KR101725758B1 - Composition comprising the extract of seaweed for wound healing and regenerating skin - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따른 해조류 추출물, 상기 해조류 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물 및 바위수염 추출물의 헥산 분획물에서 분리된 화합물은 세포증식 및 세포 이동 효과가 있으므로, 상처 치료 및 피부 재생용 조성물로 활용할 수 있다.Compounds isolated from the fraction of hexane of the organic solvent fraction and the extract of the rocky mustache of the seaweed extract, the seaweed extract, and the extract of the seaweed extract according to the present invention are effective for cell proliferation and cell migration, .
Description
본 발명은 해조류 추출물을 포함하는 상처 치료 및 피부 재생용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to compositions for wound healing and skin regeneration comprising algae extract.
피부는 인체의 대부분을 차지하며 체온조절, 분비, 배설, 흡수 등의 다양한 작용을 하고, 특히 인체의 최외부에 존재함으로써 외부로부터 물리적, 화학적, 생물학적으로 인체를 보호하는 기능을 가진다. 피부는 표피, 진피, 피하지방으로 이루어져 있으며, 표피는 인체의 외부와 내부로부터 방어작용을 하고, 진피는 피부의 탄력 및 지지 역할, 피하지방은 체온을 유지하는 기능을 가진다. The skin occupies most of the human body and has various functions such as body temperature control, secretion, excretion, absorption, and especially functions to protect the human body physically, chemically and biologically from outside by being present at the outermost part of the human body. The skin is composed of epidermis, dermis and subcutaneous fat. The epidermis protects from the outside and inside of the body. The dermis has the function of supporting elasticity and support of skin, and subcutaneous fat has the function of maintaining body temperature.
피부 창상은 일반적으로 피부를 구성하고 있는 표피층 및 하부 진피층이 손상 받은 상태를 의미한다. 정상적인 창상의 치료과정은 지혈단계(응괴 형성), 염증단계, 증식단계(재상피화, 혈관형성, 섬유증식), 창상 수축의 단계를 거친다. 지혈단계는 손상된 창상면의 모세혈관의 파열로 인하여 혈관 내 존재하는 적혈구, 백혈구, 혈소판 등에 의해 혈괴(피딱지)가 형성되어 지혈이 되는 단계로 백혈구, 호중구 등의 면역세포가 창상부위로 이동을 시작하며, 각종 사이토카인이 분비된다. 염증단계는 창상부위로 이동된 백혈구, 호중구 등의 면역세포가 창상 외부에서 침입한 이물질, 병원균 등의 위해물질과 면역반응을 일으키는 신체보호의 단계이며, 손상된 조직의 처리도 일어난다. 증식단계는 섬유아세포의 이동과 증식이 일어나며 콜라겐 및 엘라스틴 등의 조직구성 단백질을 생성하며, 손상된 조직 내로 새로운 혈관이 증식하는 단계이다. 마지막으로 수축단계는 새로 합성된 조직과 증식된 세포들 간의 느슨한 결합력을 단단히 잡아줘서 조직의 접합력과 탄력성을 올리는 단계이다. 창상 치료에는 피부의 빠른 재생과 복구가 이루어져야 하며, 이를 위해선 증식 단계가 신속히 이루어져야 한다. 창상 치료에 있어 섬유아세포는 창상부위로 이동하여 증식 및 창상 부위를 수축시키며, 교원질 등의 세포외 기질을 합성하는 중요한 역할을 맡고 있다. Skin wounds usually indicate a state of damage to the epidermis and lower dermis layers that make up the skin. The normal course of wound healing is through the stages of hemostasis (clot formation), inflammation, proliferation (re-epithelialization, angiogenesis, fiber proliferation), and wound contraction. The hemostasis phase is the stage in which hematocrit is formed by red blood cells, white blood cells, platelets present in the blood vessels due to the rupture of the capillary vessels on the upper surface of the damaged window, and the immune cells such as white blood cells and neutrophils start to move to the wound sites And various cytokines are secreted. The inflammation stage is the stage of body protection that causes immune reaction with immune cells such as leukocyte, neutrophil, etc. that have been transferred to the wound area and substances such as foreign substances and pathogens entering from outside the wound, and treatment of damaged tissues occurs. The proliferative phase is the stage where fibroblast migration and proliferation occurs and tissue proteins such as collagen and elastin are produced and new blood vessels multiply into damaged tissue. Finally, the contractile phase is the step of tightening the loose coupling between the newly synthesized tissue and the proliferated cells, thereby increasing the joint strength and resilience of the tissue. In wound healing, rapid regeneration and restoration of the skin should be performed, and the proliferation phase must be performed promptly. In wound healing, fibroblasts migrate to the wound area, contracting the growth and wound area, and playing an important role in synthesizing extracellular matrix such as collagen.
현재, 다양한 활성을 가지고 있어 상처 치료 제제로 널리 사용되고 있는 EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor)는 정제하여 얻거나 또는 박테리아에서 과량 발현하여 얻는 방법이 사용되고 있다. 직접 정제하여 얻을 경우 시간, 돈, 그리고 노동력이 많이 소요되고, 또한 박테리아에서 과량 발현 방법은 세포 내에서의 낮은 발현량과 박테리아의 단백질 분해 효소 등에 의하여 회수 수율이 매우 낮다는 문제점이 있다. 또한 EGF는 만성의 상처 부위에는 낮은 치료 효과를 나타낸다는 보고가 있으며, 온도 및 단백질 분해 효소에 의한 짧은 반감기로 인하여 효율 대비 가격이 비싸다는 문제점이 있으므로, 새로운 상처 치료제의 개발이 시급하다.
Currently, EGF (epidermal growth factor), which is widely used as a wound healing agent because of its various activities, is either obtained by purification or obtained by overexpression in bacteria. It takes a lot of time, money, and labor to obtain by direct purification. Also, the over-expression method in bacteria has a problem that the recovery yield is very low due to low amount of cells in the cell and protease of bacteria. In addition, there is a report that EGF has a low therapeutic effect on a chronic wound site, and there is a problem that the price is higher than the efficiency due to a short half-life due to temperature and protease, so development of a new wound treatment agent is urgent.
