KR101582655B1 - 광활성 메티오닌 모사체 표지 단백질 생합성을 위한 메티오닐 tRNA 합성효소 변이체 - Google Patents
광활성 메티오닌 모사체 표지 단백질 생합성을 위한 메티오닐 tRNA 합성효소 변이체 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 광활성 메티오닌 모사체 표지 단백질 생합성을 위한 메티오닐 tRNA 합성효소(methionyl tRNA synthase, MRS) 변이체에 관한 것으로, 구체적으로 야생형 MRS의 아미노산 서열 N-말단으로부터 12 번째 위치의 알라닌이 글리신으로, 13 번째 위치의 류신이 세린으로, 260 번째 위치의 티로신이 페닐알라닌으로, 297 번째 위치의 이소류신이 발린으로 및 301 번째 위치의 히스티딘이 류신으로 치환된 MRS 변이체는 효과적으로 pM이 표지된 표적 단백질을 생합성함을 확인함으로써, 상기 MRS 변이체는 pM이 표지된 표적 단백질의 생합성에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 생체 내에서 표적 단백질에 광메티오닌(photomethionine, pM)을 도입하기 위한 메티오닐 tRNA 합성효소(methionyl tRNA synthase, MRS)의 변이체에 관한 것이다.
생체 고분자 간의 광활성에 의한 공유결합 형성은 많은 분자 간 결합에 중요한 정보를 제공하여 구조와 기능 연구에 중요한 역할을 하게 된다. 이 방법은 단백질-단백질 결합(Suchanek et. al., Nat Methods, 2, 261-7, 2005; Chou et. al., Chem Sci, 2, 480-83), 단백질-지질 결합(Gubbens et. al., Chem Biol, 16, 3-14, 2009), 단백질-핵산 결합(Pingoud et. al., Mol Biosyst, 1, 135-41, 2005)등에 중요한 정보를 제공하는 도구로 사용되고 있다.
단백질에 광활성기를 도입하기 위해, N-하이드록시숙시니미드(N-hydroxysuccinimide) 기에 결합시킨 디아지린(diazirine), 벤조페논(benzophonone) 및 아지드(azide)기와 같은 광활성기를 단백질의 라이신(lysine) 잔기의 아민기에 결합할 수 있으나, 이 경우 친수성 아미노산이 소수성으로 변화되어 오히려 선택적으로 분자와 단백질 간의 결합을 방해하고, 비특이적인 결합을 유발할 수 있다. 이와 같은 단점을 보완하기 위해, Jung은 단백질의 특정위치에 시스테인(cysteine) 잔기를 도입하고, 광활성기와 말레이미드(maleimide) 기를 결합시킨 물질을 시스테인을 도입하여 단백질에 광활성기를 도입하였다(Jung et. al., Anal Chem, 81, 936-42, 2009).
생체 내 단백질 생합성 단계에서 비자연계 아미노산을 단백질에 도입하려는 연구들도 시행되고 있다(Davis and Chin, Nat Reviews Mol Cell Biol, 13, 168-182, 2012). 미국 Scripps 연구소의 Schulz 박사팀은 자연계에서는 호박 종결 코돈(amber stop codon)인 TAG를 인지하는 아미노산 tRNACUA 합성효소 및 tRNACUA 쌍을 활용하여 특정 아미노산 모사체를 단백질의 특정 위치에 도입하는 연구를 수행하여, 성공적으로 다양한 아미노산 모사체를 단백질 생합성 단계에서 도입하였다(Xie and Schulz, Nat Reviews Mol Cell Biol, 7, 775-82, 2006). 미국 CALTECH의 Tirrell 교수팀은 메티오닐 tRNA 합성효소(methionyl tRNA synthase, MRS)의 변이체를 제작하여 비자연계 아미노산의 도입을 연구하였다. 특히, MRS 중 메티오닌의 결합부위로 알려진(Crepin et. al., J Mol Biol, 332, 59-72, 2003) Leu13, Tyr260 및 His301 위치에 변이를 유도하여, 아지도노르류신(azidonorleucine)을 대장균의 디하이드로포레이트 환원효소(dihydrofolate reductase)의 메티오닌 잔기에 성공적으로 도입하였다(Tanrikulu et. al., Proc Nat Acad Sci USA, 106, 15285-90, 2009).
생체 내 단백질 생합성 단계에서 광활성을 가지는 비자연계 아미노산을 단백질에 도입하려는 연구들도 시행되고 있다. Tippmann 등은 아미노산 tRNACUA 합성효소/tRNACUA 시스템을 이용하여 4'-[3-(트리플루오로메틸)-3H-디아진-3-일]-1-페닐알라닌(4'-[3-(trifluoromethyl)-3H-diazin-3-yl]-l-phenylalanine, TfmdPhe)을 대장균 내에서 Z 도메일 단백질에 성공적으로 도입하였다(Tippmann et. al., ChemBioChem, 8, 2210-14, 2007). 또한, 피롤리실(pyrrolysyl, Pyl) tRNACUA 합성효소/PyltRNACUA 시스템을 사용하여, 대장균 및 동물세포에서 디아지린 기를 도입한 라이신을 표적 단백질에 성공적으로 도입하였으며, 광활성에 의한 단백질 간의 공유결합을 유도할 수 있음을 확인하였다(Chou et. al., Chem Sci, 2, 480-83). 그러나 상기 잔기들은 크거나(bulky) 긴 탄소 사슬을 지니고 있어, 표적물질과 정교하게 공유결합을 이루는 데에 단점을 가진다. 이와 같은 문제점들은 류신 또는 메티오닌과 매우 유사한 광류신(photoleucine, pL; L-2-amino-4,4-azi-pentanoic acid) 또는 광메티오닌(photomethionine, pM; L-2-amino-5,5-azi-hexanoic acid)을 이용하여 해결이 가능하다. Suchanek 등(Nat Methods, 2, 261-7, 2005)은 동물세포 배양시 메티오닌 또는 류신이 없는 배지에 아미노산 영양원으로서 pM 또는 pL의 광활성 아미노산 모사체들을 첨가하여 단백질을 생합성 한 후, 단백질에 표지된 광활성 아미노산 모사체를 단백질 간의 결합 분석에 활용하였다. 그러나 본 발명자들이 메티오닌 종속영양(methionine auxotroph) 대장균인 E. coli B834에서 메티오닌이 없는 최소 배지에 pM을 첨가하여 단백질을 발현한 결과 단백질 발현이 매우 낮게 나타났다.
이에 본 발명자들은 생합성된 단백질 내에 pM의 도입을 증진하고자 노력한 결과, 대장균 내에서 pM이 도입된 표적 단백질의 발현을 증진시킬 수 있는 대장균 메티오닐 tRNA 합성효소(MRS)의 변이체를 성공적으로 제작하였다. 본 발명의 MRS는 기존 대장균 MRS의 메티오닌 잔기의 결합 부위로 알려진 위치 외에도, Ala12 및 Ile297 잔기를 각각 글리신(Gly)과 발린(Val)으로 치환한 결과, 표적 단백질에 pM의 도입율이 유의적으로 향상됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 생체 내에서 표적 단백질에 광메티오닌(photomethionine, pM)을 도입하기 위한 메티오닐 tRNA 합성효소(methionyl tRNA synthase, MRS)의 변이체를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
메티오닐 tRNA 합성효소(methionyl tRNA synthase, MRS)의 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 12 번째 위치의 알라닌(Ala)이 글리신(glysine)으로, 13 번째 위치의 류신(leucine)이 세린(serine)으로, 260 번째 위치의 티로신(tyrosine)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로, 297 번째 위치의 이소류신(isoleucine)이 발린(valine)으로 및 301 번째 위치의 히스티딘(histidine)이 류신으로 치환된 아미노산 서열로 구성된, 표적 단백질에 광메티오닌(photomethionine, pM) 도입을 위한 MRS 변이체를 제공한다.
