KR101678796B1 - 세포 배양 장치 및 방법 - Google Patents

Abstract

세포 배양을 위한 장치 및 방법이 제공된다. 장치는 3차원 바디의 외면으로부터 3차원 바디의 내부를 향하여 내방향으로 연장하는 다중 2차원 표면을 포함하고, 상기 다중 2차원 표면이 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하도록 구성된다.

Description

세포 배양 장치 및 방법{Devices and Methods for Culture of Cells}

본 발명은 일반적으로 세포를 배양하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.

진핵 세포를 배양하기 위한 여러 가지의 배양 방법이 존재한다. 이들 방법 중 일부는 상대적으로 적은 개수의 세포를 배양하기 위해 개발되었고, 다른 방법들은 주변 배지 내로 세포에 의해 분비된 단백질의 생산 및 수확을 위해 개발되었다. 그러나, 몇몇 시스템이 대량의 세포를 생산하도록 세포 배양의 상업적 업-스케일링(up-scaling)을 위해 개발되었다.

진핵 세포를 배양하는 가장 통상적인 방법은 2차원 플라스크 또는 트레이, 예컨대 다수의 세포 배양 플라스크를 포함하는 눈클론 셀 팩토리(NUNCLON™ △CELL FACTORY)에서의 증식에 의한 것이다. 이 방법은 지속적인 모니터링 및 DO, pH와 같은 환경적 매개변수의 제어와, 재료 공급/노폐물 제거의 불능; 표면적 대 부피 비율 (surface area to volume ratio) 측면에서의 낮은 효율성; 거대-부피의 인큐베이터 요구; 배양 플라스크의 노동-집약적 조작의 필요성; 및 비경제적이고 세포 생존에 불리한, 접종 및 배양을 위한 장기간을 비롯한 여러 가지 단점들을 갖는다.

또한, 세포는 3차원 매트릭스에서 배양할 수 있다. 이러한 매트릭스에는 생물반응기(bioreactor) 내부의 충진층에 위치할 수 있는 다공성, 부직포/직포 섬유 및 스펀지-유사 재료가 포함될 수 있다. 이들 캐리어는 궁극적으로 제거되어 치료제로서 사용되는 세포의 배양을 위해서라기 보다는, 세포가 매트릭스에 부착된 상태로 유지하면서, 분비 단백질의 생산 및 회수를 위해 주로 사용된다. 이러한 캐리어의 예로는 FIBRA-CELL® DISKS (New-Brunswick), 및 다공성 세라믹 캐리어가 있다. 문헌[Wang, G., W. Zhang, et al., "Modified CelliGen-packed bed bioreactors for hybridoma cell cultures." Cytotechnology 9(1-3): 41-9 (1992); 및 Timmins, N. E., A. Scherberich, et al., "Three-dimentional cell culture and tissue engineering in a T-CUP (tissue culture under perfusion)." Tissue Eng 13(8): 2021-8 (2007)]을 참조하라.

그러나, 3차원 매트릭스에서의 배양은 몇 가지 단점을 가질 수 있다. 예를 들면, 매트릭스로부터 세포를 제거하는 것이 상대적으로 어려울 수 있고, 제거 공정이 세포에 손상을 입힐 수 있다. 이러한 장치를 사용한 생산은 손상된 세포가 배양 시스템 표면에 쉽게 재부착하지 않을 수 있기 때문에 어려울 수 있다. 매트릭스 및 플라스크에 사용된 재료의 종류 및 특성의 차이가 또한 세포 상호작용에의 변화를 초래할 수 있다.

마지막으로, 세포를 현탁액 내 또는 유동층 내 비-다공성 마이크로-캐리어를 사용하는 생물반응기에서 배양할 수 있다. 이 방법은 마이크로-캐리어의 표면상에서 단층으로 세포 성장을 가능케 한다. 그러나, 이 방법을 이용하는 것은 침강 또는 여과에 의해 배지로부터 캐리어의 분리를 요구하는데, 이는 단순한 공정이 아니고 높은 세포-회수율을 초래하지 않을 수 있다. 더욱이, 마이크로-캐리어는 표면에서 세포 규모로 편차를 갖는데, 이는 2차원 배양 시스템과는 다른 배양 환경을 조성한다.

본 발명은 진핵 세포의 2차원 배양을 위한 장치 및 방법을 제공한다.

다양한 구체예에 따르면, 세포 배양용 장치가 제공된다. 본 장치는 3차원 바디 (three-dimensional body)의 외면(periphery)으로부터 3차원 바디의 내부를 향하여 내방향으로 연장하는 다중 2차원 표면 (multiple two-dimensional surfaces)을 포함하는 3차원 바디를 포함하고, 상기 다중 2차원 표면은 상기 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하도록 구성되며, 상기 3차원 바디는 약 1 mm 내지 약 50 mm 범위의 최대 치수를 갖는다. 통상적인 2차원 세포 배양 방법 (여기서 세포는 2차원 표면을 제공하는 용기 내에서 성장함)과는 달리, 본 발명에 기술된 장치는 세포 배양 배지를 포함하는 용기 (vessel) 내로 도입된다. 예를 들어, 본 발명에 기술된 장치는 하기에 기술된 바와 같은 세포 배양용 시스템의 일부를 형성할 수 있다. 따라서, 일부 구체예에서, 상기 장치는 적합한 용기 내부의 배양 배지 내에 침지된다. 단층으로 세포의 2차원 성장을 제공함에 있어서, 본 발명에 기술된 장치는 2차원 환경에서 성장한 세포와 관련된 특성들을 갖는 세포를 생산하도록 성장 조건을 제어하는 것을 가능케 한다.

다양한 구체예에 따르면, 세포 배양용 시스템이 제공된다. 본 시스템은 용기 및 일군의 3차원 바디를 포함할 수 있다. 각각의 3차원 바디는 3차원 바디의 외면으로부터 3차원 바디의 내부를 향하여 내방향으로 연장하는 다중 2차원 표면을 포함할 수 있고, 상기 다중 2차원 표면은 상기 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하도록 구성되며, 3차원 바디는 약 1 mm 내지 약 50 mm 범위의 최대 치수를 갖는다.

다양한 구체예에 따르면, 세포를 배양하는 방법이 제공된다. 본 방법은 일군의 진핵 세포를 선별하고 그 진핵 세포를 적어도 하나의 3차원 바디와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있고, 상기 적어도 하나의 3차원 바디는 3차원 바디의 외면으로부터 3차원 바디의 내부를 향하여 내방향으로 연장하는 다중 2차원 표면을 포함할 수 있고, 상기 다중 2차원 표면은 상기 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하도록 구성되며, 상기 3차원 바디는 약 1 mm 내지 약 50 mm 범위의 최대 치수를 갖는다.

특정 구체예에 따르면, 세포-배양 장치가 제공된다. 본 장치는 3차원 바디의 외면으로부터 3차원 바디의 내부를 향하여 내방향으로 연장하는 다중 2차원 표면을 포함하는 3차원 바디를 포함할 수 있고, 상기 다중 2차원 표면은 상기 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하도록 구성되며, 상기 3차원 바디는 약 3 ㎠/㎤ 내지 약 1,000 ㎠/㎤의 표면적 대 부피 비율을 갖는다.

다양한 구체예에 따르면, 세포-배양 장치가 제공된다. 본 장치는 실질적으로 나선 형상으로 형성되는 재료의 시트를 포함하는 3차원 바디를 포함할 수 있다. 이 재료의 시트는 적어도 2개의 2차원 표면을 포함할 수 있는데, 상기 2차원 표면은 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하도록 구성될 수 있으며, 상기 3차원 바디는 약 3 ㎠/㎤ 내지 약 1,000 ㎠/㎤의 표면적 대 부피 비율을 갖는다.