본 발명의 목적은 해조류 추출물을 유효성분으로 포함하는 상처 치료 및 피부 재생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide a pharmaceutical composition for wound healing and skin regeneration comprising an algae extract as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 상기 해조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for skin regeneration containing the algae extract as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 해조류 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 상처 치료 및 피부 재생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for wound healing and skin regeneration comprising an organic solvent fraction prepared by further extracting algae extract with an organic solvent as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 상기 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for skin regeneration containing the organic solvent fraction as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 가돌레산(gadoleic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 상처 치료 및 피부 재생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for wound healing and skin regeneration comprising gadoleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
본 발명의 다른 목적은 상기 가돌레산 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
Another object of the present invention is to provide a cosmetic composition for skin regeneration comprising the above-mentioned valoleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
본 발명은 해조류 추출물을 유효성분으로 포함하는 상처 치료 및 피부 재생용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for wound healing and skin regeneration comprising seaweed extract as an active ingredient.
상기 해조류는 갈조류일 수 있으며 이에 제한되지 않으나, 특히 바위수염(Myelophycus simplex), 바위두둑(Leathesia difformis), 반질볼레기말(Colpomenia peregrine), 패(Ishige okamurae), 긴불레기말(Colpomenia bullosa), 넓패(Ishige foliacea)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하다.The seaweeds may be brown algae and include, but are not limited to, rock bees ( Myelophycus simplex ), rocks ( Leathesia difformis ), semilogy bolle term ( Colpomenia peregrine ), L ( Ishige okamurae , Colpomenia bullosa , Ishige foliacea, and the like.
상기 해조류는 채취한 것, 양식한 것 또는 시판되는 것 등 제한 없이 사용할 수 있으며, 일례로 채취한 후 물로 세척하여 이물질 및 염분을 제거한 후 건조하여 사용하는 것을 포함할 수 있다.The seaweeds may be collected, cultured, or marketed without restriction. For example, they may be collected by washing with water to remove foreign matter and salt, and then dried.
상기 바위수염(Myelophycus simplex)은 갈조류로, 갈색 또는 흑갈색의 바늘 모양으로 외가닥이고 여러 개가 모여나 다발을 이루며 조간대의 바위에 개체군을 이루어 서식한다.The rock beard ( Myelophycus simplex ) is a brown algae, brown or dark brown, with a needle-like shape, and several hairs are gathered to form a bundle, which inhabits the rocks in the intertidal zone.
상기 바위두둑(Leathesia difformis)은 갈조류로, 황갈색의 거품 모양으로 바위 또는 다른 식물에 붙어 자라며 조간대에 서식한다.The rocks ( Leathesia difformis ) are brown algae. They grow in the form of yellowish brown bubbles attached to rocks or other plants and live in the intertidal zone.
상기 반질볼레기말(Colpomenia peregrine)은 갈조류로, 갈색 거품모양 또는 공모양의 주머니로 표면이 매끄럽고 굵은 주름이 있으며 조간대에 서식한다. Colpomenia peregrine is brown algae, brown foam or ball-shaped pouch with smooth, thick wrinkles on its surface and inhabits in the intertidal zone.
상기 패(Ishige okamurae)는 갈조류로, 흑갈색의 이리저리 꾸부러지고 굵기가 고르지 않은 철사 모양으로 두 갈래로 가지를 내며 조간대의 바위에 개체군을 이루어 서식한다.The Ishige okamurae ) is a brown algae, dark brown, reddish , round , irregularly wired, bifurcated, with a population of rocks in the intertidal zone.
상기 긴불레기말(Colpomenia bullosa)은 갈조류로, 갈색의 고추모양의 주머니로 외가닥이며 거품같은 기부에서 몇 개 모여 나며 조산대에 서식한다.The long bull term ( Colpomenia bullosa ) is brown algae, brownish red pepper-shaped pouches, several bundles of bubble-like basalts , and inhabits in the midwifery.
상기 넓패(Ishige foliacea)는 갈조류로, 갈색의 댕기 모양으로 몇 번 두갈래로 가지를 내며 바위에 자라거나 패의 식물체에 붙어 서식한다. 주로 조간대의 바위에서 발견할 수 있다.
Ishige foliacea is a brown algae, bifurcated several times in the form of a brown duckwheat and grows on rocks and is attached to the plant of the tile. It can be found mainly in rocks in the intertidal zone.
본 명세서에서 “해조류 추출물"은, 상기 바위수염(Myelophycus simplex), 바위두둑(Leathesia difformis), 반질볼레기말(Colpomenia peregrine), 패(Ishige okamurae), 긴불레기말(Colpomenia bullosa), 넓패(Ishige foliacea)로 이루어진 군으로부터 유효성분을 추출하여 얻어진 것이라면 특별히 한정하지 않고 모두 포함한다. 예컨대, 상기 해조류를 물이나 유기용매에 넣고 정치, 교반, 가압 또는 가열 등의 수단을 통해 유효성분을 용출함으로써 얻어진 결과물을 들 수 있다. "Seaweed extract" herein, the bearded rock (Myelophycus simplex ), rocks ( Leathesia difformis ), semilogy bolle term ( Colpomenia peregrine , L ( Ishige okamurae ), Long bull ( Colpomenia bullosa , and Ishige foliacea, as long as they are obtained by extracting the active ingredient. For example, the resultant product is obtained by adding the above-mentioned algae into water or an organic solvent and eluting the active ingredient through means such as settling, stirring, pressing, or heating.
또한, 상기와 같이 얻어진 액상 추출물을 동결건조함으로써 얻어진 동결건조물을 포함한다. 또한, 그러한 동결건조물을 분쇄한 분말을 포함한다. 그 외에도 유효성분을 추출하기 위해 가능한 수단이 무엇이든지 가리지 않고 추출된 모든 추출물을 포함하며, 추출된 후 동결 건조 등의 가공을 거친 것까지도 모두 포함된다. The present invention also includes a lyophilized product obtained by lyophilizing the liquid extract obtained as described above. It also includes a powder obtained by pulverizing such a lyophilizate. In addition, it contains all the extracted extracts regardless of the available means for extracting the active ingredient, including those extracted and then subjected to freeze-drying and the like.
기타, 중탕이나 상온에 의한 추출법과 같이 예로부터 전해 내려오거나, 한의서 또는 교과서에 기재되어 있는 통상적인 추출법에 의한 추출물을 포함한다. Other examples include extracts obtained by conventional extraction methods such as extracting by hot water or room temperature, or extracts obtained by conventional extraction methods as described in Korean medicine or textbooks.
또한, 특정 활성 화합물들을 분리하기 위한 특별한 추출방법인 스타스 오토(Stass Otto) 추출법이나 각종 칼럼 크로마토그래피 방법 등을 통하여 얻어진 분획 추출물을 포함한다.
