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KR101624344B1 - 히스톤 탈아세틸화 효소 억제 활성을 갖는 신규한 3-치환-2-옥소인돌린 기반 n-히드록시프로펜아미드 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents

히스톤 탈아세틸화 효소 억제 활성을 갖는 신규한 3-치환-2-옥소인돌린 기반 n-히드록시프로펜아미드 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 Download PDF

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KR101624344B1
KR101624344B1 KR1020140158323A KR20140158323A KR101624344B1 KR 101624344 B1 KR101624344 B1 KR 101624344B1 KR 1020140158323 A KR1020140158323 A KR 1020140158323A KR 20140158323 A KR20140158323 A KR 20140158323A KR 101624344 B1 KR101624344 B1 KR 101624344B1
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홍진태
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마이 덩 두타이
티 킴 오안 다오
티 푸옹 덩 판
란 흐엉 트란
탄 흐엉 푸엉
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충북대학교 산학협력단
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Abstract

본 발명은 신규한 3-히드록시이미노-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미드 화합물 또는 3-메톡시이미노-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미드 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 히드록삼산 화합물은 강력한 히스톤 탈아세틸화 효소(histone deacetylase, HDAC)의 억제 활성을 가지며, 다양한 암세포에 대해 증식억제 활성을 나타낸다. 본 발명의 화합물은 강력한 항암제의 활성성분으로 개발될 수 있다.

Description

히스톤 탈아세틸화 효소 억제 활성을 갖는 신규한 3-치환-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미드 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물{Novel 3-Substituted-2-Oxoindoline-Based N-hydroxypropenamides Having Activity of Inhibiting Histone Deacetylase and Antitumor Composition Comprising the Same}
본 발명은 히스톤 탈아세틸화 효소 억제 활성을 갖는 신규 3-치환된-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미드 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
히스톤 탈아세틸화 효소(Histone deacetylases, HDAC)는 지난 수 십년간 항암 약물의 디자인 및 개발을 위한 흥미로운 분자 타겟이 되어 왔다[1-3]. 이들 효소들은 히스톤 단백질들의 꼬리 부위에 있는 라이신 잔기로부터의 아세틸기 잔기를 제거하는 작용을 통해, 염색체의 응축과 전사(transcription) 과정을 억제하는 결과를 초래한다[2, 3]. 지금까지, 진핵세포에서 HDAC의 18개의 상이한 동형 단백질이 확인되었다[4]. 이들은 상대적인 서열 유사성에 기초하여 4개의 클래스(class)로 분류된다. 클래스 I은 HDAC 1, 2, 3 및 8의 4개의 구성원을 포함하고, 클래스 Ⅱ는 현재까지 HDAC 4, 5, 6, 7, 9 및 10의 6개의 구성원을 가지고 있다. 클래스 Ⅲ의 HDAC들은 시르투인(Sirtuin)으로도 알려져 있다. 7개의 일원(Sirt1-7)을 갖는 시르투인은 NAD+-의존성 효소이다. 마지막으로, 클래스 IV HDAC은 오직 하나의 일원(HDAC11)만을 가지고 있다. HDAC11은 클래스 Ⅱ 및 클래스 I HDAC2 양쪽의 특성을 모두 갖는 것으로 알려져 있다[4]. 4개의 클래스들 중에서 클래스 I HDAC들은 가장 중요한 동형 단백질로 간주되고 가장 많이 연구되었다[4]. 여러 타입의 종양세포에서 상이한 HDAC 동형 단백질들을 억제하게 되면 세포분화, 아폽토시스 및 세포주기 정지와 관련된 다수의 연속적인 이벤트(event)가 나타난다[5, 6]. HDAC 억제가 종양 세포 성장에 미치는 억제적 효과는 인 비트로 뿐만 아니라 다수의 인 비보 전임상 모델 및 임상 단계에서도 명확하게 증명되고 있다[7, 8]. 따라서, 최근에 HDAC 억제는 암 치료 분야에서 흥미로운 접근법이 되고 있다[9]. 그 결과, 최근 까지 의학 화학자들에 의해 수백 종의 HDAC 억제제들이 보고되고 있다. 이러한 억제제들은 짧은 사슬을 갖는 지방산(예를 들어, 부티레이트, 페닐부티레이트 또는 발프로산)에서부터 다양한 종류의 히드록삼산 또는 벤즈아미드와 같이 다양하다[10 - 16]. PXD-01(Belinostat), LBH-589(Panobinostat), MS-27-527(Entinostat) (도 1)와 같은 다수의 HDAC 억제제가 각기 상이한 임상시험 단계에 있으며, SAHA(vorinostat, 상표명 Zolinza)) 및 로미뎁신(romidepsin, 상표명 Istodax)(도 1)이 임상적 적용에 대하여 허가가 완료되었다.
본 발명자들은 HDAC 억제제 및 항암제 작용을 갖는 신규 히드록삼산을 개발하기위해, SAHA의 헤테로환 유사체 개발에 중점을 두었다. 종전의 연구결과로서, 매우 강력한 HDAC 억제 활성 및 암세포에 대한 세포독성을 갖는 다양한 벤조티아졸/티아졸 시리즈가 도입된 히드록삼산을 개발하였다[17, 18](도 2). 이들 화합물중에서 활성이 우수하여 선택된 화합물은 PC-3 전립선암세포 이식된 마우스 모델에서 전임상 평가 결과 SAHA와 비견할 정도의 인 비보 항종양 활성을 나타내었다[18]. 이러한 성공적 결과에 고무되어, 5-치환된 페닐/아릴-1,3,4-티아디아졸-기반 히드록삼산에 대한 연구로 확장되었고, 이들 화합물들이 매우 강력한 HDAC 억제제로서 암세포에 대한 강한 세포독성을 갖는다는 것을 확인하였다[19, 20](도 2).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
대한민국 등록특허 제10-1261305호 대한민국 등록특허 제10-1282833호 대한민국 공개특허 제10-2007-0116626호
1. Nam NH, Parang K. Curr Drugs Targets 2003; 4: 159-179. 2. Marks PA, Rifkind RA, Richon VM, Breslow R, Miller T, Kelly WK. Nature Rev Cancer 2001; 1: 194-202. 3. Witt O, Deubzer HE, Milde T, Oehme I. HDAC family: Cancer Lett 2009; 277: 8-21. 4. De Ruijter AJM, Gennip AHV, Caron HN, Kemp S, Kuilenburg ABPV. Biochem J 2003; 370: 737-739. 5. Bolden JE, Peart MJ, Johnstone RW. Nat Rev Drug Discov 2006; 5: 769-784. 6. Dokmanovic M, Marks PA. Expert Opin Investi. Drug 2005; 14: 1497-1511. 7. Johnstone RW. Nature Rev Drug Disc 2002; 1: 287-299. 8. Glaser KB. Biochem Pharmacol 2007; 74: 659-871. 9. West AC, Johnstone RW. J Clin Invest 2014; 124: 30-39. 10. Dallavalle S, Cincinelli R, Nannei R, Merlini L, Morini G, Penco S, Pisano C, Vesci L, Barbarino M, Zuco V, De Cesare M, Zunino F. Eur J Med. Chem 2009; 44: 1900-1912. 11. Bracker TU, Sommer A, Fichtner I, Faus H, Haendler B, Hess-Stumpp H. Int J Oncol 2009; 35: 909-920. 12. Finnin MS, Donigian JR, Cohen A, Richon VM, Rifkind RA, Marks PA, Breslow R, Pavietich NP. Nature 1999; 401: 188-193. 13. Valente S, Mai A. Expert Opin Ther Pat 2014; 24: 401-415. 14. Li J, Li G, Xu X. Curr Med Chem 2013; 20: 1858-1886. 15. Ververis K, Hiong A, Karagiannis TC, Licciardi PV. Biologics 2013; 7: 47-60. 16. Qiu T, Zhou L, Zhu W, Wang T, Wang J, Shu Y, Liu P. Future Oncol 2013; 9: 255-269. 17. Oanh DTK, Hai HV, Hue VTM, Park SH, Kim HJ, Han BW, Kim HS, Hong JT, Han SB, Nam NH. Bioorg Med Chem Lett 2001; 21: 7509-7512. 18. Tung TT, Oanh DT, Dung PT, Hue VT, Park SH, Han BW, Kim Y, Hong JT, Han SB, Nam NH. Med Chem 2013; 9: 1051-1057. 19. Nam NH, Huong TL, Dung DTM, Oanh DTK, Dung PTP, Kim KR, Han BW, Kim YS, Hong JT, Han SB. J Enzyme Inhib Med Chem 2013; published online, doi:10.3109/14756366.2013.832238. 20. Nam NH, Huong TL, Dung DTM, Oanh DTK, Dung PTP, Quyen D, Kim KR, Han BW, Kim YS, Hong JT, Han SB. Eur J Med Chem 2013; 70: 477-486. 21. Skehan P, Storeng R, Scudiero D, Monk A, MacMahon J, Vistica D, Warren JT, Bokesch H, Kenney S, Boyd MR. J. Natl Cancer Inst 1990; 82: 1107-1112. 22. You YJ, Kim Y, Nam NH, Bang SC, Ahn BZ. Eur J Med Chem 2004; 39: 189-193. 23. Kim Y, You YJ, Nam NH,, Ahn BZ. Bioorg Med Chem. Lett 2002; 12: 3435-3438. 24. Wu L, Smythe AM, Stinson SF, Mullendore LA, Monks A, Scudiero DA, Paull KD, Koutsoukos AD, Rubinstein LV, Boyd MR, Shoemaker RH. Cancer Res 1992; 52: 3029-3034. 25. Trott O, Olson AJ. AutoDock Vina: J Comput Chem 2010; 31: 455-461. 26. Lauffer BE, Mintzer R, Fong R, Mukund S, Tam C, Zilberleyb I, Flicke B, Ritscher A, Fedorowicz G, Vallero R, Ortwine DF, Gunzner J, Modrusan Z, Neumann L, Koth CM, Lupardus PJ, Kaminker JS, Heise CE, Steiner P. J Biol Chem 2013; 288: 26926-26943. 27. Schuttelkopf AW, van Aalten DM. PRODRG: Biological crystallography 2004; 60: 1355-1363. 28. Pelzel HR, Schlamp CL, Nickells RW. BMC Neuroscience 2010; 11: 62. (http://www.biomedcentral.com/1471-2202/11/62).
