KR101601364B1 - A method for designing antimicrobial peptides for reducing the hemolysis thereof - Google Patents
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Abstract
본 발명은 양면성 항생 펩타이드를 구성하는 소수성 아미노산 잔기를 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 단계를 포함하는, 치환 전 상기 양면성 항생 펩타이드 보다 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 또는 항생 펩타이드 라이브러리 제조방법, 및 이를 통해 제조된 항생 펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드 라이브러리로부터 용혈력이 감소하는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 항생 펩타이드 스크리닝 방법 및 상기 항생 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 제조방법을 통하여 제조된 펩타이드는 기준이 된 모델 또는 자연 양면성 항생 펩타이드에 비해서 용혈력이 최소 4배에서 최대 8000배 낮아지는데 비하여, 항균력은 비슷하거나 최대 8배까지 증가하는 효과를 보였다. 이에 따라, 해당 항생 펩타이드를 제조하는 전략은 다양한 양면성 항생 펩타이드에 적용할 수 있을 것으로 기대되며, 이렇게 제조된 본 발명의 항생 펩타이드는 숙주세포에 대한 용혈현상은 대폭 감소하는데에 반해 항균효과는 유지되는바, 부작용이 적은 항생 펩타이드로 널리 유용하게 사용될 수 있다.The present invention relates to a method for producing an antibiotic peptide or an antibiotic peptide library whose hemolytic potential is lower than that of the double-sided antibiotic peptide before substitution, comprising the step of substituting a hydrophobic amino acid residue constituting a bilateral antibiotic peptide with a hydrophilic amino acid residue, Antibiotic peptides. The present invention also relates to an antibiotic peptide screening method and a composition for antimicrobial use including the antibiotic peptide, which comprises the step of selecting a peptide whose hemolytic activity decreases from the antibiotic peptide library. The peptides produced by the method of producing antibiotic peptides having reduced hemolytic ability according to the present invention have a hemolytic potential lower than that of the reference model or natural bilateral antibiotic peptide by at least 4 to 8000 times, . Accordingly, it is expected that the antibiotic peptide of the present invention can be applied to a variety of double-sided antibiotic peptides, and the antibiotic peptide of the present invention thus produced is remarkably reduced in hemolysis to host cells, while the antimicrobial effect is maintained Bar, and antibiotic peptide with fewer side effects.
Description
본 발명은 양면성(amphipathic) 항생 펩타이드에서 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 알파 나선도를 유지 또는 감소시키도록 하는 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 단계를 포함하는, 치환 전 상기 양면성 항생 펩타이드 보다 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 또는 항생 펩타이드 라이브러리 제조방법, 및 이를 통해 제조된 항생 펩타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드 라이브러리로부터 용혈력이 감소하는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 항생 펩타이드 스크리닝 방법 및 상기 항생 펩타이드를 포함하는 항균용 조성물에 관한 것이다.
The present invention relates to a method for producing an antibiotic peptide having an antihypertensive effect with reduced hemolytic ability compared to the bi-surface antibiotic peptide before substitution, comprising substituting at least one hydrophobic amino acid residue in the amphipathic antibiotic peptide with a hydrophilic amino acid residue, A peptide or an antibiotic peptide library, and an antibiotic peptide prepared thereby. The present invention also relates to an antibiotic peptide screening method and a composition for antimicrobial use including the antibiotic peptide, which comprises the step of selecting a peptide whose hemolytic activity decreases from the antibiotic peptide library.
항생 펩타이드 (Antimicrobial peptides; AMP)는 생체 내에서 초기 면역반응을 담당하는, 생체의 개체 유지를 위해 스스로 생산해내는 자연 산물이다. 따라서 곤충부터 포유동물에 이르기까지 거의 모든 동물들에서 이와 같은 AMP가 다수 또한 다양하게 발견되고 있다. 항생 펩타이드의 한 종류로 양전자를 띄는 항생 펩타이드 (Cationic antimicrobial peptides; CAP)가 있으며, CAP는 다른 항생 펩타이드에 비해 다음 두 가지 중요한 성질을 가진다. 그 하나는 라이신 및 알지닌을 다수로 포함하고 있으므로 생리 pH에서 양전하를 띄고 있으며, 다른 하나는 친수성 및 소수성을 모두 갖춘 양면적 성질 (amphipathic)을 가진 펩타이드라는 점이다. Antimicrobial peptides (AMP) are natural products that produce the self-sustaining organisms that are responsible for the initial immune response in vivo. Thus, a large number of such AMPs have been found in almost all animals, from insects to mammals. One type of antibiotic peptide is positively charged anticapital peptides (CAP). CAP has two important properties compared to other antibiotic peptides. One of them is lysine and arginine, so it has positively charged at physiological pH, and the other is amphipathic peptide having both hydrophilic and hydrophobic properties.
양전하는 박테리아의 세포 표면에 존재하는 음전하를 인식하고, 박테리아 근처에 항생 펩타이드가 접근할 수 있도록 만드는데 필요하다. 많은 경우에 항생 펩타이드의 박테리아를 죽이는 능력은 친수성 및 소수성의 두 가지 성질을 모두 갖춘 양면성에서 기인된다. 양면성을 가진 펩타이드는 박테리아의 세포막을 망가뜨릴 수 있는 능력을 가지고 있으므로 항균력의 직접적 원인이기 때문이다. 하지만 이와 같은 양면성은 숙주세포인 진핵세포도 죽일 수 있기 때문에 큰 부작용으로 나타난다. 즉, 양면성을 가진 항생 펩타이드는 진핵세포 표면도 거의 같은 기작으로 통과할 수 있으므로 숙주세포도 박테리아처럼 공격을 받을 수 있다. 양전하로 되어 있는 박테리아의 표면에 비해 중성화되어 있는 진핵세포의 표면은 약간 구별되는 면도 있지만, 양면성을 가진 항생 펩타이드들의 심각한 부작용으로 인하여 아직까지 양면성을 가진 항생 펩타이드가 신약 후보 물질로 도출된 예가 없다.
Positive charge is necessary to recognize the negative charge present on the cell surface of the bacteria and make it accessible to the antibiotic peptide near the bacteria. In many cases, the ability of antibiotic peptides to kill bacteria is due to the bi-aspect of both hydrophilic and hydrophobic properties. The double-sided peptide is a direct cause of the antibacterial activity because it has the ability to destroy the bacterial cell membrane. However, such double-sidedness is a serious side effect because it can kill eukaryotic cells, which are host cells. In other words, bi-surface antibiotic peptides can pass through eukaryotic surface almost the same way, so host cells can be attacked like bacteria. Although the surface of eukaryotic cells that are neutralized compared to the surface of positively charged bacteria is somewhat differentiated, there is no example of antimicrobial peptides with double-sidedness yet being derived as candidate drugs due to serious side effects of antimicrobial peptides with bilateral nature.
한편, 양면성을 가진 항생 펩타이드, 특히 양전하를 지니는 CAP는 15-40개 정도의 아미노산을 가지며, 알파나선을 일시적 모양 (conformation) 특징으로 가지고 있는 경우가 많다. 이 알파나선은 특히 막 단백질에서 매우 높은 비율로 존재한다. 또한, 알파나선 자체에서도 양면성을 가지고 있어서 CAP가 박테리아 또는 숙주세포의 막의 안쪽인 소수성을 띈 쪽으로의 접근을 용이하게 한다. CAP의 아미노산 구성을 보면 라이신/알지닌과 같은 양전하를 띌 수 있는 잔기가 있는 반면에 루신/이소루신과 같은 소수성의 잔기 두 가지를 다 함유하고 있으며 이들 두 성질은 크게 나누어져 있다. 적절한 친수성/소수성 잔기의 비율 및 이것들의 상대적 위치가 CAP의 능력을 좌우할 수 있다는 것이 이미 잘 알려져 있다.On the other hand, double-sided antibiotic peptides, especially positive positively charged CAPs, have about 15-40 amino acids and often have alpha conformational features. These alpha helices are present at a very high rate, especially in membrane proteins. In addition, the alpha helix itself has both sides and facilitates access to the hydrophobic side of the membrane of bacteria or host cells. The amino acid composition of CAP contains two positively charged residues such as lysine / arginine while two hydrophobic residues such as leucine / isoleucine. These two properties are largely divided. It is well known that the proportion of suitable hydrophilic / hydrophobic moieties and their relative location can influence the ability of CAP.
펩타이드의 특정위치에 아미노산 잔기가 바뀌어 펩타이드 전체의 소수성을 늘릴 수 있거나 알파나선도를 증가시키면 더욱 항균 능력이 향상되는 것을 알고 있다. 하지만 이와 같은 항균능력이 커질수록 숙주세포를 파괴할 수 있는 부작용도 커지는 사실도 알려졌다. 따라서 CAP가 치료제로 쓰이기 위해선 부작용을 줄이는 방향으로 펩타이드를 제조/선별하여야 한다.
It is known that the amino acid residues at specific positions of the peptide can be changed to increase the hydrophobicity of the whole peptide or increase the alpha helicity to further improve the antibacterial activity. However, it is also known that the larger the antibacterial capacity, the greater the side effects that can destroy host cells. Therefore, in order for CAP to be used as a therapeutic agent, peptides should be manufactured / screened to reduce adverse effects.
한편, 숙주세포를 죽이는 펩타이드의 부작용은 용혈현상(hemolysis)에 의한 것으로 파악되고 있다. 따라서, 항생 펩타이드의 숙주세포에 대한 용혈현상을 대폭적으로 감소시키면서 항균효과를 유지할 수 있는 적절한 수준의 변화를 위한 돌연변이가 필요하다.
On the other hand, side effects of peptides that kill host cells are attributed to hemolysis. Therefore, it is necessary to mutate the antisense peptide for an appropriate level of change to maintain the antimicrobial effect while drastically reducing hemolysis of the host cell.