It also includes a fraction extract obtained through a Stass Otto extraction method or various column chromatography methods, which is a special extraction method for separating specific active compounds.
본 발명에 따른 상기 해조류 추출물은 초음파 추출법, 여과법 및 환류추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법으로 제조된 것일 수 있다. 바람직하게는 해조류를 C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 C1~C4의 저급 알코올로 추출한 추출물일 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출한 추출물일 수 있다. 일례로, 해조류를 80% 메탄올에 침지시켜 상온에서 24시간 동안 추출한 후 추출잔사를 제거하고 감압농축하여 추출물을 수득할 수 있다.
The algae extract according to the present invention may be prepared by a conventional extraction method such as an ultrasonic extraction method, a filtration method and a reflux extraction method. Preferably, the seaweed may be an extract of C 1 to C 4 lower alcohol or a mixed solvent thereof, more preferably an extract of C 1 to C 4 lower alcohol, and most preferably methanol or It may be an extract extracted with ethanol. For example, algae are immersed in 80% methanol and extracted at room temperature for 24 hours. The extract residue is then removed and concentrated under reduced pressure to obtain an extract.
본 발명은 상기 해조류 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
The present invention provides a cosmetic composition for skin regeneration containing the algae extract as an active ingredient.
본 발명은 상기 해조류 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물을 유효성분으로 포함하는 상처 치료 및 피부 재생용 약학적 조성물을 제공한다. The present invention provides a pharmaceutical composition for wound healing and skin regeneration comprising an organic solvent fraction prepared by further extracting the above-mentioned algae extract with an organic solvent as an active ingredient.
상기 유기용매는 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
The organic solvent may be selected from the group consisting of hexane, chloroform, ethyl acetate, butanol, and water, but is not limited thereto.
본 발명은 상기 유기용매 분획물을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
The present invention provides a cosmetic composition for skin regeneration containing the organic solvent fraction as an active ingredient.
본 발명은 상기 해조류 추출물에서 분리된 가돌레산(gadoleic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 상처 치료 및 피부 재생용 약학적 조성물을 제공한다.The present invention provides a pharmaceutical composition for wound healing and skin regeneration comprising gadoleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof isolated from the algae extract as an active ingredient.
상기 가돌레산(gadoleic acid)은 바위수염(Myelophycus simplex), 바위두둑(Leathesia difformis), 반질볼레기말(Colpomenia peregrine), 패(Ishige okamurae), 긴불레기말(Colpomenia bullosa), 넓패(Ishige foliacea)로 이루어진 군으로부터 선택되는 해조류로부터 분리된 것일 수 있으며, 특히 바위수염 추출물의 헥산 분획물에서 분리된 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.The gadoleic acid is called a rock beard ( Myelophycus simplex ), rocks ( Leathesia difformis ), semilogy bolle term ( Colpomenia peregrine , L ( Ishige okamurae ), Long bull ( Colpomenia bullosa and Ishige foliacea, and may be separated from the seaweed fraction, particularly, but not exclusively, from the hexane fraction of the rock beard extract.
상기 바위수염 추출물은 C1 내지 C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출한 추출물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 C1~C4의 저급 알코올로 추출한 추출물일 수 있고, 가장 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올로 추출한 추출물일 수 있다.
The rock beard extract may be an extract of C 1 to C 4 lower alcohol or a mixed solvent thereof, more preferably an extract of C 1 to C 4 lower alcohol, most preferably methanol or It may be an extract extracted with ethanol.
본 발명은 상기 가돌레산(gadoleic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 피부 재생용 화장료 조성물을 제공한다.
The present invention provides a cosmetic composition for skin regeneration comprising gadoleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 전체 조성물 100 중량부에 대해 0.001 내지 10 중량부를 포함할 수 있다.The pharmaceutical composition according to the present invention may contain 0.001 to 10 parts by weight per 100 parts by weight of the total composition.
본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다.The pharmaceutical composition of the present invention may be various oral or parenteral formulations. In the case of formulation, a diluent or excipient such as a filler, an extender, a binder, a wetting agent, a disintegrant, or a surfactant is usually used. Solid formulations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may contain one or more excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose lactose, gelatin and the like. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc, and the like are also used. Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions, syrups and the like. Various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, preservatives and the like may be included in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used. have. Formulations for parenteral administration include sterilized aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
본 발명의 약학적 조성물은 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.The pharmaceutical composition of the present invention may be a non-aqueous solution, a suspending agent may be propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, or the like. Examples of the suppository base include witepsol, macrogol, tween 61, cacao paper, laurin, glycerogelatin and the like.
본 발명의 조성물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 상기 염으로는 약학적으로 허용되는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들어 염산, 황산, 질산, 인산, 불화수소산, 브롬화수소산, 포름산 아세트산, 타르타르산, 젖산, 시트르산, 푸마르산, 말레산, 숙신산, 메탄술폰산, 벤젠술폰산, 톨루엔술폰산, 나프탈렌술폰산 등을 사용할 수 있다.The pharmaceutical dosage forms of the compositions of the present invention may also be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts and may be used alone or in combination with other pharmaceutically active compounds as well as in a suitable set. The salt is not particularly limited as long as it is pharmaceutically acceptable so long as it is pharmaceutically acceptable and includes, for example, hydrochloric acid, sulfuric acid, nitric acid, phosphoric acid, hydrofluoric acid, hydrobromic acid, formic acid acetic acid, tartaric acid, lactic acid, citric acid, fumaric acid, , Benzenesulfonic acid, toluenesulfonic acid, and naphthalenesulfonic acid.
본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.The composition of the present invention may be administered parenterally or orally, and may be administered in one to several divided doses so as to be administered in an amount of 0.1 to 500 mg and 1 to 100 mg per kg of body weight per day. The dosage for a particular patient may vary depending on the patient's body weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate, severity of disease, and the like.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 연고, 크림 등의 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.The pharmaceutical compositions according to the present invention can be administered orally or parenterally in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols and the like, external preparations such as ointments and creams, suppositories, And may be formulated and used in any form suitable for pharmaceutical preparations.
본 발명에 따른 조성물은, 랫(Rat), 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
The composition according to the present invention can be administered to mammals such as rats, mice, livestock, humans, and the like by various routes such as parenteral, oral, etc. All the ways of administration can be expected, Rectal, rectal or intravenous, intramuscular, subcutaneous, intrauterine or intracerebroventricular injection.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 전체 조성물 100 중량부에 대해 0.001 내지 10 중량부를 포함할 수 있다.The cosmetic composition according to the present invention may contain 0.001 to 10 parts by weight per 100 parts by weight of the total composition.
