KR101702906B1

KR101702906B1 - 신규 알파-1,3-글루카나제

Info

Publication number: KR101702906B1
Application number: KR1020150100592A
Authority: KR
Inventors: 반재구; 김의중; 양택호; 이동범; 김은영; 이혜림; 강정현
Original assignee: 주식회사 제노포커스
Priority date: 2015-07-15
Filing date: 2015-07-15
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2035-07-15
Also published as: CN108026520A; US20180201914A1; WO2017010833A1; KR20170009112A; US10472616B2

Abstract

본 발명은 신규 알파-1,3-글루카나제(α-1,3-glucanase)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 트리코더마 하찌아늄(Trichoderma harzianum)유래의 신규 알파-1,3-글루카나제, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 알파-1,3-글루카나제의 제조방법 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 알파-1,3-글루카나아제는 미생물의 바이오필름의 성분인 뮤탄을 효과적으로 분해할 수 있어, 구강 위생용품 및 의료분야에 사용될 수 있다.

Description

신규 알파-1,3-글루카나제 {Novel alpha-1,3-glucanse}

본 발명은 신규 알파-1,3-글루카나제(α-1,3-glucanase)에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 트리코더마 하찌아늄(Trichoderma harzianum)유래의 신규 알파-1,3-글루카나제, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 알파-1,3-글루카나제의 제조방법에 관한 것이다.

스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)는 구강 내에서 플라그 형성에 중요한 역할을 하는 미생물로 충치 형성과 가장 중요하게 연관되어 있는 것으로 알려져 있다. 상기 미생물은 설탕을 분해하여 세포 외부의 메트릭스(matrix)에 불용성 글루칸(glucan)을 합성하는 능력을 가지고 있다. 이렇게 형성된 글루칸은 α-1,6 결합과 α-1,3 결합이 동시에 존재하는 당중합체로서, 점착성이 높고 비수용성이어서 치아 표면에 바이오필름(biofilm)을 형성하고, 스트렙토코커스 뮤탄스의 부착을 용이하게 하며, 각종 세균들을 응집시킨다. 이러한 바이오필름내에서 스트렙토코커스 뮤탄스 등이 생산하는 유기산은 치아의 에나멜(enamel) 층이나 조직 등에 데나멜리제이션(demineralization)을 일으켜 충치를 발생시킨다. 형성된 바이오필름은 치주염의 발생과 진행에 있어서도 주요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

플라그는 포도당의 중합체인 글루칸과 과당의 중합체인 프럭탄(fructan)으로 구분된다. 글루칸은 3종류로 분류된다. 알파-1,6-글루코스 결합만 있는 덱스트란 (dextran), 알파-1,6-글루코스 결합이 주된 결합인 수용성 글루칸, 알파-1,3-글루코스 결합이 주된 결합인 비수용성 글루칸, 즉 뮤탄(mutan)으로 구분된다. (Rolla et al., 1985). 스트렙토코커스 뮤탄스 균에 의해서 생성되는 뮤탄은 알파-1,3-글루코스 결합이 85-90%를 차지하며 나머지가 알파-1,6-글루코스 결합이다.

데스트라나제는 플라그의 알파-1,6-글루코스 결합을 분해한다. 곰팡이 유래로는 페니실리움(Penicillium), 폐실로마이세스(Paecilomyces), 아스퍼질러스(Aspergillus), 푸사리움(Fusarium), 스피카리아(Spicaria), 버티실리움(Verticillium), 헬민소포리움(Helminthosporium), 채토미움 (Chaetomium), 등에서 유전자 알려져 있으며, 박테리아 유래로는 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 셀비브리오(Cellvibrio), 시토파가(Cytophaga), 브래비박테리움(Brevibacterium), 수도모나스(Pseudomonas), 코리네박테리움(Corynebacterium), 아소박터(Arthrobacter), 플라보박테리움(Flavobacterium) 등에서 많은 유전자가 알려져 있다.

국외에서는 일본 효소전문회사인 아마노 (Amano)사에서 패니실로마이세스 리라시누스(Paecilomyces lilacinus) 유래 데스트라나제 제품을 출시했다. 주로 사탕수수로부터 설탕 제조 공정시 오염균에 의해서 생성되는 데스트란 제거용도로 판매되며, 일부 구강제품에 사용되기도 한다.

일본 리온(Lion)의 클리니니카(Clinica Lion) 제품도 트리크로산(triclosan)이 함유된 데스트라나제를 사용하고 있다. 트리크로산에 의해 스트렙토코커스 뮤탄스 균을 일시적으로 줄여 줄 수는 있으나 데스트라나제 효소만으로는 플라그 분해능이 부족할 것이라 예상된다.

