KR101617883B1

KR101617883B1 - 젖산 내성 강화능 및 고생산능을 갖는 루코노스톡 메센테로이데스 lma92a 균주 및 이를 이용한 젖산 생산 방법

Info

Publication number: KR101617883B1
Application number: KR1020140067555A
Authority: KR
Inventors: 이평천; 이형주
Original assignee: 아주대학교 산학협력단
Priority date: 2014-06-03
Filing date: 2014-06-03
Publication date: 2016-05-04
Anticipated expiration: 2034-06-03
Also published as: KR20150139675A

Abstract

본 발명은 젖산 내성 강화능 및 고생산능을 갖는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주, 상기 균주를 이용하는 젖산의 생산 방법 및 젖산 내성 강화 균주의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주는 모균주에 비해 젖산에 대한 내성이 강화되고 D형 젖산 생산능이 현저하게 우수하여, 젖산 및 PLA 상업화 기술뿐만 아니라 D형 젖산을 원료로 사용하는 각종 제품의 생산성을 향상시키는데 널리 활용될 수 있다.

Description

젖산 내성 강화능 및 고생산능을 갖는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주 및 이를 이용한 젖산 생산 방법{Leuconostoc mesenteroides LMA92A having enhancing tolerance and producing capacity to Lactic acid and method for producing lactic acid using the same}

본 발명은 젖산 내성 강화능 및 고생산능을 갖는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주, 상기 균주를 이용하는 젖산의 생산 방법 및 젖산 내성 강화 균주의 제조방법에 관한 것이다.

젖산균(lactic acid bacteria)은 글루코스 등 당류를 분해하여 젖산을 생성하는 세균으로 유산균이라고도 한다. 주요 젖산균으로는 락토코쿠스속(Lactococcus sp.), 락토바실러스속(Lactobacillus sp.), 루코노스톡속(Leuconostoc sp.), 페디오코커스속(Pediococcus sp.) 및 스트렙토코쿠스속(Streptococcus sp.) 등이 있으며, 그람 양성균이고, 통성혐기성 또는 혐기성인 특징이 있다. 젖산은 산미제, 부패균 억제제, 화장품 및 바이오 플라스틱 등으로 식품 및 생명공학 산업에 다양하게 사용되는 물질이며, 구조에 따라 L형 젖산 및 D형 젖산으로 분류된다.

상기 L형 젖산 및 D형 젖산은 여러 분야에서 이용되고 있으며, 이 중 바이오 플라스틱 분야의 소재로서의 이용에 관한 연구가 진행되고 있다. 특히, 여러 생분해성 플라스틱 중에서 상기 L형 젖산 및 D형 젖산을 중합한 PLA(ploy-lactic acid)가 기존 플라스틱을 대체할 수 있는 유망한 소재로 이와 관련한 연구가 활발히 진행되고 있다. L형 젖산을 중합한 PLLA는 열 안정성과 충격 안정성 문제가 발생하여 그 응용 범위가 한정되어 있으나, D형 젖산을 중합한 PDLA를 착화(complexing)하여 만든 PLA는 녹는점 및 결정화도가 상기 PLLA보다 증가된 것이 특징이다. 이에 따라, 상기 D형 젖산을 이용한 PLA의 응용 범위가 넓어지면서 D형 젖산에 대한 연구가 증가하는 추세이다. 또한, PLA 중합 시 고순도의 젖산이 요구됨에 따라, 화학적 공정으로 생산한 젖산보다는 생물학적 공정에 따른 젖산 생산이 선호되고 있다.

이에 본 발명자는 젖산균을 이용하여 D형 젖산의 생산성을 증가시키기 위한 연구를 지속한 결과, 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주에 고강도의 스트레스 조건을 주어 돌연변이를 유발시킨 신규한 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주를 선발하고, 상기 균주는 젖산 내성이 강화되고 D형 젖산 고생산능이 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

한국등록특허 101020153 한국등록특허 101041440 한국등록특허 101381547

Journal of microbiology and biotechnology(2013), 23(6) : 837-842 Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre(2015), 6(2): 55-61

본 발명의 목적은 젖산 내성 강화능 및 고생산능을 갖는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A(Leuconostoc mesenteroides LMA92A, KCTC18266P)를 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은, (a) 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A(KCTC18266P) 균주를 배지에 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양 배지로부터 젖산을 수득하는 단계;를 포함하는 젖산의 생산방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 (a) 균주를 젖산이 포함된 배지에 배양하여 1차 배양물을 수득하는 단계; (b) 상기 1차 배양물을 젖산이 포함된 배지와 혼합하고, 상기 혼합물을 다시 배양하여 2차 배양물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 2차 배양액을 브로모크레졸 그린 및 탄산칼슘이 첨가된 배지와 혼합하고, 상기 혼합물을 배양하여 젖산 내성 균주를 선발하는 단계;를 포함하는 젖산 내성 강화 균주의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 젖산 내성 강화능 및 고생산능을 갖는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A(Leuconostoc mesenteroides LMA92A, KCTC18266P)를 제공한다.

또한 본 발명은, (a) 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A(KCTC18266P) 균주를 배지에 배양하는 단계; 및 (b) 상기 배양 배지로부터 젖산을 수득하는 단계;를 포함하는 젖산의 생산방법을 제공한다.