또한, 본 발명은 MRS를 점 돌연변이를 통해 전체 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 12 번째 위치의 알라닌이 글리신으로, 13 번째 위치의 류신이 세린으로, 260 번째 위치의 티로신이 페닐알라닌으로, 297 번째 위치의 이소류신이 발린으로 및 301 번째 위치의 히스티딘이 류신으로 치환시키는 단계를 포함하는 표적 단백질에 pM 도입을 위한 MRS 변이체의 제조 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 MRS 변이체를 포함하는 표적 단백질에 대한 pM 도입용 시약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 MRS 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 발현 벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환체를 배양하여 pM이 표지된 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는,
표적 단백질로의 pM의 도입 방법을 제공한다.
본 발명의 메티오닐 tRNA 합성효소(methionyl tRNA synthase, MRS) 변이체는 야생형 MRS보다 효과적으로 광메티오닌(photomethionine, pM)이 도입된 표적 단백질을 생합성 할 수 있는 변이체이므로, 본 발명의 MRS 변이체를 통해 생합성된 pM 표지 단백질은 향후 특정 단백질과 특이적으로 결합하는 다른 고분자들을 분석하는데 중요한 도구로 사용될 수 있다.
도 1은 광메티오닌(photomethionine, pM) 표지 단백질을 클로닝하기 위한 pET-28at 벡터의 제조를 모식한 도이다. 6xH은 히스티딘(Higtidine) 태그를 나타내며, tc는 트롬빈 절단 부위(Trombin cleavage site)를 나타낸다.
도 2는 GFP/FIH 접합 단백질을 발현하기 위한 pET-GFP/FIH 플라스미드의 제조를 모식한 도이다.
도 3은 카복시 말단이 일부 절단된 메티오닐 tRNA 합성효소(methionyl tRNA synthase, MRS)(MRS 1-548)를 pBAD/Myc-HisA 벡터에 클로닝한 pBAD-MRSwt 플라스미드의 제조를 모식한 도이다.
도 4는 야생형 MRS를 통한 MRS 변이체의 제조를 모식한 도이다. 검은색 역삼각형은 기존 메티오닌 잔기의 위치로 알려진 13, 260 및 301 부위의 변이를 나타내며, 회색 역삼각형은 본 발명에서 대상으로 하는 12 및 297 부위의 변이를 나타낸다. 검정색 삼각형은 정지 코돈(stop codon)을 나타낸다. 각 위치에 해당하는 야생형의 아미노산은 아래에 표기하였다.
도 5는 MRS 변이체(MRS5pm)에 의한 pM 표지 6xH-EGFP의 발현의 증가를 나타낸다. Ara는 0.02 % L-아라비노오즈(L-arabinose)를, IPTG는 1 mM의 IPTG를 나타내며, M9a는 M9BV + CMS-MET를 나타낸다. X는 메티오닌 영양원을 포함하지 않은 배지에서 대장균을 배양한 경우를 나타내며, M은 메티오닌을 포함한 배지에서 대장균을 배양한 경우를 나타내고, pM은 pM을 메티오닌 영양원으로 포함한 배지에서 대장균을 배양한 경우를 나타낸다. 발현된 6xH-EGFP 단백질은 적색 화살표로 표시하였다.
도 6은 야생형 MRS 또는 MRS5pm 변이체 및 메티오닌(Met) 또는 pM의 결합 구조를 예상한 도이다. MRSwt-pM의 적색 별은 야생형 MRS 및 pM이 결합하기 위해 pM이 야생형 MRS의 결합부위에 접근할 때 분자적인 충돌이 일어나, 결합이 용이하지 않음을 보인다.
도 7은 MRS 변이체(MRS5pm)에 의한 pM 표지 6xH-FIH의 발현의 증가를 나타낸다. Ara는 0.02 % L-아라비노오즈(L-arabinose)를, IPTG는 1 mM의 IPTG를 나타내며, M9a는 M9BV + CMS-MET를 나타낸다. M은 메티오닌을 포함한 배지에서 대장균을 배양한 경우를 나타내고, pM은 pM을 메티오닌 영양원으로 포함한 배지에서 대장균을 배양한 경우를 나타낸다. 발현된 6xH-EGFP 단백질은 적색 화살표로 표시하였다.
도 8은 pM 표지 6xH-EGFP의 정제를 나타낸다. 1은 배양한 대장균을 초음파 파쇄하고 원심분리하여 수득한 상등액을 나타내며, 2는 크로마토그래피에 결합하지 않고 통과(flow trough)한 정제되지 않은 용출액을 나타내고, 3은 30 mM 히스티딘(histidine)으로 세척한 용출액을 나타내며, 4 및 5는 150mM 이미다졸(imidazol)로 용출되어 수득한 정제된 6xH-EGFP를 나타낸다.
도 9는 FIH 이량체의 구조를 나타내는 도이다. 검은색 원은 카복시 말단에 이량체 형성에 관여하는 부분을 나타내며, 초록색 원 및 적색 별은 이량체 형성 부분에 존재하는 3 개의 메티오닌 잔기를 나타내고, 초록색 원은 이 중 매우 근접하게 존재하는 2 개의 메티오닌 잔기를 나타낸다.
도 10은 365 nm의 UV 조사 유무에 의한 FIH의 이량체화를 확인한 도이다. A는 코마시에(coomassie)로 염색한 SDS-PAGE를 나타내며, B는 항-6xH 항체에 대한 웨스턴블럿(western blot)을 나타낸다.
도 2는 GFP/FIH 접합 단백질을 발현하기 위한 pET-GFP/FIH 플라스미드의 제조를 모식한 도이다.
도 3은 카복시 말단이 일부 절단된 메티오닐 tRNA 합성효소(methionyl tRNA synthase, MRS)(MRS 1-548)를 pBAD/Myc-HisA 벡터에 클로닝한 pBAD-MRSwt 플라스미드의 제조를 모식한 도이다.
도 4는 야생형 MRS를 통한 MRS 변이체의 제조를 모식한 도이다. 검은색 역삼각형은 기존 메티오닌 잔기의 위치로 알려진 13, 260 및 301 부위의 변이를 나타내며, 회색 역삼각형은 본 발명에서 대상으로 하는 12 및 297 부위의 변이를 나타낸다. 검정색 삼각형은 정지 코돈(stop codon)을 나타낸다. 각 위치에 해당하는 야생형의 아미노산은 아래에 표기하였다.
도 5는 MRS 변이체(MRS5pm)에 의한 pM 표지 6xH-EGFP의 발현의 증가를 나타낸다. Ara는 0.02 % L-아라비노오즈(L-arabinose)를, IPTG는 1 mM의 IPTG를 나타내며, M9a는 M9BV + CMS-MET를 나타낸다. X는 메티오닌 영양원을 포함하지 않은 배지에서 대장균을 배양한 경우를 나타내며, M은 메티오닌을 포함한 배지에서 대장균을 배양한 경우를 나타내고, pM은 pM을 메티오닌 영양원으로 포함한 배지에서 대장균을 배양한 경우를 나타낸다. 발현된 6xH-EGFP 단백질은 적색 화살표로 표시하였다.
도 6은 야생형 MRS 또는 MRS5pm 변이체 및 메티오닌(Met) 또는 pM의 결합 구조를 예상한 도이다. MRSwt-pM의 적색 별은 야생형 MRS 및 pM이 결합하기 위해 pM이 야생형 MRS의 결합부위에 접근할 때 분자적인 충돌이 일어나, 결합이 용이하지 않음을 보인다.
