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WO2024214767A1 - ペプチドライゲーション活性を有するポリペプチド及びその利用 - Google Patents

ペプチドライゲーション活性を有するポリペプチド及びその利用 Download PDF

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Publication number
WO2024214767A1
WO2024214767A1 PCT/JP2024/014648 JP2024014648W WO2024214767A1 WO 2024214767 A1 WO2024214767 A1 WO 2024214767A1 JP 2024014648 W JP2024014648 W JP 2024014648W WO 2024214767 A1 WO2024214767 A1 WO 2024214767A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
amino acid
acid sequence
polypeptide
donor substrate
present
Prior art date
Application number
PCT/JP2024/014648
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
浩之 竹田
祥吾 中野
創平 伊藤
梓 宮田
Original Assignee
国立大学法人愛媛大学
静岡県公立大学法人
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 国立大学法人愛媛大学, 静岡県公立大学法人 filed Critical 国立大学法人愛媛大学
Publication of WO2024214767A1 publication Critical patent/WO2024214767A1/ja

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)

Definitions

  • the present invention relates to a polypeptide having peptide ligation activity and its use.
  • Sortase is a unique cysteine transpeptidase that covalently binds proteins to the cell walls of Gram-positive bacteria and controls various functions such as capillary formation and expression of virulence factors.
  • sortases A to F There are six classes of sortases (classes A to F), called sortases A to F (SrtA to F).
  • Sortase has the activity of catalyzing the following peptide ligation reaction using a donor substrate containing a sortase recognition motif and an acceptor substrate containing a primary amine as substrates: (1) cleaving a peptide bond on the C-terminal side of the threonine or serine residue of the sortase recognition motif of the donor substrate; (2) of the two fragments generated by cleavage of the sortase recognition motif, the fragment containing the threonine or serine residue (referred to as the "N-terminal fragment” herein) forms a thioester bond with a specific cysteine residue of sortase to form an acyl intermediate; (3) the amino group ( -NH2 or -NH3 + ) of the primary amine of the acceptor substrate performs nucleophilic attack on the acyl intermediate to form an amide bond.
  • the donor substrate is a surface protein having a cell wall sorting signal (CWSS) motif containing the sortase recognition motif
  • the acceptor substrate is peptidoglycan of the cell wall.
  • CWSS cell wall sorting signal
  • the amino acid sequence recognized as a sortase recognition motif consists of 5 to 7 residues, usually 5 residues, and is known to differ depending on the class of sortase.
  • sortase can ligate donor substrates containing a sortase recognition motif and acceptor substrates containing other moieties, as long as they contain a primary amine.
  • sortase-mediated ligation SML or sortagging, and is known as an attractive tool for various protein and peptide modifications, such as protein engineering and the creation of antibody-drug conjugates (ADCs).
  • sortase A derived from Staphylococcus aureus
  • natural sortase A has a slow reaction rate and calcium ions are essential for activity.
  • an acceptor substrate other than one in which the N-terminal amino group on polyglycine is used as a nucleophile
  • sortase A mutants have been developed. For example, various high-activity mutants and calcium ion-independent mutants have been developed by rational design of sortase A protein and introduction of mutations using directed evolution (e.g., Non-Patent Documents 1 and 2).
  • Patent Document 1 discloses a method of using pilus-associated sortase C for SML.
  • the objective of the present invention is to develop a novel polypeptide that has an amino acid sequence that is significantly different from that of previously known sortases such as sortase A, and that has the activity of ligating a donor substrate that contains a specific amino acid sequence, such as a sortase recognition motif peptide, to an acceptor substrate that contains an amino group.
  • the inventors used a bioinformatics technique that utilized the amino acid sequence of a known sortase E to design an ancestral sortase E that has low sequence identity to known sortase E. They then unexpectedly discovered that the resulting ancestral sortase and its mutants can have the above-mentioned ligation activity, thus completing the present invention.
  • the present invention includes the following aspects.
  • It comprises any one of the following amino acid sequences (a) to (c), and A polypeptide having an activity of binding a donor substrate comprising at least one donor substrate recognition sequence to an acceptor substrate comprising at least one primary amine: (a) an amino acid sequence represented by positions 1 to 178 of SEQ ID NO:1; (b) an amino acid sequence in which 1 to 35 amino acids are deleted, inserted, substituted or added in the amino acid sequence represented by positions 1 to 178 of SEQ ID NO: 1; (c) an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence represented by positions 1 to 178 of SEQ ID NO:1.
  • polypeptide according to [1] wherein the primary amine does not contain a polyglycine having two or more amino-terminated residues.
  • polypeptide according to [1] or [2] which has the activity independent of calcium ions.
  • An expression vector comprising the polynucleotide according to [4].
  • a transformant comprising the polynucleotide according to [4].
  • An enzyme preparation comprising the polypeptide according to any one of [1] to [3].
  • kit comprising the enzyme preparation according to [7].
  • a method for producing a ligation product comprising treating a donor substrate containing at least one donor substrate recognition sequence and an acceptor substrate containing at least one primary amine with the polypeptide according to any one of [1] to [3] or the transformant according to [6].
  • FIG. 1 is a graph comparing the conversion rate when the pH of a reaction solution containing 50 ⁇ M AcSE, 0.5 mM Ac-YNLAETGA, and 1 mM GGGKY is changed in Example 2.
  • FIG. 1 shows a formula representing the reaction of a donor substrate (Ac-YNLAETGA) with a primary amine catalyzed by AcSE in Example 3, and structural formulas (1a to 1d) of the primary amines used.
  • 1 shows LC/HRMS chromatograms of ligation products (2a to 2d) in the reaction mixture obtained by reaction with AcSE in Example 3.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a ligation reaction using AcSE in Example 4. 4 is an SDS-PAGE gel image of samples after reaction 1 in Example 4.
  • FIG. 13 is a conceptual diagram showing the immobilization reaction of HTAncLAAO2 onto polyamine beads using AcSE in Example 5. This figure shows a comparison of the reactivity of polyamine beads immobilized in the presence of various concentrations of HTAncLAAO2 with five types of L-amino acids in Example 5. The deeper the purple color, the more the enzyme reaction by HTAncLAAO2 proceeded. Aspartic acid (L-Asp) is a negative control. 13 is a graph comparing the time-dependent binding efficiency of highly activated sortase A (eSrtA) and ancestral sortase E (AcSE) in Example 6.
  • eSrtA highly activated sortase A
  • AcSE ancestral sortase E
  • amino acid sequences are displayed from left to right from the amino terminal to the carboxy terminal, and nucleotide sequences are displayed from left to right from the 5' terminal to the 3' terminal.
  • amino acid sequences are displayed from left to right from the amino terminal to the carboxy terminal, and nucleotide sequences are displayed from left to right from the 5' terminal to the 3' terminal.
  • Ac- at the N-terminus of an amino acid sequence indicates that the N-terminus is acetylated.
  • ligation of a polypeptide or “peptide ligation” refers to the covalent bonding of a substrate containing a polypeptide portion to another substrate via the polypeptide portion.
  • the other substrate may be either a substrate containing a polypeptide portion or a substrate not containing a polypeptide portion.
  • the term "donor substrate” is not particularly limited as long as it contains at least one donor substrate recognition sequence.
  • the portion may be covalently bound to or associated with the N-terminus, C-terminus, or both of the donor substrate recognition sequence.
  • the multiple donor substrate recognition sequences may be the same sequence, or at least one of the donor substrate recognition sequences may be different.
  • the donor substrate can be, for example, (i) a peptide consisting of at least one donor substrate recognition sequence, or a polypeptide having at least one donor substrate recognition sequence in its portion; or (ii) A substrate in which one or more selected from the group consisting of proteins (antibodies, antibody fragments, antigens, enzymes, receptors, reporter proteins (fluorescent proteins, luminescent proteins, etc.), tag proteins (GST, MBP, etc.), etc.), peptides, DNA, RNA, nucleic acid analogs (PNA, LNA, morpholino nucleic acids, S-oligosaccharides, etc.), amino acids, nucleotide and nucleoside monomers, lipids, natural organic compounds, synthetic organic compounds, nanoparticles, quantum dots, atoms (radioactive nuclei, etc.), vesicles, saccharides, and polysaccharides are covalently bound or associated with at least one of (i).
  • proteins antibodies, antibody fragments, antigen
  • acceptor substrate is not particularly limited as long as it contains at least one primary amine containing at least one amino group capable of nucleophilic attack ( -NH2 or -NH3 + ) and can be enzymatically ligated to a donor substrate recognition sequence.
  • the acceptor substrate contains multiple primary amines, the multiple primary amines may be the same or at least one may be different.
  • the acceptor substrate can be, for example, (I) a primary amine, or (II) Substrates in which one or more selected from the group consisting of proteins (antibodies, antibody fragments, antigens, enzymes, receptors, reporter proteins (fluorescent proteins, luminescent proteins, etc.), tag proteins (GST, MBP, etc.), etc.), peptides, DNA, RNA, nucleic acid analogs (PNA, LNA, morpholino nucleic acids, S-oligosaccharides, etc.), amino acids, nucleotide and nucleoside monomers, lipids, natural organic compounds, synthetic organic compounds, nanoparticles, quantum dots, atoms (radionuclides, etc.), vesicles, saccharides, and polysaccharides are covalently bound or associated with at least one primary amine.
  • proteins antibodies, antibody fragments, antigens, enzymes, receptors, reporter proteins (fluorescent proteins, luminescent proteins, etc.), tag proteins (
  • association refers to the formation of an aggregate of two or more molecules through coordinate bonds, ionic bonds, hydrophobic interactions, van der Waals interactions, hydrogen bonds, or other non-covalent interactions, or a combination of two or more of these interactions.
  • a "donor substrate recognition sequence” refers to an amino acid sequence on a donor substrate that is enzymatically recognized and cleaved by a polypeptide of the present invention.
  • N-terminal fragment of a donor substrate recognition sequence refers to the fragment that contains the N-terminal portion of the donor substrate recognition sequence, out of the two fragments generated by cleavage of the donor substrate recognition sequence by the polypeptide of the present invention.
  • the "identity" value of an amino acid sequence or a nucleotide sequence refers to the conservation of the entire residues (monomers) when comparing two sequences.
  • the percentage of identity of an amino acid sequence and a nucleotide sequence is the percentage of identity obtained by sequence alignment using the default parameters of MAFFT (https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/), unless otherwise specified. MAFFT is available, for example, from the European Bioinformatics Institute website (https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/).
  • an amino acid sequence in which "1 to 35 amino acids have been deleted, inserted, substituted or added” includes an amino acid sequence in which preferably 1 to 20 amino acids have been deleted, inserted, substituted or added, more preferably 1 to 18 amino acids, even more preferably 1 to 15 amino acids, even more preferably 1 to 10 amino acids, and particularly preferably 1 to 5 amino acids have been deleted, inserted, substituted or added.
  • amino acid sequence or a nucleotide sequence preferably means identity of 90% or more, more preferably 95% or more, even more preferably 97% or more, even more preferably 98% or more, and particularly preferably 99% or more.
  • a portion that does not specify one of the 20 natural standard amino acids may contain, in addition to the standard amino acids, amino acids other than the standard amino acids (called “non-standard amino acids” and including unnatural amino acids), unless otherwise specified.
  • operably linked to a certain component means that the component is positioned so that it can function in the manner intended.
  • operably linking a certain regulatory element to a certain gene means that the regulatory element is linked to a polynucleotide encoding the gene so that expression of the gene can be controlled in the manner intended by the regulatory element.
  • polypeptide having peptide ligation activity of the present invention is a polypeptide which comprises any one of the following amino acid sequences (a) to (c), and has activity of binding a donor substrate containing at least one donor substrate recognition sequence to an acceptor substrate containing at least one primary amine: (a) an amino acid sequence represented by positions 1 to 178 of SEQ ID NO:1; (b) an amino acid sequence in which 1 to 35 amino acids are deleted, inserted, substituted or added in the amino acid sequence represented by positions 1 to 178 of SEQ ID NO: 1; (c) an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence represented by positions 1 to 178 of SEQ ID NO:1.
  • the polypeptide of the invention comprises: (a) comprising or consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1; or (b) comprising an amino acid sequence in which 1 to 35 amino acids have been deleted, inserted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1, or consisting of an amino acid sequence in which 1 to 35 amino acids have been deleted, inserted, substituted or added in the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 1; or (c) comprising an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1, or consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the amino acid sequence represented by SEQ ID NO:1.
  • the amino acid sequence according to (b) or (c) above may have no mutation in, for example, at least one residue corresponding to His77, Cys146, and Arg155 in SEQ ID NO: 1, preferably all of the residues corresponding to these three residues.
  • the amino acid sequence according to (b) or (c) may have no mutation in, for example, the residue corresponding to Tyr55 in SEQ ID NO: 1. These amino acid residues are presumed to be involved in exerting a specific ligation activity based on the alignment with SavSrtE.
  • the amino acid sequences (a) to (c) of the polypeptide of the present invention may be, for example, 70% or less, 60% or less, or 50% or less identical to the amino acid sequence of any of sortases A to E, respectively.
  • the polypeptide of the present invention may be, for example, 70% or less, 60% or less, or 50% or less identical to sortase A.
  • an example of the sortase A to be compared is SaSrtA.