도 1a는 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치의 투시도이다.
도 1b는 도 1a의 장치의 횡단면도이다.
도 2a는 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치의 투시도이다.
도 2b는 도 2a의 장치의 측면 투시도이다.
도 2c는 도 2a의 장치의 상면도이다.
도 2d는 도 2a의 장치의 횡단면도이다.
도 3a는 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치의 투시도이다.
도 3b는 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치의 투시도이다.
도 4a는 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치의 투시도이다.
도 4b는 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치의 투시도이다.
도 5는 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치의 투시도이다.
도 6은 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치의 투시도이다.
도 7은 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치의 투시도이다.
도 8a는 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치의 투시도이다.
도 8b는 도 8a의 장치의 횡단면도이다.
도 9는 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 시스템의 투시도이다.
도 10은 실시예 1에 기술된 바와 같이, 플라스크에서 또는 본 발명의 2차원 배양 장치를 사용하여 세포를 배양한 결과를 나타낸 막대 그래프이다.
도 11은 실시예 1에 기술된 바와 같이, 플라스크에서 또는 본 발명의 2차원 배양 장치를 사용하여 배양된 세포의 집단 복제수 (population duplication number)를 나타내 막대 그래프이다.
도 12는 실시예 1에 기술된 바와 같이 상이한 배지 혼합 속도(RPM)에서, 2차원 배양장치를 사용하여 성장한 세포의 세포 부착 효율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 13은 실시예 1에 기술된 바와 같이, 2차원 배양 장치를 사용하여 성장한 세포의 세포 부착 효율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 14는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 다양하게 코팅된 2차원 배양 장치를 사용하여 성장한 세포의 세포 부착 효율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 15는 실시예 1에 기술된 바와 같이, 배양 배지 사전-인큐베이션된 2차원 배양 장치를 사용하여 성장한 세포의 세포 부착 효율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 16은 실시예 1에 기술된 바와 같이, 장치의 플라즈마 표면 처리 존재 또는 부재 하에서 다양하게 코팅된 2차원 배양 장치를 사용하여 성장한 세포의 세포 부착 효율을 나타내는 막대 그래프이다.
도 17은 실시예 3에 기술된 바와 같이, 175 ㎠ 플라스크와 2D 캐리어 간의 PDD (1일당 집단 배가) 비교를 나타내는 막대 그래프이다.

이하 본 출원에 따른 특정의 예시적 구체예에 대해 상세히 언급되며, 이들 중 특정의 실시예는 첨부한 도면에 예시된다. 가능한 한, 동일한 참조 번호가 동일하거나 유사한 부분을 지칭하는 것으로 도면 전체에 사용될 것이다.

본 출원에서, 단수의 사용은 특별하게 달리 언급되지 않는 한 복수를 포함한다. 또한 본 출원에서, "또는"의 사용은 달리 언급되지 않는 한 "및/또는"을 의미한다. 나아가, 용어 "포함하는(including)"과, 예컨대 "포함하다 (includes)" 및 "포함된(included)"과 같은 다른 형태의 사용이 제한되지 않는다. 본 발명에 기술된 임의의 범위는 종료점과 종료점 사이의 모든 값을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

본 발명의 장치는 진핵 세포의 2차원 성장을 허용한다. "2차원 성장"은 세포 성장의 대부분이 단층으로 이루어지는 표면을 따라서 진핵 세포의 성장을 포함하는 것으로 이해될 것이다. "단층으로 세포 성장의 대부분"은 단층으로 세포의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%의 세포 성장을 포함하는 것으로 이해될 것이다. "2차원 성장"은, 하기에 더 상세히 기술되는 바와 같이, 평면 (즉, 평편한 표면)을 따른 성장 및/또는 약간의 곡률(curvature)을 갖는 표면을 따른 성장을 포함할 수 있다. 따라서, "2차원 표면"은 평면 및/또는 약간의 곡률을 갖는 표면인 표면을 포함하는 것으로 이해될 것이다. 또한, 본 발명에 사용된 바와 같이, 문구 "3차원 성장"은 3차원으로 세포-대-세포 접촉(cell-to-cell contact)을 허용하는 스캐폴드 상에서의 세포 성장과 양립하는 조건 하에서의 성장을 지칭한다.

2차원 성장을 허용함에 있어서, 본 발명의 장치는 높은 표면적 대 부피 비율을 제공하고, 그로 인해 플라스크에서의 2차원 성장에 비해, 적은 부피에서 다량의 세포 성장을 허용한다. 나아가, 본 발명의 장치는 성장 후 세포의 제거 및/또는 저장, 상업적 사용 (예컨대, 치료제로서)을 위해 또는 추가적인 세포의 성장을 위해 다른 환경으로의 세포 이동을 촉진하도록 구성될 수 있다. 더욱이, 본 발명에 기술된 장치는 세포 생존능, 부착능, 및/또는 다른 세포 특성의 유지 또는 제어라는 측면에서 적어도 표준 세포 배양 시스템을 사용하여 달성된 것과 다름없이 고품질의 세포 성장을 허용하도록 구성될 수 있다.

본 발명의 장치는 다양한 다른 진핵 세포 유형을 배양하는데 사용될 수 있다. 본 장치는 줄기 세포, 정박 의존성 (anchorage dependent) 세포, 중간엽 세포, 및 부착성 세포의 성장에 적합하다. 본 발명에 사용된 바와 같이, 문구 "부착 세포"는 정박 의존적, 즉 시험관 내에서 성장하기 위해 표면에의 부착을 필요로 하는 세포를 지칭한다. 적합한 부착 세포에는 중간엽 간질 세포가 포함될 수 있는데, 이 세포는 예컨대 골수, 지방 조직, 태반, 및 혈액으로부터 입수된 세포의 이질적 집단이고, 다양한 생체활성 인자(bioactive factor)로부터의 영향에 의존적으로 상이한 유형의 세포 (예컨대, 망상 내피 세포, 섬유아세포, 지방세포, 골형성 전구 세포)로 분화되거나 되지 않을 수 있다.

다양한 유형의 부착세포의 효율적인 성장은 성장 동안 세포에 의해 경험되는 환경 또는 상호작용에 매우 의존적일 수 있다. 예를 들어, 부착세포는 다른 부착 세포와 우연히 접촉하게 될 수 있다. 만약 세포의 일 단층이 세포의 다른 단층과 우연히 접촉한다면, 두 단층은 서로에게 부착할 수 있다. 상이한 장치의 단층들 사이의 이러한 상호작용은 장치들이 서로에게 부착하는 결과를 초래할 수 있다. 상호작용은 세포에 의해 분비된 세포외 기질에 의해 매개될 수 있다. 본 발명에 기술된 장치는 이러한 바람직하지 않은 세포-대-세포 상호작용을 제한할 수 있기 때문에, 일반적으로 응괴(clumping) 또는 응집이 제한될 수 있다. 또한, 본 발명의 장치는 부착 세포의 단층 성장과 세포의 효율적인 수확에 안정적인 환경을 제공하도록 배양 내내 영양분, 배지, 및 가스의 효율적인 전달을 제공할 수 있다. 상기 장치는 또한 2차원 조건에 비해 3차원 조건 하에서 성장하는 세포의 소집단을 제한함으로써 세포의 더 일관된 성장을 촉진할 수 있다.

일 관점에서, 본 발명에 기술된 장치는 세포 성장을 위해 구성된 표면들 사이의 접촉을 제한하도록 형상화될 수 있다. 따라서, 상기 장치는 인접한 장치들 사이의 접촉을 최소화하기 위하여 대체로 원형이거나, 곡선 모양이거나, 또는 아치 (arcuate) 모양일 수 있다. 각각의 장치는 상대적으로 작은 면적에 걸쳐서 인접한 장치들과 접촉하도록 고안될 수 있다. 이렇게 제한된 장치간 접촉은 성장하는 세포를 다른 장치에서 성장한 다른 세포와의 상대적으로 적은 상호작용에 적용시키는 성장 표면을 제공할 수 있다. 따라서 단일 인큐베이션 용기 내 다중 장치는 부착 세포에 더욱 효율적이고, 제어된, 안정한 성장환경을 제공할 수 있다.

일부 구체예에서, 본 발명에 기술된 장치는 대체로 횡단면 상 원형일 수 있다. 예를 들어, 본 장치의 외형은 구형, 원통형, 및 다른 대체로 둥근 부피일 수 있다. 이러한 장치는 장치의 전체 외부 표면적 대비 약 10% 미만의 접촉 면적을 제공할 수 있다. 다른 구체예에서, 접촉 면적은 전체 표면적의 약 5%, 2%, 또는 1% 미만일 수 있다. 만약 인접한 장치들 사이의 접촉이 충분히 최소화될 수 있다면, 다른 모양이 또한 사용될 수 있다.

본 발명에 기술된 세포 성장 방법은 또한 본 발명에 기술된 장치와 함께 사용하도록 구성될 수 있다. 일반적으로 세포 부착에 내성을 갖도록 구성된 용기가 이들 장치와 함께 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포부착을 제한하는 것으로 알려진 유리 또는 플라스틱으로 만들어지거나 이들로 코팅된 용기가 사용될 수 있다. 이러한 용기는 본 발명에 기술된 장치상에서 부착세포 단층의 적절한 성장을 조장할 수 있다. 이러한 용기는 또한, 상기에 기술된 바와 같이 우연한 세포-대-세포 부착을 초래할 수 있는, 바람직하지 않은 세포 상호작용을 제한할 수 있다.