본 발명자들은 히스톤 탈아세틸화 효소 억제 활성을 갖는 신규한 화합물을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 3-히드록시이미노-2-옥소인돌린 기반 및 3-메톡시이미노-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미노 화합물들을 신규 합성하였고, 이들의 히스톤 탈아세틸화 효소 억제 활성과 암세포에 대한 증식억제 활성을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 신규한 3-히드록시이미노-2-옥소인돌린 기반 및 3-메톡시이미노-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미노 화합물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 화합물의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 제공한다.
[화학식 1]
Figure 112014109522042-pat00001
단, 상기 화학식 1에서 R1은 수소 또는 메틸이고, R2는 수소, 할로겐, C1-6의 알킬, 또는 C1-6의 알콕시이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 할로겐은 플루오르(F), 염소(Cl) 또는 브롬(Br)이다.
본 발명의 화합물은 3-히드록시이미노-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미드 화합물 또는 3-메톡시이미노-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미드 화합물이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 다음의 화합물 중 어느 하나의 화합물이다:
(E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드;
(E)-3-(4-(((Z)-5-플루오로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
(E)-3-(4-(((Z)-5-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
(E)-3-(4-(((Z)-5-브로모-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜이미드;
(E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(히드록시이미노)-5-메틸-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드;
(E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(히드록시이미노)-5-메톡시-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드;
(E)-3-(4-(((Z)-7-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
(E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드;
(E)-3-(4-(((Z)-5-플루오로-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
(E)-3-(4-(((Z)-5-클로로-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
(E)-3-(4-(((Z)-5-브로모-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
(E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(메톡시이미노)-5-메틸-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드;
(E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(메톡시이미노)-5-메톡시-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드; 및
(E)-3-(4-(((Z)-7-클로로-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드.
본 명세서에서 용어 “약학적으로 허용되는 염”은 상기 화합물의 생물학적 효능 및 특성을 보유하며, 적절한 무독성 유기산 또는 무기산, 또는 무독성 유기염기 또는 무기염기로부터 형성되는 통상의 산부가염 또는 염기 부가염을 의미한다. 산부가염의 예는 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 술팜산, 인산 및 질산과 같은 무기산으로부터 유래된 산부가염, p-톨루엔술폰산, 살리실산, 메탄술폰산, 옥살산, 숙신산, 시트르산, 말산, 락트산, 푸마르산 등과 같은 유기산으로부터 유래된 산부가염이 포함된다. 염기 부가염의 예는 암모늄, 칼륨, 나트륨, 및 4차 수산화암모늄 예컨대, 수산화테트라메틸암모늄으로부터 유래된 염기부가염이 포함된다. 화합물의 개선된 물리적 및 화학적 안정성, 흡습성, 유동성 및 가용성을 얻기 위해, 약학적 화합물(즉, 약물)을 염으로 화학적으로 변형시키는 것은 약학 화학자에게 잘 공지되어 있는 기술이며, 이러한 내용은 문헌 [H. Ansel et. al., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (6th Ed. 1995) at pp. 196 and 1456-1457]에 기재되어 있고, 이 문헌은 본 명세서에 참조로써 포함된다.
본 명세서에서 용어 “약학적으로 허용되는”은 예컨대, 약제학적으로 허용가능한 담체, 부형제 등이 특정한 화합물이 투여되는 환자에게 약리학적으로 허용될 수 있으며 실질적으로 무독성을 나타낸다는 것을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 화합물은 히스톤 탈아세틸화 효소(histone deacetylase) 활성 억제를 통해 히스톤의 아세틸화를 촉진하는 효능을 가지며, 히스톤 탈아세틸화 효소의 활성을 억제함으로써 세포내 히스톤을 고아세틸화 상태로 유도한다.
본 발명의 화합물은 하기 구체적인 일 실시예에서 입증되는 바와 같이, 다양한 암세포주에 대해 세포독성(세포증식 억제) 효과를 나타내어 항암 효능을 발휘한다.
본 발명의 약제학적 조성물에 의한 치료 대상 질병인 암(cancer)은 세포가 정상적인 성장 한계를 무시하고 분열 및 성장하는 공격적(aggressive) 특성, 주위 조직에 침투하는 침윤적(invasive) 특성, 및 체내의 다른 부위로 퍼지는 전이적(metastatic) 특성을 갖는 세포에 의한 질병을 총칭하는 의미이다.
본 발명의 다른 일 구현예에 따르면, 상기 치료 대상 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암이나, 이에 한정되지 않는다. 보다 바람직하게는 상기 암은 대장암, 유방암, 전립선암, 췌장암, 또는 폐암이다.
본 발명의 항암용 약제학적 조성물은 (i) 상기 설명된 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염의 약제학적 유효량; 및 (ⅱ) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 따라 다양한 방법으로 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.001-1000 mg/kg(체중)이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구로 투여되는 경우, 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물에 포함되는 유효 성분의 농도는 치료 목적, 환자의 상태, 필요 기간, 질환의 위중도 등을 고려하여 결정되며 특정 범위의 농도로 한정되지 않는다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 상기 설명된 본 발명의 화합물의 제조 방법을 제공한다:
(i) 염기성 조건하에서 하기 화학식 (a-1)의 화합물과 메틸 4-브로모메틸신나메이트를 반응시켜 하기 화학식 (a-2)의 화합물을 생성하는 단계; 및
[화학식 (a-1)]
Figure 112014109522042-pat00002
[화학식 (a-2)]
Figure 112014109522042-pat00003

(ⅱ) 상기 생성된 화학식 (a-2)의 화합물과 히드록실아민을 반응시켜 하기 화학식 (a-3)의 화합물을 생성하는 단계.
[화학식 (a-3)]
Figure 112014109522042-pat00004
단, 상기 화학식 a-1 내지 화학식 a-3에서 R은 수소, 할로겐, C1-6의 알킬, 또는 C1-6의 알콕시이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 상기 설명된 본 발명의 화합물의 제조 방법을 제공한다:
(i′) 염기성 조건하에서 하기 화학식 (a-1)의 화합물과 메톡실아민 하이드로클로라이드를 반응시켜 하기 화학식 (a-4)의 화합물을 생성하는 단계;
[화학식 (a-1)]
Figure 112014109522042-pat00005
[화학식 (a-4)]
Figure 112014109522042-pat00006
(ⅱ′) 상기 생성된 화학식 (a-4)의 화합물과 메틸 4-브로모메틸신나메이트를 반응시켜 하기 화학식 (a-5)의 화합물을 생성하는 단계; 및
[화학식 (a-5)]
Figure 112014109522042-pat00007
(ⅲ′) 상기 생성된 화학식 (a-5)의 화합물과 히드록실아민을 반응시켜 하기 화학식 (a-6)의 화합물을 생성하는 단계.
[화학식 (a-6)]
Figure 112014109522042-pat00008
단, 상기 화학식 a-1 내지 화학식 a-6 에서 R은 수소, 할로겐, C1-6의 알킬, 또는 C1-6의 알콕시이다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(i) 본 발명은 신규한 3-히드록시이미노-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미드 화합물 또는 3-메톡시이미노-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미드 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
(ⅱ) 본 발명의 히드록삼산 화합물은 강력한 히스톤 탈아세틸화 효소(histone deacetylase, HDAC)의 억제 활성을 가지며, 다양한 암세포에 대해 증식억제 활성을 나타낸다.
(ⅲ) 본 발명의 화합물은 강력한 항암제의 활성성분으로 개발될 수 있다.
도 1은 지금까지 개발된 HDAC 억제제들의 구조를 보여준다.