  • polypeptide of the present invention is not particularly limited as long as it contains any of the amino acid sequences selected from (a) to (c) above and has the above activity. Therefore, the polypeptide of the present invention may further contain the amino acid sequence of a tag (His tag, FLAG tag, AGIA tag, Myc tag, etc.), a linker, or a protein or a part thereof (tag protein, reporter protein, etc.) depending on the purpose, for example, purification, labeling, detection, transport or localization, solubilization, improvement of expression level, modification, etc.
  • a tag His tag, FLAG tag, AGIA tag, Myc tag, etc.
  • linker or a protein or a part thereof (tag protein, reporter protein, etc.) depending on the purpose, for example, purification, labeling, detection, transport or localization, solubilization, improvement of expression level, modification, etc.
  • the donor substrate recognition sequence consists of an amino acid sequence of, for example, 5 to 7 residues, preferably 5 residues.
  • the donor substrate recognition sequence consists of P 1 -P 2 -P 3 -P 4 -P 5.
  • P 1 to P 5 are amino acid residues
  • P 4 is threonine, serine, or glycine, more preferably threonine or serine, and even more preferably threonine.
  • the donor substrate recognition sequence is cleaved between P 4 and P 5 by the polypeptide of the present invention, and a fragment containing P 1 -P 2 -P 3 -P 4 becomes the N-terminal fragment.
  • P 1 is, for example, leucine, alanine, phenylalanine, asparagine, or isoleucine, and is preferably leucine.
  • P 2 is, for example, alanine, proline, or methionine, and is preferably alanine or proline, and is more preferably alanine.
  • P 3 can be any amino acid.
  • P 5 is, for example, glycine, alanine, serine, or asparagine, and is preferably glycine.
  • the donor substrate recognition sequence comprises an amino acid sequence known as a sortase recognition motif.
  • a sortase recognition motif include LPXTG (SEQ ID NO: 5) for sortase A, NPXTN (SEQ ID NO: 6) for sortase B, LPXTG or LAXTG (SEQ ID NO: 7) for sortases C and D, and LAXTG for sortase E.
  • LAXTG or LPXTG are preferred as donor substrate recognition sequences, with LAXTG being more preferred.
  • the primary amine comprises a polyglycine having an amino terminus and two or more residues (e.g., two to five residues), preferably three or more residues (e.g., three to five residues).
  • a more specific example of such a primary amine is, for example, the GGGKY peptide.
  • the primary amine does not include polyglycine having two or more amino-terminated residues.
  • a primary amine is preferably one having a structure in which a methylene group (-CH 2 -) follows an amino group (-NH 2 or -NH 3 + ), and is, for example, selected from the group consisting of 1,4-diaminobutane, L-lysine, spermidine, and N,N'-bis(3-aminopropyl)ethylenediamine.
  • the above activity of the polypeptide of the present invention represents the activity of cleaving the donor substrate recognition sequence and amide-bonding the N-terminal fragment to a primary amine.
  • the N-terminal fragment forms a thioester bond with a cysteine residue of the polypeptide of the present invention to form an acyl intermediate, and the primary amine attacks the acyl intermediate with a nucleophilic bond to form an amide bond between the N-terminal fragment and the primary amine.
  • the activity of the polypeptide of the present invention can be confirmed, for example, by reacting a donor substrate containing a donor substrate recognition sequence with an acceptor substrate containing a primary amine in the presence of the polypeptide of the present invention and detecting the ligation product that is the product.
  • the substrates used in Example 2 below can be used as the donor substrate and the acceptor substrate.
  • the reaction conditions can be set appropriately according to the type and characteristics of the polypeptide of the present invention and each substrate.
  • the reaction conditions can be, for example, pH 7-9 or 8-8.5, and reaction at 4-30°C for 1-24 hours.
  • the reaction buffer can be, for example, the buffer used for AcSE in Example 2 below.
  • the detection method of the product is also not particularly limited.
  • the ligation product can be determined based on the molecular size obtained using high performance liquid chromatography mass spectrometry (LC/MS), SDS-PAGE, etc.
  • LC/MS high performance liquid chromatography mass spectrometry
  • SDS-PAGE SDS-PAGE
  • the product it is also possible to determine the product by detecting the colocalization of the tag and/or reporter, or by detecting an interaction (e.g., FRET, etc.).
  • the activity of the polypeptide of the present invention can be quantitatively evaluated, for example, by the conversion rate (the ratio of the actual amount of product to the amount of product estimated assuming that all reactable substrates have reacted) after a certain period of reaction under certain conditions, or the value of k cat /K M in enzyme kinetics. More specifically, for example, the conversion rate or k cat /K M under the reaction conditions described in Example 2 below can be used.
  • the conversion rate the ratio of the actual amount of product to the amount of product estimated assuming that all reactable substrates have reacted
  • the polypeptides of the invention may further have the following properties: (1) Calcium ion-independent
  • the polypeptide of the present invention has the above activity independent of calcium ions.
  • the enzyme activity being "calcium ion-independent" is determined, for example, by the following method. (1-1) Enzyme activity is measured under reaction conditions (reaction conditions A) in which a chelating agent such as EDTA or EGTA is added so as to chelate substantially all calcium, or in which no calcium is added, and under the same reaction conditions (reaction conditions B) except that a chelating agent is not added and 1 to 10 mM (preferably 2 to 8 mM, more preferably 5 mM) calcium ions are added.
  • the polypeptide of the present invention has a 50% denaturation temperature (T m ) measured by differential scanning calorimetry (DSC) of, for example, 20° C. or higher, 30° C. or higher, or 40° C. or higher, and for example, 100° C. or lower, or 90° C. or lower. From the viewpoint of thermal stability, a higher T m is preferable.
  • T m 50% denaturation temperature measured by differential scanning calorimetry
  • DSC differential scanning calorimetry
  • Optimal reaction pH refers to the pH at which activity is maximized under certain reaction conditions.
  • the reaction conditions described in 2-3 of Example 2 below can be used.
  • the optimal reaction pH of the polypeptide of the present invention is, for example, 7 to 9 or 8 to 8.5.
  • the activity of the polypeptide of the present invention is preferably at least 1-fold, more preferably at least 5-fold, and even more preferably at least 10-fold, compared to the activity of the wild-type SavSrtE.
  • under conditions in which acetyl-YNLAETGA peptide as a donor substrate and GGGKY peptide as an acceptor substrate are reacted at 30° C.
  • the k cat /K M of the polypeptide of the present invention is preferably 0.5-fold or more, more preferably 0.8-fold or more, even more preferably 1-fold or more, even more preferably 1.2-fold or more, and particularly preferably 1.5-fold or more, and may be, for example, 10,000-fold or less, 1,000-fold or less, 100-fold or less, or 10-fold or less, relative to wild-type SavSrtE.
  • the polypeptide of the present invention can be produced, for example, by expressing a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention in vivo or in vitro, as described in the following section.
  • the produced polypeptide may be subjected to appropriate operations such as extraction, filtration, separation, purification, and concentration. Examples of these operations include at least one selected from the group consisting of ultrasonic treatment, enzyme digestion, salting out, solvent precipitation, dialysis, centrifugation, ultrafiltration, gel filtration, SDS-PAGE, isoelectric focusing, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography, and reverse phase chromatography.
  • the conditions for separation and purification can be the same as those used in the examples.
  • the polypeptide of the present invention may further undergo at least one process such as blending with other components, pH adjustment, filtration, decolorization, deodorization, sterilization, drying, powderization, granulation, and tableting, depending on the intended use.
  • the polynucleotide of the present invention is a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • the polynucleotide of the present invention is, for example, a single-stranded or double-stranded DNA, RNA, or nucleic acid analog (PNA, LNA, morpholino nucleic acid, S-oligonucleotide, etc.), preferably DNA or RNA.
  • the sequence of the polynucleotide of the present invention can be designed, for example, based on the amino acid sequence of the polypeptide of the present invention.
  • a polynucleotide having a designed sequence can be produced by chemical synthesis and/or genetic engineering techniques.
  • the synthesized polypeptide can be used as a template for amplification, mutagenesis, etc., by various genetic engineering techniques.
  • the polynucleotide of the present invention may be operably linked to at least one of the following: a regulatory element (promoter, ribosome binding site, terminator, enhancer, etc.), a 5'-untranslated region (UTR), a 3'-UTR, a signal sequence, a protein tag sequence, and a poly(A) addition sequence.
  • a regulatory element promoter, ribosome binding site, terminator, enhancer, etc.
  • UTR 5'-untranslated region
  • 3'-UTR a signal sequence
  • protein tag sequence e.g., a poly(A) addition sequence
  • the polynucleotide of the present invention can be introduced into a cell for use.
  • a codon for each amino acid residue based on the codon usage frequency of the transformant.
  • coli for the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 include a polynucleotide containing the nucleotide sequence of positions 1 to 534 of SEQ ID NO: 8 or a polynucleotide containing a nucleotide sequence having at least 80% identity to positions 1 to 534 of SEQ ID NO: 8, or a polynucleotide containing the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 8 or a polynucleotide containing a nucleotide sequence having at least 80% identity to SEQ ID NO: 8.
  • the polynucleotides of the present invention can be used for in vitro transcription and/or in vitro translation.
  • in vitro translation systems examples include E. coli S30 fractions, insect cell (e.g., SF9 or SF21) lysates, rabbit reticulocyte lysates, and wheat germ extracts.
  • In vitro transcripts can be introduced into cells, for example, and can be subjected to in vitro translation.
  • the expression vector of the present invention includes a polynucleotide encoding the polypeptide of the present invention.
  • Examples of the expression vector of the present invention include plasmids, cosmids, bacteriophages, viruses (plant viruses, animal viruses, etc.), artificial chromosomes (YAC, BAC, etc.), viral vectors, etc.
  • the expression vector of the present invention preferably further comprises a replicable origin, a DNA cloning site, a regulatory element, a protein tag sequence, a selection marker, etc.
  • the expression vector of the present invention comprises a regulatory element to which a DNA fragment, which is a nucleotide of the present invention, is operably linked so that the polypeptide of the present invention is expressed in the cells of the transformant.
  • a pUC system, pBluescript II, a pET expression system, a pGEX expression system, etc. can be used.
  • the transformant of the present invention contains the polynucleotide of the present invention.
  • the transformant of the present invention can be produced, for example, by introducing the expression vector into a host cell, or by inserting DNA as the polynucleotide of the present invention into the chromosome of the host cell.
  • Host cells include, for example, bacteria (Escherichia coli, Bacillus subtilis, etc.), budding yeast, fission yeast, fungi (Rhizopus genus, Trichoderma genus, etc.), silkworm cells, SF9 cells, SF12 cells, Xenopus oocytes, plant cells (derived from tobacco, rice, corn, etc.), mammalian cells (monkey kidney cells (including cultured cell lines such as COS7), Chinese hamster ovary cells (CHO)), etc.), with bacteria being preferred, and Escherichia coli being more preferred.
  • the host cell may be contained in a multicellular individual (e.g., a plant individual, an animal individual, etc.).
  • the method for introducing the polynucleotide of the present invention into a host cell is not particularly limited, and may be appropriately selected depending on the type of host cell, the form of the expression vector to be introduced, etc. Specific examples include the calcium phosphate method, electroporation method, particle gun method, lipofection, injection method, etc.
  • the method for introducing the polynucleotide (DNA) of the present invention into the chromosome of a host cell is not particularly limited, and for example, a homologous recombination method, a genome editing method using CRISPR-Cas9, etc., can be used.
  • the obtained transformant of the present invention can be cultured or grown individually under conditions suitable for expression in a host cell to express the polypeptide of the present invention. Prior to the expression, steps such as screening with a selection marker and expression induction treatment may be performed. In one embodiment, the transformant of the present invention is used to produce the polypeptide of the present invention. In another embodiment, the transformant of the present invention is used to ligate a donor substrate and an acceptor substrate in a state in which the polypeptide of the present invention is present inside or on the cell surface.
  • the present invention includes an enzyme preparation and a kit comprising the polypeptide of the present invention.
  • the enzyme preparation of the present invention can be used, for example, for producing a peptide ligation product of a donor substrate and an acceptor substrate.
  • the enzyme preparation of the present invention may contain a single type of polypeptide of the present invention, or may contain two or more types (for example, two or more types of polypeptides with different donor substrate recognition sequences).
  • the enzyme preparation of the present invention may be in the form of, for example, a powder, granules, pills, tablets, liquid, gel, dispersion, paste, or a form in which the polypeptide of the present invention is immobilized on a solid phase (resin, carrier, etc.) (for example, beads or slurries to which the polypeptide of the present invention is immobilized).
  • a solid phase for example, beads or slurries to which the polypeptide of the present invention is immobilized.
  • the enzyme preparation of the present invention may further contain at least one selected from the group consisting of, for example, a solvent, an excipient, a buffer, a stabilizer, a preservative, an antiseptic, and a solid phase used for immobilization, depending on the form, the purpose of use, the properties of the polypeptide of the present invention, etc.
  • the kit of the present invention includes the enzyme preparation described above and can be used for producing peptide ligation products of donor and acceptor substrates.
  • the kit of the present invention may also include, for example, a donor substrate, an acceptor substrate, a solvent, a buffer, a support on which the substrate is immobilized (e.g., a dish, a resin, beads, a plate, etc.), a standard sample, a separation and purification device, etc.
  • the method for producing the ligation product of the present invention comprises treating a donor substrate containing at least one donor substrate recognition sequence and an acceptor substrate containing at least one primary amine with the above-mentioned polypeptide of the present invention and/or the above-mentioned transformant of the present invention.