국내에서는 김치유산균 유래 신규 데스트라나제가 개발된바 있으며, 데스트라나제와 글로코스 옥시다제(glucose oxidase)를 사용하는 치약이 출시된 바 있으나, 데스트라나제에 의한 바이오필름(biofilm) 분해 효과가 미약하여 성공하지 못하였다.

알파-1,3-글루카나제는 플라그의 알파-1,3-글루코스 결합을 분해하는 효소로 뮤타나아제(Mutanase)라 불린다. 알파-1,3-글루코스 결합을 분해하는 효소는 트리코더마 종 (Trichoderma sp.) (Hasegawa et al., J. Biol. Chem., 244: 5460??5470, 1969), 스트렙토마이세스(Streptomyces) (Takehara et al., J Bacteriol., 145:729-735,1981), 클라도스포리움 레시내(Cladosporium resinae) (Hare et al. Carbohydr Res.,58:415-432, 1977), 수도모나스 종 (Pseudomonas sp.) (미국등록특허 제4,438,093호), 플라보박테리움 종(Flavobacterium sp.) (일본등록특허 제77038113호), 바실러스 써큘란스(Bacillus circulanse) (일본등록특허 63301788), 아스퍼질러스 종(Aspergillus sp.) 등에서 보고되었다. 하지만, 구강내 뮤탄의 분해능에 대해서 연구는 초기 단계이다. 해외에서 알파-1,3-글루카나제가 개발된 바가 있었으나, 뮤탄 분해 활성이 떨어져서 상용화되지 못하였다. 최근 일본에서 바실러스 써큘란스 유래 알파-1,3-글루카나제가 개발되어 GSK(GlaxoSmithKline)사에 공급되어 바이오텐(Biotene) 가글제와 치약제품에 적용되고 있다. 하지만, 효소가 제품으로는 출시된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 세균의 바이오필름 분해효과가 우수한 효소를 개발하고자 예의노력한 결과, 트리코더마 하찌아늄 GF101 균주 유래의 신규 알파-1,3-글루카나제가 높은 바이오필름 분해효과를 나타내는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 세균의 바이오필름 분해효과가 우수한 신규 알파-1,3-글루카나제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 알파-1,3-글루카나제를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자 또는 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물 및 상기 재조합 미생물을 이용한 알파-1,3-글루카나제의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 알파-1,3-글루카나제를 이용하여 스트렙토코코스 속 균주에 의해 생성된 바이오필름을 분해시키는 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 알파-1,3-글루카나아제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 알파-1,3-글루카나아제를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 알파-1,3-글루카나아제를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 알파-1,3-글루카나아제를 수득하는 단계를 포함하는 알파-1,3-글루카나아제의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 알파-1,3-글루카나아제를 이용한 바이오필름의 분해방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 알파-1,3-글루카나아제를 함유하는 구강위생용품을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 알파-1,3-글루카나아제는 미생물의 바이오필름의 성분인 뮤탄을 효과적으로 분해할 수 있어, 구강 위생용품 및 의료분야에 사용될 수 있다.

도 1은 재조합 알파-1,3-글루카나제 유전자가 형질전환된 아스퍼질러스 나이거에서 생산된 재조합 알파-1,3-글루카나제의 단백질 발현 양상을 배양 시간 별로 SDS-PAGE로 확인한 결과이다 (M: 단백질 사이즈 마커(Bio-rad:161-0317, 200:Myosine(미오신), 116:beta-galactosidase(베타 갈랄토시다제, 96:serum albumine(시럽 알부민), 66:Ovalvumine(오발부민), 45:, 31:carbonic anhydrase(카보닉 언하이드라제).

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명자들은 곰팡이를 이용한 재조합 단백질 생산 연구를 진행하던 중, 형질전환을 위한 곰팡이 세포벽 분해효소를 개발하였다. 곰팡이 세포벽의 주요 성분인 글루칸 분해 효소 생산 균주를 다수 스크리닝하여, 이 중에서 효소 분비 활성이 비교적 높은 트리코더마 종(Trichoderma sp.) 균주를 확보하고 있었다. (Trichoderma sp. GF01). rRNA 분석 결과 GF101 균주는 트리코더마 하찌아늄으로 판명되었다. 트리코더마 하찌아늄 GF101 균주에서 분비되는 글루칸 분해 효소는 알파-1,3-글루카나제, 베타-1,3-글루카나제, 엑소-베타-1,4-글루카나제, 엔도-베타-1,4-글루카나제, 베타-1,4글루코시다제, 키니나제, 프로테아제로 구성되어 있으며 이중 알파-1,3-글루카나제가 많이 포함되어 있음을 확인하였다.