또한 본 발명은 (a) 균주를 젖산이 포함된 배지에 배양하여 1차 배양물을 수득하는 단계; (b) 상기 1차 배양물을 젖산이 포함된 배지와 혼합하고, 상기 혼합물을 다시 배양하여 2차 배양물을 수득하는 단계; 및 (c) 상기 2차 배양액을 브로모크레졸 그린 및 탄산칼슘이 첨가된 배지와 혼합하고, 상기 혼합물을 배양하여 젖산 내성 균주를 선발하는 단계;를 포함하는 젖산 내성 강화 균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주는 모균주에 비해 젖산에 대한 내성이 강화되고 D형 젖산 생산능이 현저하게 우수하여, 젖산 및 PLA 상업화 기술뿐만 아니라 D형 젖산을 원료로 사용하는 각종 제품의 생산성을 향상시키는데 널리 활용될 수 있다.

도 1은 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 돌연변이 유도 및 돌연변이 균주를 스크리닝하는 과정을 나타낸 도이다.
도 2는 젖산 농도 및 배양 시간 조건에 따른 돌연변이 균주의 계통발생(Phylogeny)을 나타낸 도이다.
도 3은 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주의 배양액을 HPLC 분석한 결과를 나타낸 도이다(1은 글루코스 피크; 2는 젖산 피크; 3은 에탄올 피크).
도 4는 젖산 농도(0 내지 30 g/L)에 따른 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주(A) 및 LMA92A 균주(B)의 생장곡선을 나타낸 도이다(1; 0 g/L, 2; 15g/L, 3; 30 g/L).
도 5는 젖산 농도(50 내지 90 g/L)에 따른 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주(A) 및 LMA92A 균주(B)의 생장곡선을 나타낸 도이다(4; 50 g/L, 5; 70g/L, 6; 90 g/L).
도 6은 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주(A) 및 LMA92A 균주(B)의 비성장속도 저해 정도를 나타낸 도이다.
도 7은 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주(A) 및 LMA92A 균주(B)의 2차원 전기영동 결과(pH4-7 IPG 스트립)를 나타낸 도이다.
도 8은 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주(A) 및 LMA92A(B) 균주의 2차원 전기영동 결과(pH3-10 IPG 스트립)를 나타낸 도이다.
도 9는 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주(왼쪽 상자) 및 LMA92A 균주(오른쪽 상자)의 단백질을 정량 분석한 결과를 나타낸 도이다((A)는 pH 4-7 IPG strips; (B)는 pH 3-10 strips).
도 10은 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주 및 LMA92A 균주의 지방산 구성의 주성분 분석(Principal component analysis, PCA) 결과를 나타낸 도이다((A) Score plot, (B) Loading plot)
도 11은 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주 및 LMA92A 균주의 지방산 구성의 비율을 나타낸 도이다((A)는 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주의 증식기(exponential phase)의 지방산 구성(12 hours); (B)는 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주의 정체기(stationary phase)의 지방산 구성(20 hours); (C)는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주의 증식기의 지방산 구성(12 hours); (D)는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주의 정체기의 지방산 구성(20 hours)).
도 12는 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주(A) 및 LMA92A 균주(B)를 회분식 발효(Batch fermentations) 조건에서 배양한 결과를 나타낸 도이다(● 은 세포 성장의 흡광도(OD₆₆₀); ■은 글루코스 농도; ▲은 생산된 D형 젖산 농도; ×는 생산된 에탄올 농도).
도 13은 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주(A) 및 LMA92A 균주(B)를 유가 배양 발효(fed-batch fermentation) 조건에서 배양한 결과를 나타낸 도이다(● 은 세포 성장의 흡광도(OD₆₆₀); ■은 글루코스 농도; ▲은 생산된 D형 젖산 농도; ×는 생산된 에탄올 농도).

본 발명은 젖산 내성 강화능 및 고생산능을 갖는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A(Leuconostoc mesenteroides LMA92A, KCTC18266P)를 제공한다.

상기 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 서열은 서열번호 1로 표시되며, 상기 염기서열은 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 (NR_074957.1)와 100%의 상동성을 가지나, 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293에 비해 젖산 내성 증가 및 젖산 생산능 증가 등이 인정되어 신규한 돌연변이 균주로 판명되었다. 이에 본 발명자는 이를 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주로 명명하고, 2013년 12월 2일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 수탁하여 수탁번호 KCTC 18266P를 부여 받았다.

상기 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주는 통상의 배지에서 생육 가능하며, 일 예로 MRS 배지에서 배양할 수 있다. 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다. 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주는 통상의 배양방법에 따라 배양할 수 있다.

상기 젖산은 D형 젖산이며, 이의 구조는 하기 화학식 1에 나타내었다.

[화학식 1]

본 발명에서 용어 "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다. 본 발명에서 젖산의 생산방법은 당업계에 널리 알려져 있는 방법을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A(KCTC18266P) 균주를 30 내지 250g/L의 글루코스를 포함하는 배지에서, 질소를 0.1 내지 0.5 vvm의 유속으로 공급하면서 10 내지 50℃의 온도 및 pH 5.5 내지 7.5의 조건으로 배양하였다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 글루코스 함량은 회분식 발효 조건으로 배양 시 200g/L로 공급하고, 유가 배양 발효 조건으로 배양 시 50g/L으로 공급하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 질소는 0.1 vvm의 유속으로 공급하고, 상기 배양 온도는 30℃ 및 상기 pH는 6.5로 공급하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 배양은 혐기성 조건에서 배양하는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 젖산은 D형 젖산이며 이의 구조식은 상기 화학식 1에 나타내었다.