상기 화장료 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.The cosmetic composition may be prepared by dissolving or dispersing at least one compound selected from the group consisting of a fatty substance, an organic solvent, a solubilizer, a thickening agent, a gelling agent, a softening agent, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, a fragrance, Such as cosmetics or skin, such as fillers, sequestering agents, chelating agents, preservatives, vitamins, barrier agents, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic active agents, lipid vesicles or any other ingredient commonly used in cosmetics And may contain adjuvants conventionally used in the scientific field. Such adjuvants are introduced in amounts commonly used in the cosmetics or dermatological fields.
상기 화장료 조성물의 외형은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유한다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.The external form of the cosmetic composition contains a cosmetically or dermatologically acceptable medium or base. It may be in any form suitable for topical application, for example, as a solution, a gel, a solid, a paste anhydrous product, an emulsion obtained by dispersing the oil phase in water, a suspension, a microemulsion, a microcapsule, In the form of a non-ionic follicle dispersing agent, or in the form of creams, skins, lotions, powders, ointments, sprays or conical sticks. These compositions may be prepared according to conventional methods in the art. The composition according to the invention may also be used in the form of a foam or in the form of an aerosol composition further containing a compressed propellant.
본 발명에 따른 유효성분을 포함하는 화장료 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장품으로 제형화될 수 있다.The cosmetic composition containing the active ingredient according to the present invention is not particularly limited in its formulation and may be, for example, softening lotion, convergent lotion, nutritional lotion, nutritional cream, massage cream, essence, eye cream, eye essence, Cream, cleansing foam, cleansing water, pack, powder, body lotion, body cream, body oil and body essence.
상술한 바와 같은 화장료 조성물은 피부에 바르는 형태로 적용될 수도 있고, 마이크로 니들 등을 이용하여 피부 내부로 흡수되는 형태로 적용될 수도 있다.
The cosmetic composition as described above may be applied to the skin, or may be applied to the inside of the skin using a micro needle or the like.
본 발명에 따른 상기 가돌레산(gadoleic acid) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 농도는 0.01 - 30 μg/mL일 수 있다.
The concentration of the gadoleic acid or a pharmaceutically acceptable salt thereof according to the present invention may be 0.01 - 30 μg / mL.
본 발명의 일실시예에서, 상기 해조류 추출물의 NIH3T3 섬유아세포 증식 효능을 측정한 결과, 가장 우수한 세포재생 효과를 나타낸 것은 바위수염 추출물이었으며, 바위수염의 헥산 분획물로부터 총 6 개의 화합물을 분리하여 세포증식 및 세포 이동 효능을 실험하였다. 그 결과, 화합물 2번(F2, MSHJ)에서 우수한 세포증식 및 세포 이동 효과를 확인하였다. In one embodiment of the present invention, NIH3T3 fibroblast proliferation activity of the algae extract was measured. As a result, the best cell regeneration effect was obtained from a rock beard extract. Six compounds were isolated from hexane fraction of rock beard, And cell migration efficiency. As a result, compound 2 (F2, MSHJ) showed excellent cell proliferation and cell migration effect.
본 발명의 일실시예에서, 상기 화합물 2번(F2, MSHJ)이 가돌레산(gadoleic acid)임을 확인하였다.In one embodiment of the present invention, it was confirmed that Compound No. 2 (F2, MSHJ) was gadoleic acid.
본 발명의 일실시예에서, 제브라피쉬(Zebrafish)를 통해 가돌레산의 독성을 확인한 결과, 농도 50μg/mL 미만에서는 부작용이 없음을 확인하였다. 따라서, 본 발명에 따른 가돌레산은 독성 및 부작용이 없으므로 치료 및 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.In an embodiment of the present invention, the toxicity of gallolysan through zebrafish was confirmed, and as a result, it was confirmed that no adverse effect was observed at a concentration of less than 50 μg / mL. Therefore, the doloradic acid according to the present invention has no toxicity and side effects and can be safely used for long-term use for therapeutic and prophylactic purposes.
본 발명의 일실시예에서, 제브라피쉬 유생(Larvae) 상태에서와 성체(Adult) 상태에서 꼬리 및 꼬리지느러미의 재생 효과를 측정한 결과, 도 9 및 도 10과 같이 EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor)를 처리한 양성대조군과 농도 25 μg/mL의 가돌레산에서 재생 효과가 있음을 확인하였다.In an embodiment of the present invention, the regeneration effects of tail and tail fins in the zebra fish larvae and adult states were measured. As a result, as shown in Figs. 9 and 10, EGF (epidermal growth factor factor and 25 μg / mL of valoleic acid, respectively.
본 발명의 일실시예에서, 랫을 통해 피부 재생 효과를 확인한 결과, 도 11 및 도 12와 같이 농도 25 μg/mL의 가돌레산에서 우수한 피부 재생 효과를 확인하였다. In one embodiment of the present invention, skin regeneration effect was confirmed through rats, and as shown in Figs. 11 and 12, excellent skin regeneration effect was observed in gallic acid at a concentration of 25 μg / mL.
본 발명에 따른 해조류 추출물, 상기 해조류 추출물을 추가적으로 유기용매로 추출하여 제조된 유기용매 분획물 및 바위수염 추출물의 헥산 분획물에서 분리된 가돌레산은 세포증식 및 상처 치료 효과가 있으므로, 상처 치료 및 피부 재생용 조성물로 활용할 수 있다.
Since the organic solvent fraction and the hydrolyzed goat extract of the seaweed extract according to the present invention, which are obtained by further extracting the above algae extract with an organic solvent, are effective for cell proliferation and wound healing, It can be utilized as a composition.
본 발명에 따른 제주 연안에서 자생하고 있는 6 종류의 해조류 추출물 또는 이로부터 유래한 화합물을 포함하는 조성물은 In vitro 상에서 세포증식 및 세포 이동 효과가 있고 In vivo 상에서 상처 치료 효과가 있으므로, 상처 치료 및 피부 재생용 조성물로 활용할 수 있다.
Six kinds of algae extracts which are native to the coast of Jeju according to the present invention or The composition comprising the compound derived therefrom is characterized by a composition of In vitro There is a cell proliferation and cell migration effect on In vivo And thus can be utilized as a composition for wound healing and skin regeneration.