본 발명자들은 N-터미널 아미노산 분석결과 ASSADRLVFC임을 확인하였고, 트리코더마 하찌아늄 알파-1,3-글루카나제와 100% 일치 하였다. 실시예에서 트리코더마 하찌아늄 유래의신규한 알파-1,3-글루카나제 염기서열을 확인하고, 알파-1,3-글루카나제를 아스퍼질러스 나이거에서 제조하였다.

따라서, 일 관점에서 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 알파-1,3-글루카나아제에 관한 것이다.

본 발명에서는 트리코더마 하찌아늄 GF101 게놈(Genome)으로부터 신규 알파-1,3-글루카나제 유전자를 분리하였다. 상기 분리한 알파-1,3-글루카나제는 기존에 알려진 트리코더마 하찌아늄 (T. harzianum) CECT2413, CCM-F340, CBS243.71 유래의 알파-1,3-글루카나제 와 각각 98%, 99%, 99% 상동성을 보였다.

본 발명의 알파-1,3-글루카나제는 N-터미널에 24개 아미노산으로 구성된 시그날펩타이드(서열번호 1; 언더라인)를 가지고 있어 세포 밖으로 분비되며, 13개 아미노산으로 구성된 프로펩타이드(서열번호 1; 이탤릭체)를 가지고 있다. 시그날펩타이드와 프로펩타이드를 제외한 활성을 가지는 알파-1,3-글루카나제는 599개 아미노산으로 이루어져있고, 분자량은 63.9kD 이다.

다른 관점에서, 본 발명은 알파-1.3-글루카나아제를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

상기 신규 알파-1,3-글루카나제 gDNA 유전자 염기서열은 서열번호 3에 나타내었으며, 알파-1,3-글루카나제 유전자가 포함된 gDNA 전체크기는 2069 bp이고, 3개의 인트론으로 구성되며(서열번호 2; 언더라인), 인트론을 제외한 cDNA 유전자 염기서열은 서열번호 3에 나타내었으며 1908bp이고, 636개 아미노산을 암호화 한다.

알파-1.3-글루카나아제의 아미노산 및 염기서열

서열번호	비고	서열
서열번호 1	아미노산서열	mlgvfrrlglgalaaaalsslgsa apanvairsleerassadrlvfchfmigivgdrgssadydddmqrakaagidafalnigvdgytdqqlgyaydsadrngmkvfisfdfnwwspgnavgvgqkiaqyanrpaqlyvdnrpfassfagdgldvnalrsaagsnvyfvpnfhpgqsspsnidgalnwmawdndgnnkapkpgqtvtvadgdnayknwlggkpylapvspwffthfgpevsysknwvfpggpliynrwqqvlqqgfpmveivtwndygeshyvgplkskhfddgnskwvndmphdgfldlskpfiaayknrdtdiskyvqneqlvywyrrnlkaldcdatdttsnrpanngsgnyfmgrpdgwqtmddtvyvaallktagsvtvtsggttqtfqanaganlfqipasigqqkfaltrngqtvfsgtslmditnvcscgiynfnpyvgtipagfddplqadglfsltiglhvttcqakpslgtnppvtsgpvsslpassttrasspppvsstrvssppvssppvsrtssappppasstppsgqvcvagtvadgesgnyiglcqfscnygycppgpckctafgapisppasngrngcplpgegdgylglcsfscnhnycpptacqyc
서열번호 2	gDNA 서열	atgttgggcgttttccgccgcctcgggctgggcgccctagctgccgcagctctatcttctctcggcagtgccgctcccgccaatgttgctatccggtctctcgaggagcgcgcttcctctgctgaccgtcttgtattctgtcacttcatggttagtttttacctaggaattataaggatgaggactaatgtagcaacgtcatgacagattggtatcgttggtgaccgtggcagctcggcagattatgatgacgatatgcaacgtgccaaagccgctggcattgacgccttcgccctgaacatcggcgttgacggctataccgaccagcagctcggctatgcctatgactctgccgatcgtaatggcatgaaagtcttcatttcatttgatttcaactggtggagccccggcaatgcagttggtgttggccagaagattgcgcagtatgccaaccgccctgcccagctgtatgtcgacaaccggccattcgcctcttccttcgccggtgacggtctggatgtaaatgcgttgcgctctgctgcaggctccaacgtttactttgtgcccaacttccaccctggtcaatcttccccctccaacattgatggcgcccttaactggatggtaagccgcaactccagagccgagagtaggaaagcaatactaatgtgtttttagtccagtttctcgcacctcttctgcccctccccctccggccagcagcacgccgccatcgggtcaggtttgcgttgccggcaccgttgccgacggcgagtctggcaactacatcggcctgtgccaattcagctgcaagtaggttgcccccataccccttacttgcttccttaactaatcctttgtagctacggttactgcccaccaggaccgtgtaagtgcaccgcctttggtgctcccatctcgccaccggcatccaacggccgcaacggctgccctctgccgggagaaggcgatggttatctgggcctgtgcagtttcagttgtaaccataattactgcccgccaacggcatgtcaatactgctag
서열번호 3	cDNA 서열	gaaggcattggactgcgacgccaccgacaccacctctaaccgcccggctaacaatggaagcggtaattactttatgggacgccctgatggttggcaaactatggatgacaccgtttatgttgccgcacttctcaagactgccggtagcgtcacggtcacgtctggtggcaccactcaaacgttccaggccaacgccggagccaatctcttccaaatcccggccagcatcggccagcaaaagtttgctctgactcgtaacggtcagaccgtctttagcggaacctcattgatggatatcaccaacgtttgctcttgcggtatctacaacttcaacccatatgttggcaccattcctgccggctttgacgaccctcttcaggctgacggtcttttctctttgaccatcggattgcacgtcacaacttgtcaggccaagccatctcttggaactaaccctcctgtcacttccggccctgtgtcctcgcttccagcttcctccaccacccgcgcatcctcgccgcctcctgtttcttcaactcgtgtctcttctccccctgtctcttcccctccagtttctcgcacctcttctgcccctccccctccggccagcagcacgccgccatcgggtcaggtttgcgttgccggcaccgttgccgacggcgagtctggcaactacatcggcctgtgccaattcagctgcaactacggttactgcccaccaggaccgtgtaagtgcaccgcctttggtgctcccatctcgccaccggcatccaacggccgcaacggctgccctctgccgggagaaggcgatggttatctgggcctgtgcagtttcagttgtaaccataattactgcccgccaacggcatgtcaatactgctag