도 2는 벤조티아졸-, 5-치환된 페닐-1,3,4-티아디아졸 기반 히드록삼산의 구조를 보여준다.
도 3은 합성한 화합물들이 SW620 세포에서 히스톤 아세틸화에 미치는 효과를 측정한 결과를 보여준다. 세포들을 합성한 화합물 또는 SAHA로 3μg/mL의 농도로 24 시간 동안 처리하였다. 총 세포 용해물에서 아세틸-히스톤-H3 및 -H4의 수준을 웨스턴 면역 블로팅 분석으로 통해 측정하였다.
도 4는 HDAC2에 대해서 SAHA의 실제 결합 포즈(binding pose)와, 화합물 3b (패널 A)및 화합물 3g (패널 B)의 시뮬레이션된 도킹 포즈(docking pose)의 입체적 구조를 보여준다. SAHA는 탄소, 질소 및 산소 원자를 각각 분홍색, 파란색 및 빨간색으로 표시하여 스틱 모델로 표시하였다. 화합물 3b 및 3g는 탄소 원자들을 각각 청록색(cyan) 및 갈색으로; 질소 및 산소 원자는 각각 파란색 및 빨간색으로 표시하여 나타내었다. 상호작용에 관한 효소의 중요 부위는 탄소, 질소 및 산소를 각각 회색, 파란색 및 빨간색으로 나타낸 스틱 모델로 보여주었다. Zn2+ 이온은 밝은 회색 구로 표시하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 방법
1. 화합물의 합성 화학
모든 생성물들은 균일하게 얻었으며, 이들은 Whatman 250μm Silica Gel GF Uniplates 상에서 박막 크로마토그래피(thin-layer chromatography, TLC)를 행하고 254 nm 및 365 nm 에서의 UV광 하에서 시각화하여 확인하였다. 끓는점은 Gallenkamp Melting Point Apparatus(LabMerchant, London, United Kingdom)를 사용하여 측정하였고, 보정되지 않았다. 크로마토그래피를 사용한 정제는 Merck silica gel 60 (240 - 400 mesh)를 사용하여 오픈 플래쉬 실리카젤 컬럼 크로마토그래피를 통해 행하였다. 핵자기공명스펙트럼(1H NMR)은 다르게 지정하지 않으면 테트라메틸실란을 내부표준물질로 사용하고 디메틸설폭사이드-d 6 (DMSO-d 6 )를 용매로 사용하여 Bruker 500 MHz 분광기상에서 측정하였다. 화학적 이동(chemical shift)은 내부표준물질인 테트라메틸실란으로부터의 다운필드로 ppm(parts per million)으로 기록하였다. 전자이온화(electron ionization, EI), 전기분무이온화(electrospray ionization, ESI) 및 고해상도 질량스펙트럼은 각각 PE Biosystems API 200 (Perkin Elmer, Palo Alto, CA, USA) 및 Mariner(Azco Biotech, Inc. Oceanside, CA, USA) 질량 분광기를 사용하여 측정하였다. 시약 및 용매는 다르게 지정하지 않는 한 Aldrich 또는 Fluka Chemical Corp. (Milwaukee, WI, USA) 또는 머크(Merck)사로부터 구입하여 사용하였다. 용매는 사용 전에 증류하고 건조시켰다.
2. 화합물의 합성
(E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(히드록시이미노)-5/7-치환-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드(화합물 3a-3g) 및 (E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(메톡시이미노)-5/7-치환-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드(화합물 6a-6g) 화합물들은 하기 반응도 1 및 2에 설명된 방법에 따라 합성하였다. 합성은 다음과 같이 진행하였다.
(1) ( E )-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(히드록시이미노)-5/7-치환-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드(화합물 3a-3g)의 합성
DMF (3 mL)내의 화합물 1a-1g (1 mmoL) 용액을 -5℃까지 냉각시키고, K2CO3(165.5 mg, 1.2 mmoL)을 첨가하였다. 혼합물을 -5℃에서 1시간 및 상온에서 45분간 각각 교반한 후, CH3OH(0.5 mL) 및 KI(8.3 mg, 0.05 mmoL)을 첨가하였다. 15분간 교반한 후에, DMF(1 mL)내의 (E)-메틸 4-브로모메틸신나메이트(255 mg, 1 mmoL) 용액을 첨가하였고, 생성된 반응 혼합물을 60℃에서 24시간 동안 교반하였다. 교반을 완료한 후, 반응 혼합물을 냉각시키고 10％ HCl로 pH가 ~ 4에 이를 때까지 산성화시키고 DCM (50 mL x 2)으로 추출하였다. 추출물을 모은 후에 DCM을 감압하에서 증발시켜 갈색-노란색의 오일 잔류물로서, 화합물 2a-2g를 수득하고 추가적인 정제과정 없이 다음 단계에서 사용하였다.
상기 수득한 갈색-노란색의 오일(화합물 2a-2g)을 각각 메탄올/테트라하이드로퓨란 혼합물(1/1, 3 mL)에 용해시키고, 이렇게 얻은 각 화합물 용액을 -5℃으로 냉각시킨 후에 히드록실암모늄 클로라이드(195 mg, 10mmoL)을 첨가하였다. NaOH(0.4 g, 10 mmoL)을 2 mL의 물에 용해시키고 -5℃ 까지 냉각시킨 후에 혼합물에 첨가하였다. 화합물 2a-2g가 완전히 반응할 때까지 혼합물을 -5℃에서 교반하였다. 반응 혼합물에 HCl 15％ 용액을 적가하여 pH 7으로 중성화시켜 침전을 유도하였다. 침전물을 여과하고, 물로 세정하고, 60℃에서 건조하고, 에탄올로부터 재결정화하여 화합물 3a-3g를 생성하였다.
( E )- N -히드록시-3-(4-((( Z )-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드(화합물 3a)
노란색 고체; 수율: 74％. mp: 197-198℃. R f = 0.45(DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr,cm -1 ): 3441(NH), 3197(OH), 3049(C-H, aren), 2856(CH,CH2), 1714, 1655(C=O), 1608(C=C), 1463(C-N). ESI-MS(m/z):339[M + 2H]-. 1 H-NMR(500MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 8.01(1H, d, J=7.5Hz, H-4”); 7.52 (2H, d, J=8.5Hz, H-2’, H-6’); 7.40 (1H, d, J=15.5Hz, H-3); 7.35 (2H, d, J=8.5Hz,H-3’, H-5’); 7.34 (1H, t, J=7.5Hz, H-5”); 7.07 (1H, t, J=7.5Hz, H-6”); 6.96 (1H, d, J=8.0Hz, H-7”); 6.45 (1H, d, J=16.0Hz, H-2); 4.95 (2H, s, -CH2-). 13 CNMR (125MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 163.36, 162.69, 143.41, 142.60, 137.79, 137.61, 134.15, 131.92, 127.88, 127.81, 126.91, 122.88, 119.21, 115.41, 109.55, 42.37. Anal. Calcd. For C18H15N3O4(337.33):C, 64.09; H, 4.48; N, 12.46. Found: C, 64.11; H, 4.49; N, 12.41.
( E )-3-(4-((( Z )-5-플루오로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)- N -히드록시프로펜아미드(화합물 3b)
노란색 고체; 수율: 72%. mp: 198-199℃. R f = 0.35 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr, cm -1 ): 3452(NH), 3224(OH), 3049(C-H, aren) 2856(CH, CH2), 1720, 1662(C=O), 1615, 1513(C=C), 1474(C-N). ESI-MS(m/z):357[M+2H]-. 1 H-NMR(500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 7.78 (1H, dd, J=8.0Hz, J’=2.5Hz, H-4”);7.52(2H, d, J=8.0Hz, H-2’, H-6’); 7.41(1H, d, J=16.0Hz, H-3); 7.35(2H, d, J=8.0Hz, H-3’, H-5’);7.21(1H, td, J=9.0Hz, 3.0Hz, H-6”); 6.96 (1H, dd, J=8.5Hz, J’=4.0 Hz, H-7”); 6.44(1H, d, J=16.0Hz, H-2); 4.95(2H, s, -CH2-). 13 CNMR (125 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 163.35, 162.68, 159.05, 157.15, 143.14, 138.72, 137.81, 137.47, 134.17, 127.89, 127.81, 119.19, 117.91, 117.73, 116.06, 115.98, 113.80, 113.59, 110.49, 110.42, 42.46. Anal. Calcd. For C18H14FN3O4(355.32): C, 58.81; H,6.58; N,13.72. Found:C, 58.78; H, 6.55; N, 13.83.
