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KR101521990B1 - 나노포어 사용을 위한 조성물, 장치, 시스템 및 방법 - Google Patents

나노포어 사용을 위한 조성물, 장치, 시스템 및 방법 Download PDF

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KR101521990B1
KR101521990B1 KR1020097023005A KR20097023005A KR101521990B1 KR 101521990 B1 KR101521990 B1 KR 101521990B1 KR 1020097023005 A KR1020097023005 A KR 1020097023005A KR 20097023005 A KR20097023005 A KR 20097023005A KR 101521990 B1 KR101521990 B1 KR 101521990B1
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데이비드 떠블류. 디머
윌리엄 비. 던바
세이코 베너
로저 진테 아리고 첸
노아 에이. 윌슨
케이트 리버맨
로빈 아부-슈메이스
니콜라스 허트
대니얼 브랜튼
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더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아
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Abstract

본 발명은 효소와 같은 다른 화합물에 의해 영향을 받는 혼합물 내의 개별적인 폴리머를 나노포어 내에서 검출하고 제어할 수 있는 장치 및 방법을 제공한다. 또한, 상기 장치 및 방법은 피드백 제어 하에서, 즉, 폴리뉴클레오타이드와 나노포어 사이의 상호작용에 의한 신호들을 사용하여, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 염기 서열을 신속하게(~＞50㎐) 결정하는데 사용된다. 본 발명은 특히, 분자생물학, 구조생물학, 세포생물학, 분자 스위치, 분자 회로 및 분자 계산 장치 분야 및 이들의 제조에 유용하다.
나노포어, 시퀀싱, 서열분석, 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드

Description

나노포어 사용을 위한 조성물, 장치, 시스템 및 방법{COMPOSITIONS, DEVICES, SYSTEMS, AND METHODS FOR USING A NANOPORE}
본 출원은 하기 특허들: 2007년 4월 4일 출원된 "나노포어를 사용하여 하나의 분자 또는 복합체에 대한 효소 활성을 제한하는 방법"이란 명칭의 미국 가특허출원 제60/921,787호, 2007년 5월 21일에 출원된 "나노포어를 사용하여 합성에 의한 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정화하는 방법"이란 명칭의 미국 가특허출원 제 60/931,115호, 2007년 6월 30일에 출원된 "정해진 위치에 단일 분자들을 배치하는 방법"이란 명칭의 미국 가특허출원 제 60/962,530호, 2007년 9월 4일에 출원된 "독립적으로 접근가능한 대규모 나노포어 어레이의 제조방법 및 이들의 사용방법"이란 명칭의 미국 가특허출원 제 60/967,539호, 및 2008년 1월 25일에 출원된 "폴리뉴클레오타이드 결합 단백질을 반복적으로 탐침하기 위한, 나노포어 내에 지지된 단일 테더링 폴리뉴클레오타이드의 피드백 제어"란 명칭의 미국 가특허 출원 제 61/062,391호의 우선권 및 이점을 주장하며, 이들 모두는 본 명세서에 참고로 그 전체 내용이 모든 목적을 위해 포함된다.
본 발명은 미국 국립 인간유전체 연구소의 연구과제 번호 HG003703-01 및 HG004035-01, 그리고 미국 국립 종합의학 연구소의 연구과제 번호 GM073617-01A1로 지정되어 받은 연구비를 사용하여 일부 이루어졌다. 미국 연방정부는 본 발명에 대 한 일정한 권리를 갖는다.
본원에 개시된 발명은 각각의 폴리머가 효소와 같은 다른 화합물에 의해 작용을 받는 시기를 제어할 수 있는 장치 및 방법을 제공한다. 본 발명은 특히, 분자생물학, 구조생물학, 세포생물학, 분자 스위치, 분자 회로 및 분자 계산 장치 분야와 이들의 제조에 유용하다. 또한, 본 발명은 개체가 암, 자가면역 질환, 세포주기 기능장애 또는 다른 기능장애에 걸렸는지를 진단하기 위한 조성물의 사용방법을 제공한다.
본 발명은 폴리뉴클레오타이드 및 다른 폴리머들을 특성화하는 조성물, 방법 및 장치 분야에 관련된 것이다.
DNA 및 RNA의 뉴클레오타이드 서열을 신속한 방법으로 결정하는 것은 바이오테크놀로지의 연구자들, 특히 유기체의 전체 게놈 서열을 얻기위해 노력하는 연구과제들에 있어서 중요한 목표이다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 서열을 신속하게 결정하는 것은 개체 및 개체군 내의 유전적 돌연변이 및 다형성들을 식별하기 위하여 중요하다.
나노포어 시퀀싱(nanopore sequencing)은 폴리뉴클레오타이드 분자의 서열을 신속하게 결정하는 하나의 방법이다. 나노포어 시퀀싱은 개별 폴리뉴클레오타이드(예: DNA 및 RNA) 내의 각각의 뉴클레오타이드가 나노포어 구경(aperture)을 통하여 지나갈 때, 각각의 뉴클레오타이드(또는 뉴클레오타이드 환경의 물리적 변화(즉, 전류와 같은 변화))를 물리적으로 탐지하는 특성에 기초한다. 원칙적으로, 폴 리뉴클레오타이드 서열은 단분자로부터 결정될 수 있다. 그러나, 대체로 폴리뉴클레오타이드 서열은 동일 분자의 복수 통과 또는 동일 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는 복수 분자들의 통과로부터 수득된 통계적 평균에 의해 결정되는 것이 바람직하다. 분자들을 작은 이온 채널들에 통과시킴에 따라 폴리뉴클레오타이드를 특성화하는 막 채널의 사용은 Kasianowicz 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93:13770-13773, 1996, 참고를 위해 본원에 포함됨)에 의하여 연구되었는데, 전기장을 사용하여 단일가닥 RNA 및 DNA 분자들을 지질 이중층막 내의 1.5 나노미터 직경의 나노포어 구경(예: 이온 채널)으로 통과하게 하는 방법이다. 나노포어 구경의 직경은 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥만이 주어진 시간 내에 상기 나노포어 구경을 통과할 수 있도록 한다. 폴리뉴클레오타이드가 나노포어 구경을 통과함에 따라 상기 폴리뉴클레오타이드는 나노포어 구경을 일부 차단하게 되는데, 이로 인해 일시적인 이온전류의 감소가 일어난다. 전류의 감소 폭은 폴리뉴클레오타이드의 길이에 직접적으로 비례한다. Kasianowicz 등(1996)은 이온전류의 변화를 측정함으로써 폴리뉴클레오타이드의 길이를 실험적으로 결정할 수 있었다.
Baldarelli 등(미국 특허 제6,015,714호) 및 Church 등(미국 특허 제5,795,782호)은 각 모노머를 토대로 하여 DNA 및 RNA를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 특성화하는 나노포어의 용도를 기술한다. 특히, Baldarelli 등은 나노포어 구경을 통하여 폴리뉴클레오타이드를 통과시킴으로써 폴리뉴클레오타이드를 특성화하고 서열을 결정하였다. 상기 나노포어 구경은 2개의 매질을 분리하는 구조물 또는 경계면 내에 함침된다. 폴리뉴클레오타이드가 나노포어 구경을 통하여 통과함에 따 라, 상기 폴리뉴클레오타이드가 나노포어 구경을 차단함으로써 이온전류를 변하게 한다. 각각의 뉴클레오타이드들이 나노포어 구경을 통과할 때, 각각의 염기/뉴클레오타이드는 나노포어 구경을 일시적으로 막는 뉴클레오타이드의 식별을 가능하게 하도록 이온전류를 변화시키는데, 이로써 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 조성을 특성화할 수 있도록 해주며, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정할 수 있도록 해줄 수 있다.
상술한 나노포어 분석 선행 기술의 단점 중 하나는 분석되는 타겟 폴리뉴클레오타이드의 속도를 억제한다는 점이다. Kasianowicz 등(1996)에 의해 기술된 바와 같이, 나노포어 분석은 폴리뉴클레오타이드의 길이를 결정하는 유용한 방법이다. 그러나, 이동(translocation) 속도는 뉴클레오타이드 조성에 의존적이며 Kasianowicz 등(1996)에 의해 구성된 측정 조건 하에서 초당 105 내지 107 뉴클레오타이드의 범위를 가질 수 있다. 따라서, 주어진 폴리뉴클레오타이드의 길이와 그의 이동 시간 사이의 상호관계는 비례하지 않는다. 또한, 이동 속도가 실제로 감소된다면 폴리뉴클레오타이드 내의 뉴클레오타이드 단위들 사이의 조성 및 공간 관계에 대하여 더 높은 해상도를 수득할 수 있다고 기대된다.
현재, 질환 및 기능장애의 진단과 예후뿐만 아니라 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 포함하는 폴리머들의 특성화에 사용될 수 있는 조성물 및 방법의 제공이 요구된다.
본 발명은 박막 장치 및 이를 사용하는 방법을 제공한다. 상기 장치는 전기적 전달 수단에 의하여 연결된 시스 및 트랜스 챔버를 포함한다. 상기 시스 및 트랜스 챔버는 하나 이상의 포어 또는 채널을 포함하는 박막에 의해 분리된다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 박막은 소수성 영역과 친수성 영역을 갖는 화합물을 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 박막은 인지질을 포함한다. 상기 장치는 시스 및 트랜스 챔버 사이에 전기장을 인가하는 수단을 추가로 포함한다. 상기 포어 또는 채널은 폴리머가 통과하기에 적합한 용적을 갖는 형태 및 크기로 구성된다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 포어 또는 채널은 폴리머의 전체가 아닌 일부를 수용한다. 바람직한 다른 일 구현예에서, 상기 폴리머는 폴리뉴클레오타이드이다. 바람직한 대안의 구현예에서, 상기 폴리머는 폴리펩타이드이다. 본 발명에 의해 제공되는 다른 폴리머들로는 폴리펩타이드, 인지질, 다당류 및 폴리케타이드(polyketide)를 포함한다.
일 구현예에서, 상기 박막은 폴리머에 대한 결합 친화도를 갖는 화합물을 추가로 포함한다. 바람직한 일 구현예에서 상기 결합 친화도(Ka)는 최소 106l/mole이상이다. 보다 바람직한 일 구현예에서 Ka는 최소 108l/mole이상 이다. 다른 바람직한 구현예에서 상기 화합물은 하나 이상의 포어에 인접해 있다. 보다 바람직한 구현예에서 상기 화합물은 채널이다. 보다 더 바람직한 구현예에서 상기 채널은 생물학적 활성을 갖는다. 가장 바람직한 구현예에서 상기 화합물은 포어를 포함한다.
일 구현예에서 상기 화합물은 효소 활성을 갖는다. 상기 효소 활성은 이에 제한되지는 않지만 예를 들어 프로티에이즈(protease), 카이네이즈(kinase), 포스파테이즈(phosphatase), 하이드롤레이즈(hydrolase), 옥시도리덕테이즈(oxidoreductase), 아이소머레이즈(isomerase), 트랜스퍼레이즈(transferase), 메틸레이즈(methylase), 아세틸레이즈(acetylase), 라이게이즈(ligase), 라이에이즈(lyase) 등의 효소 활성이 될 수 있다. 보다 바람직한 일 구현예에서 상기 효소 활성은 DNA 폴리머레이즈, RNA 폴리머레이즈, 엔도뉴클레이즈, 엑소뉴클레이즈, DNA 라이게이즈, DNA 분해효소(DNase), 우라실-DNA 글라이코시데이즈, 라이보좀, 카이네이즈(kinase), 포스파테이즈, 메틸레이즈, 아세틸레이즈 등의 효소 활성이 될 수 있다.
다른 구현예에서 상기 포어는 활성인자가 통과하도록 크기와 형태가 구성되어 있는데, 상기 활성인자는 ATP, NAD+, NADP+, 다이아실글리세롤, 포스파티딜세린, 아이코사노이드, 레티노인산(retinoic acid), 칼시페롤, 아스코르브산, 뉴로펩타이드, 엔케팔린, 엔돌핀, 4-아미노부티레이트(GABA), 5-하이드록시트립타민(5-HT), 카테콜아민, 아세틸 CoA, S-아데노실메싸이오닌 및 기타 다른 생물학적 활성인자를 포함하는 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서 상기 포어는 보조인자가 통과하도록 크기와 형태가 구성되어 있는데, 상기 보조인자는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, ATP, NAD+, NADP+ 및 기타 다른 생물학적 보조인자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서 상기 포어 또는 채널은 포어 분자 또는 채널 분자이며, 생물학적 분자 또는 합성 개량 분자 또는 변형된 생물학적 분자 또는 이들의 조합을 포함한다. 이러한 생물학적 분자들의 예로는 이에 제한되지는 않지만, 이온 채널, 뉴클레오사이드 채널, 펩타이드 채널, 당 운송자(sugar transporter), 시냅스 채널, GPCR 등과 같은 막 수용체, 핵공(nuclear pore), 합성 변종, 키메릭 변종 등이 있다. 바람직한 일 구현예에서 상기 생물학적 분자는 α-헤몰리신(hemolysin)이다.
대안적으로, 상기 화합물은 비-효소 생물학적 활성을 갖는다. 상기 비-효소 생물학적 활성을 갖는 화합물은 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, 단백질, 펩타이드, 항체, 항원, 핵산, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 몰폴리노, 당, 지질, 글라이코포스포이노시톨, 리포폴리사카라이드 등이 될 수 있다. 상기 화합물은 항원 활성을 가질 수 있다. 상기 화합물은 선택적 결합 특성을 가질 수 있는데, 이로써 특정하게 조절된 환경 조건 하에서 폴리머가 상기 화합물에 결합하며, 환경 조건이 달라지면 결합하지 않는다. 이러한 조건들로는 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, [H+]의 변화, 주위 온도의 변화, 스트린전시(stringency)의 변화, 소수성의 변화, 친수성의 변화 등이 될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 화합물을 제공하는데, 상기 화합물은 링커 분자를 추가로 포함하며, 상기 링커 분자는 싸이올기, 설파이드기, 포스페이트기, 설페이트기, 시아노기, 피페리딘기, Fmoc기 및 Boc기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서 상기 박막은 복수의 포어들을 포함한다. 일 구현예에서 상기 장치는 복수의 전극들을 포함한다.
폴리머
다른 구현예에서, 본 발명은 폴리머에 대한 효소의 결합을 제어하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: 2개의 분리되고 인접해 있는 매질의 풀(pool)과 상기 2개의 풀 사이의 경계면을 제공하는 단계로서, 상기 경계면은 한번에 하나의 폴리머만이 한쪽 풀에서 다른쪽 풀로 순차적으로 모노머별로 통과되도록 크기가 구성된 채널을 갖는 단계; 폴리머에 대한 결합 활성을 갖는 효소를 제공하는 단계; 상기 폴리머를 상기 2개의 풀 내로 도입하는 단계; 상기 효소를 상기 2개의 풀 중 하나의 풀 내로 도입하는 단계; 상기 2개의 풀 사이에 전위차를 인가하여, 이로써 제1 극성을 형성하는 단계; 최초로 전위차를 역으로 인가하여 제2 극성을 형성하는 단계; 두번째로 전위차를 역으로 인가하여 제1 극성을 형성함으로써 폴리머에 대한 효소 결합을 제어하는 단계. 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 전기 전도성을 갖는다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 수용액이다. 다른 바람직한 구현예에서 상기 방법은, 상기 2개의 풀 사이에 전류를 측정하는 단계; 제1 극성이 형성된 최초 시기에 수득된 전류값(I1)과 제1 극성이 형성된 두번째 시기에 수득된 전류값(I2)을 비교하는 단계; 및 상기 I1과 I2 사이의 차를 확인하여 차이값 dI를 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서 상기 방법은, 상기 2개의 풀 사이에 전류를 측정하는 단계; 제1 극성이 형성된 최초 시기에 수득된 전류값(I1)과 그 이후에 수득된 전류값(I2)을 비교하는 단계; 및 상기 I1과 I2 사이의 차를 확인하여 차이값 dI를 수득하는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서 상기 효소는 프로티에이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 하이드롤레이즈, 옥시도리덕테이즈, 아이소머레이즈, 트랜스퍼레이즈, 메틸레이즈, 아세틸레이즈, 라이게이즈 및 라이에이즈로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 대안적인 구현예에서 상기 방법은, 효소 활성을 촉발하는 반응제를 제공하는 단계; 상기 반응제를 폴리뉴클레오타이드 복합체를 포함하는 풀에 도입하는 단계; 및 상기 풀을 적절한 온도에서 정치시키는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 반응제는 활성인자와 보조인자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 상기 활성인자는 보조인자를 도입하기 전에 상기 풀에 도입된다. 보다 더욱 더 바람직한 구현예에서, 상기 활성인자는 ATP, NAD+, NADP+, 다이아실글리세롤, 포스파티딜세린, 아이코사노이드, 레티노인산, 칼시페롤, 아스코르브산, 뉴로펩타이드, 엔케팔린, 엔돌핀, 4-아미노부티레이트(GABA), 5-하이드록시트립타민(5-HT), 카테콜아민, 아세틸 CoA 및 S-아데노실메싸이오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 다른 구현예에서, 상기 보조인자는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, ATP, NAD+ 및 NADP+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직한 다른 구현예에서, 상기 폴리머는 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 인지질, 다당류 및 폴리케타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서 상기 효소는 폴리머가 도입된 동일한 풀 내로 도입된다. 대안적인 구현예에서 상기 효소는 반대편 풀 내로 도입된다.
폴리뉴클레오타이드
다른 구현예에서, 본 발명은 부분적으로 이중-가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체에 대한 효소의 결합을 제어하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: 2개의 분리되고 인접해 있는 매질의 풀과 상기 2개의 풀 사이의 경계면을 제공하는 단계로서, 상기 경계면은 한번에 하나의 폴리뉴클레오타이드만이 한쪽 풀에서 다른쪽 풀로 순차적으로 모노머별로 통과되도록 크기가 구성된 채널을 갖는 단계; 부분적으로 이중-가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체에 대한 결합 활성을 갖는 효소를 제공하는 단계; 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 복합체를 제공하는 단계로서, 상기 폴리뉴클레오타이드 복합체의 일부는 이중-가닥이며, 상기 제1 폴리뉴클레오타이드는 상기 제2 폴리뉴클레오타이드와 반응하지 않는 잔기(moiety)를 추가로 포함하는 단계; 상기 폴리뉴클레오타이드 복합체를 상기 2개의 풀 중 하나에 도입하는 단계; 상기 효소를 2개의 풀 중 하나에 도입하는 단계; 상기 2개의 풀 사이에 전위차를 인가함으로써 제1 극성을 형성하는 단계; 최초로 전위차를 역으로 인가함으로써 제2 극성을 형성하는 단계; 두번째로 전위차를 역으로 인가하여 제1 극성을 형성함으로써 부분적으로 이중-가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체에 대한 효소 결합을 제어하는 단계. 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 전기 전도성을 갖는다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 수용액이다. 바람직한 구현예에서, 상기 잔기는 펩타이드 핵산, 2'-O-메틸기, 형광 화합물, 뉴클레오타이드 유도체 및 뉴클레오타이드 아이소머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서 상기 방법은, 상기 2개의 풀 사이의 전류를 측정하는 단계; 최초로 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값과 그 이후에 수득된 전류값을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서 상기 효소는 DNA 폴리머레이즈, RNA 폴리머레이즈, 엔도뉴클레이즈, 엑소뉴클레이즈, DNA 라이게이즈, DNA 분해효소, 우라실-DNA 글라이코시데이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 메틸레이즈 및 아세틸레이즈로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 대안적인 구현예에서 상기 방법은, 효소 활성을 촉발하는 하나 이상의 반응제를 제공하는 단계; 상기 반응제를 상기 폴리뉴클레오타이드 복합체를 포함하는 풀에 도입하는 단계; 및 상기 풀을 적절한 온도에서 정치시키는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 반응제는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 보조인자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 상기 데옥시리보뉴클레오타이드는 상기 보조인자를 도입하기 전에 상기 풀에 도입된다. 보다 더욱 더 바람직한 구현예에서, 상기 보조인자는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, ATP, NAD+ 및 NADP+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서 상기 효소는 폴리뉴클레오타이드가 도입된 동일한 풀 내로 도입된다. 대안적인 구현예에서 상기 효소는 반대편 풀 내로 도입된다.
폴리펩타이드
다른 구현예에서, 본 발명은 폴리펩타이드에 대한 효소의 결합을 제어하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: 2개의 분리되고 인접해 있는 매질의 풀과 상기 2개의 풀 사이의 경계면을 제공하는 단계로서, 상기 경계면은 한번에 하나의 폴리펩타이드만이 한쪽 풀에서 다른 쪽 풀로 순차적으로 모노머별로 통과되도록 크기가 구성된 채널을 갖는 제공 단계; 폴리펩타이드에 대한 결합 활성을 갖는 효소를 제공하는 단계; 개질가능한 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩타이드를 제공하는 단계; 상기 폴리펩타이드를 상기 2개의 풀 중 하나에 도입하는 단계; 상기 효소를 2개의 풀 중 하나에 도입하는 단계; 상기 2개의 풀 사이에 전위차를 인가하여, 이로써 제1 극성을 형성하는 단계; 최초로 전위차를 역으로 인가하여 제2 극성을 형성하는 단계; 두번째로 전위차를 역으로 인가하여 제1 극성을 형성함으로써 이로써 폴리펩타이드에 대한 효소 결합을 제어하는 단계. 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 전기 전도성을 갖는다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 수용액이다. 바람직한 구현예에서, 상기 잔기는 펩타이드 핵산, 2'-O-메틸기, 형광 화합물, 뉴클레오타이드 유도체 및 뉴클레오타이드 아이소머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서 상기 방법은, 상기 2개의 풀 사이에 전류를 측정하는 단계; 제1 극성이 형성된 최초 시기에 수득된 전류값과 두번째로 제1 극성이 형성된 시기에 수득된 전류값을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서 상기 방법은, 상기 2개의 풀 사이에 전류를 측정하는 단계; 제1 극성이 형성된 최초 시기에 수득된 전류값과 그 이후에 수득된 전류값을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서 상기 효소는 DNA 폴리머레이즈, RNA 폴리머레이즈, 엔도뉴클레이즈, 엑소뉴클레이즈, DNA 라이게이즈, DNA 분해효소, 우라실-DNA 글라이코시데이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 메틸레이즈 및 아세틸레이즈로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 대안적인 구현예에서 상기 방법은, 효소 활성을 촉발하는 하나 이상의 반응제를 제공하는 단계; 상기 반응제를 폴리뉴클레오타이드 복합체를 포함하는 풀에 도입하는 단계; 및 상기 풀을 적절한 온도에서 정치시키는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 반응제는 활성인자와 보조인자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 구현예에서 상기 활성인자는 ATP, NAD+, NADP+, 다이아실글리세롤, 포스파티딜세린, 아세틸 CoA 및 S-아데노실메싸이오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 상기 활성인자는 보조인자를 도입하기 전에 상기 풀에 도입된다. 보다 더욱 더 바람직한 구현예에서, 상기 보조인자는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, ATP, NAD+ 및 NADP+로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 구현예에서 상기 효소는 폴리펩타이드가 도입된 동일한 풀 내로 도입된다. 대안적인 구현예에서 상기 효소는 반대편 풀 내로 도입된다.
본원에 개시된 본 발명은 혼합물 내의 개별적인 폴리머가 효소와 같은 다른 화합물에 의해 작용받는 속도를 제어할 수 있는 장치 및 방법을 제공한다. 상기 장치 및 방법은 또한 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 염기 서열을 결정하는데에도 사용된다. 본 발명은 분자 생물학, 구조 생물학, 세포 생물학, 분자 스위치, 분자 회로와 분자 계산 장치 분야 및 이들의 제조에 특히 유용하다.
대안적인 일 구현예에서, 본 발명은 부분적으로 이중 가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체에 대한 효소 결합을 제어하는 방법과 이로 인한 폴리뉴클레오타이드의 서열을 식별하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: 매질을 포함하는 2개의 분리되고 인접해 있는 풀과 상기 2개의 풀 사이의 경계면을 제공하는 단계로서, 상기 경계면은 한번에 하나의 폴리뉴클레오타이드만이 채널의 시스-쪽에서 채널의 트랜스-쪽으로 순차적으로 모노머별로 통과되도록 크기가 구성된 채널을 갖는 단계; 부분적으로 이중-가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체에 대한 결합 활성을 갖는 효소를 제공하는 단계; 하나 이상의 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드를 제공하는 단계로서, 상기 보호는 보호기를 사용하는 단계를 포함하는 단계; 어닐링(annealing)제를 제공하는 단계; 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 복합체를 제공하는 단계로서, 상기 폴리뉴클레오타이드 복합체의 일부는 이중 가닥이며, 일부는 단일 가닥인 단계; 상기 폴리뉴클레오타이드 복합체를 상기 2개의 풀 중 하나에 도입하는 단계; 상기 2개의 풀 사이에 전위차를 인가함으로써 제1 극성을 형성하고, 상기 제1 극성은 상기 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분을 채널을 통하여 트랜스 쪽으로 수송하는 단계; 상기와 동일한 풀 내에 상기 효소 및 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 다른쪽 풀 내에 상기 어닐링제를 도입하는 단계; 상기 어닐링제가 상기 단일 가닥 폴리뉴클레오타이드에 결합되게 하는 단계; 상기 효소와 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드가 상기 폴리뉴클레오타이드에 결합되도록 하는 단계; 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드가 상기 폴리뉴클레오타이드 내로 혼입되도록 하는 단계; 최초로 전위차를 역으로 인가하여 제2 극성을 형성하는 단계; 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드로 하여금 보호기가 탈리되도록 하여 비보호된 상태로 되게 하는 단계; 상기 보호기의 양을 측정하는 단계; 두번째로 전위차를 역으로 인가하여 제1 극성을 형성하게 하는 단계; 상기 단계들 중 어느 하나를 반복함으로써 이중 가닥의 폴리뉴클레오타이드 복합체에 대한 효소의 결합을 제어하여 폴리뉴클레오타이드의 서열을 결정하는 단계. 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 전기 전도성을 갖는다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 수용성 매질이다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 잔기는 펩타이드 핵산, 2'-O-메틸기, 형광 화합물, 안토시아닌, 녹색형광 단백질(GFP), β-글루쿠로니데이즈, 루시퍼레이즈, Cy3, Cy5, 뉴클레오타이드 유도체 및 뉴클레오타이드 아이소머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 효소는 DNA 폴리머레이즈, RNA 폴리머레이즈, 엔도뉴클레이즈, 엑소뉴클레이즈, DNA 라이게이즈, DNA 분해효소, 우라실-DNA 글라이코시데이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 메틸레이즈 및 아세틸레이즈로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적인 일 구현예에서, 상기 방법은 상기 2개의 풀 사이의 전류를 측정하는 단계; 최초로 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값과 두번째로 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 대안적인 다른 구현예에서, 상기 방법은 상기 2개의 풀 사이의 전류를 측정하는 단계; 최초로 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값과 그 이후에 수득된 전류값을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 효소 활성을 촉발하는 하나 이상의 반응제를 제공하는 단계; 상기 반응제를 폴리뉴클레오타이드 복합체를 포함하는 풀에 도입하는 단계; 및 상기 풀을 효소 활성을 유지하기에 적절한 온도에서 정치시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 반응제는 보조인자이다. 보다 바람직한 구현예에서 상기 보조인자는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, ATP, NAD+ 및 NADP+ 및 S-아데노실메싸이오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 다른 구현예에서, 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드는 dATP, dGTP, dTTP, dCTP 및 dUTP로 이루어진 군으로부터 선택된 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다. 보다 바람직한 다른 구현예에서, 상기 반응제는 ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP 및 ddUTP로 이루어진 군으로부터 선택된다. 또 다른 바람직한 구현예에서, 하나 이상의 수용성 매질은 어닐링제를 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 어닐링제는 상보적인 올리고뉴클레오타이드 및 스트렙타비딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한, 포어에 대한 분자의 위치를 탐지하는 방법을 제공하는데, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: 2개의 분리되고 인접해 있는 매질의 풀 및 상기 2개의 풀 사이의 구조물을 제공하는 단계로서, 상기 구조물은 이온 투과성 포어를 갖는 단계; 폴리이온을 제공하는 단계; 상기 폴리이온에 대한 결합 활성을 갖는 분자를 제공하는 단계; 상기 폴리이온을 상기 2개의 풀 중 하나에 도입하는 단계; 상기 분자를 동일한 풀 내로 도입하는 단계; 상기 2개의 풀 사이에 전위차를 인가하여 제1 극성을 형성하는 단계; 상기 2개의 풀 사이의 제1 전류를 측정함으로써 상기 포어에 대한 분자의 위치를 탐지하는 단계. 바람직한 구현예에서, 상기 분자는 거대분자이며, 상기 거대분자는 프로티에이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 하이드롤레이즈, 옥시도리덕테이즈, 아이소머레이즈, 트랜스퍼레이즈, 메틸레이즈, 아세틸레이즈, 라이게이즈, 라이에이즈, 막 수용체, 수용체 타이로신 카이네이즈, T-세포 수용체, MHC 수용체 및 핵 수용체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서 상기 매질은 전기 전도성을 갖는다. 보다 바람직한 구현예에서 상기 매질은 수용액이다. 다른 바람직한 구현예에서 상기 구조물은 화합물을 추가로 포함하는데, 상기 화합물은 싸이올기, 설파이드기, 포스페이트기, 설페이트기, 시아노기, 피페리딘기, Fmoc기, Boc기, 질화규소, 이작용기성 알킬 설파이드 및 금으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 폴리이온은 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 인지질, 다당류 및 폴리케타이드로 이루어진 군으로부터 선택된다. 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 최초에 전위차를 역으로 인가하여 제2 극성을 형성하는 단계; 두번째로 전위차를 역으로 인가하여 제1 극성을 형성하고, 상기 2개의 풀 사이의 제2 전류를 측정함으로써 포어에 대한 상기 분자의 위치를 추가로 탐지하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 상기 2개의 풀 사이의 전류를 측정하는 단계; 최초로 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값과 그 이후에 수득된 전류값을 비교하는 단계를 포함한다. 또 다른 대안적인 구현예에서, 상기 방법은 효소 활성을 촉발하는 반응제를 제공하는 단계; 상기 반응제를 폴리뉴클레오타이드 복합체를 포함하는 풀 내에 도입하는 단계; 및 상기 풀을 적절한 온도에서 정치시키는 단계를 추가로 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 반응제는 활성인자와 보조인자로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 상기 활성인자는 보조인자를 도입하기 전에 상기 풀에 도입된다. 보다 더욱 더 바람직한 구현예에서, 상기 활성인자는 ATP, NAD+, NADP+, 다이아실글리세롤, 포스파티딜세린, 아이코사노이드, 글라이코실 포스파티딜 이노시톨, 글라이코포스포이노시톨, 리포폴리사카라이드, 레티노인산, 칼시페롤, 아스코르브산, 뉴로펩타이드, 엔케팔린, 엔돌핀, 4-아미노부티레이트(GABA), 5-하이드록시트립타민(5-HT), 카테콜아민, 아세틸 CoA 및 S-아데노실메싸이오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 더 바람직한 다른 구현예에서, 상기 보조인자는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, ATP, NAD+ 및 NADP+로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서 상기 포어 또는 채널은 생물학적 분자 또는 합성 개량되거나 변형된 생물학적 분자를 포함한다. 이러한 생물학적 분자들의 예로는 이에 제한되지는 않지만, α-헤몰리신과 같은 이온 채널, 뉴클레오사이드 채널, 펩타이드 채널, 당 운송자, 시냅스 채널, GPCR, 수용체 타이로신 카이네이즈 등과 같은 막 수용체, T-세포 수용체, MHC 수용체, 스테로이드 호르몬 수용체와 같은 핵 수용체, 핵공 등이다.