다른 관점에서, 본 발명은 상기 알파-1,3-글루카나제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 알파-1,3-글루카나제를 코딩하는 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입된 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 재조합 미생물은 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택될 수 있다.

본 발명의 일 양태에서는 알파-1,3-글루카나제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 제조하였으며, 다른 양태에서는 알파-1,3-글루카나제를 코딩하는 유전자로 형질전환된 곰팡이 아스퍼질러스 나이저를 제조하였다.

본 발명에 일 양태에서 제조된 아스퍼질러스 나이저 형질전환체는 가 생산하는 알파-1,3-글루카나제의 경우는, 원래의 단백질 분자량은 64.9kD 크기이나 글라이코실레이션(Glysosylation)되어 실제 크기는 115-240 kD로 다양함을 확인하였다

본 발명에서 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.

"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다.

그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및, 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열 중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이(E. coli)에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나, 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 곰팡이 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다.

예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.

재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 액체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열 (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있다. 실시예에서 예시된 아스퍼질러스 나이가 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다. 또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하여 알파-1,3-글루카나제를 생성시키는 제조방법에 관한 것이다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 (a) 상기 재조합 미생물을 배양하여 알파-1,3-글루카나아제를 생성시키는 단계; 및 (b) 상기 생성된 알파-1,3-글루카나아제를 수득하는 단계를 포함하는 알파-1,3-글루카나아제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서는 형질전환된 재조합 A. niger를 이용하여 재조합 알파-1,3-글루카나제를 제조하였으며, 상기 pASP(GenoFocus사, 한국) 벡터는 단백질 발현을 위해 별도의 유도제(Inducer) 첨가가 필요 없이 미생물 배양만으로 세포성장과 단백질 발현이 분리된 상태로 재조합 단백질이 가능하다.

상기 방법으로 생산된 알파-1,3-글루카나제는 SDS-PAGE로 확인결과 115-240kDa의 크기를 가지는 밴드가 확인되었다 (도 1).

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 알파-1,3-글루카나아제를 이용한 바이오필름의 분해방법에 관한 것이다.

본 발명의 일양태에서는 아스퍼질러스 나이저 유래 효소를 스트렙토코커스 뮤탄스에 의해 생산된 뮤탄에 처리하였을 때, 뮤탄 분해에 의하여 환원당이 형성된는 것을 확인하였다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 알파-1,3-글루카나아제를 함유하는 구강위생용품에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 구강위생용품은 치약 또는 구강세척제일 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 트리코더마 유래 신규 알파-1,3-글루카나제의 클로닝

트리코더마 하찌아늄 신규 알파-1,3-글루카나제 유전자 염기서열을 이용하여 재조합 벡터 및 재조합 미생물을 제조하였다. 서열번호 2의 알파-1,3-글루카나제 유전자의 염기서열을 토대로 하기와 같은 서열번호 4 MutF와 서열번호 5 MutR의 프라미어(primer)를 제작하였다.