( E )-3-(4-((( Z )-5-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)- N -히드록시프로펜아미드(화합물 3c)
노란색 고체; 수율: 69％. mp: 196-198℃. R f = 0.38 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr, cm -1 ): 3279(OH), 3069(C-H, aren), 2924, 2847(CH, CH2), 1716, 1656(C=O), 1607, 1513(C=C), 1463(C-N). ESI-MS(m/z):370.4[M-H]-. 1 H-NMR(500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 13.80 (1H, s, OH); 10.75 (1H, s, NH); 9.03 (1H, s, OH); 7.97 (1H, d, J=2.0Hz, H-4”); 7.52 (2H, d, J=8.0Hz, H-2’, H-6’); 7.43-7.40 (2H, m, H-6”, H-3); 7.35 (2H, d, J=8.0Hz, H-3’, H-5’); 6.99 (1H, d, J=8.5Hz, H-7”); 6.43 (1H, d, J=15.5Hz, H-2); 4.96 (2H, s, H-7’a, H-7’b). 13 CNMR (125 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 162.90, 162.67, 142.68, 141.39, 137.79, 137.21, 134.17, 131.40, 127.85, 127.75, 126.67, 126.24, 119.17, 116.51, 110.10, 42.46. Anal. Calcd. For C18H14ClN3O4(371.78): C, 58.15; H, 3.80; N, 11.30. Found: C, 58.19; H, 3.76; N, 11.26.
( E )-3-(4-((( Z )-5-브로모-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)- N -히드록시프로펜이미드(화합물 3d)
노란색 고체; 수율: 67%. mp: 205-207℃. R f = 0.47 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR (KBr,cm -1 ): 3431(NH), 3290(OH), 3089(C-H, aren), 2925(CH, CH2), 1715, 1656(C=O), 1603, 1462(C=C), 1433(C-N). ESI-MS(m/z):415.3[M-H]-. 1 H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 13.85 (1H, s, OH); 10.74 (1H, s, NH); 9.02 (1H, s, OH); 8.10 (1H, d, J=2.0Hz, H-4”); 7.56 (1H, dd, J=8.5Hz, J’=2.0Hz, H-6”); 7.52(2H, d, J=8.0Hz, H-2’, H-6’);7.42(1H, d, J=15.5Hz, H-3); 7.35(2H, d, J=8.0Hz, H-3’, H-5’); 6.95(1H, d, J=8.5Hz, H-7”), 6.43(1H, d, J=15.5Hz, H-2); 4.96(2H, s, H-7’a, H-7’b). 13 CNMR(125 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 162.76, 162.64, 142.54, 141.77, 137.78, 137.16, 134.21, 134.14, 128.92, 127.82, 127.72, 119.16, 116.92, 114.30, 111.59, 42.41. Anal. Calcd. For C18H14BrN3O4(416.23): C, 51.94; H, 3.39; N, 10.10. Found: C, 51.98; H, 3.42; N, 10.14.
( E )- N -히드록시-3-(4-((( Z )-3-(히드록시이미노)-5-메틸-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드(화합물 3e)
노란색 고체; 수율: 71%. mp: 195-196℃. R f = 0.46 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr,cm -1 ): 3226(OH), 3049(C-H, aren), 2921(CH, CH2), 1711, 1660(C=O), 1616, 1478(C=C), 1438(C-N). ESI-MS(m/z):349.9[M-H]-. 1 H-NMR(500MHz,DMSO-d 6 , ppm): δ 13.50 (1H, s, OH); 10.76 (1H, s, NH); 9.03 (1H, s, OH); 7.85 (1H, s, H-4”); 7.54 (2H, d, 8.0Hz, H-2’, H-6’); 7.41 (1H, d, J=15.5Hz, H-3); 7.34 (2H, d, J=8.0Hz, H-3’,H-5’); 7.16 (1H, d, J=7.5Hz, H-7”); 6.85 (1H, d, J=8.0Hz, H-6”); 6.41 (1H, d, J=16.0Hz, H-2); 4.92 (2H, s, H-7’a, H-7’b); 2.25 (3H, s, -CH3). 13 CNMR(125MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 163.27, 162.74, 143.58, 140.45, 137.89, 137.67, 134.08, 132.19, 131.94, 127.86, 127.76, 127.52, 119.11, 115.40, 109.35, 42.35, 20.52. Anal. Calcd. For C19H17N3O4(351.36): C, 64.95; H, 4.88; N, 11.96. Found: C, 64.99; H, 4.51; N, 11.92.
( E )- N -히드록시-3-(4-((( Z )-3-(히드록시이미노)-5-메톡시-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드(화합물 3f)
노란색 고체; 수율: 75%. mp: 201-202℃. R f = 0.38 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr,cm -1 ): 3212(OH), 3054(C-H, aren), 2884(CH, CH2), 1709, 1660(C=O), 1625, 1514, 1480(C=C), 1436(C-N). ESI-MS(m/z):368.3[M+H]+. 1 H-NMR (500MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 13.61 (1H, s, OH); 7.69 (1H, d, J=2.0Hz, H-4”); 7.52(2H, d, J=8.0Hz, H-2’, H-6’); 7.41(1H, d, J=15.5Hz, H-3); 7.34(2H, d, J=8.0Hz, H-3’, H-5’); 6.94(1H, dd, J=8.5, J’=2.5Hz, H-6”); 6.87(1H, d, J=8.5Hz, H-7”); 6.44(1H, d, J=15.5Hz, H-2); 4.92(2H, s, H-7’a, H-7’b), 3.74(4H, s, -OCH3). 13 CNMR (125MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 163.15, 162.70, 155.33, 143.70, 137.83, 137.67, 136.28, 134.12, 127.87, 127.80, 119.17, 116.90, 115.95, 113.28, 110.20, 55.68, 42.41. Anal. Calcd. For C19H17N3O5(367.36): C, 62.12; H, 4.66; N, 11.44. Found: C, 62.17; H, 4.62; N, 11.47.
( E )-3-(4-((( Z )-7-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)- N -히드록시프로펜아미드(화합물 3g)
노란색 고체; 수율: 72%. mp: 190-192℃. R f = 0.44 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr,cm -1 ): 3214(OH), 3054(C-H, aren), 2855(CH, CH2), 1717, 1659(C=O), 1602, 1514, 1470(C=C), 1442(C-N). ESI-MS(m/z): 370.6[M-2H]-. 1 H-NMR(500MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 13.90 (1H, s, OH); 10.74 (1H, s, NH); 9.01 (1H, s, OH); 8.10 (1H, dd, J=8.5Hz, J’=1.0Hz, H-4”); 7.52(2H, d, J=8.0Hz, H-2’, H-6’); 7.42(1H, d, J=15.5Hz, H-3); 7.38(1H, dd, J=8.5Hz, J’=1.0Hz, H-6”); 7.24(2H, d, J=8.0Hz, H-3’, H-5’); 7.12(1H, t, J=8.0Hz, H-5”), 6.42(1H, d, J=15.5Hz, H-2), 5.30(1H, s, H-7’a, H-7’b). 13 CNMR(125MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 163.90, 162.70, 142.11, 138.96, 138.43, 137.88, 133.80, 133.67, 127.76, 126.50, 125.95, 124.39, 118.91, 118.26, 114.58, 40.01. Anal. Calcd. For C18H14ClN3O4(371.78): C, 58.15; H, 3.80; N, 11.30. Found: C, 58.19; H, 3.86; N, 11.25.
(2) ( E )-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(메톡시이미노)-5/7-치환-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드(화합물 6a-6g)의 합성
피리딘 무수물(5 mL) 내에서 화합물 1a-1g (1 mmoL) 및 메톡실아민 하이드로클로라이드 (501 mg, 6 mmoL) 혼합물을 3 시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 상온까지 냉각시키고, 냉각된 HCl 5M (30 mL) 용액에 부었다. 침전물(화합물 4a-4g)을 물로 세정하고, 진공하의 40℃에서 24 시간 동안 건조시킨 후, 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. 상기 수득한 화합물 4a-4g를 DMF (3 mL)에 용해시켰다. 얻어진 용액을 -5℃로 냉각시키고 K2CO3 (165.5 mg, 1.2 mmoL)을 첨가하였다. 혼합물을 -5℃에서 1시간 및 상온에서 45 분간 각각 교반하고, CH3OH (0.5 mL) 및 KI (8.3 mg, 0.05 mmoL)을 첨가하였다. 15분간 교반한 후에, DMF(1 mL)내의 (E)-메틸 4-브로모메틸신나메이트(255 mg, 1 mmoL) 용액을 첨가하였고, 생성된 반응 혼합물을 60℃에서 24 시간 동안 교반하였다. 교반을 완료한 후, 반응 혼합물을 냉각시키고 10％ HCl로 pH가 ~ 4에 이를 때까지 산성화시키고 DCM (50 mL x 2)으로 추출하였다. 추출물을 모은 후에 DCM을 감압하에서 증발시켜 갈색-노란색의 오일 잔류물로서 화합물 5a-5g를 수득하였다.