도 1은 EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor)의 섬유아세포에 대한 세포증식 효과를 나타낸 도이다; Control: 음성대조군.
도 2는 해조류 6종의 섬유아세포에 대한 세포증식 효과를 나타낸 도이다; Control: 음성대조군, Leathesia difformis: 바위두둑, Colpomenia bullosa: 긴불레기말, Colpomenia peregrine: 반질볼레기말, Myelophycus simplex: 바위수염, Ishige okamurae: 패, Ishige foliacea: 넓패.
도 3은 바위수염 추출물의 분획 단계를 나타낸 모식도이다.
도 4는 바위수염 분획물의 섬유아세포에 대한 세포증식 효과를 나타낸 도이다; MSH: 헥산 분획물, MSC: 클로로포름 분획물, MSE: 에틸아세테이트, MSW: 물 분획물, Control: 음성대조군, EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor, 0.05 μg/ml): 양성대조군.
도 5는 바위수염 분획물로부터 유래한 6개 화합물(F1, F2(MSHJ), F3, F4, F5 및 F6)의 섬유아세포에 대한 세포증식 효과를 나타낸 도이다; Control: 음성대조군, EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor, 0.05 μg/ml): 양성대조군.
도 6은 바위수염 분획물로부터 유래한 2번 화합물(F2, MSHJ)의 세포 이동 효과를 나타낸 도이다; Control: 음성대조군, EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor, 0.05 μg/ml): 양성대조군.
도 7은 바위수염 유래 가돌레산(gadoleic acid)의 구조식이다.
도 8은 바위수염 유래 가돌레산(gadoleic acid)의 독성을 제브라피쉬(Zebrafish)에서 평가한 결과를 나타낸 도이다; Control: 음성대조군, EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor, 0.05 μg/ml): 양성대조군, 1 μg/ml: 가돌레산 1 μg/ml 처리군, 10 μg/ml: 가돌레산 10 μg/ml 처리군, 25 μg/ml: 가돌레산 25 μg/ml 처리군, 50 μg/ml: 가돌레산 50 μg/ml 처리군.
도 9는 바위수염 유래 가돌레산(gadoleic acid)의 제브라피쉬(Zebrafish) 유생(Larvae)에서의 꼬리 재생 효과를 나타낸 도이다; Control: 음성대조군, EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor, 0.05 μg/ml): 양성대조군, 1 μg/ml: 가돌레산 1 μg/ml 처리군, 10 μg/ml: 가돌레산 10 μg/ml 처리군, 25 μg/ml: 가돌레산 25 μg/ml 처리군.
도 10은 바위수염 유래 가돌레산(gadoleic acid)의 제브라피쉬(Zebrafish) 성체(Adult)에서의 꼬리지느러미 재생 효과를 나타낸 도이다; Control: 음성대조군, EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor, 0.05 μg/ml): 양성대조군, 1 μg/ml: 가돌레산 1 μg/ml 처리군, 10 μg/ml: 가돌레산 10 μg/ml 처리군, 25 μg/ml: 가돌레산 25 μg/ml 처리군.
도 11은 바위수염 유래 가돌레산(gadoleic acid)의 SD(Spraque-Dawley) 랫(Rat)에서의 상처 치료 효과를 나타낸 도이다; Control: 음성대조군, EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor, 0.05 μg/ml): 양성대조군, 10 μg/ml: 가돌레산 10 μg/ml 처리군, 25 μg/ml: 가돌레산 25 μg/ml 처리군.
도 12는 바위수염 유래 가돌레산(gadoleic acid)의 SD(Spraque-Dawley) 랫(Rat)에서의 상처 치료 효과의 조직학적 분석 결과를 나타낸 도이다; Control: 음성대조군, EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor, 0.05 μg/ml): 양성대조군, 10 μg/ml: 가돌레산 10 μg/ml 처리군, 25 μg/ml: 가돌레산 25 μg/ml 처리군, 검은 화살표: 상피세포의 위치Figure 1 shows the cell proliferation effect of fibroblasts of EGF (epidermal growth factor); Control: negative control.
FIG. 2 is a graph showing cell proliferation effects on six kinds of fibroblasts of seaweed; Control: negative control, Leathesia difformis : rock fence , Colpomenia bullosa : long bull's term, Colpomenia peregrine : bone quality term, Myelophycus simplex : rock beard, Ishige okamurae : L, Ishige foliacea: neolpae.
FIG. 3 is a schematic diagram showing fractionation steps of the rock beard extract. FIG.
FIG. 4 is a graph showing cell proliferation effect on fibroblasts of the rock beard fraction; FIG. MSH: hexane fraction, MSC: chloroform fraction, MSE: ethyl acetate, MSW: water fraction, Control: negative control, EGF (epidermal growth factor, 0.05 μg / ml): positive control.
Figure 5 shows the cell proliferation effect on fibroblasts of six compounds (F1, F2 (MSHJ), F3, F4, F5 and F6) derived from the rock beard fraction; Control: negative control, EGF (epidermal growth factor, 0.05 μg / ml): positive control.
6 is a diagram showing the cell migration effect of the compound No. 2 (F2, MSHJ) derived from the rock beard fraction; Control: negative control, EGF (epidermal growth factor, 0.05 μg / ml): positive control.
7 is a structural formula of gadoleic acid derived from rock salt.
Fig. 8 shows the results of evaluating the toxicity of gadoleic acid derived from rock beard in zebrafish; Fig. Control: EGF (epidermal growth factor, 0.05 μg / ml): Positive control, 1 μg / ml: treated with 1 μg / ml of valoleic acid, 10 μg / Group, 25 μg / ml: treated with 25 μg / ml of valoleic acid, 50 μg / ml: treated with 50 μg / ml of valoleic acid.
Figure 9 shows the effect of tail regeneration in zebrafish larvae of gadoleic acid derived from rock beard; Control: EGF (epidermal growth factor, 0.05 μg / ml): Positive control, 1 μg / ml: treated with 1 μg / ml of valoleic acid, 10 μg / Group, 25 μg / ml: treated with 25 μg / ml of valoleic acid.
10 shows the effect of regeneration of the caudal fin in a Zebrafish adult of gadoleic acid derived from rock beard; Control: EGF (epidermal growth factor, 0.05 μg / ml): Positive control, 1 μg / ml: treated with 1 μg / ml of valoleic acid, 10 μg / Group, 25 μg / ml: treated with 25 μg / ml of valoleic acid.