대안적인 구현예에서, 상기 화합물은 비-효소 생물학적 활성을 포함한다. 상기 비-효소 생물학적 활성을 갖는 화합물은 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, 단백질, 펩타이드, 항체, 항원, 핵산, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 몰폴리노, 당, 지질, 글라이코실 포스파티딜 이노시톨, 글라이코포스포이노시톨, 리포폴리사카라이드 등이 될 수 있다. 상기 화합물은 항원 활성을 가질 수 있다. 상기 화합물은 라이보자임(ribozyme) 활성을 가질 수 있다. 상기 화합물은 선택적 결합 특성을 가질 수 있는데, 이로써 특정하게 조절된 환경 조건 하에서 폴리머가 상기 화합물에 결합하며, 환경 조건이 달라지면 결합하지 않는다. 이러한 조건들로는 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, [H+]의 변화, 주위 온도의 변화, 스트린전시(stringency)의 변화, 소수성의 변화, 친수성의 변화 등이 될 수 있다.
일 구현예에서 상기 거대분자는 효소 활성을 갖는다. 상기 효소 활성은 이에 제한되지는 않지만 예를 들어 프로티에이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 하이드롤레이즈, 옥시도리덕테이즈, 아이소머레이즈, 트랜스퍼레이즈, 메틸레이즈, 아세틸레이즈, 라이게이즈, 라이에이즈 등의 효소 활성이 될 수 있다. 보다 바람직한 일 구현예에서 상기 효소 활성은 DNA 폴리머레이즈, RNA 폴리머레이즈, 엔도뉴클레이즈, 엑소뉴클레이즈, DNA 라이게이즈, DNA 분해효소, 우라실-DNA 글라이코시데이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 메틸레이즈, 아세틸레이즈, 글루코스 옥시데이즈 등의 효소 활성이 될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 상기 거대분자는 하나 이상의 효소 활성을 가질 수 있는데, 예를 들어 사이토크롬 P450 효소의 효소 활성을 들 수 있다. 다른 대안적인 구현예에서, 상기 거대분자는 하나 이상의 효소 활성 종류을 가질 수 있는데, 예를 들어 포유류의 지방산 합성효소를 들 수 있다. 다른 구현예에서 상기 거대분자는 라이보자임 활성을 포함한다.
대안적인 구현예에서, 상기 거대분자는 비-효소 생물학적 활성을 포함한다. 상기 비-효소 생물학적 활성을 갖는 거대분자는 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, 단백질, 펩타이드, 항체, 항원, 핵산, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 몰폴리노, 당, 인지질, 지질, 글라이코실 포스파티딜 이노시톨, 글라이코포스포이노시톨, 리포폴리사카라이드 등이 될 수 있다. 상기 거대분자는 이에 제한되지는 않지만, 라이보좀 또는 뉴클레오좀과 같은 폴리뉴클레오타이드-결합 활성 및/또는 폴리펩타이드 생합성 활성을 가질 수 있다. 상기 거대분자는 항원 활성을 가질 수 있다. 상기 거대분자는 선택적 결합 특성을 가질 수 있는데, 이로써 특정하게 조절된 환경 조건 하에서 폴리머가 상기 거대분자에 결합하며, 환경 조건이 달라지면 결합하지 않는다. 이러한 조건들로는 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, [H+]의 변화, 주위 온도의 변화, 스트린전시의 변화, 소수성의 변화, 친수성의 변화 등이 될 수 있다.
다른 구현예에서, 본 발명은 화합물을 제공하는데, 상기 화합물은 링커 분자를 추가로 포함하며, 상기 링커 분자는 싸이올기, 설파이드기, 포스페이트기, 설페이트기, 시아노기, 피페리딘기, Fmoc기 및 Boc기로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 상기 화합물은 이작용기성 알킬 설파이드 및 금으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서 상기 박막은 복수의 포어들을 포함한다. 일 구현예에서 상기 장치는 복수의 전극들을 포함한다.
단일-채널 박막 장치, 시스템 및 이들을 사용하는 방법이 제공된다. 상기 장치 또는 시스템은 전기적 전달 수단에 의하여 연결된 시스 및 트랜스 챔버를 포함한다. 전기적 전달 수단의 시스 말단은 단일 나노포어 또는 채널을 포함하는 박막으로 밀봉된 수평의 원추형 구경으로 되어 있다. 상기 장치는 시스 및 트랜스 챔버 사이에 전기장을 인가하는 수단을 추가로 포함한다. 상기 장치는 나노포어 또는 채널을 통한 이온 전류가 관찰되는 응용분야에 유용하며, 이러한 응용분야는 자연발생의 이온 채널의 특성화, 중합 화합물의 특성화 등을 포함한다.
본 발명은 또한 단일 거대분자를 사용자에 의해 지정된 나노미터 크기의 정해진 위치로 운송하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 단일 거대분자를 사용자에 의해 지정된 나노미터 크기의 정해진 위치에 결합시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 나노미터 크기의 포어를 통한 이온 전류를 사용하여 단일 거대분자(또는 단일 분자들의 조합)의 기능을 관찰하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 최소 2개 이상의 화합물의 결합을 검출하는 장치 또는 시스템을 제공하는데, 상기 장치는 혼합신호(mixed-signal) 반도체 웨이퍼, 하나 이상의 전기화학층을 포함하고, 상기 전기화학층은 반도체 물질을 포함하며, 상기 반도체 물질은 표면 개질제를 추가로 포함하고, 상기 전기화학층은 복수의 오리피스(orifice)를 규정하며, 상기 오리피스는 챔버(chamber) 및 넥(neck)을 포함하고, 상기 오리피스의 챔버는 혼합신호 반도체 웨이퍼의 금속화 조성물과 함께 동일한 장소에 배치되어 있으며, 상기 오리피스의 일부는 금속과 접속되어 있고, 상기 금속은 상기 금속화 조성물과 전자적 전달 상태에 있으며, 상기 오리피스는 박막을 추가로 포함하고, 상기 박막은 상기 오리피스의 넥에서 용매-불투과성 밀봉을 형성하며, 상기 박막은 포어를 추가로 포함하고, 상기 포어는 포어 구경을 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 화합물은 생물학적 화합물이다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 생물학적 화합물은 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 인지질, 다당류, 폴리케타이드, 프로티에이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 하이드롤레이즈, 옥시도리덕테이즈, 아이소머레이즈, 트랜스퍼레이즈, 메틸레이즈, 아세틸레이즈, 라이게이즈 및 라이에이즈(lyase)로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 반도체 물질은 이산화규소(SiO2), 산질화규소(SiON), 질화규소(SiN), 금속 산화물 및 금속 규산염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 반도체 물질은 이산화규소이다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 표면 개질제는 탄화수소이다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 금속화 조성물은 니켈, 금, 구리 및 알루미늄으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 금속은 은이다. 바람직한 구현예에서, 상기 박막은 분자 이중층이다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 박막은 인지질 이중층이다. 대안적인 일 구현예에서, 상기 오리피스는 1 내지 2㎛의 크기를 갖는다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 오리피스는 1.25 내지 1.5㎛의 크기를 갖는다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 포어는 생물학적 분자이다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 생물학적 분자는 이온 채널, 뉴클레오사이드 채널, 펩타이드 채널, 당 운송자, 시냅스 채널, 막 수용체 및 핵공으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 생물학적 분자는 α-헤몰리신이다. 바람직한 구현예에서, 상기 포어 구경은 약 1 내지 10㎚의 크기를 갖는다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 포어 구경은 약 1 내지 4㎚의 크기를 갖는다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 포어 구경은 약 1 내지 2㎚의 크기를 갖는다. 대안적인 가장 바람직한 구현예에서, 상기 포어 구경은 약 2 내지 4㎚의 크기를 갖는다.
본 발명은 또한, 폴리머에 대한 분자의 결합을 검출하고 제어하는데 사용될 수 있는 유한 상태 기계(finite state machine)를 제공한다. 일 구현예에서, 상기 분자는 단백질이다. 바람직한 구현예에서, 상기 단백질은 효소이다. 일 구현예에서, 상기 유한 상태 기계는 나노포어를 통한 폴리머 화합물의 이동을 저해하는 구조적 요소를 갖는 폴리머 화합물을 검출할 수 있다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 유한 상태 기계는 나노포어에서 DNA 헤어핀 구조를 포함하는 폴리머 화합물을 검출하고, 검출은 되었지만, 상기 헤어핀이나 DNA 듀플렉스 구조의 염기쌍이 풀리기 전에 나노포어로부터 상기 DNA 헤어핀이나 DNA 듀플렉스 구조를 갖는 화합물을 방출시킬 수 있다. 대안적인 구현예에서, 상기 폴리머 화합물은 핵산 유도체를 포함한다. 또 다른 대안적인 구현예에서, 상기 폴리머 화합물은 펩타이드 핵산을 포함한다.
일 구현예에서, 상기 유한 상태 기계는 약 5㎐ 내지 2000㎐ 사이의 속도로 폴리머에 대한 분자의 결합을 제어할 수 있다. 상기 유한 상태 기계는 예를 들어, 약 5㎐, 약 10㎐, 약 15㎐, 약 20㎐, 약 25㎐, 약 30㎐, 약 35㎐, 약 40㎐, 약 45㎐, 약 50㎐, 약 55㎐, 약 60㎐, 약 65㎐, 약 70㎐, 약 75㎐, 약 80㎐, 약 85㎐, 약 90㎐, 약 95㎐, 약 100㎐, 약 110㎐, 약 120㎐, 약 125㎐, 약 130㎐, 약 140㎐, 약 150㎐, 약 160㎐, 약 170㎐, 약 175㎐, 약 180㎐, 약 190㎐, 약 200㎐, 약 250㎐, 약 300㎐, 약 350㎐, 약 400㎐, 약 450㎐, 약 500㎐, 약 550㎐, 약 600㎐, 약 700㎐, 약 750㎐, 약 800㎐, 약 850㎐, 약 900㎐, 약 950㎐, 약 1000㎐, 약 1125㎐, 약 1150㎐, 약 1175㎐, 약 1200㎐, 약 1250㎐, 약 1300㎐, 약 1350㎐, 약 1400㎐, 약 1450㎐, 약 1500㎐, 약 1550㎐, 약 1600㎐, 약 1700㎐, 약 1750㎐, 약 1800㎐, 약 1850㎐, 약 1900㎐, 약 1950㎐ 및 약 2000㎐로 폴리머에 대한 분자의 결합을 제어할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 유한 상태 기계는 약 25㎐ 내지 약 250㎐ 사이의 속도로 폴리머에 대한 분자의 결합을 제어할 수 있다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 유한 상태 기계는 약 45㎐ 내지 약 120㎐ 사이의 속도로 폴리머에 대한 분자의 결합을 제어할 수 있다. 가장 바람직한 구현예에서, 상기 유한 상태 기계는 약 50㎐의 속도로 폴리머에 대한 분자의 결합을 제어할 수 있다.
본 발명은 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열을 결정하는데 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 폴리뉴클레오타이드에 대한 효소의 상대적인 결합 친화도를 결정하는데 사용될 수 있는데, 이로써 본 발명은 폴리뉴클레오타이드에 결합하는 새로운 효소 화합물을 식별하는데 사용될 수 있다.
일 구현예에서, 상기 장치 또는 시스템은 전기적 전달 수단에 의하여 연결된 시스 및 트랜스 챔버를 포함한다. 상기 시스 및 트랜스 챔버는 하나 이상의 포어 또는 채널을 포함하는 박막에 의해 분리된다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 박막은 소수성 영역과 친수성 영역을 갖는 화합물을 포함한다. 보다 바람직한 구현예에서, 상기 박막은 인지질을 포함한다. 상기 장치는 시스 및 트랜스 챔버 사이에 전기장을 인가하는 수단을 추가로 포함한다. 상기 장치는 시스 및 트랜스 챔버 사이의 전류를 측정하는 수단을 추가로 포함한다. 상기 포어 또는 채널은 폴리머가 통과하기에 적합한 크기를 갖는 형태로 구성된다. 바람직한 일 구현예에서, 상기 포어 또는 채널은 폴리머의 상당한 부분을 수용한다. 보다 더 바람직한 구현예에서, 상기 포어 또는 채널은 생물학적 활성을 갖는다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 폴리머는 폴리뉴클레오타이드이다.
일 구현예에서, 상기 박막은 폴리머에 대한 결합 친화도를 갖는 화합물을 추가로 포함한다. 바람직한 일 구현예에서 상기 결합 친화도(Ka)는 최소 106l/mole이상 이다. 보다 바람직한 일 구현예에서 Ka는 최소 108l/mole이상 이다. 다른 바람직한 구현예에서 상기 화합물은 하나 이상의 포어에 인접해 있다. 보다 바람직한 구현예에서 상기 화합물은 폴리펩타이드를 포함한다.
일 구현예에서 상기 화합물은 효소 활성을 갖는다. 상기 효소 활성은 이에 제한되지는 않지만 예를 들어 프로티에이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 하이드롤레이즈, 옥시도리덕테이즈, 아이소머레이즈, 트랜스퍼레이즈, 메틸레이즈, 아세틸레이즈, 라이게이즈, 라이에이즈 등의 효소 활성이 될 수 있다. 보다 바람직한 일 구현예에서 상기 효소 활성은 DNA 폴리머레이즈, RNA 폴리머레이즈, 엔도뉴클레이즈, 엑소뉴클레이즈, DNA 라이게이즈, DNA 분해효소, 우라실-DNA 글라이코시데이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 메틸레이즈, 아세틸레이즈 등의 효소 활성이 될 수 있다.
다른 구현예에서 상기 포어 또는 채널은 활성인자가 통과하도록 크기와 형태가 구성되어 있는데, 상기 활성인자는 ATP, NAD+, NADP+ 및 기타 다른 생물학적 활성인자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 구현예에서 상기 포어 또는 채널은 보조인자가 통과하도록 크기와 형태가 구성되어 있는데, 상기 보조인자는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, ATP, NAD+, NADP+ 및 기타 다른 생물학적 보조인자로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 구현예에서 상기 포어 또는 채널은 생물학적 분자 또는 합성 개량되거나 변형된 생물학적 분자를 포함한다. 이러한 생물학적 분자들의 예로는 이에 제한되지는 않지만, 이온 채널, 뉴클레오사이드 채널, 펩타이드 채널, 당 운송자, 시냅스 채널, GPCR 등과 같은 막 수용체, 핵공 등이 있다. 바람직한 일 구현예에서 상기 생물학적 분자는 α-헤몰리신이다.
대안적으로 상기 화합물은 비-효소 생물학적 활성을 갖는다. 상기 비-효소 생물학적 활성을 갖는 화합물은 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, 단백질, 펩타이드, 항체, 항원, 핵산, 펩타이드 핵산(PNA), 잠금 핵산(LNA), 몰폴리노, 당, 지질, 글라이코포스포이노시톨, 리포폴리사카라이드 등이 될 수 있다. 상기 화합물은 항원 활성을 가질 수 있다. 상기 화합물은 선택적 결합 특성을 가질 수 있는데, 이로써 특정하게 조절된 환경 조건 하에서 폴리머가 상기 화합물에 결합하며, 환경 조건이 달라지면 결합하지 않는다. 이러한 조건들로는 예를 들어 이에 제한되지는 않지만, [H+]의 변화, 주위 온도의 변화, 스트린전시의 변화, 소수성의 변화, 친수성의 변화 등이 될 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 전압 피드백 제어를 사용하여 폴리뉴클레오타이드에 대한 효소의 결합을 제어하는 방법을 제공하는데, 상기 방법으로 인해 폴리뉴클레오타이드에 의한 효소의 포획 및 해리(dissociation)가 반복적으로 일어나게 되며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: 매질을 포함하는 2개의 분리되고 인접해 있는 구획과 상기 2개의 구획 사이의 경계면을 제공하는 단계로서, 상기 경계면은 한번에 하나의 폴리뉴클레오타이드 가닥만이 채널의 시스-쪽에서 채널의 트랜스-쪽으로 순차적으로 모노머별로 통과되도록 크기가 구성된 채널을 갖는 단계; 폴리뉴클레오타이드에 대한 결합 활성을 갖는 효소를 제공하는 단계; 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드를 제공하는 단계; 폴리뉴클레오타이드-결합 화합물을 제공하는 단계; 폴리뉴클레오타이드 복합체를 제공하는 단계로서, 상기 폴리뉴클레오타이드 복합체의 일부는 이중-가닥이며, 일부는 단일-가닥인 단계; 상기 폴리뉴클레오타이드 복합체를 상기 2개의 챔버 중 하나에 도입하는 단계; 상기 2개의 챔버 사이에 전위차를 인가함으로써 제1 극성을 형성하고, 상기 제1 극성은 상기 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분을 채널을 통하여 트랜스-쪽으로 수송하는 단계; 상기와 동일한 챔버 내에 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 상기와 동일한 챔버 내에 상기 효소를 도입하는 단계; 상기 효소가 상기 폴리뉴클레오타이드에 결합되도록 하는 단계; 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드가 상기 폴리뉴클레오타이드에 결합되도록 하는 단계; 상기 채널을 통과하는 전류를 측정함으로써 상기 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 효소 및 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드의 결합을 검출하는 단계; 상기 폴리뉴클레오타이드-결합 화합물을 상기 2개의 챔버들 중 다른 하나에 도입하는 단계; 최초로 전위차를 감소시켜 제2 극성을 형성하는 단계; 상기 폴리뉴클레오타이드-결합 화합물이 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드에 결합되도록 하는 단계; 상기 전위차를 역으로 인가하여 제3 극성을 형성하는 단계; 상기 전위차를 두번째로 역으로 인가하는 단계; 상기 채널을 통과하는 전류를 측정함으로써 폴리뉴클레오타이드 단독 또는 상기 효소 및 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드에 결합된 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 단계; 상기 단계들 중 어느 하나를 반복함으로써 상기 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 효소의 결합을 제어하는 단계. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 상기 2개의 챔버들 사이의 전류를 측정하는 단계; 최초로 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값과 두번째로 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 상기 2개의 챔버 사이의 전류를 측정하는 단계; 최초로 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값과 그 후에 수득된 전류값을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드-결합 화합물은 상기 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산, 잠금 핵산, 뉴클레오타이드 유도체 및 뉴클레오타이드 아이소머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 효소는 DNA 폴리머레이즈, RNA 폴리머레이즈, 엔도뉴클레이즈, 엑소뉴클레이즈, DNA 라이게이즈, DNA 분해효소, 우라실-DNA 글라이코시데이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 메틸레이즈 및 아세틸레이즈로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 전기 전도성을 갖는다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 수용성 매질이다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드는 dATP, dGTP, TTP, dCTP, UTP 및 dUTP로 이루어진 군으로부터 선택된 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 방법은 효소 활성을 촉발하는 하나 이상의 반응제를 제공하는 단계; 상기 반응제를 상기 폴리뉴클레오타이드 복합체를 포함하는 챔버에 도입하는 단계; 및 상기 챔버를 효소 활성을 유지하기에 충분한 온도에서 정치시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 반응제는 보조인자이다. 보다 바람직한 구현예에서 상기 보조인자는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, ATP, NAD+ 및 NADP+ 및 S-아데노실메싸이오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 다른 구현예에서, 상기 반응제는 ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP 및 ddUTP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 구현예에서, 본 발명은 전압 피드백 제어를 사용하여 폴리뉴클레오타이드에 대한 효소의 결합을 제어하는 방법을 제공하는데, 상기 방법으로 인해 폴리뉴클레오타이드의 서열을 식별하게 되며, 상기 방법은 하기 단계들을 포함한다: 매질을 포함하는 2개의 분리되고 인접해 있는 챔버와 상기 2개의 챔버들 사이의 경계면을 제공하는 단계로서, 상기 경계면은 한번에 하나의 폴리뉴클레오타이드 가닥만이 채널의 시스-쪽에서 채널의 트랜스-쪽으로 순차적으로 모노머별로 통과되도록 크기가 구성된 채널을 갖는 단계; 폴리뉴클레오타이드에 대한 결합 활성을 갖는 효소를 제공하는 단계; 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드를 제공하는 단계; 폴리뉴클레오타이드-결합 화합물을 제공하는 단계; 폴리뉴클레오타이드 복합체를 제공하는 단계로서, 상기 폴리뉴클레오타이드 복합체의 일부는 이중-가닥이며, 일부는 단일-가닥인 단계; 상기 폴리뉴클레오타이드 복합체를 상기 2개의 챔버들 중 하나에 도입하는 단계; 상기 2개의 챔버 사이에 전위차를 인가함으로써 제1 극성을 형성하고, 상기 제1 극성은 상기 폴리뉴클레오타이드의 단일 가닥 부분을 채널을 통하여 트랜스-쪽으로 수송하는 단계; 상기와 동일한 챔버 내에 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드를 도입하는 단계; 상기와 동일한 챔버 내에 상기 효소를 도입하는 단계; 상기 효소가 상기 폴리뉴클레오타이드에 결합되도록 하는 단계; 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드가 상기 폴리뉴클레오타이드에 결합되도록 하는 단계; 상기 채널을 통과하는 전류를 측정함으로써 상기 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 효소 및 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드의 결합을 검출하는 단계; 상기 폴리뉴클레오타이드-결합 화합물을 상기 2개의 챔버들 중 다른 하나에 도입하는 단계; 최초로 전위차를 감소시켜 제2 극성을 형성하는 단계; 상기 폴리뉴클레오타이드-결합 화합물이 상기 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드에 결합되도록 하는 단계; 상기 전위차를 역으로 인가하여 제3 극성을 형성하는 단계; 두번째로 상기 전위차를 역으로 인가하는 단계; 상기 채널을 통과하는 전류를 측정함으로써 폴리뉴클레오타이드 단독 또는 상기 효소 및 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드에 결합된 폴리뉴클레오타이드를 검출하는 단계; 상기 단계들 중 어느 하나를 반복함으로써 상기 폴리뉴클레오타이드에 대한 상기 효소의 결합을 제어하는 단계. 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 상기 2개의 챔버 사이의 전류를 측정하는 단계; 최초로 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값과 두번째로 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 방법은 상기 2개의 챔버 사이의 전류를 측정하는 단계; 최초로 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값과 그 후에 수득된 전류값을 비교하는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드-결합 화합물은 상기 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 올리고뉴클레오타이드, 펩타이드 핵산, 잠금 핵산, 뉴클레오타이드 유도체 및 뉴클레오타이드 아이소머로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 효소는 DNA 폴리머레이즈, RNA 폴리머레이즈, 엔도뉴클레이즈, 엑소뉴클레이즈, DNA 라이게이즈, DNA 분해효소, 우라실-DNA 글라이코시데이즈, 카이네이즈, 포스파테이즈, 메틸레이즈 및 아세틸레이즈로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 전기 전도성을 갖는다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 매질은 수용성 매질이다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 보호된 데옥시리보뉴클레오타이드는 dATP, dGTP, TTP, dCTP, UTP 및 dUTP로 이루어진 군으로부터 선택된 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함한다.
상기 방법은 효소 활성을 촉발하는 하나 이상의 반응제를 제공하는 단계; 상기 반응제를 폴리뉴클레오타이드 복합체를 포함하는 챔버에 도입하는 단계; 및 상기 챔버를 효소 활성을 유지하기에 적절한 온도에서 정치시키는 단계를 추가로 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 반응제는 보조인자이다. 보다 바람직한 구현예에서 상기 보조인자는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, ATP, NAD+ 및 NADP+ 및 S-아데노실메싸이오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 바람직한 다른 구현예에서, 상기 반응제는 ddATP, ddGTP, ddTTP, ddCTP 및 ddUTP로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 구현예에서 상기 박막은 복수의 포어들을 포함한다. 일 구현예에서 상기 장치는 복수의 전극들을 포함한다.
본 발명의 상세한 설명
본원에 개시된 구현예들은 도시 및 예시를 위한 것이지 본 발명을 제한하려는 의도가 아니다. 본 발명의 청구항의 범주로부터 벗어나지 않는다면 다른 구현예들도 사용될 수 있으며, 구조적인 변경도 이루어질 수 있다.
본원 및 첨부된 청구항에 사용된 바와 같은 단수 형태의 관사 및 정관사("a,", "an", 및 "the")는 문맥상 명백히 다른 경우를 지시하지 않는한 복수의 경우들을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "나노포어(a nanopore)"로 언급하면 복수개의 이러한 나노포어들을 포함하며, "시그널(a signal)"로 언급하면 하나 이상의 시그널 및 이의 등가물 등을 언급하는 것이다.
"폴리뉴클레오타이드"는 DNA 또는 RNA를 의미하는데, 자연발생, 합성 또는 개질된 뉴클레오타이드를 포함한다. 뉴클레오타이드는 이에 제한되지는 않지만, ATP, dATP, CTP, dCTP, GTP, dGTP, UTP, TTP, dUTP, 5-메틸-CTP, 5-메틸-dCTP, ITP, dITP, 2-아미노-아데노신-TP, 2-아미노-데옥시아데노신-TP, 2-싸이오티미딘 트라이포스페이트, 피롤로-피리미딘 트라이포스페이트, 2-싸이오시티딘 및 상술한 모든 것에 대한 알파싸이오트라이포스페이트, 및 상술한 모든 염기에 대한 2'-O-메틸-리보뉴클레오타이드 트라이포스페이트를 포함한다. 개질된 염기는 이에 제한되지는 않지만, 5-Br-UTP, 5-Br-dUTP, 5-F-UTP, 5-F-dUTP, 5-프로피닐 dCTP 및 5-프로피닐-dUTP를 포함한다.
"수송 특성(transport property)"은 폴리머가 나노포어에 대하여 움직이는 동안 측정가능한 특성을 의미한다. 상기 수송 특성은 예를 들어, 용매의 기능, 폴리머, 폴리머에 대한 표지, 다른 용질(예: 이온), 또는 나노포어 및 용매 또는 폴리머 사이의 상호작용일 수 있다.
"헤어핀 구조"는 약 6 내지 약 100개 길이의 뉴클레오타이드가 앞쪽 반 부분이 뒷쪽 부분과 적어도 부분적으로 상보적인 서열을 하고 있어 자체적으로 접혀지는 구조로 되어 2차 헤어핀 구조를 형성하는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드로 정의된다.
"헤어핀 모양의 전구체"는 마이크로프로세서 복합체 및 그 후 다이서 효소 복합체에 의해 제어되는 헤어핀 구조물로 정의되며, 약 16 내지 약 24개 길이의 뉴클레오타이드인 올리고뉴클레오타이드를 산출한다.
"일치(identity)" 또는 "유사(similarity)"는 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 2개의 폴리펩타이드 서열 사이의 서열 유사성을 의미하는데, 일치는 보다 엄격한 비교로 이루어진다. "일치 확률" 및 "% 일치도"란 구는 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 2개 이상의 폴리펩타이드 서열에서 발견되는 서열 유사성의 확률을 의미한다. "서열 유사성"은 2개 이상의 폴리뉴클레오타이드 서열에서의 염기쌍 서열(어떤 적절한 방법에 의해 결정된)의 유사성 확률을 의미한다. 2개 이상의 서열은 0-100% 유사성 또는 그 사이의 어떤 정수값을 가질 수 있다. 일치 또는 유사는 비교 목적으로 배열되는 각 서열의 위치를 비교함으로써 결정될 수 있다. 비교될 서열 내의 위치가 동일한 뉴클레오타이드 염기 또는 아미노산에 의해 채워지는 경우, 그 분자들은 상기 위치에서 일치한다. 폴리뉴클레오타이드 서열 사이의 유사성 또는 일치성 정도는 폴리뉴클레오타이드 서열들에 의해 공유되는 위치에서 일치하거나 매칭되는 뉴클레오타이드의 수에 따라 결정된다. 폴리펩타이드 서열의 일치도 정도는 폴리펩타이드 서열들에 의해 공유되는 위치에서 동일한 아미노산의 수에 따라 결정된다. 폴리펩타이드의 상동성 또는 유사성의 정도는 폴리펩타이드 서열들에 의해 공유되는 위치에서의 아미노산 수에 의해 결정된다.
