KR101619863B1 - 신규 베타-갈락토시다아제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규 베타-갈락토시다제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans) 유래의 신규 베타-갈락토시다제, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제의 제조방법 및 상기 베타-갈락토시다제를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 신규 베타-갈락토시다아제를 사용하면, 갈락토올리고당을 효율적으로 대량 생산할 수 있다.

Description

신규 베타-갈락토시다아제{Novel β-glactosidase}

본 발명은 신규 베타-갈락토시다제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 바실러스 서큘란스 (Bacillus circulans) 유래의 신규 베타-갈락토시다제, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용한 베타-갈락토시다제의 제조방법 및 상기 베타-갈락토시다제를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.

베타-갈락토시다제(β-galactosidase)는 유당과 같은 베타-D-갈락토피라노사이드(β-D-galactopyranoside)에서 비환원 말단 베타-D-갈락토스(β-D-galactose)를 가수분해하거나, 갈락토스(Galactose)의 전이반응을 촉매한다. 일반적으로 이 효소는 가수분해 활성과 당 전이 활성의 두 가지 특성을 가지고 있는데, 모두 산업적으로 응용성이 있다. 가수분해 활성은 우유와 유제품의 유당을 가수분해하여 유당불내증을 막아주며 감미도를 높여 주고, 당 전이 활성은 인간의 장내 유용미생물인 유산균의 성장을 증진시키는 갈락토올리고당(Galactooligosaccharide)의 제조에 이용된다.

베타-갈락토시다제는 여러 종류의 미생물, 식물, 그리고 동물에서 발견되나, 현재 산업적으로 이용되는 대다수의 베타-갈락토시다제는 미생물에서 분리된 것이다. 당 전이 반응의 특이성이 다른 베타-갈락토시다제가 바실러스 속(Bacillus sp), 아스퍼질러스 속(Aspergillus sp), 사카로마이세스 속(Saccharomyces sp) 등에서 분리되었으며, 그 외의 고온성 미생물에서 분리된 내열성 효소에 관한 연구도 다양하게 진행되었다.

현재 전세계적으로 갈락토올리고당 생산에 사용되는 베타-갈락토시다제는 바실러스 또는 아스퍼질러스 유래의 것이 대다수이며, 특히 바실러스 유래, 구체적으로, 바실러스 서큘란스 유래의 베타-갈락토시다제는 50~60℃의 활성온도와 높은 당 전이 활성 때문에 상업적으로 가장 많이 사용되는 것 중의 하나이며, 특히, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제는 BIOLACTA(Amano사)라는 제품명으로 판매되고 있다. 상기 효소는 적절한 배양배지에 바실러스 서큘란스를 배양시킨 후, 세포파쇄 또는 배양배지로부터 회수하는 방법으로 생산된다고 알려져 있다.

또한, 바실러스 서큘란스 ATCC 31382 유래의 베타-갈락토시다제의 특성은 여러 문헌에 보고되어 있다. 상기 미생물에는 3개의 구조적 아형(Isoform)의 베타-갈락토시다제가 존재한다고 보고 하였으며, 단백질 크기에 따라 212 kDa의 베타-갈락토시다제 I, 145 kDa의 베타-갈락토시다제 II, 그리고 86 kDa의 베타-갈락토시다제 III로 명명된다. 상기 3가지 아형 의 유전자 염기서열은 베타-갈락토시다제 I은 Amano사(WO2010/140435)에서, 베타-갈락토시다제 II는 GenoFocus사(대한민국 등록특허 제1,121,161호)에서, 베타-갈락토시다제 III는 Ito 그룹(Ito Y. et al., Biosci Biotechnol Biochem., 61:1270-6, 1997)에서 확인하였다. 이 3가지의 아형중 베타-갈락토시다제 I과 II가 갈락토올리고당 합성에 이용될 수 있다고 확인되었다. 지금까지 다양한 그룹의 연구에서 바실러스 서큘란스에는 3가지의 베타-갈락토시다제 유전자만이 존재한다고 보고하였다.

본 발명자들은 바실러스 서큘란스에 베타-갈락토시다제 아형이 존재한다면, 지금까지 확인된 3종의 베타-갈락토시다제와는 또 다른 추가 베타-갈락토시다제의 특성을 가지는 베타-글리코시다제(beta-glycosidase) 계열의 유전자가 존재할 수 있을 것이라 예상하였고, 이를 바탕으로, 신규 베타-글리코시다제를 확인하기 위하여 노력한 결과, 바실러스 서큘란스에서 기존의 보고된 3가지의 베타-갈락토시다제외에 또 다른 신규한 베타-갈락토시다제의 존재와 이의 유전자 염기서열을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 바실러스 서큘란스 유래의 신규 베타-갈락토시다제를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 신규 베타-갈락토시다제를 코딩하는 유전자를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 도입되어 있는 재조합 미생물을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 미생물을 이용한 신규 베타-갈락토시다제의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 신규 베타-갈락토시다제를 이용한 갈락토올리고당의 제조방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다아제를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자 및 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 베타-갈락토시다제를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 베타-갈락토시다제를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규 베타-갈락토시다아제를 사용하면, 갈락토올리고당을 효율적으로 대량 생산할 수 있다.