이와 같은 배경하에, 본 발명자들은 지금까지 당업계에서 이루어지던 친수성을 증가시키고 알파나선도를 증가시켜서 항균력을 증진시키는 전략에서 벗어나, 알파나선도를 유지 또는 감소시키면서 소수성 부분만을 변화시킨 결과, 소수성 아미노산의 치환으로 용혈현상은 대폭 감소하고 항균효과는 유지되는 것을 발견하고, 본 발명의 항생 펩타이드가 부작용이 적은 항생 펩타이드로 유용하게 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
Under these circumstances, the present inventors have succeeded in increasing the hydrophilicity and increasing the alpha-helicity, which have been performed in the related art, to shift from the strategy of enhancing the antibacterial activity. As a result of changing only the hydrophobic part while maintaining or decreasing the alpha helix, , The hemolysis phenomenon is greatly reduced and the antimicrobial effect is maintained. It was confirmed that the antibiotic peptide of the present invention can be effectively used as an antibiotic peptide with few side effects, thereby completing the present invention.
본 발명의 하나의 목적은 양면성(amphipathic) 항생 펩타이드에서 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 알파 나선도를 유지 또는 감소시키도록 하는 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 단계를 포함하는, 치환 전 상기 양면성 항생 펩타이드 보다 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 제조방법을 제공하는 것이다.It is an object of the present invention to provide an antibiotic peptide that is more amphipathic than antiphosphonic antimicrobial peptides prior to substitution, comprising substituting at least one hydrophobic amino acid residue with a hydrophilic amino acid residue to maintain or reduce alpha- And a method for producing the reduced antibiotic peptide.
본 발명의 다른 목적은 상기 항생 펩타이드 제조방법으로 제조된 항생 펩타이드를 제공하는 것이다.It is another object of the present invention to provide an antibiotic peptide prepared by the above antibiotic peptide production method.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
Yet another object of the present invention is to provide a composition for antimicrobial use comprising the antibiotic peptide as an active ingredient.
상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 양면성(amphipathic) 항생 펩타이드에서 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 알파 나선도를 유지 또는 감소시키도록 하는 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 단계를 포함하는, 치환 전 상기 양면성 항생 펩타이드 보다 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 제조방법을 제공한다.
In one aspect to accomplish the above object, the present invention provides a method for producing an amphipathic antibiotic peptide comprising substituting at least one hydrophobic amino acid residue in a amphipathic antibiotic peptide with a hydrophilic amino acid residue to maintain or reduce alpha helix, The present invention provides a method for producing an antibiotic peptide having reduced hemolytic ability than the bi-surface antibiotic peptide.
본 발명에서 용어, "항생 펩타이드"는 박테리아나 곰팡이에 항생 효능을 가지는 펩타이드를 의미한다. 지난 30여 년 간 곤충이나 양서류 등 다양한 생명체에서 박테리아나 곰팡이의 감염에 대항하는 새로운 항생 물질들이 발견되었는데, 이러한 물질들이 비교적 그 크기가 작은 단백질이나 펩타이드임이 밝혀졌다. 이러한 숙주 방어 펩타이드(host defense peptide)는 포유류인 소, 돼지 및 인간의 장, 피부, 식균 작용 세포내, 점액질 등 다양한 곳에서도 발견되고 있다. 이러한 방어 펩타이드는 면역세포 식균 작용 세포 및 항체 등과 더불어 세균 감염에 대항하기 위한 중요한 면역요소로 인식되고 있으며, 이러한 펩타이드를 항생 펩타이드라고 지칭하게 되었다. 본 발명에서 항생 펩타이드는 항균 펩타이드와 병용될 수 있다. 본 발명에서 항생 펩타이드는 천연 유래 펩타이드 또는 인공 펩타이드일 수 있다. 인공 펩타이드는 천연 유래 펩타이드의 활성 증대 또는 독성 감소를 위하여 변형이 가해진 펩타이드이거나, 항생 펩타이드의 활성에 영향을 미치는 인자들인 알파나선도, 양전하성, 소수성 등을 고려하여 인위적으로 디자인된 모델 펩타이드일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The term "antibiotic peptide " in the present invention means a peptide having an antibiotic effect on bacteria or fungi. Over the past three decades, new antibiotics have been found against a variety of bacteria and fungi in a variety of organisms, including insects and amphibians, and these have been found to be relatively small proteins or peptides. Such host defense peptides are found in a variety of places including mammalian cows, pigs and human intestines, skin, phagocytic cells, and mucus. These protective peptides, along with immune cell phagocytic cells and antibodies, are recognized as important immune factors against bacterial infections, and these peptides are referred to as antimicrobial peptides. Antibiotic peptides in the present invention can be used in combination with an antimicrobial peptide. Antibiotic peptides in the present invention may be naturally occurring peptides or artificial peptides. Artificial peptides can be modified peptides in order to increase activity or decrease toxicity of naturally derived peptides or artificially designed peptide peptides in consideration of factors such as alpha helicality, positivity, and hydrophobicity, which affect the activity of antibiotic peptides But is not limited thereto.
항생 펩타이드는 구조상 크게 선형 펩타이드와 원형 펩타이드로 나뉠 수 있다. 또한, 이러한 펩타이드들은 그 아미노산의 서열과 길이 등이 매우 다양하지만 공통적으로 염기성 아미노산인 아르기닌이나 라이신 등의 아미노산을 가지고 있어 중성에서 펩타이드 자체가 양전하를 띌 수 있다.Antibiotic peptides can be broadly divided into linear peptides and circular peptides in structure. In addition, these peptides vary in their sequence and length, but commonly have amino acids such as arginine and lysine, which are basic amino acids, so that the peptide itself can be positively charged in neutral.
이러한 펩타이드는 다양한 구조 및 서열을 가지나, 이와 상관없이 일반적으로 대부분이 미생물의 지질막에 작용하여, 미생물 지질막의 투과도를 증가시키는 기작을 통하여 항생 활성을 가진다. 특히, 양면성 펩타이드를 이루는 소수성과 알파나선 구조는 지질막으로 들어가 이온 채널을 형성하거나 지질막을 교란시키는데 매우 중요한 역할을 한다.Although these peptides have various structures and sequences, most of them have antibiotic activity through a mechanism that increases the permeability of the microbial lipid membrane, generally acting on the lipid membrane of microorganisms. In particular, the hydrophobic and alpha helical structure of the double-sided peptide plays an important role in entering the lipid membrane and forming ion channels or disturbing the lipid membrane.
이와 더불어, 항생 펩타이드가 박테리아와 숙주인 동물 세포를 구별하여 항생 효과를 보이는 특이성에 관하여, 이에 영향을 미치는 인자들에 대하여 연구가 진행되었다. 박테리아 세포와 숙주 동물 세포를 구별하는 특이성은 두 세포 간의 지질말의 차이에서 비롯된다. 동물 세포 지질막의 표면은 중성인데 반하여 세균의 지질막은 음전하를 띄고 있으며 동물 세포 지질막에는 콜레스테롤이 있는데 반하여 세균의 막은 콜레스테롤이 없다. 이러한 지질막의 차이에 의하여 항생 펩타이드는 박테리아나 곰팡이 세포에 대한 특이성을 가질 수 있으며 이와 관련된 인자로 순 양전하, 소수성과 알파 나선도를 들 수 있다. In addition, the antibiotic peptides distinguish between bacterial and host animal cells and have antibiotic effects. The specificity of distinguishing between bacterial and host animal cells arises from the difference in lipid hairs between the two cells. The surface of the animal cell lipid membrane is neutral, whereas the lipid membrane of the bacteria is negatively charged, while the lipid membrane of the animal cell has cholesterol, while the membrane of the bacteria does not have cholesterol. Due to these differences in lipid membranes, antibiotic peptides may have specificity for bacterial or fungal cells, and related factors include net positive charge, hydrophobicity and alpha helix.
본 발명에서 용어, "양면성(amphipathic) 항생 펩타이드"는 구조적으로는 양면성, 즉 소수성과 친수성을 모두 가지는 펩타이드로서, 알파나선(α-helix) 또는 베타 병풍(β-sheet) 구조를 가질 수 있으나 이에 제한되지는 않는다. 상기 양면성 항생 펩타이드는 3차원 구조상에서 소수성 부분과 친수성 부분이 각각 결집되어 구성될 수 있으며, 이에 따라 펩타이드의 일 측면 또는 영역이 친수성을 띄고 타 측면 또는 영역이 소수성을 띌 수 있다. 상기 양면성 항생 펩타이드는 친수성 부분과 소수성 부분을 가짐에 따라, 친수성 부분은 지질막의 외부 노출에 면하고, 소수성 부분은 지질막의 소수성을 띄는 내부에 면하여, 지질막에서 이온 채널을 형성하거나 교란하여 지질막의 투과도를 증가시킬 수 있다. 상기 양면성 항생 펩타이드의 친수성 부분과 소수성 부분은 해당 영역을 이루는 아미노산이 친수성 아미노산인지 소수성 아미노산인지에 의하여 결정된다. The term "amphipathic antibiotic peptide" in the present invention is structurally bi-functional, that is, a peptide having both hydrophobicity and hydrophilicity, and may have an α-helix or β-sheet structure, But is not limited to. The bi-surface antibiotic peptide may be composed of a hydrophobic part and a hydrophilic part in a three-dimensional structure, respectively, so that one side or region of the peptide may be hydrophilic and the other side or region may be hydrophobic. Since the bi-surface antibiotic peptide has a hydrophilic part and a hydrophobic part, the hydrophilic part faces the external exposure of the lipid membrane, and the hydrophobic part faces the hydrophobic inside of the lipid membrane and forms an ion channel in the lipid membrane or disturbs the lipid membrane The permeability can be increased. The hydrophilic part and the hydrophobic part of the bi-surface antibiotic peptide are determined by whether the amino acid constituting the corresponding region is a hydrophilic amino acid or a hydrophobic amino acid.
본 발명에서 상기 양면성 항생 펩타이드는 알파나선형 또는 베타병풍형 항생 펩타이드일 수 있으며, 특히 알파나선형 펩타이드일 수 있다. In the present invention, the bilateral antibiotic peptide may be an alpha helical or beta screen antibiotic peptide, and may be an alpha helical peptide.