상기 수득한 갈색-노란색의 오일(화합물 5a-5g)을 각각 메탄올/테트라하이드로퓨란 혼합물(1/1, 3 mL)에 용해시키고, 이렇게 얻은 각 화합물 용액을 -5℃으로 냉각시킨 후에 히드록실암모늄 클로라이드(195 mg, 10 mmoL)을 첨가하였다. NaOH(0.4 g, 10 mmoL)을 2 mL의 물에 용해시키고 -5℃ 까지 냉각시킨 후에 혼합물에 첨가하였다. 화합물 5a-5g가 완전히 반응할 때까지 혼합물을 -5℃에서 교반하였다. 반응 혼합물에 HCl 15％ 용액을 적가하여 pH 7으로 중성화시켜 침전을 유도하였다. 침전물을 여과하고, 물로 세정하고, 60℃에서 건조하고, 에탄올로부터 재결정화하여 화합물 6a-6g를 생성하였다.
( E )- N -히드록시-3-(4-((( Z )-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드(화합물 6a)
엷은 노란색 고체; 수율: 76%. mp: 207-208℃. R f = 0.43(DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr,cm -1 ): 3313(NH), 3220(OH), 3038(C-H,aren), 2938(CH,CH2), 1718, 1648(C=O), 1622, 1607, 1516(C=C), 1437(C-N). ESI-MS(m/z): 349.4[M-2H]-. 1 H-NMR(500MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 10.76 (1H, s, NH), 7.89 (1H, d, J=7.5Hz, H-4”), 7.52(2H, d, J=8.0Hz, H-2’, H-6’), 7.44-7.35(4H, m, H-3, H-3’, H-5’, H-5”), 7.07(1H, t, J=8.5Hz, H-6”), 6.98(1H, d, J=8.0Hz, H-7”), 6.44(1H, d, J=16.0Hz, H-2), 4.95(2H, s, H-7’a, H-7’b), 4.23(3H, s, -NOCH3), 13 CNMR(125MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 162.63, 162.41, 143.25, 143.16, 137.75, 137.31, 134.13, 132.85, 127.81, 127.75, 127.37, 122.95, 119.16, 115.01, 109.79, 64.53, 42.40. Anal. Calcd. For C19H17N3O4(351.36): C, 64.95; H, 4.88; N, 11.96. Found: C, 64.91; H, 4.92; N, 11.91.
( E )-3-(4-((( Z )-5-플루오로-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)- N -히드록시프로펜아미드(화합물 6b)
엷은 노란색 고체; 수율: 67%. mp: 194-195oC. R f = 0.41 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr, cm -1 ): 3426(NH), 3199(OH), 2946(CH, CH2), 1715(C=O), 1614, 1601, 1513, 1476(C=C), 1430(C-N). ESI-MS(m/z):368.0[M-H]-. 1 H-NMR(500MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 10.76 (1H, s, NH), 9.03 (1H, s, OH), 7.69 (1H, d, J=6.5Hz, H-4”), 7.52(2H, d, J=7.0Hz, H-2’, H-6’), 7.42(1H, d, J=15.5Hz, H-3), 7.36(2H, d, J=7.5Hz, H-3’, H-5’), 7.27(1H, t, J=7.5Hz, H-6”), 6.99(1H, s, H-7”), 6.44(1H, d, J=15.5Hz, H-2), 4.95(2H, s, H-7’a, H-7’b), 4.25(3H, s, -NOCH­3). 13 CNMR(125MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 162.66, 162.29, 158.99, 157.09, 142.87, 139.59, 137.75, 137.11, 134.17, 127.83, 127.76, 119.20, 118.99, 115.59, 115.51, 114.55, 114.34, 110.87, 110.81, 64.78, 42.53. Anal. Calcd. For C19H16FN3O4(369.35): C, 61.79; H, 4.37; N, 11.38. Found: C, 61.83; H, 4.41; N, 11.34.
( E )-3-(4-((( Z )-5-클로로-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)- N -히드록시프로펜아미드(화합물 6c)
노란색 고체; 수율: 70%. mp: 202-203℃. R f = 0.37 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr,cm -1 ): 3426(NH), 3224(OH), 2942(CH, CH2), 1722, 1661(C=O), 1608, 1467(C=C), 1444(C-N). ESI-MS(m/z):386.4[M+H]--. 1 H-NMR(500MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 10.75 (1H, s, NH), 9.02 (1H, s, OH), 7.87 (1H, d, J=2.0Hz, H-4”), 7.52(2H, d, J=8.0Hz, H-2’, H-6’), 7.46(1H, dd, J=8.5Hz, J’=2.0Hz, H-6”), 7.42(1H, d, J=16.0Hz, H-3), 7.35(2H, d, J=8.0Hz, H-3’, H-5’), 7.00(1H, d, J=8.0Hz, H-7”), 6.43(1H, d, J=15.5Hz, H-2), 4.95(2H, s, H-7’a, H-7’b), 4.26(3H, s, -NOCH3). 13 CNMR(125MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 162.62, 162.08, 142.41, 142.02, 137.72, 136.97, 134.17, 132.26, 127.81, 127.72, 126.79, 126.64, 119.20, 116.21, 111.34, 64.85, 42.52. Anal. Calcd. For C19H16ClN3O4(385.80): C, 59.15; H, 4.18; N, 10.89. Found: C, 59.19; H, 4.21; N, 10.83.
( E )-3-(4-((( Z )-5-브로모-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)- N -히드록시프로펜아미드(화합물 6d)
노란색 고체; 수율: 65%. mp: 190-191℃. R f = 0.42 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr, cm -1 ): 3435(NH), 2942(CH, CH2), 1723, 1627(C=O), 1604, 1516, 1466(C=C), 1437(C-N). ESI-MS(m/z):429.9[M-H]-. 1 H-NMR(500MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 8.00 (1H, s, H-4”), 7.65-7.51(4H, m, H-6”, H-2’, H-6’, H-3), 7.43-7.34 (2H, m, H-3’, H-5’), 6.96(1H, d, J=8.0Hz, H-7”), 6.50-6.41(1H, m, H-2), 4.98-4.95(2H, m, H-7’a, H-7’b), 4.26(3H, s, -NOCH3). 13 CNMR(125MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 167.43, 161.98, 143.27, 142.40, 142.38, 142.27, 137.78, 137.71, 135.08, 133.56, 129.32, 128.51, 127.79, 127.69, 127.64, 119.28, 119.19, 116.64, 114.43, 111.81, 64.86, 42.49. Anal. Calcd. For C19H16BrN3O4(430.25): C, 53.04; H, 3.75; N, 9.77. Found: C, 53.11; H, 3.79; N, 9.72.
( E )- N -히드록시-3-(4-((( Z )-3-(메톡시이미노)-5-메틸-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드(화합물 6e)
엷은 노란색 고체; 수율: 68%. mp: 193-194℃. R f = 0.44 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr,cm -1 ): 3428(NH), 3296(OH), 2938, 2856(CH, CH2), 1709, 1669(C=O), 1616, 1594, 1516, 1480(C=C), 1441(C-N). ESI-MS(m/z):364.1[M-H]-. 1 H-NMR(500MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 10.74 (1H, s, NH), 9.01 (1H, s, OH), 7.74 (1H, s, H-4”), 7.51 (2H, d, J=8.0Hz, H-2’, H-6’), 7.41(1H, d, J=16.0Hz, H-3), 7.43(2H, d, J=8.0Hz, H-3’, H-5’), 7.20(1H, d, J=7.5Hz, H-7”), 6.87(1H, d, J=8.0Hz, H-6”), 6.42(1H, d, J=16.0Hz, H-2), 4.93(2H, s, H-7’a, H-7’b), 4.23(3H, s, -NOCH3), 2.26(3H, s, -CH3). 13 CNMR(125MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 162.61, 162.39, 143.28, 141.03, 137.75, 137.38, 134.07, 133.05, 132.07, 127.83, 127.78, 127.70, 119.11, 115.05, 109.58, 64.48, 42.37, 20.40. Anal. Calcd. For C20H19N3O4(365.38): C, 65.74; H, 5.24; N, 11.50. Found: C, 65.77; H, 5.21; N, 11.54.
( E )- N -히드록시-3-(4-((( Z )-3-(메톡시이미노)-5-메톡시-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드(화합물 6f)
엷은 노란색 고체; 수율: 71%. mp: 201-202℃. R f =0.42(DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr, cm -1 ): 3413(NH), 3214(OH), 3018(C-H,aren), 2942(CH, CH2), 1699(C=O), 1617, 1595, 1478(C=C). ESI-MS (m/z): 379.4 [M-2H]-. 1 H-NMR(500MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 10.73 (1H, s, NH), 9.01 (1H, s, OH), 7.52 (2H, d, J=8.0Hz,H-2’,H-6’), 7.49(1H, d, J=2.5Hz, H-4”), 7.41(1H, d, J=16.0Hz, H-3), 7.34(2H, d, J=8.0Hz, H-3’, H-5’), 6.99(1H, dd, J=8.0Hz, J’=2.5Hz, H-6”), 6.90(1H, d, J=8.5Hz, H-7”), 6.42(1H, d, J=16.0Hz, H-2), 4.92(2H, s, H-7’a, H-7’b), 4.24(3H, s, =NOCH3), 3.72(3H, s, -OCH3). 13 CNMR(125MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 162.63, 162.25, 155.32, 143.41, 137.76, 137.40, 136.82, 134.09, 127.79, 127.73, 119.12, 117.61, 115.57, 113.80, 110.40, 64.60, 55.69, 42.42. Anal. Calcd. For C20H19N3O5(381.38): C, 62.99; H, 5.02; N, 11.02. Found: C, 63.06; H, 5.10; N, 10.91.
