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CN100540647C - 槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器及其用途 - Google Patents

槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器，它包括上带盖子、多孔板底座和中空纤维丝，所述多孔板底座上刻有6～24条半圆形凹槽、每个凹槽含有1～20条中空纤维丝；动物细胞凝胶包埋培养于所述中空纤维丝内；因中空纤维丝具有适合细胞生存的传氧和传质能力，保持了细胞的药物代谢等功能。它结合了多孔板的微型化优势和人工肝反应器的三维仿生培养优势，保持了动物细胞的生物活性，用作药物代谢和药理毒理研究的动物细胞体外模型。该反应器可用于其它器官细胞的三维培养，为基础生理研究以及药理研究奠定基础。另外，也能用于实验室规模研究细胞培养条件和生产细胞代谢产物，适合进行条件实验、优化和筛选。

Description

槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器及其用途
技术领域
本发明涉及一种动物细胞的体外培养方法，特别地，涉及一种槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器。
背景技术
肝脏是人体中的重要器官，具有合成、代谢和解毒等功能。仅占人体2.6％的肝脏常被比作体内综合生物化学工厂，具有多种如糖、脂类、蛋白质、维生素和激素等代谢功能。在有机体整个生命过程中经常有毒物、药物等进入体内，同时在代谢过程中体内自身也产生内毒性物质。这些物质大部分通过肝脏进行代谢转变而增加了极性或水溶性，有利于随尿或胆汁排出体外，同时也改变其毒性或药理作用。这种毒物或药物在体内的代谢转变过程被称为生物转化作用。同样，药物经过肝脏代谢后发生物化性质改变，影响其药理作用。另外，药物与药物相互作用导致药物代谢的诱导迅速加快或者被抑制，降低或提高了目的药物在作用部位上的有效药物浓度，失去药效或者富集导致脏器损伤。所以，肝脏的药物代谢研究是先期临床药物筛选的关键步骤之一。
随着化学工业及生物合成能力的日新月异发展，大量新药有待于筛选与开发。用体外培养的原代动物肝细胞模型来模拟肝脏在体内的生物学功能是目前的重要研究方向之一。而占肝脏90％(重量)的肝细胞是肝脏进行药物代谢和反映药物肝毒性的主要场所，是理想的药物代谢研究的生物体系。目前，肝细胞用于药物代谢的国外研究主要有下述三个特点：第一，由于健康人体肝细胞难以获得，通常采用从动物肝脏中酶解得到的游离肝细胞；第二，游离肝细胞都采用涂有胶原的培养皿单层培养或两层凝胶中间的夹层培养，使存活期可达数天至数星期；第三，为提高药物筛选效率，大都采用多孔培养皿，规模逐渐趋向微型化。可以避免动物实验的弊端，如效率低、个体差异大导致结果偏差过大、不利于动物保护等缺点、无法消除种属差异。
目前，用于药物研究的体外细胞模型主要有孔板培养和平皿培养等，此种二维的方式虽然操作简单，但保持细胞活性时间短，细胞功能易丧失，不能很好的模拟体内细胞的结构和功能，这些缺陷使其应用受到了限制。现有的肝细胞体外培养方式大都采用二维的单层培养，肝细胞需要在培养容器的表面上才能贴壁生长，细胞呈岛状，而且蛋白尿素以及各种药物代谢功能往往在数天内显著下降甚至完全丧失，存活期通常在一周左右。因此单层培养的细胞表型、功能与体内肝细胞有很大差异，还无法代替体内肝细胞完成肝功能。为了更好地研究实现肝细胞在体内的重要功能，目前已发展出若干三维培养技术，如通过胶原凝胶包埋或者形成肝细胞聚球体，使肝细胞在体外培养过程中采用与体内生理状态更接近的方式进行培养。其中肝细胞聚球体培养是目前研究最受关注的培养方法。而三维培养方式，如中空纤维生物人工肝反应器，虽能较长时间保持细胞功能，模拟肝脏环境，但结构复杂，需要有多路供氧和培养基循环，体积庞大，成本也相当高，显然不适用于需要小型化的药物代谢研究和高通量的药物筛选。
同时，实验室研究细胞培养条件和生产细胞代谢产物，需要一种小型化，适合进行条件实验、优化、筛选的装置。而工业生产用的大型中空纤维反应器显然无法满足这个要求。如果能找到一种既操作简单又容易放大的培养方式，对于动物细胞工业化生产的前期研究有一定的意义。
发明内容