다양한 구체예에 따르면, 세포-배양용 장치가 제공된다. 상기 장치는 3차원 바디의 외면으로부터 3차원 바디의 내부를 향하여 내방향으로 연장하는 다중 2차원 표면을 포함하는 3차원 바디를 포함할 수 있고, 상기 다중 2차원 표면은 상기 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하도록 형상화된다. 일부 구체예에서, 상기 다중 2차원 표면은 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하거나 지지하지 않을 수 있다. "다중" 2차원 표면은 "하나 이상의" 2차원 표면을 의미하고, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 또는 적어도 10개의 2차원 표면을 포함한다. 예를 들면, 50개, 100개, 500개, 또는 그 이상의 표면과 같이, 10개 이상의 2차원 표면이 또한 고려된다. 표면적의 대부분은 표면적의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 적어도 99%를 포함하는 것으로 이해된다. 다양한 구체예에서, 상기 장치는 약 50 mm 미만인 최대 치수 및/또는 약 3 ㎠/㎤ 및 약 1,000 ㎠/㎤ 사이의 표면적 대 부피 비율을 갖는다. "최대 치수(maximum dimension)"는 3차원 바디의 최대 외부 높이, 너비, 길이, 공간 대각선 (space diagonal), 정점 사이 거리(vertex distance), 가로직경 (transverse diameter), 직경, 횡단면 거리(cross-sectional span), 또는 임의의 다른 최대 외부 공간 치수를 포함하는 것으로 이해된다.

본 발명의 세포-배양 장치는 다수의 상이한 모양 및 구조를 가질 수 있고, 임의의 다수의 적합한 재료로부터 형성될 수 있으며, 세포 성장을 촉진하기 위해 다양한 처리 및/또는 코팅을 포함할 수 있다. 도 1a 내지 8b는 하기에 상세히 기술된 바와 같이, 다양한 구체예에 따른 세포-배양 장치를 나타낸다. 또한, 도 9는 용기 및 일군의 세포-배양 장치를 포함하는 예시적인 세포-배양 시스템을 나타낸다. 도면에 도시되고 하기에 기술된 장치 및 시스템은 예시적이며, 본 발명에 기술된 다른 구체예로부터 다양한 특징들은 조합되거나 서로 교환될 수 있는 것으로 이해될 것이다.

도 1a는 특정 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치 (10)의 투시도이고; 도 1b는 도 1a의 장치 (10)의 횡단면도이다. 도시된 바와 같이, 장치 (10)는 장치 (10)의 외부로부터 장치(10)의 내부를 향하여 연장하는 다중 2차원 표면 (12)을 포함한다. 도시된 바와 같이, 표면은 개구부 (16)를 형성하기 위해 일정한 간격으로 배치된 일군의 리브(ribs)(14)에 의해 형성되고, 이는 사용 동안 세포 및 배양 배지의 흐름을 허용하는 크기로 만들어질 수 있다. 장치 (10)는 또한 장치 (10)의 중심축으로부터 연장하고 대체로 리브(14)에 수직으로 연장하는 하나 이상의 측면 날개(lateral planes)를 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 장치 (10)의 외부 직경은 약 1 mm 내지 약 50 mm 범위일 수 있다. 다른 구체예에서, 외부 직경은 약 2 mm 내지 약 20 mm, 및 약 4 mm 내지 약 10 mm 범위일 수 있다. 장치 (10)의 전체 크기에 따라서, 격벽 (14) 및 개구부 (16)는 다양한 크기를 가질 수 있다. 예를 들어, 격벽 (14)은 두께가 약 0.1 mm 내지 약 2 mm, 및 약 0.2 mm 내지 약 1 mm 범위일 수 있다. 구체적으로, 격벽 (14)은 두께가 약 0.5 mm, 약 0.6 mm, 또는 약 0.7 mm일 수 있다. 개구부 (16)는 너비가 약 0.01 mm 내지 약 1 mm, 및 약 0.1 mm 내지 약 0.5 mm 범위일 수 있다. 구체적으로, 개구부 (16)는 두께가 약 0.3 mm, 약 0.4 mm, 또는 약 0.5 mm일 수 있다.

도 1a 및 1b에 도시된 구체예에서, 격벽 (14)은 실질적으로 편평하고 장치의 중심으로부터 장치의 외면으로 서로에게 평행하게 연장한다. 그러나, 격벽은 다양한 형상을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 2a 내지 2d는 상이한 형상으로 격벽 (24)에 의해 형성된 다중 2차원 표면 (22)을 갖는 장치 (20)를 나타낸다. 도 2a는 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치 (20)의 투시도이고; 도 2b는 도 2a의 장치의 측면 투시도이고; 도 2c는 도 2a의 장치의 상면도이고; 도 2d는 도 2a의 장치의 횡단면도이다. 도 2a 내지 2d의 장치 (20)는 도 1a 및 1b의 장치 (10)와 유사하지만, 장치 (20)의 격벽 (24)은 장치 (20)의 둘레 주변에 일정 간격으로 배치되는 개구부 (26)를 형성하도록 만들어진다. 개구부 (26)는 일반적으로 쐐기 (wedge) 모양일 수 있다. 리브 (24)은 대체로 장치 (20)의 중심축으로부터 장치 (20)의 주변 표면으로 방사상으로 연장할 수 있다. 장치 (20)는 또한 장치 (20)의 중심축으로부터 연장하고 일반적으로 리브 (24)에 수직으로 연장하는 하나 이상의 측면 날개를 포함할 수 있다. 또한, 장치 (20)는 장치의 중심을 통해 연장하고 부가적인 표면(32)을 형성하는 개구부 (36)를 포함하는데, 이는 진핵 세포의 단층 성장을 지지할 수 있다.

장치(10)에 대해 상기에 기술된 바와 같이, 장치(20)의 치수는 다양한 크기일 수 있다. 예를 들어, 장치 (20)의 외부 직경은 약 1 mm 내지 약 50 mm의 범위일 수 있다. 다른 구체예에서, 외부 직경은 약 2 mm 내지 약 20 mm, 및 약 4 mm 내지 약 10 mm 범위일 수 있다. 장치 (20)의 전체 크기에 따라서, 리브 (24) 및 개구부 (26)는 다양한 크기일 수 있다. 예를 들어, 리브 (24)은 두께가 약 0.1 mm 내지 약 2 mm, 및 약 0.2 mm 내지 약 1 mm 범위일 수 있다. 구체적으로, 리브 (24)은 두께가 약 0.5 mm, 약 0.6 mm, 또는 약 0.7 mm일 수 있다. 도 2a 내지 2c에 나타난 바와 같이, 개구부 (26)는 너비가 장치 (20) 또는 개구부 (36)를 통해 연장하는 중심축 부근에 대체로 위치하는 최소 너비로부터, 장치 (20)의 외면 부근에 대체로 위치하는 최대 너비의 범위일 수 있다. 개구부 (26)의 최소 너비는 약 0.01 mm 내지 약 1 mm, 및 약 0.1 mm 내지 약 0.5 mm 범위일 수 있다. 구체적으로, 개구부 (26)의 최소 너비는 약 0.3 mm, 약 0.4 mm, 또는 약 0.5 mm일 수 있다. 또한, 개구부 (36)는 직경이 약 0.1 mm 내지 약 5 mm, 및 약 0.5 mm 내지 약 2 mm 범위일 수 있다. 더욱 구체적으로, 개구부 (36)는 약 0.8 mm, 약 1 mm, 또는 약 1.2 mm의 직경을 가질 수 있다.

도시된 바와 같이, 장치 (10, 20)는 실질적으로 구형이고 장치의 최대 치수를 형성하는 직경 (18)을 갖는다. 본 발명에 기술된 장치는, 그 장치가 다중 2차원 표면(12, 22)의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 부착 및 단층 성장을 위한 2차원 표면을 제공하는 한, 다양한 다른 모양 및 구조를 가질 수 있다.

본 발명의 세포-배양 장치는 다양한 모양 및 구조를 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 1a 내지 2d와 관련하여 상기에 기술된 장치가 실질적으로 구형이라고 하더라도, 다른 적합한 모양이 사용될 수 있다. 예를 들어, 도 3a 및 3b는 2차원 세포 배양을 위한 장치 (10', 20')의 투시도이다. 장치 (10', 20')가 실질적으로 달걀(ovoid) 모양을 갖는다는 점을 제외하고, 장치 (10', 20')는 도 1a 내지 2d의 장치 (10, 20)와 유사하지만, 마찬가지로 리브 (14', 24') 또는 개구부 (36')에 의해 형성된 다중 2차원 표면 (12',22')을 제공한다. 또한, 다른 다면체(polyhedral) 및/또는 불규칙한 다면체 모양을 비롯한, 다른 적합한 모양이 사용될 수 있다.