본 발명의 용어, "알파나선(α-helix)"는 단백질의 2차 구조 중에 하나로, 나선이 수소 결합에 의하여 안정성을 유지하는 구조를 의미한다. 일반적으로 한 펩티드 결합의 C=O 기와 4번째 있는 다른 펩티드 결합의 N-H 기 사이에 형성되는 수소 결합에 의하여 이루어진다. 한 회전에는 3.6 개의 아미노산이 있고 한 회전당 길이는 0.54 nm를 가지고 있는 2차 구조 모양일 수 있다. The term "alpha-helix" of the present invention means one of the secondary structures of proteins, wherein the helices retain their stability by hydrogen bonding. Generally, it is formed by a hydrogen bond formed between the C = O group of one peptide bond and the N-H group of the fourth peptide bond. There may be a secondary structure with 3.6 amino acids in one revolution and 0.54 nm in length per revolution.
또한, 본 발명의 용어, "베타 병풍(β-sheet)"은 단백질의 2차 구조 중의 하나로, 한 폴리펩타이드 사슬과 인접한 사슬에 있는 펩티드 결합 사이의 수소 결합에 의하여 형성된 평평한 평면 형태의 2차 구조를 의미한다. 한 마디의 병풍의 길이가 0.7 nm의 길이의 구조를 가질 수 있으며, 평행한 베타 병풍 구조 또는 역평행의 베타 병풍 구조를 가지고 있을 수 있다.
The term " beta-sheet "of the present invention is one of the secondary structures of proteins, and is a flat plane-shaped secondary structure formed by a hydrogen bond between a polypeptide chain and a peptide bond in an adjacent chain . The length of a single screen may have a length of 0.7 nm and may have a parallel beta screen structure or an anti-parallel beta screen structure.
본 발명의 양면성 항생 펩타이드는 하기 일반식을 가질 수 있다.The bi-surface antibiotic peptide of the present invention may have the following general formula.
[일반식][General formula]
(Xa-Yb-)n(Xa-Yb-) n
상기 식에서,In this formula,
X는 친수성 아미노산 잔기이고,X is a hydrophilic amino acid residue,
Y는 소수성 아미노산 잔기이며,Y is a hydrophobic amino acid residue,
a, b는 0 내지 5의 정수이고,a and b are integers of 0 to 5,
n은 1 내지 100인 정수이다.
n is an integer of 1 to 100;
상기 일반식에서, a, b는 반복되는 각 n번째 마다 다른 정수일 수 있으며, 바람직하게는, 1 내지 3의 정수일 수 있다.In the above general formula, a and b may be different integers for each n-th repetition, and may be an integer of 1 to 3, preferably.
양면성 항생 펩타이드는 그 3차원 구조에서 한쪽 측면 또는 일 부분에 소수성 부분, 다 측면 또는 타 부분에 친수성 부분이 모여있는 특징이 있으며, 이는 소수성 아미노산 잔기와 친수성 아미노산 잔기가 각각 부분에 많이 분포함으로써 생기는 현상이다. 이를 위해서는 2차원 서열상 친수성 아미노산 잔기와 소수성 아미노산 잔기가 상기 일반식과 같이 일정 개수를 번갈아 가며 존재하는 것일 수 있다.The bi-surface antibiotic peptide is characterized in that a hydrophilic part, a multi-side part, or a hydrophilic part is gathered on one side or one part in the three-dimensional structure. This is because the hydrophobic amino acid residues and the hydrophilic amino acid residues are distributed to be. For this purpose, hydrophilic amino acid residues and hydrophobic amino acid residues in the two-dimensional sequence may alternatively exist in a certain number of times as in the general formula.
이에 본 발명의 양면성 항생 펩타이드는 루신과 라이신으로 이루어진 모델 펩타이드인 LK 펩타이드일 수 있고, 특히 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다(서열번호 1 : LKKLLKLLKKLLKLAG). 또한, 본 발명의 양면성 항생 펩타이드는 자연 항생 펩타이드의 양면성을 가진 부위, 곧 알파나선 부위 또는 베타 병풍 부위일 수 있으며, 특히 LL37 펩타이드의 일부일 수 있고, 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드일 수 있다(서열번호 2 : FKRIVQRIKDFLR).
Accordingly, the double-sided antibiotic peptide of the present invention may be a peptide including the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (SEQ ID NO: 1: LKKLLKLLKKLLKLAG), which is a model peptide consisting of leucine and lysine. In addition, the double-sided antibiotic peptide of the present invention may be a site having double-side nature of a natural antibiotic peptide, that is, an alpha helical region or a beta screening site, and may be a part of LL37 peptide and may be a peptide containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: (SEQ ID NO: 2: FKRIVQRIKDFLR).
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 모델 펩타이드인 LK 펩타이드 및 자연 펩타이드인 LL37를 기준 양면성 항생 펩타이드로 하여, 본 발명의 용혈력을 감소시킨 항생 펩타이드를 제조하였다. 구체적으로, 양면성 항생 펩타이드에 존재하는 소수성 아미노산 자리에 알라닌으로 치환한 펩타이드를 제조하였다(펩타이드 1a 내지 1h 및 3a 내지 3f, 라이브러리 1 및 라이브러리 3). 상기 알라닌 치환을 통하여 선택된 자리에 치환할 최적 아미노산을 스크리닝하기 위하여 글리신(Glycine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 아스파르트산(Aspartic Acid), 아스파라긴(Asparagine), 글루탐산(Glutamic Acid), 글루타민(Glutamine), 라이신(Lysine), 또는 히스타민(Histamine)으로 치환한 펩타이드(2a 내지 2j 및 4a 내지 4o, 라이브러리 2 및 라이브러리 4)를 제조하였다.
In one specific embodiment of the present invention, an antibiotic peptide having reduced hemolytic activity according to the present invention was prepared by using the model peptide LK peptide and the natural peptide LL37 as reference bi-surface antibiotic peptides. Specifically, peptides substituted with alanine at the hydrophobic amino acid sites present in both antimicrobial peptides were prepared (
한편, 본 명세서에서 언급된 아미노산은 IUPAC-IUB 명명법에 따라 다음과 같이 약어로 기재하였다.
On the other hand, the amino acids referred to herein are abbreviated as follows according to the IUPAC-IUB nomenclature.
알라닌A 아르기닌RAlanine A arginine R
아스파라긴N 아스파르트산DAsparagine N aspartate D
시스테인C 글루탐산ECysteine C glutamic acid E
글루타민Q 글리신GGlutamine Q Glycine G
히스티딘H 이소루신IHistidine H Isoruzin I
루신L 리신KLeucine L Lysine K
메티오닌M 페닐알라닌FMethionine M phenylalanine F
프롤린P 세린SProlin P Serin S
트레오닌T 트립토판WThreonine T tryptophan W
티로신Y 발린V
Tyrosine Y valine V
본 발명에서 용어, "소수성 아미노산 잔기"는 극성이 없거나 현저히 낮은 아미노산 잔기를 의미하며, 이에 따라, 극성 용매인 물에 대하여 친화력이 없는 성질, 즉 물과 혼합되지 않는 성질을 가지는 아미노산 잔기를 의미한다. 본 발명에서 소수성 아미노산 잔기는 페닐알라닌(F), 트립토판(W), 이소루신(I), 루신(L), 프롤린(P), 메티오닌(M), 또는 발린(V)일 수 있다. The term "hydrophobic amino acid residue" in the present invention means an amino acid residue having no or extremely low polarity, and accordingly means an amino acid residue having no affinity for water as a polar solvent, that is, a property not to be mixed with water . In the present invention, the hydrophobic amino acid residue may be phenylalanine (F), tryptophan (W), isoleucine (I), leucine (L), proline (P), methionine (M), or valine (V).
본 발명에서 용어, "친수성 아미노산 잔기"는 극성을 띄는 아미노산 잔기를 의미할 수 있으며, 이에 따라, 극성 용매인 물에 대하여 친화력을 가지는, 즉 물과 혼합될 수 있는 아미노산 잔기를 의미한다. 본 발명에서 친수성 아미노산 잔기는 알라닌(A), 글라이신(G), 시스테인(C), 글루타민(Q), 아스파라긴산(D), 글루탐산(E), 트레오닌(T), 아스파라긴(N), 아르기닌(R), 세린(S), 리신(K), 티로신(Y) 또는 히스티딘(H)일 수 있다.The term "hydrophilic amino acid residue" in the present invention means an amino acid residue having polarity, and thus has an affinity for water as a polar solvent, that is, an amino acid residue that can be mixed with water. In the present invention, the hydrophilic amino acid residues include alanine (A), glycine (G), cysteine (C), glutamine (Q), aspartic acid (D), glutamic acid (E), threonine (T), asparagine (N) ), Serine (S), lysine (K), tyrosine (Y) or histidine (H).
본 발명에서 친수성 아미노산 잔기로 사용하는 알라닌이나 글라이신은 엄밀히는 극성을 크게 가지지 않는 비극성 아미노산 잔기에 해당하나, 아미노산의 부피가 현저히 작아 전체 펩타이드의 극성 또는 비극성을 결정하는데 큰 영향을 미치지 않는다. 이에, 커다란 소수성 아미노산을 상기 작은 비극성 아미노산인 알라닌이나 글라이신으로 치환했을 때, 펩타이드의 전체적인 소수성을 줄일 수 있어 상대적으로 소수성을 줄이는 혹은 친수성을 증가시키는 치환 잔기로 사용하였다.
In the present invention, alanine or glycine used as a hydrophilic amino acid residue is strictly a nonpolar amino acid residue which has no significant polarity, but the volume of the amino acid is remarkably small and does not greatly influence the determination of polarity or nonpolarity of the whole peptide. Thus, when a large hydrophobic amino acid is substituted with alanine or glycine, which is a small nonpolar amino acid, the entire hydrophobicity of the peptide can be reduced and used as a substitution moiety that reduces hydrophobicity or increases hydrophilicity.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 기준 양면성 항생 펩타이드에 대하여 이를 구성하는 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 알파 나선도를 유지 또는 감소시키도록 하는 친수성 아미노산 잔기로 치환한 펩타이드 라이브러리를 제조하는 단계를 포함하는, 항생 펩타이드 라이브러리 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 상기 항생 펩타이드 라이브러리를 구성하는 펩타이드의 용혈력을 측정하는 단계; 및 기준 양면성 항생 펩타이드에 비하여 용혈력이 감소하는 펩타이드를 선별하는 단계를 포함하는, 항생 펩타이드 스크리닝 방법을 제공한다.In another aspect, the present invention provides a method of producing a peptide library, comprising the steps of: preparing a reference bi-surface antibiotic peptide with a peptide library in which at least one hydrophobic amino acid residue constituting it is replaced with a hydrophilic amino acid residue, A method for producing an antimicrobial peptide library is provided. In addition, the present invention provides a method for detecting hemolysin of a peptide comprising the antibiotic peptide library, And a step of selecting a peptide whose hemolytic activity is lower than that of the reference bi-surface antibiotic peptide.