  • the donor substrate is preferably made of a polypeptide from the viewpoint of facilitating its preparation. More preferably, the donor substrate is a polypeptide in which a protein (such as an antibody, an antibody fragment, an antigen, an enzyme, a receptor, a reporter protein, or a tag protein such as GST or MBP) is fused to the N-terminus of the donor substrate recognition sequence. An amino acid sequence that serves as a linker can also be inserted between the protein and the donor substrate recognition sequence as appropriate. These polypeptides can be easily produced, for example, by designing and expressing a gene that codes for the polypeptide.
  • a protein such as an antibody, an antibody fragment, an antigen, an enzyme, a receptor, a reporter protein, or a tag protein such as GST or MBP
  • the acceptor substrate is preferably a substrate to which at least one compound containing a primary amine or a moiety corresponding to the primary amine described in the [Polypeptide] section of the present invention is bound or associated.
  • the donor substrate and the acceptor substrate may each be used in a single type or in a combination of two or more types.
  • the polypeptide of the present invention may also be used in a single type or in a combination of two or more types.
  • the above treatment means ligating the donor substrate and the acceptor substrate by a peptide ligation reaction using the above-mentioned polypeptide of the present invention and/or the above-mentioned transformant of the present invention.
  • the above treatment means carrying out a peptide ligation reaction based on the activity of the polypeptide of the present invention in the coexistence of a donor substrate, an acceptor substrate, and the polypeptide of the present invention or the transformant of the present invention.
  • the above process includes a step of (1) reacting a donor substrate with a polypeptide of the present invention and/or a transformant of the present invention to prepare an intermediate in which an N-terminal fragment of the donor substrate is bound to the polypeptide of the present invention, and a step of (2) reacting the intermediate with an acceptor substrate after (1) to obtain a ligation product.
  • an intermediate separation step may be optionally included between steps (1) and (2).
  • the pH during the above treatment is preferably the optimal reaction pH for the polypeptide of the present invention, which may be, for example, 7 to 9 or 8 to 8.5.
  • the temperature during the above treatment may be appropriately changed depending on the thermal stability of the polypeptide of the present invention, but may be, for example, 4°C or higher, 10°C or higher, 20°C or higher, or 30°C or higher, and 50°C or lower, or 40°C or lower.
  • the ratio of the acceptor substrate to the donor substrate during the above treatment can be set appropriately depending on the type of each substrate, the donor substrate recognition sequence and the number of amino groups contained, the reaction conditions (pH, reaction time, temperature, substrate concentration, enzyme concentration, etc.), the intended use of the ligation product, etc.
  • the ratio of the acceptor substrate to the donor substrate can be, for example, 0.01 to 100 times, 0.05 to 20 times, or 0.1 to 10 times in molar concentration ratio.
  • the resulting ligation product may be, for example, one or more donor substrates ligated to an acceptor substrate.
  • the acceptor substrate has multiple amino groups, multiple donor substrates may be ligated.
  • the donor substrates to be ligated may be the same as each other, or at least one of them may be different.
  • the donor substrate may be an antibody or antibody fragment having a donor substrate recognition sequence added to the C-terminus of at least one subunit.
  • an antibody-drug conjugate can be produced in one step by using an acceptor substrate containing a portion that can be a drug, such as a drug delivery system (DDS) carrier, such as a cytotoxic agent, a physiologically active substance, or a vesicle containing them.
  • DDS drug delivery system
  • an antibody or antibody fragment can be multimerized by using a donor substrate containing multiple antibodies or antibody fragments and an acceptor substrate containing multiple amino groups. Such a multimerized antibody or antibody fragment can provide multispecificity, for example, by having binding ability to two or more targets.
  • the donor substrate may have a donor substrate recognition sequence added to the C-terminus of the enzyme.
  • a donor substrate recognition sequence added to the C-terminus of the enzyme.
  • the uses of the ligation products are not particularly limited, and examples include pharmaceuticals, quasi-drugs, cosmetics, foods (including beverages, functional foods, supplements, etc.), as well as their raw materials, reagents, chemical products, etc.
  • the ligation product may further undergo at least one process such as extraction, filtration, separation, purification, concentration, blending with other components, pH adjustment, decolorization, deodorization, sterilization, drying, powderization, granulation, tableting, etc.
  • Example 1 Preparation of ancestral sortase E
  • (1-1. Design of ancestral sortase E sequence The design of the ancestral sortase E sequence according to the present invention is outlined in FIG. (1) First, 5,000 sequences similar to the template sequence of sortase E (SavSrtE) derived from Streptomyces avermitilis were selected and analyzed using a sequence analysis program to identify multiple amino acid residues that are important for sequence classification. The selected sequences were then grouped according to the combination of these residues. (2) The amino acid sequence of ancestral sortase E was designed by the ancestral sequence remodeling (ASR) method. Specifically, the classified sequence was used as input to design the amino acid sequence of ancestral sortase E using MAFFT2ASR.py (https://github.com/shognakano/MAFFT2ASR).
  • ASR ancestral sequence remodeling
  • AcSE the one having the amino acid sequence represented by positions 1 to 178 of SEQ ID NO:1 (herein referred to as "AcSE") was used in the subsequent tests.
  • AcSE had an amino acid sequence identity of only 41.1% with SavSrtE, and was significantly different from natural sortase E.
  • a DNA encoding a protein (SEQ ID NO: 1) with a 12-residue polyhistidine tag added to the C-terminus of AcSE was synthesized and subcloned into the pET15b vector at the NcoI and XhoI sites.
  • the DNA sequence of AcSE is SEQ ID NO: 8 and is optimized for expression in E. coli.
  • the resulting plasmid was transformed into the BL21(DE3) strain.
  • the strain was cultured at 37°C in 1 L of LB medium containing 30 ⁇ g/mL ampicillin. When the OD 600 value reached the range of 0.6 to 0.8, the temperature was lowered to 23°C.
  • the samples containing AcSE were further purified.
  • the samples were applied to a MonoQ column (Cytiva, MA, USA) equilibrated with Buffer A and eluted with a linear gradient based on Buffer A.
  • the eluted samples were collected and concentrated, and the concentrated samples were applied to a Superdex 200 Increase column (Cytiva, MA, USA) equilibrated with Buffer A for purification.
  • the purity of AcSE was confirmed by SDS-PAGE.
  • the concentration of the AcSE samples was estimated from the absorbance at 280 nm using NanoDrop (Thermofisher Scientific, USA).
  • the thermal stability of the obtained AcSE was measured using a differential scanning calorimeter (DSC).
  • the protein solution was concentrated and dissolved in buffer A to about 2 mg/mL.
  • the measurement was performed using the following method: 25°C, 5 minutes, then heating to 70°C at 90°C/hr.
  • the data obtained by the measurement was analyzed using Microcal PEAQ-DSC Software.
  • the enthalpy ( ⁇ H cal , ⁇ H VH ) was measured using a non-Two State model, and the heat capacity change ( ⁇ C P ) was analyzed using a Two-State, ⁇ C P ⁇ 0 model.
  • Example 2 Peptide ligation test to polyglycine using AcSE
  • SavSrtE recognizes and cleaves the N-terminal acetylated peptides Ac-YNLAETGA and Ac-YNLPETGA (collectively referred to as Ac-YNL(A/P)ETGA), and binds them to GGGKY.
  • Ac-YNL(A/P)ETGA N-terminal acetylated peptides
  • the concentration of Ac-YNL(A/P)ETGGGKY was calculated from the peak area of the chromatogram in the 210 nm region obtained by HPLC analysis of the reaction product.
  • the HPLC conditions for Ac-YNL(A/P)ETGGGKY are as follows. Mobile phase: (A) 0.1% TFA aqueous solution, (B) 0.1% TFA-containing acetonitrile solution Gradient: Linear gradient from 5% (B) to 30% (B) in 30 minutes Flow rate: 0.35 mL/min Column: Unison UK-C18 column (150 x 2 mm, Imtakt) Column temperature: 40°C Injection volume: 10 ⁇ L
  • LC/HRMS liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry
  • the enzyme activities of AcSE and SavSrtE were measured by quantifying the amount of Ac-YNL(A/P)ETGGGKY peptide produced by the progress of the enzyme reaction, based on Das S. et al., J Biol Chem, 2017, Vol.292, p.7244-7257.
  • the reaction temperature was set at 30°C.
  • Table 1 shows the comparison results of the reaction rate parameters of AcSE and SavSrtE for the Ac-YNL(A/P)ETGA peptide.
  • the reaction rate parameters of Streptococcus aureus sortase A (SaSrtA) described in the above-mentioned document by Das S. et al. are also shown. It was revealed that AcSE has a larger k cat /K M value and higher activity than wild-type sortase A and sortase E. Furthermore, like SavSrtE, AcSE more selectively recognizes LAETG as a donor substrate recognition sequence than LPETG, but the selectivity was improved by about 14-fold compared to SavSrtE.
  • Example 3 Peptide ligation test to primary amines not containing glycine using AcSE.
  • Wild-type sortase E generally cannot perform peptide ligation reactions on primary amines that do not have a polyglycine sequence.
  • AcSE has a significantly different amino acid sequence from wild-type sortase E, it was presumed that its substrate specificity would also be different. Therefore, we confirmed whether AcSE has peptide ligation activity on primary amines that do not have a polyglycine sequence.
  • LC/HRMS The sample after the enzyme reaction was analyzed by LC/HRMS.
  • VNAR-Fc Venus protein with GGG added to the N-terminus
  • LAETGA shark VNAR-Fc
  • LAETGA peptide containing a donor substrate recognition sequence added to the C-terminus
  • VNAR-Fc contains an AGIA tag (Yano S. et al., PLoS ONE, 2016, Vol.11, No.6: e0156716) between the donor substrate recognition sequence and Fc.
  • Samples after 0, 1, 2, 4, 8, and 24 hours were mixed with an equal volume of 2x SDS-PAGE sample buffer and heated at 90°C for 10 minutes to terminate the reaction. The obtained samples were analyzed by SDS-PAGE.
  • poly(ethylene glycol) diamine (molecular weight 2,000) was ligated to VNAR-Fc as an acceptor substrate using AcSE (Reaction 2 in Figure 4A).
  • the reaction was carried out under the same conditions as Reaction 1 above, except that 200 ⁇ M poly(ethylene glycol) diamine was used instead of GGG-Venus and 50 ⁇ M AcSE was used.
  • the samples after the reaction were similarly analyzed by SDS-PAGE.
  • Example 5 Enzyme immobilization test using AcSE] (Preparation of ancestral L-amino acid oxidase as a donor substrate protein)
  • the ancestral L-amino acid oxidase (HTAncLAAO2) previously prepared by the present inventors was used in this example.
  • the obtained sHTAncLAAO2 gene was subcloned into a pET28a vector at the NcoI/XhoI site. Protein purification was performed by adopting the same procedure as reported in the above-mentioned paper by Ishida C. et al.
  • HTAncLAAO2 was immobilized on polyamine beads using AcSE (see FIG. 5A). 0, 47, or 470 ⁇ M AcSE, 80 ⁇ M sHTAncLAAO2, and buffer B (20 mM potassium phosphate buffer [pH 7.0], 10 mM NaCl) were added to polyamine beads (Polybead TM , 0.50 ⁇ m; Polyscience Inc.) and reacted at 4° C. for 48 hours. The beads were collected by centrifugation and washed at least seven times with buffer B. The immobilized beads were collected and resuspended in 2 mL of buffer B.
  • HTAncLAAO2 activity of immobilized beads
  • L-amino acid substrates L-phenylalanine, L-leucine, L-isoleucine, L-alanine, or L-aspartic acid. Since HTAncLAAO2 has low activity toward L-alanine and no activity toward L-aspartic acid, these were used as controls.
  • the beads obtained by the above immobilization were dispensed into a 96-well plate, and a reaction buffer was added and reacted at room temperature for 30 minutes.
  • the reaction buffer was as follows: 100 mM Bis-Tris HCl (pH 7.0), 1.5 mM 4-aminoantipyrine, 2.2 mM N-ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline (TOOS), 50 U/mL horseradish peroxidase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), and 10 mM L-amino acid substrate. L-amino acid oxidase activity was detected by the purple color produced by the product H 2 O 2 .
  • Example 6 Test to confirm the time-dependent binding efficiency of highly activated sortase A and ancestral sortase E
  • the inventors investigated the time-dependent binding efficiency of eSrtA and AcSE using hyperactivated sortase A (eSrtA), which has five mutations and is said to have catalytic activity approximately 140-fold higher than that of wild-type SrtA (B. M. Dorr et al., PNAS 111(37), 13343-13348, 2014), and ancestral sortase E (AcSE) prepared by the inventors of the present application.
  • eSrtA hyperactivated sortase A
  • the conjugation reaction was initiated at 4° C. by adding HTAncLAAO2 with sortag at a final concentration of 10 ⁇ M and 100 ⁇ M eSrtA or AcSE to a buffer solution corresponding to each sortase described below.
  • the composition of the buffer solution differed between eSrtA and AcSE.
  • eSrtA a buffer solution consisting of 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 0.5 mM TCEP, and 1 mM CaCl 2 was used.
  • a buffer solution consisting of 20 mM Tris-HCl (pH 7.0) and 200 mM NaCl was used.
  • the beads were recovered at each time point from the start of the reaction (0 min), 10 min, 30 min, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 8 hours, and 24 hours, and immediately washed with Buffer A containing 20 mM potassium phosphate (pH 7.0) and 10 mM NaCl.