도 1은 바실러스 서큘란스의 게놈 DNA를 HpaI 제한효소로 처리한 단편에서 확인된 베타-갈락토시다제 유전자의 ORF의 크기 및 위치를 나타낸 모식도이다.
도 2는 재조합 베타-갈락토시다제 유전자가 형질전환된 대장균 DH5α/pACE-BgaI.New에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제의 단백질 발현 양상을 SDS-PAGE로 확인한 결과이다 (M: 단백질 사이즈 마커, 1: DH5α /None, 2: DH5α/pACE-BgaI.New, 화살표: 베타-갈락토시다제).
도 3은 형질전환된 대장균 DH5α/pACE-BgaI.New에서 생산된 재조합 베타-갈락토시다제의 최적 온도를 나타낸 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

일 관점에서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열을 가지는 베타-갈락토시다아제 및 상기 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

본 발명에서는 바실러스 서큘란스에서 지금까지 확인된 3종의 베타-갈락토시다제 이외의 또 다른 추가 베타-갈락토시다제의 특성을 가지는 베타-글리코시다제(beta-glycosidase) 계열의 유전자가 존재할 수 있을 것이라 예상하고, 바실러스 서큘란스의 게놈으로부터 신규 베타-갈락토시다아제 유전자를 분리하였다.

본 발명의 일 양태에서는 바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 게놈 DNA를 23종의 제한효소로 절단하여, 베타-갈락토시다아제 클로닝용 게놈 라이브러리를 제작하고, 상기 라이브러리에서 베타-갈락토시다아제 활성을 가지는 균주를 선별하였다.

상기 선별된 베타-갈락토시다아제 활성을 가지는 균주가 함유하는 바실러스 서큘란스 게놈 단편을 서열분석을 수행한 결과, 기존에 알려진 바실러스 서큘란스 유래의 베타-갈락토시다아제 유전자를 외에 신규한 서열을 가지는 베타-갈락토시다아제 유전자를 함유하는 단편을 확인하였다.

상기 신규 베타-갈락토시다제 유전자를 함유하는 단편의 염기서열은 서열번호 3에 나타내었으며, 베타-갈락토시다제 유전자가 포함된 DNA 단편의 전체크기는 6731bp이고, 상기 단편에서는 3개의 ORF(Open Reading Frames)가 발견되었다(도 1). 그 중 세번째 ORF가 3105bp의 DNA 크기(서열번호 2)와 1035개의 아미노산(서열번호 1)으로 이루어졌으며, 베타-갈락토시다아제 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

다른 관점에서, 본 발명은 상기 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 벡터 및 상기 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자 또는 상기 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "벡터 (vector)"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드 (plasmid)" 및 "벡터 (vector)"는 때로 상호 교환적으로 사용된다. 그러나, 본 발명은 당업계에 알려진 또는 알려지게 되는 바와 동등한 기능을 갖는 벡터의 다른 형태를 포함한다. 포유동물 세포 배양물 발현을 위한 전형적인 발현 벡터는 예를 들면 pRK5 (EP 307,247호), pSV16B (WO 91/08291호) 및 pVL1392 (Pharmingen)을 기초로 한다.

"발현 조절 서열 (expression control sequence)"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서가 이에 포함된다. 플라스미드에서 유전자의 발현 양에 가장 영향을 미치는 인자는 프로모터이다. 고 발현용의 프로모터로서 SRα 프로모터와 사이토메가로바이러스 (cytomegalovirus) 유래 프로모터 등이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는 TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 단백질 NSP를 발현시키는데 유용하게 사용될 수 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결 (operably linked)"된다. 이것은 적절한 분자 (예를 들면, 전사 활성화 단백질)은 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열(pre-sequence) 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩타이드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩타이드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 프레임 내에 존재하는것을 의미한다. 그러나, 인핸서 (enhancer)는 접촉할 필요가 없다. 이들 서열의 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 (oligonucleotide adaptor) 또는 링커(linker)를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 통상 이종의 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어 (recombinant carrier)로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA의 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA를 의미한다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주 내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현 조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주 내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다.

모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나, 당업자라면 과도한 실험적 부담없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를 선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 발효 또는 대규모 동물 배양에서 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다. 발현 클로닝에 의해 NSP 단백질의 cDNA를 클로닝 하려고 할 때의 스크리닝법으로서 바인딩법(binding법), 페닝법(panning법), 필름에멀션법(film emulsion 법)등이 적용될 수 있다.

본 발명의 정의상 "실질적으로 순수한"이란 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드를 코딩하는 DAN 서열이 박테리아로부터 유래된 다른 단백질을 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.

재조합 단백질을 발현하기 위한 숙주세포는 짧은 시간 내 고농도 균체 배양이 가능하고 유전자 조작이 용이하고 유전학적, 생리적 특징이 잘 밝혀져 있는 대장균 (Escherichia coli), 고초균 (Bacillus subtillis) 등과 같은 원핵세포가 널리 이용되어 왔다. 그러나, 단백질의 번역 후 수식 (post-translational modification), 분비과정 및 활성형의 3차원 구조, 단백질의 활성상태의 문제점들을 해결하기 위해 최근 단세포 진핵세포인 효모 계열 (Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha 등), 사상성 진균류 (filamentous fungi), 곤충세포 (insect cells), 식물세포, 포유동물세포 (mammalian cells) 등 고등생물에 이르기까지 재조합 단백질 생산의 숙주세포로 활용하고 있으므로, 실시예에서 예시된 대장균 뿐만 아니라 다른 숙주세포를 이용하는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 용이하게 적용가능하다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다제를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 베타-갈락토시다제를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다제의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 일 양태에서는 형질전환된 재조합 대장균 (DH5α/pACE-BgaI.New)를 이용하여 재조합 베타-갈락토시다제를 제조하였으며, 상기 pACE(GenoFocus사,한국) 벡터는 단백질 발현을 위해 별도의 유도제(Inducer) 첨가가 필요 없이 미생물 배양만으로 세포성장과 단백질 발현이 분리된 상태로 재조합 단백질이 가능하다. 상기 방법으로 생산된 베타-갈락토시다제는 SDS-PAGE로 확인결과 120kDa의 크기를 가지는 밴드가 확인되었다(도 2).