상기 젖산을 수득하는 단계는 당업계에 공지된 방법에 의해 수행될 수 있다. 구체적으로, 원심분리, 여과, 추출, 분무, 건조, 증방, 침전, 결정화, 전기영동, 분별용해(예를 들면 암모늄 설페이트 침전) 및 크로마토그래피(예를 들면 이온 교환, 친화성, 소수성 및 크기배제) 등의 방법을 사용함이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (a) 또는 (b)의 배지에는 10 내지 110 g/L의 젖산이 첨가될 수 있으며, 바람직하게는 30 내지 95 g/L의 젖산이 첨가될 수 있다.

또한, (a) 또는 (b)단계의 배양은 6 내지 10개월간 이루어질 수 있으며, 바람직하게는 8개월간 이루어질 수 있다.

상기 배양물은 액체배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 여과 또는 원심분리하여 균주를 제거한 여액(원심분리한 상등액)등을 포함할 수 있다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A( Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides LMA92A)의 선발

실시예 1-1. 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 ( Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides ATCC 8293) 균주 준비

루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293을 돌연변이시켜 신규한 균주를 선발하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

모균주로는, 셔틀 벡터(shuttle vectors) pMBLT03 (pMBLT02_ldhD)를 도입한 재조합 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주를 사용하였다. 상기 균주를 2%(w/v) CaCO₃(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)이 포함된 MRS 배지(deMan, Rogosa, and Sharpe)(MRS broth, Oxoid, England)에서 30℃의 무산소(anaerobic)조건하에 배양하였다. 상기 배양된 균주를 20%(v/v) 글리세롤이 포함된 MRS 배지에 넣고, 최종 농도 20 ㎍/mL의 에리트로마이신(Erythromycin)(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 첨가하여 -80℃에 보관하였다.

실시예 1-2. 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 돌연변이 유도 및 돌연변이 균주 스크리닝

상기 실시예 1-1에서 배양한 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293을 스트레스 환경에 노출시켜 돌연변이를 유도한 후, 돌연변이 균주를 스크리닝하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주를 저농도인 30 g/L의 젖산(lactic acid)을 포함한 MRS 배지에서 30 ℃로 배양하고, 점차 농도를 높여 고농도인 95 g/L의 젖산을 포함한 MRS 배지에서 약 8개월 가량 장기간 배양하는 스트레스 조건을 주어, 돌연변이를 유도하였다. 상기 고농도 젖산 스트레스 조건으로 배양된 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293을 120 ml MRS 배지가 들어있는 125 ml 배양병에 넣어 30 ℃에서 200 rpm으로 배양하였다. 상기 배양된 균주의 성장 곡선(growth curve)이 지수기(exponential phase)가 되었을 때, 배양 배지의 1 ml을 다른 배지에 접종하고 24시간 배양하였다. 상기 배양한 배지의 0.1 ml을 50 g/L 젖산, 0.05 g/L 브로모크레졸 그린(bromocresol green) 및 5% CaCO₃이 첨가된 MRS 아가 배지에 넣고 72시간 배양하였다. 돌연변이 균주는 탄산칼슘 중화에 따른 콜로니 주변 할로존의 크기 및 콜로니의 색상 변화(노란색)를 통해 스크리닝하였다. 그 결과를 표 1 및 도 2에 나타내었다.

Strains	Character and culture condition of selection strains	ETC
Control (KCTC 3718)	recombinant Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides harboring pMBLT03 plasmid	ATCC 8293
LM30	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 30 g/L in serum bottle (125mL)
LM50	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 50 g/L in bioreactor
LM51	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 50 g/L in bioreactor
LM52	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 50 g/L in serum bottle (125mL) and be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 50 g/L
LM60A	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 60 g/L in serum bottle (125mL)
LM60B	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 60 g/L in serum bottle (125mL)
LMA70A	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 70 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 70 g/L
LMA70B	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 70 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 70 g/L
LMA80A	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 80 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 80 g/L
LMA80B	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 80 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 80 g/L
LMA81A	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 80~90 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 80 g/L
LMA81B	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 80~90 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 80 g/L
LMA85	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 80~90 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 80 g/L
LMA90A	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 90 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 90 g/L
LMA90B	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 90 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 90 g/L
LMA91	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 95 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 90 g/L
LMA92A	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 95 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 90 g/L
LMA92B	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 95 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 90 g/L
LMA93	Be cultivated in modified MRS with lactic acid of 95 g/L in serum bottle (125mL) And be selected by the colony grown in MRS-agar plate with lactic acid of 90 g/L

표 1 및 도 2에 나타낸 바와 같이, 각 농도 및 배양 기간에 따른 총 20개의 젖산 내성 돌연변이 균주를 선발하였다. 그 중 LMA92A 균주가 가장 젖산 내성이 강함을 확인하여 이를 선발하였다.

실시예 1-3. 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A( Leuconostoc mesenteroides subsp. Mesenteroides LMA92A) 균주의 HPLC(high performance liquid chromatography) 분석

상기 실시예 1-2에서 스크리닝한 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주를 HPLC로 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주를 15 ml 배양병에 넣고 24시간 배양한 후 660nm에서 발광측정기(microplate readers)(SpectraMax plus 384, Molecular Devices, USA)를 이용하여 흡광도(optical density)를 측정하였다. 등용매(isocratic) 조건하에 액체 크로마토그래피(Liquid chromatography)는 Agilent 1200 Series HPLC system (Agilent, USA)으로 수행하였다. 크로마토그래피의 분리는 Aminex HPX-87H Column, 7.8×300mm (Bio-rad, USA)를 이용하였으며, 50℃ 및 유량(flow rate) 0.7 mL/min 조건을 유지하였다. 주입량은 10 μL로 이동상(mobile phase)은 증류수에 4mM H₂SO₄로 구성하여 이용하였다. 분석 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 배양액에 존재하는 글루코스(1), 젖산(2) 및 에탄올(3) 피크가 잘 분리되었음을 확인하였다.