본 발명에서 양면성 항생 펩타이드, 소수성 아미노산 잔기, 및 친수성 아미노산 잔기는 상기 설명한 바와 동일하다.In the present invention, the bi-surface antibiotic peptide, the hydrophobic amino acid residue, and the hydrophilic amino acid residue are the same as described above.
상기 라이브러리를 구성하는 펩타이드는 숙주에 해당하는 동물 세포에 대한 용혈력이 기준 양면성 항생 펩타이드보다 낮아지는 것일 수 있다. The peptide constituting the library may be such that the hemolytic ability of the animal cell corresponding to the host is lower than that of the reference bi-surface antibiotic peptide.
본 발명의 항생 펩타이드 라이브러리를 구성하는 펩타이드의 용혈력을 측정하는 단계는 상기 항생 펩타이드를 인간 적혈구 세포에 처리하는 단계; 및 상기 처리물의 흡광도를 405 nm에서 측정하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 즉, 인간 적혈구 세포에 처리하여 적혈구가 용혈된 정도를 헤모글로빈(hemoglobin)을 측정할 수 있는 405 nm 파장에서 측정하는 것일 수 있다.
The step of measuring the hemolytic activity of the peptide constituting the antibiotic peptide library of the present invention comprises the steps of treating the human antiserum peptide with the antibiotic peptide; And measuring the absorbance of the treated material at 405 nm. That is, the degree of hemolysis of red blood cells treated with human red blood cells may be measured at a wavelength of 405 nm at which hemoglobin can be measured.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 모델 펩타이드인 LK 펩타이드 및 자연 펩타이드인 LL37를 기준 양면성 항생 펩타이드로 하여, 본 발명의 용혈력을 감소시킨 항생 펩타이드를 제조하였다. 구체적으로, 양면성 항생 펩타이드에 존재하는 소수성 아미노산 자리를 알라닌으로 치환한 알라닌 스캐닝 펩타이드 라이브러리를 제조하였다(펩타이드 1a 내지 1h 및 3a 내지 3f, 라이브러리 1 및 라이브러리 3). 상기 알라닌 스캐닝 라이브러리에서 선택된 자리에 치환할 최적 아미노산을 스크리닝하기 위하여 글리신(Glycine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 아스파르트산(Aspartic Acid), 아스파라긴(Asparagine), 글루탐산(Glutamic Acid), 글루타민(Glutamine), 라이신(Lysine), 또는 히스타민(Histamine)으로 치환한 펩타이드 라이브러리(2a 내지 2j 및 4a 내지 4o, 라이브러리 2 및 라이브러리 4)를 제조하였다. In one specific embodiment of the present invention, an antibiotic peptide having reduced hemolytic activity according to the present invention was prepared by using the model peptide LK peptide and the natural peptide LL37 as reference bi-surface antibiotic peptides. Specifically, an alanine scanning peptide library in which the hydrophobic amino acid residues present in the bi-surface antibiotic peptide was replaced with alanine was prepared (
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기에서 제조한 펩타이드의 용혈력을 측정하기 위하여, 인간 적혈구 세포에 처리하여 확인하였다. 먼저, 모델 펩타이드인 LK 펩타이드에 대한 알라닌 스캐닝 라이브러리인 라이브러리 1의 펩타이드에 대하여 용혈력을 측정한 결과, 기준 모델 펩타이드는 낮은 농도(2.5 μM)에서도 65% 이상의 높은 용혈비율을 보이는데 비하여, 이의 루신 부분을 알라닌으로 치환한 펩타이드 1a 내지 1h들은 모두 낮은 농도(2.5 μM)에서 20% 안팎으로 용혈력이 현저히 낮아짐을 확인할 수 있었다(도 1). 특히, LK 펩타이드의 8번째 루신이 알라닌으로 치환된 펩타이드 1e가 세 가지 다른 농도에서 모두 가장 낮은 용혈력을 가짐을 확인하여, 여덟번째 루신 위치를 용혈력에 가장 중요한 자리로 판단하였다. 다음으로, 최적 아미노산을 스크리닝하는 라이브러리 2의 용혈력을 측정한 결과, LK 펩타이드의 8번째 루신을 아스파라긴(N) 또는 아스파르트산(D)로 치환한 2d 및 2f 펩타이드는 기존 LK 펩타이드에 비하여 용혈력이 8000배 가량 줄어드는 것을 확인하였다(표 3).In one specific embodiment of the present invention, the hemolytic activity of the peptides prepared above was assayed by treatment with human red blood cells. First, hemolytic activity of the peptide of the
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 항생 펩타이드 제조방법에 의하여 제조된 항생 펩타이드를 제공한다. In another aspect, the present invention provides an antibiotic peptide produced by the method for producing an antimicrobial peptide of the present invention.
본 발명에서 항생 펩타이드는 임의의 자연 또는 인공 양면성 항생 펩타이드를 이용하여 제조된 것일 수 있으며, 알파나선형 또는 베타 병풍형 항생 펩타이드를 이용하여 제조된 것일 수 있으나, 상기 양면성 항생 펩타이드를 구성하는 하나 이상의 소수성 아미노산 잔기를 친수성 아미노산 잔기로 치환하는 것을 통하여 제조된 것인 한 제한되지 않는다. 또한, 제조된 항생 펩타이드는 기준 양면성 항생 펩타이드보다 숙주세포인 동물 세포에 대하여 용혈력이 감소된 것일 수 있다.In the present invention, the antibiotic peptide may be produced using any natural or artificial bilateral antibiotic peptide, and may be one prepared using an alpha helical or beta screen antibiotic peptide. However, the antibiotic peptide may include one or more hydrophobic Is not limited as long as it is produced through the substitution of an amino acid residue with a hydrophilic amino acid residue. In addition, the produced antibiotic peptide may have decreased hemolytic ability against animal cells that are host cells rather than the reference bi-surface antibiotic peptide.
바람직하게는 상기 양면성 항생 펩타이드는 서열번호 1 또는 서열번호 2일 수 있으며, Preferably, the bi-surface antibiotic peptide may be SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2,
본 발명에 의하여 제조된 항생 펩타이드는 상기 서열번호 1의 8번째 아미노산인 루신, 또는 서열번호 19의 4번째 아미노산인 이소루신, 5번째 아미노산인 발린, 또는 11번째 아미노산인 페닐알라닌을 친수성 아미노산 잔기로 치환한 것일 수 있으며, 특히 서열번호 3 내지 서열번호 40으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The antibiotic peptide prepared according to the present invention is prepared by substituting leucine, which is the eighth amino acid of SEQ ID NO: 1, or isoleucine, which is the fourth amino acid of SEQ ID NO: 19, valine, which is the fifth amino acid, or phenylalanine, which is the 11th amino acid, with a hydrophilic amino acid residue And may be selected from the group consisting of SEQ ID NO: 3 to SEQ ID NO: 40, but is not limited thereto.
본 발명의 항생 펩타이드는 균주 등을 이용한 재조합 생산 방법 또는 순차적인 화학적 아미노산 결합반응을 이용한 생산 방법 등으로 제조될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.The antibiotic peptide of the present invention can be produced by a recombinant production method using a strain or the like, or a production method using a sequential chemical amino acid binding reaction, but is not limited thereto.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명의 펩타이드를 링크 아미드 MBHA 레진(0.59 mM/g)과 Fmoc 보호기로 보호된 아미노산 단위체를 이용하여 일반적인 펩타이드 고체상 합성 방법에 따라 합성하였다. 먼저, 아미노산 단위체의 Fmoc제거하고, 이에 다음 아미노산을 결합시키는 것을 반복하여 마지막 아미노산이 결합될 때까지 진행하였다. 마지막 아미노산 결합 반응이 완결된 후, 펩타이드의 N-말단의 마지막 아미노산에 존재하는 Fmoc 보호기를 제거하고 아세틸화하여 펩타이드 합성 반응을 완결하였다(실시예 1).
In one specific embodiment of the present invention, the peptide of the present invention was synthesized according to a general peptide solid phase synthesis method using an amino acid unit protected with a link amide MBHA resin (0.59 mM / g) and an Fmoc protecting group. First, Fmoc removal of the amino acid unit and subsequent binding of the following amino acid was repeated until the last amino acid was bound. After the last amino acid binding reaction was completed, the Fmoc protecting group present at the N-terminal last amino acid of the peptide was removed and acetylated to complete the peptide synthesis reaction (Example 1).
또 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 항생 펩타이드를 유효성분으로 포함하는, 항균용 조성물을 제공한다.In another aspect, the present invention provides an antimicrobial composition comprising the antibiotic peptide of the present invention as an active ingredient.
본 발명의 항균용 조성물은 세균, 진균 또는 효모에 대해 항균 활성을 가질 수 있으며, 그람음성균 또는 그람양성균에 대하여 항균력을 가지는 것일 수 있다. 바람직하게는 더욱 바람직하게는 그람음성균인 대장균 (Escherichia coli) 또는 그람양성균인 포도상구균(Staphylococcus aureus)에 항균 활성을 가질 수 있다.The antimicrobial composition of the present invention may have an antibacterial activity against bacteria, fungi or yeast, and may have antimicrobial activity against Gram-negative bacteria or Gram-positive bacteria. Preferably, more preferably, it may have antimicrobial activity against Escherichia coli which is gram-negative bacteria or Staphylococcus aureus which is Gram-positive bacteria.
본 발명에서 용어, "항균"은 균에 저항하는 능력을 의미하며, 세균이나 곰팡이, 효도 등과 같은 미생물의 작용으로부터 방어하기 위해 이루어지는 모든 기작을 의미한다. 본 발명의 패니바실러스 크리벤시스 발효배양물을 포함하는 조성물은 세균, 진균 및 효모를 포함하는 미생물에 대한 항균활성이 뛰어난 것을 확인하였다. In the present invention, the term "antibacterial" means the ability to resist bacteria and means all mechanisms that are carried out to defend against the action of microorganisms such as bacteria, fungi, The composition comprising the fermentation broth of Fanny Bacillus cvibiscus of the present invention was found to have excellent antimicrobial activity against microorganisms including bacteria, fungi and yeast.