( E )-3-(4-((( Z )-7-클로로-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)- N -히드록시프로펜아미드(화합물 6g)
엷은 노란색 고체; 수율: 75％. mp: 203-204℃. R f = 0.39 (DCM : MeOH : AcOH = 90 : 5 : 1). IR(KBr, cm -1 ): 3307(NH), 3204 (OH), 3018 (C-H, aren), 2938 (CH, CH2), 1722, 1662(C=O), 1624, 1601, 1514, 1470(C=C), 1442(C-N). ESI-MS(m/z): 383.3[M-2H]-. 1 H-NMR(500MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 10.74 (1H, s, NH), 9.01 (1H, s, OH), 7.98(1H, d, J=7.5Hz, H-4”), 7.51(2H, d, J=8.0Hz, H-2’, H-6’), 7.44-7.41(2H, m, H-3, H-6”), 7.25(2H, d, J=8.0Hz, H-3’, H-5’), 7.12(1H, t, J=8.0Hz, H-5”), 6.42(1H, d, J=16.0Hz, H-2), 5.28(2H, s, H-7’a, H-7’b), 4.27(3H, s, -NOCH3). 13 CNMR(125MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 163.12, 162.69, 141.91, 139.06, 138.74, 137.85, 134.68, 133.70, 127.76, 126.50, 126.44, 124.49, 118.94, 117.98, 114.79, 64.95, 44.14. Anal. Calcd. For C19H16ClN3O4(385.80): C, 59.15; H, 4.18; N, 10.89. Found: C, 59.18; H, 4.21; N, 10.84.
3. 항암활성 평가를 위한 암세포주에 대한 세포독성 분석
SW620 (대장암세포), PC3 (전립선암세포), 및 AsPC-1(췌장암세포) 세포주의 인간암세포주는 한국생명공학연구소(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology, KRIBB)에 있는 암세포 은행으로부터 구입하였다. 세포 배양에 사용한 배지, 혈청 및 다른 시약들은 GIBCO Co. Ltd. (Grand Island, New York, USA)으로부터 구입하였다. 세포들을 96웰 플레이트에 9 x 103 세포/웰의 농도로 플레이팅하고, 하룻밤 인큐베이션하여 48시간 동안 시료로 처리하였다. 테스트하는 화합물들은 디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해시켜 사용하였다. 세포독성은 공지된 문헌[21]에 기재된 내용에 약간의 변형을 가한 방법[20, 22-23]을 통해 측정하였다. IC50 값은 Probits 방법[24]에 따라 산출하였다. 각 화합물에 대해 측정한 값은 3회의 독립적 측정결과의 평균값으로 나타내었다.
4. HDAC 억제 활성 평가를 위한 단백질 분석(웨스턴 블로팅 분석)
RIPA 완충액(50 mM TrisCl [pH 8.0], 5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1％ NP-40, 0.1％ SDS, 및 1 mM 페닐메틸술포닐 플루오라이드)내에서 세포를 용해시켜 총 단백질 추출물을 얻었다. 용해물내의 단백질 농도는 Bio-Rad 단백질 분석 키트(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA)를 사용하여 측정하였다. 시료를 SDS-PAGE젤상에서 분리하고 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 이동시켰다. 멤브레인을 블로킹 완충액(0.2％ Tween-20 및 3％ 탈지유를 포함하는 TBS)과 함께 둔 후, 아세틸 히스톤-H3, -H4, 및 GAPDH에 대한 1차 항체를 사용하여 탐지하였다. 세정후에 멤브레인을 양고추냉이(horseradish) 퍼옥시다아제-컨쥬게이트된 2차 항체를 사용하여 탐지하였다. 검출은 ECL(enhanced chemiluminescent protein) 검출 시스템(Amersham Biosciences, Little Chalfont, UK)을 사용하여 행하였다.
5. HDAC2 효소 분석
HDAC2 효소는 BPS Bioscience (San Diego, CA, USA)로부터 구입하고, HDAC 효소 활성 분석은 제조사 지시서에 따라 형광 HDAC 분석 키트 (BPS Bioscience)를 사용하여 행하였다. 간략히 설명하면, HDAC2 효소들을 HDAC 형광 기질의 존재하에서 37℃에서 30분간 다양한 농도의 KBH-A42 또는 비히클(vehicle)과 함께 인큐베이션하였다. 반응 혼합물에서 형광단을 생성하는 HDAC 분석 현상액을 첨가하고, VICTOR3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA)을 사용하여 여기 파장 360 nm 및 방출 파장 460 nm으로 형광을 측정하였다. 측정된 활성에서 비히클-처리된 대조군 효소 활성을 차감하고, IC50 값은 GraphPad Prism (GraphPad Software, San Diego, CA, USA)을 사용하여 측정하였다.
6. 도킹연구
AutoDock Vina program [25] (The Scripps Research Institute, CA, USA)를 사용하여 도킹 연구(docking study)를 수행하였다. SAHA와의 복합체를 형성하는 HDAC2 [26]의 초기 구조들은 Protein Data Bank (PDB) (PDB ID: 4LXZ)으로부터 얻었고, 화합물들에 대한 좌표들은 GlycoBioChem PRODRG2 Server (http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/prodrg/) [27]를 사용하여 생성하였다. 도킹 연구에 대한 그리드 맵(grid map)은 SAHA 결합자리상의 중앙에 위치하게 하였고, 복합체 구조로부터 SAHA를 제거한 후에 1.0 의 간격으로 26 x 26 x 22 포인트를 포함하도록 하였다[17-20]. AutoDock Vina program을 eight-way multithreading으로 수행시키고, 다른 파라미터들은 AutoDock Vina program에서 디폴트 세팅으로 하였다.
Ⅱ. 실험결과 및 고찰
1. 화합물의 합성
N-히드록시프로펜아미드(3a-3g)의 합성은 하기 반응도 1에 설명되어 있다. 최초 단계에서, 이사틴 및 이의 5- 또는 7-치환된 유도체들을 알칼리 조건(K2CO3)하에서 KI의 촉매적 양과 함께 디메틸포름아미드(DMF)내에서 메틸4-브로모메틸신나메이트의 동량의 몰로 반응시켜 갈색-노란색 오일로서 신나메이트 중간체 2a-2h를 전체 좋은 수율(85-96％)로 생성하였다. 이어서, 염기성 조건하에서 히드록실아민에 의해 신나메이트 2a-2h를 친핵성 아실 치환함으로써 높은 수율로 최종 프로펜아미드를 생성하였다.
3-메톡시이미노-2-옥소인돌린 N-히드록시프로펜아미드(6a-6g)도, 먼저 이사틴 1a-1g을 무수 피리딘내에서 환류조건하에서 메톡실아민 하이드로클로라이드를 사용하여 3-메톡시이미노-2-옥소인돌 유도체 4a-4g로 전환시킨 것을 제외하고는 상기 설명된 방법과 유사한 방법을 통해 합성하였다(하기 반응도 2 참조).
최종 생성물들의 구조는 IR, MS, 1H NMR 및 13C NMR와 같은 분광학적 방법을 사용하여 분명하게 확인하였다. 히드록실아민은 에스테르 화합물 2a-2g의 인돌린 부위 상의 에스테르 및 3-옥소 그룹 양쪽에 반응하여 3-히드록시이미노-2-옥소인돌린 N-히드록시프로펜아미드(3a-3g)를 생성하였다. 이는 화합물 3a-3g의 질량분광데이터 및 1H NMR 스펙트럼에서 H-4′(δ 8.01-7.78 ppm)의 다운필드 쉬프트(downfield shift)로부터 명확히 알 수 있었다. H-4의 다운필드 쉬프트는 인돌환상의 3번 위치에서의 히드록시이미노 그룹의 존재를 지시하였다[20]. 또한, 일반적으로 DMSO-d 6 에서 측정된 화합물 3a-3g의 1H NMR 스펙트럼에서, 3개의 넓은 1중선(singlet)들이 δ 9.02, 10.75, 및 13.50 - 13.80 ppm 부근에서 나타났는데, 이들은 -OH, -NH (히드록삼산 부분), 및 -OH (인돌환상의 3-히드록시이미노 부분)에 기여하였다. 화합물 3a-3g의 13C NMR 스펙트럼에서, δ 184.00-188.00 ppm 부근에서 나타나야만 하는[20] 인돌환상의 3-옥소 탄소에 대응하는 피크는 발견되지 않았다. 이러한 증거들은 인돌린 부분상의 3-히드록시이미노 그룹의 존재를 더욱 확인하여 주었다. 에스테르 그룹과 인돌환상의 3-옥소 그룹에서 히드록실아민의 동시적 반응은 이전의 동일한 조건하에서 관찰되었었다[20]. 히드록실아민.HCl의 몰 동량을 감소시켜 3-옥소 그룹을 온전하게 유지시키려는 노력은 성공적이지 못하였다. 대응하는 에스테르 중간체에 대해 1:1 몰동량으로 사용하였을 경우에도 반응하지 않은 출발물질(에스테르)과 함께 많은 생성물의 혼합물이 관찰되었고, 이 때문에 표적 생성물을 분리하기가 불가능하였다.