本发明的目的在于针对现有的药物研究模型的不足，提供一种槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器，大大简化了一般反应器所需的结构和操作，通过胶原凝胶将动物包埋于中空纤维丝内，胶原模拟了体内器官内的结缔组织，而多孔的中空纤维丝则模拟了体内血管，营养以及氧从与空气充分的培养基扩散到中空表面、透过中空丝壁后在凝胶内扩散至细胞表面，而代谢释放物质则反相扩散至培养基。该培养系统以三维培养的方式达到仿生学效果，并能长期维持动物细胞功能。
本发明为实现上述发明目的采用的技术方案是：一种槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器，包括上带盖子、多孔板底座和中空纤维丝，所述多孔板底座上刻有6～24条半圆形凹槽、每个凹槽含有1～20条中空纤维丝，动物细胞凝胶包埋培养于所述中空纤维丝内。
本发明的目的还在于提供槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器的用途。
本发明为实现上述发明目的采用的技术方案是：它能保持动物细胞的生物活性，实现动物细胞的以下用途：
(1)为药物代谢和药理毒理的研究的动物肝细胞体外模型的用途；
(2)用于细胞培养条件和产物生产的实验室研究的用途。
本发明具有的有益的效果是：能对动物细胞进行长期三维培养，大大简化了动物细胞三维培养的操作步骤，方便了动物培养在研究以及药物筛选中的应用。本技术公开的技术能保持动物细胞的生物活性，实现动物细胞的多种用途。具体来说，一是作为药物代谢和药理毒理的研究的动物肝细胞体外模型，二是用于细胞培养条件和产物生产的实验室研究。并且可作为动物细胞培养条件研究的载体，为工业化生产奠定基础。以肝细胞为例，本发明提供的培养技术可以使肝细胞进行三维培养，类似于肝脏内肝细胞的组织结构，可以更好地反映药物对肝脏的可能的毒性或保护作用以及药物在肝脏体内的代谢转化反应。
附图说明
图1是24槽的槽形孔板中空纤维反应器的结构示意图。
图2是实施例1中24孔单层贴壁培养和24孔槽形孔板中空纤维培养肝细胞对异烟肼药物作用的响应。其中(A)为细胞活率；(B)为尿素合成水平；(C)为白蛋白合成水平；(D)为胞内谷胱甘肽水平。
图3是实施例2中24孔单层贴壁培养和12孔槽形孔板中空纤维培养肝细胞对他克宁药物作用的响应以及对甘草酸保肝作用的响应。其中(A)细胞活率；(B)为胞内为胞内谷胱甘肽水平。
图4是实施例3的6孔槽形孔板中空纤维培养肝细胞进行药物代谢的曲线，其中(A)为单层贴壁肝细胞(-■-)以及凝胶包埋人肝细胞(-◆-)代谢非那西汀生成醋氨酚的生物转化能力，该反应表征了CYP1A2的酶代谢能力；(B)单层贴壁肝细胞(-■-)以及凝胶包埋肝细胞(-◆-)代谢生成4-硝基邻苯二酚的生物转化能力，该反应表征了CYP2E1的酶代谢能力.
图5是实施例4的24孔单层贴壁培养和槽形孔板中空纤维反应培养肝细胞进行甲氨喋呤胆汁排泄能力的间接测定。其中(A)单层贴壁肝细胞的细胞活率；(B)为凝胶包埋肝细胞的尿素合成水平；(C)为单层贴壁肝细胞的白蛋白合成水平；(D)为凝胶包埋细胞肝细胞的白蛋白合成水平。
具体实施方式
本发明的槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器包括上带盖子、下刻有6～24条半圆形凹槽的多孔板底座、每个凹槽含有1根以上的中空纤维丝；每根中空丝内腔包埋(胶原凝胶固定)动物细胞。
孔板材料为透明的低毒素聚苯乙烯材料材料。底部突出的数字清晰地标注槽的位置，气栅的设计方便气体交换而保证通风性能优越，外形设计同普通市售的细胞培养板，可以方便叠放，另外，该孔板可以经Gamma射线灭菌，一次性包装。
中空纤维丝的材料是其截留分子量在100KDa～1000KDa的聚丙烯、聚砜、聚丙烯腈或聚乙烯。
细胞培养为细胞经胶原凝胶包埋于中空纤维丝内。将收获得到的原代动物细胞和普通动物细胞株按106-107细胞/ml密度接种于1∶3，v∶v的4倍浓缩培养基和鼠尾胶原溶液混合液中，注入中空纤维丝，20-37℃放置10-15分钟凝固，将中空纤维丝剪短至6-8cm，放1-20根含细胞的中空丝到槽形多孔板的各个槽中，每条槽中加入1-5毫升温育过的培养基，这样就形成所述槽形孔板中空纤维反应器。
每个凹槽含为0.1ml-2ml的包埋有细胞的内腔容积，其容积大小取决于中空纤维丝的根数。每个孔板可开6到24的凹槽数，具体槽数则根据需要来定。
