation Ltd Single nucleotide detection method

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003080861A1 (en) 2002-03-22 2003-10-02 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Single molecule sequencing using phosphate labeled nucleotides

Also Published As

Publication number Publication date
ES2610461T3 (es) 2017-04-27
US20170130265A1 (en) 2017-05-11
CA2951212C (en) 2019-01-08
JP2017522031A (ja) 2017-08-10
EP3013987B1 (en) 2016-11-16
KR20170018066A (ko) 2017-02-15
EP3150725B1 (en) 2017-12-06
US9856528B2 (en) 2018-01-02
EP3150725A1 (en) 2017-04-05
CN106471133A (zh) 2017-03-01
US20180057872A1 (en) 2018-03-01
DK3013987T3 (en) 2017-02-27
WO2016012789A1 (en) 2016-01-28
BR112016029548A2 (pt) 2017-10-24
US10519497B2 (en) 2019-12-31
GB201412977D0 (en) 2014-09-03
US20180080074A1 (en) 2018-03-22
CA2951212A1 (en) 2016-01-28
AU2015293706B2 (en) 2017-11-02
ES2655319T3 (es) 2018-02-19
JP6433575B2 (ja) 2018-12-05
AU2015293706A1 (en) 2017-02-09
EP3013987A1 (en) 2016-05-04
DK3150725T3 (en) 2018-02-26
US10501795B2 (en) 2019-12-10
CN106471133B (zh) 2019-07-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101754091B1 (ko) 단일 뉴클레오티드 검출 방법
US20240271200A1 (en) Single nucleotide detection method and associated probes
WO2017144653A1 (en) Single nucleotide detection method
EP3507381B1 (en) Single nucleotide detection method and associated probes
EP3510168B1 (en) Single nucleotide detection method and associated probes
US20190203273A1 (en) Single nucleotide detection method and associated probes
JP7230039B2 (ja) 単一ヌクレオチド分析方法及び関連するプローブ

Legal Events

Date Code Title Description
PA0105 International application

Patent event date: 20170118

Patent event code: PA01051R01D

Comment text: International Patent Application

A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20170126

Comment text: Request for Examination of Application

A302 Request for accelerated examination
PA0302 Request for accelerated examination

Patent event date: 20170206

Patent event code: PA03022R01D

Comment text: Request for Accelerated Examination

PG1501 Laying open of application
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20170415

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20170622

PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20170629

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20170629

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20200528

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20211123

Start annual number: 5

End annual number: 5

PC1903 Unpaid annual fee

Termination category: Default of registration fee

Termination date: 20230410