실시예 1-4. 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A의 동정

상기 실시예 1-2에서 선발한 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A를 16S rRNA를 이용하여 동정하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 상기 실시예 1-2에서 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주가 배양된 배지에서 균체를 회수하여 DNA(genomic DNA)를 추출한 후, 분리한 유전체 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)을 수행하여 16S rRNA를 증폭하였다. 이때, 정방향 프라이머(서열번호 2, 5'-GAG TTT GAT CCT GGC GGC TCA G-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 3, 5'-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3')를 사용하였다. 증폭한 PCR 산물은 PCR 정제 시스템을 이용하여 정제하였다(마크로젠). 상기 정제한 PCR 산물의 전체 염기서열을 분석하기 위하여, 마크로젠에 의뢰하여 실시하였다.

상기 분석된 염기서열의 상동성은 NCBI의 BLAST 프로그램을 통해 분석하였다. 본 발명의 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA)의 염기서열을 서열번호 1에 나타내었다. 또한, 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293과의 상동성 분석 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

Query Strain	Length (bp)	Closest match	Similarity (%)
Control strains	1432	Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293(T)	100
LMA92(A)	1417	Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293(T)	100

표 2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(rDNA) 염기서열이 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293(NR_074957.1)과 100%의 상동성을 가지는 것을 확인하였다. 또한, 모균주에 비해 젖산 내성 증가 및 젖산 생산능 증가를 확인하여, 이를 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A으로 명명하고, 상기 균주를 한국생명공학연구원 미생물자원센터에 기탁하였으며 수탁번호 KCTC 18266P를 부여받았다.

실시예 2. 젖산 농도에 따른 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 및 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A( Leuconostoc mesenteroides LMA92A)의 생장 비교

젖산 농도에 따른 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 및 본 발명의 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A의 생장을 비교하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 각 0, 15, 30, 50, 70 또는 90 g/L 농도의 젖산을 첨가한 MRS 배지에서 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 또는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주를 각각 배양하였다. 각 젖산 농도에 따른 상기 균주의 생장 곡선을 측정하였다. 또한, 각 젖산 농도에 따른 상기 균주의 비성장속도(specific growth rate)를 측정하고, 최대 비성장속도를 100%으로 하여 젖산 농도에 따른 균주의 생장 저해 곡선을 완성하였다. 또한, 글로벌 플롯 커브(global plot curve)로 나타내 식을 도출하여 세포성장이 50% 저해되는 젖산의 농도인 IC₅₀값을 측정하였다. 그 결과를 도 4 내지 도 6 및 표 3에 나타내었다.

	Strains
Lactic acid (g/L)	ATCC 8293	LMA92A
Lactic acid (g/L)	18.21 ± 2.368	33.68 ± 5.066

도 4에 나타낸 바와 같이, 젖산 농도가 0 내지 15 g/L일때는 본 발명의 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 및 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 생장곡선이 비슷한 양상임을 확인하였다. 그러나, 젖산이 30g/L 농도 이상으로 포함된 경우 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A만 고농도의 젖산에 대한 내성을 갖고 성장함을 확인하였다.

또한, 도 5에 나타낸 바와 같이, 젖산 농도가 50 g/L이상이 되면 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 생장속도에 변화가 없었으나, 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A는 젖산 농도가 90 g/L임에도 내성이 증가되어 성장함을 확인하였다.

또한, 도 6에 나타낸 바와 같이, 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293는 젖산 농도가 높아짐에 따라 비성장속도가 저해됨을 확인하였으나, 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A는 젖산 농도에 따른 저해 정도가 낮아 상기 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293보다 비성장속도가 높음을 확인하였다.

또한, 표 4에 나타낸 바와 같이, 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 IC₅₀는 약 18g/L, 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A의 IC₅₀는 약 33g/L의 값을 나타내며, 상기 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주의 젖산 내성이 모균주보다 약 2배 정도 증가되었음을 확인하였다.

실시예 3. 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 및 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 단백질 분석 및 비교

본 발명의 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 및 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 단백질을 수득하여 2차원 전기영동(two-dimensional gelelectrophoresis)하고 이를 분석하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 각 균주의 단백질을 수득하기 위하여, 초기 정체기(early stationary phase)에 있는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 및 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 세포 배양 배지를 원심분리(2,500×g, 5분, 4℃)하고 100mM PBS(Phosphate Buffered Saline)로 두 번 세척하였다. 상기 원심분리하고 세척하여 수득한 펠렛(세포 부피의 100 μL)을 7M 요소(urea), 2M 티오요소(thiourea), 4% (w/v) CHAPS, 40 mM DTT(dithiothreitol) 및 1% (v/v) 프로테아제 저해 반응혼합액(protease inhibitor cocktail)(Complete Mini EDTA-free, Roche Diagnostics GmbH, Germany)이 포함된 샘플 조제 용액으로 재현탁(resuspended)하였다. 상기 재현탁한 세포를 마이크로-팁 프로브(micro-tip probe)를 이용하여 최대 출력(maximum output)(750 W)의 35%로 15초의 휴지기를 주면서 각 2초간 40회 초음파 처리하였다(High-intensity ultrasonic liquid processors, Sonics & Material Inc., Newtown, CT, USA). 상기 초음파 처리된 세포 파편(Cellular debris)을 원심분리(2,500×g, 5분, 4℃)하여 제거하고 상층액을 1.5 mL 튜브에 옮긴 후, 2-D Clean-Up kit(GE healthcare, Sweden)를 사용하여 회수된 단백질을 농축하였다. 상기 농축된 단백질을 4℃에서 100 μL 샘플 조제 용액으로 용해하였다.