상기에 논의된 바와 같이, 본 발명의 장치는 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하도록 구성된 다중 2차원 표면을 포함할 수 있다. 특정의 구체예에서, 다중 2차원 표면은 실질적으로 이들 표면적의 전체에 걸쳐서 단층성장을 지지하도록 구성된다. 예를 들어, 도 4a 및 4B는 특정의 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치의 투시도이고, 이는 실질적으로 이들 표면적의 전체에 걸쳐서 단층성장을 지지하도록 구성된다. 도 4a 및 4b의 장치 (10", 20")는 상기에 기술된 다른 장치들과 유사하고 격벽 (14',24')에 의해 형성된 표면 (12', 22')을 포함한다. 그러나, 장치 (10", 20")는 그들의 전체 면적을 따라서 완만한 곡선을 형성하는 표면 (12', 22')이 구비된 개구부 (16', 26')를 가지며, 그로 인해 3차원 성장이 일어날 수 있는 뾰족한 곡률 면적을 제거하거나 감소시킨다. 예를 들어, 도시된 바와 같이, 장치 (10", 20")는 도 1a 내지 2d의 장치와 관련하여 설명된 바와 같은, 더 뾰족한 곡선과는 대조적으로, 완만하게 굽은 하부 표면 (40, 42)을 갖는다.

다양한 구체예에서, 다중 2차원 표면의 특정 곡률 및 구조는, 예컨대 더 높은 표면적을 제공하고/하거나 세포 성장을 제어하도록 변형될 수 있다. 예를 들어, 도 5는 특정 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치(50)의 투시도이다. 장치 (50)는 개구부 (56) 및 단층 성장을 위한 다중 2차원 표면(52)을 형성하도록 장치 (50)의 외면으로부터 장치의 내부를 향하여 연장하는 격벽 (54)을 포함한다. 도시된 바와 같이, 격벽 (54) 및 표면 (52)은 굽은 모양이다. 표면 (52)의 굽은 모양은 편평한 표면에 비해, 다중 2차원 표면 (52)의 표면적을 더욱 증가시킬 수 있고, 그로 인해 세포 부착 및 단층 성장을 위한 추가적인 면적을 제공한다.

도 6은 특정 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 장치 (60)의 투시도이다. 도시된 바와 같이, 장치 (60)는 장치(60)의 내부로부터 장치(60)의 외면을 향하여 연장하는 격벽 (64)을 포함한다. 격벽 (64)은 진핵 세포의 2차원 성장을 위한 적어도 2개의 2차원 표면 (62, 62')을 형성하도록 장치(60)의 직경을 따라서 적어도 부분적으로 연장하는 나선형 형상을 포함할 수 있다. 도시된 바와 같이, 격벽은 코어 부분 (68)으로부터 장치(60)의 외면 쪽으로 연장한다.

상기에 기술된 각각의 구체예에서, 다중 2차원 표면은 내부 코어로부터 연장한다. 그러나, 다른 구체예에 따르면, 표면은 중심 코어 쪽으로 지시되는 내부에 내방향으로 연장할 수 있다. 예를 들어, 도 7은 일부 구체예에 따른 또 다른 장치 (70)를 나타낸다. 장치 (70)는 개구부 (76)가 구비된 실질적으로 나선 모양의 벽 (74)의 형태로, 진핵 세포의 2차원 성장을 허용하도록 구성된 적어도 제1 표면 (72)과 제2 표면 (72')을 갖는, 재료의 적어도 하나의 시트를 포함한다. 그러나, 다른 모양이 사용될 수 있고, 장치 (70)가 연속적인 나선형일 필요는 없으며, 다른 형상을 포함할 수 있는 것으로 이해될 것이다.

또한, 도 8a 및 8b에 도시된 바와 같이, 장치 (90)가 하나 이상의 분리 가능한(detachable) 구성요소를 포함할 수 있는 것으로 고려된다. 예를 들어, 장치 (90)는 하나 이상의 분리 가능한 디스크(92)를 포함할 수 있다. 각각의 디스크 (92)는 장치(90)의 또 다른 구조적 요소에 연결되도록 형상화된 하나 이상의 연결기(connector)(94)을 포함할 수 있다. 따라서, 복수 개의 디스크 (92)는 어셈블리 (96)를 형성하기 위해 함께 연결될 수 있다. 어셈블리 (96)는, 상기 도 1 내지 7에 도시된 구체예를 포함하는, 임의의 개수의 디스크 (92) 또는 다양한 모양 또는 크기의 커넥터(connector)를 포함할 수 있다.

디스크 (92)는 임의의 모양일 수 있고, 커넥터 (94)에 연결되도록 형상화된, 암 연결 (female coupling)(도시하지 않음)을 포함할 수 있다. 디스크 (92)와 커넥터(94) 사이의 연결은 영구적이거나 분리 가능할 수 있다. 다른 구체예에서, 복수 개의 디스크 (92)는 복수 개의 디스크 (92)를 수용하고 복수 개의 디스크 (92) 사이에 적당한 거리를 유지하도록 구성된 단일 연결기 (94)에 연결될 수 있다.

상기에 기술된 다양한 세포-배양 장치는 다양한 모양으로 형성될 수 있다. 다수의 구체예가 장치가 둥근 것으로 묘사한 반면, 장치는 또한 정육면체, 사각형, 또는 선형 및 아치형의 조합일 수 있다. 또한, 부가적인 안정화, 연결성, 또는 다른 구조적 특징부가 이들 장치와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 가늘고 긴 부재 (threadlike member)가 다중 장치와 함께 연결될 수 있고, 점착 부재 (adhesive member)가 인큐베이션 용기의 벽에 장치를 연결할 수 있으며, 또는 부유 부재(flotation member)가 우연히 다른 표면과 접촉하게 되는 세포를 제한하기 위해 장치가 유체 내에서 부양성을 유지하게 할 수 있다. 이러한 부재는 수동 또는 자동화 기술을 이용하여 취급성(handling)을 강화할 수 있다. 예를 들어, 수집 및 가공 단계를 보조하기 위해 자성 재료가 장치 내로 도입될 수 있다. 장치는 또한 인큐베이션 유체에 대해 지속적으로 노출되거나 상기 유체에 대해 간헐적으로 노출되도록 구성될 수 있다.

본 발명에 기술된 세포-배양 장치는 다양한 다른 적합한 재료를 사용하여 생산될 수 있다. 일반적으로, 장치는 약학적 목적을 위한 세포 배양을 허용하도록 선택된 광범위한 특성을 갖는 재료를 사용하여 생산될 수 있다. 다양한 구체예에서, 재료는 공인된 USP 클래스 6 (US Pharmacopeial Convention Class VI)일 수 있고, 고온을 견딜 수 있으며, 고압살균 가능하고 (autoclavable), 세포부착을 개선하기 위해 플라즈마 또는 코로나 처리에 순응하며, 광범위한 pH를 견딜 수 있고, 세포 성장 과정 동안에 유해한 재료가 침출되지 않으며/않거나, 분해되거나 생성물 내에 바람직하지 않은 잔사를 남기지 않으면서 세포를 제거하기 위한 효소적 및 물리적 스트레스에 노출될 수 있다. 또한, 본 발명에 기술된 임의의 장치를 생산하는데 사용되는 재료는 고체일 수 있거나 중공 또는 다공성 내부를 가질 수 있다. 나아가, 본 발명에 기술된 장치는 재료의 단일 단편으로부터, 또는 (예컨대, 화학적 또는 물리적 결합에 의해) 하나가 다른 하나에 부착된 2개 이상의 단편들로부터 생산될 수 있다. 재료는 적용에 의해 요구하는 바에 따라 단단하거나 유연할 수 있다.

본 발명에 기술된 임의의 세포-배양 장치를 생산하는데 사용되는 재료에는 금속 (예컨대, 티타늄), 산화금속 (예컨대, 산화티타늄 필름), 유리, 붕규산염, 탄소 섬유, 세라믹, 생분해성 재료 (예컨대, 콜라겐, 젤라틴, PEG, 하이드로겔), 및 고분자가 포함될 수 있다. 적합한 고분자에는 GRILAMID® TR 55 (EMS-Grivory)와 같은 폴리아미드; LEXAN® (Sabic) 및 Macrolon® (Bayer)과 같은 폴리카보네이트; RADEL® PPSU (Solvay) 및 UDEL® PSU (Solvay)와 같은 폴리설폰; TRITAN® (Polyone) 및 PBT® HX312C와 같은 폴리에스테르; CELON® (Ticana)과 같은 폴리아세탈, 및 폴리염화비닐이 포함될 수 있다.