  • SEQ ID NO:1 (AcSE; amino acid sequence) MKPASGVPDP KRKPGAFEPG QGFAIIYIPK LDVKAPIAEG IDKHKVLDKG MVGHYGEAPL KTAMPWDKQG NFALAGHRNT HGEPFRYINR LEPGDKIVVE TADRYYTYEM TSILPQTPPS NVSVIDPVPP GSGFTQPGRY ITLTTCTPEF TSTYRMIVWG KMVDERPRSK GKPDALVRSG HHHHHHHHHHHHH
  • SEQ ID NO:14 (sHTAncLAAO2; nucleotide sequence) atgggcgaaa atgagaaaat tgatatagct atagttggtg gcggcgtgag cggcgtttac tctgcatgga agctgaagac caaatacccg aataaaaga tcgtgctgttt cgaaggcggt gatcacattg gtggtcgtttgctgcttagtgtg atcccaccgg gtattccaaa catggtggct gagctgggtg gcatgcgtat ttggagaac acccaaaaac tcatagtgaa acttatcgac gacattaacg aaaagctgtc tcaggaggat cagattgaac ttacgactt

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Abstract

本発明では、これまで知られているソルターゼＡ等とはアミノ酸配列において大きく相違しながら、ソルターゼ認識モチーフペプチドのような特定のアミノ酸配列を含むドナー基質と、アミノ基を含むアクセプター基質をライゲーションする活性を有する、新規ポリペプチドの開発を課題とする。　下記（ａ）～（ｃ）から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、ドナー基質認識配列を少なくとも１つ含むドナー基質を、第一級アミンを少なくとも１つ含むアクセプター基質に結合させる活性を有する、ポリペプチド：（ａ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列；（ｂ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列において、１～３５個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列；（ｃ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。

Description

ペプチドライゲーション活性を有するポリペプチド及びその利用
　本発明は、ペプチドライゲーション活性を有するポリペプチド及びその利用に関する。
　ソルターゼ（Ｓｏｒｔａｓｅ）は、グラム陽性菌の細胞壁にタンパク質を共有結合させ、毛細血管の形成や病原性因子の発現など様々な機能を制御する、ユニークなシステイントランスペプチダーゼである。ソルターゼには６つのクラス（クラスＡ～Ｆ）が存在し、ソルターゼＡ～Ｆ（ＳｒｔＡ～Ｆ）と呼ばれる。
　ソルターゼは、ソルターゼ認識モチーフを含むドナー基質と、第一級アミンを含むアクセプター基質を基質として、次のペプチドライゲーション反応を触媒する活性を有する：（１）ドナー基質のソルターゼ認識モチーフのトレオニン又はセリン残基のＣ末端側のペプチド結合を切断する；（２）ソルターゼ認識モチーフが切断されて生じる２つの断片のうち、トレオニン又はセリン残基を含む側の断片（本明細書中、「Ｎ末端側断片」と呼ぶ）が、ソルターゼの特定のシステイン残基とチオエステル結合し、アシル中間体が形成される；（３）アクセプター基質の第一級アミンのアミノ基（－ＮＨ２又は－ＮＨ３ ＋）がアシル中間体を求核攻撃して、アミド結合が形成される。天然においては、ドナー基質はソルターゼ認識モチーフを含む細胞壁ソーティングシグナル（ＣＷＳＳ）モチーフを有する表面タンパク質であり、アクセプター基質は細胞壁のペプチドグリカンである。ここで、ソルターゼ認識モチーフとして認識されるアミノ酸配列は、５～７残基、通常は５残基からなり、ソルターゼのクラスごとに異なることが知られている。
　さらにソルターゼは、ドナー基質がソルターゼ認識モチーフを、アクセプター基質が第一級アミンを含んでいれば、他の部分を含んでいてもライゲーションすることができる。このような性質を利用すれば、ソルターゼが認識可能な基質を設計して、ソルターゼを介して２つ以上の基質を人為的にライゲーションさせることができる。このような手法は、ソルターゼ介在ライゲーション（ｓｏｒｔａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ　ｌｉｇａｔｉｏｎ；ＳＭＬ）やｓｏｒｔａｇｇｉｎｇと呼ばれ、タンパク質工学や抗体薬物複合体（ＡＤＣ）の作製など、種々のタンパク質・ペプチド修飾のための魅力的なツールとして知られる。
　現在ＳＭＬに広く用いられているのは、最初に発見されたＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ由来のソルターゼＡ（ＳａＳｒｔＡ）である。しかし、天然のソルターゼＡは反応速度も遅く、またカルシウムイオンが活性に必須であった。またアクセプター基質としてポリグリシン上のＮ末端アミノ基を求核剤とするもの以外を用いた場合は、反応が進行しにくいといった課題があった。これらの課題を解決すべく、これまでに数多くのソルターゼＡ変異体が開発されている。例えば、ソルターゼＡのタンパク質の合理的設計や指向的進化を用いた変異導入により、種々の高活性変異体やカルシウムイオン非依存的変異体が開発されている（例えば、非特許文献１、２）。ソルターゼＡ変異体によって上記課題は部分的に解決しているが、まだ改善の余地は大きい。
　また、別のクラスのソルターゼを利用した例として、特許文献１には、線毛関連ソルターゼＣをＳＭＬに使用する方法が開示されている。
特表２０１５－５０９７１３号公報
Proc. Natl Acad. Sci. USA., 2011, Vol.108, pp.11399-11404 Biotechnol. Bioeng., 2012, Vol.109, pp.2955-2961
　既存のソルターゼＡ等をベースとした合理的設計や指向的進化では、得られる改変体の酵素活性の改善や基質特異性のバリエーションに限界があることが推察された。
　そこで、本発明では、これまで知られているソルターゼＡ等とはアミノ酸配列において大きく相違し、かつ、ソルターゼ認識モチーフペプチドのような特定のアミノ酸配列を含むドナー基質と、アミノ基を含むアクセプター基質をライゲーションする活性を有する、新規ポリペプチドの開発を課題とする。
　本発明者らは、既知のソルターゼＥのアミノ酸配列を利用した生物情報工学的手法により、既知のソルターゼＥに対して配列同一性が低い祖先型ソルターゼＥを設計した。そして、得られた祖先型ソルターゼ及びその変異体が、意外にも上記ライゲーション活性を有し得ることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下の態様を含む。
　［１］
　下記（ａ）～（ｃ）から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、
　ドナー基質認識配列を少なくとも１つ含むドナー基質を、第一級アミンを少なくとも１つ含むアクセプター基質に結合させる活性を有する、ポリペプチド：
　（ａ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列；
　（ｂ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列において、１～３５個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列；
　（ｃ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。
　［２］
　前記第一級アミンが、アミノ末端を有する残基数２以上のポリグリシンを含まない、［１］に記載のポリペプチド。
　［３］
　カルシウムイオン非依存的に前記活性を有する、［１］又は［２］に記載のポリペプチド。
　［４］
　［１］～［３］のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
　［５］
　［４］に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
　［６］
　［４］に記載のポリヌクレオチドを含む、形質転換体。
　［７］
　［１］～［３］のいずれか１に記載のポリペプチドを含む、酵素剤。
　［８］
　［７］に記載の酵素剤を含む、キット。
　［９］
　ドナー基質認識配列を少なくとも１つ含むドナー基質と、第一級アミンを少なくとも１つ含むアクセプター基質を、［１］～［３］のいずれか１に記載のポリペプチド、又は［６］に記載の形質転換体で処理することを含む、ライゲーション産物の製造方法。
　本発明のポリペプチドは、既存のソルターゼＥとは異なる新規のアミノ酸配列を有しているにもかかわらず、特定のアミノ酸配列を少なくとも１つ含むドナー基質と第一級アミンを少なくとも１つ含むアクセプター基質をライゲーションする活性を有する。そして、本発明のポリペプチドには、従来ソルターゼＥが有していない性質（酵素活性、基質特異性、安定性等）を備え、有用性の高いポリペプチドが含まれ得る。
祖先型ソルターゼＥ（ＡｃＳＥ）を設計するプロセスの概念図である。 実施例２において、ＡｃＳＥが触媒する反応の模式図である。 実施例２において、５０μＭ又は１μＭ　ＡｃＳＥを用いて、Ａｃ－ＹＮＬＡＥＴＧＡ（配列番号２）又はＡｃ－ＹＮＬＰＥＴＧＡ（配列番号３）をドナー基質として反応させたときの変換率を比較したグラフである。アクセプター基質であるＧＧＧＫＹ（配列番号４）の濃度は１ｍＭである。 実施例２において、図２Ｂと同様の条件で、アクセプター基質であるＧＧＧＫＹを種々の濃度に設定して８時間反応させたときの変換率を比較したグラフである。 実施例２において、５０μＭ　ＡｃＳＥ、０．５ｍＭ　Ａｃ－ＹＮＬＡＥＴＧＡ及び１ｍＭ　ＧＧＧＫＹを含む反応液のｐＨを変化させたときの変換率を比較したグラフである。 実施例３において、ＡｃＳＥが触媒するドナー基質（Ａｃ－ＹＮＬＡＥＴＧＡ）と第一級アミンとの反応を表す式と、使用した第一級アミンの構造式（１ａ～１ｄ）である。 実施例３において、ＡｃＳＥによる反応で得られた反応物中のライゲーション産物（２ａ～２ｄ）のＬＣ／ＨＲＭＳのクロマトグラムである。 実施例４のＡｃＳＥを用いたライゲーション反応の模式図である。 実施例４の反応１の後のサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像である。ａ～ｄのバンドは図４Ａの反応１のａ～ｄに対応する。 実施例４の反応２の後のサンプルのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル画像である。ａ～ｅのバンドは図４Ａの反応２のａ～ｅに対応する。 実施例５において、ＡｃＳＥを用いたＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２のポリアミンビーズへの固定化反応を表した概念図である。 実施例５において、種々の濃度のＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２の存在下で固定化処理を行ったポリアミンビーズと５種類のＬ－アミノ酸との反応性を比較した図である。紫色が濃いほど、ＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２による酵素反応が進行したことを表す。アスパラギン酸（Ｌ－Ａｓｐ）はネガティブコントロールである。 実施例６において、高活性化ソルターゼＡ（ｅＳｒｔＡ）と祖先型ソルターゼＥ（ＡｃＳＥ）の各時間依存性結合効率を比較したグラフである。
　［定義］
　本明細書において、特に断りがない限り、アミノ酸配列はアミノ末端側からカルボキシ末端側に向かって左から右に表示され、ヌクレオチド配列は５′末端側から３′末端側に向かって左から右に表示される。本明細書において、アミノ酸配列のＮ末端の「Ａｃ－」は、Ｎ末端がアセチル化されていることを表す。
　本明細書において、ポリペプチドの「ライゲーション」、又は「ペプチドライゲーション」とは、ポリペプチド部分を含む基質と、別の基質とを、ポリペプチド部分を介して共有結合させることを表す。ここで、当該別の基質は、ポリペプチド部分を含む基質、又は含まない基質のいずれであってもよい。
　本明細書において、「ドナー基質」とは、少なくとも１つのドナー基質認識配列を含むものであれば特に限定されない。ドナー基質がドナー基質認識配列とは別の部分を含む場合、当該別の部分はドナー基質認識配列のＮ末端側、Ｃ末端側、又はそれらの両方に共有結合又は会合していてもよい。１つのドナー基質が複数のドナー基質認識配列を含む場合、複数のドナー基質認識配列は同じ配列であっても、少なくとも１つが異なる配列であってもよい。
　ドナー基質は、例えば、
　（ｉ）少なくとも１つのドナー基質認識配列からなるペプチド、若しくは少なくとも１つのドナー基質認識配列を一部に有するポリペプチド；又は、
　（ｉｉ）タンパク質（抗体、抗体断片、抗原、酵素、受容体、レポータータンパク質（蛍光タンパク質、発光タンパク質等）、タグタンパク質（ＧＳＴ、ＭＢＰ等）など）、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸類縁体（ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルフォリノ核酸、Ｓ化オリゴなど）、アミノ酸、ヌクレオチド及びヌクレオシドモノマー、脂質、天然有機化合物、合成有機化合物、ナノ粒子、量子ドット、原子（放射性核種など）、ベシクル、サッカリド並びにポリサッカリドからなる群より選ばれる１つ以上が、少なくとも１つの（ｉ）と共有結合又は会合した基質、が挙げられる。
　本明細書において、「アクセプター基質」とは、求核攻撃可能なアミノ基（－ＮＨ２又は－ＮＨ３ ＋）を少なくとも１つ含む第一級アミンを少なくとも１つ含み、酵素的にドナー基質認識配列にライゲーションされ得る基質であれば特に限定されない。アクセプター基質が複数の第一級アミンを含む場合、複数の第一級アミンは同じものであっても、少なくとも１つが異なるものであってもよい。
　アクセプター基質は、例えば、
　（Ｉ）第一級アミン、又は、
　（ＩＩ）タンパク質（抗体、抗体断片、抗原、酵素、受容体、レポータータンパク質（蛍光タンパク質、発光タンパク質等）、タグタンパク質（ＧＳＴ、ＭＢＰ等）など）、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、核酸類縁体（ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルフォリノ核酸、Ｓ化オリゴなど）、アミノ酸、ヌクレオチド及びヌクレオシドモノマー、脂質、天然有機化合物、合成有機化合物、ナノ粒子、量子ドット、原子（放射性核種など）、ベシクル、サッカリド並びにポリサッカリドからなる群より選ばれる１つ以上が、少なくとも１つの第一級アミンに共有結合又は会合した基質、が挙げられる。