본 발명의 다른 양태에서는, 상기 수득한 재조합 베타-갈락토시다제와 4-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드(4-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)(SIGMA사)를 기질로 하여, 효소 반응의 최적 온도를 확인한 결과, 본 발명의 신규 베타-갈락토시다제의 최적 활성 온도는 40℃로 확인되었다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 베타-갈락토시다제를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유,유아 우유, 유아 조제식 (baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 구성성분인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 또다른 양태에서는 락토스를 기질로 사용하여, 본 발명의 신규 베타-갈락토시다제의 갈락토올리고당을 합성능을 확인하였으며, 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제의 갈락토올리고당 전환율은 32% 정도로 확인되었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 바실러스 서큘란스 유래 신규 베타-갈락토시다제의 클로닝

바실러스 서큘란스 ATCC 31382는 기본 배지인 LB(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl)배지에서 배양하였으며, 배양된 세포로부터 게놈 DNA 500㎍을 분리(Genomic DNA extraction kit; RBC사)하였다. 상기 분리된 게놈 DNA를 23종의 제한효소 AatII, AflII, ApaI, ApaLI, BamHI, BgalII, BsiWI, ClaI, EcoRI, EcoRV, HindIII, HpaI, KpnI, MluI, NcoI, NdeI, NheI, NotI, NsiI, PciI, PsiI, PstI, PvuI, PvuII, SacI, SalI, ScaI, SpeI, SphI, StuI, XbaI, XhoI 및 XmaI으로 각각 단일 처리하고, 각 제한효소로 잘려진 게놈 DNA 단편 중 1~8 kb의 DNA 단편의 혼합물을 클레노브효소(klenow fragment enzyme; TaKaRa사)로 처리하여 제한효소로 잘려진 DNA 단편의 양 말단을 블런트화(blunt end) 시키고, T-blunt(SolGent사) 벡터에 라이게이션(ligation)하여, T-gDNA.flag로 명명한 각각의 벡터를 함유하는 라이브러리를 제작하였다.

상기 라이브러리를 대장균 DH5α에 형질전환 시키고, X-gal이 함유된 LB agar(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl, 1.5% 한천, 50ug/ml X-gal)에 배양하였다. 24시간 후 LB agar에서 성장한 형질전환 대장균 콜로니(colony) 중 X-gal을 분해하여 초록색 콜로니를 보이는 것을 베타-갈락토시다제 기능의 유전자를 함유하는 균주로 판단하고, 회수하였다. 회수된 콜로니들을 각각 LB 액체 배지에 배양하고, 이들로부터 플라스미드 벡터를 회수(Plasmid mini extraction kit; Bioneer사)하고, 염기서열 분석(SolGent사)을 하였다.

그 결과, 기존에 보고된 베타-갈락토시다제 유전자의 염기서열이 여러 확인 되었고, HpaI 제한효소를 단일 처리하여 생성한 벡터 라이브러리에서 신규 베타-갈락토시다제 유전자가 확인되었다.

상기 신규 베타-갈락토시다제 유전자를 함유하는 단편을 서열번호 3에 나타내었으며, 베타-갈락토시다제 유전자가 포함된 DNA 단편의 전체크기는 6731bp이고, 상기 단편에서는 3개의 ORF(Open Reading Frames)가 발견되었다(도 1). 그 중 세번째 ORF가 3105bp의 DNA 크기(서열번호 2)와 1035개의 아미노산(서열번호 1)으로 이루어졌으며, 베타-갈락토시다아제 활성을 갖는 것으로 확인되었다.

실시예 2: 베타-갈락토시다제 II 유전자를 함유한 재조합 벡터 및 재조합 미생물의 제조

실시예 1에서 확보된 바실러스 서큘란스의 신규 베타-갈락토시다제 유전자 염기서열을 이용하여 재조합 벡터 및 재조합 미생물을 제조하였다.

서열번호 2의 베타-갈락토시다제유전자의 염기서열을 토대로 하기와 같은 서열번호 4와 서열번호 5의 프라미어(primer)를 제작하였다.

서열번호 4: aaaaatgtcacaattaacgtatga

서열번호 5: aaaactgcagttagtgtaaggtaaatgaat

바실러스 서큘란스 ATCC 31382의 게놈 DNA를 주형으로 하고, 서열번호 4와 서열번호 5의 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 정제 후, 각각의 프라이머에 삽입한 제한효소 서열 NdeI과 PstI을 이용하여, pACE(GenoFocus사, 한국) 벡터에 동일 제한효소 부위에 삽입하여 pACE-BgaI.New로 명명한 벡터를 제조하였고, 상기 제조된 벡터를 대장균 DH5α 균주에 형질전환 시켰다.