상기 과정을 통해 수득한 단백질을 2차원 전기영동 분석하기 위하여, Immobiline DryStrip Gels(immobilized pH gradient(IPG) strips; 18cm, pH 3-10, pH 4-7)(GE healthcare)을 각 1% (v/v) IPG 완충액(pH 4-7 및 pH 3-10)(GE healthcare)이 포함된 340 μL 샘플 재수화(rehydration) 용액에 넣어 하룻동안 재수화하였다. 단백질 샘플은 Qubit^®2.0 fluorometer(Invitrogen, USA)을 이용하여 정량하였고 1% IPG 완충액이 포함된 샘플 재수화 용액에 넣어 희석하였다. 상기 희석된 샘플을 재수화된 IPG 스트립(IPG strips)에 컵-로딩(cup-loading)하였다. 등전점 전기영동(isoelectric focusing, IEF)은 Ettan IPGphorTM3 IEF system (GE healthcare, Sweden)을 이용하여 100 V에서 10,000 V까지 20℃에서 수행하였다. 상기 스트립에 안정화(equilibration) 완충액 I(6 M 요소, 75 mM 트리스-염화수소(Tris-HCl), 29.3%(w/v) 글리세롤, 2%(w/v) SDS(Sodium dodecyl sulfate), 0.002%(w/v) 브로모페놀 블루(bromophenol blue)(1% 원액) 및 0.65 mM DTT); 및 완충액 II(DTT를 포함한 1.35 mM 요오드아세트아미드 용액(iodoacetamide solution))를 각 15분 처리하였다. IPG 스트립을 아가로스 실링 용액(25 mM Tris-HCl, 1.92 M 글리신(glycine), 1%(w/v) SDS, 0.5%(w/v) 아가로스 및 0.002%(w/v) 브로모페놀 블루)이 포함된 12% 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)에 넣었다. 상기 겔을 Ettan DALTsix Electrophoresis Unit(GE healthcare) 및 EPS 601 Power Supply(GE healthcare)을 이용하여 16℃에서 지속적인 200mA 전류를 주어 2차원 전기영동을 실시하였다. 상기 전기영동 완료한 겔을 쿠마시 브릴리언트 블루 R350(Coomassie Brilliant Blue R350)(PhastGel Blue R-350, GE healthcare, Sweden)으로 염색한 후, PowerLook 2100 XL scanner system(UMAX, Taipei, Taiwan)을 이용하여 스캔하였다. 상기 스캔한 겔의 단백질 스팟 분석은 Image Master 2D Platinum v.7.0 software(GE healthcare)을 이용하여 각 단백질을 분석하였다. 상기 단백질 분석은 제노마인(Genomine, INC)에 의뢰하였으며, 단백질 가수분해물(digests)의 펩티드 질량 지문 추적은(peptide mass fingerprints) MALDI-TOF 질량 분석법(mass spectrometry)을 이용하여 수행하였다. 상기 단백질의 데이터 파일은 NCBI database를 탐색하는 Mascot bioinformatics 서치 엔진(http://www.matrixscience.com)으로 분석하였다. 그 결과를 도 7 내지 도 9 및 표 4에 나타내었다.