　本明細書において、「会合」とは、配位結合、イオン結合、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合若しくはその他の非共有結合的な相互作用、又はそれらの２つ以上の相互作用の組み合わせを介して、２つ以上の分子が集合体を形成することを表す。
　本明細書において、「ドナー基質認識配列」とは、ドナー基質上で本発明のポリペプチドによって酵素的に認識、切断されるアミノ酸配列である。
　本明細書において、ドナー基質認識配列の「Ｎ末端側断片」とは、ドナー基質認識配列において、本発明のポリペプチドによる切断によって生じる２つの断片のうち、当該ドナー基質認識配列のＮ末端側の部分を含む断片を表す。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の「同一性」の値とは、２つの配列を比較したときの全体の残基（モノマー）の保存性を意味する。本明細書において、アミノ酸配列及びヌクレオチド配列の同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）のパーセンテージは、特に記載がない限り、ＭＡＦＦＴ（https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/）のデフォルトのパラメーターを用いて配列アラインメントして得られる同一性のパーセンテージである。ＭＡＦＦＴは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所のウェブサイト（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/mafft/）から利用することができる。
　本明細書において、「１～３５個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加」されたアミノ酸配列としては、好ましくは１～２０個、より好ましくは１～１８個、さらに好ましくは１～１５個、さらにより好ましくは１～１０個、特に好ましくは１～５個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の「少なくとも８０％の同一性」は、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらにより好ましくは９８％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を表す。
　本明細書において、アミノ酸配列中、天然の２０種類の標準アミノ酸（Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ又はＹ）の指定がされていない部分は、特に断りがない限り、標準アミノ酸の他に、標準アミノ酸以外のアミノ酸（「非標準アミノ酸」と呼び、非天然アミノ酸を含む）を含み得る。
　本明細書において、ある構成要素が「作動可能に連結する」とは、当該構成要素がその意図する様式で機能し得るように配置することを表す。例えば、ある調節要素をある遺伝子に対して作動可能に連結するとは、遺伝子の発現を当該調節要素の意図する様式で制御できるように、当該調節要素と遺伝子をコードするポリヌクレオチドが連結されることを表す。
　［ペプチドライゲーション活性を有するポリペプチド］
　本発明のペプチドライゲーション活性を有するポリペプチド（本明細書中、「本発明のポリペプチド」と呼ぶ場合がある）は、下記（ａ）～（ｃ）から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、ドナー基質認識配列を少なくとも１つ含むドナー基質を、第一級アミンを少なくとも１つ含むアクセプター基質に結合させる活性を有する、ポリペプチドである：
　（ａ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列；
　（ｂ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列において、１～３５個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列；
　（ｃ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。
　一実施形態では、本発明のポリペプチドは、
　（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列を含む、又は、配列番号１で表されるアミノ酸配列からなる；あるいは、
　（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～３５個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列を含む、又は、配列番号１で表されるアミノ酸配列において、１～３５個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなる；あるいは、
　（ｃ）配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、又は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる。
　一実施形態では、上記（ｂ）又は（ｃ）に係るアミノ酸配列は、例えば、配列番号１のＨｉｓ７７、Ｃｙｓ１４６及びＡｒｇ１５５からなる群より選ばれる少なくとも１つに対応する残基、好ましくはこれら３残基に対応する残基全てに、変異を有しないものであり得る。一実施形態では、（ｂ）又は（ｃ）に係るアミノ酸配列は、例えば、配列番号１のＴｙｒ５５に対応する残基に変異を有しないものであり得る。これらのアミノ酸残基は、ＳａｖＳｒｔＥとのアラインメントに基づいて、特定のライゲーション活性の発揮に関与することが推察される。
　本発明のポリペプチドの（ａ）～（ｃ）のアミノ酸配列は、それぞれ、ソルターゼＡ～Ｅのいずれかのアミノ酸配列と、例えば７０％以下、６０％以下又は５０％以下の同一性であり得る。本発明のポリペプチドは、ソルターゼＡに対して、例えば７０％以下、６０％以下又は５０％以下の同一性であり得る。ここで、比較対象となるソルターゼＡとしては、例えばＳａＳｒｔＡが挙げられる。
　本発明のポリペプチドは、上記（ａ）～（ｃ）から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含み、上記活性を有するものであれば特に限定されない。したがって、本発明のポリペプチドは、例えば、精製、標識、検出、輸送又は局在化、可溶化、発現量向上、修飾等の目的に応じて、タグ（Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＡＧＩＡタグ、Ｍｙｃタグ等）、リンカー、又はタンパク質若しくはその一部（タグタンパク質、レポータータンパク質等）のアミノ酸配列をさらに含んでいてもよい。
　ドナー基質認識配列は、例えば、残基数５～７残基、好ましくは５残基のアミノ酸配列からなる。
　一実施形態では、ドナー基質認識配列は、Ｐ１－Ｐ２－Ｐ３－Ｐ４－Ｐ５からなる。ここで、Ｐ１～Ｐ５はアミノ酸残基であり、Ｐ４はトレオニン、セリン又はグリシンであり、より好ましくはトレオニン又はセリンであり、さらに好ましくはトレオニンである。係る場合、ドナー基質認識配列は、本発明のポリペプチドによってＰ４とＰ５の間で切断され、Ｐ１－Ｐ２－Ｐ３－Ｐ４を含む断片がＮ末端側断片となる。Ｐ１は、例えばロイシン、アラニン、フェニルアラニン、アスパラギン又はイソロイシンであり、好ましくはロイシンである。Ｐ２は、例えば、アラニン、プロリン又はメチオニンであり、好ましくはアラニン又はプロリンであり、より好ましくはアラニンである。Ｐ３は任意のアミノ酸であり得る。Ｐ５は、例えばグリシン、アラニン、セリン又はアスパラギンであり、好ましくはグリシンである。
　特定の実施形態では、ドナー基質認識配列は、ソルターゼ認識モチーフとして知られるアミノ酸配列を含む。そのようなソルターゼ認識モチーフとしては、例えば、ソルターゼＡではＬＰＸＴＧ（配列番号５）、ソルターゼＢではＮＰＸＴＮ（配列番号６）、ソルターゼＣ及びＤではＬＰＸＴＧ又はＬＡＸＴＧ（配列番号７）、ソルターゼＥではＬＡＸＴＧが挙げられる。中でも、ドナー基質認識配列としては、ＬＡＸＴＧ又はＬＰＸＴＧが好ましく、ＬＡＸＴＧがより好ましい。
　一実施形態では、第一級アミンは、アミノ末端を有する残基数２以上（例えば残基数２～５）、好ましくは残基数３以上（例えば残基数３～５）のポリグリシンを含む。そのような第一級アミンのより具体的な例としては、例えば、ＧＧＧＫＹペプチドが挙げられる。
　別の実施形態では、第一級アミンは、アミノ末端を有する残基数２以上のポリグリシンを含まないものである。このような第一級アミンとしては、アミノ基（－ＮＨ２又は－ＮＨ３ ＋）に対してメチレン基（－ＣＨ２－）が続く構造を有するものが好ましく、例えば、１，４－ジアミノブタン、Ｌ－リジン、スペルミジン及びＮ，Ｎ’－ビス（３－アミノプロピル）エチレンジアミンからなる群より選択される。
　本発明のポリペプチドの上記の活性は、より具体的には、ドナー基質認識配列を切断して、そのＮ末端側断片を第一級アミンにアミド結合させる活性を表す。一実施形態では、Ｎ末端側断片は、本発明のポリペプチドのシステイン残基とチオエステル結合を形成してアシル中間体を形成し、第一級アミンがアシル中間体を求核攻撃することによって、Ｎ末端側断片と第一級アミンのアミド結合が形成される。
　本発明のポリペプチドの活性は、例えば、本発明のポリペプチドの存在下で、ドナー基質認識配列を含むドナー基質と第一級アミンを含むアクセプター基質を反応させて、生成物であるライゲーション産物を検出することによって確認することができる。一実施形態では、ドナー基質、アクセプター基質として、下記の実施例２で使用した基質を使用することができる。反応条件は、本発明のポリペプチド及び各基質の種類及び特性に応じて適宜設定することができる。反応条件は、例えばｐＨ７～９又は８～８．５において、４～３０℃で１～２４時間の反応とすることができる。反応緩衝液は、例えば、下記の実施例２においてＡｃＳＥに対して使用した緩衝液を用いることができる。生成物の検出方法も特に限定されない。例えば、ライゲーション産物は、高速液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ等を使用して得られる分子サイズに基づいて判別することができる。また、ドナー基質、アクセプター基質のいずれか一方又は両方にタグ又はレポーター分子を含む場合であれば、タグ及び／若しくはレポーターの共局在の検出、又は相互作用の検出（例えばＦＲＥＴなど）などによって判別することも可能である。
　本発明のポリペプチドの活性は、例えば、一定条件の下で一定時間反応した後の変換率（全ての反応可能な基質が反応したと仮定して見積もられる生成物量に対する、実際の生成物の量の割合）や、酵素反応速度論におけるｋｃａｔ／ＫＭの値などによって定量的に評価することができる。より具体的には、例えば下記の実施例２に記載した反応条件における、変換率又はｋｃａｔ／ＫＭを用いることができる。
　本発明のポリペプチドは、さらに以下の特性を有していてもよい。
　（１）カルシウムイオン非依存性
　一実施形態では、本発明のポリペプチドは、カルシウムイオン非依存的に上記の活性を有する。本明細書において、酵素活性が「カルシウムイオン非依存的」とは、例えば、以下の方法によって判別される。
　　（１－１）実質的に全てのカルシウムをキレートするようにＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ等のキレート剤を含む、又はカルシウムを添加してしない反応条件（反応条件Ａ）と、キレート剤を含まず、かつ１～１０ｍＭ（好ましくは２～８ｍＭ、より好ましくは５ｍＭ）のカルシウムイオンを含む以外は同じ反応条件（反応条件Ｂ）で酵素活性を測定する。
　　（１－２）反応条件Ａにおける酵素活性が反応条件Ｂにおける酵素活性に対して、例えば、７０％以上、８０％以上又は９０％以上であれば、カルシウムイオン非依存的であることを表す。
　（２）熱安定性
　一実施形態では、本発明のポリペプチドは、示差走査熱量計（ＤＳＣ）により測定される５０％変性温度（Ｔｍ）が、例えば２０℃以上、３０℃以上又は４０℃以上であり、例えば１００℃以下又は９０℃以下である。熱安定性の観点から、Ｔｍは高いほうが好ましい。
　（３）最適反応ｐＨ
　本明細書において、最適反応ｐＨは、一定の反応条件において活性が最大となるｐＨを表す。反応条件としては、例えば、下記の実施例２の２－３に記載のものを使用することができる。一実施形態では、本発明のポリペプチドの最適反応ｐＨは、例えば、７～９又は８～８．５である。
　（４）野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓソルターゼＥ（ＳａｖＳｒｔＥ）に対する比活性
　本発明のポリペプチドの活性は、野生型ＳａｖＳｒｔＥの活性に対して、好ましくは１倍以上、より好ましくは５倍以上、さらに好ましくは１０倍以上である。一実施形態では、１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　β－メルカプトエタノール存在下で、ドナー基質としてＡｃｅｔｙｌ－ＹＮＬＡＥＴＧＡペプチド、アクセプター基質としてＧＧＧＫＹペプチドを３０℃で反応させる条件では、本発明のポリペプチドのｋｃａｔ／ＫＭは、野生型ＳａｖＳｒｔＥに対して、好ましくは０．５倍以上、より好ましくは０．８倍以上、さらに好ましくは１倍以上、さらにより好ましくは１．２倍以上、特に好ましくは１．５倍以上であり、例えば、１０，０００倍以下、１，０００倍以下、１００倍以下又は１０倍以下であり得る。
　本発明のポリペプチドは、例えば、下記の項で示すように、上記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをｉｎ　ｖｉｖｏ又はｉｎ　ｖｉｔｒｏで発現させることによって産生することができる。産生されたポリペプチドは、適宜抽出、濾過、分離、精製、濃縮等の操作を経てもよい。これらの操作としては、例えば、超音波処理、酵素消化、塩析、溶媒沈殿法、透析、遠心分離、限外濾過、ゲル濾過、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーからなる群より選ばれる少なくとも１つが例示される。一実施形態では、分離・精製の条件は、実施例で使用した条件を使用することができる。本発明のポリペプチドは、さらに、その使用目的に応じて、他の成分の配合、ｐＨ調整、濾過、脱色、脱臭、殺菌、乾燥、粉末化、顆粒化、打錠等の工程を少なくとも１つ経てもよい。
　［ポリヌクレオチド、発現ベクター、形質転換体］
　本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドである。本発明のポリヌクレオチドは、例えば、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ、ＲＮＡ又は核酸類縁体（ＰＮＡ、ＬＮＡ、モルフォリノ核酸、Ｓ化オリゴなど）であり、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡである。本発明のポリヌクレオチドの配列は、例えば、本発明のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計することができる。設計された配列を有するポリヌクレオチドは、化学的合成及び／又は遺伝子工学的手法によって製造することができる。また、合成したポリペプチドを鋳型にして、種々の遺伝子工学的手法によって増幅、変異導入等を行うことができる。