도 7은 MRS 변이체(MRS5pm)에 의한 pM 표지 6xH-FIH의 발현의 증가를 나타낸다. Ara는 0.02 % L-아라비노오즈(L-arabinose)를, IPTG는 1 mM의 IPTG를 나타내며, M9a는 M9BV + CMS-MET를 나타낸다. M은 메티오닌을 포함한 배지에서 대장균을 배양한 경우를 나타내고, pM은 pM을 메티오닌 영양원으로 포함한 배지에서 대장균을 배양한 경우를 나타낸다. 발현된 6xH-EGFP 단백질은 적색 화살표로 표시하였다.
도 8은 pM 표지 6xH-EGFP의 정제를 나타낸다. 1은 배양한 대장균을 초음파 파쇄하고 원심분리하여 수득한 상등액을 나타내며, 2는 크로마토그래피에 결합하지 않고 통과(flow trough)한 정제되지 않은 용출액을 나타내고, 3은 30 mM 히스티딘(histidine)으로 세척한 용출액을 나타내며, 4 및 5는 150mM 이미다졸(imidazol)로 용출되어 수득한 정제된 6xH-EGFP를 나타낸다.
도 9는 FIH 이량체의 구조를 나타내는 도이다. 검은색 원은 카복시 말단에 이량체 형성에 관여하는 부분을 나타내며, 초록색 원 및 적색 별은 이량체 형성 부분에 존재하는 3 개의 메티오닌 잔기를 나타내고, 초록색 원은 이 중 매우 근접하게 존재하는 2 개의 메티오닌 잔기를 나타낸다.
도 10은 365 nm의 UV 조사 유무에 의한 FIH의 이량체화를 확인한 도이다. A는 코마시에(coomassie)로 염색한 SDS-PAGE를 나타내며, B는 항-6xH 항체에 대한 웨스턴블럿(western blot)을 나타낸다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표적 단백질에 광메티오닌(photomethionine, pM) 도입을 위한 메티오닐 tRNA 합성효소(methionyl tRNA synthase, MRS)의 변이체를 제공한다.
상기 MRS 변이체는 야생형 MRS의 아미노산 서열 N-말단으로부터 12 번째 위치의 알라닌(Ala)이 글리신(glysine)으로, 13 번째 위치의 류신(leucine)이 세린(serine)으로, 260 번째 위치의 티로신(tyrosine)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로, 297 번째 위치의 이소류신(isoleucine)이 발린(valine)으로 및 301 번째 위치의 히스티딘(histidine)이 류신으로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 야생형 대장균 MRS는 서열 번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 야생형 MRS는 C-말단이 제거된 서열로부터 만들어지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 표적 단백질은 표적 단백질로는 본 실시예에서 사용한 녹색형광 단백질(enhanced green fluorescence protein, EGFP) 및 FIH(factor inhibiting hypoxia inducible factor) 뿐만 아니라 모든 단백질을 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 표적 단백질 클로닝을 위한 벡터를 제조하였으며, 이를 사용하여 6x히스티딘(6xH)이 태그된 표적 단백질로 녹색형광 단백질(enhanced green fluorescence protein)(EGFP), FIH(factor inhibiting hypoxia inducible factor) 및 EGFP-FIH을 발현하기 위한 유전자를 클로닝하였다(도 1 및 도 2 참조). 또한, C-말단이 제거된 야생형 MRS 유전자를 클로닝하여 점돌연변이를 통한 MRS 변이체를 제조하였다(도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 제조한 표적 단백질 발현 벡터를 E. coli B834에 형질전환하여, 이를 메티오닌 영양원으로 메티오닌 또는 pM을 포함하는 배지에서 EGFP, FIH 또는 GFP-FIH의 표적 단백질을 발현한 결과, 메티오닌 처리시에는 표적 단백질이 발현되었으나, pM 처리시에는 표적 단백질이 거의 발현되지 않음을 확인하였다.
또한, 본 발명자들은 상기 제조한 표적 단백질 발현 벡터 및 MRS 변이체 발현 벡터를 동시에 E. coli B834에 형질전환하여, 이를 메티오닌 영양원으로 메티오닌 또는 pM을 포함하는 배지에서 표적 단백질을 발현한 결과, 야생형 MRS가 발현되는 조건에서 메티오닌 처리시에는 EGFP, FIH 또는 GFP-FIH의 표적 단백질이 발현되었으나, pM 처리시에는 표적 단백질이 거의 발현되지 않음을 확인하였으며(도 5 및 도 7 참조), 이전에 알려진 13, 260 및 301 위치에 변이를 유발한 MRS1pm 및 MRS3pm 변이체는 야생형 MRS와 마찬가지로 pM에 의한 단백질 발현의 증가를 보이지 않음을 확인하였다. 그러나, MRS5pm 변이체를 발현시킨 경우에는 메티오닌을 처리했을 때와 마찬가지로 pM을 처리한 경우에도 6xH-EGFP 단백질이 발현됨을 확인하였다(도 5 및 도 7 참조). 이를 통해, 본 발명자들은 야생형 MRS와 메티오닌의 결합은 용이하나, 메티오닌에 비해 돌출된 디아지린기를 가지는 pM의 구조로 인하여, 야생형 MRS와 같이 Ala12 및 Ile297을 가지는 MRS는 리간드 결합 부위에 pM이 접근할 수 있는 공간이 부족하므로 pM의 결합이 어려운 반면, MRS5pm 변이체는 메틸기를 제거하기 위해 Ala12 및 Ile297 잔기를 각각 글리신과 발린으로 치환하여 MRS의 리간드 결합 부위로 pM의 접근이 용이한 효과를 가짐을 확인하였다(도 6 참조).
또한, pM의 결합을 최적화하기 위하여 기존에 알려진 기질의 결합 부위인 Leu13, Tyr260 및 His301을 각각 세린, 페닐알라닌 및 류신으로 치환함으로써, EGFP, FIH 또는 GFP-FIH의 표적 단백질에 pM의 도입 효과가 향상됨을 확인하였다(도 6 참조).
또한, 본 발명자들은 pM이 표지된 표적 단백질을 Ni-NTA-아가로오즈 크로마토그래피를 통하여 pM이 표지된 6xH-표적 단백질을 부분 분리정제하여(도 8 참조), SDS-폴리아크릴아미드 겔 및 웨스턴블럿팅을 통해 365 nm의 UV를 조사하여 광활성 공유 결합을 통해 GFP-FIH 표적 단백질의 이량체(dimer)가 형성됨을 확인하였다(도 10 참조).
따라서, 본 발명의 MRS 변이체는 pM이 표지된 표적 단백질을 유의적으로 생합성 할 수 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명은 야생형 MRS를 점 돌연변이를 통해 만들어지는 표적 단백질에 pM 도입을 위한 MRS 변이체의 제조 방법을 제공한다.
상기 MRS 변이체는 전체 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 12 번째 위치의 알라닌이 글리신으로, 13 번째 위치의 류신이 세린으로, 260 번째 위치의 티로신이 페닐알라닌으로, 297 번째 위치의 이소류신이 발린으로 및 301 번째 위치의 히스티딘이 류신으로 치환된 아미노산 서열로 구성되는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 MRS 변이체는 야생형 MRS 유전자에 돌연변이를 도입하는 것으로 제작할 수 있다. 핵산의 염기 서열에 원하는 돌연변이를 도입하는 방법은 점 돌연변이(point mutation), 축퇴성(degeneracy)을 유발하는 올리고뉴클레오타이드를 이용한 PCR, 핵산을 포함하는 세포 변이유발제 또는 방사선 노출과 같이 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.