서열번호 4 MutF: atataggcctatgttgggcgttttccgccgcctc

서열번호 5 MutR: atatgcggccgcctagcagtattgacatgccgttgg

트리코더마 하찌아늄 GF101()의 게놈 gDNA를 주형으로 하고, MutF와 MutR의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 정제 후, 각각의 프라이머에 삽입한 제한효소 서열 StuI과 NotI을 이용하여, pASP(GenoFocus사, 한국) 벡터에 동일 제한효소 부위에 삽입하여 pASPGFMUT로 명명한 벡터를 제조하였고, 상기 제조된 벡터를 대장균 DH5α 균주에 형질전환 시켰다.

실시예 2: 알파-1,3-글루카나제 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조

실시예 1에서 제작된 재조합 대장균에서 pASPGFMUT 플라스미드 DNA를 제조하였다. 발현벡터 pASPGFMUT를 아스퍼질러스 나이거에 도입하여 형질전환하였다. (Tilburn et al., Gene., 26:205-221, 1983).

형질전환은 YPD(Yest extract 1%, peptone 2%, Dextran 2%)배지에서 15시간 액상 배양한 균사체에 세포벽분해 효소(Sigma L1412)를 처리하여 프로토플라스트(protoplast)를 제조한 후 pASPGFMUT DNA를 유전체에 삽입하였다. 재조합미생물을 선별하기 위하여, 하이그로마시신(Hygromycin B)이 100ug/ml로 첨가된 YPD 아가 배지에서 선별하여 계대 배양하였다.

실시예 3: 재조합미생물의 플라스크 배양

실시예 2의 재조합 미생물 중에서 하이그로마이신 B에 내성을 가지는 재조합미생물들을 동일한 아가배지에 점 접종하여 1차 계대를 한다. 4일 후 아가완전 배지에 재조합미생물 포자를 골고루 분산시킨 후 30℃에서 포자가 골고루 형성될때까지 5-6일간 배양한다.

5일간 배양한 배양접시로부터 0.1% 트윈(Tween) 80으로 무성포자를 1X10^6 cell/ml 로 수확하여 이 희석액 1ml를 액상 생산배지(Glucose 5% soybean meal 2% CSL1%) 50ml 에 접종한다. 접종후 진탕배양기에서 28℃, 200rpm, 4일 이상 배양한다. 배양액을 10,000 g에서 10분간 원심분리하여 균체를 제거하고 회수한 배양 상등액을 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다.

전기영동 분석 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 알파-1,3-글루카나제 분자량은 64.9 kD 크기이나 글라이코실레이션(Glysosylation)되어 실제 크기는 115-240 kD로 다양함을 확인하였다. O-링크(link) 글라이코실레이젼 분석프로그램(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/)을 이용하여 분석한 결과 316, 317 446, 452, 455, 460, 461, 465, 466, 470, 471, 472, 473, 477, 482, 483, 484, 487, 488, 492, 493, 497, 499, 500, 501, 508, 509, 510, 558, 562 위치에 존재하고 있다.

균체를 파쇄하지 않고 균체만 제거하고 상등액을 전기영동한 결과와 같이 알파-1,3-글루카나제가 시그날펩타이드에 의해 아스퍼질러스 나이거 외부로 분비됨을 확인할 수 있었다. 분비된 액상 발효액은 33.6U/ml 활성을 보였다. 액상 발효액은 5% 트래할로스(trehalose)를 첨가하여 동결건조하여 파우더로 제작하였다.

재조합 형질전환체를 151시간 배양한 후, 동결건조한 파우더는 105.4U/g 알파-1,3-글루카나제 활성을 보였다.

실시예 4: 알파-1,3-글루카나제 효소의 활성 측정

스트렙토코커스 뮤탄스를 배양하여 분리한 뮤탄을 이용하여 유리 환원당의 생성을 정량한다. 뮤탄 10 mg을 튜브에 담고, 0.1 M 포스페이트 완충용액 0.9 ml을 첨가하여 뮤탄이 고르게 분산되도록 한다. 뮤탄이 담겨있는 용액을 37℃에서 5분 정도 놓아두었다. 실시예 3에서 발효액상 0.1ml 또는 동결건조한 파우더를 물 9ml에 1g에 녹여 효소액 0.1ml을 첨가하여 총 1 ml이 되도록 하고, 이 반응액을 37℃에서 30분간 반응시킨다. 효소를 불활성화시키기 위해 반응액을 끓는 물에서 3분 정도 놓아두었다.