Gene name	NCBI Acc. No	Protein description	pI	MW (Da)	Score	Sequence Coverage (%)
glycolysis/gluconeogenesis
eno	gi\|116617370	phosphopyruvate hydratase	4.65	47511	351	64
LEUM_0305	gi\|116617432	glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase	5.10	36016	130	46
LEUM_0251	gi\|116617380	phosphoglycerate mutase	5.21	24927	247	86
LEUM_1919	gi\|116618994	alcohol dehydrogenase	5.35	37438	232	64
LEUM_1961	gi\|116619034	phosphoketolase	4.95	91831	316	42
LEUM_1509	gi\|116618603	ribulose-5-phosphate 3-epimerase	4.72	23806	210	63
LEUM_0551	gi\|116617667	6-phosphogluconate dehydrogenase	4.76	32821	158	58
pyruvate metabolism
LEUM_0469	gi\|116617587	acetate kinase	5.55	46018	332	64
LEUM_0146	gi\|116617298	bifunctional acetaldehyde-CoA/alcohol dehydrogenase	5.75	98371	267	51
LEUM_0737	gi\|116617849	acetoin dehydrogenase complex, E1 component subunit alpha	5.16	41878	198	48
vitamin biosynthesis
LEUM_0143	gi\|116617295	hydroxymethylpyrimidine/phosphomethylpyrimidine kinase	5.20	29800	192	65
LEUM_1157	gi\|116618257	thiamine biosynthesis protein ThiF	6.05	23292	205	70
LEUM_0143	gi\|116617295	hydroxymethylpyrimidine/phosphomethylpyrimidine kinase	5.20	29800	270	83
energy interconversion
LEUM_1869	gi\|116618945	F0F1 ATP synthase subunit beta	4.66	50,278	215	53
amino acids metabolism
glyA	gi\|116617899	serine hydroxymethyltransferase	5.52	44530	350	75
LEUM_0603	gi\|116617719	threonine dehydrogenase related Zn-dependent dehydrogenase	4.90	36352	133	46
fatty acid biosynthesis
LEUM_0314	gi\|116617441	3-oxoacyl-ACP synthase	4.95	43667	208	60
nucleosides and nucleotides metabolism
purH	gi\|116617839	bifunctional phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase/IMP cyclohydrolase	5.19	55369	288	64
LEUM_1206	gi\|116618306	orotidine-5'-phosphate decarboxylase	5.49	25218	176	53
LEUM_0720	gi\|116617832	phosphoribosylaminoimidazolesuccinocarboxamide synthase	4.87	28326	155	64
LEUM_0725	gi\|116617837	phosphoribosylformylglycinamidine cyclo-ligase	4.78	36525	161	48
transport system components
LEUM_1768	gi\|116618857	PTS system mannose/fructose-specific transporter subunit IIA	5.41	34199	256	57
OppA	gi\|116619005	ABC-type oligopeptide transport system, periplasmic component	9.46	59484	169	37
stress proteins
tig	gi\|116618616	trigger factor	4.38	47285	152	36
dnaK	gi\|116618442	molecular chaperone DnaK	4.56	65,651	138	27
LEUM_0150	gi\|116617302	ATP-binding subunit of Clp protease and DnaK/DnaJ chaperones	5.05	77,983	232	40
groEL	gi\|116618851	chaperonin GroEL	4.64	56665	330	59
RNA metabolism
LEUM_0513	gi\|116617631	DNA-directed RNA polymerase subunit delta	3.76	21877	81	38
translation
rplE	gi\|116617341	50S ribosomal protein L5	9.27	20154	223	68
LEUM_0627	gi\|116617742	elongation factor Tu	4.78	43344	319	66
tsf	gi\|116618298	elongation factor Ts	4.72	31,046	100	36
ETC
LEUM_0145	gi\|116617297	acetoin reductase	4.73	27230	129	41
LEUM_1148	gi\|116618249	short-chain alcohol dehydrogenase	4.76	26887	238	78
LEUM_0858	gi\|116618188	short-chain alcohol dehydrogenase	5.43	26679	135	36
LEUM_1770	gi\|116618859	nitroreductase	5.74	27513	290	74
LEUM_0666	gi\|116617778	fructosamine-3-kinase	5.60	32505	191	44
LEUM_0701	gi\|116617813	formate-tetrahydrofolate ligase	5.93	59141	399	56
LEUM_0284	gi\|116617413	UDP-galactose 4-epimerase	5.07	36437	215	64
LEUM_0699	gi\|116617811	aryl-alcohol dehydrogenase	5.64	36747	253	83
LEUM_0354	gi\|116617479	glucosamine-6-phosphate isomerase	5.23	25414	176	84
LEUM_0757	gi\|116617868	dihydrofolate reductase	5.11	19007	164	70

도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주에서 약 350개의 단백질 스팟을 확인하였으며, 그 중 41개의 단백질 스팟 농도가 1.5-폴드(fold) 차이 이상임을 확인하였다.

또한, 도 9에 나타낸 바와 같이, 상기 41개의 다른 단백질 중 18개의 단백질이 상향 조절(up-regulated)되었고, 23개의 단백질이 하향 조절(down-regulated) 되었음을 확인하였다.

또한, 표 4에 나타낸 바와 같이, 상기 단백질 스팟 농도차이가 나는 단백질 또는 효소는 해당과정(glycolysis), 지방산 생합성(fatty acid biosynthesis) 및 스트레스 단백질(stress protein) 등과 상관성이 있는 것으로 확인하였다. 이 중 F₀F₁ ATP 합성, 샤페로닌(chaperonin)과 지방산 신장(Fatty acid elongation)과 관련된 단백질인 leum_1869, groEL 및 leum_0314의 발현이 상향 조절되고, dnaK 및 leum_0150의 발현이 하향 조절되었음을 확인하였다.

실시예 4. 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 및 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 지방산 구성 분석 및 비교