일부 구체예에서, 장본 치의 적어도 일부는 폴리스티렌 고분자를 사용하여 형성될 수 있다. 폴리스티렌은 코로나 방전, 가스-플라즈마 [롤러 병 및 배양 튜브), 또는 다른 유사한 공정을 사용하여 추가로 변형될 수 있다. 이들 공정은 표면이 친수성이 되고 배지가 첨가될 때 음으로 하전되도록, 표면 폴리스티렌 사슬 위를 그라프트하는 고 에너지 산소 이온을 생성할 수 있다 (Hud s, 1.974; Amstein and Hartman, 1.975; Ramsey el. al, 1984). 또한, 임의의 장치는 적어도 부분적으로 재료들의 조합으로부터 생산될 수 있다. 장치의 재료는 세포 부착을 지지하도록 추가로 코팅되거나 처리될 수 있다. 이러한 코팅 및/또는 전처리는 콜라겐 I, 콜라겐 IV, 젤라틴, 폴리-d-라이신, 피브로넥틴, 라미닌, 아민, 및 카르복실의 사용을 포함할 수 있다.

일부 구체예에서, 장치를 생산하는데 사용되는 재료는 진핵 세포의 직접적인 부착을 허용하도록 선택된다. 본 발명에 기술된 장치는 여러 가지 적합한 생산 공정을 이용하여 생산될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 장치는, 예를 들어, 하나 이상의 고분자 재료를 사용한 사출 성형에 의해 생산될 수 있다.

또한, 재료 특성 및 2차원 표면의 대부분 또는 전체 표면적에 걸친 곡률이 특정 생물학적 특성을 제어하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 재료는 바람직한 생물학적 특성을 생산하도록 특정한 탄성계수 및 곡률을 갖도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 적합한 탄성 계수는 약 0.1 내지 100 kPa 사이일 수 있다.

다양한 구체예에서, 본 장치는 (예컨대, 여과, 긁어 모으기 (scooping), 배지 제거에 의해) 수집을 촉진하고, 장치간 공극 공간을 최소화하도록 선택된 크기를 갖는다. 예를 들어, 3차원 바디는 약 1 mm 내지 50 mm, 약 1 mm 내지 20 mm, 또는 약 2 mm 내지 10 mm의 최대 치수를 가질 수 있다. 특정 구체예에서, 장치는 구형이고 약 l mm 내지 50 mm, 약 1 mm 내지 20 mm, 또는 약 2 mm 내지 10 mm인 최대 직경을 갖는다.

특정의 구체예에서, 본 장치는 배양 동안 2차원 표면에 대한 손상 또는 2차원 표면으로부터 세포의 제거를 방지하도록 형상화된다. 예를 들어, 도 1a 내지 8b에 도시된 바와 같이, 장치는 개구부 (16, 26, 16', 26', 및 76), 및 상기 개구부 내에 위치하는 2차원 표면을 포함할 수 있다. 다양한 구체예에서, 다중 2차원 표면은 3차원 바디에 인접한 물체가 다중 2차원 표면상에서 성장하는 세포와 접촉하는 것을 방지하도록 선택된 거리만큼 서로 떨어져 있다. 구체적으로, 개구부 (16, 26, 16', 26', 또는 76)는 2차원 표면이 배양 시스템 내부의 인접한 장치에 접촉되지 않고/않거나 용기 또는 배양 용기의 벽에 접촉되지 않도록 크기를 가질 수 있다. 따라서, 2차원 표면을 따른 세포의 단층 성장은 기계적 접촉에 의해 방해되지 않을 것이다. 또한, 2차원 표면은 인접한 표면상에서 세포들 사이의 접촉을 방지하도록 서로에게 충분히 멀리 간격을 두고 있을 수 있다.

다양한 구체예에서, 본 발명의 세포-배양 장치는 바람직한 표면적 대 부피 비율을 제공하도록 구성될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 기술된 임의의 세포-배양 장치의 표면적 대 부피 비율은 약 3 ㎠/㎤ 내지 30 ㎠/㎤, 약 5 ㎠/㎤ 내지 20 ㎠/㎤, 또는 약 10 ㎠/㎤ 내지 15 ㎠/㎤일 수 있다. 다른 구체예에서, 표면적 대 부피 비율은 최대 약 50, 100, 200, 500, 또는 1,000 ㎠/㎤에 이를 수 있다

다양한 구체예에서, 본 발명에 기술된 장치는 추가로 하나 이상의 코팅으로 코팅될 수 있다. 적합한 코팅은 세포 부착 또는 세포 생물학에 대한 변화를 제어하도록 선택될 수 있다. 적합한 코팅에는, 예를 들어, 펩티드, 단백질, 탄수화물, 핵산, 지질, 다당류, 점질다당류(glycosaminoglycans), 프로테오글리칸, 호르몬, 세포외 기질 분자, 세포 부착 분자, 천연 고분자, 효소, 항체, 항원, 폴리뉴클레오티드, 성장인자, 합성 고분자, 폴리라이신, 약물 및/또는 다른 분자 또는 이들의 조합 또는 단편이 포함될 수 있다.

또한, 다양한 구체예에서, 본 발명에 기술된 장치의 표면은 처리되거나 다르게는 변경될 수 있다. 세포 부착 및/또는 다른 생물학적 특성을 제어하기 위함이다. 화학적 처리, 플라즈마 처리, 및/또는 코로나 처리를 비롯한 표면을 처리하는 방안들이 있다. 또한, 다양한 구체예에서, 재료는 탄화수소, 산소, 질소를 함유하는 기를 포함하는, 관능기를 재료 내로 또는 재료상에 도입하도록 처리될 수 있다. 또한, 다양한 구체예에서, 재료는 세포부착을 촉진하거나 다른 세포 특성을 제어하기 위해 질감을 갖도록 생산되거나 변경될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, 세포-배양 장치를 생산하는데 사용되는 재료는 세포 부착을 촉진하고/하거나 다른 세포 특성을 제어하는 나노미터 또는 마이크로미터 규모로 조도(roughness)를 갖는다.

다양한 구체예에 따르면, 세포 배양용 시스템이 제공된다. 상기 시스템은 용기 및 일군의 3차원 바디를 포함할 수 있다. 상기 3차원 바디는 3차원 바디의 외면으로부터 각 3차원 바디의 내부를 향하여 내방향으로 연장하는 다중 2차원 표면을 포함할 수 있고, 다중 2차원 표면은 상기 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하도록 형상화된다.

도 9는 특정 구체예에 따른, 2차원 세포 배양용 시스템 (100)의 투시도이다. 도시된 바와 같이, 시스템 (100)은 용기(110), 및 상기 용기 (100)의 표면상에서 세포의 2차원 성장을 허용하도록 배지 (120) 및/또는 다른 재료와 함께 용기 (100) 내에 배치될 수 있는 하나 이상의 세포-배양 장치 (110)를 포함한다.

도시된 바와 같이, 용기 (100)는 세포 도입을 위한 개구부 (130), 세포-배양 장치 (110), 배지 및/또는 다른 재료를 구비한 통상적인 세포 배양 플라스크를 포함한다. 그러나, 다른 용기가 선택될 수 있음을 인식할 것이다. 예를 들어, 용기는 더 커질 수 있고, 예컨대 수십 개, 수백 개, 수천 개, 수십만 개, 또는 수백만 개의 세포-배양 장치를 보유하도록 선택될 수 있다. 배양되는 세포의 양 및/또는, 온도, pH, 주변 가스 수준 등과 같은 배양 조건을 제어하기 위한 통합 시스템의 요구와 같은, 다른 기준에 근거하여 특정 크기 및 형상이 선택될 수 있다.

다양한 구체예에서, 시스템은 충진층 반응기, 유동화 반응기, 또는 현탁 반응기와 같은 생물반응기 용기를 포함할 수 있다. 예를 들어, 시스템은 2차원 성장을 허용하도록 하나 이상의 장치를 포함할 수 있고, 이는 이어서 생물반응기의 용기 내에 배치될 수 있다. 이러한 생물반응기의 예시에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 플러그 플로우(plug flow)생물반응기, 연속교반 탱크 생물반응기, 정지상 (stationary-bed) 생물반응기 (충진층 생물반응기) 및 유동층 생물반응기가 포함된다.