[반응도 1]
Figure 112014109522042-pat00009
상기 반응도 1은 3-옥심-2-옥소인돌린-기반-N-히드록시프로펜아미드의 합성 반응도이다. 시약 및 조건은 다음과 같다: a) 메틸 4-브로모메틸신나메이트, K2CO3, KI, DMF, 60℃, 24 hrs; b) NH2OH.HCl, NaOH, MeOH/THF, -5℃, 30-60분.
[반응도 2]
Figure 112014109522042-pat00010
상기 반응도 2는 3-메톡심-2-옥소인돌린-기반 N-히드록시프로펜아미드의 합성 반응도이다. 시약 및 조건은 다음과 같다: a) NH2OCH3.HCl, 피리딘, DMF; b) 메틸 4-브로모메틸신나메이트, K2CO3, KI,, DMF, 60℃, 24 hrs; c) NH2OH.HCl, NaOH, MeOH/THF, -5℃, 30-60 분.
2. 생물학적 활성 측정
합성한 모든 히드록삼산(화합물 3a-3g, 6a-6g)에 대해 웨스턴 블로팅(western blot) 분석법을 사용하여 히스톤-H3 및 히스톤-H4의 억제 활성을 평가하였다. 일반적으로 히스톤 탈아세틸화는 주로 HDACs에 의해 결정되기 때문에, 화합물들의 HDAC 억제 효과는 히스톤 탈아세틸화 수준을 억제할 수 있는 능력으로 상정될 수 있다. 도 3에서 보여지는 바와 같이, 공지된 HDAC 억제제인 SAHA의 존재하에서는 아세틸-히스톤 H3 및 아세틸-히스톤 H4의 수준이 강하게 나타났는데, 이러한 사실은 HDAC이 강하게 억제되어 히스톤 H3 및 히스톤 H4상의 아세틸 그룹을 제거할 수 없다는 것을 시사한다. 이와 유사하게, 아세틸-히스톤 H3 및 아세틸-히스톤 H4의 수준은 화합물 3a, 3b, 3d-f, 6a-c, 6d, 및 6e의 존재하에서 명확하게 나타나, 화합물들에 의해 HDAC 활성이 크게 억제되었다는 사실을 암시하였다. 화합물 3c의 존재하에서는 아세틸-히스톤 H3 및 아세톤-히스톤 H4가 여전히 관찰되었으나, 더욱 약한 수준으로 나타났다. 따라서, 화합물 3c는 활성을 보유하고 있었지만, 상기한 화합물들 보다 더욱 약하게 나타났다. 이와 대조적으로, 아세틸-히스톤 H3 및 아세틸-히스톤 H4의 수준은 화합물 3g 및 화합물 6g의 존재하에서 거의 관찰되지 않았는데, 이는 HDAC들이 여전히 활성을 가지고 있으며, 히스톤-H3 및 히스톤-H4를 탈아세틸화시켰다는 것을 지시한다. 이러한 결과들은 7번 위치에서 염소(chlorine) 및 가능한 다른 치환체에 의한 치환이 생물학적 활성에 바람직하지 않은 반면, 5번 위치에서는 다양한 치환체에 대해 감내할 수 있을 정도이었다.
이와 대조적으로, 화합물 3c는 HDAC2 분석에서 IC50 값이 0.086 μM을 나타내어 강력한 항암 활성을 나타내었으나, 웨스턴 블로팅 분석에서는 약한 활성을 나타내었다. 히스톤-H3 및 히스톤-H4가 HDAC2 및 HDAC3의 기질이기 때문에[28], HDAC3는 화합물 3c에 의해 여전히 억제되지 않은 것 같았다. 이와 유사한 설명이 화합물 3g, 6d, 및 6g에도 적용될 수 있을 것이다.
다음으로, 합성한 화합물들에 대해 SRB (sulforhodamine B) 세포 증식 분석을 사용하여 암세포에 대한 항증식활성을 평가하였다. 먼저, 화합물들에 대해 SW620 (인간대장암) 세포주에 대해 30 μM에서 세포성장억제 활성을 스크리닝하였다. 모든 화합물 3a-3g 및 6a-6g는 이러한 농도에서 SW620 세포의 성장을 완전히 억제하였다. 따라서, 화합물들을 추가적으로 5개의 농도(30, 10, 3, 1, 0.3 )에서 SW620 세포주 및 다른 인간 암세포주인 PC-3(전림선암) 및 AsPC-1(췌장암) 세포주에 대해서도 세포성장의 억제 분석을 행하였다. 각 화합물들의 IC50 값(50％의 세포 증식 억제를 일으키는 농도)을 측정하여 하기 표 1에 정리하였다. SAHA를 양성 대조군으로 사용하였다.
표 1의 데이터에서 화합물 6f를 제외한 모든 화합물들은 분석한 3주의 암세포주에 대한 세포독성의 면에서 SAHA와 비교하여 동등하거나 우수한 항암활성을 나타내었다. 또한 테스트한 3주의 모든 암세포주에서 화합물 3a 및 화합물 3b는 동등한 암세포주 세포독성을 나타내었는데, 이는 화합물 3a에서 옥심(oxime)에서의 메틸화가 세포독성에 대해 견딜만한 것이라는 점을 지시한다. 인돌 부위상의 5번 위치에서 전자끌기그룹(-F, -Cl, -Br)의 치환(화합물 3b-3d, 6b-6d)은 세포독성을 증가시키는 것처럼 보인 반면, 7번 위치에서의 치환(화합물 3g 및 6g)은 생물학적 활성에서 덜 바람직한 것처럼 보였다. 전자주개그룹(-CH3, -OCH3)들 중에서도, 메틸 그룹만이 암세포에 대한 세포독성을 약간 증가시켰는데(화합물 3e, 6e vs. 화합물 3a, 6a), 반면 메톡시 그룹은 그렇지 않았다(화합물 3f). 인돌환 상에 5-메톡시 치환체 및 메톡심(methoxime)이 동시에 존재하는 경우 세포독성을 더욱 감소시켰다(화합물 6f). 이러한 결과는 이들 화합물들의 생물학적 활성이 인돌 부위 상의 치환체들의 부피(bulkiness)에 매우 민감할 수 있다는 것을 암시한다.
암세포에 대한 세포독성과, HDAC2 또는 히스톤-H3 및 히스톤-H4 탈아세틸화에 대한 화합물의 억제적 효과 사이의 연관성과 관련하여, 시리즈 화합물 3a-3h 내에서 비교적 좋은 상관성이 나타났다. 웨스턴 블로팅 분석에서 활성을 나타내었으며 HDAC2 활성에 대해 우수한 억제 활성을 나타낸 화합물 3a-3f는 모든 3주의 암세포주에 대해(화합물 3b-3e) 또는 3주의 암세포주 중의 적어도 2주의 암세포주에 대해(화합물 3a 및 화합물 3f) 현저히 우수한 암세포주 세포독성을 나타내었다. 반면에, 웨스턴 블롯 분석에서 비활성이고 HDAC2에 대해 가장 높은 IC50 값을 나타낸 화합물 3g은 화합물 시리즈 3a-3g에서 가장 약한 암세포주 세포독성을 나타내는 화합물이었다. 화합물 시리즈 6a-6g에서도 화합물 6d를 제외하고 이와 유사한 상관관계가 나타났다. 화합물 6d는 웨스턴 블롯 분석에서 활성을 나타내지 않았고 HDAC2에 대해 비교적 높은 IC50 값을 보여주었다(1.320 μM). 그러나, 3주의 암세포주에 대한 분석에서, 이 화합물은 강력한 암세포 세포독성을 나타내었다. 다른 타입의 HDAC 효소들은 화합물 6d에 의해 영향을 받아 전체적으로 여전히 세포 성장 억제에 이른다. 물론, HDAC 억제 이외에, 화합물 6d에 의한 다른 세포독성 메카니즘이 배제될 수 없다. 따라서 이들 화합물들의 HDAC 억제와 암세포 세포독성 사이의 완전한 상관관계를 가져서, 잔존하는 HDAC 서브 타입들에 대해서는 추가적인 실험 수행이 필요하다. 그럼에도 불구하고, 본 발명의 3-치환된-2-옥소인돌 기반 N-히드록시프로펜아미드들은 강한 HDAC 억제자 및 세포독성제로서 유망하다.