"반응하지 않는(incompatible)"이란 2개의 분자들 또는 그 일부가 물리적, 화학적 또는 물리화학적 모두 서로 상호작용할 수 없는 분자의 화학적 특성을 의미한다. 예를 들어, 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리머의 일부는 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리머의 일부 및 예를 들어, 펩타이드 핵산, 2'-O-메틸기, 형광 화합물, 뉴클레오타이드 유도체, 뉴클레오타이드 아이소머 등과 같은 다른 화학적 작용기와 반응하지 않을 수 있다. 다른 예로서, 아미노산 잔기를 포함하는 폴리머의 일부는 아미노산 잔기를 포함하는 폴리머의 일부 및 예를 들어, 설페이트기, 포스페이트기, 아세틸기, 시아노기, 피페리딘기, 형광기, 시알산기, 만노스기 등과 같은 다른 화학적 작용기와 반응하지 않을 수 있다.
"정렬(alignment)"이란 서열의 공통 부분(뉴클레오타이드 염기 또는 아미노산 잔기와 같은)이 시각적으로 용이하게 식별될 수 있도록 길이별 비교에 의해 정렬된 수 많은 DNA 또는 아미노산 서열을 의미한다. 공통 부분의 분율 또는 비율은 서열 사이의 상동성 또는 일치성과 관계된다. 정렬은 보존된 도메인 및 이들 도메인들 내의 관련성을 확인하는데 사용될 수 있다. 정렬은 MACVECTOR 소프트웨어(1999)(Accelrys, Inc., San Diego, CA)와 같은 당해분야에 공지된 컴퓨터 프로그램에 의해 적절히 결정될 수 있다.
"높은 스트린전트(highly stringent)" 또는 "높은 스트린전트 조건"이란 용어는 서열이 매우 상보적인 DNA 가닥들이 혼성화되도록 하는 조건을 의미하는데, 이들 조건들은 명백하게 미스매치된 DNA의 혼성화는 배제한다. 스트린전트 조건 하에서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, 대립유전자 또는 스플라이스 변이체를 포함하는 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열의 변이체 또는 본원에 개시된 폴리펩타이드의 올소로그(ortholog) 또는 상동체(paralog)를 인코딩하는 서열이 될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 혼성화 방법은 하기 문헌: Kashima 등(1985)(Nature 313: 402-404); Sambrook 등(1989)(분자 클로닝: 실험 매뉴얼, 2판, 콜드스프링하버 연구소, 콜드스프링하버, N.Y.("Sambrook"); 및 Haymes 등("핵산 혼성화: 실험적 접근", IRL 출판사, 워싱턴 D.C.(1985))에 상세히 기술되어 있으며, 이들은 참고를 위해 본원에 포함된다.
일반적으로, 스트린전시(stringency)는 배양 온도, 용액의 이온강도, 혼성화에 사용되는 변성제(예: 포름아마이드)의 농도 및 세척 절차(스트린전시를 확립하고 결정하는 보다 자세한 설명은 하기를 참조하라)에 의해 결정된다. 2개의 핵산이 스트린전시의 다양한 조건 하에서 혼성화하는 정도는 그들의 유사성의 정도와 연관이 있다. 따라서, 유기체의 게놈 내에서의 다양한 소스(상동체의 경우에서와 같이) 또는 유사한 기능을 수행할 수 있는 다른 유기체(올소로그의 경우에서와 같이)로부터의 유사한 폴리뉴클레오타이드 서열이, 공지된 펩타이드-인코딩 서열과 혼성화할 수 있는 능력에 따라 단리될 수 있다. 이러한 접근법은 개시된 서열과의 다양한 유사성 정도를 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 개시된 서열과 60% 일치성, 보다 바람직하게는 약 70% 일치성 이상, 가장 바람직하게는 72% 이상의 일치성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 단리하는데 사용될 수 있다.
단일-채널 박막 장치 및 이를 사용하는 방법이 제공된다. 상기 장치는 전기적 전달 수단에 의하여 연결된 시스 및 트랜스 챔버를 포함한다. 전기적 전달 수단의 시스 말단은 단일 나노포어 또는 채널을 포함하는 박막으로 밀봉된 수평의 원추형 구경으로 되어 있다. 상기 장치는 시스 및 트랜스 챔버 사이에 전기장을 인가하는 수단을 추가로 포함한다. 상기 장치는 나노포어 또는 채널을 통한 이온 전류가 관찰되는 응용분야에 유용하며, 이러한 응용분야는 자연발생의 이온 채널의 특성화, 중합 화합물의 특성화 등을 포함한다. 현재 서열분석 방법은 약 1 킬로베이스(1000 염기쌍 식별)의 길이까지로 해독이 제한되어 있으나, 본원에 개시된 발명은 전통적인 벌크 방식의 서열분석 방법과 비교하면 보다 더 긴 길이를 해독하는 능력을 갖고 있다(Metzker(2005) Genome res. 15: 1767-1776; Rhee 및 Burns(2006) TIBS 24: 580-586).
본 발명의 방법들을 수행하는데 사용될 수 있는 장치는 예를 들어, USPN 제5,795,782호, USPN 제6,015,714호, USPN 제6,267,872호, USPN 제6,746,594호, USPN 제6,428,959호 및 USPN 제6,617,113호에 기술되어 있으며, 이들 각 문헌은 본원에 참고로 포함된다. 본 발명은 본원에 개시된 실시예 및 방법들에 의해 가장 잘 이해된다.
이제 혼합물 내의 각각의 폴리머에 대하여 효소 활성이 개시되는 시기를 제어하는 수단이 유용하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 다시말해, 이러한 제어가 없다면, 효소 활성의 촉발(예를 들어, 효소 및 DNA를 포함하는 용기에 Mg2+를 첨가함에 의한 촉발)이 동시에 일어나서, 시계열상 나노포어에 의해 포획되는 경우 효소-폴리뉴클레오타이드 복합체는 필연적으로 타겟 가닥을 따라 많은 지점에서 존재할 것이다. 최소 5개의 방법들이 이들 잠재적인 다중 상호작용을 극복하기 위하여 사용될 수 있다.
a) 마이크로유체공학(Microfluidics): 효소-폴리뉴클레오타이드 복합체가 포어에 의해 포획된 후에만 효소 활성을 유도하는 인자가 첨가될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드가 처리된 후에, 상기 용기는 세척될 수 있으며 새로운 일정 수의 폴리뉴클레오타이드 타겟이 유도인자 없이 첨가된다. 그 후, 상기 사이클이 반복된다.
b) 단백질 공학: 포어에 효소를 공유 결합시킴으로써, 시스템 내에 하나의 효소만이 상기 포어의 바로 옆에 위치하도록 할 수 있다(이를 달성한 몇가지 방법들이 미국 특허출원 제10/739,585호에 기술되어 있다).
c) 나노포어 내에 복합체의 포획이 일어난 경우에 한해서만 방출되는 제제를 사용한 벌크상에서의 효소 활성 차단: 이는 도면(도 1 및 2)에 예시되어 있으며 아래에 설명된다.
모든 필요 요소인 dNTPs(각각 약 200μM), Mg2+(약 5mM) 및 가공된 DNA 폴리머레이즈(약 1μM)를 포함하는 용액 내에 DNA 프라이머-주형 쌍(약 1μM)을 가정하라. 상기 용액은 단일 나노포어(예: α-헤몰리신)에 접하여 있고, 음전하를 띄는 DNA가 포어 내로 끌어 당겨지도록 전압이 인가된다. 또한, 각 프라이머-주형 쌍은 프라이머 가닥에 결합될 첫번째 염기(위치 n=0)에서 (또는 인접하여) 서열 특이적 분자에 어닐링된다. 상기 분자는 다양한 구조를 가질 수 있으나 초기 시도단계에서는 PNA 또는 2'-O-메틸 치환된 DNA일 수 있다. 이러한 차단 분자는 개시 부위에서 폴리머레이즈의 결합을 저해하거나(도 1) 또는 결합은 허용하나 가닥의 합성을 저해한다(도 2). 상기 차단 분자는 나노포어에 통과될 수 없는 충분히 큰 루프를 포함한다. 따라서, 인가된 전압 하에서 상기 가닥이 포어 내로 끌려오는 경우, 상기 루프는 포어 오리피스에 매달리게 된다. 이는 프라이머 주형으로부터의 차단을 해제시키고, 차단 프라이머를 분리시킨다. 폴리머레이즈 결합 및 폴리머레이즈-촉진의 가닥 합성이 뒤따를 수 있다. 이 방법의 핵심은 실험 시작과 동시에 나노포어에 의해 포획된 가닥만이 차단 프라이머로부터 풀려난다는 점이다. 최적화되는 경우, 1μM의 DNA 프라이머/주형을 포함하는 100㎕ 용액은 하나의 나노포어당 활성화되는 분자수가 총 6×1013개이다.
d) 트랜스-쪽으로부터 시스-쪽으로 포어를 통한 보조인자의 공급(효소 포함): 이는 포어에 바로 근접한 공간에 필요 인자의 양을 효과적으로 제어할 수 있다. 예로는 Mg2 +를 들 수 있다. 이는 도면(도 3)에 예시되어 있으며 아래에 설명된다.
이러한 접근법의 예는 도 3에 예시되어 있다. Mg2+는 폴리뉴클레오타이드 폴리머레이즈를 포함하는 많은 DNA 및/또는 RNA 수식 효소들에 의한 촉매 활성에 대하여 필수적인 보조인자이다. 본 방법에서, mM 농도보다 더 큰 농도의 Mg2+를 트랜스 구획에 첨가한다. 시스 구획은 모든 다른 반응제, 효소 및 촉매 활성에 필수적인 기질을 포함한다. 또한, 상기 시스 구획은 벌크 상에서 시스쪽에 자유 [Mg2+]가 사실상 0이 되도록 미량의 EDTA(약 0.1mM)를 포함한다. Mg2+가 생리적 조건하에서 2가 양이온이므로, 폴리뉴클레오타이드를 나노포어 내로 당기는 인가 전압(트랜스 쪽 +)은 반대 방향의 Mg2+를 시스 구획으로 몰아갈 것이다. 따라서, 상기 포어 구경에 바로 인접한 공간(매질의 면적)에서, 자유 [Mg2+]는 나노포어를 통한 트랜스 쪽에서 시스 쪽으로의 전압-구동 플럭스에 비례하며, 0.1mM EDTA에 의해 착화된 Mg2+ 분율 및 상기 나노포어 구경에 인접한 공간(매질의 면적)으로부터 Mg2+가 확산하는 속도에 반비례하는 함수이다. 벌크 공간에서의 [Mg2+]는 사실상 0이 되며, 2가 금속(들)의 EDTA 착체에 의해 지배된다.
e) 트랜스 쪽에서 효소를 포함하는 시스 쪽으로 포어를 통한 ssDNA의 운송: 이는 포어 내에 포획된 분자에 대하여 사실상 주형의 효소 수식을 제한할 수 있다. 모든 다른 주형 가닥들은 채널을 지지하는 불투과성 층(예: 이중층)에 의해 효소로부터 분리된다.
폴리뉴클레오타이드들과 상호작용하는 효소들은 당업자들에게 공지된 것이며이에 제한되지는 않지만, E.coli DNA 폴리머레이즈 I, E.coli DNA 폴리머레이즈 I 큰 절편(Klenow 절편), 파지 T7 DNA 폴리머레이즈, Phi-29 DNA 폴리머레이즈, Thermus aquaticus(Taq) DNA 폴리머레이즈, Thermus flavus(Tfl) DNA 폴리머레이즈, Thermus Thermophilus(Tth) DNA 폴리머레이즈, Thermococcus litoralis(Tli) DNA 폴리머레이즈, Pyrococcus furiosus(Pfu) DNA 폴리머레이즈, VENT DNA 폴리머레이즈 및 Bacillus stearothermophilus(Bst) DNA 폴리머레이즈로부터 선택되는 DNA 폴리머레이즈와 같은 DNA 폴리머레이즈, AMV 역전사효소, MMLV 역전사효소 및 HIV-1 역전사효소, T7 RNA 폴리머레이즈, T3 RNA 폴리머레이즈, SP6 RNA 폴리머레이즈 및 E.coli RNA 폴리머레이즈로부터 선택된 RNA 폴리머레이즈와 같은 RNA 폴리머레이즈, 및 엑소뉴클레이즈 람다, T7 엑소뉴클레이즈, Exo III, RecJ1 엑소뉴클레이즈, Exo I 및 Exo T와 같은 엑소뉴클레이즈를 포함할 수 있다.
나노포어와 결합된, 합성에 의한 서열분석
이는 단일 DNA 분자의 서열분석을 위한 기술이다. 합성에 의한 통상적인 서열분석(SBS)의 특성과, 전자 및 생화학적인 피드백 제어하에서의 단일 DNA 분자의 신규 나노포어 분석 기술을 조합한 것이다. 이는 3' 종결자 기술, 구체적으로 가역 종결자 기술에 의존한다.
기초적인 방법이 단일 나노포어에 대하여 도 4에 도시되어 있다. 본 연구소는 상기 방법을 발전시켜 400,000개까지의 포어를 가진 칩 상에서 상기 분석을 수행하도록 하였다. 이러한 칩의 고안 및 제조에 관하여 아래에 기술한다.
도 4에 도시된 바와 같이, 이중 가닥 및 단일 가닥 단편을 모두 가진 DNA 분자가 인가된 전압(트랜스 쪽 +)하에서 나노크기의 포어 내에 포획되어 있다(단계 a: 도 4). 이러한 속성의 DNA는 게놈 DNA 또는 BAC 클론 등으로부터 시의적절한 엑소뉴클레이즈의 제한 절편 절단으로 생성될 수 있다. 상기 나노포어는 ssDNA 단편의 이동이 가능할 정도로 넓지만, 이중 가닥의 단편은 그 직경이 상기 포어의 가장 협소한 부위를 통과하기에는 너무 크기때문에 이동할 수 없다. 상기 α-헤몰리신 포어는 이러한 목적에 이상적이므로 본 기술을 예시하는데 사용된다. 가닥의 포획 및 포어 연결통로 내로의 듀플렉스 단편의 진입은 전류 진폭에 기초하여 결정될 수 있다. 일단 상기 상황이 일어난다면, 전압은 피드백 제어하에서 감소된다(단계 b: 도 4). 이 단계에서, 다양한 기술들에 의해 듀플렉스 말단을 조사 및 식별할 수 있다. 예를 들어, 본 연구소의 초기 특허 문헌에서 듀플렉스 말단은 DC 전류 임피던스만으로 식별할 수 있음을 보였다. 이와 동시에, 채널의 트랜스 쪽의 ssDNA의 5'-말단은 포어 내에서 계속 가닥을 유지시켜주는 제제(예: 상보적인 올리고뉴클레오타이드 또는 스트렙타비딘)와 어닐링하고 있다.
일단 DNA 가닥이 포획되고 말단이 식별되면, 시스 구획은 Mg2+, DNA 폴리머레이즈(예: DNA 폴리머레이즈의 Klenow 단편(KF)), 및 별개의 가역 말단자 또는 동일한 가역 말단자에 의해 보호된 4개의 dNTPs를 포함하는 완충액으로 가득차게 된다(단계 c: 도 4). 그 후, 막 전위를 역으로 하여 타겟 가닥의 듀플렉스 말단이 폴리머레이즈 및 기질을 포함하는 시스 구획 내로 들어가도록 한다(단계 c: 도 4). 그 후, 보호된 정확한 dNTP가 상기 타겟에 결합되도록 충분한 시간이 주어진다(단계 e: 도 4). 시간이 경과된 후, 전압은 다시 한번 역으로 인가된다(트랜스 쪽 +; 단계 f: 도 4). 상기 듀플렉스 말단은 포어의 제한된 구경 옆으로 당겨져 나오며, 결합된 뉴클레오타이드의 식별이 이루어진다. 보호된 뉴클레오타이드가 결합되지 않았다면, 시그널은 단계 b에서와 동일할 것이다. 이러한 경우에는, 정확한 뉴클레오타이드가 결합되고 식별될 때까지 단계 d에서 f까지를 반복한다. 보호된 뉴클레오타이드의 확인된 결합을 따라 시스 구획은 관류(perfusion)되며 탈보호 완충액이 첨가된다(단계 g: 도 4). 대안적으로, 본 연구진은 관류의 필요성을 줄이기 위하여 나노포어 근처에서만 위치하는 탈보호 제제가 본 연구진의 제어하에 활성화되거나 비활성화되는 방법을 고안하였다. 상기 탈보호 제제는 효소(예: 알칼라인 포스파테이즈), 빛 또는 용질(예: 탈알릴화를 촉매화하는 팔라듐)이 될 수 있다. 관류 후에, 트랜스-쪽에 음 전위를 생기게 하여, 듀플렉스 말단을 시스 구획으로 보내어 그 곳에서 가역 말단자를 제거할 수 있다(단계 h: 도 4). 상기 반응 후에, 트랜스-쪽에 양 전위를 다시 생기게 하여, 듀플렉스 말단을 다시 제한 구경으로 끌어 당겨 탈보호가 성공적으로 이루어졌는지를 조사하고 판정할 수 있으며 마지막 염기가 동일한지도 확인할 수 있다(단계 i: 도 4). 탈보호가 성공적이지 않은 경우, 단계 h 및 i를 반복한다. 탈보호가 성공적인 경우에는, 단계 b에서 사이클이 반복된다.
도 5에 예시된 방법은 채널의 트랜스 쪽에서 엑소뉴클레이즈의 절단 작용이 일어난다는 점과 도 4와 비교하여 DNA가 역방향으로 포획되어 있다는 점을 제외하고는 도 4에 예시된 방법과 유사하다. 본 방법에서, 주형 가닥은 가닥 합성이 개시되는 프라이머에 의해 시스쪽에 위치하고 있다. 본 방법의 장점은 나노포어 내에 포획된 ssDNA가 트랜스 구획 내에서의 계속되는 엑소뉴클레이즈의 절단 작용에 의해 일괄적으로 생성될 수 있다는 점이다. 따라서, 주형의 대부분은 dsDNA이다. 예를 들어, 엑소뉴클레이즈가 염기당 10ms(평균)로 절단한다면, 20kb dsDNA 타겟의 말단에서 1000개의 염기 오버행이 생성될 수 있다. 약 1000개의 염기들이 나노포어-결합된 SBS에 의해 성공적으로 채워지는 경우, 상기 엑소뉴클레이즈(또는 필요 보조인자)가 트랜스 구획에 재첨가되어 추가로 10초간 반응을 하게 된다. 신규로 생성된 ssDNA가 상술한 바와 같이 시스 구획 내에 염기별로 채워지게 된다. 이러한 작업이 20kb 단편을 완성하기 위하여 1000개의 염기들을 약 2회 반복하게 된다.
상기 포어 구경은 다양한 크기를 가질 수 있는데, 예를 들어, 약 0.5㎚ 내지 10㎚ 사이의 직경을 가질 수 있다. 예를 들어, 직경은 약 0.5㎚, 1㎚, 1.25㎚, 1.5㎚, 1.75㎚, 2㎚, 2.25㎚, 2.5㎚, 2.75㎚, 3㎚, 3.5㎚, 4㎚, 4.5㎚, 5㎚, 6㎚, 7㎚, 8㎚, 9㎚, 10㎚ 또는 이들 사이의 어떤 직경을 가질 수 있다.
나노포어와 결합된, 합성에 의한 서열분석은 통상적인 SBS에 대하여 몇개의 장점들을 가지는데, 주요한 장점들은 아래와 같다:
1) 뉴클레오타이드 첨가 및 가역 종결자 제거가 개별 타겟 가닥에 대하여 직접 측정될 수 있다.
2) 뉴클레오타이드 첨가 및 탈보호 단계들이 성공할 때까지 신속하게 반복될 수 있도록 시스템이 전자적 및 생화학적으로 조절된다.
3) 매우 긴 DNA 분자가 무한정의 기간 동안 포어 내에 포획되고 조작되며 정량적으로 보유될 수 있다.
4) 사용되는 반응제의 양은 매우 소량(100㎕의 단위)일 수 있으며, 주어진 양이 몇백번이고 재활용될 수 있다. 좀 더 연구를 하면, 나노포어 오리피스에서 탈보호 단계의 활성 및 비활성을 조절할 수 있을 것이다. 이로 인해 관류의 필요성이 완전히 없어질 것이다.
통상적인 SBS에서 알려진 바와 같이, 본 분석은 병렬적으로 수행될 수 있다. 본 연구진은 1㎝×1㎝ 칩 상에 400,000개의 독자적으로 제어가능한 포어를 고안하였는데, 이는 일반적인 리소그래피를 사용하여 제조될 수 있다(하기 개별적인 설명을 참조하라).
여기에서 본 연구진은 거대분자 및 다른 폴리양이온/폴리음이온을 나노포어 구경에 위치시키고 부착하는데 사용될 수 있는 폴리뉴클레오타이드를 제안한다. 이러한 거대분자 및 폴리머는 예를 들어, 이에 제한되지는 않지만 나노포어 오리피스에서의 폴리뉴클레오타이드 폴리머레이즈와 같은 폴리뉴클레오타이드-결합 단백질이 될 수 있다. 나노포어는 사용자에 의해 특정될 수 있는 정해진 위치에 어떠한 원하는 거대분자 구조물을 실질적으로 이동하게 하는 유용한 특성을 가진다. 나노포어 위치에 배치된 후, 거대분자의 기능은 다양한 방법으로 사용자에 의해 관찰될 수 있다. 이러한 방법은 이에 제한되지는 않지만, 효소, 수용체 단백질, 라이보자임 및 라이보좀과 같은 거대분자들에 적용될 수 있다. 상기 방법은 생물학적 포어 또는 얇은 무기 멤브레인으로 제조되는 고체 상태 포어에 적용될 수 있다.
본 발명의 기초는 이온화된 폴리머의 충분히 긴 가닥이, 원하는 거대분자에 공유 또는 비공유 결합으로 부착될 수 있다는 점이다. 그 후, 상기 폴리머는 막 전체에 인가된 전압에 의해 나노포어를 통해 빠져나간다. 일부 적용예에서, 포어 전체에 작용하는 전압을 변환함으로써 상기 거대분자에 작용하는 힘을 제어하는 일이 필요할 것이다. 그 결과, 상기 거대분자는 포어의 위치에 나노미터 이하의 정확도로 배치된다. 그 후, 상기 거대분자는 막 전압에 의해 만들어진 전기적 힘, 또는 거대분자와 포어 또는 포어 주위의 표면 사이에 만들어진 공유 결합에 의하여 포어 위치에 유지된다. 원한다면, 하나 이상의 거대분자가 일렬로 부착될 수 있다.
그 후, 단일 거대분자의 기능이 포어에서 생성된 전기적 효과에 의하여 관찰될 수 있다. 예를 들어, 포어를 통한 이온 전류가 측정될 수 있으며 분자 기능이 전류의 변조로 검출된다. 대안적으로, 탄소 나노튜브와 같은 전극이 포어 전체에 배치되어 상기 나노튜브를 통한 전류의 변조에 의해 분자 기능이 검출된다.
본 발명의 대표적 용도
(1) 나노포어 장치는 엑소뉴클레이즈 및 폴리머레이즈와 같은 효소들의 턴오버(turn over)를 관찰하는데 사용될 수 있는데, 이는 DNA 서열분석에 중요하게 이용된다.
(2) 나노포어 장치는 효소 기질 또는 신호 분자와 같은 가용성 물질들 사이의 상호작용을 관찰하는 바이오센서로서의 기능을 할 수 있다. 예로는 글루코스, 요산 및 요소와 같은 혈액 성분, 스테로이드 및 사이토카인과 같은 호르몬, 및 수용체 분자에 결합함으로써 기능을 발휘하는 약제학적 제제들을 포함한다.
(3) 나노포어 장치는 라이보좀과 같은 중요한 생물학적 구조물들의 기능을 실시간으로 관찰할 수 있으며, 하나의 기능적 단위로 이러한 작업을 수행할 수 있다.
도 6 내지 도 8은 본 발명의 대표적인 구현예를 예시한다.
도 6
도 6A는 기질 내의 포어 구경(1) 또는 상기 포어 구경에 인접하게 결합된 화합물(3)을 갖는 구조물(2)을 포함하는 나노포어 장치를 예시하는데; 상기 기질 또는 구조물이 시스 쪽과 트랜스 쪽을 구분짓는다. 또한, 도 6A는 폴리머(5)에 결합된 분자 또는 거대분자(4)가 거대분자/폴리머 복합체를 형성함을 보여주는데, 상기 폴리머는 불완전하게 합성된 부분(6)을 추가로 포함한다.
도 6B에 의해 예시된 바와 같이, 상기 장치에 전압 구배가 인가되어 거대분자/폴리머 복합체는 기질 또는 구조물의 시스면으로 끌려오게 된다. 상기 불완전하게 합성된 부분(6)은 상기 포어 구경을 통하여 통과되기에 충분한 크기를 갖는다. 또한, 시스쪽에 모노머(7)가 존재한다는 것도 예시되어 있다. 거대분자/폴리머 복합체의 위치 변화는 포어 구경 전체에 걸친 전류의 변화(화살표; δI)에 의해 측정될 수 있다. 그 후 거대분자가 폴리머 내로 상기 모노머들을 결합하게 하여 도 6C에 도시된 바와 같은 완전히 합성된 폴리머(8)를 형성하게 한다.
그 후, 전압 구배가 역으로 인가되며, 도 6C에 도시된 바와 같이, 완전히 합성된 폴리머가 거대분자로부터 방출됨으로써 추가의 전류 변화(δI)를 형성한다. 이는 거대분자로 DNA 폴리머레이즈를 사용함으로써 예증될 수 있다.
대안으로서, 도 6D에 도시된 바와 같이, 상기 거대분자가 폴리머로부터 불완전하게 합성된 부분을 절단함으로써, 거대분자/폴리머 복합체로부터 불완전하게 합성된 부분(6)을 방출한다. 그 후, 전압 구배가 역으로 인가되어 상기 폴리머(5)는 상기 거대분자로부터 탈리된다. 이러한 경우들 역시 전류 변화(화살표; δI)에 의해 측정될 수 있다. 이는 거대분자로 엔도뉴클레이즈 효소를 사용함으로써 예증될 수 있다.
도 7
도 7A는 기질 내의 포어 구경(1) 또는 상기 포어 구경에 인접하게 결합된 화합물(3)을 갖는 구조물(2)을 포함하는 나노포어 장치를 예시하는데; 상기 기질 또는 구조물이 시스 쪽과 트랜스 쪽을 구분짓는다. 또한, 도 7A는 폴리머(5)에 결합된 분자 또는 거대분자(4)가 거대분자/폴리머 복합체를 형성함을 보여주는데, 상기 거대분자는 도 7B의 리간드(10)에 대해 매우 친화력이 높은 결합 부위(9)를 추가로 포함한다.
도 7B에 예시된 바와 같이, 상기 장치에 전압 구배가 인가되어 거대분자/폴리머 복합체는 기질 또는 구조물의 시스면으로 끌려오게 된다. 그 후, 상기 폴리머(5)는 상기 화합물(3)에 공유결합함으로써 포어 구경(1)의 인접 부위에 위치하게 된다. 거대분자/폴리머 복합체의 위치 변화는 포어 구경 전체에 걸리는 전류의 변화(화살표; δI)에 의해 측정될 수 있다.
그 후, 상기 리간드(10)가 매우 친화력이 높은 결합 부위(9)에 결합되게 되며, 도 7C에 예시된 바와 같이, 이로써 전류 변화(화살표; δI)를 추가로 형성하게 된다. 이는 거대분자로 스테로이드 호르몬 수용체를 사용하고 폴리머로 폴리아스파르트산을 사용함으로써 예증될 수 있다.
대안적으로, 도 7D에 예시된 바와 같이, 상기 거대분자는 상기 리간드에 물질대사가 일어나게 하여 2개의 생성물(11)을 만드는데, 이로써 거대분자/폴리머 복합체로부터 상기 생성물이 방출된다. 그 후, 전압 구배가 역으로 인가되어 상기 생성물은 거대분자로부터 방출된다. 이 경우들 역시 전류의 변화(δI)에 의해 측정될 수 있다. 이는 거대분자로 글루코스 옥시데이즈 효소 또는 단백질 포스파테이즈 효소를 사용함으로써 예증될 수 있다.
도 8
도 8A는 기질 내의 포어 구경(1) 또는 상기 포어 구경에 인접하게 결합된 화합물(3)을 갖는 구조물(2)을 포함하는 나노포어 장치를 예시하는데; 상기 기질 또는 구조물이 시스 쪽과 트랜스 쪽을 구분짓는다. 또한, 도 8A는 제1 폴리머(5)에 결합된 분자 또는 거대분자(4)가 거대분자/폴리머 복합체를 형성함을 보여준다.