루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 및 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 지방산 구성을 분석하고 비교하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 균주의 지질 및 지방산 메틸 에스터(fatty acid methyl esters, FAMEs)의 제제(preparation)는 Zhang et al(Applied and Environmental Microbiology, 2010. 76(9): p. 2989-2996)의 방법을 일부 변경하여 수행하였다. 약 0.1g의 세포를 원심분리(2,500×g for 10min)하여 수득한 뒤, PBS로 두 번 세척하였다. 세포의 지방산은 메탄올-증류수 용액(methanol-distilled water solution)에 15% NaOH(w/v)(10:10, v/v)를 넣어 30분간 100℃로 끓여 비누화(saponified)하였고, 여기에 메틸화 용액 혼합물(혼합물: 13:11 (v/v), 6N HCl-MeOH)을 첨가하여 80℃로 10분간 가열하였다. 상기 가열한 시료를 빙점조에 빠르게 식힌 후, 지방산 메틸 에스터(FAMEs)는 1.25 ml 메틸 터트 부틸 에테르-헥산(methyl tert butyl ether-hexane)(1:1, v/v)으로 10분 처리하여 추출하고, 1.2% NaOH(w/v)로 세척한 후, 포화된 NaCl을 첨가하였다. 상기 지방산 메틸 에스터 샘플을 가스 크로마토그래피(chromatography-mass spectroscopy, GC-MS)로 분석하였다. GC-MS는 50 m×0.25 mm HP-1MS UI 칼럼(Agilent, USA)으로 Agilent 7890A 및 불활성의 검출기(mass selective detector, MSD)(Agilent, USA)가 장착된 Agilent 5975C를 사용하였다. 샘플은 70℃에서 주입하였고, 오븐 온도를 10℃/min로 70℃에서 150℃로 높인 후, 5℃/min로 300℃까지 높였다. 헬륨 가스를 운반 기체로 사용하여 39분 실행하였다. 그 후 직교부분최소자승판별 분석(OPLS-DA) 및 로딩 플롯(loading plot) 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, 멤브레인 지방산에서의 변화 및 강화된 젖산 저항성의 관계가 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 및 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293에서 확인되었다. OPLS-DA 플롯(plots)에서는, 지방산 양상의(profile) 주성분 분석(principal component analysis, PCA)하여 균주의 생장단계별로 확연히 구분됨을 확인하였으며(A), 로딩 플롯(loading plot) 분석에서는, 유의적으로 차이가 있는 지방산을 분류하여 이를 확인하였다(B).

또한, 팔미톨레산(palmitoleic acid)(C_16:1), 올레산(oleic acid)(C_18:1), 리놀레산(linoleic acid)(C_18:2) 및 에이코센산(eicosenoic acid)(C_20:1)과 같은 불포화 지방산(unsaturated long chain fatty acids)의 비율이 증가함을 확인하였다. 또한, 정체기의 세포는 불포화 지방산(C_16:1, C_18:1)의 비율이 특이적으로 감소함을 확인하였으며, 시클로프로판 지방산(cyclopropane fatty acids)(C_{17:0 cyclo}, C_{19:0 cyclo}), 불포화 지방산인 미리스트산(myristic acid)(C_14:0) 및 팔미트산(palmitic acid)(C_16:0)의 비율이 동시에 증가함을 확인하였다. 따라서, 멤브레인 지방산 구성의 변화는 주변 환경 스트레스에 반응하기 위한 균주의 적응 매커니즘임을 확인하였다.

또한, 도 11에 나타낸 바와 같이, 지속적인 정체기의 젖산 조건에서 유래한 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 및 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 지방산은 변화함을 확인하였다. 불포화 지방산의 특이적인 비율이 줄어들었지만, 시클로프로판산(cyclopropane fatty acids)의 비율은 증가함을 확인하였다.

따라서, 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주가 고농도 젖산 조건에서 불포화 고급 지방산 수준이 감소되고, 지방산이 조절되는 것은 젖산 스트레스 조건에서 살아남기 위함임을 확인하였다.

실시예 5. 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 및 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 발효 조건에 따른 비교

루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 및 모균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293의 발효 조건에 따른 비교를 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

보다 구체적으로, 회분식 발효(Batch fermentation) 및 유가 배양 발효(fed-batch fermentation)를 수행하였으며, 1.5 L 바이오리액터(bioreactor)(FMT DS-T1.5, Fermentec, Korea)에 1 L 부피로 발효하였다. 회분식 및 유가 배양 배지는 10 g/L 펩톤(peptone), 10 g/L 육추출물(beef extract), 10 g/L 효모추출물(yeast extract), 1 mL 폴리옥시에틸렌 소리비탄 모노-올레이트(polyoxyethylene sorbitan mono-oleate) (Tween80), 5 g/L 아세트산 나트륨(Sodium acetate), 2.0 g/L 트리-구연산 암모늄(tri-ammonium citrate), 2.0 g/L K₂HPO₄, 0.1 g/L MgSO₄·H₂O 및 0.05 g/L MnSO₄·7H₂O로 구성되었다. 회분식 발효의 탄소원은 200 g/L 글루코스이며, 유가 배양 발효의 탄소원은 50 g/L 초기 글루코스이다. 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 및 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주를 1.5 L 자 발효인(jar fermenter)에 30℃의 무산소 조건하에 상기 배지에 배양하였고, 임펠러(impeller) 속도를 200 rpm으로 하였다. 상기 배양 pH는 5 M NaOH를 첨가하여 6.5로 유지하였다. 유가 배양 발효 과정은, 고농도 글루코스인 750 g/L의 주입 용액을 pH 6.5 및 그 이상일 때, 15 g/L 글루코스 농도를 유지하기 위하여 첨가하였다. 질소 가스 유량은 무산소 조건하에 0.1 vvm으로 유지하였다. 상기 비연속 발효 및 유가 배양 발효 결과를 도 12 및 도 13에 나타내었다.

도 12에 나타낸 바와 같이, 회분식 발효 조건(Batch fermentation)에서는, 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주가 12.5의 흡광도(optical density, OD)에서 배양될 때, 185g/L 글루코스를 소모하였고, 80 g/L 젖산을 생산하였다(도 12 B). 반면, 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주가 7.62의 OD에서 배양될 때, 83 g/L 글루코스를 소모하였고, 31 g/L의 젖산을 생산함을 확인하였다(도 12 A). 이에 따라, 회분식 발효 조건에는 고농도의 글루코스(190 g/L)가 포함되어 있어, 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293 균주가 생장 저해를 나타낸 반면, 본 발명의 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A 균주는 비교적 적은 저해가 나타남을 확인하여, 이를 통해 상기 균주의 젖산에 대한 내성이 강화되었음을 확인하였다.