　本発明のポリヌクレオチドは、使用目的に応じて、例えば、調節要素（プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、エンハンサー等）、５’－非翻訳領域（ＵＴＲ）、３’－ＵＴＲ、シグナル配列、プロテインタグ配列及びポリ（Ａ）付加配列のうちの少なくとも１つを作動可能に連結させてもよい。
　一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、細胞に導入して使用することができる。形質転換体に導入する場合は、形質転換体のコドン使用頻度に基づいて各アミノ酸残基のコドンを選択することが好ましい。例えば、配列番号１のアミノ酸配列に対して、大腸菌への導入に適するように設計されたポリヌクレオチドとして、配列番号８の１～５３４位のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド若しくは配列番号８の１～５３４位に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、又は、配列番号８のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド若しくは配列番号８に対して少なくとも８０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド、が挙げられる。
　一実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写及び／又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳に用いることもできる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系としては、例えば、大腸菌Ｓ３０画分、昆虫細胞（ＳＦ９又はＳＦ２１等）溶解物、ウサギ網状赤血球溶解物や小麦胚芽抽出物等のｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を使用することができる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写物は、例えば、細胞に導入してもよいし、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳に供することもできる。
　本発明の発現ベクターは、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。本発明の発現ベクターとしては、例えば、プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、ウイルス（植物ウイルス、動物ウイルス等）、人工染色体（ＹＡＣ、ＢＡＣ等）、ウイルスベクター等が挙げられる。
　本発明の発現ベクターは、さらに複製可能なオリジン、ＤＮＡクローニング部位、調節要素、プロテインタグ配列、選択マーカー等を含むことが好ましい。例えば、本発明の発現ベクターは、形質転換体の細胞内で本発明のポリペプチドが発現するように、本発明のヌクレオチドであるＤＮＡ断片が作動可能に連結された調節要素を含む。例えば大腸菌用の発現ベクターの作製には、例えば、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ　ＩＩ、ｐＥＴ発現システム、ｐＧＥＸ発現システム等が使用できる。
　本発明の形質転換体は、本発明のポリヌクレオチドを含む。本発明の形質転換体は、例えば、宿主細胞に上記発現ベクターを導入することによって、又は、本発明のポリヌクレオチドとしてＤＮＡを宿主細胞の染色体に挿入することによって作製することができる。
　宿主細胞は、例えば、細菌（大腸菌、枯草菌等）、出芽酵母、分裂酵母、真菌（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属等）、カイコ細胞、ＳＦ９細胞、ＳＦ１２細胞、アフリカツメガエル卵細胞、植物細胞（タバコ、イネ、トウモロコシ等由来）、哺乳動物細胞（サル腎臓細胞（ＣＯＳ７などの培養細胞株を含む）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）等）などが挙げられるが、中でも細菌が好ましく、大腸菌がより好ましい。一実施形態では、宿主細胞は、多細胞からなる個体（例えば、植物個体、動物個体等）に含まれるものであり得る。
　本発明のポリヌクレオチドの宿主細胞への導入手法は特に限定されず、宿主細胞の種類、導入される発現ベクターの形態等に応じて適宜選択し得る。具体的には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法、リポフェクション、インジェクション法等が挙げられる。
　本発明のポリヌクレオチド（ＤＮＡ）の宿主細胞の染色体への導入方法は特に限定されず、例えば、相同組換え法、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９等を用いたゲノム編集法などを使用することができる。
　得られた本発明の形質転換体を、宿主細胞での発現に適した条件の下で培養又は個体ごと生育させることによって、本発明のポリペプチドを発現させることができる。当該発現の前に、例えば、選択マーカーによるスクリーニング、発現誘導処理等の工程を経てもよい。一実施形態では、本発明の形質転換体は本発明のポリペプチドを製造するために用いられる。別の実施形態では、本発明の形質転換体は、本発明のポリペプチドが細胞内又は細胞表面に存在する状態で、ドナー基質とアクセプター基質をライゲーションするために用いられる。
　［酵素剤、キット］
　本発明は、本発明のポリペプチドを含む、酵素剤及びキットを包含する。
　本発明の酵素剤は、例えばドナー基質とアクセプター基質のペプチドライゲーション産物の製造等に使用することができる。本発明の酵素剤には、本発明のポリペプチドとして、１種単独が含まれていてもよく、２種以上（例えば、ドナー基質認識配列の異なる２種以上のポリペプチド）が含まれていてもよい。
　本発明の酵素剤の形態は、例えば、粉末剤、顆粒剤、丸剤、錠剤、液剤、ゲル剤、分散剤、ペースト、本発明のポリペプチドが固相（樹脂、担体等）に固定化された形態（例えば本発明のポリペプチドが固定化されたビーズ、スラリー等）などが挙げられる。
　本発明の酵素剤は、その形態、使用目的、本発明のポリペプチドの特性等に応じて、例えば、溶媒、賦形剤、緩衝剤、安定化剤、保存剤、防腐剤及び固定化に用いられる固相からなる群より選ばれる少なくとも１つをさらに含んでもよい。
　本発明のキットは、上記の酵素剤を含み、ドナー基質とアクセプター基質のペプチドライゲーション産物の製造等に使用することができる。本発明のキットには、酵素剤以外に、例えば、ドナー基質、アクセプター基質、溶媒、緩衝剤、基質が固相化された担体（例えば、ディッシュ、樹脂、ビーズ、プレート等）、標準試料、分離・精製用器具等を含んでもよい。
　［ライゲーション産物の製造方法］
　本発明のライゲーション産物の製造方法は、ドナー基質認識配列を少なくとも１つ含むドナー基質と、第一級アミンを少なくとも１つ含むアクセプター基質を、上記の本発明のポリペプチド及び／又は上記の本発明の形質転換体で処理することを含む。
　本態様において、ドナー基質認識配列の具体的な例は、本発明の［ポリペプチド］の項の記載に準じる。
　本態様において、ドナー基質は、その調製を容易とする観点から、ポリペプチドからなるものが好ましい。ドナー基質は、より好ましくはドナー基質認識配列のＮ末端側にタンパク質（抗体、抗体断片、抗原、酵素、受容体、レポータータンパク質、ＧＳＴ、ＭＢＰ等のタグタンパク質など）が融合したポリペプチドである。タンパク質とドナー基質認識配列の間には、適宜リンカーとなるアミノ酸配列を挿入することもできる。これらのポリペプチドは、例えばポリペプチドをコードする遺伝子を設計、発現させることによって容易に製造することができる。
　本態様において、アクセプター基質は、例えば、本発明の［ポリペプチド］の項に記載した第一級アミン又は当該第一級アミンに対応する部分を含む化合物が少なくとも１つ結合又は会合している基質が好ましい。
　本態様において、ドナー基質とアクセプター基質は、それぞれ１種単独を用いてもよいし、２種以上を用いてもよい。本発明のポリペプチドもまた、１種単独又は２種以上を用いることができる。
　上記の処理は、より具体的には、ドナー基質とアクセプター基質を、上記の本発明のポリペプチド及び／又は上記の本発明の形質転換体によるペプチドライゲーション反応によってライゲーションすることを意味する。
　一実施形態では、上記の処理は、ドナー基質、アクセプター基質、並びに、本発明のポリペプチド又は本発明の形質転換体の共存下で、本発明のポリペプチドの活性に基づくペプチドライゲーション反応を行わせることを意味する。
　別の実施形態では、上記の処理は、（１）ドナー基質と本発明のポリペプチド及び／又は本発明の形質転換体を反応させて、ドナー基質のＮ末端側断片が本発明のポリペプチドに結合した中間体を調製する工程と、（２）（１）の後に中間体とアクセプター基質を反応させて、ライゲーション産物を得る工程を含む。ここで、（１）と（２）の工程の間に、任意で、中間体の分離工程を含んでもよい。
　上記の処理の際のｐＨは、本発明のポリペプチドの最適反応ｐＨが好ましく、例えば７～９又は８～８．５であり得る。
　上記の処理の際の温度は、本発明のポリペプチドの熱安定性によって適宜変更し得るが、例えば４℃以上、１０℃以上、２０℃以上又は３０℃以上であり、５０℃以下又は４０℃以下であり得る。
　上記の処理の際のドナー基質に対するアクセプター基質の割合は、それぞれの基質の種類、含まれるドナー基質認識配列及びアミノ基の数、反応条件（ｐＨ、反応時間、温度、基質濃度、酵素濃度等）、ライゲーション産物の使用目的等に応じて適宜設定し得る。ドナー基質に対するアクセプター基質の割合は、モル濃度比で、例えば、０．０１～１００倍、０．０５～２０倍又は０．１～１０倍であり得る。
　得られるライゲーション産物は、例えば、アクセプター基質に対して１つ又は複数のドナー基質がライゲーションされたものであり得る。例えばアクセプター基質が複数のアミノ基を有する場合は、複数のドナー基質がライゲーションされ得る。ここで、ライゲーションされるドナー基質は、互いに同一であっても少なくとも１つが異なるものであってもよい。
　本態様において、ドナー基質は、抗体又は抗体断片の少なくとも１つのサブユニットのＣ末端側にドナー基質認識配列が付加したものであり得る。例えば、細胞傷害剤、生理活性物質等や、それらを含むベシクル等のような、ドラッグデリバリーシステム（ＤＤＳ）キャリア等の薬物となり得る部分を含むアクセプター基質を用いれば、ワンステップで抗体薬物複合体（ＡＤＣ）が製造される。また、例えば、下記の実施例４のように、複数の抗体又は抗体断片を含むドナー基質と複数のアミノ基を含むアクセプター基質を用いれば、抗体又は抗体断片を多量体化することができる。このように多量体化された抗体又は抗体断片は、例えば２以上の標的に結合性を有する多重特異性をもたらし得る。
　本態様において、別の実施形態では、ドナー基質は、酵素のＣ末端側にドナー基質認識配列が付加したものであり得る。例えばアクセプター基質として固相に結合又は会合した第一級アミンを用いることで、下記の実施例５のように、固定化酵素を容易に製造することができる。
　ライゲーション産物の用途は特に限定されず、例えば、医薬品、医薬部外品、化粧品、食品（飲料、機能性食品、サプリメント等を含む）、及びそれらの原材料、試薬類、化成品等が挙げられる。
　ライゲーション産物は、その形態、使用目的等に応じて、さらに抽出、濾過、分離、精製、濃縮、他の成分の配合、ｐＨ調整、脱色、脱臭、殺菌、乾燥、粉末化、顆粒化、打錠等の工程を少なくとも１つ経てもよい。
　次に、実施例や試験例により本発明を具体的に説明するが、本発明は以下の実施例や試験例に限定されるものではない。
　［実施例１：祖先型ソルターゼＥの調製］
　（１－１．祖先型ソルターゼＥ配列の設計）
　本発明に係る祖先型ソルターゼＥ配列の設計の概要を図１に示した。
　（１）まずテンプレートとなるＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ由来のソルターゼＥ（ＳａｖＳｒｔＥ）の配列に類似する５，０００配列をピックアップし、配列解析プログラムを用いて解析し、配列分類に重要なアミノ酸残基を複数個同定した。この残基の組み合わせに応じて上記の選択した配列をグループ分けした。
　（２）祖先型設計法（ＡＳＲ法）により祖先型ソルターゼＥのアミノ酸配列を設計した。具体的には、分類された配列を入力として、MAFFT2ASR.py（https://github.com/shognakano/MAFFT2ASR）を用いて設計を行った。
　得られた複数の祖先型ソルターゼＥのうち、配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列を有するもの（本明細書において、「ＡｃＳＥ」と呼ぶ）について、以降の試験に用いた。ＡｃＳＥは、ＳａｖＳｒｔＥとのアミノ酸配列の同一性がわずか４１．１％であり、天然のソルターゼＥとは大きく異なっていた。
　（１－２．ＡｃＳＥの調製）
　ＡｃＳＥのＣ末端に１２残基のポリヒスチジンタグを付加したタンパク質（配列番号１）をコードするＤＮＡを合成し、ＮｃｏＩとＸｈｏＩ部位でｐＥＴ１５ｂベクターにサブクローニングした。ＡｃＳＥのＤＮＡ配列は配列番号８であり、大腸菌での発現に最適化されている。得られたプラスミドでＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。菌株は３０μｇ／ｍＬアンピシリンを含む１ＬのＬＢ培地で３７℃で培養された。ＯＤ６００値が０．６～０．８の範囲に達した時点で温度を２３℃に下げた。ＩＰＴＧを最終濃度０．５ｍＭで培地に添加してから、さらに１６時間培養した。培養後、遠心分離により細胞を回収した。この細胞を緩衝液Ａ（２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ＝７．０］、２００ｍＭ　ＮａＣｌ）に懸濁し、超音波処理した。超音波処理したサンプルを１１，０００ｇで３０分間遠心分離した後に上清を回収し、緩衝液Ａで平衡化したＨｉｓＴｒａｐ　ＨＰ　ｃｏｌｕｍｎ（Ｃｙｔｉｖａ，ＭＡ，ＵＳＡ）にアプライした。カラムを緩衝液Ａで洗浄した後、１００、２５０、５００、７５０、１５００ｍＭのイミダゾールを含む緩衝液Ａでサンプルを溶出した。
　その結果、可溶性のＡｃＳＥが、１Ｌ培養液に対して４９．４ｍｇ得られた。
　以降の試験のために、ＡｃＳＥを含むサンプルをさらに精製した。緩衝液Ａによって平衡化されたＭｏｎｏＱカラム（Ｃｙｔｉｖａ，　ＭＡ，　ＵＳＡ）にサンプルをアプライし、緩衝液Ａベースで直線グラジエントで溶出した。溶出したサンプルを回収し、濃縮したサンプルを、緩衝液Ａで平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ　２００　Ｉｎｃｒｅａｓｅカラム（Ｃｙｔｉｖａ，ＭＡ，米国）にアプライして精製した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥによりＡｃＳＥの精製度を確認した。ＡｃＳＥサンプルの濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて２８０ｎｍの吸光度から見積もった。