본 발명에서 용어, "세균"은 박테리아에 속하는 생물로서, 생명체들 중에 가장 많이 번성한 종으로 대부분 병원성 균이며 원핵생물의 특징을 그대로 가지고 있으나, 핵막이나 미토콘드리아, 엽록체와 같은 구조는 가지고 있지 않다. 크기는 0.5 μm 부터 0.5 mm 까지 다양하다. 상기 세균에는 예를 들어, 포도상구균(스타필로코커스 아우레우스, Staphylococcus aureus), 대장균(에스케리치아 콜라이, Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Paeudomonas aeruginosa)가 포함된다. In the present invention, the term "bacterium" is a bacterium belonging to bacteria. It is the most prolific species among living organisms, and most of them are pathogenic bacteria, but they do not have nucleus, mitochondria and chloroplast. Sizes range from 0.5 μm to 0.5 mm. The bacteria include, for example, Staphylococcus (Staphylococcus aureus, Staphylococcus aureus , Escherichia coli , and Paeudomonas aeruginosa .
본 발명에서 용어, "진균"은 곰팡이, 효모, 버섯을 포함한 72,000종 이상의 균종으로 구성되는 미생물군을 총칭하며, 핵막이 있는 진핵생물에 속하고, 미토콘드리아, 소포체 등의 세포 소기관이 발달해 있으며, 키틴, 글루칸 등으로 구성된 세포벽이 있다. 대부분은 세포성인 균사를 형성하여 신장, 발육하고 유성생식 및 무성생식을 하는 것이 특징이다. 번식체로 포자를 형성하지만 일부 균종은 단세포성 증식을 한다. 주로 부생균으로서 자연계의 유기분해에 관여하지만, 일부는 동식물에 기생 또는 공생한다. 상기 진균에는 예를 들어, 캔디다 알비칸스(Candida albicans) 및 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)이 포함된다. The term "fungus" in the present invention refers to a group of microorganisms consisting of more than 72,000 species including fungi, yeast, and mushroom. It belongs to eukaryotes having nuclear membrane, and mitochondria and endoplasmic reticulum are developed, Chitin, and glucan. Most of them are characterized by the formation of cell-grown mycelium to elongate, develop, sexual reproduction and asexual reproduction. Spores are formed in the form of reproductive sperm but some of the species are unicellular. It is mainly a negative bacterium, but it is involved in the organic decomposition of nature, but some parasitism or symbiosis with plants and animals. Such fungi include, for example, Candida albicans and Aspergillus niger .
본 발명에서 용어, "효모"는 곰팡이, 버섯 무리이지만 균사가 없고, 광합성능이나 운동능도 가지지 않는 단세포 생물을 총칭하며, 가장 간단한 형태의 진핵생물로 인간의 세포 주기와 비슷한 세포주기를 가지는 것으로 알려져 있다. 상기 효모에는 예를 들어, 사카로마이세스 속, 피치아 속, 캔디다 속이 포함된다.
The term "yeast" in the present invention refers to a single-celled organism that is a fungus or mushroom herb but has no mycelium, no photosynthetic ability or motility, and has the simplest form of eukaryotes having a cell cycle similar to a human cell cycle It is known. The yeast includes, for example, Saccharomyces spp., Pichia spp., Candida spp.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 본 발명에서 제조된 펩타이드의 그람음성균인 E. coli (ATCC25922)와 그람양성균인 S. aureus (ATCC29213)에 대한 항균력을 확인하였다(실시예 3). 먼저, 모델 펩타이드 기반의 라이브러리 1 및 2의 펩타이드들은 E. coli에 대해서 모두 모델 펩타이드 1보다 항균력이 2배에서 최대 8배까지 상승하는 것을 확인하였다(표 5). 다음으로, 자연 펩타이드 LL37 기반으로 한 항균력 실험은 E. coli에 대해서 자연 펩타이드 Lt 펩타이드(펩타이드 3)와 유사한 정도의 항균력을 보이는 것을 확인할 수 있었다(표 6). 이와 같이 본 발명의 용혈력은 최소 4배에서 8배 이상 증가하는데에 반해서 항균력은 유사한 정도를 유지하거나 오히려 증가하는 것을 확인하였다.
In a specific example of the present invention, the antimicrobial activity against the Gram-negative bacteria such as E. coli (ATCC25922) and S. aureus (ATCC29213), which are the peptides produced in the present invention, was confirmed (Example 3). First, the peptides of the model peptide-based
본 발명의 항균용 조성물에는 본 발명의 항생 펩타이드가 조성물의 총 중량에 대해 0.001 내지 10 중량%, 바람직하게는 0.01 내지 5 중량%, 보다 바람직하게는 0.1 내지 3중량% 포함될 수 있다. The antimicrobial composition of the present invention may contain 0.001 to 10% by weight, preferably 0.01 to 5% by weight, more preferably 0.1 to 3% by weight, based on the total weight of the composition, of the antibiotic peptide of the present invention.
본 발명의 항균용 조성물을 유효성분으로 함유하는 항균활성 효과를 갖는 각종 조성물은 예를 들면, 액상, 크림상, 페이스트상, 고체상 등 어떠한 제형으로도 응용될 수 있으며, 그 용도도 다양한 분야에 적용될 수 있다. 예를 들면 전신, 피부, 구강, 모발 등 인체관련 세정제 등 각종 화장료 조성물 등에 적용될 수 있다.Various compositions having an antimicrobial activity effect containing the antimicrobial composition of the present invention as an active ingredient can be applied to any formulations such as liquid, cream, paste, and solid forms, and its use is also applicable to various fields . And can be applied to various cosmetic compositions such as a body-related cleanser for body, skin, mouth, hair and the like.
또한, 본 발명에 따른 항균용 조성물에는 유효 성분으로서의 본 발명의 항생 펩타이드 이외에 추가적으로 당업계에 공지된 항균활성을 가진 물질이 추가적으로 포함될 수 있다.
In addition to the antibiotic peptide of the present invention as an active ingredient, the antimicrobial composition according to the present invention may additionally contain a substance having antimicrobial activity known in the art.
본 발명의 용혈력이 감소된 항생 펩타이드 제조방법을 통하여 제조된 펩타이드는 기준이 된 모델 또는 자연 양면성 항생 펩타이드에 비해서 용혈력이 최소 4배에서 최대 8000배 낮아지는데 비하여, 항균력은 비슷하거나 최대 8배까지 증가하는 효과를 보였다. 이에 따라, 해당 항생 펩타이드를 제조하는 전략은 다양한 양면성 항생 펩타이드에 적용할 수 있을 것으로 기대되며, 이렇게 제조된 본 발명의 항생 펩타이드는 숙주세포에 대한 용혈현상은 대폭 감소하는데에 반해 항균효과는 유지되는바, 부작용이 적은 항생 펩타이드로 널리 유용하게 사용될 수 있다.
The peptides produced by the method of producing antibiotic peptides having reduced hemolytic ability according to the present invention have a hemolytic potential lower than that of the reference model or natural bilateral antibiotic peptide by at least 4 to 8000 times, . Accordingly, it is expected that the antibiotic peptide of the present invention can be applied to a variety of double-sided antibiotic peptides, and the antibiotic peptide of the present invention thus produced is remarkably reduced in hemolysis to host cells, while the antimicrobial effect is maintained Bar, and antibiotic peptide with fewer side effects.
도 1은 모델 펩타이드인 LK 펩타이드에 대한 알라닌 스캐닝 라이브러리인 라이브러리 1의 펩타이드에 대하여 용혈력을 측정한 도면이다.
도 2은 자연 펩타이드 LL37의 일 부분인 13개의 아미노산으로 이루어진 Lt 펩타이드를 기반으로 한 알라닌 스캐닝 라이브러리인 라이브러리 3의 펩타이드들의 용혈력을 측정한 도면이다.
도 3은 본 발명의 펩타이드들의 소수성, 알파나선도와 상기 측정한 용혈력과의 관계를 확인한 도면이다. Brief Description of the Drawings Fig. 1 is a graph showing the hemolytic activity of the peptide of the
FIG. 2 is a graph showing the hemolytic activity of the peptides of the
FIG. 3 is a graph showing the relationship between the hydrophobicity, alpha helix and hemolytic potential of the peptides of the present invention.
이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to the following examples. However, the following examples are intended to illustrate the present invention, but the scope of the present invention is not limited thereto.
실시예Example
1. One.
펩타이드Peptides
라이브러리 합성 Library synthesis
펩타이드는 링크 아미드 MBHA 레진(0.59 mM/g)을 이용하여 일반적인 펩타이드 고체상 합성 방법에 따라 29.5 uM 스케일로 합성하였다. 합성에 필요한 아미노산 단위체는 모두 NovaBiochem에서 구입하였다. 모든 펩타이드의 N-말단을 아세틸화하였고, 이 펩타이드들은 337 nm의 질소 레이저와 1.2 m의 filght tube를 장착하고 있는 Auto Flex Ⅱ MALDI-TOF/TOF mass spectrometer(Brucker Daltonics, 독일)를 이용하여 확인하였다. 또한, Agilent 1100 HPLC를 통하여 분리하여, 순도를 확인하였다.
The peptide was synthesized on a 29.5 uM scale according to a general peptide solid phase synthesis method using a linkamide MBHA resin (0.59 mM / g). All amino acid units required for synthesis were purchased from NovaBiochem. The N-terminus of all peptides was acetylated, and these peptides were identified using an Auto Flex II MALDI-TOF / TOF mass spectrometer (Brucker Daltonics, Germany) equipped with a 337 nm nitrogen laser and a 1.2 m filght tube . The purity was also confirmed by separation through Agilent 1100 HPLC.
1-1. 1-1. 펩타이드Peptides 합성 방법 Synthesis method
펩타이드는 상기 설명한 대로, 링크 아미드 MBHA 레진(0.59 mM/g)을 이용하여 일반적인 펩타이드 고체상 합성 방법에 따라 29.5 uM 스케일로 합성하였다. 이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.The peptides were synthesized on a 29.5 uM scale according to the general peptide solid phase synthesis method using Linkamide MBHA resin (0.59 mM / g) as described above. This will be described in detail as follows.