도 8B에 예시된 바와 같이, 상기 장치에 전압 구배가 인가되어 거대분자/폴리머 복합체는 기질 또는 구조물의 시스면으로 끌려오게 된다. 또한, 시스쪽에 존재하는 제2 폴리머(12) 및 트랜스쪽에 존재하는 모노머(7)가 예시되어 있다. 대안적으로, 상기 모노머(7)는 시스쪽 상에 있을 수도 있다(미도시). 그 후, 상기 폴리머(5)는 상기 화합물(3)과 공유결합함으로써 상기 포어 구경(1)에 인접하게 된다. 거대분자/폴리머 복합체의 위치 변화는 포어 구경 전체에 걸리는 전류의 변화(화살표; δI)로 측정될 수 있다.
도 8C에 예시된 바와 같이, 상기 제2 폴리머(12)는 상기 거대분자(4)에 결합하고 전위차로 인해 상기 구경을 통하여 트랜스쪽으로 이동한다. 상기 제2 폴리머가 상기 거대분자를 통하여 이동됨에 따라 상기 모노머(7)에 의하여 제3 폴리머(13)가 순차적으로 합성되는데, 이로써 상기 포어 구경 전체에 걸친 전류 변화를 추가로 형성하게 된다(참조: 도 8D). 대안적으로, 상기 제3 폴리머(13)는 시스쪽에서 합성될 수도 있다(미도시). 이들 경우들은 또한 전류의 변화(δI)로 측정될 수 있다. 이는 거대분자로 라이보좀을 사용하고 제1 폴리머로 메신저 RNA를 사용함으로써 예증될 수 있다. 대안적으로, 라이보좀이 거대분자로 사용되고 제3 폴리머로 폴리아스파르트산이 사용될 수 있다.
단일 채널 박막 장치의 제조
단일-채널 박막 장치 및 이를 사용하는 방법이 제공된다. 상기 장치는 혼합신호 반도체 웨이퍼, 하나 이상의 전기화학층을 포함하는데, 상기 전기화학층은 이산화규소 등과 같은 반도체 물질을 포함하며, 상기 반도체 물질은 탄화수소와 같은 표면 개질제를 추가로 포함하고, 상기 전기화학층은 복수의 오리피스를 규정하는데, 상기 오리피스는 챔버 및 넥(neck)을 포함하며, 상기 오리피스의 챔버는 혼합신호 반도체 웨이퍼의 제1 금속화 조성물과 함께 동일한 장소에 배치되어 있는데, 상기 오리피스의 일부는 예를 들어 은과 같은 제2 금속과 접속되어 있고, 상기 제2 금속은 상기 제1 금속과 전기적 전달 상태에 있으며, 상기 오리피스는 인지질 이중층과 같은 박막을 추가로 포함하고, 상기 박막은 상기 오리피스의 넥에서 용매-불투과성 밀봉을 형성하며, 상기 박막은 포어를 추가로 포함하고, 상기 오리피스는 수용성 상 및 기체 상을 에워싼다. 바람직한 구현예에서, 상기 금속화 층은 이에 제한되지는 않지만 니켈, 금, 구리 및 알루미늄과 같은 금속 또는 금속 합금을 포함한다.
도 9는 본 발명의 측 투시 단면도를 도시한다.
도 10은 본 발명의 4개의 인접 요소들의 일부를 보여주는 본 발명의 평면도이다.
도 11은 제조된 바대로 본 발명을 사용하는 방법을 개시하는 흐름도이다.
생물학적 나노포어는 폴리뉴클레오타이드의 서열분석에 유용하지만, 낮은 전류(대략 수십 피코앰프)가 사용되기 때문에, 고수율의 단일 나노포어 시퀀싱 장치를 사용하는 검출은 초당 약 1000 염기쌍 정도로 제한될 수 있다. 대량의 집적 회로 어레이 및 대규모의 나노포어 어레이의 제조에 사용되는 바와 같이 서로 독립적으로 작동할 수 있는 생물학적 나노포어 어레이의 제조는 수 초 내에 수백만의 생화학적 반응 및 분석을 수행할 수 있게 한다.
상기 어레이 요소들은 단계적인 병렬식으로 제조될 수 있는데, 집적 회로 상의 트랜지스터의 제조와 유사하다. 각 어레이 요소의 유사한 층 전체 또는 대부분이 어레이 요소의 전체 또는 대부분에 동시에 일어나는 일련의 단일 제조 단계로 형성된다.
생물학적 반응제의 개별 분자들의 움직임을 일치시키는 간단한 방법이 없으므로, 상기 어레이 내의 각 요소는 다른 요소들과 독립적으로 행동할 수 있어야 한다. 이는 각각의 단일 생물학적 나노포어에, 생물학적 나노포어와 결합하는 복합체에서 분리된 단일(또는 복수의) 분자들의 생화학적 상태를 제어하고 감지하는 유한 상태 기계가 갖춰진 디지털 로직 회로를 포함함으로써 이루어질 수 있다. 상기 유한 상태 기계는 상기 생물학적 나노포어에 결합된 분자들의 복합체를 낮은 대기시간으로 제어하는 것을 가능하게 하며, 동시에 다른 시기의 검색을 위해, 모아진 정보를 저장할 수 있다.
수십만개의 생물학적 나노포어 요소들 각각이 최소의 연결선을 사용하여 서로 교신될 수 있도록, 상기 어레이로 들어오고 나가는 대량의 데이터를 다중 송신하기 위하여 직렬 인터페이스 및 어드레스가능한 로직이 사용될 수 있다(참조: 도 11의 흐름도).
도 9는 제조된 어레이의 다이어그램을 도시한다. 대표적인 제조방법이 아래에 기술된다. 아날로그 및 디지털 회로를 포함하는 상업적으로 이용가능한 혼합신호 반도체 웨이퍼(15)가 기저층으로 기능하는데 사용된다. 그 후, 전기화학층(들)(16)이 그 위에 놓여질 수 있다. 예를 들어 은과 같은 금속(19)이 노출된 금속화물(18) 상에 증착되어 나노포어 시스템에 대한 전극 전체 또는 대부분을 동시에 형성한다. 당업자에 잘 알려진 바와 같이, 산화물(2)은 전극 위의 면적을 채우는 용액의 양과 동일한 양을 잘 보호하기 위하여 충분한 두께로 성장된다. 상기 산화물의 표면은 화학적으로 개질되어(16, 3) 오리피스의 젖음성을 확보하고 지질 이중층(박막, 20)의 밀봉 내구성을 개선시킨다. 질소 가스와 같은 소량의 가스(21)가 화학적으로 개질되지 않은 전극의 인접 공간에 포획되어 있다. 화학적으로 개질되지 않은 산화물은 물(또는 수용액)과 섞여들지 않으므로 상기 가스가 포획되어 있다. 상기 포획된 가스(21)는 하부의 전자 회로로부터 제어된 가열 작용을 통하여 상기 이중층(20) 중 어느 하나를 흡인하는데 사용될 수 있다. 금속화물 및 금속의 높은 열 전도성은 제어된 열을 전자 회로로부터 포획된 가스로 전달한다.
화학적으로 개질된 산화물 상의 단일층(22) 및 오리피스(17)에 걸쳐있는 이중층을 모두 포함하는 지질층(들)은, 표면이 지질로 피복된 TEFLON 막에 화학적으로 개질된 웨이퍼를 압착함으로써 형성된다. 이는 챔버 또는 웰(24) 내에 존재하는 용액 또는 수용액(23) 내에서 일어날 수 있다. 걸쳐진 TEFLON 막을 제거하면 도 9A, 9B 및 9C에 도시된 바와 같이 제1 용액(23) 위에 지질층(들)(20, 22)이 놓이게 된다.
모든 어레이 요소들이 상술한 방법 및 절차대로 각각의 오리피스에 걸쳐 박막이나 이중층을 가지지는 않음에 유의해야 한다. 유한 상태 기계에 의해 측정된 오리피스 내에 존재하는 지질의 전기용량은 비기능적인 어레이 요소들의 존재를 파악하는데 사용될 수 있다. 박막이나 이중층이 없는 어레이 요소들의 비율이 바람직한 비율과 비교할 때 크다고 판단된다면, 그 즉시 TEFLON 막과 지질 피복을 씌우는 단계가 반복될 수 있다.
도 9A에 도시된 바와 같이, 제2 용액(25)은 사용되는 생화학적 반응제를 위해 pH를 안정화시키는 완충액과 약 0.1M 내지 약 5M KCl 사이 또는 다른 적절한 염을 포함하는 지지 전해질을 포함할 수 있다. 제2 용액(25)은 용액의 연속적인 점적으로 어레이 요소들을 덮는다. 접지된 거시 AgCl 전극과 같은 전극이 상기 제2 용액(25)과 접촉한 상태로 놓여진다. 기능성을 갖춘 모든 오리피스를 따라 이중층들이 적절한 장소에 위치하는 경우, 제2 용액(25)으로부터 제1 용액(23)으로 흐르는 이온 전류는 없다. α-헤몰리신 독소와 같은 포어 분자 또는 채널 분자(14)의 정해진 양을 제2 용액(25)에 첨가한다. 포어 분자 또는 채널 분자(14)의 농도는 대략 15분 내에 박막 또는 이중층 중 어느 하나에 단일 채널을 형성하기 충분한 농도이다. 이러한 채널들을 형성하는 시간은 예를 들어, 30초 내지 1시간 사이일 수 있는데, 가령 약 30초, 1분, 2분, 3분, 4분, 5분, 7분, 10분, 15분, 20분, 25분, 30분, 35분, 40분, 45분, 50분, 55분, 60분 또는 이들 사이의 어떤 시간일 수 있다. 이러한 형성 시간은 작업자에 의해, 여러 인자 또는 변수들에 의해 달라질 수 있는데, 예를 들어, 주변 온도 또는 배양 온도의 증감, 제2 용액(25) 또는 제1 용액(23) 내의 염의 농도의 증감, 박막 또는 이중층쪽으로 상기 포어나 채널 분자를 끌어당기는 제1 용액과 제2 용액 사이의 전위차의 설정 또는 당업자에 알려진 다른 방법들로 인해 달라질 수 있다. 상기 유한 상태 기계는 회로를 통하여 전류(이온)의 흐름에 반응함으로써 해당되는 이중층 내의 단일 채널의 형성을 검출 및/또는 감지할 수 있는데, 상기 회로는 특정 어레이 요소에 대한 거시 전극, 제2 용액, 단일 나노포어 또는 채널 분자, 제1 용액 및 금속(19) 전극을 포함한다.
생물학적 채널의 형성은 통계적인 공정이다. 일단 특정 어레이 요소 이중층 내에 단일 채널이 형성되었다면, 그곳에 제2 채널이 형성될 가능성은 감소되었거나 바람직하게는, 제거되었다고 보는 것이 좋을 것이다. 제2 채널이 삽입될 확률은 인가된 전압, 즉 이중층에 걸친 전위차에 의해 조절될 수 있다. 일단 단일 채널이 감지되는 경우, 상기 유한 상태 기계는 동일 이중층 내에 제2 채널이 삽입될 확률을 감소시키도록 금속 전극 상의 전위를 조절한다.
상술한 단계(들)에서 주의를 기울였음에도 불구하고 특정 이중층에서 제2 채널이 형성될 수 있다. 상기 유한 상태 기계는 제2 채널의 형성을 검출할 수 있다. 오리피스 하부에 있는 질소 가스로부터의 흡입 펄스가 상기 이중층으로부터 하나 이상의 채널들을 제거할 수 있다. 상기 가스에 열을 가하고 이로써 제어된 조건하에서 상기 가스를 팽창시키는데 사용되는 발열 요소가 상기 가스의 근접 부위에 포함될 수 있다. 정확히 제어되는 낮은 압력의 펄스가 두 채널 중 하나를 제거하여 하나의 채널만이 상기 이중층 내에 포함되도록 할 수 있다. 상기 유한 상태 기계는 발열 요소를 불활성화함으로써 가스의 수축이 일어나게 하여 상기 이중층을 흡인하는 효과를 가져오게 함으로써 상기 이중층으로부터 하나 이상의 채널을 제거할 수 있다.
생화학적 작동 및 검출을 위하여 생물학적 나노포어를 사용하는 중에, 상기 포어는 영구적으로 차단될 수 있다. 상기 유한 상태 기계는 이러한 차단된 상태를 검출 및 감지할 수 있으며, 발열 요소를 불활성화시켜 이중층에 대하여 흡인 효과(감압)를 적용함으로써 상기 이중층으로부터 차단된 채널을 제거할 수 있다.
대안적인 구현예에서, 각각의 어레이 요소는 오리피스를 둘러싸는 금 전극(26)을 포함할 수 있다. 상기 금 전극은 산화 또는 환원 반응을 사용하여 화학적 반응제를 활성화시키는 기능을 가질 수 있고 특정 오리피스의 위치에서 특이적으로 작용할 수 있다. 예를 들어, 도 10은 본 발명의 성분 및 요소들의 일부, 오리피스(17), 선택적인 금 전극(26) 및 기질이나 구조물(2)이 비슷한 간격으로 배치되어 있음을 보여주는 4개의 어레이 요소들 일부의 평면도를 도시한다.
상기 유한 상태 기계는 상업적으로 이용가능한 최신식의 65㎚ 처리 기술을 사용하여 제조될 수 있는데, 예를 들어 대만의 대만 반도체 제조 회사로부터 제조될 수 있다. 600×600 어레이의 나노포어는 360,000개의 생화학적 반응 및 1000㎐의 속도로 검출/감지 단계들을 수행할 수 있다. 이는 폴리뉴클레오타이드의 서열분석을 가능하게 할 수 있는데, 예를 들어, 반도체 웨이퍼로부터 절단된 1㎝×1㎝의 주형에서 초당 3억 6천만개의 염기 분석 속도로 처리될 수 있다.
시스 및 트랜스 챔버들 사이에 전기장을 인가하는 대표적인 수단은 예를 들어, 액체에 잠긴 음극 및 액체에 잠긴 양극을 포함하는 전극인데, 이들은 전압 공급장치에 연결되어 있다. 이러한 전극들은 예를 들어 염화은 또는 이와 유사한 물리적 및/또는 화학적 특성을 가진 다른 화합물로부터 제조될 수 있다.
검출
나노포어 구경의 시간-의존성 수송 특성은 적절한 기술에 의해 측정될 수 있다. 상기 수송 특성은 폴리뉴클레오타이드를 수송하는데 사용되는 매질, 액체 내의 용질(예: 이온), 폴리뉴클레오타이드(예: 모노머의 화학 구조) 또는 폴리뉴클레오타이드 상의 표지의 함수일 수 있다. 대표적인 수송 특성은 전류, 컨덕턴스, 저항, 커패시턴스, 전하, 농도, 광학 특성(예: 형광 및 라만 분광) 및 화학 구조를 포함한다. 바람직하게, 상기 수송 특성은 전류이다.
시스 및 트랜스 챔버 사이의 전류를 검출하는 대표적인 수단은 WO 제00/79257호, 미국특허 제6,46,594호, 제6,673호, 제6,673,615호, 제6,627,067호, 제6,464,842호, 제6,362,002호, 제6,267,872호, 제6,015,714호 및 제5,795,782호 및 미국특허 출원 제2004/0121525호, 제2003/0104428호 및 제2003/0104428호에 기술되어 있으며, 이에 제한되지는 않지만, 포어 구경에서 또는 부근에서 채널이나 포어와 직접 관련된 전극, 시스 및 트랜스 챔버 내에 배치된 전극, 절연된 유리 미세 전극을 포함할 수 있다. 상기 전극은 이에 제한되지는 않지만, 2개의 챔버들에 걸친 이온 전류 차를 검출하거나 포어 구경이나 채널 구경에 걸친 전자 터널링 전류를 검출할 수 있다. 다른 구현예에서, 수송 특성은 구경의 직경에 걸친 전자의 흐름이며, 이는 나노포어 둘레에 인접하거나 접경하는 곳에 배치된 전극들에 의해 관찰될 수 있다. 이러한 전극들은 신호를 증폭하기 위하여 Axopatch 200B에 부착될 수 있다.
본원에 개시된 본 발명의 적용 및/또는 용도는 이에 제한되지는 않지만 하기를 포함할 수 있다.
1. mRNA, rRNA 및 tRNA에 의해 표시되는 것과 같은, 상대적 또는 절대적인 유전자 발현 수준의 측정. 이는 천연, 돌연변이 및 병원성 핵산 및 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
2. 대립형질 발현의 분석.
3. 염색체 내의 복수의 SNP의 일배체 분석 및 상(phasing).
4. DNA 메틸화 상태 분석.
5. mRNA 대체 스플라이싱 및 스플라이스 변종의 수준 분석.
6. RNA 운반의 분석.
7. mRNA, rRNA 및 DNA 내의 단백질-핵산 복합체의 분석.
8. DNA, rRNA 또는 mRNA를 통한 음식물 및 환경 샘플 내의 미생물이나 바이러스 함량 존재의 분석.
9. DNA, rRNA 또는 mRNA를 통한 음식물 및 환경 샘플 내의 미생물이나 바이러스 함량의 동정.
10. 식물, 인간, 미생물 및 동물 내의 DNA, rRNA 또는 mRNA를 통한 병리의 동정.
11. 의학적 진단에서의 핵산 분석.
12. 정량적인 핵 제거 분석
13. 이에 제한되지는 않지만 면역 반응에서 관찰되는 것을 포함하는, DNA 및 RNA 수준에서의 유전자 재배열 분석.
14. 미생물, 바이러스 및 미토콘드리아에서의 유전자 전달 분석.
15. 유전적 진화 분석.
16. 법의학적 분석.
유한 상태 기계를 사용한 터미널 단계 검출 적응을 위한 필터링된 유도 진폭
DNA 단독만의 일정 전압 실험 및 DNA, DNA 폴리머레이즈의 Klenow 단편(KF) 및 상보적인 dNTP와의 일정 전압 실험이 터미널 단계, 즉, DNA로부터 KF/dNTP의 해리(dissociation)가 일어나는 단계를 검출하기 위해 사용되는 한계치를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이온 전류의 필터링된 진폭외에 이온 전류의 필터링된 유도 진폭이 터미널 단계를 검출하는데 사용될 수 있다. 실제로, 상기 필터링된 진폭은 본원에 개시된 바와 같은 한계치이며, 상기 필터링된 유도 진폭은 설정된 한계치 위로 편향되는 것이 관찰된다. 지수 가중 평균 필터를 사용하는 예비 조사에서 상기 필터링된 진폭에 적용된 상기 필터링된 유도 진폭은 터미널 단계가 존재하는 경우 10배 정도의 크기로 편향된다. 필터링된 진폭 및 필터링된 유도 진폭 모두를 사용하는 실험을 수행하였는데, KF 해리의 로버스트(robust) 검출을 보증하기 위하여 유도 필터 및 편향 한계치를 조율하였다.
상기 유도 진폭의 편향은 터미널 단계 수준의 편향에 대하여 관찰될 수 있는데, 통상적인 (최소) 편향 한계치를 사용하는 실시간에서의 인가된 전압에 대하여 관찰될 수 있다. 이러한 접근법에서, 필터링된 진폭의 한계치가 아닌 필터링된 유도 진폭의 한계치만을 사용하여 터미널 단계의 검출이 테스트된다. 필터링된 유도 진폭만을 사용하는 로버스트 검출은 각각의 탐지 전압에 대한 필터링된 전류 진폭 범위의 확인을 요구함 없이, KF 결합에 대한 DNA를 탐지하는데 사용될 수 있는 전압의 범위를 증가시킬 수 있다. 편향에 대한 필터링된 유도 진폭을 관찰하는 것 외에도, 미리 조절된 한계치를 사용하지 않고 상대적인 진폭 변화에 대한 필터링된 진폭을 관찰하는 로직도 개발되었다. 목적은 현재의 진폭 한계치에 의존하지 않고, 필터링된 진폭 및/또는 필터링된 유도 진폭을 사용하여, (변경이 가능한) 넓은 범위의 탐지 전압에 대한 KF 해리를 로버스트 검출할 수 있는 보다 적응성이 높은 이온 전류 필터링 로직이다.
다른 폴리뉴클레오타이드와 상동적인 폴리뉴클레오타이드는 스트린전트 또는 높은 스트린전트 조건하에서 서로 혼성화함으로 식별될 수 있다. 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드는 수소 결합, 용매 배제, 염기 적층(base stacking) 등과 같은 잘 특성화된 다양한 물리-화학적 힘에 기초하여 그들이 결합할 때 혼성화한다. 혼성화의 스트린전시는 관계된 핵산의 서열 일치성의 정도를 반영하는데, 스트린전시가 높을수록 2개의 폴리뉴클레오타이드 가닥의 유사성이 높다. 스트린전시는 다양한 인자들에 의해 영향을 받는데, 상술한 참고 문헌들에 보다 자세히 기술된 바와 같이, 혼성화 및 세척 용액 및 배양액 (및 각각의 횟수)에 모두 존재하는 온도, 염 농도 및 조성, 유기 및 비 유기 첨가물, 용매 등을 포함한다.
DNA 듀플렉스의 안정성은 염기 조성, 길이 및 염기쌍 미스매치의 정도와 같은 인자들에 의해 영향받는다. 혼성화 조건들은 다른 서열 관련성의 DNA들이 혼성화하도록 조절될 수 있다. 용융점(Tm)은 듀플렉스 분자들의 50%가 각각을 구성하는 단일 가닥으로 해리될 때의 온도로 정의된다. 완전히 매치된 듀플렉스의 용융점은, 혼성화 완충액이 변성제로 포름아마이드를 포함하는 경우, 하기 식으로 추정될 수 있다:
(I) DNA-DNA: Tm(℃)=81.5+16.6(log[Na+])+0.41(%G+C)-0.62(%포름아마이드)-500/L
(II) DNA-RNA: Tm(℃)=79.8+18.5(log[Na+])+0.58(%G+C)+-0.12(%G+C)2-0.5(%포름아마이드)-820/L
(III) RNA-RNA: Tm(℃)=79.8+18.5(log[Na+])+0.58(%G+C)+0.12(%G+C)2-0.35(%포름아마이드)-820/L
상기에서, L은 형성된 듀플렉스의 길이이며, [Na+]는 혼성화 또는 세척 용액 내의 나트륨 이온의 몰 농도이고, %G+C는 혼성물 내의 (구아닌+시토신)의 비율이다. 불완전하게 매치된 혼성물에 대해서는, 1% 미스매치될 때마다, 용융점은 약 1℃ 감소되게 된다.
혼성화 실험은 비록 혼성화 속도가 혼성화 완충액에 사용될 수 있는 이온 세기에서의 pH에 거의 독립적일지라도, 일반적으로 pH 6.8 내지 7.4의 완충액에서 수행된다(Anderson 및 Young(1985) "Quantitative Filter Hybridisation" In: Hames 및 Higgins, editors, Nucleic Acid Hybridisation; A Practical Approach, Oxford, IRL Press, 73-111). 또한, 하기 중 하나 이상이 비-특이적 혼성화를 감소시키는데 사용될 수 있다: 음파 분쇄된 연어 정자 DNA 또는 다른 비-상보적인 DNA, 소혈청 알부민, 소듐 파이로포스페이트, 소듐 도데실설페이트(SDS), 폴리비닐-피롤리돈, 피콜 및 덴하트 용액. 덱스트란 설페이트 및 폴리에틸렌글리콜 6000은 용액으로부터 DNA를 차단하여, 이로써 주어진 단위 시간 내에 효과적인 탐침 DNA의 농도 및 혼성화 시그널을 증가시킨다. 일부 경우에, 비-특이적 및/또는 백그라운드 혼성화를 감소시키기 위하여 보다 강력한 스트린전시 조건이 바람직하거나 요구될 수 있다. 이들 조건들은 더 높은 온도, 더 낮은 이온 세기 및 포름아마이드와 같은 변성제의 더 높은 농도를 사용함으로써 구현될 수 있다.
스트린전시 조건들은 연관 관계가 먼 유기체들로부터의 상동 서열과 같은 꽤 유사성이 높은 단편들 또는 밀접하게 연관된 유기체들로부터의 기능 효소들을 복제하는 유전자와 같은 매우 유사성이 높은 단편들을 선별하도록 조절될 수 있다. 상기 스트린전시는 혼성화 단계 또는 혼성화 후의 세척 단계에서 조절될 수 있다. 염(예: NaCl)의 농도, 포름아마이드 농도, 혼성화 온도 및 탐침 길이는 (상기 식에서 기술한 바와 같은) 스트린전시를 변경하는데 사용될 수 있는 변수들이다. 일반적인 가이드라인으로, 듀플렉스가 150 염기쌍보다 많은 경우, 높은 스트린전시는 대개 Tm - 5℃ 내지 Tm - 20℃에서 수행되며, 중간 정도의 스트린전시는 Tm - 20℃ 내지 Tm - 35℃에서, 그리고 낮은 스트린전시는 Tm - 35℃ 내지 Tm - 50℃에서 수행된다. 혼성화는 낮은 스트린전시로부터 중간 정도의 스트린전시(Tm 보다 25-50℃ 낮은 온도)에서 수행되는데, 혼성화 후 세척 단계에서 스트린전시를 증가시킨다. 용액 내에서 최대의 혼성화 율은 DNA-DNA 듀플렉스의 경우에는 Tm - 25℃에서, RNA-DNA 듀플렉스의 경우에는 Tm - 15℃에서 일어난다는 것이 실험적으로 밝혀졌다. 선택사양으로, 후속의 더 높은 스트린전시의 세척 단계가 필요한지를 결정하기 위하여, 각각의 세척 단계 후에 해리 정도를 평가할 수 있다.
본원에 개시된 서열과 높은 일치성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 서열을 선별하기 위하여 높은 스트린전시 조건들이 사용될 수 있다. 100개 이상의 상보적인 잔기들을 갖는 상보적인 핵산의 혼성화에 대하여 서던 또는 노던 블롯과 같은 필터링에 기초한 방법으로 수득된 스트린전트 혼성화 조건들의 예는 특정 이온 세기 및 pH에서 특이적 서열에 대한 열 용융점(Tm) 보다 약 5 내지 20℃가 낮다. 혼성화를 위해 사용된 조건들은 약 0.02M 내지 약 0.15M의 염화나트륨, 약 0.5% 내지 약 5%의 카제인, 약 0.02%의 SDS 또는 약 0.1%의 N-로릴살코신, 약 0.001M 내지 약 0.03M의 시트르산나트륨, 약 50℃ 내지 약 70℃ 사이의 혼성화 온도를 포함할 수 있다. 보다 바람직한 조건은, 약 0.02M 염화나트륨, 약 0.5%의 카제인, 약 0.02%의 SDS, 약 0.001M의 시트르산나트륨, 약 50℃의 온도이다. 스트린전트 조건들 하에서 혼성화하는 폴리뉴클레오타이드 분자들은 전체 DNA 분자 또는 선택된 일부, 예를 들어 DNA의 특정 서열에 기초하는 프로브에 일반적으로 혼성화할 것이다.
스트린전트 염 농도는 보통 약 750mM NaCl 및 75mM 시트르산삼나트륨 미만이다. 증가된 스트린전트 조건들은 약 500mM NaCl 및 50mM 시트르산삼나트륨 미만에서 수득될 수 있으며, 보다 증가된 스트린전트 조건들은 약 250mM NaCl 및 25mM 시트르산삼나트륨 미만이다. 낮은 스트린전시 혼성화는 포름아마이드와 같은 유기 용매의 부재하에서 수득될 수 있는 반면, 높은 스트린전시 혼성화는 적어도 약 35% 포름아마이드, 및 보다 바람직하게는 적어도 약 50%의 포름아마이드의 존재하에서 수득될 수 있다. 스트린전트 온도 조건은 포름아마이드의 존재하에서 최소 약 30℃, 보다 바람직하게는 최소 약 37℃, 및 가장 바람직하게는 최소 약 42℃의 온도를 포함할 것이다. 혼성화 시간, 소듐 도데실 설페이트(SDS)와 같은 계면활성제의 농도 및 이온 세기와 같은 가변적인 추가 변수들은 당업자에 공지이다. 이들 다양한 조건들을 필요에 따라 결합함으로써 다양한 수준의 스트린전시가 얻어진다.
혼성화 후의 세척 단계들 또한 스트린전시를 변화시킬 수 있다; 혼성화 후의 세척 단계들은 최종 세척 용액의 온도 및 이온 세기를 가장 결정적인 인자로서 혼성화 특이도를 주로 결정한다. 세척 스트린전시는 염 농도를 낮추거나 세척 온도를 높임으로써 증가될 수 있다. 세척 단계에서의 스트린전시 염 농도는 약 30mM NaCl 및 3mM 시트르산삼나트륨 미만인 것이 바람직하며, 약 15mM NaCl 및 1.5mM 시트르산삼나트륨 미만인 것이 가장 바람직하다.
따라서, 본 전사 인자들을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 서열이나 보체들에 대한 일치성이 바람직한 수준 미만인 폴리뉴클레오타이드들을 결합하고 제거하는데 사용될 수 있는 혼성화 및 세척 조건들은 하기의 예:
65℃에서 6x SSC;
42℃에서 50% 포름아마이드, 4x SSC; 또는
65℃에서 0.5x SSC, 0.1% SDS
를 포함하며, 예를 들어, 세척 단계들을 10 내지 30분간 각각 2회 실시한다. 이들 조건들에 대한 유용한 변형들은 당업자에게 자명할 것이다.
당업자는 상술한 식에서 설정된 매우 높은 스트린전트 조건들이 구조적으로 유사한 폴리뉴클레오타이드를 산출하기 때문에 본 발명의 범주 내에 포함되는 폴리뉴클레오타이드 종들 사이에서 실질적인 변형을 예상하지는 않을 것이다.