적합한 생물반응기의 예는, 제어된 조건 (예컨대, pH, 온도 및 산소 수준) 하에서 일정한 세포 성장 배지 관류로 부착성 세포를 증식시킬 수 있는, Celligen 생물반응기 (New Brunswick Scientific)이다. 나아가, 세포 배양은 글루코스, 락토스, 글루타민, 글루탐산염, 및 암모늄의 농도 수준에 대해 모니터링될 수 있다. 부착성 세포의 글루코스 소비율 및 젖산염 형성율은 세포 성장율을 측정하고 수확 시기를 결정하게 할 수 있다.

사용될 수 있는 다른 3차원 생물반응기에는, 이들로 제한되는 것은 아니지만, 생물반응기 내 시간-상수 정상 상태를 유지하기 위해, 배양 배지가 생물반응기 내로 연속적으로 공급되고 사용된 배지가 연속적으로 배출되는, 연속 교반 탱크 생물반응기가 포함된다. 교반 탱크 생물반응기는 유동층 (현탁된 캐리어) 또는 섬유층 바스켓 (fibrous bed basket) (예를 들어, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ로부터 입수 가능함), 정지상 생물반응기, 전형적으로 공기가 기포를 형성하면서 위로 흐르는 (flowing up) 중앙 통풍관 (draught tube)의 저부에 공급되고, 칼럼의 상부에서 배기가스를 배출하는(disengaging) 에어-리프트 (air-lift) 생물반응기, 폴리액티브 폼 (Polyactive foams)이 구비된 생물반응기 [Wendt, D. et al, Biotechnol Bioeng 84: 205-214, (2003)에 기술된 바와 같음], 방사상-유동 관류(Radial-flow perfusion) 생물반응기에서 다공성 스캐폴드 [문헌 (Itagawa et al., Biotechnology and Bioengineering 93(5): 947-954 (2006))에 기술된 바와 같음], 스캐폴드 또는 캐리어를 구비한 방사상 유동 생물반응기, 중공 섬유 생물반응기, 및 마이크로 캐리어와 함께 사용될 수 있다. 본 발명에 기술된 장치 및 시스템과 함께 사용될 수 있는, 다른 생물반응기가 미국특허 제6,277,151호; 제6,197,575호; 제6,139,578호; 제6,132,463호; 제5,902,741호; 및 제5,629,186호에 기술되어 있다.

본 발명은 또한 본 발명에 논의된 임의의 장치 또는 시스템을 사용하여 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 다양한 구체예에 따르면, 상기 방법은 일군의 진핵 세포를 선택하고 상기 진핵 세포를 적어도 하나의 3차원 바디와 접촉시키는 것을 포함할 수 있고, 적어도 하나의 3차원 바디는 상기 3차원 바디의 외면으로부터 적어도 하나의 3차원 바디의 내부를 향하여 내방향으로 연장하는 다중 2차원 표면을 가지며, 다중 2차원 표면은 상기 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하도록 형상화된다. 다양한 구체예에서, 장치는 약 50 mm 미만의 최대 치수 및/또는 약 3 ㎠/㎤ 및 약 1,000 ㎠/㎤ 사이의 표면적 대 부피 비율을 갖는다.

또한, 세포의 부착 및 성장을 제어하거나 증강시키기 위해 다양한 가공 단계가 수행될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 세포 및 3차원 바디를 배양 배지와 함께 용기 또는 배양 용기 내에 위치시킴으로써 세포는 3차원 바디와 접촉될 수 있다. 더욱이, 세포 및/또는 배지는, 예컨대 용기를 회전시키고, 배양 배지를 휘젓고 (예컨대, 교반에 의해), 유체 흐름을 용기의 내부 및 외부로 공급함에 의해 혼합되거나 다르게는 이동하게 될 수 있다.

본 발명에 기술된 장치 및 시스템을 사용하여 배양하는데 유용한 기저 배지의 비-제한적인 예시에는 배지 199, CMRL 1415, CMRL 1969, CMRL 1066, NCTC 135, MB75261, MAB 8713, DM 145, Williams' G, Neuman & Tytell, Higuchi, MCDB 301, MCDB 202, MCDB 501, MCDB 401, MCDB 411, MDBC 153을 포함하는 수많은 다른 배지들 중에서, 이글 최소 필수 배지 (Minimum Essential Medium Eagle), ADC-1, LPM (소 혈청 알부민-무함유), FIO(HAM), F12 (HAM), DCCMl, DCCM2, RPMI 1640, BGJ 배지 (Fitton-Jackson 변형 존재 및 부재), 이글 기저 배지 (Basal Medium Eagle) (BME-이글의 기저 염의 첨가), 둘베코 변형 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (DMEM-혈청 무함유), Yamane, IMEM-20, 글래스고 변형 이글 배지 (Glasgow Modification Eagle Medium) (GMEM), Leibovitz L-15 배지, 맥코이 5A 배지 (McCoy's 5A Medium), 배지 Ml 99 (M199E-이글의 염 염기 함유), 배지 Ml 99 (M199H-행크의 염 염기 함유), 이글 최소 필수 배지 (MEM-E-이글의 염 염기 함유), 이글 최소 필수 배지 (MEM-H-행크의 염 염기 함유) 및 이글 최소 필수 배지 (MEM-NAA 비-필수 아미노산 함유)가 포함된다. 본 발명에 사용하기에 바람직한 배지는 DMEM이다. 이들 및 다른 유용한 배지가 다른 제조사들 중에서, GIBCO, Grand Island, N.Y., USA 및 Biological Industries, Bet HaEmek, Israel로부터 입수 가능하다. 수많은 이들 배지가 문헌[Methods in Enzymology, Volume LVIII, Cell Culture, pp. 62-72, edited by William B. Jakoby and Ira H. Pastan, published by Academic Press, Inc]에 요약되어 있다.

배지는, 예컨대 소 또는 인간 또는 다른 종의 태아 혈청, 및 선택적으로 또는 대안적으로, 성장인자, 비타민 (예컨대, 아스코르브산), 사이토카인, 염 (예컨대, B-글리세로인산), 스테로이드 (예컨대, 덱사메타손), 및 호르몬 (예컨대, 성장 호르몬, 에리쓰로포이에틴, 트롬보포이에틴, 인터류킨 3, 인터류킨 6, 인터류킨 7, 대식구 콜로니 자극 인자, c-kit 리간드/줄기세포 인자, 오스테로프로테그린 (osteoprotegerin) 리간드, 인슐린, 인슐린-유사 성장인자, 표피 성장인자, 섬유아세포 성장인자, 신경 성장인자, 섬모 향신경성 인자(cilary neurotrophic factor), 혈소판 유래 성장인자, 및 골 형성 단백질이 pg/ml 내지 mg/ml 수준 사이의 농도로 보충될 수 있다.

본 발명에 기술된 장치 및 시스템을 사용한 세포 성장 후, 세포는 다양한 다른 방식으로 수확될 수 있다. 예를 들어, 세포는 하기에 기술된 바와 같은, 적합한 배지를 이용한 세척에 의해 및/또는 진동 기반 수확에 의해 수확될 수 있다.

부가적인 구성요소가 배양 배지에 첨가될 수 있는 것으로 더욱 인식된다. 이러한 구성요소는 항생제, 항진균제, 알부민, 아미노산, 및 세포의 배양을 위해 당해 기술분야에 알려진 기타 구성요소일 수 있다.

실시예 1:

본 발명에 기술된 바와 같은, 다양한 캐리어를 사용한 세포 배양의 적합성을 평가하였다. 신선하거나 냉동된 PD051010 p.3/2 세포를 가습 인큐베이터에서 충분한 DMEM으로 배양하였다. 세포를 하기에 확인된 바와 같은, 다양한 고분자 재료로 생산된 사출-성형된 캐리어 또는 플라스크를 이용하여 성장시켰다. 재료, 모양 및 구조, 표면 처리, 및 표면 질감은 하기에 상세히 기술되고/되거나 도면에 도시된 바와 같이, 다양했다. 다른 캐리어를 사용한 세포의 성장률 및 부착 효율을 측정하였고, 그 결과를 하기에 요약하였다.

도 10은 175 ㎠ 플라스크에서 또는 본 발명의 2차원 배양 장치를 사용한 세포 배양의 결과를 나타내는 막대 그래프이다. 도 11은 175 ㎠ 플라스크에서 또는 본 발명의 2차원 배양장치를 사용하여 배양된 세포의 집단 복제수를 나타내는 막대 그래프이다. 도 10 및 11에 도시된 결과는 매끈한 표면 질감과 도 1a 및 1B에 도시된 바와 같은 형상을 갖는 사출-성형된 LEXAN®로 형성된 세포-배양 장치를 사용하여 신선한 PD051010 p.3/2 세포를 배양한 것에 근거한다. 도면에 도시된 바와 같이, 수득된 세포의 양 및 세포 복제수는 플라스크 대신에 세포-배양 장치를 사용한 경우와 유사하였다.