먼저, 레진은 DMF (4 mL, 10 분)으로 swelling한 후 20% piperidine(in DMF) 4 mL을 넣고 Discover SPS Microwave Peptide Synthesizer (CEM)을 이용하여 2분 동안 Fmoc((9H-Fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl, 9H-플루오렌-9-일 메톡시카보닐) 보호기를 제거하였다. 이 후, 디클로로메탄 (4 mL, 3 번), DMF (4 mL, 3 번)으로 세척하여, 레진으로부터 piperidine 용액을 완전히 제거하였다.First, the resin was swelled with DMF (4 mL, 10 min), and 4 mL of 20% piperidine (in DMF) was added thereto. Using a Discover SPS Microwave Peptide Synthesizer (CEM), Fmoc ((9H-Fluoren- ylmethoxy) carbonyl, 9H-fluoren-9-ylmethoxycarbonyl) protecting group. This was followed by washing with dichloromethane (4 mL, 3 times) and DMF (4 mL, 3 times) to completely remove the piperidine solution from the resin.
그 후에, 상기 레진에 첫 번째 아미노산인 Glycine을 결합하기 위하여 아미노기가 Fmoc 보호기로 보호된 Glycine 아미노산 단위체, Fmoc-Gly-OH(68 mg, 6 eq.), benzotriazole-1-yl-oxy-tris-pyrridino-phosphonium hexafluoro-phosphate (PyBOP, 110 mg, 6 eq.)를 DMF 4 mL에 녹인 후 N,N-diisopropylethylamine (DIPEA , 28 μL, 6 eq.)를 마지막에 추가하고 이 용액을 위의 Fmoc 보호기가 제거된 레진에 넣고 이 현탁물(suspension)을 synthesizer에서 5분 동안 교반하여 반응시켰다. 이후 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) test를 통해 Glycine 결합 반응이 완결되었는지 확인하고, 디클로로메탄 (4 mL, 3 번), DMF (4 mL, 3 번)으로 교반 후, 여과하면서 반응 용액을 제거하였다. 이와 같은 Fmoc제거, 아미노산 결합 반응을 계속하여 마지막 아미노산이 결합될 때까지 반복하였다.Then, to bind the first amino acid Glycine to the resin, Fmoc-Gly-OH (68 mg, 6 eq.), Benzotriazole-1-yl-oxy- tris- pyridino-phosphonium hexafluoro-phosphate (PyBOP, 110 mg, 6 eq.) was dissolved in 4 mL of DMF and N, N-diisopropylethylamine (DIPEA, 28 μL, 6 eq.) was added at the end. Was added to the removed resin and the suspension was reacted by stirring in a synthesizer for 5 minutes. After the completion of the glycine-binding reaction, 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) test was carried out. After stirring with dichloromethane (4 mL, 3 times) and DMF (4 mL, 3 times) . Such Fmoc removal and amino acid binding reaction were repeated until the last amino acid was bound.
마지막 아미노산 결합 반응이 완결된 후, 제조된 펩타이드의 N-말단의 아세틸화는 상기와 동일한 방법으로 Fmoc 보호기를 제거하고, N-Hydroxybenzotriazole (HOBt, 41.2 mg, 10 eq), 무수 아세트산 (29 μL, 10eq)를 DMF 3.6mL, 디클로로메탄 0.4mL에 녹여 이 용액을 레진에 넣고 synthesizer에서 5분간 교반하여 수행하였다.
After the final amino acid binding reaction was completed, the N-terminal acetylation of the prepared peptide was carried out in the same manner as described above, except that the Fmoc protecting group was removed and N-hydroxybenzotriazole (HOBt, 41.2 mg, 10 eq),
1-2. 1-2. 펩타이드의Of peptide 분리 및 전제 방법 Separation and premise method
상기 실시예 1-1에서 제조된 펩타이드를 고체상(레진)으로부터 분리시키기 위해, 메탄올로 레진을 수축시키고, cleavage cocktail(1.5 mL, trifluoroacetic acid (TFA)/triisopropyl silane (TIS)/water = 95:2.5:2.5)을 넣고 2 시간 교반하여 펩타이드를 레진으로부터 분리하였다. 그 후 레진은 여과하여 제거하고, TFA (0.5 mL, 2 번)로 레진을 세척하여 남아있는 펩타이드를 회수하였다. To separate the peptide prepared in Example 1-1 from the solid phase (resin), the resin was shrunk with methanol and the cleavage cocktail (1.5 mL, trifluoroacetic acid (TFA) / triisopropyl silane (TIS) / water = 95: 2.5 : 2.5) was added thereto and stirred for 2 hours to separate the peptide from the resin. The resin was then removed by filtration and the resin was washed with TFA (0.5 mL, 2 times) to recover the remaining peptide.
상기 얻어진 용액을 질소하에서 농축시킨 후 10 mL의 차가운 디에틸 에테르와 n-헥산 (v/v = 50/50)를 넣어 펩타이드를 침전시켰다. 얻어진 침전물을 13000 rpm에서 5 분간 원심분리하여 펩타이드를 pellet으로 얻고 위의 상층액은 decantation하여 조심스럽게 제거하였다. 이 pellet은 10 mL의 차가운 디에틸 에테르와 n-헥산 (v/v = 50/50)으로 두 번 더 원심분리, decantation하여 세척하였다.The obtained solution was concentrated under nitrogen, and 10 mL of cold diethyl ether and n-hexane (v / v = 50/50) were added to precipitate the peptide. The obtained precipitate was centrifuged at 13000 rpm for 5 minutes to obtain a peptide as a pellet, and the supernatant was decanted and carefully removed. The pellet was washed by decantation and centrifugation twice with 10 mL of cold diethyl ether and n-hexane (v / v = 50/50).
상기 얻어진 펩타이드 pellet을 공기 중에서 말리고, DMSO (0.2 mL)에 녹여 0.45 μm의 주사기 필터(syringe filter)로 여과시킨 후, HPLC를 이용하여 정제하였다. HPLC는 waters 600을 사용하였으며, 고정상으로 XBridgeTM Prep C18 5 μm OBDTM(19 mm x 150 mm, Waters) 이동상으로 Buffer A, 0.1% TFA(in H2O)와 Buffer B, 0.1% TFA(in CH3CN)를 사용하여 0 min ~ 60 min, 0 % ~ 100 % B 조건으로 농도 기울기를 주어 분리하였다. The obtained peptide pellet was dried in air, dissolved in DMSO (0.2 mL), filtered through a 0.45 μm syringe filter, and purified using HPLC. HPLC was carried out using a
일 예로, 서열번호 1의 펩타이드 1은 52%의 buffer B 조건에서 분리되었으며, 얻어진 펩타이드 1은 동결 건조하여 하얀색 고체 파우더를 얻었다(19.2 mg) MS [M+H]+: 1860.34(calcd), 1861.22(obsd).
In one example,
1-3. 제조 1-3. Produce 펩타이드Peptides 서열 및 질량 분석 Sequence and mass analysis
상기와 같은 방법으로 하기 표 1의 펩타이드들을 제조하였다. Peptides of the following Table 1 were prepared as described above.
먼저, 서열번호 1의 모델 펩타이드인 LK 펩타이드에서 루신 아미노산 자리에 알라닌으로 치환한 모델 펩타이드에 대한 알라닌 스캐닝 라이브러리 펩타이드(1a 내지 1h, 라이브러리 1)를 제조하였다. 상기 알라닌 스캐닝 라이브러리에서 선택된 여덟번째 루신 자리에 치환할 최적 아미노산을 스크리닝하기 위하여 글리신(Glycine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 아스파르트산(Aspartic Acid), 아스파라긴(Asparagine), 글루탐산(Glutamic Acid), 글루타민(Glutamine), 라이신(Lysine), 또는 히스타민(Histamine)으로 치환한 라이브러리 펩타이드(2a 내지 2j)를 제조하였다. 상기 펩타이드의 서열, 계산된 질량 및 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 측정된 질량은 하기 표 1과 같다.First, an alanine scanning library peptide (1a to 1h, library 1) was prepared for a model peptide substituted with alanine for the leucine amino acid site in the LK peptide of the model peptide of SEQ ID NO: 1. Serine, Proline, Aspartic Acid, Asparagine, Glutamic Acid, and Glutamic Acid to Screen the Optimal Amino Acids to be Replaced at the Eighth Lucine Site Selected in the Alanine Scanning Library ), Glutamine (Glutamine), lysine (Lysine), or histamine (Histamine). The sequence of the peptide, the calculated mass, and the measured mass using a MALDI-TOF mass spectrometer are shown in Table 1 below.
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다음으로, 상기 모델 펩타이드에 적용한 전략을 자연 펩타이드인 LL37에 도입하였다. 양면성을 가진 펩타이드로 항균력은 좋지만 부작용인 용혈현상이 있는 것으로 알려져 있는 LL37의 일 부분인 13개의 아미노산으로 이루어진 펩타이드에 상기 전략을 도입하여 제조한 라이브러리의 펩타이드 서열, 계산된 질량 및 MALDI-TOF 질량 분석기를 이용한 측정된 질량은 하기 표 2와 같다.Next, the strategy applied to the model peptide was introduced into the natural peptide LL37. The peptide sequence, calculated mass, and MALDI-TOF mass spectrometer of the library prepared by introducing the above strategy into a peptide consisting of 13 amino acids, which is a part of LL37, which is a double-sided peptide, Are shown in Table 2. < tb > < TABLE >
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실시예Example
2. 합성된 2. Synthesized
펩타이드의Of peptide
용혈력Hemolytic power
측정 Measure
2-1. 2-1. 용혈력Hemolytic power 측정 방법 How to measure
상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드의 용혈력을 측정하기 위하여, 인간 적혈구 세포에 처리하여 확인하였다. In order to measure the hemolytic activity of the peptide prepared in Example 1, it was confirmed by treatment with human red blood cells.