원하는 경우, 세척 단계들을 훨씬 높은 스트린전시로 수행할 수 있는데, 65℃에서 약 0.2x SSC, 0.1% SDS의 조건으로 2회 세척을 하며 각 세척 단계는 약 30분으로 하는 경우를 포함하거나, 또는 65℃에서 약 0.1x SSC, 0.1% SDS의 조건으로 30분간 2회 세척하는 경우를 포함한다. 세척 용액의 온도는 보통 최소 약 25℃이며, 보다 높은 스트린전시의 경우에는 최소 약 42℃이다. 혼성화 스트린전시는 혼성화 단계에서와 같은 동일 조건을 사용하되 세척 온도를 약 3℃ 내지 약 5℃로 올려서 스트린전시가 추가로 증가될 수 있으며, 동일 조건을 사용하되 세척 온도를 약 6℃ 내지 약 9℃로 올림으로써 스트린전시가 추가로 더 증가될 수 있다. 덜 밀접하게 관련된 동족체의 식별을 위해서는 50℃와 같은 낮은 온도에서 세척 단계가 수행될 수 있다.
낮은 스트린전시를 갖는 세척 단계의 예로는 최소 25℃의 온도 및 30분 이상의 조건에서 30mM NaCl, 3mM 시트르산삼나트륨 및 0.1% SDS를 갖는 용액을 사용한다. 더 높은 스트린전시는 42℃에서 30분 이상, 15mM NaCl, 1.5mM 시트르산삼나트륨 및 0.1% SDS의 용액 조건으로 수득될 수 있다. 보다 더 높은 스트린전시를 갖는 세척 조건들은 15mM NaCl, 1.5mM 시트르산삼나트륨 및 0.1% SDS의 용액 조건으로 65℃ 내지 68℃에서 수득된다. 세척 단계들은 일반적으로 최소 2회의 최종 세척 단계를 수행한다. 이들 조건들에 대한 추가 변경들은 당업자들에게 자명할 것이다(참조예: 미국 특허 출원 제20010010913호).
스트린전시 조건들은 본 특허 출원일 현재 공지되어 있는 전사 인자를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대하여 완전히 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 혼성화에 대한 신호 대 잡음비 보다, 코딩 올리고뉴클레오타이드에 대하여 완전히 상보적인 올리고뉴클레오타이드의 코딩 올리고뉴클레오타이드에 대한 혼성화의 신호 대 잡음비가 약 5-10배 더 크도록 선택될 수 있다. 더 높은 신호 대 잡음비, 다시 말해 약 15배 이상의 비가 얻어지도록 특정 분석에 대한 조건을 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 알려진 폴리펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드에 대한 코딩 올리고뉴클레오타이드의 혼성화와 비교하여 최소 2배 이상의 신호 대 잡음비를 갖도록 본 실험의 폴리뉴클레오타이드는 특정 코딩 올리고뉴클레오타이드와 혼성화할 수 있을 것이다. 특정 신호들은 적절한 분석에 사용되는 표지, 예를 들어 형광 표지, 비색 표지, 방사성 표지 등에 의존할 수 있다. 관련된 폴리뉴클레오타이드 서열을 검출하기 위한 표지된 혼성화 또는 PCR 프로브는 올리고레이블링, 닉 트랜슬레이션(Nick translation), 엔드-레이블링 또는 표지된 뉴클레오타이드를 사용한 PCR 증폭에 의하여 수득될 수 있다.
본 발명에 의해 포함되는 것은 다양한 스트린전시 조건 하에서 폴리뉴클레오타이드 및 이의 단편에 혼성화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열이다(예를 들어, Wahl 및 Berger(1987) Methods Enzymol. 152: 399-407, 및 Kimmel(1987) Methods Enzymol. 152: 507-511). 일치성의 평가는 당업자들에 의해 잘 이해되는 스트린전시 조건 하에서 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 혼성화에 의해 제공된다(Hames 및 Higgins, Editors (1985) Nucleic Acid Hybridisation: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, U.K.). 스트린전시 조건들은 연관 관계가 먼 유기체들로부터의 상동 서열과 같은 꽤 유사성이 높은 단편들 또는 밀접하게 연관된 유기체들로부터의 기능 효소들을 복제하는 유전자와 같은 매우 유사성이 높은 단편들을 선별하도록 조절될 수 있다. 혼성화 후의 세척은 스트린전시 조건들을 결정한다.
본 발명의 특징 및 용도
서열분석(시퀀싱: sequencing )
일 구현예에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드의 서열 분석을 수행하는데 사용될 수 있다. 상기 분석은 하나의 분석이 하나의 장소에서 이루어질 수 있다는 점에서 선행 기술 및 현행 기술에 대하여 우위를 가지는데, 이로 인해 반응제, 기질, 리포터 분자 등에 대하여 막대한 비용 절감을 가져온다. 또 다른 장점은 시퀀싱 반응 및 생성된 신호의 신속성인데, 이로써 선행 기술에 대한 개선을 가져온다.
핵산을 서열분석하는 다른 방법들이 당해분야에 공지이며, 본 발명의 어떤 구현예에 실시하기 위하여 사용될 수 있다. 이들 방법들은 DNA 폴리머레이즈 I의 Klenow 단편, SEQUENASE, Taq DNA 폴리머레이즈 및 열안정성의 T7 DNA 폴리머레이즈(Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway NJ)와 같은 효소, 또는 폴리머레이즈 및 ELONGASE 증폭 시스템(Life Technologies, Gaithersburg MD)에서 사용되는 것과 같은 교정용 엑소뉴클레이즈의 조합을 사용한다. 바람직하게, 서열 준비는 HYDRA 마이크로디스펜서(Robbins Scientific, Sunnyvale CA), MICROLAB 2200 시스템(Hamilton, Reno NV), 및 DNA ENGINE 열 사이클러(PTC200; MJ Research, Watertown MA)와 같은 기계들로 자동화된다. 서열분석에 사용되는 기계들은 ABI PRISM 3700, 377 또는 373 DNA 서열분석 시스템(PE Biosystems), MEGABACE 1000 DNA 서열분석 시스템(Amersham Pharmacia Biotech) 등을 포함한다. 서열은 당해분야에 공지인 다양한 알고리즘을 사용하여 분석되며, 이는 Ausubel 등(1997; 분자생물학의 간단한 프로토콜, John Wiley & Sons, New York N.Y., unit 7.7) 및 Meyers(1995; 분자생물학 및 바이오테크놀로지, Wiley VCH, New York N.Y., pp.856-853)에 기술되어 있다.
샷건 시퀀싱(shotgun sequencing)은 복수의 소스들로부터 유도되어 클론된 삽입체로부터 많은 서열을 생성하는데 사용된다. 샷건 시퀀싱 방법은 당해분야에 공지이며 열안정적인 DNA 폴리머레이즈, 열에 불안정한 DNA 폴리머레이즈, 및 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드 분자의 좌우에 배치된 표현 영역으로부터 선택된 프라이머를 사용한다. 불완전하게 조립된 서열들은 당해분야에 공지인 CONSED(Gordon(1998) Genome Res. 8: 195-202)와 같은 다양한 알고리즘이나 프로그램을 사용하여 일치성을 위해 조사된다. 벡터 또는 키메릭 서열 또는 결실된 서열을 포함하는 오염된 서열들은 각각 제거되거나 복원될 수 있는데 상기 불완전하게 조립된 서열들을 완성된 서열들로 구성한다.
폴리뉴클레오타이드 서열의 확장
본 발명의 서열은 당해분야에 공지인 PCR에 기초한 다양한 방법을 사용하여 확장될 수 있다. 예를 들어, XL-PCR 키트(PE Biosystems), 네스티드 프라이머(nested primer) 및 상업적으로 이용가능한 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리가 폴리뉴클레오타이드 서열을 확장하는데 사용될 수 있다. PCR에 기초한 모든 방법에 있어서, 프라이머들은 OLIGO 4.06 프라이머 분석 소프트웨어(National Biosciences, Plymouth MN)와 같은 상업적으로 이용가능한 소프트웨어를 이용하여 약 22 내지 30개 길이의 뉴클레오타이드 및 약 50% 이상의 GC 함량을 가지며, 약 55℃ 내지 약 68℃의 온도에서 타겟 분자에 어닐링하도록 고안될 수 있다. 조절 요소들을 복구하는 서열을 확장하는 경우에는, cDNA 라이브러리보다는 게놈 DNA를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서의 폴리뉴클레오타이드 용도
혼성화
폴리뉴클레오타이드 및 이들 단편은 다양한 목적을 위해 혼성화 기술에 사용될 수 있다. 프로브는 5' 조절 영역과 같은 고유 영역 또는 수용체 특성과 같은 보존된 모티프로부터 고안되거나 유도될 수 있으며, 프로토콜에 따라 폴리뉴클레오타이드 단백질, 대립형질 변종 또는 관련 분자들을 인코딩하는 자연발생적인 분자를 동정하는데 사용될 수 있다. 상기 프로브는 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 대개 단일 가닥으로 되어 있고 폴리뉴클레오타이드 서열들 중 어느 하나와 최소 50% 이상의 서열 일치성을 가져야만 한다. 혼성화 프로브는 올리고레이블링, 닉 트랜슬레이션, 엔드-레이블링 또는 표지된 뉴클레오타이드의 존재 하에서의 PCR 증폭을 사용하여 수득될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 또는 그 단편을 포함하는 벡터는 RNA 폴리머레이즈 및 표지된 뉴클레오타이드의 첨가에 의해 체외에서 mRNA 프로브를 생성하는데 사용될 수 있다. 이들 절차들은 Amersham Pharmacia Biotech사에 의해 제공되는 것과 같은 상업적으로 이용가능한 키트들을 사용하여 수행될 수 있다.
혼성화의 스트린전시는 프로브의 G+C 함량, 염 농도 및 온도에 의해 결정된다. 특히, 스트린전시는 염 농도를 줄이거나 혼성화 온도를 올림으로써 증가될 수 있다. 일부 멤브레인에 기초한 혼성화에 대해 사용되는 용액에서, 포름아마이드와 같은 유기 용매의 첨가는 반응이 더 낮은 온도에서 일어나도록 한다. 혼성화는 60℃에서 1%의 소듐 도데실 설페이트(SDS)를 함유하는 5x SSC와 같은 완충액으로 낮은 스트린전시에서 수행될 수 있는데, 이는 폴리뉴클레오타이드 서열들 사이에 일부 미스매치를 포함하는 혼성화 복합체가 형성되게 한다. 후속의 세척과정이 45℃(중간 정도의 스트린전시) 또는 68℃(높은 스트린전시)에서 0.1% SDS를 포함하는 0.2x SSC와 같은 완충액으로 높은 스트린전시에서 수행된다. 높은 스트린전시에서, 혼성화 복합체는 폴리뉴클레오타이드들이 완전히 상보적인 경우에만 안정적이 된다. 일부 멤브레인에 기초한 혼성화에서, 혼성화가 수행되는 온도를 낮추기 위하여 바람직하게는 35%, 또는 가장 바람직하게는 50%의 포름아마이드를 혼성화 용액에 첨가할 수 있으며, 살코실(Sarkosyl) 또는 Triton X-100 및 변성된 연어 정자 DNA와 같은 차단제의 사용으로 백그라운드 신호를 감소시킬 수 있다. 혼성화를 위한 구성 요소들 및 조건들의 선택은 당업자들에게 공지이며, Ausubel(supra) 및 Sambrook 등((1989) 분자 클로닝, 실험 매뉴얼, Cold Spring Harbor Press, Plainview NY)의 문헌에 개설되어 있다.
마이크로어레이는 당해분야에 공지인 방법들을 사용하여 제조되고 분석될 수 있다. 올리고뉴클레오타이드는 마이크로어레이에서 프로브 또는 타겟으로 사용될 수 있다. 상기 마이크로어레이는 동시에 다량의 유전자들의 발현 수준을 관찰하여 유전적 변종, 돌연변이 및 단일염기 다형성을 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 정보들은 유전자 기능을 판정하고; 질병, 질환 또는 기능장애의 유전적 기초를 이해하도록 하며; 질병, 질환 또는 기능장애를 진단하고; 및 치료제들의 활성을 개발하고 관찰하는데 사용될 수 있다(참조예: Brennan 등(1995) 미국특허 제5,474,796호; Schena 등(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. 93: 10614-10619; Baldeschweiler 등(1995) PCT 출원 WO95/251116; Shalon 등(1995) PCT 출원 WO95/35505; Heller 등(1997) Proc. Natl. Acad. Sci. 94:2150-2155; 및 Heller 등(1997) 미국특허 제5,605,662호).
혼성화 프로브는 또한 자연발생적인 게놈 서열을 맵핑하는데에도 유용하다. 상기 프로브는 하기에 혼성화될 수 있다: (a) 특정 염색체, (b) 염색체의 특정 영역, 또는 (c) 인간 인공 염색체(HAC), 효모 인공 염색체(YAC), 박테리아 인공 염색체(BAC), 박테리아 P1 구조물 또는 단일 염색체 cDNA 라이브러리와 같은 인공 염색체 구조물.
분석을 위한 분자들의 표지
매우 다양한 표지법 및 접합법이 당업자에게 공지이며, 다양한 핵산, 아미노산 및 항체 분석에 사용될 수 있다. 표지된 분자들의 합성은 32P-dCTP, Cy3-dCTP 또는 Cy5-dCTP와 같은 표지된 뉴클레오타이드 또는 35S-메싸이오닌과 같은 아미노산을 포함하는 Promega(Madison WI)사 또는 Amersham Pharmacia Biotech사의 키트를 이용하여 달성될 수 있다. 뉴클레오타이드 및 아미노산은 형광, 화학발광 또는 발색제 등을 포함하는 다양한 물질에 의해 직접 표지될 수 있는데, BIODIPY 또는 FITC(Molecular Probes, Eugene OR)와 같은 반응제를 사용하여 분자 내에 존재하는 아민, 싸이올 및 다른 작용기와의 화학적 컨쥬게이션에 의해 표지될 수 있다.
폴리머-결합 거대분자를 반복적으로 탐지하기 위한 단일 테더링 폴리머의 피드백 제어
본 절에서는 Klenow 단편(KF) 폴리머레이즈의 기본 메커니즘과 DNA 주형으로부터 KF의 해리가 어떠한 방식으로 포어 전류 진폭 및 발생건 체류시간(event dwell time)의 관찰에 의하여 검출될 수 있는지를 설명한다. 또한, KF에 의하여 첨가될 다음 염기의 존재가 장기 체류시간을 갖는 발생건(예를 들어, 이에 제한되지는 않지만 ＞20msec)의 존재를 통하여 구해질 수 있다. 그 후, 상기 장기 체류시간을 갖는 발생건은 유한 상태 기계(FSM)에 의한 가변적 전압 제어를 사용하여 검출되고 반응될 수 있다.
나노포어에 포획된 DNA 헤어핀에 결합된 KF는 DNA 헤어핀만이 존재하는 경우와 전류 진폭의 측면에서 차등화될 수 있다. 또한, DNA 헤어핀에 결합될 다음 염기의 존재는 발생건 체류시간에 기초하여 식별될 수 있다. 다른 DNA/효소 구성을 검출하고 반응하는 능력 및 KF에 의해 촉매화되는 염기를 식별하는 능력은 비록 추가적인 검출 및 제어의 정확성이 요구된다고 할지라도 효소 기능의 제어 및 나노포어에 기초한 서열분석 방법의 개발에 있어서 강한 동기유발이 된다.
나노포어 시스템을 사용한 단일 DNA 헤어핀 분자들의 자동화된 검출 및 제어를 지금부터 설명한다. 단일 DNA 분자들의 정확한 제어는 나노포어에 기초한 서열분석에 사용되는 것과 같은 다중 서열 염기 식별을 수행하기 위하여 필수적이다. DNA 헤어핀 발생건(event)이 검출되고 그 체류시간이 조절될 수 있음이 알려졌다. 제공되는 결과들은 나노포어에 포획된 DNA의 하나의 단편과 반복되는 효소 결합 발생건의 조절에 필요한 제어 수준임을 증명한다.
개별적인 DNA 헤어핀은 나노포어 전류 시그널의 진폭에 기초하여 검출되고 제어될 수 있음이 알려졌다. 상기 DNA 헤어핀의 체류시간은 포어 내의 헤어핀의 검출시 인가된 전압을 감소시킴으로써 연장될 수 있다. 더 긴 체류시간은 기계 학습법(machine learning method)을 사용하여 상기 헤어핀의 말단 염기쌍을 식별하는데 사용될 수 있는 보다 많은 시그널을 제공한다(참조: Vercoutere 등(2001) Nat. Biotechnol, 19(3): 248-252; 및 Akeson(2003) Nucleic acids research, 31: 1311-1318). 여기에 증명되는 제어의 확장은 다음 장에 보는 바와 같이, 단일 DNA 헤어핀이 복수의 효소들을 포획하는데 사용될 수 있도록 한다.
실시예 XX 내지 XXX에서, 단일 DNA 헤어핀에 효소들이 반복해서 포획됨이 증명되었다. 복수의 효소 실험들은, 측정될 분자들에게 수동적인 결합을 필요로 하는 원자력 분광기기(AFM) 및 광학 집게(optical tweezer) 방법과 비교할 때 신속하고 더 높은 수율로 수행될 수 있다(참조: Elio 등(2005) Nature, 438(7067): 460-465; 및 Greenleaf 및 Block(2006) Science, 313(5788): 801). DNA/효소 상호작용을 신속하게 탐지하는 능력은 나노포어에 기초한 서열분석에 대해 보다 큰 동기를 부여한다.
반복되는 KF의 포획에 대한 단일 DNA 헤어핀의 기본적인 검출 및 제어가 증명되었다. 효소 해리의 실시간 검출은 이원 및 삼원 복합체의 위치 이동시 발생하는 나노포어 전류 시그널에 존재하는 터미널 단계를 인식함으로써 이루어질 수 있다. DNA의 단일 조각을 사용하여 효소를 반복적으로 탐침하는 것은 나노포어를 사용하여 긴 서열의 DNA를 신속하게 해독하는데 필요한 기계적인 작동을 달성한다. KF에 의한 단일 염기 첨가를 조절하기 위해 많은 작업들이 필요하며, 이는 또한 나노포어를 사용하는 서열분석을 위해서도 필요하다. 본원에 제공되는 터미널 단계 검출 방법은 만족할 만한 결과를 제공하지만, 효소 피싱(fishing)을 사용하는 서열분석을 실용화하기 위해서는 검출 오류를 더 줄여야 한다.
효소 피싱 메커니즘에 대한 개선점들이 제안되어 왔다. 통계적인 복잡성을 줄이고 시그널의 평활을 개선하기 위하여 이전에 사용된 이동 평균 필터 대신에 지수 가중 이동 평균 필터가 이를 대체한다. 각각의 검출된 효소 발생건이 신규 효소 결합 발생건임을 보증하기 위하여 피싱을 확인할 수 있는 효소의 해리 상태가 단독의 DNA 헤어핀으로 검사된다. 이는 모델이 신규의 효소 결합 발생건이라고 가정하기 때문에 서열분석을 위한 통계적 모델 용도로 중요하다. 더 높은 신호 대 잡음비는 더 높은 제어 전압을 사용할 수 있게 하는 보다 긴 DNA 헤어핀을 사용함으로써 달성될 수 있다. DNA/효소의 비결합에 대한 신뢰성 있는 검출 및 작용은 반복된 효소 발생건 데이터로부터 정확한 염기 식별을 가능하게 할 것이다.
진단
폴리뉴클레오타이드, 단편들, 올리고뉴클레오타이드, 상보적인 RNA 및 DNA 분자 및 PNA는 변형된 유전자 발현, mRNAs의 발현의 과잉, 존재/부재를 검출하고 정량화하거나, 치료 기간 동안 mRNA 수준을 관찰하는데 사용될 수 있다. 변형된 유전자 발현과 관련된 질병, 질환 또는 기능장애는 특발성 폐동맥 고혈압, 속발성 폐 고혈압, 세포 증식 기능장애, 악성뇌교종, 성상세포종, 희소별아교세포종, 교모세포종, 뇌수막종, 신경절신경종, 뉴런 종양, 다발성 경화증, 헌팅턴병, 유방선암, 전립선암, 위선암, 전이성 신경내분비암, 비증식성 섬유낭종성 및 증식성 섬유낭종성 유방질환, 담낭염 및 담석증, 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염; 후천성 면역 결핍증(AIDS), 애디슨병, 성인 호흡장애 증후군, 알레르기, 강직성 척추염, 유전분증, 빈혈, 천식, 죽상동맥경화증, 자가면역성 용혈빈혈, 자가면역성 갑상선염, 양성 전립선 비대증, 기관지염, 체디악-히가시 증후군, 담낭염, 크론씨병, 아토피 피부병, 피부근염, 당뇨, 폐기종, 태아적아구증, 결절성 홍반, 위축성 위염, 사구체 신염, 굿페스쳐증후군, 통풍, 만성 육아종, 그레이브스병, 하시모토 갑상선염, 과호산구 증가증, 과민성대장 증후군, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심근 및 심장막 염증, 골관절염, 골다공증, 췌장염, 다낭성 난소증후군, 다발성 근염 및 피부근염, 건선, 라이터증후군, 류마티스 관절염, 피부 경화증, 중증 복합형 면역결핍증(SCID), 쇼그랜 증후군, 전신 아나필랙시스, 루푸스, 경피증, 혈소판감소성 자반병, 궤양성 대장염, 포도막염, 베르너 증후군, 혈액 투석, 체외순환법, 바이러스, 박테리아, 진균, 기생충, 원충 및 구충 감염; 프로락틴 생성 기능장애, 난관질환, 배란장애 및 자궁내막증을 포함하는 불임, 발정주기의 훼손, 생리주기의 훼손, 다낭성 난소증후군, 과배란 증후군, 자궁내막 또는 난소 종양, 자궁근종, 자가면역성 질환, 자궁 외 임신 및 기형발생; 유방암, 섬유낭종성 유방 질환 및 유즙누출증; 정자형성의 훼손, 정자의 생리 기능 이상, 양성 전립선 비대증, 전립선염, 음경 만곡증, 발기부전, 여성 유방증; 광선 각화증, 동맥경화증, 윤활낭염, 간경변증, 간염, 혼합성 결체조직 질환(MCTD), 골수섬유증, 발작성 야간혈색뇨증, 진성 적혈구증가증, 원발성 혈소판증가증, 암의 합병증, 선암, 백혈병, 림프종, 흑색종, 골수종, 육종, 기형암종을 포함하는 암 및 특히 부신암, 방광암, 골암, 골수암, 뇌암, 유방암, 자궁경부암, 담낭암, 신경절암, 위장관암, 심장암, 신장암, 간암, 폐암, 근육암, 난소암, 췌장암, 부갑상선암, 음경암, 전립선암, 침샘암, 피부암, 비장암, 정소암, 흉선암, 갑상선암 및 자궁암을 포함한다. 다른 관점에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드이다.
폴리뉴클레오타이드, 단편, 올리고뉴클레오타이드, 상보적인 RNA 및 DNA 분자들 및 PNA 또는 이의 단편은 변형된 유전자 발현; mRNA의 부재, 존재 또는 과다발현을 검출하고 정량화하는데 사용되거나; 또는 치료기간 중의 mRNA 양을 관찰하는데 사용될 수 있다. 변형된 유전자 발현과 관련된 기능장애는 정좌불능, 알츠하이머 질환, 기억상실증, 루게릭병, 운동실조증, 조울증, 긴장병, 뇌성마비, 뇌혈관 질환, 크로이츠펠트-야콥병, 치매, 우울증, 다운증후군, 지발성 안면마비, 근육긴장이상, 간질, 헌팅턴병, 다발성 경화증, 근이영양증, 신경통, 신경섬유종증, 신경장해, 파킨슨병, 픽병(Pick's disease), 망막세포변성, 정신분열증, 계절성 우울증, 노인성 치매, 발작, 투렛 증후군 및 특히 뇌에 발생하는 선암, 흑색종 및 기형종을 포함하는 암을 포함한다. 또한, 이들 cDNAs는 상술한 질환 및 수 일에서 수 개월의 기간에 대하여 발생하는 다른 뇌의 기능장애, 질환 및 질병들에 대한 치료 효능의 마커로서 이용될 수 있다. 진단 분석법은 변형된 유전자 발현을 검출하기 위하여 환자의 생물학적 샘플과 정상인의 샘플을 비교하는 혼성화 또는 증폭 기술을 사용할 수 있다. 이러한 비교를 위한 정성적이거나 정량적인 방법은 당해분야에 잘 알려져 있다.
진단 분석법은 변형된 유전자 발현을 검출하기 위하여 환자의 생물학적 샘플과 정상인의 샘플을 비교하는 혼성화 또는 증폭 기술을 사용할 수 있다. 이러한 비교를 위한 정성적이거나 정량적인 방법은 당해분야에 잘 알려져 있다.
예를 들어, 폴리뉴클레오타이드 또는 프로브는 표준 방법들에 의해 표지될 수 있으며, 혼성화 복합체의 형성을 위한 조건하에서 환자의 생물학적 샘플에 결합될 수 있다. 배양이 끝난 후, 상기 샘플을 세척하고 혼성화 복합체와 결합된 표지(또는 시그널)의 양을 정량하여 정상치와 비교한다. 환자 샘플의 표지량이 정상치에 비해 현저히 다른 경우라면, 관련 질환, 질병 또는 기능장애가 있을 것으로 추측된다.
유전자 발현과 관련된 질환, 질병 또는 기능장애의 진단을 위한 기초를 제공하기 위하여, 정상 또는 표준 발현 분석표를 정립시킨다. 이는 정상의 피검체, 즉 동물이나 인간으로부터 취한 생물학적 샘플을 혼성화 또는 증폭을 위한 조건하에서 프로브와 결합함으로써 얻어질 수 있다. 표준 혼성화는 정상 피검체를 사용하여 수득된 값과 실질적으로 정제된 타겟 서열의 양을 사용하는 실험에서 수득된 값을 비교함으로써 정량할 수 있다. 이러한 방식으로 수득된 표준값들은 특정 질환, 질병 또는 기능장애에 대한 증상을 나타내는 환자의 샘플에서 수득된 값과 비교될 수 있다. 표준값으로부터 특정 질환과 관련된 값쪽으로의 편차는 그 질환을 진단하는데 사용된다.
이러한 분석법들은 또한 동물 실험 및 임상 실험에서 특정 치료를 한 효과를 평가하는데 사용될 수 있거나 개별 환자의 치료상태를 관찰하는데 사용될 수 있다. 일단 질환이 발병해서 치료 프로토콜이 시작되면, 진단 분석법은 환자의 발현량이 정상 피검체에서 관찰되는 양에 근접해지기 시작하는지를 판단하기 위하여 정기적으로 계속 반복될 수 있다. 계속되는 분석법으로부터 수득된 결과들은 수 일 내지 수 개월에 걸친 기간 동안의 치료 효과를 보여주는데 사용될 수 있다.
리간드의 정제
폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편은 샘플로부터 리간드를 정제하는데 사용될 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편을 사용하여 리간드를 정제하는 방법은 특이적 결합을 가능하게 하는 조건하에서 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편을 샘플과 결합시키는 단계, 특이적 결합을 검출하는 단계, 결합된 단백질을 복구하는 단계 및 정제된 리간드로부터 폴리뉴클레오타이드를 분리시키는 적절한 제제를 사용하는 단계를 포함한다.
부가 실험에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 아직 개발중인 분자 생물학 기술에 의해 사용될 수 있는데, 상기 신규 기술은 현재 알려진 폴리뉴클레오타이드의 특성에 의존한다면 무방하며, 예를 들어 이에 제한되지는 않지만 트리플렛 유전 코드 및 특이적인 염기쌍 상호작용과 같은 특성을 포함한다.
참조번호
1. 포어 또는 포어 구경 2. 기질 또는 구조물
3. 화합물 4. 거대분자
5. 제1 폴리머 6. 불완전하게 합성된 폴리머의 일부
7. 모노머
8. 실질적으로 완전하게 합성된 폴리머
9. 친화력이 높은 결합 부위 10. 리간드
11. 생성물 12. 제2 폴리머
13. 제3 모노머 14. 포어 분자 또는 채널 분자
15. 혼합신호 웨이퍼 16. 전기화학층
17. 오리피스 18. 금속화 조성물
19. 금속 20. 박막 또는 지질 이중층
21. 포획된 가스(예: 질소) 22. 지질 단일층
23. 액체 또는 수용액(제1) 24. 챔버 또는 웰
25. 액체 또는 수용액(제2) 26. 금 전극(선택사양)
본 연구진이 알고 있는 한, 본 연구진은 나노포어 내에서 복합체들을 제어하고 측정하는 FPGA를 사용하는 최초의 연구원들이다(참조: Hornblower 등(2007) Nature Meth. 4: 315-317). 본 연구진은 적절한 마이크로프로세서를 갖고도 유사한 기능이 달성될 것으로 믿고 있다. FSM 로직은 DNA 헤어핀의 블런트 말단의 최종 염기쌍을 식별하는데 사용되는 기계 학습 접근법의 일부로 사용되어져 왔다(참조: Vercoutere 등(2001) Nat. Biotechnol, 19(3): 248-252; Winters-Hilt 등(2003) Biophys. J., 84(2): 967-976). 이는 주요 역할이 오프라인으로 기계 학습 모델을 다룬다는 점에서 FSM의 적용예와 많이 다른데; 본 발명의 FSM 기능은 온라인의 전압 제어를 위해 사용된다.
나노포어 내에서 ssDNA를 (효소가 없는 상태에서) 직접 제어하는 것이 증명되었는데(Bates 등(2003) Biophysical Journal, 84: 2366-2372), 여기에서 DNA의 검출은 한계양에 대한 원천 진폭(raw amplitude)을 관찰함에 따라 이루어진다. Wilson 등((2008) ibid)에 사용된 것과 비교할 만한 전압 레벨 변화는 ssDNA-포어의 상호작용에 영향을 미치는 전압을 0 내지 낮은 전압 사이에서 탐색하도록 명령되었다. 원천의 이온 전류 진폭을 한계치로 설정하는 것과 대조적으로, 본 발명의 접근법은 실시간으로 전류를 필터링한다(실시예에서 상세하게 설명한다).