실시예 3: 재조합 미생물을 이용한 바실러스 서큘란스 유래의 신규 베타-갈락토시다제 제조

실시예 2에서 제작된 재조합 대장균 (DH5α/pACE-BgaI.New)을 이용하여 재조합 베타-갈락토사다제를 제조하였다. pACE(GenoFocus사,한국) 벡터는 단백질 발현을 위해 별도의 유도제(Inducer) 첨가가 필요 없이 미생물 배양만으로 세포성장과 단백질 발현이 분리된 상태로 재조합 단백질을 생산할 수 있다. 따라서, 멸균된 100 ml LB(1% 트립톤, 0.5% 효모추출물, 1% NaCl)배지가 들어있는 1 L의 삼각플라스크에 전날 충분히 종 배양한 상기 형질전환된 재조합 균주 배양물 5 ml을 접종하였고, 30℃에서 교반속도 200 rpm으로 24시간 배양하였다. 배양이 완료된 상기 형질전환된 재조합 균주는 원심분리에 의해 배양액과 분리하였으며, 멸균 증류수에 적정 농도로 다시 희석하였다. 초음파분쇄기(VibraCell사)로 형질전환된 재조합 균주를 파쇄하고 원심분리로 세포 찌꺼기와 베타-갈락토시다제 II를 최종적으로 분리하여, 단백질 전기영동(SDS-PAGE)을 수행하였다.

그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 약 120 kDa 정도의 베타-갈락토시다제 밴드를 확인하였다.

실시예 4: 신규 베타-갈락토시다제의 최적 온도 활성 확인

실시예 3에서 수득한 재조합 베타-갈락토시다제를 이용해 최적 온도를 확인하였다. 베타-갈락토시다제의 활성 결정은 다양한 완충액 중에 4-니트로페닐-베타-D-갈락토피라노사이드(4-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranoside)(SIGMA사)를 용해시켜 기질로 사용하였으며, 30~60℃에서 반응후 10% (w/v) 소디움 카보네이트(Na₂CO₃)를 이용하여 효소 반응을 중지시키고 발색시켰다.

상기 효소의 활성은 420 nm에서의 흡광도에서 유리된 O-니트로페놀의 농도를 확인하였다. 베타-갈락토시다제 1 unit는 상기 조건에서 1분당 1 μmol의 O-니트로페놀을 유리시키는 효소의 양으로 결정하였다.

도 3에 나타난 바와 같이, 신규 베타-갈락토시다제의 최적 활성온도는 40℃로 확인되었다.

실시예 5: 신규 베타-갈락토시다제를 이용한 올리고당의 합성

실시예 3에서 수득한 베타-갈락토시다제의 갈락토올리고당을 합성능을 확인하였다. 갈락토올리고당의 기질로서는 락토스를 사용하였으며, 락토스를 500 g/L의 농도로 50mM 인산 완충액(pH 6.0)에 고온을 가해 용해시켰다. 1 L 용량의 반응기에 500g/L 농도의 락토스 용액 500ml을 첨가하였으며, 반응온도는 50℃로 고정하고, 교반속도는 100 rpm을 유지하였다. 베타-갈락토시다제의 투입양은 최종 농도가 10 units(U/락토스 g)가 되도록 투여하였다. 합성시간은 48시간을 수행하였다.

갈락토올리고당의 분석은 폴리아민 II(Polyamine II; YMC사) 컬럼을 사용하여 RI 검출기가 부착된 HPLC(Agilent사)로 측정하였다. 이때 이동상은 아세토니트릴(Acetonitrile)과 정제수의 비율이 65%/35%(v/v)가 되도록 사용하였다. 이때 이동상의 흐름속도는 1.0 ml/min이었다. 상기 반응 완료 후의 갈락토올리고당의 분석결과는 표 1에 나타내었다.

갈락토올리고당의 전환율은 다음과 같이 계산하였다. 이하에 표현하는 양은 HPLC에 측정된 피크(peak) 면적을 나타내며, 락토스 기질로부터의 생성물에서 단당류인 글루코스, 갈락토스와 이당류의 락토스를 제외한 이당류 이상의 당류를 갈락토올리고당으로 정의한다.

갈락토올리고당 전환율(%)

=[전체 당의 양]-[글루코스 양]-[갈락토스 양]-[락토스 양]

당 조성	4당류 갈락토올리고당	3당류 갈락토올리고당	2당류 갈락토올리고당	락토스	글루코스+갈락토스	총 갈락토 올리고당
함량(%)	3.45	19.72	8.87	56.30	11.65	32.04

상기 함량(%)은 전체 당 (글루코스, 갈락토스, 락토스 및 올리고당)의 합에서 각각의 당에 대한 비율이다. 따라서, 본 발명에 따른 베타-갈락토시다제에 의한 갈락토올리고당 전환율은 32% 정도였다.