도 12는 2차원 배양 장치를 사용하여 성장한 세포의 세포부착 효율을 나타내는 막대 그래프이다. 도 12에 도시된 결과는 거친 표면 질감과 도 1a 및 1b에 도시된 바와 같은 형상을 갖는 사출-성형된 LEXAN®로 형성된 세포-배양 장치를 사용하여 냉동된 PD051010 p.3/2 세포를 배양한 것에 근거한다. 도 13은 2차원 배양장치를 사용하여 성장한 세포의 세포부착 효율을 나타내는 막대 그래프이다. 도 13에 나타낸 결과는 거친 표면 질감과 도 1a 및 1b에 도시된 바와 같은 형상을 갖는 사출-성형된 GRILAMID®로 형성된 세포-배양 장치를 사용하여 냉동된 PD051010 p.3/2 세포를 배양한 것에 근거한다.

도 14는 다양하게 코팅된 2차원 배양 장치를 사용하여 성장한 세포의 세포 부착 효율을 나타내는 막대 그래프이다. 도 14에 나타낸 결과는 매끈한 표면 질감과 도 2a 내지 2d에 나타난 바와 같은 형상을 갖는 사출-성형된 LEXAN® 또는 GRILAMID® (도면에 도시된 바와 같음)로 형성된 세포-배양 장치를 사용하여 냉동된 PD051010 p.3/2 세포를 배양한 것에 근거한다. 또한, 도시된 바와 같이, 도 14는 LEXAN® 또는 GRILAMID® 캐리어 상에 성장 배지 단백질 및/또는 폴리라이신을 사용한 표면 처리의 효과를 입증한다. 도시된 바와 같이, 폴리라이신 처리 및 성장 배지 단백질 처리는 대체로 세포 부착 효율을 증가시켰다.

도 15는 코팅된 2차원 배양장치를 사용하여 성장한 세포의 세포부착 효율을 나타내는 막대 그래프이다. 도 15에 도시된 결과는 거친 표면과 도 1a 및 1b에 도시된 바와 같은 형상을 갖는 사출-성형된 GRILAMID®로 형성된 세포-배양 장치를 사용하여 냉동된 PD051010 p.3/2 세포를 배양한 것에 근거한다.

도 16은 장치의 표면이 플라즈마 처리되거나 처리되지 않은 다양하게 코팅된 2차원 배양장치를 사용하여 성장한 세포의 세포 부착 효율을 나타내는 막대 그래프이다. 도 16에 나타낸 결과는 매끈한 표면 질감과 도 2a 내지 2d에 도시된 바와 같은 형상을 갖는 사출-성형된 LEXAN® 또는 GRILAMID® (도면에 도시된 바와 같음)로 형성된 세포-배양 장치를 사용하여 냉동된 PD051010 p.3/2 세포를 배양한 것에 근거한다. 또한, 나타난 바와 같이, 도 16은 LEXAN® 또는 GRILAMID® 캐리어 상에 성장 배지 단백질 및/또는 플라즈마 처리를 사용한 표면 처리의 효과를 입증한다. 도시된 바와 같이, 플라즈마 처리 및 성장 배지 단백질 처리는 전반적으로 세포 부착 효율을 증가시켰다.

실시예 2:

본 실험에서는, 2차원 배양 장치에서 성장한 세포를 2012년 4월 15일자로 출원된 국제출원 PCT/IB2012/000933호에 기술된 바와 같은 진동-기반 수확 방법을 이용하여 수확하였다. 둘베코 최소 필수 배지 ("DMEM")에 220개의 장치를 부유시키고 인간 태반-유래 부착성 간질 세포를 3,000 세포/㎠의 농도로 파종하여 2차원 배양 장치를 제조하였다. 세포가 장치에 부착하도록 장치를 약하게 혼합하면서 밤새 인큐베이션하였다. 밤새 인큐베이션 후 파종된 장치의 90 내지 100개를 150 ml의 완전 DMEM을 함유하는 250 ml 스피너 플라스크로 옮기고 37℃ 및 5% CO₂에서 3일간 인큐베이션하였다.

3일간 성장 후, 세포를 하기와 같이 진동에 의해 장치로부터 수확하였다. 스피너 플라스크 및 튜브를 인큐베이터로부터 제거하고 10개의 배양 장치를 세포 염색을 위해 제거하였다. 세포염색 및 세포계수에 의해 수확 효율을 측정하였다. 배양 배지를 버리고 남아있는 장치를 PBS로 2회 세척한 후 800 ml의 미리-가온된 TrypLE 용액으로 채워진 용기 내에 위치시켰다. 그 후에 즉시 장치를 5 Hz에서 5초간, 1 Hz에서 5분간, 및 5 Hz에서 30초간 (모두 25 mm의 진폭으로) 진동시켰다. 진동 이후에, 부가적인 10개의 장치를 세포 염색을 위해 제거하였다. 남아있는 장치에 200 ml의 FBS를 첨가하고 배지를 2,500 ml 원심분리 병으로 옮겼다. 세포를 10분간 4℃에서 1,200 RPM으로 원심분리하였고, 세포 펠렛을 재현탁한 후, 세포를 계수하였다.

진동에 의한 수확은 이들 장치로부터 세포를 회수하는데 효과적인 수단인 것으로 나타났고, 7.8×10⁶ 세포가 회수되었다. 세포들은 트립판 블루 염색 배제에 의해 95% 생존력을 갖는 것으로 나타났다.

실시예 3:

다른 실험에서는, 태반 (PD020112), 지방 (PLA25) 및 골수 (BM122) MSC를 충분한 DMEM 성장 배지 (DMEM As22320 Cat. No. 041-96417A GIBCO, 10% FBS Cat. No. S0115 BIOCHROM, 1% L-Glutamine Cat. No. G7513 SIGMA)에서, 175 ㎠ 플라스크에 0.5×10⁶ 세포/플라스크로 파종하였다. 세포를 4일간 37℃ 가습 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 각각의 세포 유형을 TrypLE (GIBCO Cat. No. 12563-029)를 사용하여 수확하였다. 그 후 각각의 세포 유형을, 2번씩, 충분한 DMEM에서 175 ㎠ 플라스크 및 2D 캐리어 상에 접종하였다. 이어서, 0.5×10⁶ 세포를 플라스크에 파종하고, 1×10⁶ 세포를 20 ml 바이알 내에서 90개의 2D 캐리어에 파종하였다. 플라스크를 37℃ 인큐베이터에서 인큐베이션하였다. 2D 캐리어 바이알을 부착을 위해 24시간 동안 회전시킨 후 바스켓이 구비된 250 ml 스피너 플라스크로 옮겼다. 스피너를 추가 3일간 37℃ 인큐베이터 내에서 40 RPM 교반 속도로 교반기 상에 위치시켰다. 4일의 전체 성장 기간 후, 세포를 TrypLE에 의해 플라스크 및 2D 캐리어로부터 수확하고 Casy 세포 계수기로 계수하였다.

도 17은 175 ㎠ 플라스크 및 2D 캐리어 사이의 PDD (일당 집단 배가)를 비교한 막대 차트를 나타낸다. 계산된 PDD는 2D 캐리어 및 플라스크 사이에 태반, 골수 및 지방 세포의 유사한 성장률을 나타낸다.