또한, 본 발명은 MRS 변이체를 포함하는 표적 단백질에 대한 pM 도입용 시약 조성물을 제공한다.
본 발명의 MRS 변이체를 포함하는 시약 조성물은 효과적으로 pM이 도입된 표적 단백질을 생합성 할 수 있으므로, 상기 시약 조성물을 이용하여 pM이 표지된 표적 단백질을 유의적으로 생합성 할 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 MRS 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 발현 벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환체를 배양하여 pM이 표지된 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는 표적 단백질로의 pM의 도입 방법을 제공한다.
상기 발현 벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파지 벡터 및 바이러스 벡터인 것이 바람직하고, 플라스미드 벡터를 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 숙주세포는 대장균(E. coli), 원핵 생물, 효모 또는 진핵 세포인 것이 바람직하고, 대장균을 사용하는 것이 보다 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
상기 배양은
1) MRS 변이체 발현 플라스미드 및 표적 단백질 발현용 플라스미드를 동시에 대장균에 형질전환하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 형질전환체에 L-아라비노즈를 첨가하여 MRS 변이체의 발현을 유도하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 형질전환체의 배양 배지에 메티오닌을 제거하는 단계; 및
4) pM 함유 최소배지에서 pM 표지 단백질을 발현하는 단계로 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 MRS 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성으로 인하여 또는 상기 항체를 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 항체의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.
상기 발현 벡터의 제작 시에는, 상기 MRS 변이체를 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
본 발명에 따른 상기 발현벡터를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 MRS 변이체를 대량 생산할 수 있다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세포일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 동물 세포는 자가 또는 동종 이계 동물 세포일 수 있다. 숙주세포의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 상기 숙주세포로의 발현벡터 도입 방법은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<
실시예
1> 표적 단백질
클로닝을
위한 벡터의 제조
표적 단백질 클로닝을 위한 벡터를 제조하기 위하여, pET-28a(+) 벡터(Novagen, 미국)의 NdeI과 BamHI 사이에 3 개의 메티오닌 잔기를 제거하였다.
구체적으로, pET-28a(+)를 주형으로 사용하여, N-말단에 6x histidine tag (6xH)을 도입하는 정방향 프라이머(TET-Xba-F)(서열번호 3: 5'-TTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAAC-3') 및 역방향 프라이머(ET-Bam-R)(서열번호 4: 5'-GCGCGGATCCGCGCGGCACCAGGCCGC-3')를 사용하여 PCR로 증폭한 후, 증폭된 DNA를 XbaI 및 BamHI으로 잘라 pET-28a(+)의 XbaI/BamHI 위치에 삽입하여, pET-28at라 명명하였다.
그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이 상기 제조한 pET-28at 벡터는 NdeI-BamHI 사이의 3 개의 메티오닌 잔기는 제거되었으나, 트롬빈(thrombin) 절단부위를 유지하고 있어 6xH 부위의 절단이 가능한 벡터를 제조하였으며, 본 발명에서 향상된 녹색형광 단백질(enhanced green fluorescence protein)(EGFP) 및 EGFP-FIH(factor inhibiting hypoxia inducible factor)를 클로닝하기 위한 벡터로 사용하였다(도 1).
<
실시예
2>
pET
-28
at
에 표적 단백질 발현 유전자
클로닝
표적 단백질을 발현하기 위하여, 상기 <실시예 1>에서 제조한 pET-28at 벡터에 단백질 발현 유전자를 클로닝하였다.
구체적으로, EGFP 단백질의 유전자를 얻기 위하여, pEGFP-N3(BD Biosciences Clontech, 미국)를 주형으로 하여, 정방향 프라이머(GFP-Bam-F)(서열번호 5: 5'-CGGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGAG-3') 및 역방향 프라이머(GFP-Xho-R)(서열번호 6: 5'-CCGCTCGAGTTACTTGTACAGCTCGTC-3')를 사용하여 PCR로 증폭한 후, pET-28at 벡터의 BamHI/XhoI 위치에 삽입하였으며, pET-GFP라 명명하였다.
GFP-FIH 접합된 단백질의 유전자를 얻기 위하여, pEGFP-N3(BD Biosciences Clontech, 미국)를 주형으로 하고 GFP-Bam-F 정방향 프라이머 및 GFP/FIH-R 역방향 프라이머(서열 번호 7: 5'-CGCCGCTGTCCCGCCGAGAGTGATCCCG-3')를 사용하여 FIH와 연결하기 위한 EGFP 유전자를 증폭하였으며, pET-FIH(Lee등, Biol Chem, 278, 7558-63, 2003)를 주형으로 하고 GFP/FIH-F 정방향 프라이머(서열번호 8: 5'-ACTCTCGGCGGGACAGCGGCGGAGGCTG-3') 및 FIH-Xho-R 역방향 프라이머(서열번호 9: 5'-TTCCCTCGAGACCCCTGGCAGGCTAG-3')를 사용하여 EGFP와 연결하기 위한 FIH 유전자를 증폭하였다. 두 종류의 증폭된 DNA를 혼합하여 GFP-Bam-F 및 FIH-Xho-R 프라이머를 사용해 PCR로 GFP-FIH 접합 유전자를 증폭하여, 이를 pET-28at 벡터의 BamHI 및 XhoI 위치에 삽입하였고, 이를 pET-GFP/FIH로 명명하였다(도 2).
<
실시예
3>
카복시
말단이 절단된
MRS
클로닝
pM(photometionine) 표지 단백질을 합성하기 위한 MRS(methionyl tRNA synthase)를 제조하기 위하여, 야생명 MRS 유전자를 클로닝하여 이의 변이체를 제조하였다.
구체적으로, 대장균(E. coli BL21) 게놈 DNA 추출물을 주형으로 하고, MRS-Nco-F 정방향 프라이머(서열 번호 10: 5'-AATTCCATGGCTCAAGTCGCGAA-3') 및 MRS-Kpn-R 역방향 프라이머(서열 번호 11: 5'-CAGCGGTACCTTATTCTTTAGAGGCTTCCACC-3')를 사용해 서열번호 2의 염기서열로 구성된 대장균 MRS 유전자를 PCR로 증폭하였고, 이를 pBAD/Myc-HisA 벡터(Invitrogen 사, 미국)의 NcoI/KpnI 위치에 삽입하였고, 이를 pBAD-MRSwt으로 명명하였다(도 3).
야생형 MRS로부터 변이체 MRS를 제조하기 위해, 상기 pBAD-MRSwt 벡터를 주형으로 하여 점돌연변이(point mutagenesis) 방법을 통해 다양한 점 변이체를 제조하였다(도 4).