단일 분자를 탐지하고 조작하는 대안적인 방법은 광학 집게 및 원자력 현미경(참조: Bustamante 등(2003) Nature, 421: 423-427)을 포함한다. 예를 들어, 광포획(optical trapping) 방법이 가공된 효소를 폴리스티렌 비드에 부착하여 DNA 서열을 분석하는데 사용되어졌다(참조: Abbondanzieri 등(2005) Nature, 438(24): 460-465; 및 Greenleaf 및 Block(2006) Science, 313: 801). 현재 단일 DNA 분자 중합화의 더 큰 시공간적인 해상도가 나노포어에 의해 달성되었다. 그러나, 이들 방법들은 일반적으로 보다 많은 준비 단계들을 필요로하여 통상의 시간 주기동안 훨씬 적은 수의 분자들이 분석될 수 있다.
본 발명은 나노포어 내에 지지된 단일 테더링(tethering) DNA 분자의 피드백 제어를 사용하여 각각의 DNA-결합 효소가 포획되고 이어서 해리되는 반복 과정을 제어한다. 본 발명의 수행에 대한 2가지 측면이 있다.
첫째, 단일 및 이중 가닥 부분을 갖는 하나의 DNA 분자가 단일 가닥의 말단에 의해 포획된 후, 단일-가닥 부분이 트랜스 쪽과 이중-가닥을 형성함으로써 테더링된다. 이러한 구성에서, 채널의 시스 및 트랜스 양쪽 모두에 있는 이중-가닥 단편으로 인해, 충분한 전압이 상기 이중-가닥 단편을 시스에서 트랜스쪽으로 보낼때까지 DNA는 상기 채널 내에 머무르게 된다. 상기 채널 내의 단일 가닥 단편의 길이는 음전압 하에서 시스 챔버 내의 단일 가닥 대 이중 가닥(ss-ds) 결합의 노출이 충분히 KF 결합에 이용될 수 있도록 선택된다.
두번째 측면으로, 상기 테더링 DNA는 나노포어의 시스 챔버 내에서 KF 효소가 반복적으로 결합되고 해리되는 데 사용된다. 낚시에 비유하면, 상기 DNA는 낚시줄과 미끼이며(ss-ds 결합은 낚시바늘), 상기 효소들은 물고기이다(한번에 하나밖에 잡을 수 없다). 본 발명의 장치, 제어 로직, 문헌 내 관련 접근법 및 나노포어 내의 테더링 DNA 분자에 대한 반복된 KF 결합의 초기 데모에 대하여 상세하게 설명한다.
테더링 DNA 성능의 효과 및 정교성
DNA 또는 RNA에 결합하거나 수식하는 효소들(예: 엑소뉴클레이즈, 카이네이즈 및 기타 폴리머레이즈)과 나노포어 내에 포획된 DNA 또는 RNA와의 상호작용을 조사하는데 있어서, 본 연구진은 본원에 개시된 발명이 하기의 기술적 효과들을 가질 것으로 생각한다:
◈ 수득된 데이터들의 실질적인 증가: 테더링 구성에서, 음 전압은 피싱 모드에서 사용되고, 양 전압은 탐침 모드를 위해 사용된다. 탐침 모드에서, 원하는 탐침 전압하에서 이온 전류 내에 포함되는 모든 정보는 폴리머만의 특성화 또는 폴리머-효소 상호작용의 특성화를 위하여 사용될 수 있다. 비-테더링 구성에서는, 독립적인 발생건들(포획, 나노포어 차단 및 최종 폴리머의 이동을 포함)이 폴리머만의 분석 또는 폴리머-효소 상호작용의 분석과 관련된 정보를 함유한다. 각 분자의 포획을 위해 충분한 전압이 요구되며, 각 발생건들 사이의 시간은 제어할 수 없고, 낮은 포획 전압은 각 발생건들 사이의 시간을 증가시킨다. 따라서, 테더링 구성은 통상의 기간에 대하여 분석가능한 발생건들의 수를 늘리고 탐침 전압의 범위를 증가시킴으로써, 분석가능한 데이터의 양을 증가시킨다.
◈ 비-분석가능한 데이터의 감소: 탐침 모드에서, 이온 전류는 테더링 폴리머 단독 또는 상기 테더링 폴리머에 결합된 효소의 상호작용에 대한 정보를 포함한다. 비-테더링 구성에서는, 실험에서 기록된 발생건들의 50%까지가 조사 대상의 운동과는 관계없을 수 있다. 예를 들어, 포어의 시스쪽과 접하고 있는 DNA 헤어핀의 ds-말단에 의해 야기된 짧은 차단 현상이 비-테더링 구성에서는 데이터에 포함되지만, 테더링 구성에서는 그렇지 않다.
◈ 시스 챔버 내의 생물학적 요소들의 첨가를 실시간 검출하기 위한 나노포어 센서 민감도의 실질적인 증가: 실험 후 분석은 Mg2+ 보조인자 및 KF의 상보적인 dNTP 존재의 검출에 대한 나노포어 센서의 민감도를 증명한다. 두가지 모든 경우에서, 검출은 이원 및 삼원 복합체 발생건들의 KF-결합된 부분에 대한 체류시간의 증가에 기초한다. 실시간으로 발생건들의 KF-결합된 부분에 대한 체류시간을 관찰함으로써, 테더링 구성은 시스 챔버에 대하여 Mg2+의 첨가 및 상보적인 dNTP 요소들의 온라인에 의한 검출을 가능하게 하는 새로운 기능을 제공한다. 동일한 기능은 다른 효소들 및 그들과 상응하는 발생건에 민감한 요소들에게도 사용될 수 있다. 테더링 DNA와 KF의 장래 실험에서, 실시간 검출 기능은 피싱 시간, dNTP 농도, Mg2 + 농도 및 탐침 전압의 함수로 조사될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예들을 참고로 하여 보다 쉽게 이해될 수 있을 것이며, 이 실시예들은 본 발명의 특정 측면 및 구현예를 단순히 예시하기 위하여 포함된 것이지 본 발명을 제한하려는 의도에서 포함되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 구현예를 도시하는데, 폴리뉴클레오타이드에 대한 효소의 결합이 차단 프라이머에 의해 저지되는 것을 도시한다.
도 2는 본 발명의 일 구현예를 도시하는데, 폴리뉴클레오타이드에 대한 효소의 촉매 활성이 차단 프라이머에 의해 저지되는 것을 도시한다.
도 3은 본 발명의 일 구현예를 도시하는데, 폴리뉴클레오타이드에 대한 효소의 촉매 활성이 나노포어를 통과하는 Mg2 +의 주입으로 인해 활성화됨을 도시한다.
도 4는 본 발명의 일 구현예를 도시하는데, 단일 폴리뉴클레오타이드 분자의 서열을 결정하는 방법을 도시한다.
도 5는 본 발명의 일 구현예를 도시하는데, 단일 폴리뉴클레오타이드 분자의 서열을 결정하는 대안적인 방법을 도시한다.
도 6은 본 발명의 일 구현예를 도시하는데, 정해진 위치에 단일 분자들을 배치하는 방법을 도시한다.
도 7은 본 발명의 일 구현예를 도시하는데, 정해진 위치에 단일 분자들을 배치하는 대안적인 방법을 도시한다.
도 8은 본 발명의 일 구현예를 도시하는데, 정해진 위치에 단일 분자들을 배치하는 다른 대안적인 방법을 도시한다.
도 9는 본 발명이 어떻게 제조될 수 있는지에 대한 대표적인 구현예를 도시하는데, 2개의 배열 요소들의 측단면도를 도시한다.
도 10은 본 발명의 평면도를 도시하는데, 본 발명의 4개의 인접하는 요소들의 일부를 도시한다.
도 11은 본 발명의 일 구현예의 시스템을 개시하는 흐름도이다.
도 12는 지질 이중층 내로 삽입된 단일의 α-헤몰리신 단백질 채널(버섯 모양)을 도시한다. 인가된 전위하에서(트랜스-쪽 양성), K+ 이온이 시스 쪽으로 이동하며, Cl_ 이온이 트랜스 쪽으로 이동한다. 포어 채널의 연결통로(vestibule) 및 스템(stem)을 도시한다.
도 13은 나노포어와 DNA의 개념도(상부) 및 180mV의 전압이 인가된 경우에 20개의 염기쌍 헤어핀 DNA가 위치를 이동하는 동안 발생하는 전형적인 이온 전류 신호의 그래프(하부)를 도시한다. (I) 180mV에서 KCl 이온들이 열린 채널을 통하여 통과하여 ~64pA 전류가 흐르게 되었다. (II) 포어의 시스 개구부 내로 DNA 분자의 단일 가닥 말단의 포획이 일어난 경우, 이온의 흐름은 ~20pA로 감소되었다. (III) ~5msec 후에, 전압이 헤어핀 구조를 풀어, ssDNA가 포어를 통하여 트랜스 챔버 내로 통과되도록 하였는데, 상기 측정된 차단 현상이 완료되었다. 상기 차단 현상의 지속시간을 체류시간(dwell time)이라 부른다.
도 14는 나노포어 장치 내의 DNA, DNA/KF 복합체, 또는 DNA/KF/dNTP 복합체의 구별을 도시한다. (a)행은 DNA(36 뉴클레오타이드 5' 오버행 및 2',3'-다이데옥시시티딘 말단을 가진 14bp 헤어핀이며, n=0에서의 주형 염기는 C이다) 단독의 나노포어를 통한 위치이동을 도시하며, (b)행 및 (c)행은 각각 KF와의 복합체, 또는 KF 및 dGTP와의 복합체로부터의 14bphp의 위치 이동을 도시한다. 각각의 행에 대하여, 관련 복합체와의 나노포어 모식도(I열), 전류 변화(II열) 및 체류시간 경과 그래프(III열)가 나타내어져 있다. (IV)열에서 체류시간 데이터를 상용로그값으로 변환한 확률 막대 그래프가 실선으로 도시되어 있다. (c)의 체류시간 경과 그래프 및 (III)열을 자세히 분석하면, 가장 오래 머무는 체류시간은 22 내지 24pA 사이에 있음을 알 수 있다. 22 내지 24pA 사이의 발생건(event)들에 대한 열린 막대 그래프가 확률 히스토그램 (c) 상에 겹친다는 사실은 상기 선택된 범위가 장기 체류시간 발생건에 좌우됨을 보여준다.
도 15는 트랜스-쪽 프라이머를 어닐링함에 의한, 포획된 DNA 올리고머의 테더링(tethering)을 도시한다. a) 유한 상태 기계(FSM)가 위치 이동 현상에 대한 열린 채널 전류를 측정한다. b) 포획된 분자가 전류값을 감소시키게 만들며, 상기 FSM은 한계치 [15.75, 26.75]pA에 기초하여 발생건(DNA 또는 DNA/KF/dGTP)을 진단한다. 상기 발생건의 진단시, 상기 FSM은 인가 전압을 20초 동안 50mV로 감소시키는데, 이 시간 동안 20mer 프라이머가 5' 말단에 어닐링한다. 그림은 나노포어의 하부 반쪽의 확대도를 보여주며, 트랜스 챔버 내에 5' 말단과 20mer 프라이머가 있다.
도 16은 테더링 DNA 실험에서 시간 경과에 따른 이온 전류 신호의 변화를 도시한다. 초기 2초는 트랜스 챔버 내에서 5'-말단 프라이머가 어닐링하는 20초간의 테더링 대기 시간(50mV 인가전압)의 끝부분을 보여준다. 9개의 탐침 발생건을 갖는 t f ish =5초의 피싱타임이 사용되었음을 보여준다. 탐침 발생건 5번이 자세하게 확대되었는데, 터미널 단계 및 1.13msec 후의 후속의 터미널 단계 판정을 갖는, 효소 결합 발생건에 대해 자세하게 도시하고 있다. 효소와 결합된 발생건들이 ~100msec 정도 지속되므로, 본 실험의 피싱 모드에서 제어 로직이 가장 중요하다.
도 17은 나노포어 내의 테더링 DNA 분자의 피싱 및 탐침을 도시한다. a) t fish =0.521초의 피싱 모드이다. b) 탐침 모드이며, FSM은 한계치 [7.5, 15.5]pA로 DNA 단독 발생건이 진단될 때까지 150mV를 인가한다. 도시된 발생건에서 DNA 단독은 과도전류가 안정되자마자 진단되는데, DNA에 결합된 효소가 없으면 피싱 모드가 재시작된다. c) 피싱 모드.
도 18은 나노포어 내의 테더링 DNA 분자의 피싱 및 탐침에 대한 다른 방법을 도시한다. a) t fish =0.521초의 피싱 모드이다. b) 탐침 모드이며, FSM은 DNA 단독 발 생건이 진단될 때까지 150mV를 인가한다. 도시된 상황에서 효소가 결합된 DNA가 진단되며, FSM은 필터링된 진폭을 계속 관찰한다. c) [7.5, 15.5]pA 한계치를 사용하여 터미널 단계가 진단되며, 피싱 모드가 재시작된다. d) 피싱 모드.
도 19는 나노포어를 통한 DNA/KF 이원 복합체 및 DNA/KF/dGTP 삼원 복합체의 위치 이동에 대하여 제안된 메커니즘을 도시한다. a)는 삼원 복합체가 존재하는 경우의 전형적인 전류 흐름을 보여준다. a(i), a(ii) 및 a(iii)는 각각의 시그널 부분에 대한 시스템의 형태를 보여준다. b) 및 c)는 14bphp 단독에 대한 체류시간 발생건 도표 및 삼원 복합체 상황 내에 존재하는 터미널 단계를 각각 보여준다. 2개의 도표에서 체류시간의 유사성은 상기 터미널 단계가 KF 해리에 의한 것이라는 개념을 지지한다. d) 및 e)는 b) 및 c)와 동일한 상황에서 단지 20bphp에 대한 결과를 보여준다. f)는 DNA 단독 발생건 f(i) 및 DNA/KF 이원 복합체 발생건 f(ii)를 나란히 보여준다. 효소가 결합된 상황과 비교할 때, DNA 단독 상황에서는 터미널 단계가 없음에 유의하라.
도 20은 FPGA 제어하의 대표적인 삼원 복합체 발생건을 도시한다. a(i) 상기 FPGA가 [17.2pA, 22.8pA]의 검출 범위에서 효소 발생건을 진단하였다. a(ii) 상기 FPGA가 계속해서 전류를 관찰하여 최소 20msec 이상 검출 범위 내에 머무름을 확인하였다. 20msec 이상 지속되는 발생건들은 DNA/KF/dGTP의 삼원 복합체 발생건으로 진단하였다. a(iii) 삼원 복합체로 진단된 경우, 상기 FPGA는 5ms 동안 전압을 -50mV로 5ms동안 역인가하여 포어로부터 상기 복합체를 방출시켰다. 그 후, 180mV 포획 전압으로 복구되었다. b) FPGA로 제어된 경우(적색으로 표시된 527개의 총 발 생건) 및 FPGA로 제어되지 않은 경우(청색으로 표시된 155개의 총 발생건)에서의 24±2.8pA에 대한 체류시간 확률 히스토그램이다.
도 21은 FSM 제어를 사용한 20 염기쌍 헤어핀(bphp) 체류시간의 제어를 도시한다. (I) 적색 전류 시그널은 5㎑에서의 저역 통과 필터된 것이며, 청색 시그널은 평균 필터된 전류이며, 적색 전압 시그널은 명령전압이다. a) 일정한 180mV 전압, b) 체류시간 연장 제어 및 c) 체류시간 응집 제어 하에서의 전형적인 발생건들 및 해당 전압 시그널을 나타낸다. (II) DNA 발생건들에서의 발생 도표이며, 각 발생건에서의 체류시간 대 평균 진폭을 나타낸다. (III) 모든 발생건들에 대한 체류시간의 상용로그값의 확률 히스토그램(채워진 막대) 및 13 내지 18pA 범위 내의 부분 발생건 집합들에 대한 체류시간의 상용로그값의 확률 히스토그램(열린 막대)을 나타낸다.
도 22는 단일 폴리뉴클레오타이드 올리고머를 사용한 반복된 KF 결합 발생건들을 도시한다. a) 180mV에서 포획된 헤어핀 또는 KF와 결합된 헤어핀을 나타낸다. b) 트랜스-쪽 프라이머와의 어닐링을 위하여 50mV에서 헤어핀이 연결통로에 머물러 있다(20초). c) -20mV에서 5초간 KF와의 결합을 위한 피싱 모드. d) KF의 존재를 확인하기 위하여 180mV가 인가된다. 효소 결합이 일어나지 않으면, DNA만이 포어 내에 즉시 검출된다. 그렇지 않다면, FSM은 헤어핀을 연결통로에 놓아둔채, KF가 해리되기를 기다린다(20pA 터미널 단계). 모든 경우에, 일단 DNA만이 포어 내에 존재한다면, FSM은 헤어핀 염기쌍이 풀려 다른 KF를 피싱하기 전에 전압을 역인가한다(-20mV). 단계 c)와 d)는 헤어핀이 위치 이동하기 전까지 반복된다.
여기에선 거대분자 및 폴리양이온 또는 폴리음이온을 측정하는 능력을 보여주기 위하여 몇몇의 실시예들을 기술한다.
실시예 I: 차단 프라이머에 의한 효소 결합의 억제
본 방법의 예시에 대하여 도 1(a) 내지 1(g)를 참조하라. (a) 본 계획에서, 차단 프라이머가 벌크상에서 프라이머/주형에 결합된다. 삼원 복합체의 구조는 제1 뉴클레오타이드가 포함되는 타겟 DNA의 dsDNA 및 ssDNA 단편들 사이의 접합부에 효소가 결합하지 못하도록 한다. (b) 인가된 전압하(트랜스쪽 +)에서 차단된 프라이머/주형이 포획되어 ssDNA는 포어 내로 빠져나가고 dsDNA는 통로상에 놓여있다. 이러한 현상은 차단 프라이머의 말단에서의 루프가 상기 통로를 통과하기에는 너무 크기 때문에 일어난다. 전류는 이러한 상태로 복합체가 포획되었음을 보고한다. (c) 인가된 전압하에서, ssDNA 단편은 포어 내에서 트랜스쪽으로 빠져나오고, 계속해서 차단 프라이머와 주형 사이의 염기쌍을 풀어헤친다. 각 염기쌍을 독립적으로 푸는데 드는 에너지는 작으므로(약 2.5kcal/mol), 힘의 작용하에서 신속하게 진행된다. 이러한 풀어헤치는 과정동안 전류는 (b)에서와 동일한데, dsDNA 단편이 통로를 통과할 수 없기 때문이다. (d) 상기 풀어헤치는 단계 후에 차단 프라이머가 분리된다. 차단 프라이머가 없으므로, 타겟 DNA의 dsDNA 단편은 포어 통로를 통과할 수 있다. 이는 차단 프라이머의 분리 및 타겟 DNA의 활성화를 알려주는 어느 정도의 전류의 감소를 가져온다. (e) 역전압을 가하여, 활성화된 dsDNA/ssDNA 접합부를 효소 결합을 위하여 노출시킨다. 전압을 역으로 가함으로써, 음으로 하전된 DNA가 시스 구획으로 되돌아가게 된다. (f) 차단 프라이머가 없으므로, 효소는 목표 위치(본 실시예에서 dsDNA/ssDNA 접합부)에서 DNA에 결합할 수 있다. (g) 결합된 효소 또는 DNA 수식에 대해 탐침한다. 정해진 시간 후에(일반적으로 수백 밀리초 내지 수 초), 전압은 다시 한번 역으로 가해져서 본래의 극성을 띌 수 있으며, 이로써 DNA는 다시 나노포어 내로 끌려간다. 전류 수치는 효소가 결합되었는지(도시) 또는 DNA 듀플렉스 말단이 수식되었는지(미도시)를 판정하는데 사용될 수 있다. 결과가 얻어지지 않았다면, 단계 (e) 내지 (g)를 반복할 수 있다.
실시예 II: 차단 프라이머에 의한 효소 촉매작용의 억제
본 방법의 예시에 대하여, 도 2(a) 내지 2(g)를 참조하라. (a) 본 계획에서, 차단 프라이머가 벌크상에서 프라이머/주형에 결합된다. 삼원 복합체의 구조는 타겟 DNA에 효소가 결합될 수 있도록 하지만, 상기 주형과 함께 일어나는 촉매작용 및 변화는 억제된다. (b) 인가된 전압하(트랜스쪽 +)에서 차단된 프라이머/주형이 포획되어 ssDNA는 포어 내로 빠져나가고 dsDNA는 통로상에 놓여있다. 이러한 현상은 차단 프라이머의 말단에서의 루프가 상기 통로를 통과하기에는 너무 크기 때문에 일어난다. 전류는 이러한 상태로 복합체가 포획되었음을 보고한다. (c) 인가된 전압하에서, ssDNA 단편은 포어 내에서 트랜스쪽으로 빠져나오고, 계속해서 차단 프라이머와 주형 사이의 염기쌍을 풀어헤친다. 각 염기쌍을 독립적으로 푸는데 드는 에너지는 작으므로(약 2.5kcal/mol), 힘의 작용하에서 신속하게 진행된다. 이러한 풀어헤치는 과정동안 전류는 (b)에서와 동일한데, dsDNA 단편이 통로를 통과할 수 없기 때문이다. (d) 상기 풀어헤치는 단계 후에 차단 프라이머가 분리되어 복합 체를 활성화한다. 도 1에 개시된 계획과는 달리, 타겟 DNA의 dsDNA 단편은 차단 프라이머가 분리되더라도 포어 통로로 들어갈 수 없는데, 이는 결합된 효소가 너무 커서 통과할 수 없기 때문이다. 따라서 평균 전류는 변하지 않는다. (e) 인가된 전압을 감소시켜 효소가 이동하도록 한다. 분석을 위한 이온 전류가 충분히 잔존한다. (f) 상기 주형 가닥이 완전히 복제된다. (g) 상기 복합체가 분리되면 나노포어는 다른 DNA 타겟을 포획하고 활성화할 준비가 된다(참조: 단계 a).
실시예 III : 나노포어를 통한 Mg 2 + 의 주입에 의한 효소 촉매작용의 활성화
본 방법의 예시에 대하여, 도 3(a) 내지 3(c)를 참조하라. (a) 본 실시예의 계획에서, 시스 구획은 Mg2+를 제외하고는 DNA 폴리머레이즈 활성에 필요한 모든 요소들을 포함한다. 따라서, 촉매작용은 일어날 수 없다. (b) 전압이 가해지면(트랜스쪽 +), Mg2+가 포어를 통하여 시스 구획으로 이동된다. (c) DNA-폴리머레이즈 복합체가 포어에 의해 포획되는 경우, 상기 포어에 바로 인접한 공간 내의 Mg2+ 농도는 충분히 높기 때문에 효소의 촉매활성 부위 내 2개의 필수 위치에 Mg2+가 들어갈 수 있도록 한다. 그 후 복제될 가닥의 중합화가 일어날 수 있다. 벌크상에서의 삼원 복합체는 DNA 합성을 촉매할 수 없는데, Mg2+가 포어로부터 멀리 떨어져 있어서 Mg2+의 농도는 실질적으로 0이기 때문이다. 본 계획은 DNA 합성을 필요로하면서 충분히 작아 제어된 조건하에서 나노포어를 통과할 수 있는 여러 물질들에 적용될 수 있다.
실시예 IV: 생물학적 나노포어인 α-헤몰리신을 사용한 폴리머레이즈 활성의 측정
DNA 폴리머레이즈 I의 폴리머레이즈 활성은 Klenow 단편으로 불리는 보다 작은 구조 내에 거의 포함되어 있다. 본 적용에서는, 특정 염기 서열의 프라이머와 상보적인 염기쌍을 형성한 DNA(주형) 가닥에 상기 Klenow 단편이 결합될 수 있다. 단백질이 포어쪽으로 끌려와서 포어를 통한 이온 전류가 감소된다. 2개의 다른 효소 기능이 관찰될 수 있다. 1) 단백질이 프라이머-주형 복합체 상의 결합 부위로부터 분리된 경우, 특징적인 이온 전류의 일시적 감소가 얻어진다. 2) 효소가 알맞은 dNTP 기질에 의해 공급받는 경우, 포어 내 효소의 특징적인 체류시간의 증가가 얻어진다. 부정확한 dNTP 기질은 체류시간에 영향을 주지 않는다.
실시예 V: 수용체 단백질에 결합한 리간드의 검출
세포질 에스트라다이올(estradiol) 수용체는 가교결합제에 의해 형성된 것과 같이, 적절한 공유결합의 형성에 의해 100mer의 폴리아스파르트산과 공유적으로 결합된다. 상기 수용체는 음이온 형태의 폴리아스파르트산에 작용하는 전기장에 의해 3㎚ 직경의 질화규소 포어에 위치해 있다. 상기 포어는 포어 상의 금층(gold layer)에 부착된 이작용기의 알킬 설파이드 단일층을 갖는다. 위치를 잡은 후, 상기 수용체는 포어 상의 알킬기와 수용체 상의 시스테인기 사이에 다이설파이드 결합을 형성함으로써 상기 포어와 공유적으로 결합된다. 에스트라다이올이 존재하는 경우, 상기 수용체 상에서 높은 친화성을 갖는 부위와 결합하여 포어를 통한 이온 전류를 변화시키는데, 이로써 단일 분자의 감도로 이러한 스테로이드 호르몬을 검출하는 수단을 제공한다.
실시예 VI: 글루코스 옥시데이즈 활성의 검출
실시예 2에서 약술된 절차를 따라, 글루코스 옥시데이즈 분자가 질화규소 포어에 부착된다. 글루코스가 존재하는 경우, 글루코스가 활성 부위에 결합하고, 산화하며, 생성물을 방출함에 따라 효소 작용은 포어를 통하여 검출가능한 일시적인 이온 전류의 변화를 생성한다.
실시예 VII: 라이보좀 기능의 관찰
라이보좀 표본은 E.coli의 세포질 추출액과 같은 흔히 사용되는 해독 시스템에서 특정 mRNA에 노출된다. 상기 시스템은 라이보좀 기능을 저해하기 위하여 0℃ 근처로 유지한다. 대안적으로 라이보좀은 신장 인자 또는 tRNA와 같은 필요한 보조인자를 배제함으로써 불활성화될 수 있다. 단일 라이보좀이 mRNA에 결합하는 경우, 100mV 이상의 막 전압의 작용에 의해 포어를 통하여 mRNA가 끌려옴에 따라 포어에 위치할 수 있다. 그 후, 상기 혼합물을 신속하게 25℃로 가온하여 단백질 합성을 개시하거나 필요 보조인자를 첨가한다. 그런 다음, 단백질 합성의 개별 단계들은 포어를 통해 끌려온 mRNA에 의해 생성된 이온 전류에 대한 조합된 효과로 인해 관찰되는데, 해독 단계가 진행됨에 따른 라이보좀 작용 및 라이보좀의 주기적인 배열 변화가 관찰된다.
실시예 VIII: 고체 상태의 포어 내에 α-헤몰리신 채널의 배치
헵타머의 형태로 알파 헤몰리신 채널이 리포좀 막 내에서 조합된다. 조합이 완료된 후, 하나의 말단에 스트렙타비딘 분자를 갖는 DNA 100mer가 결합되고 리포좀 막에 걸쳐 일시적인 막 전위가 내부에 양으로 형성된다. 이렇게 하기 위한 하나의 방법은 헤몰리신 채널을 통과할 수 있는 양이온 및 크기로 인하여 통과할 수 없는 음이온을 갖는 염을 첨가하는 것이다. 막 전위는 헤어핀의 자유 말단을 포어 내로 끌어당긴다. 스트렙타비딘의 구조로 인하여, DNA는 포어를 통하여 통과할 수 없지만, 대신 헤몰리신과 복합체를 형성한다. 그 후, DNA 가닥이 결합된 헵타머는 공개된 문헌의 절차에 의해 분리되고, 5㎚ 포어를 갖는 질회규소막의 시스 쪽에 부착된다. 100mV 이상의 전압이 가해지고, 전기영동은 헤몰리신 헵타머의 몸체로부터 돌출된 DNA 가닥을 포어 내로 끌어당긴다. 그런 다음, 헤몰리신 헵타머는 실시예에 기술된 바와 같이 포어와 공유적으로 결합한다. 그 후, 유도 DNA 가닥은 인가된 전위의 극성을 역으로 함으로써 제거되며, 비로소 헤몰리신-질화규소막이 바이오센서로 응용되기 위한 고해상도의 나노포어로 사용될 수 있다.