반응이 끝난 뮤탄을 분리하기 위해 12,000RPM에서 10분간 윈심분리한다. 앞의 과정에서 분리된 상층액 0.5ml을 취하여 그대로 또는 적정하게 희석하여 반응 중에 생성된 유리 환원당을 Somogyi-Nelson method로 정량한다. 효소의 활성은 1분당 1umole의 유리 환원당을 생성시키는 효소의 양으로 한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시태양일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Genofocus, Inc. <120> Novel alpha-1,3-glucanse <130> P15-B188 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 635 <212> PRT <213> Trichoderma harzianum <400> 1 Met Leu Gly Val Phe Arg Arg Leu Gly Leu Gly Ala Leu Ala Ala Ala 1 5 10 15 Ala Leu Ser Ser Leu Gly Ser Ala Ala Pro Ala Asn Val Ala Ile Arg 20 25 30 Ser Leu Glu Glu Arg Ala Ser Ser Ala Asp Arg Leu Val Phe Cys His 35 40 45 Phe Met Ile Gly Ile Val Gly Asp Arg Gly Ser Ser Ala Asp Tyr Asp 50 55 60 Asp Asp Met Gln Arg Ala Lys Ala Ala Gly Ile Asp Ala Phe Ala Leu 65 70 75 80 Asn Ile Gly Val Asp Gly Tyr Thr Asp Gln Gln Leu Gly Tyr Ala Tyr 85 90 95 Asp Ser Ala Asp Arg Asn Gly Met Lys Val Phe Ile Ser Phe Asp Phe 100 105 110 Asn Trp Trp Ser Pro Gly Asn Ala Val Gly Val Gly Gln Lys Ile Ala 115 120 125 Gln Tyr Ala Asn Arg Pro Ala Gln Leu Tyr Val Asp Asn Arg Pro Phe 130 135 140 Ala Ser Ser Phe Ala Gly Asp Gly Leu Asp Val Asn Ala Leu Arg Ser 145 150 155 160 Ala Ala Gly Ser Asn Val Tyr Phe Val Pro Asn Phe His Pro Gly Gln 165 170 175 Ser Ser Pro Ser Asn Ile Asp Gly Ala Leu Asn Trp Met Ala Trp Asp 180 185 190 Asn Asp Gly Asn Asn Lys Ala Pro Lys Pro Gly Gln Thr Val Thr Val 195 200 205 Ala Asp Gly Asp Asn Ala Tyr Lys Asn Trp Leu Gly Gly Lys Pro Tyr 210 215 220 Leu Ala Pro Val Ser Pro Trp Phe Phe Thr His Phe Gly Pro Glu Val 225 230 235 240 Ser Tyr Ser Lys Asn Trp Val Phe Pro Gly Gly Pro Leu Ile Tyr Asn 245 250 255 Arg Trp Gln Gln Val Leu Gln Gln Gly Phe Pro Met Val Glu Ile Val 260 265 270 Thr Trp Asn Asp Tyr Gly Glu Ser His Tyr Val Gly Pro Leu Lys Ser 275 280 285 Lys His Phe Asp Asp Gly Asn Ser Lys Trp Val Asn Asp Met Pro His 290 295 300 Asp Gly Phe Leu Asp Leu Ser Lys Pro Phe Ile Ala Ala Tyr Lys Asn 305 310 315 320 Arg Asp Thr Asp Ile Ser Lys Tyr Val Gln Asn Glu Gln Leu Val Tyr 325 330 335 Trp Tyr Arg Arg Asn Leu Lys Ala Leu Asp Cys Asp Ala Thr Asp Thr 340 345 350 Thr Ser Asn Arg Pro Ala Asn Asn Gly Ser Gly Asn Tyr Phe Met Gly 355 360 365 Arg Pro Asp Gly Trp Gln Thr Met Asp Asp Thr Val Tyr Val Ala Ala 370 375 380 Leu Leu Lys Thr Ala Gly Ser Val Thr Val Thr Ser Gly Gly Thr Thr 385 390 395 400 Gln Thr Phe Gln Ala Asn Ala Gly Ala Asn Leu Phe Gln Ile Pro Ala 405 410 415 Ser Ile Gly Gln Gln Lys Phe Ala Leu Thr Arg Asn Gly Gln Thr Val 420 425 430 Phe Ser Gly Thr Ser Leu Met Asp Ile Thr Asn Val Cys Ser Cys Gly 435 440 445 Ile Tyr Asn Phe Asn Pro Tyr Val Gly Thr Ile Pro Ala Gly Phe Asp 450 455 460 Asp Pro Leu Gln Ala Asp Gly Leu Phe Ser Leu Thr Ile Gly Leu His 465 470 475 480 Val Thr Thr Cys Gln Ala Lys Pro Ser Leu Gly Thr Asn Pro Pro Val 485 490 495 Thr Ser Gly Pro Val Ser Ser Leu Pro Ala Ser Ser Thr Thr Arg Ala 500 505 510 Ser Ser Pro Pro Pro Val Ser Ser Thr Arg Val Ser Ser Pro Pro Val 515 520 525 Ser Ser Pro Pro Val Ser Arg Thr Ser Ser Ala Pro Pro Pro Pro Ala 530 535 540 Ser Ser Thr Pro