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
如附图1所示，本发明包括：带槽形条孔的细胞培养板，包括下刻有多条半圆形凹槽的多孔板底座、上带盖子、每个凹槽含有1根以上的中空纤维丝；每根中空丝内腔包埋(胶原凝胶固定)动物细胞。槽形细胞培养板类似于常规的用于单层贴璧培养的12孔或24孔细胞培养板，只是孔的形状以及细胞培养方式不同。
具体实施例1：(在异烟肼药物毒性上的比较)
将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/ml密度接种于4倍浓缩培养基和鼠尾胶原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纤维丝3，37℃放置10分钟使之凝固。将中空纤维丝3剪短，6.5cm×12根，每3根装入24槽槽形孔板的槽中，加入3ml含5％胎牛血清Williams’E培养基，放入37℃，5％CO2培养箱静置培养。
将同批大鼠肝细胞按0.8×106cells/ml接入3ml含5％胎牛血清Williams’E培养基的铺有鼠尾胶原的24孔细胞培养板中。培养条件与上述相同。
待24孔细胞培养板中细胞贴壁后(12-18h)，在中空纤维反应器和平皿中分别加入含待测药物异烟肼培养基和不含药物培养基(作为空白对照)。其后每60h更换新的培养基。各重复三组，测定肝细胞活率及肝功能指标尿素和白蛋白。结果如附图2所示。
由图2可见，凝胶包埋肝细胞对肝毒性药物异烟肼的反应比贴璧细胞更敏感，说明了三维培养的肝细胞比单层贴壁肝细胞更适用于药物毒性研究。
一般多孔细胞培养板常被用做细胞体外的载体，常用于二维的单层培养。因此，实验发现槽形孔板中空纤维细胞培养板比常规多孔细胞培养板更优越，也可说明本发明与多孔板的差异。
具体实施例2：(用于保肝药物的评价)
将收获活率高于90％的大鼠肝细胞按106cells/ml密度接种于4倍浓缩培养基和鼠尾胶原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纤维丝3，37℃放置10分钟使之凝固。将中空纤维丝3剪短，6.5cm×12根，每3根装入12槽槽形孔板的槽中，加入3ml含5％胎牛血清Williams’E培养基，放入37℃，5％CO2培养箱静置培养。
培养12-18h后，各组分别换入含药物浓度为0.25mM他克宁、0.25mM他克宁+0.5g/l的甘草酸和不含药物的培养基(作为空白对照)。48h后观察细胞形态，发现0.25mM他克宁+0.5g/l的甘草酸的细胞活率和谷胱甘肽均较高，接近于空白对照，与他克宁组相比有显著的改善与提高。
具体实施例3：(用于药物代谢研究)
将收获活率高于90％的人肝细胞按106cells/ml密度接种于4倍浓缩培养基和鼠尾胶原溶液混合液(1∶3；v∶v)中，注入中空纤维丝3，37℃放置10分钟使之凝固。将中空纤维丝3剪短，6.5cm×12根，每3根装入24孔槽形孔板的槽中，加入3ml含5％胎牛血清Williams’E培养基，放入37℃，5％CO2培养箱静置培养。
将同批大鼠肝细胞按0.8×106cells/ml接入2ml含5％胎牛血清Williams’E培养基的铺有鼠尾胶原的24孔细胞培养板的培养孔。培养条件与上述相同。
培养60h后，各组加入药物代谢底物(40uM的非那西丁溶液和4-硝基邻苯二酚，4-NC)，分别是CYP1A2和CYP2E1的特异性底物)，经过3h的药物代谢，HPLC法测定各底物的代谢产物(非那西丁和4-硝基邻苯二酚，4-NC)含量。结果如图4所示。从图中看出，人肝细胞在中空纤维反应器内代谢非那西丁和4-硝基邻苯二酚的能力高于平皿培养细胞，说明细胞色素CYP1A2和CYP2E1比平皿单层培养能更好地保持酶活性。而普通体外培养的肝细胞在12小时内很快消失相应药物代谢酶活。因此中空纤维凝胶包埋培养比细胞培养板单层贴壁培养更适用于药物代谢研究。
具体实施例4：(用于观察药物胆汁排泄能力)