실시예 IX: DNA-결합 효소를 반복적으로 탐침하기 위한, 나노포어 내에 지지된 단일 테더링 DNA 분자의 피드백 제어
생물학적 나노포어 장치에서, KCl 용액 내의 50-100㎛ 테플론 구경에 걸쳐 평면의 지질 이중층이 형성되며, 단일 α-헤몰리신 단백질 채널이 상기 평면 지질 내로 자체 삽입된다. 상기 채널(포어)은 길이가 15㎚이며 직경은 다양하다. 포어의 시스쪽 개구부는 폭이 2.6㎚이며, 연결통로(vestibule)에서는 3.6㎚이다가 스템(stem)의 시작부분에서는 최소 1.5㎚로 좁아진다. 스템의 끝 부분에서 트랜스 개구부까지의 폭은 2㎚이다. 상기 통로는 이중-가닥 DNA(dsDNA)가 들어가기에 충분히 크지만, 제한적인 스템에서는 단일-가닥 DNA(ssDNA)만이 통과할 정도의 폭이다. 염화은 전극이 포어를 통한 이온 전류를 생성하는 전위를 이중층 전체에 걸쳐 인가하는데 사용된다(도 12). 이러한 전압으로 형성된 전기장은 ssDNA 또는 RNA의 음으로 하전된 인산염 골격(phosphate backbone)을 포어를 통하여 끌어당기며, 트랜스쪽 전압이 양이므로 포어의 시스 쪽에서 트랜스 쪽으로 이동하도록 한다. 분자들이 이동함에 따라 포어는 이동 분자에 의해 부분적으로 차단되어 전류가 감소하게 된다. 이들 위치 이동의 발생건은 감쇄된(차단된) 전류의 진폭 및 체류시간으로 정의되는 포어 내 분자가 머무는 시간에 의해 식별될 수 있다. 나노포어 시스템의 개념도 및 DNA 위치 이동 발생건의 예시가 도 13에 도시되어 있다. 도 13에 도시된 DNA는 단일 및 이중-가닥 부분을 가지는데, 이중-가닥 부분은 20 염기쌍 헤어핀(20bphp)으로 되어 있다. 상기 DNA는 단일-가닥 말단에 의해 나노포어 내로 포획되며, 전기장력이 상기 헤어핀을 통로 내에서 풀어지도록 하면 위치 이동을 한다. 이러한 구성은 본 발명의 일부에 대한 유용성을 갖는다. 이중-가닥 단편의 유용성은 전압이 상기 단편을 단일 가닥 DNA로 분해하여 상기 DNA가 이동할 때까지, DNA의 체류시간을 (위치 이동을 중단함으로써) 어느정도 늘려준다는 데 있다. 또한, 이중-가닥 단편이 길수록 주어진 전압에서 체류시간이 더 길어진다. 이와 대조적으로, ssDNA 또는 RNA의 위치이동 속도는 포획-수준의 전압하에서 위치이동의 중단없이 2 뉴클레오타이드/μsec의 속도에 이른다.
본 연구진은 대안적으로 이중 가닥 단편이 단일 가닥 DNA의 말단과 상보적인 염기를 갖는 프라이머 DNA 단편을 어닐링함으로써 형성될 수도 있음에 주목하였다. 본 발명의 구성에서 핵심은 포획된 DNA 분자가 단일 및 이중-가닥 단편을 가져야만 한다는 점이다. 이러한 구조는 포획 및 체류를 용이하게 한다: 단일-가닥 말단이 포획되고 이중-가닥 말단은 체류시간을 증가시켜, 포획을 검출하는 시간 및 전압을 대기 수준으로 감소시킴에 의한 반응 시간을 제공한다(하기에 보다 상세히 설명한다). 이러한 DNA 구조를 사용하는 다른 핵심적인 이유는 본 연구진이 제안한 접근방법에 사용되는 효소는 DNA의 단일가닥과 이중가닥이 접합되는 부위에서 DNA와 정확히 결합한다는 점이다.
실시예 X: 나노포어 및 효소
최근에, 본 연구진은 포획된 DNA 분자와 효소의 상호작용을 탐침하기 위하여 생물학적 나노포어를 사용하였다. 인가된 전압 하에서, 효소-결합 DNA의 ssDNA 말단이 나노포어 내에 포획되고, 효소는 나노포어를 통하여 이동하기에는 너무 크기 때문에 나노포어 위에 머무르게 되었다. 나노포어에 기초한 역학 분광기를 위한 전압 램프를 사용하여 E.coli 엑소뉴클레이즈 I(ExoI)이 ssDNA에 결합하는 동력학(kinetics)이 정량되었다. 특히, ssDNA의 포획 검출시, 전압은 자동적으로 ssDNA-ExoI 복합체 상태로 짧게 있게 한 후, ExoI이 해리하고 ssDNA가 포어를 통하여 이동할 때까지 전압 램프를 제공하였다. 인가된 전압 램프하에서 해리에 걸린 시간은 역으로 결합속도 상수를 추정하는데 사용된다.
본 연구진은 이전에(참조: Benner 등(2007) Nature Nanotechnology, 2:718-724), E.coli DNA 폴리머레이즈 I의 Klenow 단편(KF)과 DNA의 상호작용을 연구하였다. KF가 없는 상태에서, 일정한 180mV 전압하의 14bphp의 포획 및 이어지는 짝풀 림(unzipping)을 통하여 20pA 평균 진폭의 한계치 및 1msec 중앙값(median)의 체류시간을 가진다는 것을 알게 되었다(도 14a). 2μM의 KF를 첨가하였더니, 보다 큰 평균 진폭(23pA)을 가진 이원 복합체(DNA/KF)로 인한 새로운 발생건들이 생겨났으며, 발생건 도표(도 14bII)에서도 더 긴 체류시간이 얻어졌다(모든 발생건에 대한 3msec 중앙값). 200μM의 데옥시구아노신 트라이포스페이트(dGTP), KF 촉매활성 부위 내의 DNA 주형 염기와 상보적인 dNTP의 첨가는 신규 모집단의 체류시간을 133msec 중앙값으로 연장시켰는데, 이는 삼원 복합체(DNA/KF/dGTP) 내에서 더 안정적인 결합을 하기 때문이다.
다음 절에서 기술될 본 발명의 테더링 DNA 구성은, KF-결합 DNA 발생건(상보적인 dNTP가 있거나 없는 경우, 즉, 이원 또는 삼원 복합체의 경우)에 의해 보여지는 주요한 구조적 특질에 영향을 미치며, 하기에 기술된다. 이원 및 삼원 복합체 차단을 면밀히 조사한 결과, 각각 90% 이상의 차단 및 97% 이상의 차단의 2단계 패턴이 나옴을 알 수 있었다. 첫째 단계는 23pA 평균 진폭을 가지며, 그 후, 20pA 평균 진폭에서 터미널 단계로 불리는 짧은(1 msec 중앙값의 체류시간) 둘째 단계가 이어진다. 첫째 단계에서 둘째 단계로의 전이는 DNA로부터 KF(이원 및 삼원 복합체에 대하여)의 해리가 일어난 후, 위치 이동하기 전까지 포어 통로 내로 헤어핀이 끌려온 것에 기인하는 것임이 밝혀졌다. 따라서, 터미널 단계의 동력학은 정확히 DNA 듀플렉스 짝풀림의 동력학이다.
효소-결합 DNA 발생건 내에서 터미널 단계가 계속 존재한다는 것은 본 발명에 있어 기계학적으로 중요한 사실이다. 특히, 일정한 전압하에서 나노포어 내에 포획된 효소-결합 DNA 복합체에 대하여, 상기 터미널 단계는 진폭의 변화(본 연구진의 KF에 대한 최근 연구에 의하면, 180mV에서 23pA로부터 20pA로 변화)에 기초하여 효소가 DNA로부터 해리하였음을 실시간으로 검출할 수 있게 해준다.
실시예 XI : 나노포어 내의 DNA 및 KF - 결합된 DNA 의 검출 및 제어
본 접근법에서, LabVIEW 8 소프트웨어 내의 유한 상태 기계(FSM)를 사용하여 전압 제어 로직을 프로그램화하며, 상기 FSM 로직은 FPGA(field-programmable gate array) 하드웨어 시스템 상에 제공된다. 본 연구진이 최초로 제공하는 FSM/FPGA 전압 제어는 특징적인 23pA 진폭 및 최소 20msec의 체류시간에 기초하여, 각각의 삼원 복합체를 효율적으로 자동 검출할 수 있음이 증명되었다. 21.2-26.8pA의 한계 범위 내에서 20ms 동안 머무르는 모든 발생건에 대하여, 전압을 역으로 인가하여 복합체를 시스 챔버 내로 다시 되돌리는데, 효소의 해리 및 트랜스쪽으로의 DNA 이동을 위한 대기(＞100msec 중앙값의 체류시간)가 필요없게 된다. 상기 제어 로직은 검출되는 삼원 복합체 발생건의 체류시간을 FSM/FPGA 제어가 없는 경우 123msec 중앙값의 체류시간(235msec 사분위수 범위(IQR))에서, FSM/FPGA 제어가 있는 경우 23msec 중앙값의 체류시간(0.3msec IQR)으로 집중시키는 효과를 나타내었다. DNA 및 이원 복합체 발생건 중 2% 미만이 20msec 보다 길기때문에, 20msec의 대기 시간은 거의 모든 제어된 발생건들이 삼원 복합체임을 보증한다.
본 연구진이 두번째로 제공하는 FSM/FPGA 전압 제어에서, 본 연구진은 특징적인 20pA 진폭에 기초하여 각각의 DNA 복합체(시스 챔버 내에 KF 효소가 없음)를 효율적으로 자동 검출할 수 있음을 증명하였다(Wilson 등(2008) Rapid finite state machine control of individual DNA molecules in a nanopore. In International Conference on Biomedical Electronics and Devices(BIODEVICES), to appear, Madeira, Portugal). 20±2.8pA의 한계 범위 내에 속하는 모든 발생건들에 대하여, DNA 체류시간을 늘리기 위하여 전압을 즉시 감소시켰다. 두번째 실험에서는, 20pA 수준 근처의 한계치 내에 속하는 모든 DNA 발생건들에 대하여, 위치 이동 전에 시스 챔버 내로 상기 DNA를 다시 되돌리기 위하여 전압을 즉시 역인가하였다. 양쪽의 실험(효소-결합된 DNA 발생건의 검출 및 반응과, 효소가 없는 DNA 발생건의 검출 및 반응)이 모두 기본적으로 성취되었으므로, 본 연구진은 서둘러 양쪽 발생건들의 검출 및 식별을 실시간으로 시도하였다.
실시예 XII: 장치
패치-클램프 증폭기, 분자 장치 AxoPatch 200B는 인가된 전압을 조절하고 채널을 통한 이온 전류를 측정한다. 데이터는 분자 장치 Digidata 1440A 디지타이저를 사용하여 기록되는데, 50㎑에서 샘플링하여 4극 베셀 필터로 5㎑에서 저역통과 필터링한다. 장치들 중 하나는 다른 패치 클램프, A-M 시스템 모델 2400을 사용한다.
실시예 XIII: 제어 로직: 하드웨어 및 소프트웨어
전압 제어 로직은 LabVIEW 8 소프트웨어 내의 유한 상태 기계(FSM)를 사용하여 프로그램화된다. 상기 FSM 로직은 FPGA 하드웨어 시스템, National Instruments PCI-7831R 상에 제공된다. FPGA는 빠른 측정 및 전압 반응시간(1μsec 산출 샘플 시간)을 가능하게 하는 재구성가능한 하드웨어 플랫폼이다. FSM은 프로그램 실행이 일련의 개별적인 상태로 분해되는 로직 구조이다. 각 상태는 관련 명령을 갖고 있으며, 상태들 사이의 전이는 시스템 측정의 함수이다. 포어 전류의 측정이 진행되어 FSM으로 입력값으로 전달된다. FSM 제어 로직의 변경은 FPGA를 작동하는 설계를 재컴파일하거나 경로를 다시 모색할 필요없이 편의에 따라 만들어진다. 이는 시스템으로 하여금 발생건들에 대하여 마이크로초 단위로 반응하게 함으로써 속도와 유연성 사이의 균형을 실현하며, 또한, 제어 로직이 실험들마다의 필요에 따라 재구성될 수 있도록 한다.
실시예 XIV: 이온 전류의 여과 및 한계치 설정
본 연구진의 제어 로직은 DNA 단독 또는 KF-결합된 DNA로부터 수득되는 이온 전류 차단(발생건)의 효과적인 검출을 필요로 한다. 또한, 상기 로직은 이들 두가지 타입의 발생건 사이를 효과적으로 구별할 수 있어야 한다. 180mV에서, DNA 단독 및 KF-결합된 DNA의 평균 진폭은 각각 20pA 및 23pA이며; 차이는 3pA이다. DNA 단독과 KF-결합된 DNA 발생건을 실시간으로 구별하기 위하여, FPGA 상으로 들어오는 전류 시그널은 필터링되고 한계치가 설정된다.
한계치는 시스 챔버 내에서 검출될 수 있는 생물학적 요소들에 대하여 전압 실험들을 계속하여 선험적으로 결정된다. KF에 대한 본 연구진의 실험에서는, KF-결합된 발생건이나 KF-없는 발생건의 진폭과 일치하는 진폭 한계치는 180mV 및 150mV에서 확인되었다. 예를 들어, 180mV에서, DNA 단독 발생건을 확인하고 검출에 사용되는 한계치는 20±2.8pA이었으며; KF-결합된 DNA 발생건을 확인하고 검출에 사용되는 한계치는 24±2.8pA이었다. 지금까지 본 연구진의 실험에서는, 한번에 하 나 또는 두개의 한계치가 제공되었다. 장래에는, 감쇄된 진폭에 기초하여 다르다고 알려진 복수의 거대분자 상태를 구별하기 위하여 2개 이상의 한계치들이 동시에 사용될 수 있다.
필터링은 잡음(noise)을 줄이기 위하여 사용된다. 이온 전류의 피크 대 피크 잡음이 일반적으로 180mV에서 3pA를 초과하기 때문에, DNA 단독 발생건 및 KF-결합된 DNA 발생건은 원천의 전류 진폭을 관찰하는 것으로는 신뢰성있게 구분할 수 없다. 전류 진폭을 필터링함으로써, 본 연구진은 DNA 단독 발생건 및 KF-결합된 DNA 발생건을 실시간으로 검출할 수 있음을 보였다. 윈도처리된 평균 필터가 2.3절에 보여진 본 연구진의 초기 데모를 포함하여 지금까지 사용되어왔다. 최근에, 보다 월등한 지수 가중 평균 필터가 확인되었으며 신규 실험들에 사용될 것이다. 두 필터들에 대해서는 하기에 상세하게 설명한다.
실시예 XV : 이동 평균 필터
5.3μsec마다 FPGA는 이온 전류를 샘플링하고, 0.75msec의 윈도 크기를 사용하여 윈도처리된 평균 진폭을 계산한다. 평균이 선택된 한계치 범위에 들어오면, FPGA는 입력된 사항을 검출하며 평균을 계속 관찰하고 0.2msec마다 한계치를 재점검한다. 만일 평균이 4개의 연속되는 체크점에 대한 한계치 범위 내에 머무른다면, FSM 로직은 선택된 한계치와 일치하는 것으로 알려진 타입의 발생건으로서의 차단임을 진단한다.
전압의 변화가 없는 경우, 발생건의 시작점과 진단점 사이에 예상되는 시간 지체는 1.35msec이며; 한계치로 가장 먼저 들어오는 윈도처리된 평균에 대해서는 0.75msec이고, 세 개 이상의 확인된 테스트에 대해서는 0.6msec이다. 실제로, 진단 시간의 범위는 1.1 내지 2.5msec이다. 상기 평균 필터는 본 발명의 초기 데모에 제공되었다(하기에 상술함).
실시예 XVI: 지수 가중 이동 평균 필터
실험 후 분석을 통하여, 본 연구진의 평균 필터는 삼원 복합체 발생건에서의 터미널 단계를 잘못 검출하였음이 밝혀졌다. FSM/FPGA는 특이적으로, 삼원 복합체 수준의 진폭을 검출하고, 터미널 단계까지 대기하다가, 터미널 단계의 검출 시에 전압을 역으로 인가하여 결합되지 않은 DNA를 시스 챔버로 되돌리도록 프로그램되었다. 데이터의 조사로 인해 비록 삼원 복합체 발생건의 터미널 단계의 존재는 전압 역인가가 없는 경우에 높을지라도(97%), 많은 발생건에 대한 전압 역인가는 터미널 단계가 완전히 존재하지 않음을 보였다.
터미널 단계의 검출에 오류를 범하는 FSM의 로버스트도를 개선하기 위하여, 지수 가중 이동 평균(EWMA) 필터가 상기 평균 필터를 대체하기 위해 현재 개발중이다. 상기 EWMA 필터는 전기공학 응용분야에서 신호 평활화를 위해 흔히 사용되는 아날로그 RC 필터의 디지털화를 제공한다. 상기 필터는 과거 샘플에 대해서는 지수적으로 중요성을 덜 부여하는 이동 평균을 계산하여 필터링된 신호가 실제 신호를 더 잘 추적할 수 있도록 한다. EWMA 필터링은 또한 회귀 실행으로 인해 단순 이동 평균보다 효율적으로 신호 평활화를 수행한다.
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상기에서, 과 ￣은 각각 필터링되지않은 것과 필터링된 전류 신호이며, t는 샘플 번호이다. _=0.9에서, 오프라인의 터미널 단계 검출 실험으로부터 데이터를 필터링한 것은 평균 필터에 대한 위양성(false positive)을 가져오는 로버스트도를 실질적으로 개선함을 보여주었다. 평균 필터에 있어서, 4개의 연속적인 한계치 테스트가 발생건 진단을 하는데 사용될 것이며 한계치 테스트들 사이의 대기시간은 0.2msec이다.
전압 변화가 없는 경우, 발생건의 시작점과 발생건의 진단 사이에 예상되는 시간 지체는 0.7msec이며; 한계치로 가장 먼저 들어오는 EWMA에 대해서는 0.1msec이고, 세 개 이상의 확인된 테스트들에 대해서는 0.6msec이다. EWMA 검출 시간의 보다 정밀한 평가는 본 연구진의 계속되는 연구의 일부가 될 것이다.
실시예 XVII: 전기장력의 변화에 대한 시간 규모
막 전체에 걸친 전압의 크기가 변화되는 경우, 용량성의 과도전류가 측정된 이온 전류 위에 겹쳐진다. 상기 과도전류는 전압 변화를 포함하는 모든 알파-헤몰리신 나노포어 연구에서 나타나며(참조: Bates 등(2003) supra), 각 발생건의 규정되고 처리가능한 부분에 대하여 측정된 전류의 일부 정보를 불가피하게 은폐한다. 본 발명에서, 상기 과도전류는, 제어 로직이 전압 변화 후의 발생건 타입을 진단하도록 프로그램화된 경우에, 필터링된 전류 진폭은 상기 과도전류가 충분히 안정될 때까지 발생건 진단을 위해 선택된 한계치(들)에 들어가지 않는다는 것을 의미한다.
상기 과도전류에 대한 안정화 시간은 전압의 순변화에 비례한다. 전압 제어 실험에서, 인가된 전압의 변화는 180mV 내지 -50mV, 및 -50mV 내지 180mV이다. 230mV의 순변화(절대값)에 대하여, 본 연구진은 98%의 과도전류가 2.5msec 후에 정확한 한계치로 쇠퇴한다는 것을 관찰하였다. 본 연구진의 초기 테더링 DNA 실험에서, 전압 변화는 200mV 및 170mV(절대값)였다. 전압 변화에 기인하는 과도 전류는 도 17 내지 18에서 찾아볼 수 있다.
전압 변화가 존재하는 경우, 발생건의 진단에 요구되는 시간(DNA 발생건 또는 효소-결합 DNA 발생건)은 과도전압이 안정화되는 시간과 일치할 것으로 예상된다. 이는 일반적으로 과도전압이 안정화되는 시간이, 측정된 이온 전류 신호 상에 필터링된 진폭이 집중되는데 요구되는 시간보다 길기 때문이다. 따라서, 진단 시간은 230mV의 전압 변화(절대값)에 대해서는 최대 2.5msec이며, 더 작은 전압 변화에 대해서는 2.5msec 미만이 될 것으로 예상된다.
실시예 XVIII: 테더링 DNA 구성
본 연구진의 초기 테더링 DNA 실험에서, 단일 DNA 20bphp가 시스 챔버 내에서 ss-ds 접합부에 KF가 반복적으로 결합하고 해리하도록 하는 전압하에서 포어 내에 포획되고 테더링되며 포어를 통하여 좌우로 빠져나가게 된다. 본 실험에서, 1μM의 100mer DNA, 5mM MgCl2, 2μM KF 및 200μM의 dGTP가 포어의 시스쪽 웰에 존재한다. 따라서, 각 발생건들이 나노포어 내에 포획된 DNA 단독 또는 삼원 복합체로부터 기인한다.
테더링(tethering)을 위하여 DNA 올리고머가 고안된다. 특이적으로, 3' 말단 이 20 염기쌍 헤어핀 내에 형성되며, 5' 말단에 상보적인 20mer 프라이머 2μM이 트랜스 챔버 내에 존재한다. 5' 말단의 포획시, 전압은 포어 내에 DNA를 유지시키기 위해 감소되지만, 통로 내에 3'-말단 헤어핀 염기쌍을 풀지 않으며(비결합 DNA가 포획된 경우), 또는 ss-ds 접합부로부터 KF/dGTP를 해리시키지도 않는다(삼원 복합체가 포획된 경우). 충분한 시간이 흐른 후, 20mer 프라이머는 5' 말단과 어닐링을 하여 포어의 트랜스쪽에 20mer 듀플렉스를 형성한다. 본 연구진의 초기 실험들에 대해 하기에 상세히 설명한다.
본 실험에서, 트랜스 챔버 내로 이동하는 5' 말단으로 포어 내 각 DNA 분자를 포획하기 위하여 180mV의 인가된 전압이 사용되었다. DNA 발생건([15.75, 21.25]pA의 한계치) 또는 KF-결합된 DNA 발생건([21.25, 26.75]pA의 한계치)이 평균 필터를 사용하여 진단된 경우, FSM은 50mV로 전위를 감소하여 포어 내 분자를 유지시키지만 헤어핀의 염기쌍을 풀거나 KF/dGTP를 해리시키지는 않는다. 20mer 프라이머가 트랜스 챔버 내에서 DNA의 5' 말단에 어닐링하기에 충분한 시간인 20초간 50mV 유지 전압이 적용된다. 포획된 DNA 분자의 초기 테더링 양상이 도 15에 도시되어 있다.
20초 후에, FSM은 전압을 -20mV로 역인가하여, 채널의 트랜스쪽 말단에 대하여 5' 듀플렉스를 형성하기에 충분한 힘을 가진 채 DNA를 포어의 시스쪽으로 이동하게 하여, 시스 챔버 내로 3' 말단 헤어핀의 ss-ds 접합부에 매달리게 한다. -20mV 전압은 5'-말단 프라이머 듀플렉스 염기쌍을 풀지않는 충분히 작은 전압인 것으로 확인되었다. -20mV 전압에서의 시간양은 피싱 시간 t fish 으로 불리며 초 단위로 측정된다. t fish 초에 대한 -20mV의 적용은 제어 로직의 피싱 모드로 불린다.
-20mV에서 t fish =5초 후에, FSM은 전압을 180mV로 변경하였으며, 그 후, 포어 내 분자의 정체가 DNA만인지 또는 효소-결합된 DNA인지를 진단하기 위하여 평균 필터링된 진폭을 관찰하였다(한계치를 설정하였다). 결합되지 않은 DNA로 진단된다면([15.75, 21.25]pA 한계치), 전압을 -20mV로 역인가하여 피싱 모드를 재시작한다. 다른 경우라면, FSM은 계속해서 필터링된 진폭을 관찰한다. KF/dGTP-결합 발생건에서는, 터미널 단계([15.75, 21.25]pA 한계치)의 진단시, 전압을 -20mV로 역인가하여 피싱 모드를 재시작한다.
결합되지 않은 DNA가 진단될 때까지(DNA 단독에 의한 것 또는 효소-결합 발생건의 터미널 단계 진입에 의한 것) 180mV를 적용하는 것을 제어 로직의 탐침 모드라고 부른다. 테더링 DNA 실험 내에서의 처음 9개의 피싱 후 탐침 작용이 도 16에 도시된다. 일단 DNA가 테더링되고, FSM 로직이 피싱 후 탐침 사이클을 시작하면, 결합되지 않은 DNA 한계치만이 결합되지 않은 DNA 또는 효소-결합 DNA 발생건 내의 터미널 단계의 진단용으로 사용된다. FSM 로직은 테더링 DNA 분자가 포어를 통하여 이동하여 열린 채널 전류가 검출될 때까지 피싱 후 탐침 모드 사이클을 반복한다. DNA는 3'-말단 헤어핀의 염기쌍이 풀리거나 5'-말단 듀플렉스 염기쌍이 풀린다면 이동하게 된다. 본 연구진은 3'-말단 헤어핀 염기쌍이 풀림에 따라 DNA 이동이 가장 잘 일어날 것으로 예측하고 있는데 180mV에서의 짝풀림은 DNA 발생건 진 단보다 더 빠르게 일어날 수 있기 때문이다. 한편, -20mV 전압은 5'-말단 듀플렉스 염기쌍을 가장 덜 풀것 같은데, 심지어 피싱 시간도 분 단위이다. 실험 후 분석은 피싱 모드에 대한 탐침 모드에서 DNA의 이동 빈도를 결정하는데 사용될 수 있다. 테더링 DNA가 이동하여 전류가 열린 채널 값으로 돌아오는 경우, FSM은 리셋을 하고 신규 DNA 분자를 테더링하는 다른 발생건을 위한 전류를 관찰한다.
두번째 실험에서 150mV의 더 낮은 포획 및 탐침 전압이 사용되었으며, t fish =0.521초의 더 빠른 피싱 시간이 사용되었다. 150mV의 일정 전압에서 DNA 단독 및 KF 및 dGTP와 결합된 DNA의 실험들에 기초하여, 결합되지 않은 DNA 한계치는 [7.5, 15.5]pA로 설정되었고, KF/dGTP-결합된 DNA 한계치는 [19,27]pA로 설정되었다. 피싱 및 탐침 모드는 도 17에 도시되어 있는데, 탐침은 DNA만의 발생건을 나타낸다. 피싱 및 탐침 모드는 도 18에 다시 도시되며, 여기에서 탐침은 효소-결합 DNA 발생건을 나타낸다. FSM은 8개의 독립적인 DNA 분자들을 포획하고 테더링하였다. 380초 시간동안 총 337개의 효소-결합된 DNA 발생건이 탐침 모드에서 일어났다. 데이터의 분석을 통하여 FSM/FPGA가 이들 발생건의 72%를 터미널 단계로 정확히 진단하였음을 보여주었다. 나머지 28%에서는, 효소-결합 DNA 발생건에서 터미널 단계가 실제로 일어나기 전에 피싱이 재시작되었다(이를 위양성이라 부른다). 오프라인 분석을 통하여 EWMA 필터는 상기 데이터에서 위양성이 0임을 알 수 있었다. 장래의 테더링 DNA 실험에서의 EWMA 필터의 온라인 제공은 위양성에 대한 필터의 로버스트도를 평가하고 개선하는데 사용될 것이다. "결합되지 않은 DNA 점검" 메커 니즘은 위양성을 배제하고/최소화하는데 이용될 수 있다. 상기 메커니즘은 하기와 같이 작용한다: 각 탐침 모드의 말단에서 피싱 시간이 너무 짧아 시스 챔버 내에서 ss-ds 접합부를 노출할 수 없으며 그 후 DNA가 결합되지 않았음을 확증하기 위하여 재탐침하는데; 결합되지 않았다면 피싱을 위한 주기 t fish 가 되며; 결합되었다면, 터미널 단계가 검출될 때까지 대기한다. DNA가 결합되지 않았음을 확인하기 위해 사용되는 짧은 피싱 주기의 검증은 본 연구진이 계속해서 연구해야 할 부분이 될 것이다.
실시예 XIX: 나노포어 내의 개별적인 DNA 및 효소-결합된 DNA 분자들의 신속 검출 및 탐침 제어
생물학적 나노포어 장치에서, KCl 용액 내의 20㎛ 테플론 구경에 걸쳐 평면의 지질 이중층이 형성된다. 단일 α-헤몰리신 단백질 채널이 상기 평면 지질 내로 삽입되었다. 상기 채널(포어)은 길이가 15㎚이며 직경은 다양하다. 포어의 시스쪽 개구부는 폭이 2.6㎚이며, 통로에서는 3.6㎚이다가 스템의 시작부분에서는 최소 1.5㎚로 좁아진다. 스템의 끝 부분에서 트랜스 개구부까지의 폭은 2㎚이다. 상기 통로는 이중-가닥 DNA(dsDNA)가 들어가기에 충분히 크지만, 제한적인 스템에서는 ssDNA만이 통과할 정도의 폭이다. 염화은 전극이 포어를 통한 이온 전류를 생성하는 전위를 이중층 전체에 걸쳐 인가하는데 사용된다(도 12). 이러한 전압으로 형성된 전기장은 ssDNA 또는 RNA의 음으로 하전된 인 전체를 포어를 통하여 끌어당기며, 트랜스쪽 전압이 양이므로 포어의 시스쪽에서 트랜스쪽으로 이동하도록 한다. 분자들이 이동함에 따라 포어는 이동 분자에 의해 부분적으로 차단되어 전류가 일시적으로 감소하게 된다. 이들 위치 이동의 발생건은 감쇄된 전류의 진폭 및 체류시간으로 정의되는 포어 내 분자가 머무는 시간에 의해 식별될 수 있다. 여기에 제공되는 실험에 사용되는 DNA는 ssDNA 및 dsDNA 단편으로 이루어져 있다. 구체적으로, 본원에 개시된 비-FPGA 실험에 있어서 14 염기쌍 헤어핀(14bphp)의 총 길이 67 뉴클레오타이드가 사용되었다. 나머지 실험에 있어서는, 20bphp의 총 길이 79 뉴클레오타이드인 올리고머가 사용되었다. 상기 헤어핀은 3' 말단이 자체적으로 접혀져서 14 또는 20 염기쌍을 형성하였다. 따라서, 상기 헤어핀은 이중-가닥 단편이며, 14 및 20bphp(이중-가닥 말단 루프에서 4개의 쌍이 없는 염기 포함) 양쪽에 대하여 단일-가닥 단편은 35뉴클레오타이드로 길다. ssDNA 말단의 포획시, 상기 헤어핀은 포어 통로로 들어가서 헤어핀의 짝풀림이 일어날 때까지 머무른다. 나노포어 시스템의 개념도 및 20bphp 이동 발생건의 예시는 도 13에 도시되어 있다.