Pro Ser Gly Gln Val Cys Val Ala Gly Thr Val Ala 545 550 555 560 Asp Gly Glu Ser Gly Asn Tyr Ile Gly Leu Cys Gln Phe Ser Cys Asn 565 570 575 Tyr Gly Tyr Cys Pro Pro Gly Pro Cys Lys Cys Thr Ala Phe Gly Ala 580 585 590 Pro Ile Ser Pro Pro Ala Ser Asn Gly Arg Asn Gly Cys Pro Leu Pro 595 600 605 Gly Glu Gly Asp Gly Tyr Leu Gly Leu Cys Ser Phe Ser Cys Asn His 610 615 620 Asn Tyr Cys Pro Pro Thr Ala Cys Gln Tyr Cys 625 630 635 <210> 2 <211> 2069 <212> DNA <213> Trichoderma harzianum <400> 2 atgttgggcg ttttccgccg cctcgggctg ggcgccctag ctgccgcagc tctatcttct 60 ctcggcagtg ccgctcccgc caatgttgct atccggtctc tcgaggagcg cgcttcctct 120 gctgaccgtc ttgtattctg tcacttcatg gttagttttt acctaggaat tataaggatg 180 aggactaatg tagcaacgtc atgacagatt ggtatcgttg gtgaccgtgg cagctcggca 240 gattatgatg acgatatgca acgtgccaaa gccgctggca ttgacgcctt cgccctgaac 300 atcggcgttg acggctatac cgaccagcag ctcggctatg cctatgactc tgccgatcgt 360 aatggcatga aagtcttcat ttcatttgat ttcaactggt ggagccccgg caatgcagtt 420 ggtgttggcc agaagattgc gcagtatgcc aaccgccctg cccagctgta tgtcgacaac 480 cggccattcg cctcttcctt cgccggtgac ggtctggatg taaatgcgtt gcgctctgct 540 gcaggctcca acgtttactt tgtgcccaac ttccaccctg gtcaatcttc cccctccaac 600 attgatggcg cccttaactg gatggtaagc cgcaactcca gagccgagag taggaaagca 660 atactaatgt gtttttaggc ctgggataat gatggaaaca acaaggcacc caagccgggc 720 cagactgtca cagtggcaga cggtgacaac gcttataaga attggttggg tggcaagcct 780 tacctggcgc ctgtctcacc ttggtttttc acccatttcg gccccgaagt ttcatattcc 840 aagaactggg ttttcccagg tggtcctctg atctataacc ggtggcaaca ggtcttgcag 900 cagggtttcc ccatggttga gatcgttacc tggaatgact acggcgagtc tcactacgtc 960 ggtcccctga agtctaagca tttcgatgat ggcaactcca aatgggtcaa tgatatgccc 1020 catgatggat tccttgatct ttcgaagccg ttcattgcag catataagaa cagggatacc 1080 gacatctcca agtatgttca aaatgagcag cttgtttact ggtaccgccg caacttgaag 1140 gcattggact gcgacgccac cgacaccacc tctaaccgcc cggctaacaa tggaagcggt 1200 aattacttta tgggacgccc tgatggttgg caaactatgg atgacaccgt ttatgttgcc 1260 gcacttctca agactgccgg tagcgtcacg gtcacgtctg gtggcaccac tcaaacgttc 1320 caggccaacg ccggagccaa tctcttccaa atcccggcca gcatcggcca gcaaaagttt 1380 gctctgactc gtaacggtca gaccgtcttt agcggaacct cattgatgga tatcaccaac 1440 gtttgctctt gcggtatcta caacttcaac ccatatgttg gcaccattcc tgccggcttt 1500 gacgaccctc ttcaggctga cggtcttttc tctttgacca tcggattgca cgtcacaact 1560 tgtcaggcca agccatctct tggaactaac cctcctgtca cttccggccc tgtgtcctcg 1620 cttccagctt cctccaccac ccgcgcatcc tcgccgcctc ctgtttcttc aactcgtgtc 1680 tcttctcccc ctgtctcttc ccctccagtt tctcgcacct cttctgcccc tccccctccg 1740 gccagcagca cgccgccatc gggtcaggtt tgcgttgccg gcaccgttgc cgacggcgag 1800 tctggcaact acatcggcct gtgccaattc agctgcaagt aggttgcccc catacccctt 1860 acttgcttcc ttaactaatc ctttgtagct acggttactg cccaccagga ccgtgtaagt 1920 gcaccgcctt tggtgctccc atctcgccac cggcatccaa cggccgcaac ggctgccctc 1980 tgccgggaga aggcgatggt tatctgggcc tgtgcagttt cagttgtaac cataattact 2040 gcccgccaac ggcatgtcaa tactgctag 2069 <210> 3 <211> 1908 <212> DNA <213> Trichoderma harzianum <400> 3 atgttgggcg ttttccgccg cctcgggctg ggcgccctag ctgccgcagc tctatcttct 60 