　（１－３．ＡｃＳＥの熱安定性の測定）
　得られたＡｃＳＥの熱安定性を、示差走査熱量計（ＤＳＣ）を用いて測定した。タンパク質溶液は、緩衝液Ａに約２ｍｇ／ｍＬになるように濃縮・溶解した。測定は、２５℃、５分→９０℃／ｈｒで７０℃まで昇温、のメソッドで行った。測定により得られたデータは、Ｍｉｃｒｏｃａｌ　ＰＥＡＱ－ＤＳＣ　Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて解析した。エンタルピー（ΔＨｃａｌ、ΔＨＶＨ）はｎｏｎ－Ｔｗｏ　Ｓｔａｔｅモデルで行い、熱容量変化（ΔＣＰ）はＴｗｏ－Ｓｔａｔｅ、ΔＣＰ≠０モデルを用いて分析した。その結果、ＡｃＳＥの熱力学パラメータは、Ｔｍ＝４４．５±０．２４（℃）、ΔＣＰ＝４．２３±０．０９（ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃）、ΔＨｃａｌ＝４８．８±４．９９（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）、ΔＨＶＨ＝９６．５±４．７７（ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であった。
　［実施例２：ＡｃＳＥによるポリグリシンへのペプチドライゲーション試験］
　ＳａｖＳｒｔＥは、Ｎ末端がアセチル化されたペプチドであるＡｃ－ＹＮＬＡＥＴＧＡとＡｃ－ＹＮＬＰＥＴＧＡ（合わせて、Ａｃ－ＹＮＬ（Ａ／Ｐ）ＥＴＧＡのように記述する）を認識して切断し、ＧＧＧＫＹに結合させる。そこで本実施例では、これらの基質が、ＡｃＳＥの基質となり得るかどうかを調べた。
　（共通する材料及び方法）
　本実施例の各試験で用いたペプチド（ＧＧＧＫＹ、Ａｃ－ＹＮＬＰＥＴＧＡ、Ａｃ－ＹＮＬＡＥＴＧＡ、Ａｃ－ＹＮＬＰＥＴＧＧＧＫＹ（配列番号９）、Ａｃ－ＹＮＬＡＥＴＧＧＧＫＹ（配列番号１０））は、いずれもＧｅｎＳｃｒｉｐｔ　Ｊａｐａｎ株式会社に合成を委託して作製した。
　各試験の反応後の生成物であるＡｃ－ＹＮＬ（Ａ／Ｐ）ＥＴＧＧＧＫＹの濃度は、反応物をＨＰＬＣ分析して得られる２１０ｎｍ領域のクロマトグラムのピーク面積から算出した。Ａｃ－ＹＮＬ（Ａ／Ｐ）ＥＴＧＧＧＫＹのＨＰＬＣ条件は以下の通りである。
　移動相：（Ａ）０．１％ＴＦＡ水溶液，（Ｂ）０．１％ＴＦＡ含有アセトニトリル溶液
　グラジエント：５％（Ｂ）→３０％（Ｂ）まで３０分で直線グラジエント
　流速：０．３５ｍＬ／ｍｉｎ
　カラム：Ｕｎｉｓｏｎ　ＵＫ－Ｃ１８　ｃｏｌｕｍｎ（１５０×２ｍｍ，　Ｉｍｔａｋｔ）
　カラム温度：４０℃
　注入量：１０μＬ
　ＨＰＬＣの各ピークに対応する化合物、各ピークの画分は、液体クロマトグラフィー／高分解能質量分析（ＬＣ／ＨＲＭＳ）によって同定した。ＬＣ／ＨＲＭＳスペクトルは、ＥＳＩデュアルソースとＡＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｃ１８カラム（１．７μｍ，２．１×１００ｍｍ，Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，米国）を備えたＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ　ＨＲ－ＥＳＩ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ－ＭＳ（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で取得した。液体クロマトグラフィーは、移動相として（Ａ）０．１％ギ酸水溶液、（Ｂ）０．１％ギ酸含有アセトニトリル溶液を用い、流速０．３５ｍＬ／ｍｉｎ、カラムオーブン温度４０℃、注入量は１μＬで行った。溶出は（Ａ）：（Ｂ）＝９５：５→７０：３０の直線グラジエントで３０分間で実施した。各ＨＲＭＳ／ＭＳスペクトルは、トータルイオンフラグメンテーションモードで取得した。ｓｔｅｐ－ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ　ｃｏｌｌｉｓｉｏｎ　ｅｎｅｒｇｉｅｓは１５、３５、４５ユニットに設定した。
　（２－１．反応速度パラメーターの算出）
　ＡｃＳＥ、ＳａｖＳｒｔＥの酵素活性は、Das S. et al., J Biol Chem, 2017, Vol.292, p.7244-7257に基づいて、酵素反応の進行により生成するＡｃ－ＹＮＬ（Ａ／Ｐ）ＥＴＧＧＧＫＹペプチドの量を定量することにより測定した。アッセイバッファーの内容は以下の通りである：１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　β－メルカプトエタノール、０．０５～４ｍＭ　Ａｃ－ＹＮＬ（Ａ／Ｐ）ＥＴＧＡペプチド、及び１ｍＭ　ＧＧＧＫＹペプチド。反応温度は３０℃に設定した。各濃度について、反応時間０分、１０分、３０分、６０分の生成物（Ａｃ－ＹＮＬ（Ａ／Ｐ）ＥＴＧＧＧＫＹ）の量をプロットし、ＡｃＳＥの反応速度パラメータｋｃａｔ及びＫＭを算出した。これらのパラメータは、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ社製）を用いて、非線形最小二乗法により初速度データをＭｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ式にフィッティングさせて求めた。
　ＡｃＳＥ、ＳａｖＳｒｔＥのＡｃ－ＹＮＬ（Ａ／Ｐ）ＥＴＧＡペプチドに対する反応速度パラメータの比較結果を表１に示した。上記Ｄａｓ　Ｓ．らの文献に記載のＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓソルターゼＡ（ＳａＳｒｔＡ）の反応速度パラメータも示した。ＡｃＳＥは、野生型のソルターゼＡ及びソルターゼＥと比べてｋｃａｔ／ＫＭの値が大きく、高い活性を有することが明らかとなった。また、ＡｃＳＥはＳａｖＳｒｔＥと同様に、ドナー基質認識配列としてＬＰＥＴＧに比べてＬＡＥＴＧをより選択的に認識するが、その選択性はＳａｖＳｒｔＥに比べて約１４倍向上していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（２－２．反応物の生成量の時間依存性の検討）
　１μＭ又は５０μＭのＡｃＳＥを１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．０）、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　β－メルカプトエタノール、０．５ｍＭ　Ａｃ－ＹＮＬ（Ａ／Ｐ）ＥＴＧＡペプチド及び１ｍＭ　ＧＧＧＫＹペプチドに加え、３０℃で反応させた。
　その結果を図２Ｂに示した。１μＭ　ＡｃＳＥを用いたところ、Ａｃ－ＹＮＬＡＥＴＧＡ、Ａｃ－ＹＮＬＰＥＴＧＡを基質とした場合の変換率（全ての反応可能な基質が反応したと仮定して見積もられる生成物量に対する実際の生成物の割合）は、１２時間後にそれぞれ５５％、３９％であった。５０μＭ　ＡｃＳＥを用いた場合は、３０分間で変換率６０％に達した。その後、基質の枯渇と生成物の加水分解によって生成物が減少したが、このような加水分解活性は天然のソルターゼにも認められるものである。
　次に、ＧＧＧＫＹペプチドの濃度を１～１６ｍＭに変更した以外は同じ条件で反応を行い、反応８時間後の変換率を比較した。その結果を図２Ｃに示した。アクセプター基質であるＧＧＧＫＹ濃度を増加させることで変換率が増加し、８ｍＭで最大７０％の変換率を示した。一方、１６ｍＭの場合は変換率の低下が見られたが、これはドナー基質が枯渇した後に生成物が加水分解されたことが原因の一つと考えられる。
　（２－３．反応物の生成量のｐＨ依存性の検討）
　さらに、ＡｃＳＥ活性のｐＨ依存性の検討を行った。５０μＭ　ＡｃＳＥと終濃度１００ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０～９．０）あるいはＣＡＰＳＯ－ＮａＯＨ（ｐＨ９．５～１０．２）と、１５０ｍＭ　ＮａＣｌ、２ｍＭ　β－メルカプトエタノール、０．５ｍＭ　Ａｃ－ＹＮＬＡＥＴＧＡ及び１ｍＭ　ＧＧＧＫＹを含む反応液を用いて３０℃で１時間反応させ、上記２－２と同様の方法に基づいて得られる変換率を比較した。
　その結果を図２Ｄに示した。ＡｃＳＥによる生成物の加水分解は、塩基性条件下で抑制され、ｐＨが７．０～９．０、特に８．０～８．５において高い変換率を示すことが判明した。
　また、上記２－１～３に示されるように、いずれの反応においてもカルシウムイオンを添加しない条件でＡｃＳＥの活性が見られたことから、ＡｃＳＥはカルシウムイオン非依存的であることが確認された。
　［実施例３：ＡｃＳＥによるグリシンを含まない第一級アミンへのペプチドライゲーション試験］
　野生型ソルターゼＥは、一般的にポリグリシン配列を有しない第一級アミンにペプチドライゲーション反応を行うことはできない。しかし、ＡｃＳＥは野生型ソルターゼＥとはアミノ酸配列が大きく異なることから、基質特異性も異なることが推察された。そこで、ＡｃＳＥがポリグリシン配列を有しない第一級アミンに対してペプチドライゲーション活性を有するかどうかを確認した。
　ＡｃＳＥを用いて、Ａｃ－ＹＮＬＡＥＴＧＡと、図３Ａ及び表２に記載の第一級アミンのライゲーション反応を行った。酵素反応は、５０μＭ　ＡｃＳＥ、０．５ｍＭ　Ａｃ－ＹＮＬＡＥＴＧＡ、１ｍＭの第一級アミンを用いるほかは、実施例２－１の条件に準じて８時間行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　酵素反応後のサンプルをＬＣ／ＨＲＭＳで解析した。ＬＣ／ＨＲＭＳは、下記の溶出条件を使用する以外は、実施例２と同様の条件で行った。
　図３Ｂの２ｄ以外の第一級アミン付加Ａｃ－ＹＮＬＡＥＴ（配列番号１１）：（Ａ）：（Ｂ）＝８４：１６→８０：２０の直線グラジエントで３０分間で溶出。
　図３Ｂの２ｄ：（Ａ）：（Ｂ）＝９５：５→３０：７０の直線グラジエントで３０分間で溶出。
　酵素反応後のサンプルのＬＣ／ＨＲＭＳの結果を図３Ｂに示した。試験した第一級アミンは、いずれもドナー基質とのライゲーション産物に対応するピークが検出された。よって、ＡｃＳＥはポリグリシンを有しないアクセプター基質に対してもペプチドライゲーション反応を触媒することが明らかとなった。
　［実施例４：ＡｃＳＥを利用したタンパク質のライゲーション反応試験］
　ＡｃＳＥを用いて、Ｃ末端にドナー基質認識配列を含むペプチド（ＬＡＥＴＧＡ；配列番号１２）が付加されたサメＶＮＡＲ（Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｄｏｍａｉｎ　ｏｆ　Ｎｅｗ　Ａｎｔｉｇｅｎ　Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）－ヒトＦｃ融合タンパク質（ＶＮＡＲ－Ｆｃ）に対して、アクセプター基質としてＮ末端にＧＧＧが付加されたＶｅｎｕｓタンパク質（ＧＧＧ－Ｖｅｎｕｓ）をライゲーションした（図４Ａの反応１）。ＶＮＡＲ－Ｆｃはドナー基質認識配列とＦｃの間にＡＧＩＡタグ（Yano S. et al., PLoS ONE, 2016, Vol.11, No.6: e0156716）を含む。反応は、２０μＭ　ＶＮＡＲ－Ｆｃ、１００μＭ　ＧＧＧ－Ｖｅｎｕｓ及び５μＭ　ＡｃＳＥ、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝７．０）、２００ｍＭ　ＮａＣｌ及び１ｍＭ　ジチオトレイトール（ＤＴＴ）で、４℃で２４時間進行させた。０、１、２、４、８、２４時間後のサンプルを等量の２×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ用サンプルバッファーと混合し、９０℃で１０分間加熱して反応を終結させた。得られたサンプルをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
　また、ＡｃＳＥを用いて、ＶＮＡＲ－Ｆｃに対して、アクセプター基質としてポリ（エチレングリコール）ジアミン（分子量２，０００）をライゲーションした（図４Ａの反応２）。ＧＧＧ－Ｖｅｎｕｓの代わりに２００μＭ　ポリ（エチレングリコール）ジアミンを使用し、ＡｃＳＥを５０μＭ使用する以外は、上記反応１と同様の条件で反応を行った。反応後のサンプルを同様にＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した。
　ＳＤＳ－ＰＡＧＥの結果を図４Ｂ、Ｃに示した。反応１、２ともにライゲーション反応により各基質よりも大きい分子量のバンド（図４Ｂのｄ、図４Ｃのｅ）が検出された。これらのバンドの分子量から、それぞれ図４Ａのｄ、ｅに対応する生成物が得られていることが推定された。各バンドからタンパク質を抽出し、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ質量分析を行ったところ、目的の生成物から予測される分子量に一致した。したがって、ＡｃＳＥによるライゲーション反応によって、予測される生成物が得られたことが確認された。
　［実施例５：ＡｃＳＥによる酵素の固定化試験］
　（ドナー基質タンパク質である祖先型Ｌ－アミノ酸酸化酵素の調製）
　本発明者らが以前に作製した祖先型Ｌ－アミノ酸酸化酵素（ＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２）（Ishida C. et al., ChemCatChem, 2021, Vol.13, Issue 24, p.5228-5235参照）を本実施例で使用した。ＡｃＳＥのドナー基質認識配列を含むペプチド（ＬＡＥＴＧＡ）を付加した祖先型Ｌ－アミノ酸酸化酵素（ｓＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２）（配列番号１３）をコードする遺伝子（配列番号１４）を合成した。得られたｓＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２遺伝子をＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ部位でｐＥＴ２８ａベクターにサブクローニングした。タンパク質の精製は、上記Ｉｓｈｉｄａ　Ｃ．　ｅｔ　ａｌ．の論文で報告されたものと同じ手順を採用することにより行われた。
　（５．１：固定化ＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２ビーズの作製）
　ＡｃＳＥを用いて、ＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２をポリアミンビーズに固定化させた（図５Ａ参照）。ポリアミンビーズ（ＰｏｌｙｂｅａｄＴＭ、０．５０μｍ；Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｃ．）に、０、４７又は４７０μＭ　ＡｃＳＥ、８０μＭ　ｓＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２と緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液［ｐＨ７．０］，１０ｍＭ　ＮａＣｌ）を加え、４℃で４８時間反応させた。ビーズを遠心分離で回収し、緩衝液Ｂで少なくとも７回洗浄した。固定化されたビーズを回収し、２ｍＬの緩衝液Ｂに再懸濁した。