Fig. 11 shows the effect of wound healing in SD (Spraque-Dawley) rats of gadoleic acid derived from rock beard; Control: EGF (epidermal growth factor, 0.05 μg / ml): positive control, 10 μg / ml: treated with 10 μg / ml of valoleic acid, 25 μg / group.
FIG. 12 is a histological analysis result of wound healing effect in a SD (Spraque-Dawley) rat of gadoleic acid derived from rock beard; FIG. Control: EGF (epidermal growth factor, 0.05 μg / ml): positive control, 10 μg / ml: treated with 10 μg / ml of valoleic acid, 25 μg / Group, black arrow: location of epithelial cells
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the contents of the present invention, but the scope of the present invention is not limited to the following examples. Embodiments of the present invention are provided to more fully describe the present invention to those skilled in the art.
<실시예 1> 해조류 추출물 제조 Example 1 Preparation of Seaweed Extract
제주연안에서 직접 채집한 6 종의 해조류인 바위수염(Myelophycus simplex), 바위두둑(Leathesia difformis), 반질볼레기말(Colpomenia peregrine), 패(Ishige okamurae), 긴불레기말(Colpomenia bullosa), 넓패(Ishige foliacea)를 80 % 메탄올에 침지시켜 상온에서 24 시간 동안 추출한 후 추출잔사를 제거하고 감압농축하여 추출물을 수득하였다. 각각의 추출물은 분주 후 다이메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)(Sigma, 미국)에 녹여 실험에 사용하였다.
Six species of seaweed, Rock Beard ( Myelophycus simplex ), rocks ( Leathesia difformis ), semilogy bolle term ( Colpomenia peregrine , L ( Ishige okamurae ), Long bull ( Colpomenia bullosa and Ishige foliacea were immersed in 80% methanol and extracted at room temperature for 24 hours. The extracts were then removed and concentrated under reduced pressure to obtain an extract. Each extract was dissolved in dimethyl sulfoxide (DMSO) (Sigma, USA) after dispensing and used in the experiment.
<< 실시예Example 2> 세포증식 효능 평가 2> Evaluation of cell proliferation efficacy
세포증식 효능을 평가하기 위하여, 피부 섬유아세포인 NIH3T3 세포주(한국세포주은행, 한국)를 10 % 소혈청(bovine serum)과 L-글루타민을 포함하는 DMEM(Dulbeccos modified Eagle's medium) 배지(Gibco-BRL, 미국)를 이용하여 37 ℃, 5 % CO2 배양기에서 배양하였다. NIH3T3 세포주를 24 웰 플레이트에 5×104 cells/ml로 분주하고 16 시간 경과 후, 1.5 % 소혈청이 포함된 DMEM 배지로 교체하였다. 양성대조군인 EGF(표피성장인자, Epidermal growth factor)(0.05 μg/ml)(Sigma, 미국) 및 실험군인 6종의 해조류 추출물(0.001, 0.1, 1, 10, 25 μg/ml)을 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 세포증식 결과는 MTT(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) 어세이를 이용하여 실험하였다. MTT 용액 50 μl(2 mg/ml)를 24 시간 동안 배양된 배지에 첨가하여 2 시간 동안 반응시켰다. 이후 상층액을 완전히 제거하고 DMSO를 가하여 침전물을 완전히 용해시킨 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.In order to evaluate the cell proliferation effect, a skin fibroblast NIH3T3 cell line (Korean Cell Line Bank, Korea) was inoculated into DMEM (Dulbeccos modified Eagle's medium) containing 10% bovine serum and L-glutamine (Gibco-BRL, USA) at 37 ° C in a 5% CO 2 incubator. The NIH3T3 cell line was dispensed into a 24-well plate at 5 × 10 4 cells / ml, and after 16 hours, it was replaced with DMEM medium containing 1.5% bovine serum. Treatment of six seaweed extracts (0.001, 0.1, 1, 10, 25 μg / ml) with positive control group EGF (Epidermal growth factor) (0.05 μg / ml) Lt; / RTI > Cell proliferation was assayed using MTT (3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide) assays. 50 μl of MTT solution (2 mg / ml) was added to the cultured medium for 24 hours and reacted for 2 hours. After the supernatant was completely removed, DMSO was added to completely dissolve the precipitate, and the absorbance was measured at 540 nm.
그 결과, 도 2와 같이 농도별로 처리한 6 종의 해조류 추출물을 중 긴불레기말과 바위수염 추출물에서 세포증식 효과가 나타났으며, 그 중 바위수염에서 가장 우수한 세포증식 효과가 나타남을 확인하였다.
As a result, as shown in FIG. 2, six kinds of algae extracts treated by concentration showed cell proliferation effect in medium bulbous period and rock beard extract, and the most prominent cell proliferation effect was observed in rock beard.
<< 실시예Example 3> 해조류 추출물 유래 화합물의 정제 및 분리 3> Purification and Separation of Seaweed Extract-Derived Compounds
<3-1> 유기용매 분획≪ 3-1 > Organic solvent fraction
실시예 1로부터 수득한 바위수염 추출물로부터 세포증식 효과를 나타내는 화합물을 정제 및 분리하기 위하여, 유기용매 분획을 실시하였다. 헥산(MSH), 클로로포름(MSC), 에틸아세테이트(MSE), 부탄올, 물(MSW)을 사용하여 각각의 유기용매 분획물을 수득하였으며(도 3), 실시예 2와 동일한 방법으로 세포증식 효과를 측정하여 가장 우수한 분획물을 선정하였다. To purify and separate the compounds showing cell proliferation effect from the rock beard extract obtained from Example 1, an organic solvent fraction was carried out. Individual organic solvent fractions were obtained using hexane (MSH), chloroform (MSC), ethyl acetate (MSE), butanol and water (MSW) (FIG. 3) The best fractions were selected.
그 결과, 도 4와 같이 헥산 분획물에서 가장 우수한 세포증식 효과가 나타났으며, 분리 전 추출물보다 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.As a result, as shown in FIG. 4, the hexane fraction showed the best cell proliferation effect, and it was confirmed that the effect was superior to that of the extract before the separation.
<3-2> 화합물 정제 및 분리<3-2> Purification and Separation of Compound
순수한 물질을 대량으로 빠르고 단일공정으로 정제하는데 용이한 고속원심분배크로마토그래피(High performance centrifugal partition chromatography, HPCPC)를 이용하여 바위수염 헥산 분획물을 분리함으로써 총 6개의 화합물을 수득하였다.A total of six compounds were obtained by separating the rocky bean hexane fractions using high performance centrifugal partition chromatography (HPCPC), which is easy to purify pure materials in a fast and single process.