이상으로, 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> GenoFocus, Inc. <120> Novel beta glactosidase <130> P14-B173 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1035 <212> PRT <213> Bacillus circulans <400> 1 Met Leu Lys Val Lys Glu Lys Phe Val Tyr Thr Pro Pro Lys Asn Gly 1 5 10 15 Tyr Pro Glu Trp Asn Asn Asn Pro Glu Ile Phe Gln Leu Asn Cys Leu 20 25 30 Pro Ala His Ala Thr Ser Met Pro Phe Leu Ser Val Lys Asp Ala Ile 35 40 45 Thr Leu Asp Arg Leu Glu Ser Ser Phe Cys Lys Cys Leu Asn Gly Glu 50 55 60 Trp Lys Phe Ser Phe Ser Glu Asn Pro Ala Asn Arg Asn Pro Asp Phe 65 70 75 80 Phe Lys Met Gly Phe Asp Glu Cys Glu Met Lys Pro Ile Gln Val Pro 85 90 95 Ser His Trp Gln Phe Gln Gly Tyr Asp Tyr Pro Gln Tyr Thr Asn Val 100 105 110 Arg Tyr Pro Trp Glu Glu Gln Glu Val Leu Lys Pro Pro Phe Ala Pro 115 120 125 Thr Lys Tyr Asn Pro Val Gly Gln Tyr Ile Thr Tyr Phe Asp Ile Pro 130 135 140 Lys Asp Trp Gly Asp Gln Pro Val Tyr Ile His Phe Ala Gly Val Glu 145 150 155 160 Ser Ala Phe Tyr Val Trp Ile Asn Gly Asp Leu Val Gly Tyr Ser Glu 165 170 175 Asp Ser Phe Thr Pro Ser Glu Phe Asp Leu Thr Pro Tyr Leu Val Glu 180 185 190 Gly Thr Asn Lys Leu Ala Val Glu Val Tyr Arg Trp Ser Asp Ala Ser 195 200 205 Trp Leu Glu Asp Gln Asp Phe Trp Arg Leu Ser Gly Ile Phe Arg Asp 210 215 220 Val Tyr Leu Tyr Thr Thr Pro Leu Val His Val Ser Asp Tyr Phe Val 225 230 235 240 Arg Thr Asp Leu Asp Glu Asn Tyr Lys Asp Ala Glu Leu Val Val Asn 245 250 255 Met Lys Val Ser Asn Tyr Gly Ser Met Phe Glu Glu Pro Val Thr Ile 260 265 270 Glu Ala His Leu Ile Asp His Thr Gly Tyr Lys Val Phe Ser Glu Val 275 280 285 Met Val Glu Arg His Ile Gln Thr Val Glu Glu Asn Glu Leu Cys Phe 290 295 300 Leu Lys Lys Ile Ser Ser Pro Leu Leu Trp Ser Ala Glu Gln Pro Met 305 310 315 320 Leu Tyr Thr Phe Val Ile Thr Val Lys Thr Ile Asp Gly Ser Ile Leu 325 330 335 Glu Ala Gln Ser Cys Lys Val Gly Phe Arg Lys Phe Glu Leu Lys Asp 340 345 350 Gly Leu Met Leu Ile Asn Gly Lys Arg Ile Leu Phe Asn Gly Val Asn 355 360 365 Arg His Glu Phe Ser His Leu Arg Gly Arg Ser Val Thr Lys Glu Asp 370 375 380 Met Leu His Asp Val Ile Glu Met Lys Lys His Asn Ile Asn Ala Val 385 390 395 400 Arg Thr Ser His Tyr Pro Asn His Pro Tyr Trp Tyr Asp Leu Cys Asp 405 410 415 Gln Tyr Gly Leu Tyr Val Ile Asp Glu Thr Asn Leu Glu Thr His Gly 420 425 430 Thr Trp Ser Tyr Gly Gln Asn Gln Ile Gln Asn Ala Ile Pro Gly Asp 435 440 445 Lys Glu Glu Trp Thr Ala Asn Val Ile Asp Arg Cys His Ser Met Leu 450 455 460 His Arg Asp Lys Asn His Pro Cys Ile Leu Ile Trp Ser Leu Gly Asn 465 470 475 480 Glu Ser Phe Gly Gly Thr Asn Phe Ile Lys Met Lys Asp His Ile Lys 485 490 495 Lys Glu Asp Pro Thr Arg Leu Val His Tyr Glu Gly Val Ala His Tyr 500 505 510 Arg Ala Ser Ser Glu Ala Ser Glu Ile Glu Ser Met Met Tyr Glu His 515 520 525 Pro Ser Lys Leu Glu Ala Tyr Ala Leu Ser Ala Glu Ser Ser Glu Val 530 535 540 Pro Leu Lys Pro Tyr Ile Ile Cys Glu Tyr Ala His Ala Met Gly Asn 545 550 555 560 Ser Val Gly Asn Leu Tyr Gln Tyr Thr Asp Leu Phe Asn Lys Tyr Pro 565 570 575 Ile Leu Gln Gly Gly Phe Ile Trp Asp Tyr Lys Asp Gln Ala Ile Gln 580 585 590 Thr Ile Ser Glu Thr Gly Thr Pro Tyr Leu Ala Tyr Gly Gly Asp Phe 595 600 605 Gly Glu Ser Pro Asn Asp Gly Asn Phe Cys Gly Asn Gly Leu Leu Phe 610 615 620 Ala Asp Gly Ser Leu Thr Pro Lys Ile Phe Glu Val Lys Lys Cys Tyr 625 630 635 640 Gln Pro Ile Asp Val Arg Ile Glu His Asp Val Phe Thr Val Ile Asn 645 650 655 Lys His Leu Phe Thr Asp Val Asn Glu Tyr Glu Ala Arg Trp Thr Ile 660 665 670 Leu Lys Asp Gly Glu Glu Ile Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ile Ser Cys 675 680 685 Lys Pro Leu Ser Ser Thr Leu Ile Asp Leu Lys Asn Val Leu Ser Lys 690 695 700 Tyr Val Met Asp Asp His Glu Tyr Ile Ile Thr Ile Ser Phe His Thr 705 710 715 720 Val Lys Asp Ser Leu Trp Ala Gln Lys Gly Tyr Glu Ile Ala Phe Asp 725 730 735 Gln Phe Val Leu Thr Asn Arg Ile Ile Ala Gln Arg Val Pro Ser Met 740 745 750 Ser Ile Lys Arg Ile Glu Lys Thr Asn Asp Asn Leu Lys Ile Glu Gly 755 760 765 Glu Thr Phe Ser Val Ile Val Ser Lys Thr Ser Gly Phe Ile Thr Ser 770 775 780 Phe Val Lys Gln Gly Val Glu Ile Leu Ala Glu Pro Ile Val Pro Asn 785 790 795 800 Phe Trp Arg Ala Leu Thr Asp Asn Asp Arg Gly Asn Lys Leu Gly Glu 805 810 815 Arg Thr Gly Ile Trp Glu Gln Ala Gly Lys Thr Ala Val Leu Gln Gln 820 825 830 Met Asp Val Glu Glu Met Asp Lys Thr Val His Ile Lys Thr Val Leu 835 840 845 Gln Leu Gln Thr Ser Pro Ala Ser Val Cys Ser Ile Asp Tyr Glu Ile 850 855 860 Thr Gly Asp Gly Glu Ile His Val Ala Phe