Figure 112014109522042-pat00011
상기 표 1에서 윗첨자 1은 ChemDraw 9.0 소프트웨어로 계산하였다; 윗첨자 2은 효소 활성 또는 세포 성장을 50％ 감소시키는 화합물들의 농도(μM)이고, 숫자는 10％ 미만의 오차를 갖는 3회 반복 실험의 평균결과이다; 윗첨자 3은 각각 SW620, 대장암; PC3, 전립선암; AsPC-1, 췌장암의 세포주이다; 윗첨자 4 은 양성대조군으로서 SAHA(suberoylanilide acid)이다.
3. 도킹 연구 결과
합성한 화합물들과 HDAC과의 사이의 상호작용에 대한 기작을 연구하기 위해, HDAC 활성자리를 사용하여 도킹(docking, 결합) 실험을 수행하였다. 히스톤-H3 및 히스톤-H4 탈아세틸화가 HDAC2 및 HDAC3에 의해 주로 조절되기 때문에[28], 도킹 주형으로서 SAHA와 복합체를 형성한 HDAC2의 구조를 선택하였다. SAHA와의 복합체로서 HDAC2의 결정 구조는 Lauffer 및 공동연구자들에 의해 보고되어 있다[26]. 선행문헌 등에 공지된 바와 같이[17-20], SAHA를 복합체 구조로부터 제거한 후에 AutoDock Vina program[25]을 사용하여 HDAC2의 결정구조에 대해 SAHA와 함께 대조군 도킹 실험을 수행하였다. 도킹 실험결과, 합성된 모든 화합물들은 SAHA 보다 높은 결합 친화도를 가지면서 활성자리에 위치함을 확인하였는데, 이들 화합물들의 안정화에너지는 -8.3 kcal/mol 내지 -9.4 kcal/mol으로서 SAHA와 비교하여 매우 낮은 값을 가졌다. 예를 들어, HDAC2에 대한 예상되는 결합 모드의 안정화 에너지는 화합물 3b 및 6b에 대해 각각 -9.0 kcal/mol 및 -8.6 kcal/mol가 될 것으로 계산되었는데, 반면 SAHA에 대한 안정화 에너지 값은 -7.4 kcal/mol이었다(결정구조에서 원래 SAHA로부터의 r.m.s.d 거리는 0.609/2.056 이다). 도킹 실험결과, 아연 이온(회색 구)은 HDAC2의 3개 잔기인 Asp181, His183 및 Asp269에 의해 배위결합 되었다. 합성된 화합물들 모두는 SAHA의 방식과 유사한 방식으로 아연이온과 결합하였다. 모든 화합물들에서, 인돌린과 N-히드록시프로펜아미드 부위를 연결하는 벤젠이 효소의 Phe155 및 Phe210 사이에 단단히 끼워져 들어가는 것이 확인되었고(도 4 참조), 이러한 끼워져 들어가는 구조에 의한 상호작용이 화합물들과 HDAC2와의 높은 결합 친화도에 기여할 것이다. 그러나, 이러한 도킹 실험에서 인돌린 부분은 효소와 미미한 상호작용을 하는 것으로 나타났다. 따라서, 상이한 치환기를 갖는 화합물들 사이에서 결합 친화도는 거의 변화가 없었다. 예를 들어, 화합물 3g 및 화합물 6g의 HDAC2에 대한 결합 모드의 예측 안정화 에너지는 각각 -8.9 kacl/mol 및 -8.4 kcal/mol 이었다. 이러한 수치들은 화합물 6b 및 화합물 6g의 것과 거의 유사한 수준이었다. 따라서, 결합 안정화 에너지의 차이는 HDAC2 효소 억제 분석(표 1)에서 화합물 3b 및 화합물 3g의 IC50 값의 3배 차이 또는 화합물 6b 및 화합물 6g의 IC50 값에서 5배 차이를 설명하기는 어렵다. 그럼에도 불구하고, 화합물 6g의 결합 안정화 에너지는 SAHA 보다 매우 낮았는데(각각, -8.4 kcal/mol vs. -7/4 kcal/mol), 이는 HDAC2에 대해 SAHA의 것(IC50, 1.840 μM)과 비교하여 이 화합물의 비교적 높은 억제(IC50, 1.399 μM)를 설명할 수 있을 것이다.
Ⅲ. 결론
본 발명자들은 강력한 HDAC 억제 효과 및 강한 암세포 세포독성을 갖는 3-치환된-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미드의 2개의 시리즈 화합물을 합성하였다. 상기 실험결과에서 얻어진 결과로부터 명확한 바와 같이, 다양한 치환체가 3-히드록시이미노-2-옥소인돌린 또는 3-메톡시이미노-2-옥소인돌린의 5번 위치 및 7번 위치 모두에 도입되었으나, 생물학적 활성이 그대로 유지되었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (8)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
    [화학식 1]
    Figure 112014109522042-pat00012

    상기 화학식 1에서 R1은 수소 또는 메틸이고, R2는 수소, 할로겐, C1-6의 알킬, 또는 C1-6의 알콕시이다.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 할로겐은 플루오르(F), 염소(Cl) 또는 브롬(Br)인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 화합물은 다음의 화합물 중 어느 하나인 것을 특징으로 하는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염:
    (E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드;
    (E)-3-(4-(((Z)-5-플루오로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
    (E)-3-(4-(((Z)-5-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
    (E)-3-(4-(((Z)-5-브로모-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜이미드;
    (E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(히드록시이미노)-5-메틸-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드;
    (E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(히드록시이미노)-5-메톡시-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드;
    (E)-3-(4-(((Z)-7-클로로-3-(히드록시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
    (E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드;
    (E)-3-(4-(((Z)-5-플루오로-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
    (E)-3-(4-(((Z)-5-클로로-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
    (E)-3-(4-(((Z)-5-브로모-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드;
    (E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(메톡시이미노)-5-메틸-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드;
    (E)-N-히드록시-3-(4-(((Z)-3-(메톡시이미노)-5-메톡시-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)프로펜아미드; 및
    (E)-3-(4-(((Z)-7-클로로-3-(메톡시이미노)-2-옥소인돌린-1-일)메틸)페닐)-N-히드록시프로펜아미드.
  4. 상기 청구항 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항 기재 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 항암용 약제학적 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 암은 유방암, 폐암, 위암, 간암, 혈액암, 뼈암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부 또는 안구 흑색종, 자궁육종, 난소암, 직장암, 항문암, 대장암, 난관암, 자궁내막암, 자궁경부암, 소장암, 내분비암, 갑상선암, 부갑상선암, 신장암, 연조직종양, 요도암, 전립선암, 기관지암, 또는 골수암인 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염은 히스톤 탈아세틸화효소(histone deacetylase)의 억제를 통해 히스톤의 아세틸화를 촉진하는 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항암용 약제학적 조성물.
  7. 다음의 단계를 포함하는 상기 청구항 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항 기재 화합물 중 3-히드록시이미노-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미드계 화합물의 제조방법:
    (i) 염기성 조건하에서 하기 화학식 (a-1)의 화합물과 메틸 4-브로모메틸신나메이트를 반응시켜 하기 화학식 (a-2)의 화합물을 생성하는 단계; 및
    [화학식 (a-1)]
    Figure 112014109522042-pat00013

    [화학식 (a-2)]
    Figure 112014109522042-pat00014

    (ⅱ) 상기 생성된 화학식 (a-2)의 화합물과 히드록실아민을 반응시켜 하기 화학식 (a-3)의 화합물을 생성하는 단계.
    [화학식 (a-3)]
    Figure 112014109522042-pat00015

    단, 상기 화학식 a-1 내지 화학식 a-3에서 R은 수소, 할로겐, C1-6의 알킬, 또는 C1-6의 알콕시이다.
  8. 다음의 단계를 포함하는 상기 청구항 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항 기재 화합물 중 3-메톡시이미노-2-옥소인돌린 기반 N-히드록시프로펜아미드계 화합물의 제조방법:
    (i′) 염기성 조건하에서 하기 화학식 (a-1)의 화합물과 메톡실아민 하이드로클로라이드를 반응시켜 하기 화학식 (a-4)의 화합물을 생성하는 단계;
    [화학식 (a-1)]
    Figure 112014109522042-pat00016

    [화학식 (a-4)]
    Figure 112014109522042-pat00017

    (ⅱ′) 상기 생성된 화학식 (a-4)의 화합물과 메틸 4-브로모메틸신나메이트를 반응시켜 하기 화학식 (a-5)의 화합물을 생성하는 단계; 및
    [화학식 (a-5)]
    Figure 112014109522042-pat00018

    (ⅲ′) 상기 생성된 화학식 (a-5)의 화합물과 히드록실아민을 반응시켜 하기 화학식 (a-6)의 화합물을 생성하는 단계.
    [화학식 (a-6)]
    Figure 112014109522042-pat00019

    단, 상기 화학식 a-1 내지 화학식 a-6 에서 R은 수소, 할로겐, C1-6의 알킬, 또는 C1-6의 알콕시이다.
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