구체적으로는, 먼저 혈액 2 mL을 항응고제 처리된 튜브에 넣고 1400 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 제거하였다. 하층에 모인 적혈구에 PBS(phosphate-buffered saline; 100 mM NaCl, 80 mM Na2HPO4, pH 7.4)를 1 mL 넣고 가볍게 위 아래로 흔들어 준 후, 1400 rpm에서 5분간 원심분리 후 다시 상층액을 제거하는 방법으로 상층액이 투명해질 때까지 3번 이상 적혈구를 세척하였다. Specifically, 2 mL of blood was put into a tube treated with anticoagulant, centrifuged at 1400 rpm for 10 minutes, and then the supernatant was removed. 1 mL of PBS (phosphate-buffered saline; 100 mM NaCl, 80 mM Na 2 HPO 4 , pH 7.4) was added to the red blood cells collected in the lower layer and then lightly shaken up and down. After centrifugation at 1400 rpm for 5 minutes, The erythrocytes were washed 3 times or more until the supernatant was transparent.
세척이 끝난 적혈구는 적혈구 대 PBS의 부피비가 1 : 19 되도록 PBS(5% hematocrit PBS)로 희석시켜 준비하였다. 상기 펩타이드는 PBS를 이용하여 2-fold serial dilution을 통해 원하는 농도로 준비하여 각 농도의 펩타이드 용액을 200 ㎕씩 마이크로 파이펫을 사용하여 microtiter plate로 옮겼다. 그 후 준비한 적혈구를 50 ㎕씩 펩타이드 용액을 넣은 microtiter plate의 각 well에 옮겨 넣고 37℃ 인큐베이터에 3 시간 동안 두었다. 그 후 인큐베이터에서 plate를 꺼내 1400 rpm에서 5분간 원심분리 후 상층액을 따서 새로운 microtiter plate에 옮겼다. 405 nm에서 흡광도를 측정하여 용혈 비율(%)을 측정하였으며, 이때 대조군으로는 PBS와 증류수를 이용하였다.
The washed red blood cells were prepared by diluting with PBS (5% hematocrit PBS) so that the volume ratio of red blood cells to PBS was 1: 19. The peptide was prepared at a desired concentration through 2-fold serial dilution using PBS, and 200 μl of each concentration of the peptide solution was transferred to a microtiter plate using a micropipette. Then, 50 ㎕ of red blood cells were transferred into each well of a microtiter plate containing a peptide solution and placed in a 37 ° C incubator for 3 hours. The plate was then removed from the incubator and centrifuged at 1400 rpm for 5 minutes. The supernatant was removed and transferred to a new microtiter plate. Absorbance was measured at 405 nm and hemolysis rate (%) was measured. PBS and distilled water were used as a control group.
2-2. 모델 2-2. Model 펩타이드Peptides 기반 라이브러리 Based library 펩타이드의Of peptide 용혈력Hemolytic power 측정 Measure
먼저, 모델 펩타이드인 LK 펩타이드에 대한 알라닌 스캐닝 라이브러리인 라이브러리 1의 펩타이드에 대하여 용혈력을 측정하였다(도 1). 그 결과, 도 1에서 확인할 수 있듯이, 모델 펩타이드는 낮은 농도(2.5 μM)에서도 65% 이상의 높은 용혈비율을 보이는데 비하여, 이의 루신 부분을 알라닌으로 치환한 펩타이드 1a 내지 1h 모두 낮은 농도(2.5 μM)에서 20% 안팎의 현저히 낮아진 용혈비율을 확인할 수 있었다. 이는 본 발명의 전략인 항생 펩타이드에 존재하는 소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환할 경우 용혈력을 줄일 수 있다는 것을 보여주는 것이다. 한편, LK 펩타이드의 8번째 루신이 알라닌으로 치환된 펩타이드 1e가 세 가지 다른 농도에서 모두 가장 낮은 용혈력을 가진다는 것을 확인하였다. 따라서, 여덟번째 루신 위치가 용혈력을 낮추는데 가장 중요한 자리로 판단하였다.First, hemolytic activity was measured on the peptide of the
이에 실시예 1에 설명한 바와 같이, 최적 아미노산을 스크리닝하는 라이브러리 2에서는 LK 펩타이드의 8번째 루신을 글리신(Glycine), 세린(Serine), 프롤린(Proline), 아스파르트산(Aspartic Acid), 아스파라긴(Asparagine), 글루타민산(Glutamic Acid), 글루타민(Glutamine), 라이신(Lysine), 또는 히스타민(Histamine)의 친수성 아미노산으로 치환한 펩타이드를 제조하였다. 해당 라이브러리 2의 펩타이드들에 대하여 상기와 동일한 방법으로 용혈력을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 3과 같다.As described in Example 1, in the library 2 for screening the optimal amino acid, the eighth leucine of the LK peptide was substituted with glycine, serine, proline, aspartic acid, asparagine, , Glutamic acid (Glutamic Acid), glutamine (Glutamine), lysine, or histamine (Histamine). The hemolytic activity was measured for the peptides of the library 2 in the same manner as above, and the results are shown in Table 3 below.
*MHC : Minimum Hemolytic Concentration의 약자로, 용혈 현상을 10% 미만으로 일으키는 펩타이드의 최대 농도값을 의미한다.
* MHC: Abbreviation for Minimum Hemolytic Concentration, which means the maximum concentration of a peptide that causes less than 10% hemolysis.
상기 표 3에서 확인할 수 있듯이, LK 펩타이드의 8번째 루신을 아스파라긴(N) 또는 아스파르트산(D)로 치환한 2d 및 2f 펩타이드는 기존 LK 펩타이드에 비하여 용혈력이 8000배 가량 줄어드는 것을 확인할 수 있다. As shown in Table 3, the 2d and 2f peptides in which the eighth leucine of the LK peptide was substituted with asparagine (N) or aspartic acid (D) showed a decrease in hemolysis power by 8,000 times as compared with the conventional LK peptide.
2-3. 2-3. LL37LL37 펩타이드Peptides 기반 라이브러리 Based library 펩타이드의Of peptide 용혈력Hemolytic power 측정 Measure
다음으로, 자연 펩타이드 LL37의 일 부분인 13개의 아미노산으로 이루어진 Lt 펩타이드를 기반으로 한 알라닌 스캐닝 라이브러리인 라이브러리 3의 펩타이드들의 용혈력을 측정하였다(도 2). 그 결과, 높은 용혈력을 보이는 Lt 펩타이드인 펩타이드 3에 비하여, 이의 소수성 부분을 알라닌으로 치환한 펩타이드 3a 내지 3f가 모두 용혈력이 현저히 낮아짐을 확인할 수 있었다. 이는 상기 모델 펩타이드에서 확인한 항생 펩타이드에 존재하는 소수성 아미노산을 친수성 아미노산으로 치환할 경우 용혈력을 줄일 수 있다는 것이 자연 펩타이드에 적용시에도 동일하게 작용함을 보여주는 것이다. Next, the hemolytic activity of the peptide of the
이 중에 알라닌 스캐닝 라이브러리 펩타이드 3b, 3c, 및 3e에 상응하는 4, 5, 또는 11번째 소수성 아미노산을 글라이신, 세린, 아스파라긴, 글루타민 또는 히스티딘의 친수성 아미노산으로 치환한 펩타이드를 제조하였다(라이브러리 4). 해당 라이브러리 4의 펩타이드들에 대하여 상기와 동일한 방법으로 용혈력을 측정하였으며, 그 결과는 하기 표 4와 같다.Among them, peptides in which 4, 5, or 11th hydrophobic amino acids corresponding to alanine
상기 표 4에서 확인할 수 있듯이, Lt 펩타이드의 4번째 이소루신, 5번째 발린, 11번째 페닐알라닌을 글라이신, 세린, 아스파라긴, 글루타민 또는 히스티딘의 친수성 아미노산으로 치환한 상기 라이브러리 펩타이드들은 기존 Lt 펩타이드에 비하여 용혈력이 최소 4배에서 8배 이상 줄어드는 것을 확인할 수 있다.
As shown in Table 4, the library peptides in which the 4th isoleucine, the 5th valine and the 11th phenylalanine of the Lt peptide were substituted with the hydrophilic amino acids of glycine, serine, asparagine, glutamine or histidine had higher hemolytic activity Is reduced by at least 4 to 8 times.
2-4. 2-4. 용혈력Hemolytic power , , 알파나선도Alpha spiral 및 And 소수성과의Of minority performance 상관관계 correlation
일반적으로 소수성과 알파나선도는 펩타이드의 용혈현상과 깊은 관계가 있음이 알려져 있었다. 이에 소수성을 줄이는 치환을 가미한 상기 제조한 펩타이드들의 소수성, 알파나선도와 상기 측정한 용혈력과의 관계를 확인한 결과 도 3과 같은 결과를 얻었다.In general, it has been known that hydrophobicity and alpha helicity are closely related to the hemolysis of peptides. As a result of confirming the relationship between the hydrophobicity, the alpha helix and the hemolytic potential of the peptides prepared above with the substitution reducing the hydrophobicity, the results as shown in Fig. 3 were obtained.
도 3에서 확인할 수 있듯이, 펩타이드들의 알파나선 구조의 약화 및 소수성의 감소가 용혈현상을 감소시키는 것과 일응 비례함을 확인하였다.
As shown in FIG. 3, it was confirmed that the weakening of the alpha helical structure and the decrease of the hydrophobicity of the peptides are in proportion to the reduction of the hemolysis phenomenon.
실시예Example
3. 3.
펩타이드의Of peptide
항균력 측정 Antimicrobial activity measurement
상기 실시예 1에서 제조한 펩타이드의 항균력은 그람음성균인 E. coli (ATCC25922)와 그람양성균인 S. aureus (ATCC29213)에 대해서 미량희석법을 이용한 감수성 검사(microdilution susceptibility testing)로 측정하였다. 두 종류의 박테리아는 Muller-Hinton broth (Difco)에서 배양하였다.The antimicrobial activity of the peptides prepared in Example 1 was measured by microdilution susceptibility testing using Gram-negative bacteria such as E. coli (ATCC25922) and gram-positive bacteria ( S. aureus (ATCC29213)). Two types of bacteria were cultured in Muller-Hinton broth (Difco).