구체적으로, MRS 변이체 제조에 사용한 프라이머는 [표 1]에 정리하였다. 변이 생성을 포함하는 프라이머쌍을 이용해 도 4과 같은 구성으로 PCR을 한 유전자를 정제하여 섞어, 이를 주형으로 다시 BAD-F 및 MRS-Kpn-R 프라이머로 PCR하여 변이가 포함된 산물을 얻었다. 그 후, NcoI/KpnI로 절단하여 pBAD/Myc-HisA 벡터의 NcoI/KpnI에 삽입하여 pBAD-MRS1m을 제조하였다. 다른 변이체들도 정해진 프라이머쌍을 사용하여 동일한 방법으로 변이체를 제조하여, pBAD-MRS2m, pBAD-MRS3m, pBAD-MRS4m 및 pBAD-MRS5m을 제조하였다(도 4).
| 이름 | 염기서열 |
| MRS-Nco-F (서열번호: 10) | 5’-AATTCCATGGCTCAAGTCGCGAA-3’ |
| MRS-Kpn-R (서열번호: 11) | 5’-CAGCGGTACCTTATTCTTTAGAGGCTTCCACC-3’ |
| BAD-F (서열번호: 12) | 5’-ATGCCATAGCATTTTTATCCA-3’ |
| MRS-A12G-F (서열번호: 13) | 5’-GACGTGCGGCCTGCCGTACGCTAACGGCTCAATCC-3’ |
| MRS-A12G-R (서열번호: 14) | 5’-ACGGCAGGCCGCACGTCACCAGAATTTTCTT-3’ |
| MRS-L13G-F (서열번호: 15) | 5’-GGGCCGTACGCTAACGGCTCAATC-3’ |
| MRS-L13G-R (서열번호: 16) | 5’-GATTGAGCCGTTAGCGTACGGCCCTGCGCACGTCACCAG-3’ |
| MRS-AL/GS-F (서열번호: 17) | 5’-GACGTGCGGCTCGCCGTACGCTAACGGCTCAATC-3’ |
| MRS-AL/GS-R (서열번호: 18) | 5’-ACGGCGAGCCGCACGTCACCAGAATTTTCTTCGC-3’ |
| MRS-Y260F-F (서열번호:19) | 5’-ACCGATTGGCTTCATGGGTTCTTTCAAGAATCTGTGCGA-3’ |
| MRS-Y260F-R(서열번호: 20) | 5’-AAGAACCCATGAAGCCAATCGGTGCGTCCAGC-3’ |
| MRS-I297V-F (서열번호: 21) | 5’-GGTAAAGATGTTGTTTACTTCCTGAGCCTGTTCTGGCC-3’ |
| MRS-I297V-R (서열번호: 22) | 5’-GGCTCAGGAAGTAAACAACATCTTTACCGATGAAGTGGTACAG-3’ |
| MRS-H301L-F (서열번호: 23) | 5’-GATATTGTTTACTTCCTGAGCCTGTTCTGGCCTGC-3’ |
| MRS-H301L-R (서열번호: 24) | 5’-CAGAACAGGCTCAGGAAGTAAACAATATCTTTACC-3’ |
● MRS-Nco-F 및 MRS-Kpn-R는 MRS의 1 내지 548 서열을 증폭하여 pBAD/Myc-HisA 벡터에 도입하기 위한 프라이머 세트이다.
● MRS-A12G-F 및 MRS-A12G-R는 12번째 알라닌을 글리신으로 치환하기 위한 프라이머 세트임.
● MRS-L13G-F 및 MRS-L13G-R는 13번째 류신을 글리신으로 치환하기 위한 프라이머 세트임.
● MRS-AL/GS-F 및 MRS-AL/GS-R는 12 및 13번째 알라닌-글리신을 글리신-세린 치환하기 위한 프라이머 세트임.
● MRS-Y260F-F 및 MRS-Y260F-R는 260번째 티로신을 페닐알라닌으로 치환하기 위한 프라이머 세트임.
● MRS-I297V-F 및 MRS-I297V-R는 297번째 이소류신을 발린으로 치환하기 위한 프라이머 세트임.
● MRS-H301L-F 및 MRS-H301L-R는 301번째 히스티딘을 류신으로 치환하기 위한 프라이머 세트임.
<
실시예
4> 메티오닌 종속 영양
대장균(
E. coli
B834)에서
pM
표지 단백질 발현 확인
외부 MRS를 발현하지 않을 때 pM 표지 단백질의 발현을 확인하기 위해, 메티오닌 종속 영양 대장균인 E. coli B834에서 pM이 표지된 EGFP, FIH 또는 GFP/FIH 단백질의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 6xH 태그를 가지는 표적 단백질을 발현시키기 위하여, 상기 <실시예 2>에서 제조한 pET-GFP, pET-FIH 또는 pET-GFP/FIH 벡터를 E. coli B834에 형질전환(transformation)한 후, 카나마이신(kanamycin)에 저항성을 가지는 콜로니를 선별하여, 30 ㎍/㎖의 카나마이신을 포함하는 LB 배지에서 하루 동안 배양하였다. 그런 다음, 배양한 대장균은 2000 xg에서 15 내지 20 분간 원심분리하여 수득하고, M9B(48 mM Na2HPO4, 22 mM KH2PO4, 9 mM NaCl, 및 19 mM NH4Cl)으로 2 회 세척한 후, M9BV+1/2 CMS-MET 용액 (M9B + 0.4 % 포도당, 2 mM MgSO4, 0.1 mM CaCl2, 0.05 mM MnCl2, 0.1 M FeCl3, 1 ㎎/㎖ 티아민(thiamine), 0.2 ㎎/㎖ 니코틴아미드(nicotinamide), 0.2 ㎎/㎖ 폴릭산(folic acid), 0.2 ㎎/㎖ 콜린 클로라이드(choline chloride) 및 0.02 ㎎/㎖ 리보플라빈(riboflavine) + 375 ㎍/㎖ CSM-MET(메티오닌을 제외한 19개 아미노산 혼합물))에 1/5로 희석하여 분산하였다. 분산한 대장균은 37℃에서 2 내지 3 시간 동안 더 배양한 후, 375 ㎍/㎖ CSM-MET 및 50 ㎍/㎖ 메티오닌 또는 pM을 가하고, 1 mM IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)로 20℃에서 12 내지 16 시간 동안 단백질 발현을 유도하였다. 그런 다음, 세포는 원심분리하여 PBS로 세척하고, 수분을 마이크로 피펫으로 최대한 제거한 다음, 젖은 세포를 100 ㎎/㎖ 농도로 증류수에 희석하였다. 그런 다음, 5 ㎕를 동량의 2xSDS 완충용액과 혼합하여 100℃에서 2 분간 가열하여 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 단백질 발현을 분석하였다.
그 결과, 메티오닌 처리시에는 표적 단백질이 발현되었으나, pM 처리시에는 표적 단백질이 거의 발현되지 않음을 확인하였다.
<
실시예
5>
E.
coli
B834에서
MRS
에 의한
pM
표지 6
xH
-E
GFP
단백질 발현 확인.
약 28 KDa의 분자량을 가지며 분자 내에 모두 7개의 메티오닌을 포함하는 6xF-EGFP 및 상기 <실시예 3>에서 제조한 MRS 변이체를 이용하여, E. coli B834에서 pM이 표지된 6xH-EGFP 단백질 발현을 확인하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 3>에서 제조한 pBAD-MRSwt 또는 pBAD-MRS1m 내지 pBAD-MRS5m 및 pET-GFP를 E. coli B834에 형질전환한 후, 암피실린 및 카나마이신에 모두 저항성을 가지는 콜로니를 선별하여 암피실린 및 카나마이신을 포함하는 LB 배지에서 하루 동안 배양하였다. 배양한 대장균은 2000 xg에서 15 내지 20 분간 원심분리하여 수득하고, 암피실린 및 카나마이신을 포함하는 LB 배지에 1/20로 희석하여 분산하였다. 분산한 대장균은 1 시간 동안 더 배양한 후, 0.02 % L-아라비노오즈(L-arabinose)를 37℃에서 2 시간 동안 처리하여 야생형 MRS 또는 MRS 변이체를 발현하였다. 그런 다음, 표적 단백질인 EGFP를 발현하기 위하여, 상기 대장균을 M9B로 2 회 세척하고, M9BV+1/2 CMS-MET 용액에 1/2 내지 1/3로 희석한 다음, <실시예 4>와 동일한 방법으로 표적 단백질의 발현을 유도하였다. 배양 후, 원심분리하여 수득한 젖은 세포를 100 ㎎/㎖ 농도로 물에 희석한 다음, 5 ㎕를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 단백질 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 5에서 나타낸 바와 같이 외부 MRS의 발현이 되지 않을 때와 마찬가지로, 야생형 MRS가 발현되는 조건에서는 메티오닌 처리시 단백질의 발현이 높게 나타났으나, pM 처리시에는 EGFP 단백질이 거의 발현되지 않음을 확인하였다. 또한, 이전에 알려진 13, 260 및 301 위치에 변이를 유발한 MRS1pm 및 MRS3pm 변이체는 야생형 MRS와 마찬가지로 pM에 의한 단백질 발현의 증가를 보이지 않음을 확인하였다. 그러나, MRS5pm 변이체를 발현시킨 경우에는 메티오닌을 처리했을 때와 마찬가지로 pM을 처리한 경우에도 6xH-EGFP 단백질이 발현됨을 확인하였다(도 5). 아울러, 6xH-EGFP는 메티오닌 또는 pM을 처리하지 않은 경우, IPTG에 의한 단백질의 발현이 이루어지지 않아, pM 처리시 발현된 6xH-EGFP에는 pM이 포함되어 있음을 확인하였다(도 5).