수득한 화합물의 세포증식 효과를 실시예 2와 동일한 방법으로 측정한 결과, 도 5와 같이 2번 화합물(F2, MSHJ)의 세포증식 효능이 가장 우수함을 확인하였다.
The cell proliferation effect of the obtained compound was measured in the same manner as in Example 2, and as a result, it was confirmed that the compound 2 (F2, MSHJ) had the best cell proliferation efficiency as shown in FIG.
<< 실시예Example 4> 세포 이동 효능 평가 4> Evaluation of cell migration efficacy
실시예 3에 따라 바위수염에서 분리된 2번 화합물(F2, MSHJ)의 세포 이동률을 측정하기 위하여, 섬유아세포를 이용하여 세포 이동 분석(migration assay)을 실시하였다. 24 웰 플레이트에 섬유아세포를 1×105 cells/ml로 분주하고 16 시간 경과 후, 세포가 24 웰 플레이트에 90% 이상 배양되었을 때 멸균된 팁(tip)으로 24 웰 플레이트 바닥을 스크래치(scratch)하였다. 스크래치로 인하여 24 웰 플레이트 바닥에 떨어진 세포를 제거하기 위하여 DPBS(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)(Sigma, 미국)로 세척 후 1.5% 소혈청이 포함된 DMEM 배지로 교체하였다. 양성대조군인 EGF(50 ng/ml) 및 실험군인 2번 화합물(F2, MSHJ)(0.1, 1, 10, 25 μg/ml)을 처리하고 24 시간 동안 배양한 다음 현미경 상에서 세포 이동률을 측정하였다.In order to measure the cell migration rate of compound No. 2 (F2, MSHJ) isolated from rock beard according to Example 3, migration assay was performed using fibroblast. After 24 hours, cells were plated on a 24-well plate and cultured at a density of 1 x 10 5 cells / ml in a 24-well plate. When the cells were cultured at 90% or more, 24- Respectively. The cells were washed with Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (Sigma, USA) to remove the cells that had fallen on the bottom of the 24-well plate due to scratching, and then replaced with DMEM medium containing 1.5% bovine serum. The cells were treated with EGF (50 ng / ml) as a positive control and Compound 2 (F2, MSHJ) (0.1, 1, 10, 25 μg / ml) as an experimental group and cultured for 24 hours.
그 결과, 도 6과 같이 농도별로 처리한 2번 화합물(F2, MSHJ)은 처리된 모든 농도에서 섬유아세포의 이동을 증가시키는 것을 확인하였다.
As a result, it was confirmed that the compound No. 2 (F2, MSHJ) treated by concentration as shown in Fig. 6 increased the migration of fibroblasts at all treated concentrations.
<< 실시예Example 5> 화합물 구조 규명 5> Identification of compound structure
바위수염에서 분리된 2번 화합물(F2, MSHJ)의 구조를 규명한 결과, 가돌레산(gadoleic acid)으로 밝혀졌다. 가돌레산은 9번째 탄소에 이중결합이 있어, 11-트랜스-에이코세노익(11-trans-eicosenoic), 8-에이코세노익(8-eicosenoic), 11-에이코세노익(11-eicosenoic) 및 5-에이코세노익(5-eicosenoic) 들과는 구조적 차이점이 있다.
The structure of the second compound (F2, MSHJ) isolated from the rock beard was identified and found to be gadoleic acid. The dicarboxylic acid has a double bond at the ninth carbon, and the 11-trans-eicosenoic, 8-eicosenoic, 11-eicosenoic and 5-trans- - There is a structural difference from the 5-eicosenoic.
<< 실시예Example 6> 화합물의 독성 평가 6> Toxicity Evaluation of Compounds
바위수염에서 분리된 가돌레산의 독성을 확인하기 위하여 제브라피쉬(Zebrafish)를 이용하여 독성 실험하였다. 성체 제브라피쉬를 구입하여 3 L 아크릴 탱크에 넣고, 28.5℃, 14/10 시간, 명/암 조건을 유지하고, 하루 3번씩 먹이를 주며 2주간 순치시켰다. 순치시킨 후 배아는 빛을 비춰주는 아침에 유도되는 자연산란으로부터 얻어 실험에 사용하였다. 얻어진 배아를 수집하여 피펫으로 950 μl의 배아 배지를 담은 6 웰 플레이트(well plate)에 웰(well) 당 20개의 배아를 넣고, 가돌레산을 농도별(1, 10, 25, 50 μg/ml)로 50 μl 처리하였다. In order to confirm the toxicity of garlestan separated from rock beard, it was tested for toxicity using Zebrafish. The adult zebrafish was purchased and placed in a 3 L acrylic tank, maintained at 28.5 ° C, 14/10 hours, light / dark conditions, and fed for 3 weeks with feeding for 2 weeks. The embryos were used for experiments obtained from natural light scattering induced in the morning. The resulting embryos were collected and placed in a 6-well plate containing 950 μl of embryo culture medium with a pipette. Twenty embryos per well were placed in the wells, and the concentration of valoleic acid (1, 10, 25, 50 μg / ml) .
제브라피쉬는 평균적으로 수정 후 3일째(3 dpf 째, dpf: day post-fertilization)에 유생으로 깨어나며, 가돌레산 처리 후 3일째에 생존한 제브라피쉬 유생(Larvae)의 생존율을 측정하여 독성 평가를 하였다. On average, zebrafish wakes up on the third day (3 dpf, day post-fertilization) of the fertilized zebrafish, and the survival rate of the zebrafish larvae survived on the third day after treatment with gadoletic acid Respectively.
그 결과, 도 8과 같이 아무것도 처리하지 않은 대조군, EGF를 처리한 실험군(50 ng/ml)과 비교했을 때 50 μg/mL 미만의 가돌레산에서는 부작용이 없음을 확인하였다.
As a result, it was confirmed that there was no side effect in the case of less than 50 μg / mL of valoleic acid compared with the control group treated with nothing (EGF) (50 ng / ml) as shown in FIG.