또한, 도 13에 나타낸 바와 같이, 유가 배양 발효(fed-batch fermentation)에서는, 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A는 210 g/L의 글루코스를 소모하고, 105 g/L의 젖산을 생산하였다(도 13 B). 반면, 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293은 145 g/L의 글루코스를 소모하고, 67 g/L 젖산을 생산함을 확인하였다(도 13A). 이에 따라, 본 발명의 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A는 상기 야생형 균주인 루코노스톡 메센테로이데스 ATCC 8293보다 약 2배의 젖산을 생산하여, 젖산 생산능이 현저하게 우수함을 확인하였다.

한국생명공학연구원 미생물자원센터

KCTC18266P

20131202

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> Leuconostoc mesenteroides LMA92A having enhancing tolerance and producing capacity to Lactic acid and method for producing lactic acid using the same <130> ajou1-41 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA sequence of Leuconostoc mesenteroides LMA92A <400> 1 gaacgcacag cgaaaggtgc ttgcaccttt caagtgagtg gcgaacgggt gagtaacacg 60 tggacaacct gcctcaaggc tggggataac atttggaaac agatgctaat accgaataaa 120 acttagtgtc gcatgacaca aagttaaaag gcgcttcggc gtcacctaga gatggatccg 180 cggtgcatta gttagttggt ggggtaaagg cctaccaaga caatgatgca tagccgagtt 240 gagagactga tcggccacat tgggactgag acacggccca aactcctacg ggaggctgca 300 gtagggaatc ttccacaatg ggcgaaagcc tgatggagca acgccgcgtg tgtgatgaag 360 gctttcgggt cgtaaagcac tgttgtatgg gaagaacagc tagaatagga aatgatttta 420 gtttgacggt accataccag aaagggacgg ctaaatacgt gccagcagcc gcggtaatac 480 gtatgtcccg agcgttatcc ggatttattg ggcgtaaagc gagcgcagac ggtttattaa 540 gtctgatgtg aaagcccgga gctcaactcc ggaatggcat tggaaactgg ttaacttgag 600 tgcagtagag gtaagtggaa ctccatgtgt agcggtggaa tgcgtagata tatggaagaa 660 caccagtggc gaaggcggct tactggactg caactgacgt tgaggctcga aagtgtgggt 720 agcaaacagg attagatacc ctggtagtcc acaccgtaaa cgatgaacac taggtgttag 780 gaggtttccg cctcttagtg ccgaagctaa cgcattaagt gttccgcctg gggagtacga 840 ccgcaaggtt gaaactcaaa ggaattgacg gggacccgca caagcggtgg agcatgtggt 900 ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctttgaa gcttttagag 960 atagaagtgt tctcttcgga gacaaagtga caggtggtgc atggtcgtcg tcagctcgtg 1020 tcgtgagatg ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttattgttag ttgccagcat 1080 tcagatgggc actctagcga gactgccggt gacaaaccgg aggaaggcgg ggacgacgtc 1140 agatcatcat gccccttatg acctgggcta cacacgtgct acaatggcgt atacaacgag 1200 ttgccaaccc gcgagggtga gctaatctct taaagtacgt ctcagttcgg attgtagtct 1260 gcaactcgac tacatgaagt cggaatcgct agtaatcgcg gatcagcacg ccgcggtgaa 1320 tacgttcccg ggtcttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagtttgta atgcccaaag 1380 ccggtggcct aaccttttag gaaggagccg tctaagg 1417 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA forward primer <400> 2 gagtttgatc ctggcggctc ag 22 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S rRNA reverse primer <400> 3 acggctacct tgttacgact t 21

Claims

젖산 내성 강화능 및 젖산 고생산능을 갖는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A(Leuconostoc mesenteroides LMA92A, KCTC18266P).
제1항에 있어서,
상기 젖산은 D형 젖산인 것을 특징으로 하는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A(KCTC18266P).
(a) 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A(KCTC18266P) 균주를 배지에 배양하는 단계; 및
(b) 상기 배양 배지로부터 젖산을 수득하는 단계; 를 포함하는 젖산의 생산방법.
제3항에 있어서,
상기 (a) 단계의 배양은 30 내지 250g/L의 글루코스를 포함하는 배지에서, 10 내지 50℃의 온도 및 pH 5.5 내지 7.5의 조건에서 이루어지는 것을 특징으로 하는, 젖산의 생산방법.
제3항에 있어서,
상기 젖산은 D형 젖산인 것을 특징으로 하는 젖산의 생산방법.
(a) 20 내지 100g/L의 젖산이 포함된 배지에 5 내지 10개월 동안 균주를 지속적으로 배양하여 1차 배양물을 수득하는 단계;
(b) 상기 1차 배양물을 젖산이 포함된 배지와 혼합하고, 상기 혼합물을 다시 배양하여 2차 배양물을 수득하는 단계; 및
(c) 상기 2차 배양액을 브로모크레졸 그린 및 탄산칼슘이 첨가된 배지와 혼합하고, 상기 혼합물을 배양하여 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A(KCTC18266P) 균주를 선발하는 단계;를 포함하는 루코노스톡 메센테로이데스 LMA92A(KCTC18266P) 균주의 선발방법.