Glu Leu Gln Pro Gly Asp 865 870 875 880 Gly Leu Pro Glu Ile Pro Glu Ile Gly Met Ile Leu Pro Leu Val Lys 885 890 895 Ser Phe Glu Ala Ile Ser Trp Tyr Gly Lys Gly Pro His Glu Asn Tyr 900 905 910 Trp Asp Arg Glu Lys Gly Ala Lys Ile Gly Arg Tyr Val Ser Thr Val 915 920 925 Glu Asn Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Lys Pro Gln Glu Asn Gly Asn Lys 930 935 940 Ile Gly Val Arg Ser Phe Glu Ile Gly Asp Gly Arg Gly Ile Ile Leu 945 950 955 960 Arg Val Ser Ser Asp Ser Leu Leu Glu Ile Asn Ala Gly Ala Tyr Ser 965 970 975 Ala Thr Glu Leu Gln Glu Ala Ala His Thr Tyr Gln Leu Pro Glu Arg 980 985 990 Thr Lys Thr Tyr Leu Arg Val Asn His Lys Gln Met Gly Ile Gly Gly 995 1000 1005 Asp Asp Ser Trp Ala Ala Lys Thr His Pro Glu Phe Thr Leu Tyr Ser 1010 1015 1020 Asp His Thr Tyr Gln Tyr Ser Phe Thr Leu His 1025 1030 1035 <210> 2 <211> 3108 <212> DNA <213> Bacillus circulans <400> 2 atgttaaaag tgaaagaaaa atttgtttat acaccaccta aaaacgggta tccggagtgg 60 aataataatc cggaaatttt ccagctcaat tgtttgcctg cacatgctac gagtatgccg 120 tttttgtcgg tgaaagatgc aataacatta gatcgattgg agtcttcgtt ctgtaaatgt 180 ttgaatgggg aatggaaatt ttcattttca gagaatccgg caaatcgaaa tcctgatttt 240 tttaaaatgg gatttgatga atgtgagatg aaaccgattc aagttccttc ccattggcaa 300 tttcagggct atgattatcc gcagtatacg aatgtccgtt atccatggga agagcaagaa 360 gttttaaagc ctccctttgc accgacaaaa tataatcccg taggtcaata cattacatat 420 tttgatatcc cgaaggattg gggagatcag ccggtatata ttcattttgc aggggtggaa 480 tccgcttttt acgtgtggat aaatggcgat ttagttggtt acagtgaaga tagttttact 540 cctagtgagt ttgatctaac tccttattta gtagaaggaa cgaataaact ggcggtagaa 600 gtttatcgct ggagtgatgc cagttggtta gaggaccagg atttttggcg attaagtggt 660 attttcaggg atgtatatct gtataccaca ccgctagtac atgtttcgga ttattttgta 720 cgtacagatc tagatgaaaa ttataaagat gcagaactag ttgtaaatat gaaagtatcg 780 aattatggca gtatgtttga ggagcctgtt actatcgaag cacatttaat tgatcataca 840 ggctacaaag tatttagcga ggttatggta gagcgacata tacaaacagt agaggaaaat 900 gagttatgct ttttaaaaaa aatatcttct cccctcctgt ggagtgcgga gcagccaatg 960 ctttatacat ttgttattac cgtgaaaact atagatggtt cgatattgga agcgcaaagc 1020 tgtaaagtgg gctttcgtaa atttgaatta aaggatggcc tgatgctgat taatggcaaa 1080 aggatattgt ttaacggtgt aaatcgtcat gagttttctc atctgcgcgg tcgctctgtc 1140 acaaaagagg atatgcttca tgatgtcatc gaaatgaaaa agcataatat taatgctgtg 1200 agaacttctc attatccaaa ccatccctat tggtatgatt tatgtgatca atatggttta 1260 tatgtaatcg atgaaactaa tttagaaacg catggtacat ggtcttatgg tcagaatcaa 1320 attcaaaatg ccattccggg agataaggaa gagtggacag ccaatgtgat cgatcgctgt 1380 cattccatgc tgcatcggga taagaatcat ccgtgcattc taatttggtc gctcggaaat 1440 gaatctttcg gcggaaccaa ttttattaaa atgaaagatc atatcaaaaa ggaggaccca 1500 actcgccttg ttcactacga aggggtagcc cattatcgtg cttcaagtga ggcttcggaa 1560 attgaaagta tgatgtacga acatccttca aaactcgaag cctatgccct aagtgcagaa 1620 agcagtgaag tgccgctgaa gccatatatt atttgtgagt atgcacatgc aatggggaat 1680 tctgtaggaa atctctatca atatactgat ctatttaata agtatccaat tttacaggga 1740 ggttttattt gggattataa agatcaagcc attcaaacca tctctgaaac cggaacaccg 1800 tatttagctt atgggggaga ttttggagaa tcgccgaacg acggtaattt ttgcggcaat 1860 ggcctgttat ttgcagatgg gtctttaaca cctaaaatct ttgaagtaaa aaaatgctat 1920 cagccaattg atgtccgaat tgagcatgat gtatttaccg tcatcaataa gcacttattc 1980 actgacgtaa acgaatatga ggcaaggtgg accatactta aagatgggga agagattgcg 2040 agtgaaagca taagtatttc ctgtaagccg ctatcatcta cattgataga tcttaaaaat 2100 gtattgtcaa aatatgtaat ggatgatcat gaatatatta taactattag ttttcacact 2160 gttaaagata gcctttgggc tcaaaagggt tatgaaatag cctttgatca atttgttcta 2220 acaaatcgaa tcattgccca gagagtaccg agcatgtcta ttaaacgtat tgaaaagaca 2280 aacgataatt tgaaaattga gggtgaaaca ttctccgtta ttgtaagtaa aacatcagga 2340 ttcataactt ctttcgtaaa acagggtgta gagattttag ctgagccaat tgttccgaat 2400 ttctggaggg ctcttaccga taatgaccgt gggaataaat taggtgagcg tacaggaatt 2460 tgggaacagg cgggaaaaac ggccgttttg caacagatgg atgtagagga aatggataaa 2520 acggttcata ttaaaaccgt acttcaatta caaacttcac ctgcttcagt ttgtagtatt 2580 gattatgaaa taactggaga cggagaaatt catgttgcgt ttgaacttca gcctggtgat 2640 gggttgccgg aaattcctga aatcgggatg atcctgcctt tagtcaaatc gtttgaggct 2700 atttcttggt acggaaaagg tcctcatgaa aattattggg accgtgaaaa gggggcaaaa 2760 attggccgct atgtatcgac agtggaaaat gagtttacac catatctaaa accacaagaa 2820 aatgggaata aaatcggagt ccgctcgttt gaaattgggg atggccgtgg aataatcctc 2880 cgtgtttcaa gtgattcatt attagaaatt aatgcaggtg cctattcggc aacagaatta 2940 caggaagcag cccatacgta tcagctgcct gaaagaacaa aaacgtattt acgcgtaaac 3000 