상기 결과는 도 6에서 나타내는 바와 같이 야생형 MRS와 메티오닌의 결합은 용이하나, 메티오닌에 비해 돌출된 디아지린기를 가지는 pM의 구조로 인하여, 야생형 MRS 또는 MRS1pm 및 MRS3pm 변이체와 같이 Ala12 및 Ile297을 가지는 MRS는 리간드 결합 부위에 pM이 접근할 수 있는 공간이 부족하므로 pM의 결합이 어려움을 나타낸다. 반면에, MRS5pm 변이체는 메틸기를 제거하기 위해 Ala12 및 Ile297 잔기를 각각 글리신과 발린으로 치환하여 MRS의 리간드 결합 부위로 pM의 접근이 용이한 효과를 가짐을 확인하였다(도 6). 또한, pM의 결합을 최적화하기 위하여 기존에 알려진 기질의 결합 부위인 Leu13, Tyr260 및 His301을 각각 세린, 페닐알라닌 및 류신으로 치환한 함으로써, 6xH-EGFP 등의 표적 단백질에 pM의 도입 효과가 향상됨을 확인하였다(도 6).
<
실시예
6>
E.
coli
B834에서
MRS
에 의한
pM
표지 6
xH
-
FIH
단백질 발현.
약 45 KDa의 분자량을 가지며 분자 내에 모두 10개의 메티오닌을 포함하는 6xFIH 및 상기 <실시예 3>에서 제조한 MRS 변이체를 이용하여 E. coli B834에서 pM이 표지된 6xH-FIH 단백질을 발현하였다.
구체적으로, pBAD-MRSwt 또는 pBAD-MRS1m 내지 pBAD-MRS5m 및 pET-FIH을 E. coli B834에 형질전환한 후, 상기 <실시예 5>와 동일한 방법으로 MRS 및 FIH 단백질을 발현하였다. 배양 후, 원심분리하여 수득한 젖은 세포를 100 ㎎/㎖ 농도로 물에 희석한 다음, 5 ㎕를 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 단백질 발현을 분석하였다.
그 결과, 도 7에서 나타내는 바와 같이 MRS5pm 변이체를 발현시킨 경우에는 메티오닌을 처리했을 때보다 pM을 처리한 경우에 6xH-FIH 단백질이 유의적으로 발현됨을 확인하였다. 아울러, MRS4pm 변이체를 발현시킨 경우 6xH-FIH에 pM 표지 단백질의 발현되었으나, 야생형 및 MRS5pm 변이체를 발현시킨 경우에 비해 xH-FIH에 pM 표지 단백질이 적게 발현됨을 확인하였다(도 7). MRS4pm 변이체는 MRS5pm 변이체에서 치환한 5 개의 아미노산 잔기 중 Leu13을 세린으로 치환하는 것을 제외한 네 개의 아미노산 잔기만 치환한 변이체이므로, 상기 결과는 MRS 변이체에 의한 pM 표지 단백질의 발현에서 Leu13 잔기를 세린으로 치환하는 것이 중요함을 확인하였다.
<
실시예
7>
pM
표지 6
xH
-E
GFP
및 6
xH
-
FIH
단백질 부분 분리 정제
발현된 pM 표지 단백질을 정제하기 위하여 Ni-NTA-아가로오즈 크로마토그래피를 통하여 pM이 표지된 6xH-표적 단백질을 부분 분리정제하였다.
구체적으로, pM이 표지된 6xH-표적 단백질의 분리를 위하여 상기 <실시예 5> 또는 <실시예 6>에서 배양한 MRS5pm 변이체를 포함하여 pM 표지 단백질을 발현한 대장균을 원심분리하여 세포를 수득하였다. 그런 다음, 배양액 100 ㎖ 당 세포 파괴용 완충액(20 mM 트리스-HCl(Tris-HCl), 300 mM NaCL, 2 mM 2-머캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 1 mM PMSF 및 5 % glycerol) 1 내지 2 ㎖에 분산한 후, 초음파 파쇄하였다. 파쇄액은 15,000 rpm에서 20 분간 원심분리 하여 상등액을 수득하고, 이를 Ni-NTA-아가로오즈 크로마토그래피로 부분 분리정제하였다.
그 결과, 도 8에서 나타난 바와 같이 단계 구배 Ni-NTA-아가로오즈 크로마토그래피 중 150mM 이미다졸(imidazole) 농도에서 6xHis-태그된 표적 단백질을 부분 분리정제함을 확인하였다(도 8).
<
실시예
8>
pM
표지 6
xH
-E
GFP
및 6
xH
-
FIH
단백질의 광활성 공유 결합 분석
발현된 표적 단백질에 표지된 pM의 광활성을 가지는 것을 확인하기 위하여, 발현된 표적 단백질의 광활성 공유 결합을 분석하였다.
구체적으로, 상기 <실시예 7>에서 부분 분리정제한 pM 표지 단백질에 365 nm 파장의 UV를 조사하여 단백질간의 이량체(dimer) 형성을 확인하였다.
그 결과, 단량체(monomer)로 존재한다고 알려진 EGFP 단백질 간의 이량체를 형성하지 않음을 확인하였다. 또한, 도 9에서 나타낸 바와 같이 6xH-FIH는 C-말단으로 이량체를 형성한다고 알려져 있으며, 이량체 형성 부위에 3 개의 메티오닌 잔기가 존재하고, 이 중 2 개의 잔기가 서로 대응되는 FIH 메티오닌 잔기와 매우 밀접한 구조를 보이는 것으로 알려져 있다(도 9). 그러나, FIH 단백질 또한 본 발명의 배양 및 IPTG로 인한 유도 조건에서는 LB 배지에서의 IPTG 유도 조건(Lee등, Biol Chem, 278, 7558-63, 2003)과 다르게 UV 조사시 단백질이 침전물로 존재함을 확인하였다.
<
실시예
9>
pM
표지 6
xH
-
GFP
/
FIH
단백질의 부분 분리 정제 및 광활성 공유 결합 분석
상기 <실시예 9>의 단백질에서 광활성 공유결합이 형성되지 않음을 극복하기 위해, FIH의 아미노말단에 EGFP를 결합하여 발현한 GFP/FIH 단백질을 대장균에서 발현하였다.