ctcggcagtg ccgctcccgc caatgttgct atccggtctc tcgaggagcg cgcttcctct 120 gctgaccgtc ttgtattctg tcacttcatg attggtatcg ttggtgaccg tggcagctcg 180 gcagattatg atgacgatat gcaacgtgcc aaagccgctg gcattgacgc cttcgccctg 240 aacatcggcg ttgacggcta taccgaccag cagctcggct atgcctatga ctctgccgat 300 cgtaatggca tgaaagtctt catttcattt gatttcaact ggtggagccc cggcaatgca 360 gttggtgttg gccagaagat tgcgcagtat gccaaccgcc ctgcccagct gtatgtcgac 420 aaccggccat tcgcctcttc cttcgccggt gacggtctgg atgtaaatgc gttgcgctct 480 gctgcaggct ccaacgttta ctttgtgccc aacttccacc ctggtcaatc ttccccctcc 540 aacattgatg gcgcccttaa ctggatggcc tgggataatg atggaaacaa caaggcaccc 600 aagccgggcc agactgtcac agtggcagac ggtgacaacg cttataagaa ttggttgggt 660 ggcaagcctt acctggcgcc tgtctcacct tggtttttca cccatttcgg ccccgaagtt 720 tcatattcca agaactgggt tttcccaggt ggtcctctga tctataaccg gtggcaacag 780 gtcttgcagc agggtttccc catggttgag atcgttacct ggaatgacta cggcgagtct 840 cactacgtcg gtcccctgaa gtctaagcat ttcgatgatg gcaactccaa atgggtcaat 900 gatatgcccc atgatggatt ccttgatctt tcgaagccgt tcattgcagc atataagaac 960 agggataccg acatctccaa gtatgttcaa aatgagcagc ttgtttactg gtaccgccgc 1020 aacttgaagg cattggactg cgacgccacc gacaccacct ctaaccgccc ggctaacaat 1080 ggaagcggta attactttat gggacgccct gatggttggc aaactatgga tgacaccgtt 1140 tatgttgccg cacttctcaa gactgccggt agcgtcacgg tcacgtctgg tggcaccact 1200 caaacgttcc aggccaacgc cggagccaat ctcttccaaa tcccggccag catcggccag 1260 caaaagtttg ctctgactcg taacggtcag accgtcttta gcggaacctc attgatggat 1320 atcaccaacg tttgctcttg cggtatctac aacttcaacc catatgttgg caccattcct 1380 gccggctttg acgaccctct tcaggctgac ggtcttttct ctttgaccat cggattgcac 1440 gtcacaactt gtcaggccaa gccatctctt ggaactaacc ctcctgtcac ttccggccct 1500 gtgtcctcgc ttccagcttc ctccaccacc cgcgcatcct cgccgcctcc tgtttcttca 1560 actcgtgtct cttctccccc tgtctcttcc cctccagttt ctcgcacctc ttctgcccct 1620 ccccctccgg ccagcagcac gccgccatcg ggtcaggttt gcgttgccgg caccgttgcc 1680 gacggcgagt ctggcaacta catcggcctg tgccaattca gctgcaacta cggttactgc 1740 ccaccaggac cgtgtaagtg caccgccttt ggtgctccca tctcgccacc ggcatccaac 1800 ggccgcaacg gctgccctct gccgggagaa ggcgatggtt atctgggcct gtgcagtttc 1860 agttgtaacc ataattactg cccgccaacg gcatgtcaat actgctag 1908 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 atataggcct atgttgggcg ttttccgccg cctc 34 <210> 5 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atatgcggcc gcctagcagt attgacatgc cgttgg 36

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 트리코더마 하찌아눔 유래의 알파-1,3-글루카나아제.
삭제
제1항의 알파-1,3-글루카나아제를 코딩하는 유전자.
제3항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
제3항에 있어서, 서열번호 3의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
제3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제3항의 유전자 또는 제6항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
제7항에 있어서, 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 재조합 미생물
다음 단계를 포함하는 알파-1,3-글루카나아제의 제조방법.
(a) 제7항의 재조합 미생물을 배양하여 알파-1,3-글루카나아제를 생성시키는 단계; 및
(b) 상기 생성된 알파-1,3-글루카나아제를 수득하는 단계.
제1항의 알파-1,3-글루카나아제를 이용한 바이오필름의 분해방법.
제10항에 있어서, 상기 바이오필름은 스트렙토코코스 속 균주에 의해 생성된 것을 특징으로 하는 방법.
제1항의 알파-1,3-글루카나아제를 유효성분으로 함유하는 구강위생용품.