cataagcaaa tggggattgg cggagatgat tcttgggctg caaagaccca tccggaattc 3060 actttatatt ctgatcatac ttatcaatat tcatttacct tacactaa 3108 <210> 3 <211> 6731 <212> DNA <213> Bacillus circulans <400> 3 gttaacttca tattaatctt tactgctaac aaaatatcta aacgattctc atcatcaagc 60 ttatggtagg agggaaggat atgacgaaaa caggaaatac aagaattaaa gaatcaaaaa 120 ttgatcgcct ttttatagga gctatttatg tatttttagt tctcatttta atagctgttt 180 tatatccgct tatctatatt gtgagcgctt catttagcag tgcatctgcg gtaacatccg 240 ggagtgtttg gctgtggccg gtagaaccaa cactattagg atacacgaca gtgtttaaga 300 atccgcaaat tcttcaaggg ttttataatt cgctgtttta cactgttgtt ggaaccttta 360 ttagtgtaag tatcacgatt atgcttgcct atccgctttc aagaaaaaca ttttatgggc 420 gaaaattgat catgatttta ctggttttta cgatgatttt tgatggggga ttaataccgt 480 tgtatttggt tgtaaaaagt ttgcatttaa ttgatacaat atgggcactt ttactcccgt 540 ccgcattagc ggttttccaa gtgattattg ctagaacatt cttccaatct acgataccgg 600 atgaattagt agaagcaagt gaaatggatg gctgcagcga tattggattc atcctgaaag 660 ttgtcctgcc gttgtccaaa ccgattattg cagttcttgt cctcatgtat gcggtgatga 720 aatggaatat gtactttgat gcattgattt atttgaaatc cgaagagcta tatccattac 780 agctcatttt acgaagcatc ttaattttga atactgaccc atctgcaaat attgaagata 840 tattgaaaat gcaaggattg aaagaattaa tgaagtactc attgattgtt atttcaagtt 900 taccagtttt ggtgctgtat ccatttgttc aaaaacattt tgtaaaaggc atgttaattg 960 gatctgtaaa aggatgaaga agaagcaatc cagctaatac cagaggacgt tagaaaaaat 1020 aatataacgt taaacaaaca aaggagaggg tcaaatgaaa aagttatcaa ctagtttcat 1080 gcttttagtt ttaatgacga tgcttttcgc cggatgtgtt cctactaaga aaagttcatc 1140 cgaaggttca aaaagtgaaa gtccagatcc aaacggacca attgaagttt ccattttcac 1200 cccgagtata tcgtatgatc cagtttttga cagggataaa aatgaattca caaaaatggt 1260 tgaagagaaa tttaatatca aaattaattg gcaatttgca aaccaggatg cagcaaaaga 1320 aaaacgtcaa ttgtctctag ccagcggaga ctatccagat gcatatttgc ttgttgcatg 1380 gttagataat atttctaaag tggaagccca aaagtatggg aaagaaggtg tatttctgcc 1440 attaaataat ttaatagaaa aacatgcgcc aaatctccaa aaattaatga cagaagtccc 1500 ttatatggaa aaaggaatga ctgcaccgga tggtaatatt tatgctcttc ctccaatcaa 1560 tgaatgtttc cattgttcaa gatatgggaa gatgtggata aatacggact ggttgaaaaa 1620 attaaattta gaaatgccta aaacaacgga agaatttaaa acagtattag aagcatttaa 1680 aaataatgat ccaaatggaa acggcaagaa ggatgaaatc ccattaagcg gagaaagtac 1740 catgttaggg gatgatccaa cgatcttcct aatgaatgca tttttgccag ataatggtaa 1800 ggattatata aatgtacagg atggaaaatt agtgttagct ccgatgcagc cagcttggaa 1860 agatgggttg aaatacattc attctcttta taaagagggg ttaatcgatc aaggagcatt 1920 cacccaaaac ccggaggcgt ataagcagtt aggtactcct aaaggggatg aagtccttgg 1980 tgctggtgca gcaagtcatt tagcaattat atctgatata gcttctgaca aatcaaaagc 2040 attcgatgtt gtcccaccgt taaaaggtcc tgaaggtgct caatttacac cttctgatta 2100 tggtaatatc aataatttca cgtttgccat tacgaataaa gcaaatggga aaaaagccga 2160 agcattaatt aagttagcag atttcttata tactgaagaa ggaaccatga tgacagctag 2220 aggtaaggaa ggcgttcatt ggaaaaaggg cggtccggat gatattgatt taactggcaa 2280 acaagcaaaa tatgccatca ttcctagcga ccctaacgag aaagaggaag acaaggtaga 2340 atatggctgg ggagaaagag gtcctctggc actaactagg acacttaggg actccattgc 2400 tgcagaaaca gatgagctgt cctcaaaggg ctatgaaaga agattatata atgcaacact 2460 aaaatatgag ggatttgaac cgaaggaaca atttaatttt gaagcggcat gggttgatcc 2520 taaaaaagca gacgaagtga atctgttaaa aatcaatatt aataaataca tccaagaaaa 2580 tcttgttcaa ttcgtgacag gttcaaagaa catcgataaa gactgggata agtacgttga 2640 cggttttaaa gcattacagg ttgaccgcta tctagaaatc tatcaaaaag cgtatgatgt 2700 cggaaagtaa tacttgaaca ttacaaaaaa agaatacact taagttttat tctggcgtgt 2760 attctttttt cttttgaaaa gggggatgat gtccaatatg ttaaaagtga aagaaaaatt 2820 tgtttataca ccacctaaaa acgggtatcc ggagtggaat aataatccgg aaattttcca 2880 gctcaattgt ttgcctgcac atgctacgag tatgccgttt ttgtcggtga aagatgcaat 2940 aacattagat cgattggagt cttcgttctg taaatgtttg aatggggaat ggaaattttc 3000 attttcagag aatccggcaa atcgaaatcc tgattttttt aaaatgggat ttgatgaatg 3060 tgagatgaaa ccgattcaag ttccttccca ttggcaattt cagggctatg attatccgca 3120 gtatacgaat gtccgttatc catgggaaga gcaagaagtt ttaaagcctc cctttgcacc 3180 gacaaaatat aatcccgtag gtcaatacat tacatatttt gatatcccga aggattgggg 3240 agatcagccg gtatatattc attttgcagg ggtggaatcc gctttttacg tgtggataaa 3300 tggcgattta gttggttaca gtgaagatag ttttactcct agtgagtttg atctaactcc 3360 ttatttagta gaaggaacga ataaactggc ggtagaagtt tatcgctgga gtgatgccag 3420 ttggttagag gaccaggatt 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aaaaatgtca caattaacgt atga 24 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 aaaactgcag ttagtgtaag gtaaatgaat 30