구체적으로, pBAD-MRS5m 및 상기 <실시예 2>에서 제조한 pET-GFP/FIH를 E. coli B834에 형질전환한 후, 상기 <실시예 5>와 동일한 방법으로 MRS 변이체 및 GFP/FIH 단백질을 발현하였다. 그런 다음, 상기 <실시예 7>과 동일한 방법으로 Ni-NTA-아가로오즈 크로마토그래피를 통하여 pM이 표지된 6xH-GFP/FIH 단백질을 부분 분리정제하였으며, 365 nm 파장의 UV를 조사하여 단백질 간의 이량체(dimer) 형성을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 전개 후 코마시에 브릴리언트 블루 R-250(Coomassie brilliant blue R-250) 염색 및 웨스턴블럿팅(westeren blotting) 분석을 통해 확인하였다.
웨스턴블럿팅을 위하여, SDS-PAGE 후 니트로셀룰로오즈(nitrocellulose, NC) 멤브레인으로 단백질을 이동시켜 6xH 특이 마우스 단일클론항체(Aviva Systems biology, 미국) 및 겨자무과산화수소(Horse-radish peroxidase)가 결합된 항 마우스 IgG 염소 항체(Millipore, 미국)를 순차적으로 결합시켰다. 그런 다음, Amersham ECL 웨스턴블럿팅 검출시약(GE Healthcare, 미국)을 처리하여 확인하였다.
그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이 6xH-GFP/FIH 단백질을 소량 분리 정제하였으며(도 10A), 6xH는 이 tag를 인위적으로 넣어준 단백질인 GFP-FIH에만 존재하므로, 단백질이 완전히 정제되지 않아 72 KDa 위치에 몇 개 단백질 밴드가 존재하나, 6xH 특이 항체에 반응하는 밴드는 1 개뿐임을 알 수 있어, 386 nm의 UV 조사시 pM이 표지된 6xH-GFP/FIH 단백질이 이량체를 형성하는 것을 웨스턴블럿팅을 통하여 확인하였다(도 10B).
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology
<120> Methionyl tRNA synthase mutants for photoactive methionine
mimetics labelled protein biosynthesis
<130> 2013P-04-051
<160> 24
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 548
<212> PRT
<213> Escherichia coli
<400> 1
Thr Gln Val Ala Lys Lys Ile Leu Val Thr Cys Ala Leu Pro Tyr Ala
1 5 10 15
Asn Gly Ser Ile His Leu Gly His Met Leu Glu His Ile Gln Ala Asp
20 25 30
Val Trp Val Arg Tyr Gln Arg Met Arg Gly His Glu Val Asn Phe Ile
35 40 45
Cys Ala Asp Asp Ala His Gly Thr Pro Ile Met Leu Lys Ala Gln Gln
50 55 60
Leu Gly Ile Thr Pro Glu Gln Met Ile Gly Glu Met Ser Gln Glu His
65 70 75 80
Gln Thr Asp Phe Ala Gly Phe Asn Ile Ser Tyr Asp Asn Tyr His Ser
85 90 95
Thr His Ser Glu Glu Asn Arg Gln Leu Ser Glu Leu Ile Tyr Ser Arg
100 105 110
Leu Lys Glu Asn Gly Phe Ile Lys Asn Arg Thr Ile Ser Gln Leu Tyr
115 120 125
Asp Pro Glu Lys Gly Met Phe Leu Pro Asp Arg Phe Val Lys Gly Thr
130 135 140
Cys Pro Lys Cys Lys Ser Pro Asp Gln Tyr Gly Asp Asn Cys Glu Val
145 150 155 160
Cys Gly Ala Thr Tyr Ser Pro Thr Glu Leu Ile Glu Pro Lys Ser Val
165 170 175
Val Ser Gly Ala Thr Pro Val Met Arg Asp Ser Glu His Phe Phe Phe
180 185 190
Asp Leu Pro Ser Phe Ser Glu Met Leu Gln Ala Trp Thr Arg Ser Gly
195 200 205
Ala Leu Gln Glu Gln Val Ala Asn Lys Met Gln Glu Trp Phe Glu Ser
210 215 220
Gly Leu Gln Gln Trp Asp Ile Ser Arg Asp Ala Pro Tyr Phe Gly Phe
225 230 235 240
Glu Ile Pro Asn Ala Pro Gly Lys Tyr Phe Tyr Val Trp Leu Asp Ala
245 250 255
Pro Ile Gly Tyr Met Gly Ser Phe Lys Asn Leu Cys Asp Lys Arg Gly
260 265 270
Asp Ser Val Ser Phe Asp Glu Tyr Trp Lys Lys Asp Ser Thr Ala Glu
275 280 285
Leu Tyr His Phe Ile Gly Lys Asp Ile Val Tyr Phe His Ser Leu Phe
290 295 300
Trp Pro Ala Met Leu Glu Gly Ser Asn Phe Arg Lys Pro Ser Asn Leu
305 310 315 320
Phe Val His Gly Tyr Val Thr Val Asn Gly Ala Lys Met Ser Lys Ser
325 330 335
Arg Gly Thr Phe Ile Lys Ala Ser Thr Trp Leu Asn His Phe Asp Ala
340 345 350
Asp Ser Leu Arg Tyr Tyr Tyr Thr Ala Lys Leu Ser Ser Arg Ile Asp
355 360 365
Asp Ile Asp Leu Asn Leu Glu Asp Phe Val Gln Arg Val Asn Ala Asp
370 375 380
Ile Val Asn Lys Val Val Asn Leu Ala Ser Arg Asn Ala Gly Phe Ile
385 390 395 400
Asn Lys Arg Phe Asp Gly Val Leu Ala Ser Glu Leu Ala Asp Pro Gln
405 410 415
Leu Tyr Lys Thr Phe Thr Asp Ala Ala Glu Val Ile Gly Glu Ala Trp
420 425 430
Glu Ser Arg Glu Phe Gly Lys Ala Val Arg Glu Ile Met Ala Leu Ala
435 440 445
Asp Leu Ala Asn Arg Tyr Val Asp Glu Gln Ala Pro Trp Val Val Ala
450 455 460
Lys Gln Glu Gly Arg Asp Ala Asp Leu Gln Ala Ile Cys Ser Met Gly
465 470 475 480
Ile Asn Leu Phe Arg Val Leu Met Thr Tyr Leu Lys Pro Val Leu Pro
485 490 495
Lys Leu Thr Glu Arg Ala Glu Ala Phe Leu Asn Thr Glu Leu Thr Trp
500 505 510
Asp Gly Ile Gln Gln Pro Leu Leu Gly His Lys Val Asn Pro Phe Lys
515 520 525
Ala Leu Tyr Asn Arg Ile Asp Met Arg Gln Val Glu Ala Leu Val Glu
530 535 540
Ala Ser Lys Glu
545
<210> 2
<211> 1644
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 2
actcaagtcg cgaagaaaat tctggtgacg tgcgcactgc cgtacgctaa cggctcaatc 60
cacctcggcc atatgctgga gcacatccag gctgatgtct gggtccgtta ccagcgaatg 120
cgcggccacg aggtcaactt catctgcgcc gacgatgccc acggtacacc gatcatgctg 180
aaagctcagc agcttggtat caccccggag cagatgattg gcgaaatgag tcaggagcat 240
cagactgatt tcgcaggctt taacatcagc tatgacaact atcactcgac gcacagcgaa 300
gagaaccgcc agttgtcaga acttatctac tctcgcctga aagaaaacgg ttttattaaa 360
aaccgcacca tctctcagct gtacgatccg gaaaaaggca tgttcctgcc ggaccgtttt 420
gtgaaaggca cctgcccgaa atgtaaatcc ccggatcaat acggcgataa ctgcgaagtc 480
tgcggcgcga cctacagccc gactgaactg atcgagccga aatcggtggt ttctggcgct 540
acgccggtaa tgcgtgattc tgaacacttc ttctttgatc tgccctcttt cagcgaaatg 600
ttgcaggcat ggacccgcag cggtgcgttg caggagcagg tggcaaataa aatgcaggag 660
tggtttgaat ctggcctgca acagtgggat atctcccgcg acgcccctta cttcggtttt 720
gaaattccga acgcgccggg caaatatttc tacgtctggc tggacgcacc gattggctac 780
atgggttctt tcaagaatct gtgcgacaag cgcggcgaca gcgtaagctt cgatgaatac 840
tggaagaaag actccaccgc cgagctgtac cacttcatcg gtaaagatat tgtttacttc 900
cacagcctgt tctggcctgc catgctggaa ggcagcaact tccgcaagcc gtccaacctg 960
tttgttcatg gctatgtgac ggtgaacggc gcaaagatgt ccaagtctcg cggcaccttt 1020
attaaagcca gcacctggct gaatcatttt gacgcagaca gcctgcgtta ctactacact 1080
gcgaaactct cttcgcgcat tgatgatatc gatctcaacc tggaagattt cgttcagcgt 1140