<< 실시예Example 7> 화합물의 꼬리 재생 효능 평가 7> Evaluation of Tail Regeneration Efficiency of Compounds
바위수염에서 분리된 가돌레산의 상처 치유 효과를 확인하기 위하여 제브라피쉬 유생을 이용하여 실험하였다. 수정 후 3 dpf 째 유생의 꼬리 끝부분을 절단한 후 아무것도 처리하지 않은 대조군, EGF를 처리한 실험군(50 ng/ml) 및 가돌레산을 농도별(1, 10, 25 μg/ml)로 처리한 후, 4일 동안 (7 dpf) 꼬리 재생 효과를 측정하였다. Zebrafish larvae were used to investigate wound healing effects of garlestar acid isolated from rock beard. After the fertilization, 3 dpf larvae were treated with EGF-treated group (50 ng / ml) and carbolic acid (1, 10, 25 μg / ml) , The tail regeneration effect was measured for 4 days (7 dpf).
그 결과, 도 9와 같이 5 dpf 째 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 EGF 처리 실험군과 가돌레산 농도 25 μg/ml 처리 군에서 꼬리 재생이 완벽하게 일어난 것을 확인하였다.
As a result, as shown in Fig. 9, tail regeneration was completely observed in the EGF treatment group and the 25 μg / ml treatment group of carbolic acid compared with the control group treated with nothing at 5 dpf.
<< 실시예Example 8> 화합물의 꼬리지느러미 재생 효능 평가 8> Evaluation of regeneration efficacy of caudal fin of compound
바위수염에서 분리된 가돌레산을 성체(Adult) 제브라피쉬를 이용하여 꼬리지느러미에 대한 재생 효과를 확인하였다. 성체 제브라피쉬를 15 마리 씩 3 L 아크릴 탱크에 넣어 아무것도 처리하지 않은 대조군, EGF를 처리한 실험군(50 ng/ml) 및 가돌레산을 농도별(1, 10, 25 μg/ml)로 처리 한 실험군으로 각각 그룹을 나눠 실험하였다. 제브라피쉬의 꼬리 지느러미 일부분을 절단한 후, 염(saline), EGF 및 가돌레산을 각각의 제브라피쉬 그룹에 근육주사하여 일주일 간 꼬리 재생 효능을 확인하였다. The regeneration effect of cauliflower acid separated from rock beard on the caudal fin was confirmed by using the adult zebra fish. EGF-treated experimental group (50 ng / ml) and vehicle (1, 10, and 25 μg / ml) treated with adult male zebrafish were placed in a 3 L acrylic tank with no treatment Were divided into groups. After cutting a portion of the tail fin of the zebrafish, saline, EGF, and valoleceane were intramuscularly injected into each zebrafish group to confirm tail rejuvenation efficacy for one week.
그 결과, 도 10과 같이 농도 25 μg/mL의 가돌레산에서 EGF를 처리했을 때와 유사한 꼬리지느러미 재생 효과가 있음을 확인하였다.As a result, as shown in Fig. 10, it was confirmed that the regeneration effect of caudal fin was similar to that of EGF treated at 25 μg / mL of valoleic acid.
<< 실시예Example 9> 화합물의 상처 치료 효능 평가 9> Evaluation of wound healing efficacy of compound
인비보(In vivo) 실험에서 바위수염에서 분리된 가돌레산의 상처 치료 효과를 확인하기 위하여 SD(Spraque-Dawley) 랫(Rat)을 사용하였다. 20 마리 SD 랫의 등에 지름 1 cm 크기의 원형 전층피부결손을 4 곳에 만든 후 아무것도 처리하지 않은 대조군, EGF를 처리한 실험군(50 ng/ml) 및 가돌레산을 농도별(10, 25 μg/ml)로 처리한 실험군으로 분류하여 실험을 진행하였다. 시술 후 0, 2, 4, 6, 8일째에 실험동물로부터 각각 상처 크기 및 피부조직을 수득하여 분석하였다. SD (Spraque-Dawley) rat (Rat) was used for the in vivo experiment to confirm the wound healing effect of galloolentan isolated from rock beard. (50 ng / ml) treated with EGF (10 ng / ml) and carbolic acid (10, 25 μg / ml) were administered to the rats of 20 SD rats. ), And the experiment was conducted. On the 0, 2, 4, 6, and 8 days after the procedure, wound size and skin texture were obtained from the experimental animals, respectively.
그 결과 도 11과 같이, 2일에서 4일째까지 상처 크기를 확인하였을 때, 아무것도 처리하지 않은 대조군에 비해 가돌레산 25 μg/ml 을 처리하였을 때 유의적으로 상처 치료 효과가 있는 것을 확인할 수 있었다. 또한 2일에서 6일째까지의 상처 크기를 확인하였을 때 EGF 처리 실험군과 가돌레산 25 μg/ml 처리 실험군에서 유의적으로 상처 치료 효과가 있음을 확인할 수 있었다.
As a result, when wound size was confirmed from
<< 실시예Example 10> 화합물의 상처 치료 효능에 대한 조직학적 분석 10> Histological analysis of wound healing efficacy of compounds
실시예 9에 따른 실험에서 수득한 6일째의 랫 피부조직을 즉시 10 % 포르말린에 고정하고 파라핀에 포매한 후 6 μm 두께로 잘라 메이슨 트리크롬 스테인(Masson trichrome stain) 염색을 하여 관찰하였다. The 6-day-old rat skin tissue obtained from the experiment according to Example 9 was immediately fixed in 10% formalin, embedded in paraffin, and cut to a thickness of 6 μm and stained with Masson trichrome stain.
피딱지 밑으로 재상피화가 일어나는 부분을 관찰한 결과 도 12와 같이, 아무것도 처리하지 않은 대조군의 경우 상피세포가 회복되지 않았으며, EGF 처리 실험군의 경우 상피세포가 만나기 직전까지의 수준으로 회복되었다. 그러나, 가돌레산 25 μg/ml 처리 실험군의 경우 상피세포들이 서로 만나 재상피화가 완벽히 일어난 것을 확인할 수 있었다.
As shown in FIG. 12, the epithelial cells were not recovered in the control group without any treatment, and the epithelial cells were recovered to the level just before the epithelial cells met the EGF treatment group. However, in the experimental group treated with 25 μg / ml of valoleic acid, epithelial cells were found to meet each other and re-epitaxialization completely occurred.
상기 실시예에 대한 모든 실험결과는 3번 이상의 독립적인 실험의 데이터를 mean±standard error(SE) 값으로 나타내었으며, 실험군 사이의 통계적 유의성 검정은 Tukey test 분석방법을 사용하였다.All experimental results for the above example are shown as mean ± standard error (SE) values of three independent experiments or more, and the statistical significance test between the experimental groups was performed using the Tukey test method.
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