Claims (8)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 베타-갈락토시다아제.
   
2. 제1항의 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자.
   
3. 제2항에 있어서, 상기 베타-갈락토시다아제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 것을 특징으로 하는 유전자.
   
4. 제2항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
   
5. 제2항의 유전자 또는 제4항의 재조합 벡터가 박테리아, 곰팡이 및 효모로 구성된 군에서 선택되는 숙주세포에 삽입되어 있는 재조합 미생물
   
6. 제5항의 재조합 미생물을 배양하여 베타-갈락토시다아제를 생성시키는 단계; 및 상기 생성된 베타-갈락토시다아제를 회수하는 단계를 포함하는 베타-갈락토시다아제의 제조방법.
   
7. 제1항의 베타-갈락토시다아제를 락토스 함유 기질과 반응시켜 갈락토올리고당을 제조하는 단계; 및 상기 제조된 갈락토올리고당을 회수하는 단계를 포함하는 갈락토올리고당의 제조방법.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 갈락토올리고당은 액상유, 건조분말우유,유아 우유,유아 조제식 (baby formula), 아이스크림, 요거트, 치즈, 유제품, 음료, 유아 식품, 시리얼, 빵, 비스켓, 제과류, 케이크, 식품보조제, 식이보충제, 프로바이오틱 식료품, 프리바이오틱 식료품, 동물 사료, 가축 사료 및 약제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나의 구성성분인 것을 특징으로 하는 갈락토올리고당의 제조방법.

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