gtgaatgccg atatcgttaa caaagtggtt aacctggcct cccgtaatgc gggctttatc 1200
aacaagcgtt ttgacggcgt gctggcaagc gaactggctg acccgcagtt gtacaaaacc 1260
ttcactgatg ccgctgaagt gattggtgaa gcgtgggaaa gccgtgaatt tggtaaagcc 1320
gtgcgcgaaa tcatggcgct ggctgatctg gctaaccgct atgtcgatga acaggctccg 1380
tgggtggtgg cgaaacagga aggccgcgat gccgacctgc aggcaatttg ctcaatgggc 1440
atcaacctgt tccgcgtgct gatgacttac ctgaagccgg tactgccgaa actgaccgag 1500
cgtgcagaag cattcctcaa tacggaactg acctgggatg gtatccagca accgctgctg 1560
ggccacaaag tgaatccgtt caaggcgctg tataaccgca tcgatatgag gcaggttgaa 1620
gcactggtgg aagcctctaa agaa 1644
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> TET-Xba-F
<400> 3
ttcccctcta gaaataattt tgtttaac 28
<210> 4
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ET-Bam-R
<400> 4
gcgcggatcc gcgcggcacc aggccgc 27
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP-Bam-F
<400> 5
cgggatccat ggtgagcaag ggcgag 26
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP-Xho-R
<400> 6
ccgctcgagt tacttgtaca gctcgtc 27
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP/FIH-R
<400> 7
cgccgctgtc ccgccgagag tgatcccg 28
<210> 8
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> GFP/FIH-F
<400> 8
actctcggcg ggacagcggc ggaggctg 28
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> FIH-Xho-R
<400> 9
ttccctcgag acccctggca ggctag 26
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-Nco-F
<400> 10
aattccatgg ctcaagtcgc gaa 23
<210> 11
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-Kpn-R
<400> 11
cagcggtacc ttattcttta gaggcttcca cc 32
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> BAD-F
<400> 12
atgccatagc atttttatcc a 21
<210> 13
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-A12G-F
<400> 13
gacgtgcggc ctgccgtacg ctaacggctc aatcc 35
<210> 14
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-A12G-R
<400> 14
acggcaggcc gcacgtcacc agaattttct t 31
<210> 15
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-L13G-F
<400> 15
gggccgtacg ctaacggctc aatc 24
<210> 16
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-L13G-R
<400> 16
gattgagccg ttagcgtacg gccctgcgca cgtcaccag 39
<210> 17
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-AL/GS-F
<400> 17
gacgtgcggc tcgccgtacg ctaacggctc aatc 34
<210> 18
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-AL/GS-R
<400> 18
acggcgagcc gcacgtcacc agaattttct tcgc 34
<210> 19
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-Y260F-F
<400> 19
accgattggc ttcatgggtt ctttcaagaa tctgtgcga 39
<210> 20
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-Y260F-R
<400> 20
aagaacccat gaagccaatc ggtgcgtcca gc 32
<210> 21
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-I297V-F
<400> 21
ggtaaagatg ttgtttactt cctgagcctg ttctggcc 38
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-I297V-R
<400> 22
ggctcaggaa gtaaacaaca tctttaccga tgaagtggta cag 43
<210> 23
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-H301L-F
<400> 23
gatattgttt acttcctgag cctgttctgg cctgc 35
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> MRS-H301L-R
<400> 24
cagaacaggc tcaggaagta aacaatatct ttacc 35
Claims (9)
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 메티오닐 tRNA 합성효소(methionyl tRNA synthase, MRS)의 아미노산 서열 N-말단으로부터 12 번째 위치의 알라닌(Ala)이 글리신(glysine)으로, 13 번째 위치의 류신(leucine)이 세린(serine)으로, 260 번째 위치의 티로신(tyrosine)이 페닐알라닌(phenylalanine)으로, 297 번째 위치의 이소류신(isoleucine)이 발린(valine)으로 및 301 번째 위치의 히스티딘(histidine)이 류신으로 치환된 아미노산 서열로 구성된, 표적 단백질에 광메티오닌(photomethionine, pM) 도입을 위한 MRS 변이체.
- 삭제
- 삭제
- 서열번호 1의 아미노산 서열로 구성되는 MRS를 점 돌연변이를 통해 전체 아미노산 서열에서 N-말단으로부터 12 번째 위치의 알라닌이 글리신으로, 13 번째 위치의 류신이 세린으로, 260 번째 위치의 티로신이 페닐알라닌으로, 297 번째 위치의 이소류신이 발린으로 및 301 번째 위치의 히스티딘이 류신으로 치환된 아미노산 서열을 제조하는 단계를 포함하는, 표적 단백질에 pM 도입을 위한 MRS 변이체의 제조 방법.
- 삭제
- 제 1항의 MRS 변이체를 포함하는 표적 단백질에 대한 pM 도입용 시약 조성물.
- 1) 표적 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터 및 제 1항의 MRS 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 발현 벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 형질전환체를 제조하는 단계; 및
3) 상기 단계 2)의 형질전환체를 배양하여 pM이 표지된 표적 단백질을 발현시키는 단계를 포함하는, 표적 단백질로의 pM의 도입 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 단계 1)의 벡터는 플라스미드 벡터인 것을 특징으로 하는 표적 단백질로의 pM 도입 방법.
- 제 7항에 있어서, 상기 단계 2)의 숙주세포는 대장균(E. coli), 원핵 생물, 효모 또는 진핵 세포인 것을 특징으로 하는 표적 단백질로의 pM 도입 방법.
Priority Applications (3)
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|---|---|---|---|
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| US14/894,756 US9914757B2 (en) | 2013-05-30 | 2014-05-29 | Methionyl tRNA synthetase for biosynthesis of photomethionine-labeled protein and method for preparing photoactive protein G variant using same |
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Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020130061895A KR101582655B1 (ko) | 2013-05-30 | 2013-05-30 | 광활성 메티오닌 모사체 표지 단백질 생합성을 위한 메티오닐 tRNA 합성효소 변이체 |
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Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101582655B1 (ko) |
-
2013
- 2013-05-30 KR KR1020130061895A patent/KR101582655B1/ko active Active
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Proc Natl Acad Sci U S A., Vol. 106, No. 36, P.p. 15285-15290 (2009.09.08.) |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20140140896A (ko) | 2014-12-10 |
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