Claims (65)

1. 실질적으로 구형 또는 실질적으로 타원체 모양인 3차원 바디(three-dimensional body)를 포함하는 세포 배양 장치로서,
   상기 3차원 바디가 다수의 개구부를 포함하고, 상기 다수의 개구부는 3차원 바디의 외주면으로부터 3차원 바디의 내부를 향하여 내방향으로 연장하는 다중 2차원 표면 (multiple two-dimensional surfaces)을 포함하며, 상기 다중 2차원 표면이 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵세포의 단층 성장을 지지하도록 구성되고, 상기 다수의 개구부가, 이격된 복수개의 리브에 의해 형성되며, 상기 리브는 실질적으로 구형 또는 실질적으로 타원체 모양인 상기 3차원 바디의 중심부로부터 3차원 바디의 외주면으로 방사상으로 연장되어 있고, 상기 3차원 바디가:
   (a) 2 mm 내지 10 mm 범위의 최대 치수를 가지며, 그리고
   (b) 3 ㎠/㎤ 내지 1,000 ㎠/㎤의 표면적 대 부피 비율을 갖는 것인, 세포 배양 장치.
2. 용기, 및 일군의 실질적으로 구형 또는 실질적으로 타원체 모양인 3차원 바디를 포함하는 세포 배양 시스템으로서,
   각각의 3차원 바디가 다수의 개구부를 포함하고, 상기 다수의 개구부는 3차원 바디의 외주면으로부터 3차원 바디의 내부를 향하여 내방향으로 연장하는 다중 2차원 표면을 포함하고, 상기 다중 2차원 표면이 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵 세포의 단층 성장을 지지하도록 구성되며, 상기 다수의 개구부가, 이격된 복수개의 리브에 의해 형성되며, 상기 리브는 실질적으로 구형 또는 실질적으로 타원체 모양인 상기 각 3차원 바디의 중심부로부터 각 3차원 바디의 외주면으로 방사상으로 연장되어 있고, 상기 3차원 바디 각각이:
   (a) 2 mm 내지 10 mm 범위의 최대 치수를 가지며, 그리고
   (b) 3 ㎠/㎤ 내지 1,000 ㎠/㎤의 표면적 대 부피 비율을 갖는 것인, 세포 배양 시스템.
3. 제1항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면이
   (i) 곡선 모양을 갖거나 3차원 바디의 내부로부터 3차원 바디의 외주면을 향하여 연장하는 적어도 하나의 나선형 모양의 리브를 포함하거나; 또는 (ii) 이들 표면적의 적어도 일부분에 걸쳐서 실질적으로 편평한 것인, 장치.
4. 제2항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면이
   (i) 곡선 모양을 갖거나 3차원 바디의 내부로부터 3차원 바디의 외주면을 향하여 연장하는 적어도 하나의 나선형 모양의 리브를 포함하거나; 또는 (ii) 이들 표면적의 적어도 일부분에 걸쳐서 실질적으로 편평한 것인, 시스템.
5. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 3차원 바디가 실질적으로 구형 모양을 포함하는 것인, 장치.
6. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 3차원 바디가 실질적으로 구형 모양을 포함하는 것인, 시스템.
7. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면을 형성하는 재료가 금속, 유리, 붕규산염, 탄소섬유, 세라믹, 콜라겐, 젤라틴, 하이드로겔, 및 고분자의 적어도 하나로부터 선택된 재료를 포함하는 것인, 장치.
8. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면을 형성하는 재료가 금속, 유리, 붕규산염, 탄소섬유, 세라믹, 콜라겐, 젤라틴, 하이드로겔, 및 고분자의 적어도 하나로부터 선택된 재료를 포함하는 것인, 시스템.
9. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면을 형성하는 재료가 적어도 하나의 고분자를 포함하는 것인, 장치.
10. 제9항에 있어서, 상기 고분자가
    (a) 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리에스테르, 폴리아세탈, 및 폴리염화비닐로부터 선택된 것;
    (b) 폴리아미드; 또는
    (c) 폴리카보네이트인 것인, 장치.
11. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면을 형성하는 재료가 적어도 하나의 고분자를 포함하는 것인, 시스템.
12. 제11항에 있어서, 상기 고분자가
    (a) 폴리아미드, 폴리카보네이트, 폴리설폰, 폴리에스테르, 폴리아세탈, 및 폴리염화비닐로부터 선택된 것;
    (b) 폴리아미드; 또는
    (c) 폴리카보네이트인 것인, 시스템.
13. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면이 진핵 세포의 부착 및 성장을 촉진하도록 선택된 적어도 하나의 코팅을 추가로 포함하는 것인, 장치.
14. 제13항에 있어서, 상기 적어도 하나의 코팅이 단백질 및 폴리라이신으로부터 선택되는 것인, 장치.
15. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면이 진핵 세포의 부착 및 성장을 촉진하도록 선택된 적어도 하나의 코팅을 추가로 포함하는 것인, 시스템.
16. 제15항에 있어서, 상기 적어도 하나의 코팅이 단백질 및 폴리라이신으로부터 선택되는 것인, 시스템.
17. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면이 플라즈마 표면 처리에 적용되었던 것인, 장치.
18. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면이 플라즈마 표면 처리에 적용되었던 것인, 시스템.
19. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면이 진핵 세포의 성장을 촉진하도록 선택된 탄성 계수 및 곡률을 포함하는 것인, 장치.
20. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 다중 2차원 표면이 진핵 세포의 성장을 촉진하도록 선택된 탄성 계수 및 곡률을 포함하는 것인, 시스템.
21. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 진핵 세포가 줄기 세포, 정박 의존성 세포, 중간엽 세포, 및 간질 세포의 적어도 하나를 포함하는 것인, 장치.
22. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 진핵 세포가 줄기 세포, 정박 의존성 세포, 중간엽 세포, 및 간질 세포의 적어도 하나를 포함하는 것인, 시스템.
23. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 3차원 바디의 부피 대비 다중 2차원 표면의 표면적의 비율이 3 ㎠/㎤ 내지 1,000 ㎠/㎤인 것인, 장치.
24. 제23항에 있어서, 상기 3차원 바디의 부피 대비 다중 2차원 표면의 표면적의 비율이 10 ㎠/㎤ 내지 15 ㎠/㎤인 것인, 장치.
25. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 3차원 바디의 부피 대비 다중 2차원 표면의 표면적의 비율이 3 ㎠/㎤ 내지 1,000 ㎠/㎤인 것인, 시스템.
26. 제25항에 있어서, 상기 3차원 바디의 부피 대비 다중 2차원 표면의 표면적의 비율이 10 ㎠/㎤ 내지 15 ㎠/㎤인 것인, 시스템.
27. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 3차원 바디가 1 mm 내지 20 mm의 최대 치수를 갖는 것인, 시스템.
28. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 3차원 바디가 2 mm 내지 10 mm의 최대 치수를 갖는 것인, 장치.
29. 제28항에 있어서, 장치가 실질적으로 구형이고, 상기 최대 치수가 직경인 것인, 장치.
30. 제2항 또는 제4항에 있어서, 상기 3차원 바디가 2 mm 내지 10 mm의 최대 치수를 갖는 것인, 시스템.
31. 제30항에 있어서, 상기 3차원 바디가 실질적으로 구형이고, 상기 최대 치수가 직경인 것인, 시스템.
32. 일군의 진핵 세포를 선택하는 단계; 및
    상기 진핵 세포를 적어도 하나의 3차원 바디와 접촉시키는 단계를 포함하는 세포 배양 방법으로서,
    상기 적어도 하나의 3차원 바디가 실질적으로 구형 또는 실질적으로 타원체 모양이며, 상기 3차원 바디가 다수의 개구부를 포함하고, 상기 다수의 개구부는 3차원 바디의 외주면으로부터 3차원 바디의 내부를 향하여 내방향으로 연장하는 다중 2차원 표면 (multiple two-dimensional surfaces)을 포함하며, 상기 다중 2차원 표면이 다중 2차원 표면의 적어도 대부분 또는 전체 표면적에 걸쳐서 진핵세포의 단층 성장을 지지하도록 구성되고, 상기 다수의 개구부가, 이격된 복수개의 리브에 의해 형성되며, 상기 리브는 실질적으로 구형 또는 실질적으로 타원체 모양인 3차원 바디의 중심부로부터 3차원 바디의 외주면으로 방사상으로 연장되어 있고, 상기 3차원 바디가:
    (a) 2 mm 내지 10 mm 범위의 최대 치수를 가지며, 그리고
    (b) 3 ㎠/㎤ 내지 1,000 ㎠/㎤의 표면적 대 부피 비율을 갖는 것인, 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 진핵 세포를 적어도 하나의 3차원 바디와 접촉시키는 단계가
    (a) 상기 세포와 적어도 하나의 3차원 바디를 용기 내에 위치시키는 단계;
    (b) 배양 배지를 상기 세포에게 공급하는 단계; 및
    (c) 상기 적어도 하나의 3차원 바디의 이동을 야기하는 단계를 추가로 포함하는 것인, 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 이동을 야기하는 단계가
    (i) 적어도 하나의 3차원 바디가 담긴 용기를 회전시키거나 흔들어주거나; 또는
    (ii) 적어도 하나의 3차원 바디가 담긴 용기 내로 배지의 흐름을 공급하는 것을 포함하는 것인, 방법.
35. 제32항에 있어서, 상기 적어도 하나의 3차원 바디가 세포 부착에 내성을 갖도록 구성된 적합한 용기 내부의 배양 배지 내에 침지되는 것인, 방법.
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37. 삭제
38. 삭제
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