　（５．２：固定化ビーズのＡｎｃＬＡＡＯ２活性の確認試験）
　得られた固定化ＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２の活性は、Ｌ－アミノ酸基質（Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－アラニン又はＬ－アスパラギン酸）の存在下で酵素反応により生成するＨ２Ｏ２を検出することにより確認した。なお、ＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２はＬ－アラニンに対する活性が低く、Ｌ－アスパラギン酸に対する活性がないことから、これらはコントロールとして使用した。
　上記の固定化によって得られたビーズを９６ウェルプレートに分注し、反応用緩衝液を加えて、室温で３０分反応させた。反応用緩衝液は以下の通りである：１００ｍＭ　Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１．５ｍＭ　４－アミノアンチピリン、２．２ｍＭ　Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－３－メチルアニリン（ＴＯＯＳ）、５０Ｕ／ｍＬ　西洋ワサビペルオキシダーゼ（東洋紡株式会社製）、１０ｍＭ　Ｌ－アミノ酸基質。Ｌ－アミノ酸酸化酵素活性は、生成物であるＨ２Ｏ２による紫色の呈色により検出した。
　結果を図５Ｂに示した。Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－イソロイシンを基質として加えた場合、ＡｃＳＥの存在下で固定化反応を行ったビーズを加えたウェルで酵素活性が検出された。高濃度のＡｃＳＥで固定化したビーズのほうが、より高い酵素活性を示した。ＡｃＳＥを添加しない場合はビーズへの酵素固定化は起こらず、活性は検出されなかった。Ｌ－アラニンでは上記３基質より低い酵素活性が認められ、Ｌ－アスパラギン酸では酵素活性が認められなかった。したがって、ＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２による活性が適切に検出されていることが確かめられた。
　［実施例６：高活性化ソルターゼＡと祖先型ソルターゼＥの各時間依存性結合効率の確認試験］
　発明者らは、野生型ＳｒｔＡに対して５つの変異を有し、触媒活性が約１４０倍高いとされる高活性化ソルターゼＡ（ｅＳｒｔＡ）（B, M. Dorr et al., PNAS 111(37), 13343-13348, 2014）及び本願発明者らが作製した祖先型ソルターゼＥ（ＡｃＳＥ）を用いて、ｅＳｒｔＡとＡｃＳＥの各時間依存性結合効率を検討した。
　合計１０ｍｇのアミノ化ポリスチレンビーズ（０．５０μｍ、Ｂａｎｇｓ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｉｎｃ．）を１ｍＬチューブに分注した。コンジュゲーション反応は、最終濃度１０μＭのＳｏｒｔａｇ付きＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２と１００μＭのｅＳｒｔＡ又はＡｃＳＥを以下に記載する各ソルターゼに応じた緩衝液に加えて４℃で反応開始した。緩衝液の組成はｅＳｒｔＡとＡｃＳＥで異なり、ｅＳｒｔＡでは、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、３００ｍＭ　ＮａＣｌ、０．５ｍＭ　ＴＣＥＰ、１ｍＭ　ＣａＣｌ２から成る緩衝液を用いた。また、ＡｃＳＥでは、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２００ｍＭ　ＮａＣｌから成る緩衝液を用いた。反応開始から反応開始時（０分）、１０分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間の各時点でビーズを回収し、直ちに２０ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ７．０）と１０ｍＭ　ＮａＣｌを含むＢｕｆｆｅｒＡで回収したビーズを洗浄した。
　結果を図６に示した。ＡｃＳＥを用いて連結反応を実施した結果、４時間の反応ののちに連結されたＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２量が最大となり、反応開始から２４時間後も９０％以上のＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２が保持されていた。一方で、ｅＳｒｔＡを用いた実験では、ビーズに連結されたＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２量は２時間で最大であったが、ＡｃＳＥを用いた場合の同時点の４０％程度であった。また、その後も副反応による切断反応が進行し、２４時間後におけるＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２量は、最大値の５０％以下まで低下した。したがって、本試験結果からＡｃＳＥは、ｅＳｒｔＡと比較すると副反応による切断反応が進行しにくいことが確認された。
　配列番号１（ＡｃＳＥ；アミノ酸配列）
MKPASGVPDP KRKPGAFEPG QGFAIIYIPK LDVKAPIAEG IDKHKVLDKG MVGHYGEAPL
KTAMPWDKQG NFALAGHRNT HGEPFRYINR LEPGDKIVVE TADRYYTYEM TSILPQTPPS
NVSVIDPVPP GSGFTQPGRY ITLTTCTPEF TSTYRMIVWG KMVDERPRSK GKPDALVRSG
HHHHHHHHHH
　配列番号８（ＡｃＳＥ；ＤＮＡ配列）
atgaaaccgg caagcggtgt tccggatccg aaacgtaaac cgggtgcatt tgaacctggt
cagggttttg caattatcta tattccgaaa ctggatgtga aagcaccgat tgcagaaggc
attgataaac ataaagtgct ggataaaggt atggtgggtc attatggtga agcaccgctg
aaaaccgcaa tgccgtggga taaacagggt aattttgcac tggcaggtca tcgtaatacc
catggtgaac cgtttcgtta tatcaatcgt ctggaaccgg gtgataaaat tgttgttgaa
accgcagatc gctattacac ctatgaaatg accagcattc tgccgcagac accgcctagc
aatgttagcg ttattgatcc ggttccgcct ggtagcggtt ttacccagcc tggtcgttat
attaccctga caacctgtac accggaattt accagcacct atcgtatgat tgtttggggt
aaaatggttg atgaacgtcc gcgtagcaaa ggtaaaccgg atgcgctggt tcgttccggc
catcaccatc accatcacca tcaccatcac
　配列番号１３（ｓＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２；アミノ酸配列）
MGENEKIDIA IVGGGVSGVY SAWKLKTKYP NKKIVLFEGG DHIGGRLLSV IPPGIPNMVA
ELGGMRILEN TQKLIVKLID DINEKLSQED QIELYDFPVD QPQNIAYLRG EHLRLFDFTN
DPDKVPYKLS FLEKGNTSGT IIVNAIEQLV PGITNTDLTE EERLKMCQEA TFEGAPLYTL
GFWNLLYRVI SGEAYQFSID SGGYNSTLVN WNAADAIPWY LSDFGIKPVY KGFKNGFQQV
PISLANFFEE DGGEIRLNAK LEGFEFKNNL FELTIDGEII EATQLILAMP RRSLDLLTNT
SPKLQEIQSL IGSVTPRPLF KVFTTYSSPW WRNAGYTDSE GGYIPLQSGR TVTDLPIRQT
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WNSWNIGVKS WEVKEKIVHP IDNCSLYICG EAYSDGQGWV EGALQTADIM LKKFIAVESK
TSVKEEAILA ETGAGLE
　配列番号１４（ｓＨＴＡｎｃＬＡＡＯ２；ヌクレオチド配列）
atgggcgaaa atgagaaaat tgatatagct atagttggtg gcggcgtgag cggcgtttac
tctgcatgga agctgaagac caaatacccg aataaaaaga tcgtgctgtt cgaaggcggt
gatcacattg gtggtcgttt gcttagtgtg atcccaccgg gtattccaaa catggtggct
gagctgggtg gcatgcgtat tttggagaac acccaaaaac tcatagtgaa acttatcgac
gacattaacg aaaagctgtc tcaggaggat cagattgaac tttacgactt cccggttgac
caaccgcaga atattgccta cttgcgcggt gaacatctgc gtttgttcga tttcaccaat
gatccggaca aagttccgta taagctgtcc ttcctggaaa aaggtaatac gagcggcacc
atcatcgtga acgccatcga gcagttggtt cctggtatta ccaacactga cctgaccgaa
gaggaacgtc tgaaaatgtg ccaggaagcg acgtttgaag gtgctccgtt gtacactctg
gggttctgga atttgctgta tcgtgttatt tccggcgaag cgtaccagtt tagcattgac
tccggcggct ataactcgac cctggtcaac tggaacgcgg ctgatgctat tccgtggtac
ctgagcgatt tcggcatcaa accggtgtac aaaggtttta agaacggttt ccagcaggtt
ccgatcagct tggctaattt ttttgaagag gacggcggtg agatccgcct gaatgctaaa
ttggagggct tcgagttcaa gaataacctg ttcgagctga ccatcgacgg cgaaattatc
gaagcgaccc agttgatcct ggccatgccg cgccgttcac tggatctgct gaccaacacg
agcccgaagc tgcaagagat ccagtccctg atcggctctg taacaccaag acctctgttt
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ggtggctaca ttccgctcca aagcggacgc accgtgaccg acctgccgat ccgccagacg
tattattggc cgaagaacaa cggtcaaccg agcgtgtccg gtgaaagcat gctgttggcg
agctatgacg acggtagcaa tattggcttc tgggatggct tgcgtccgca acgtaagaag
gcgtggaaaa aaggcttgag ccatgcagag ctggcggacg acccgttcat tggcgagtat
agcgagaccg aatcgctgct atccaaagcc ttaaaccaaa cgtggcacca gtataaagca
ccgcgcaaaa tggtggagga gctctctcgt cagctgaagc agatccacga tgttgactac
accccggcag tcaagaacgc gtcatttcgt gattggggtg aggacccgtt tggtggcggt
tggaacagct ggaacattgg tgtgaagagc tgggaagtta aggagaaaat cgttcacccg
attgataatt gttccctgta catctgcggt gaagcgtaca gcgatggcca aggttgggtc
gaaggtgcgc tgcaaaccgc agatattatg ctgaaaaagt ttatcgcggt agagagcaag
accagcgtta aagaggaagc gatcttagcc gagactggtg cgggtctcga g

Claims (9)

  1. 　下記（ａ）～（ｃ）から選ばれるいずれかのアミノ酸配列を含み、かつ、
    　ドナー基質認識配列を少なくとも１つ含むドナー基質を、第一級アミンを少なくとも１つ含むアクセプター基質に結合させる活性を有する、ポリペプチド：
    　（ａ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列；
    　（ｂ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列において、１～３５個のアミノ酸が欠失、挿入、置換又は付加されたアミノ酸配列；
    　（ｃ）配列番号１の１～１７８位で表されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列。
  2. 　前記第一級アミンが、アミノ末端を有する残基数２以上のポリグリシンを含まない、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 　カルシウムイオン非依存的に前記活性を有する、請求項１に記載のポリペプチド。
  4. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
  5. 　請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
  6. 　請求項４に記載のポリヌクレオチドを含む、形質転換体。
  7. 　請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、酵素剤。
  8. 　請求項７に記載の酵素剤を含む、キット。
  9. 　ドナー基質認識配列を少なくとも１つ含むドナー基質と、第一級アミンを少なくとも１つ含むアクセプター基質を、請求項１～３のいずれか一項に記載のポリペプチド、又は請求項６に記載の形質転換体で処理することを含む、ライゲーション産物の製造方法。
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DATABASE PROTEIN 30 May 2014 (2014-05-30), ANONYMOUS: "sortase family protein [Streptomyces iranensis]", XP093222036, Database accession no. CDR08379.1 *
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