24孔细胞培养板单层贴壁培养和在24槽槽形孔板中空纤维反应器中培养的肝细胞进行药物吸收与排泄的曲线；采用荧光素(fluorescein diacetate)分泌实验表征单层贴壁肝细胞或凝胶包埋肝细胞的胆汁分泌功能。将单层贴壁肝细胞或凝胶包埋肝细胞在含有0.125mg/ml荧光素的Willam E培养基中，在37C培养箱中温育30min后，在荧光显微镜下观察呈蛇行，观察波长为495nm和520nm。从荧光照片(图略)可知，单层贴壁培养肝细胞的荧光胆管通道并不明显，而凝胶培养肝细胞的荧光胆道非常清晰。另外，采用甲氨碟呤的药物作用观察胆管排泄能力，单层贴壁培养的肝细胞培养4h后，分别把培养基换成不加任何药物、含有1mmol/L甲氨喋呤和含有5mmol/L甲氨喋呤的培养基，48h后再更换培养基。对单层贴壁肝细胞，培养24和72h后分析细胞活率、尿素和白蛋白产量；对凝胶培养肝细胞，培养120小时后分析肝功能指标。结果如图4。从图中明显看出来，单层贴壁肝细胞对甲氨碟呤的药物作用非常敏感，而凝胶包埋细胞则在72h内没有显著的毒性反应，只有在5天时间的作用下才有一定程度的反应。在大鼠体内，约70-90％的甲氨碟呤是通过胆汁排泄的。由于单层贴壁肝细胞的微胆囊结构不如三维组织化的凝胶包埋肝细胞那样完全与丰富，单层贴壁肝细胞的微胆囊排泄能力不如凝胶包埋肝细胞。因此，甲氨喋呤就容易在单层贴壁肝细胞胞内，由于其本身的细胞毒性，导致单层肝细胞比凝胶包埋肝细胞更敏感于甲氨喋呤的毒性。
本发明提出的槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器，已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本发明进行改动或适当变更与组合来实现本发明技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域的技术人员是显而易见的，它们都会被视为包括在本发明精神、范围和内容中。

Claims (6)

1.一种槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器，其特征在于：包括盖子、多孔板底座和中空纤维丝，所述多孔板底座上刻有6～24条半圆形凹槽、每个凹槽含有1～20条中空纤维丝，盖子盖在多孔板底座上部；动物细胞凝胶包埋培养于所述中空纤维丝内。
2.根据权利要求1所述的槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器，其特征在于，所述多孔板底座的材料为透明的低毒素聚苯乙烯材料。
3.根据权利要求1所述的槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器，其特征在于，所述中空纤维丝的材料是其截留分子量在100KDa～1000KDa的聚丙烯、聚砜、聚丙烯腈或聚乙烯。
4.根据权利要求1所述的槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器，其特征在于，所述凝胶包埋培养为细胞经胶原凝胶包埋于中空纤维丝内；将4倍浓缩培养基和鼠尾胶原按1∶3的比例制备混合溶液，再将动物细胞按106～107细胞/ml密度接种于该混合溶液中，注入中空纤维丝，20-37℃放置10～15分钟凝固，将中空纤维丝剪短至6～8cm，放1～20根含细胞的中空丝到各槽中，各槽中加入1～5毫升温育过的培养基，这样就形成所述槽形孔板中空纤维反应器。
5.根据权利要求1所述的槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器，其特征在于，所述凹槽每个含0.1ml～2ml的包埋有细胞的内腔容积，每个孔板可开6～24的凹槽数。
6.一种槽形多孔板动物细胞中空纤维反应器的用途，该反应器包括盖子、多孔板底座和中空纤维丝，所述多孔板底座上刻有6～24条半圆形凹槽、每个凹槽含有1～20条中空纤维丝，盖子盖在多孔板底座上部；动物细胞凝胶包埋培养于所述中空纤维丝内；其特征在于，它能保持动物细胞的生物活性，实现动物细胞的以下用途：
(1)作为药物代谢和药理毒理的研究的动物肝细胞体外模型的用途；
(2)用于细胞培养条件和产物生产的实验室研究的用途。
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微型中空纤维反应器用于药物肝脏毒性研究. 沈冲.浙江大学硕士论文，第2005年卷.
微型中空纤维反应器用于药物肝脏毒性研究. 沈冲.浙江大学硕士论文，第2005年卷. *

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