먼저 합성된 펩타이드를 2배수 계단 희석법(2-fold serial dilution)을 통해 Muller-Hinton broth로 희석하여 원하는 농도로 준비하였다. 펩타이드 용액을 200 ㎕씩 마이크로 파이펫을 사용하여 microtiter plate로 옮겼다. 펩타이드를 모두 옮긴 다음에는 각각의 well에 박테리아가 든 broth를 10 ㎕씩 넣었는데 박테리아의 최종 수가 1 mL당 5 x 105 colony-forming units(CFU)가 되도록 하였다. 이 microtitier plate를 37 인큐베이터에 18시간 동안 두었다. 박테리아가 생장하지 못하도록 하는 최소 펩타이드 농도를 MIC(Minimum Inhibitory Concentration)라고 하며 MIC가 작은 값을 가질수록 우수한 항균력을 가진다. First, the synthesized peptide was diluted with Muller-Hinton broth through 2-fold serial dilution to prepare a desired concentration. The peptide solution was transferred to a microtiter plate using 200 μl of micropipette. After transferring all of the peptides, 10 μl of bacterial broth in each well was added so that the final bacterial count was 5 × 10 5 colony-forming units (CFU) per mL. The microtitier plate was placed in a 37 incubator for 18 hours. The minimum peptide concentration that prevents bacteria from growing is called MIC (Minimum Inhibitory Concentration) and the better the MIC is, the better the antimicrobial activity.
상기 배양한 microtitier plate 상의 각 well을 육안으로 관찰하였을 때 박테리아가 자라지 못해서 투명한 상태를 유지하는 가장 낮은 펩타이드 농도를 각 펩타이드의 MIC로 측정하였다.When each well on the cultured microtitier plate was observed with the naked eye, the lowest peptide concentration, which was kept in a transparent state due to the bacteria not growing, was measured by MIC of each peptide.
상기 항균력 측정 실험을 모델 펩타이드 및 자연 펩타이드 LL37에 기반한 라이브러리 펩타이드에 대하여 수행한 결과는 하기 표 5 및 표 6과 같다.The results of performing the above-mentioned antibacterial activity measurement test on the library peptide based on the model peptide and the natural peptide LL37 are shown in Tables 5 and 6 below.
먼저 표 5에서 확인할 수 있듯이, 모델 펩타이드 기반의 라이브러리 1 및 2의 펩타이드들은 E. coli에 대해서 모두 모델 펩타이드 1보다 항균력이 상승하는 것을 확인할 수 있다. 이들 라이브러리 펩타이드들은 용혈력이 모델 펩타이드에 비하여 현저히 낮아지는 것을 확인한 바 있는데, 항균력은 2배에서 최대 8배까지 상승하는 것을 확인하였다.As can be seen in Table 5, the peptides of the model peptide-based
library
Peptides
order
다음으로 상기 표 6에서 확인할 수 있듯이, 자연 펩타이드 LL37 기반으로 한 항균력 실험은 E. coli에 대해서 자연 펩타이드 Lt 펩타이드(펩타이드 3)와 유사한 정도의 항균력을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 이와 같이 본 발명의 용혈력은 최소 4배에서 8배 이상 증가하는데에 반해서 항균력은 유사한 정도를 유지하는 것을 확인하였다.Next, as shown in Table 6, it was confirmed that the antibacterial activity test based on the natural peptide LL37 showed a similar antibacterial activity to that of the natural peptide Lt peptide (peptide 3) against E. coli . Thus, it was confirmed that the hemolytic power of the present invention increases at least 4 to 8 times, while the antibacterial activity is maintained at a similar level.
상기 결과들을 종합하면, 본 발명에 따라 양면성 항생 펩타이드의 용혈력을 극소화하는 펩타이드 디자인 방법을 통하여 제조한 펩타이드들은 용혈력이 현저히 감소하여, 숙주세포에 대한 독성은 현저히 줄어든 반면, 항균력은 오히려 증가되거나 원래 수준을 유지하는 것을 확인하였다. 이를 통하여 현재까지 숙주세포에 대한 심각한 부작용으로 인하여, 뛰어난 항균력에도 불구하고 활용되지 못했던 양면성을 가진 항생 펩타이드들을 부작용없이 뛰어난 항균력을 유지한 상태로 활용할 수 있음을 확인하였다.
According to the above results, the peptides prepared by the peptide design method for minimizing the hemolytic ability of the bilateral antibiotic peptides according to the present invention have remarkably decreased hemolytic ability and the toxicity to the host cells is remarkably reduced while the antibacterial activity is rather increased And it was confirmed that it maintained the original level. Thus, it has been confirmed that antibiotic peptides having double-sidedness, which had not been utilized despite their excellent antibacterial activity due to serious side effects on host cells, can be maintained in a state of excellent antimicrobial activity without side effects.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.From the above description, it will be understood by those skilled in the art that the present invention may be embodied in other specific forms without departing from the spirit or essential characteristics thereof. In this regard, it should be understood that the above-described embodiments are to be considered in all respects as illustrative and not restrictive. The scope of the present invention should be construed as being included in the scope of the present invention without departing from the scope of the present invention as defined by the appended claims.
<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> A method for designing antimicrobial peptides for reducing the hemolysis thereof <130> PA130551/KR <160> 40 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK model peptide(peptide 1) <400> 1 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative(peptide 1a) <400> 2 Ala Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1b) <400> 3 Leu Lys Lys Ala Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 4 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1c) <400> 4 Leu Lys Lys Leu Ala Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 5 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1d) <400> 5 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Ala Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 6 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1e) <400> 6 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1f) <400> 7 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Ala Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1g) <400> 8 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Ala Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 1h) <400> 9 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Leu Lys Lys Leu Leu Lys Ala Ala Gly 1 5 10 15 <210> 10 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2a) <400> 10 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Gly Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> 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(peptide 2a) <400> 10 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Gly Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 11 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2b) <400> 11 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ser Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 12 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2c) <400> 12 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Pro Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 13 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2d) <400> 13 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Asn Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2e) <400> 14 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Gln Lys Lys Leu Leu Lys Leu Ala Gly 1 5 10 15 <210> 15 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> LK peptide derivative (peptide 2f) <400> 15 Leu Lys Lys Leu Leu Lys Leu Asp Lys Lys Leu Leu Lys Leu 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Arg 1 5 10 <210> 22 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Lt peptide derivative (peptide 3c) <400> 22 Phe Lys Arg Ile Ala Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 23 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > Lt peptide derivative (peptide 3d) <400> 23 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ala Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 24 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Lt peptide derivative (peptide 3e) <400> 24 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Ala Leu Arg 1 5 10 <210> 25 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Lt peptide derivative (peptide 3f) <400> 25 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Ala Arg 1 5 10 <210> 26 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Lt peptide derivative (peptide 4a) <400> 26 Phe Lys Arg Gly Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 27 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Lt peptide derivative (peptide 4b) <400> 27 Phe Lys Arg Ser Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 28 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative (peptide 4c) <400> 28 Phe Lys Arg Asn Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 29 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Lt peptide derivative (peptide 4d) <400> 29 Phe Lys Arg Gln Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 30 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Lt peptide derivative (peptide 4e) <400> 30 Phe Lys Arg His Val Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 31 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > Lt peptide derivative (peptide 4f) <400> 31 Phe Lys Arg Ile Gly Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 32 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Lt peptide derivative (peptide 4 g) <400> 32 Phe Lys Arg Ile Ser Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 33 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative (peptide 4h) <400> 33 Phe Lys Arg Ile Asn Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 34 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Lt peptide derivative (peptide 4i) <400> 34 Phe Lys Arg Ile Gln Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative (peptide 4j) <400> 35 Phe Lys Arg Ile His Gln Arg Ile Lys Asp Phe Leu Arg 1 5 10 <210> 36 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Lt peptide derivative (peptide 4k) <400> 36 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Gly Leu Arg 1 5 10 <210> 37 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> The Lt peptide derivative (peptide 4l) <400> 37 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Ser Leu Arg 1 5 10 <210> 38 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Lt peptide derivative (peptide 4m) <400> 38 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Asn Leu Arg 1 5 10 <210> 39 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> Lt peptide derivative (peptide 4n) <400> 39 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp Gln Leu Arg 1 5 10 <210> 40 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> ≪ 223 > Lt peptide derivative (peptide 4o) <400> 40 Phe Lys Arg Ile Val Gln Arg Ile Lys Asp His Leu Arg 1 5 10
Claims (17)
상기 양면성 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드이고, 서열번호 1의 8번째 루신을 아스파라긴(N) 또는 아스파르트산(D)으로 치환하는 것인 방법.
A method for producing antibiotic peptides having reduced hemolytic potential compared to the bi-surface antibiotic peptide before substitution, comprising substituting at least one hydrophobic amino acid residue in the amphipathic antibiotic peptide with a hydrophilic amino acid residue that maintains or decreases alpha helicity In this case,
Wherein the double-sided peptide is the peptide of SEQ ID NO: 1 and the eighth leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with asparagine (N) or aspartic acid (D).
2. The method of claim 1, wherein the bi-surface antibiotic peptide is an alpha helical antimicrobial peptide.
상기 양면성 펩타이드는 서열번호 1의 펩타이드이고, 서열번호 1의 8번째 루신을 아스파라긴(N) 또는 아스파르트산(D)으로 치환하는 것인 방법.
A method for producing an antimicrobial peptide library, comprising preparing a peptide library in which a hydrophobic amino acid residue constituting the basal bilayer antibiotic peptide is substituted with a hydrophilic amino acid residue that maintains or decreases alpha helicity,
Wherein the double-sided peptide is the peptide of SEQ ID NO: 1 and the eighth leucine of SEQ ID NO: 1 is replaced with asparagine (N) or aspartic acid (D).
An antibiotic peptide produced by the method of claim 1 or claim 4.
14. The antibiotic peptide according to claim 13, wherein the antibiotic peptide is SEQ ID NO: 13 which is a sequence obtained by replacing eighth leucine of SEQ ID NO: 1 with asparagine (N), or SEQ ID NO: 13 which is a sequence obtained by substituting an eighth leucine of SEQ ID NO: 1 with an aspartic acid SEQ ID NO: 15.
13. An antimicrobial composition comprising an antimicrobial peptide according to claim 13 as an active ingredient.
16. The composition according to claim 15, wherein the antibiotic peptide has antibacterial activity against Gram-negative bacteria or Gram-positive bacteria.
17. The method of claim 16 wherein the gram-negative bacteria is E. coli (Escherichia coli ). < / RTI >
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