이온 전류 진폭 및 포어를 통해 이동하는 개별적인 DNA 또는 RNA 분자들의 특성 사이의 상관 관계가 α-헤몰리신 나노포어를 사용하는 다양한 분석법을 통하여 보여졌다. 포어를 통해 통과하는 분자들의 수와 전류 하락 수치와는 거의 직접적인 상관 관계가 있음이 증명되었다. ssDNA의 호모폴리머 및 RNA의 블록 코폴리머 또한 차단 전류 진폭 또는 동력학의 측정가능한 차이에 기초하여 구분할 수 있다. 그러나, 현재의 생물학적 나노포어를 이용하여 이종 단일-가닥 폴리머 내의 각 뉴클레오타이드를 서열분석하기에는 이동 속도가 너무 빠르다(최대 2 뉴클레오타이드/μsec). 본원 및 다른 연구에서, 단일 및 이중-가닥 단편들을 가진 DNA가 포어 내 뉴클레오타이드의 체류시간(0.5-5msec, 인가된 전압 및 dsDNA 단편의 길이에 좌우)을 증가시키는데 사용되었다. 예를 들어, 단일-가닥 오버행이 없는 3 내지 9 염기 길이를 갖는 블런트 말단 헤어핀이 사용되었는데(참조: Vercoutere 등(2001) Nat. Biotechnol, 19(3): 248-252, 및 Vercoutere 등(2003) Necleic acids research, 31:1311-1318), 체류시간 발생건을 증가시키기 위하여 ssDNA의 3' 및 5' 말단으로 이루어진 말단 염기쌍의 (서열)을 확인하는 기계 학습법이 적용되었다.
실시예 XX: FSM/FPGA를 사용한 전압 조절
나노포어 시스템이 0.3mM KCl 용액 내에 설치된다. 패치-클램프 증폭기, 분자 장치 AxoPatch 200B는 인가된 전압을 조절하고 채널을 통한 이온 전류를 측정한다. 데이터는 분자 장치 Digidata 1440A 디지타이저를 사용하여 기록되는데, 50㎑에서 샘플링하여 4극 베셀 필터로 5㎑에서 저역통과 필터링한다.
전압 제어 로직은 LabVIEW 8 소프트웨어 내의 유한 상태 기계(FSM)를 사용하여 프로그램화된다. 상기 FSM 로직은 FPGA 하드웨어 시스템, National Instruments PCI-7831R 상에 제공된다. FPGA는 빠른 측정 및 전압 반응시간(1μsec 산출 샘플 시간)을 가능하게 하는 재구성가능한 하드웨어 플랫폼이다. FSM은 프로그램 실행이 일련의 개별적인 상태로 분해되는 로직 구조이다. 각 상태는 관련 명령을 갖고 있으며, 상태들 사이의 전이는 시스템 측정의 함수이다. 포어 전류의 측정이 진행되어 FSM으로 입력값으로 전달된다. FSM 제어 로직의 변경은 FPGA를 작동하는 설계를 재컴파일하거나 경로를 다시 모색할 필요없이 편의에 따라 만들어진다. 이는 시스템으로 하여금 발생건들에 대하여 마이크로초 단위로 반응하게 함으로써 속도와 유 연성 사이의 균형을 실현하며, 또한, 제어 로직이 실험들마다의 필요에 따라 재구성될 수 있도록 한다.
실시예 XXI: DNA 및 효소-결합 DNA 발생건 진단을 위한 FSM의 평균 필터링된 전류의 관찰
차단 전류 및 체류시간으로 정량화되는 차단 발생건은 FSM/FPGA를 사용하여 실시간으로 검출되고 관찰될 수 있다. FPGA 상으로 들어오는 전류 신호에 적용되는 평균 필터는 피크 대 피크 잡음의 대부분을 제거한다. 구체적으로, 5.3μsec마다 FPGA는 이온 전류를 샘플링하고, 윈도처리된 평균 진폭을 계산한다. FPGA는 평균이 미리 정해진 범위 내에 있으면, 초기 검출 후 매 0.2msec 마다 평균을 계속해서 테스트한다. 평균이 4개의 연속되는 테스트의 범위 내에 들어가서 머무른다면, FSM 로직은 DNA 헤어핀 발생건에 의한 차단으로 진단한다. DNA 이동이 발생한 시점 및 DNA 이동 발생건의 진단 사이의 시간 지체는 명목상 1.35msec이며; 17.2 내지 22.8pA 범위로 가장 먼저 들어오는 윈도처리된 평균에 대해서는 0.75msec이고, 세 개 이상의 확인된 테스트에 대해서는 0.6msec이며, 계산의 지체로 인한 시간이 0.65ms이다. 상기 평균 필터링된 전류는 DNA 발생건의 진단에 사용되며 FSM 제어 로직 내의 상태들 사이의 전이를 유발한다.
상기 FSM 로직은 나노포어 시스템을 사용하여 DNA 단독 또는 DNA/효소 복합체 사이를 식별하기 위하여 활용되어 왔다. 또한, FSM을 사용하여 DNA로부터의 효소 해리도 검출되고 실시간으로 반응될 수 있으며, 전류 신호 내에 존재하는 터미널 단계도 검출될 수 있다. 포어 내의 DNA 및 DNA/효소 복합체 모두를 검출하는 능 력은 본원에 상술한 바와 같이, KF가 DNA 헤어핀에 결합되고 정확한 뉴클레오타이드가 시스템 내에 존재하는 경우, 단일 가닥 및 이중 가닥 DNA 사이의 접합부에서 염기의 실시간 확인을 가능하게 할 수 있다.
또한, 단일 DNA 헤어핀 분자의 검출 및 제어를 확장하여 DNA 단일 복제를 사용한 반복되는 KF의 포획을 포함할 수 있다. 나노포어를 사용하여 KF가 DNA 헤어핀으로부터 분리되는 경우에 하나의 염기가 식별될 수 있다. DNA의 동일 복제물로부터 KF의 반복되는 포획 및 해리는 단일-염기 단계적 폴리머레이즈 반응에 대한 방법만 찾아진다면 많은 염기들의 서열분석을 가능하게 할 수 있다. 현재의 서열분석 방법은 약 1000 킬로베이스(1000 염기쌍 식별)의 해독 길이에 국한되지만, 나노포어에 기초한 서열분석 방법은 전통적인 벌크 서열분석 방법과 비교할 때 더 긴 길이를 해독할 수 있는 능력을 갖고 있다.
대부분의 장래 연구는 개선된 필터링 및 더 긴 길이의 DNA 사용을 통해, 전류 신호의 신호 대 잡음비를 증가시켜 검출 로버스트를 개선시키는 점에 초점이 맞춰져 있다. 또한, 효소가 해리되었음을 확증시켜주는 이중 점검 설계도 제공될 것이다. 또한, KF 및 dNTP의 농도를 변경하는 실험도 다른 복합체들의 검출 한계를 찾기 위해 실행될 것이다.
실시예 XXII: 분자 복합체의 검출
DNA와 E.coli DNA 폴리머레이즈 I의 Klenow 단편(KF)과의 상호작용이 나노포어 시스템으로 탐침될 수 있다. KF가 없는 경우, 일정한 180mV 전압하의 20bphp의 포획 및 이어지는 짝풀림을 통하여 20pA 평균 진폭 및 4msec 중앙값의 체류시간으 로 전류가 차단됨을 알 수 있었다. KF 및 KF 촉매활성 부위의 DNA 주형 염기와 상보적인 dNTP를 첨가하여 차단 체류시간(dGTP에 대하여 110msec 중앙값의 존속기간)을 실질적으로 증가시키는 결과를 가져왔는데 이는 삼원(DNA/KF/dGTP) 복합체에 기인한 것이다. 이러한 차단을 더욱 면밀히 조사한 결과, 차단의 97% 이상에서 2단계 패턴이 나타났는데, 24pA 평균 진폭을 갖는 첫째 단계 및 20pA 평균 진폭을 갖는 둘째 단계(터미널 단계)였으며, 헤어핀 만의 동력학과 일치하는 4ms 기간동안 지속되었다. 첫째 단계에서 둘째 단계로의 전이는 DNA로부터 KF의 해리가 일어난 후, 짝풀림이 일어나기 전까지 포어 통로 내로 헤어핀이 끌려온 것에 기인하는 것임이 밝혀졌다. 효소-결합 DNA의 전압 제어에 대한 초기 노력으로서, 각각의 삼원 복합체의 효율적이며 자동화된 검출(＜3msec)이 증명되었는데, 이는 특징적인 24pA 진폭과 20msec 후의 역전압에 의한 차단 시간의 절단에 근거하였다. 20msec의 컷어프가 사용되었는데, 이는 정확한 dNTP가 존재하는 경우 발생건들의 60%가 20msec보다 긴 반면, 정확한 dNTP가 부재하는 경우에는 발생건들의 불과 2%만이 20msec보다 긴 검출 범위를 가지기 때문이며, 이는 20msec 보다 긴 시간을 갖는 발생건들은 삼원 복합체 발생건과 일반적으로 일치함을 보여준다(도 14). 검출은 이전의 1.5msec의 신호와 17.2 내지 22.8pA의 검출 범위를 사용하는 윈도처리된 평균 계산에 대한 1.2.2 절에 기술된 메커니즘에 근거하였다. 이러한 범위를 선택한 근거는 ~20pA가 터미널 단계뿐만 아니라 180mV에서의 14 및 20bphp에 대한 진폭 중앙값이라는 점이다(도 19).
실시간으로 각 개별 발생건들을 진단하는 능력은 이러한 시스템을 서열분석 에 확장시킬 수 있는 잠재력을 보여준다. 단일 장기 체류시간 발생건(＞20msec)은 높은 확률로 삼원 복합체 발생건임을 알려준다. 시스템 내에 존재하는 dNTP에 기초하여, 결합될 다음 염기의 식별도 이루어질 수 있어 단일 염기 서열분석이 가능하게 된다. 복수의 염기 해석을 위해서는, 뉴클레오타이드의 결합뿐만 아니라 염기 중합화의 조절도 필요하다. 결합될 모든 염기를 위하여, 포어 내에 존재하는 효소결합된 DNA가 삼원 복합체의 존재를 찾기 위해 탐침될 수 있으며 중합화를 위한 정확한 dNTP가 존재함을 확인하게 된다. 본원에 제공되는 실험에서, dNTP들은 다이-데옥시 말단으로 되어 있어 중합화가 중단되게 되어 헤어핀에 하나 이상의 염기가 결합되는 것을 방지한다. 다이-데옥시 종결자의 이러한 용도는 오늘날 이용되는 대부분의 서열분석 방법들의 기초이다.
실시예 XXIII: 각 DNA 분자들의 제어
신속한 검출(＜2msec)은 필터링된 평균 진폭의 계산 및 실시간에서의 0.75msec의 이온 전류의 지속 및 DNA 헤어핀 차단(20±2.8pA)과 일치하는 진폭 범위에 대한 평균 관찰에 기초한다. 검출 시, 전압 제어의 두 방법이 증명되었다.
첫째 방법으로, 헤어핀 염기쌍이 풀릴 때까지 감소된 전압이 인가되는데, 즉각적인 전압 감소에 의해 체류시간의 연장이 달성된다. 포획을 위한 더 높은 전압은 조사될 분자들의 수를 증가시키며, 포획 후의 감소된 전압은 체류시간을 증가시켜 이론적으로 서열분석이 가능하도록 한다. 특히, 포어 내의 DNA 헤어핀의 존속기간을 연장시키면 기계 학습법에 의해 달성될 수 있는 말단 염기 식별 시간을 증가한다.
둘째 방법은 설정된 시간(10msec) 동안 전압을 감소시킨 후 상기 전압을 역인가하여 헤어핀 짝풀림 전에 분자를 되돌아가게 한다. 이는 수백개의 발생건들의 체류시간을 집중시키는 제어 능력을 보여준다. 또한, 이전 연구에 보태어, DNA-효소 차단 및 DNA 헤어핀 차단 양쪽 모두를 검출하는 능력을 확인시킨다. 각 차단 형태들을 실시간에서 구분하는 능력의 확인은 장래 연구에 있어 매우 중요하다. 궁극적으로, 나노포어에 기초한 효소 동력학의 특성화는 효소에 대한 복수 DNA의 배열을 직접 검출하고 제어하는 능력을 요구할 것이며, 효소없는 DNA의 직접 제어는 상기 능력을 개발하기 위한 필수조건이다.
나노포어 내의 ssDNA의 직접적인 제어는 증명되었으며, DNA의 검출은 한계치에 대하여 가공되지 않은 진폭을 관찰하는 것에 기초한다. 본원에 사용된 것과 비교할 만한 전압 수준 변화는 ssDNA-포어의 상호작용에 영향을 미치는 전압을 0 내지 낮은 전압 사이에서 탐색하도록 명령되었다. 가공되지 않은 이온 전류 진폭을 한계치로 설정하는 것과 대조적으로, 본원에 사용된 윈도처리된 진폭 평균 계산은 전류 노이즈를 필터링한다. 또한, 검출은 다수의 연속적인 비교에 대하여 미리 설정된 진폭 범위(＜6pA 폭) 내에 머무르는 평균값에 의존하는데, 단일 한계치 비교보다 검출 오류가 더 적었다.
실시예 XXIV: 실험 및 결과
나노포어 내 단일 DNA 분자에 대한 직접적인 FSM/FPGA 제어 실험을 이제 기술한다. 제1 실험에서, 목표는 DNA 헤어핀 발생건을 효율적으로 검출하는 것이었는데, 한번에 하나의 분자를 검출하며, 검출시 인가전압을 180mV에서 150mV로 낮춤으 로써 차단 체류시간을 증가시켰다. 이는 "체류시간 연장 제어(dwell time extension control)"로 불린다. 상기 단계가 종료된 후, 150mV에서 10msec 후에 -50mV의 역전압을 인가하여 DNA를 방출함으로써 연장된 차단 체류시간의 값이 집중되도록 하였다. 이는 "체류시간 집중 제어(dwell time aggregation control)"로 불린다. 명목상의 헤어핀 체류시간을 증가시키는 것을 유도하였지만, 상기 헤어핀의 염기쌍이 풀리기 전에 분자를 방출하였다. 연장된 체류시간 발생건들의 분포와는 대조적으로, 집중된 체류시간 발생건들의 보다 조밀한 분포는 본 목표가 달성되었음을 암시해준다.
일정한 180mV 전압에서의 통상적인 20bphp 발생건이 도 13 및 도 21aI에 도시되어 있다. 체류시간의 상용로그값의 확률 히스토그램(도 21aIII, 채워진 막대)은 단일 모드이며, 2.8msec의 체류시간 중앙값을 갖는다. 도 21aII 내의 모든 발생건들의 진폭 중앙값은 1.7pA의 사분위수 범위(IQR)에서 20.9pA이다. 발생건들의 6%만이 13 내지 18pA의 하부 범위에 속한다(도 21aIII, 열린 막대). 150mV의 일정 전압에서의 동일한 실험(미도시)에 대해서는, 발생건들이 14.7pA의 진폭 중앙값 주변으로 몰렸으며, 150mV 발생건의 87%가 13 내지 18pA의 범위 내에 있었다. 따라서, 모든 검출된 발생건들에 대하여 전압이 150mV로 감소되는 연장 및 집중 제어하에서는, 많은 비율의 차단 진폭들이 13 내지 18pA 범위 내의 평균 진폭을 가져야만 한다.
실시예 XXV: 체류시간 연장 제어(도 21b)
평균 필터링된 전류를 사용한 DNA 헤어핀 발생건의 진단시, 헤어핀 염기쌍이 풀어져서 DNA가 포어를 통해 이동할 때까지 명령전압이 150mV로 감소된다. 포획을 위한 180mV의 전압 사용은 150mV보다 많은 발생건들이 생기도록 하지만, 150mV로의 전압 감소는 헤어핀의 존속 기간을 증가시킨다. 거듭 언급하지만, 체류시간 증가는 기계 학습법에 의한 서열분석에 유용하다. 또한, 연장된 시간은 각 상태에 상응하는 진폭 한계치 내에 평균이 머물러야 하는 시간을 증가시켜, DNA 또는 DNA-효소 구성(상태)을 정확히 검출할 가능성을 높이는데 사용될 수도 있다. 각각의 이동 후에, FPGA는 전압을 180mV로 재설정한다. 대표적인 발생건은 도 21bI에 도시되어 있다. 발생건 도표(도 21bII)의 패턴은 ~1.4msec의 명목상 진단 시간보다 더 빠른 발생건들은 연장 제어에 의해 영향을 받지 않으며, 더 긴 체류시간을 갖는 발생건들이 예상된 바와 같이 ~15pA 평균 진폭으로 집중된다는 사실을 보여준다. 또한, 오목한 추세는 각 발생건들에 대한 평균 진폭 계산과 일치한다. 특히, 1.4msec에서의 21pA의 발생건 및 msec에서의 15pA의 발생건에 대하여, 대략적인 발생건 평균 진폭 ￣은
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이며, 도 21bI에서와 같이 4msec인 경우, ￣=15pA이다. 13 내지 18pA의 하부 범위 내에 있는 발생건들의 비율은 41%로 증가하였으며, 이는 확률(채워진 막대) 히스토그램 상에 겹쳐진 열린 막대 히스토그램에서 보여진다(도 21bIII).
실시예 XXVI: 체류시간 집중 제어(도 21c)
목표는 연장된 발생건들의 체류시간을 집중시키는 것이었는데, 이는 헤어핀 발생건의 진단시 10msec동안 150mV를 인가한 후, 이어 5msec동안 -50mV의 역전압을 인가함으로써 달성되었다. 5msec의 역인가 시간은 채널로부터 DNA를 제거하고, 포어가 후속 발생건들에 대한 준비를 하기에 충분한 시간으로 알려졌다. 집중 제어는 각각의 분자 발생건들뿐만 아니라 발생건들의 분포에 대한 제어 처리를 의미한다. 대표적인 발생건이 도 21cI에 도시되어 있다. 이전과 같이, 발생건 도표(도 21cII)의 패턴은 ~1.4msec의 명목상 진단 시간보다 더 빠른 발생건들은 집중 제어에 의해 영향을 받지 않음을 보여준다. 상기 식을 사용하면, 1.4msec에서의 21pA의 발생건 및 10msec에서의 15pA의 발생건에 대하여, 대략적인 발생건 평균 진폭은 ￣=16pA이다. 13 내지 18pA의 하부 범위 내에서의 중앙값은 0.7pA IQR에서 16pA인데, 이는 대략적인 평균값 계산과 일치한다. 13 내지 18pA의 하부 범위 내에서의 발생건 비율은 55%로 증가하였는데, 채워진 막대 확률 히스토그램 상에 겹치는 열린 막대 히스토그램으로 도시되어 있다(도 21cIII). 발생건들의 하부 범위에 대하여 12.4msec의 체류시간 중앙값은 헤어핀 상태로 진단하는데 요구되는 짧은 시간 지체에 상응하는데, 10msec의 연장 시간이 합쳐진 것이다. 열린 막대 하부범위 히스토그램에 대한 0.1의 IQR은 집중시키려고 했던 목표가 달성되었음을 암시한다. 발생건들의 분포에 대한 제어의 영향에 관해서는, 도 21cII에서 모든 발생건들의 43%가 12-13msec의 체류시간 및 13-18pA의 진폭 범위 내에 놓이게 된다.
실시예 XXVII: 테더링 DNA
20 염기쌍 DNA 헤어핀(20bphp)에 결합되는 KF에 대하여 예비 실험들이 진행되었다. KF가 DNA와 여러번 결합하도록 단일 20bphp가 포어를 통하여 좌우로 빠져 나가도록 하였다. 본 실험에서, 1μM의 100mer DNA, 5mM MgCl2, 2μM KF 및 200μM의 dGTP가 포어의 시스쪽 웰에 존재하였다. ssDNA 올리고머는 20mer 헤어핀이 3' 말단에 형성되도록 설계되었다. 트랜스 쪽에는, 시스 쪽 DNA 헤어핀의 5' 말단의 서열과 상보적인 20 염기쌍(20mer) 프라이머 2μM이 존재하였다.
전압을 인가하면, DNA가 먼저 5' 말단이 이동하여 포어를 통하여 끌려나왔다. ssDNA 이동 발생건의 특징적인 20pA가 검출되는 경우, FSM은 전위차를 50mV로 낮추어, 포어 내 분자를 유지시키지만 헤어핀의 염기쌍을 풀어 헤치는 정도는 아닌 수준으로 만들었다. 효소-결합된 DNA 발생건의 특징적인 24pA가 검출되는 경우, 효소가 해리되어 결합하지 않은 DNA가 포어 내에 있을 때까지 계속해서 전압을 인가하였는데, 그 시점에서 전압은 50mV로 감소되어 포어 내 분자를 유지시켰다. 포어 내에 분자를 20초간 유지시켰는데, 이 시간은 20mer 프라이머가 2μM의 프라이머 농도로 DNA의 5' 말단에 어닐링하기에 충분한 시간임이 판명되었다. 20mer의 이중-가닥 단편을 포함하는 DNA의 양쪽 말단에 의해, 상기 분자는 즉각적인 이동이 제지되었다. 프라이머가 어닐링하는 대기 시간이 지난 후, FSM은 전압을 -20mV로 역인가하여, DNA를 포어의 시스쪽으로 끌어 당겼는데, 트랜스쪽 프라이머가 끊어지지 않고 용액 내에서 매달릴 정도의 힘이 가해졌다. 전압을 -20mV에서 5초간 머무르게 한 후, FSM은 전압을 180mV로 변경하여 포어 내 분자의 상태; DNA 단독인지, DNA/KF 이원 복합체인지, 또는 DNA/KF/dGTP 삼원 복합체인지를 진단하였다. 만일, 효소가 결합되었다면 당연히 ~24pA가 관찰되며, 상기 FSM은 20pA 터미널 단계에 대 한 전류 신호를 관찰하였는데, 이 상태는 KF는 해리를 하였지만 DNA는 이동하기 전인 상태이며, 전압을 -20mV로 역인가하여 다른 KF를 포획하려고 시도하였다. 만일 FSM이 DNA 분자가 이동하기 전에 검출에 실패하였다면, 전류는 ~60pA의 열린 채널 전류로 복귀되며, 상기 FSM은 다른 DNA 이동 발생건에 대한 전류를 관찰하며 피싱 과정을 반복하였다(도 22). 특정 피싱 시도 동안 효소가 포획되지 않았다면, 상기 FSM은 효소 포획이 일어날 때까지 피싱을 다시 시도하였다. 본 실험으로부터 분석된 데이터에 있어서, 5개의 DNA 복제물이 포획되었으며 KF에 대한 피싱에 이용되었다. 비록 FSM에 의해 정확히 반응하는 KF 해리 발생건의 횟수를 판정하는 분석은 이루어지지 않았지만, 피싱 시도의 95.1%에 대해서 장기 체류시간 발생건(즉, 발생건 ＞20msec)이 보고되었다.
개념을 증명하는 초기 실험을 수행한 후, 2번째 피싱 실험을 실행하였더니 더 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 0.521초의 피싱 시간을 사용하여 FSM은 동일한 DNA 헤어핀의 8개의 복제물을 포획하였으며 380초의 기간 동안 337개의 유력한 KF 해리 발생건에 반응하였다. 실험 후 데이터의 분석은 FPGA가 KF 포획된 경우의 71.86%에 대하여 효소 해리 발생건을 정확히 검출하고 반응하였음을 보여주는데, 예를 들어, 337개의 유력한 해리 발생건 중 74개는 위양성이었다.
실시예 XXVIII: 효소 해리 검출의 오류 경감
상기 제공한 데이터에서, 효소의 해리는, 나노포어 전류 신호를 평균 필터링하고 선택된 진폭 범위 내에 있는지를 체크함으로써 검출된다. 이러한 간략한 방법은 많은 수의 잘못된 검출을 양산하였다. 이러한 필터링 설계의 개선을 위하여, 지 수 가중 이동 평균(EWMA) 필터가 FPGA가 사용했던 평균 필터를 대체할 수 있다. 상기 EWMA 필터는 전기공학 응용분야에서 신호 평활화를 위해 흔히 사용되는 아날로그 RC 필터의 디지털화를 제공한다. 상기 필터는 과거 샘플에 대해서는 지수적으로 중요성을 덜 부여하는 이동 평균을 계산한다. EWMA 필터링은 또한 회귀 실행으로 인해 단순 이동 평균보다 효율적으로 신호 평활화를 수행한다. 그러나, 나노포어 전류 신호 분석을 위한 필터를 조율하기 위하여 실험적 테스팅을 할 필요가 있다.
효소 해리 발생건을 보다 로버스트하게 검출하기 위하여, 결합되지 않은 DNA와 피싱이 되었음을 보증하기 위한 KF 해리 체크가 제공될 필요가 있다. FPGA가 KF 해리를 검출하는 경우, KF가 결합되지 않도록 충분히 빨리 일정 기간 피싱을 하여 DNA에 효소가 존재하는지의 여부를 체크할 것이다. DNA 단독임이 진단되면(전류는 ~20pA), 효소는 해리된 것이며 시스템은 다른 효소를 포획하기 위한 시도를 할 수 있다. 이러한 체크는 반복되는 발생건들에 대한 정보를 수집하는 실험을 수행하는데 있어 중요하다. 데이터가 유효해지고 통계적으로 정확해지기 위하여, 각 검출된 발생건은 새로운 효소 결합 발생건이어야만 한다.
장기 체류시간 발생건의 대부분은 강한 KF 결합 발생건에 대응되는데, 예를 들어, KF 및 정확한 dNTP가 포화수준으로 존재하는 경우, 주형 가닥에 결합될 그 다음의 dNTP는 나노포어 시스템 내에 존재한다. 연속적인 복수의 장기 체류시간 발생건은 염기 식별에 있어 신뢰도를 개선시키는데, 이는 결합될 정확한 dNTP가 존재할 때보다 부재하는 경우에 반복적인 연속의 장기 체류시간 발생건이 훨씬 덜 일어나기 때문이다. 이런 점에서 KF 피싱은 그 유용성을 보여줄 것이다. 체류시간 발생 건을 포아송 과정으로 모델화하는 개별적인 연구가 진행중인데, 반복되는 연속의 장기 체류시간 발생건의 횟수에 기초한 염기 식별 진단에 Phred 질 점수가 적용될 수 있다. 상기 Phred 시스템은 DNA 서열분석에 흔히 사용되는 정확도 측정법이다. 예를 들어, 90%의 정확도는 Phred 스케일상에서 Q10이라 부르며 99%의 정확도는 Q20이라 부른다. Q20은 본 명세서를 작성하는 시기에서는 DNA 서열분석의 표준적인 수준의 질로 간주되었다.
효소 발생건의 종료 시점에서 전류 폭의 검출가능성을 개선하는 다른 방법은 더 긴 헤어핀을 사용하고 더 높은 전압에서 실험을 수행하는 것이다. 채널 전류의 신호 대 잡음비는 채널을 통한 이온 흐름을 더 크게 함으로써 개선될 것이며, 이는 터미널 단계를 보다 분명하게 만들 것이다.
실시예 XXIX: 전압 적정 실험
진폭, 터미널 단계의 지속기간 및 인가된 전압 사이에 보다 정량적인 연결관계를 정립할 수 있다. 여기에서의 목표는 터미널 단계의 반복가능성을 밝히며, 어떻게 그 구조가 다른 전압에서 DNA 만의 데이터와 일치하는 지를 규명하는 것이다. 터미널 단계의 면밀한 특성 분석은 터미널 단계를 더 잘 제어할 수 있게 한다. 일정한 전압 실험은 4개의 다른 전압에서 실행되는데, DNA 단독의 경우뿐만 아니라 DNA/KF/dNTP 삼원 복합체의 경우에서 실행되며, 삼원 복합체의 경우에는 각 기질마다 포화수준의 양을 사용한다(각각 1μM, 2μM 및 200μM). 전압은 220, 200, 180 및 160mV를 사용한다. 더 높은 전압에서 체류시간을 늘리기 위하여 다른 테더링 실 험에서 사용되는 20bphp보다는 24bphp를 사용한다. 검출가능한 터미널 단계 발생건의 지속기간(1msec)을 산출하는 인가전압의 실제적인 상한치를 결정하기 위하여 우선 더 높은 전압이 실행된다.
실시예 XXX: 터미널 단계 제어 실험
상술한 바와 같이, 터미널 단계의 정확한 검출과 반응을 입증하는 것이 필요하다. 이전에 언급한 대로, 효소-결합 발생건의 97%가 터미널 단계를 나타내고 있으므로, 이는 이론적인 최대 검출 비율이다. 터미널 단계에 대한 검출 및 반응은 검출시의 역전압 인가에 의한 터미널 단계 지속시간의 집중에 의해 증명될 것이다. 상기에 사용된 바와 같은 높은 탐침 전압은 결합 및 비결합 경우의 전류양 사이에 높은 해상도를 부여한다. DNA 단독 및 DNA/KF/dNTP 삼원 복합체에 대하여 각 기질의 포화수준의 양을 사용하여 실험을 실시한다. 오프라인에서 정확한 검출을 대조 확인함으로써 위양성에 대한 로버스트도가 구해질 수 있다.
실시예 XXXI: 터미널 단계 제어 실험: 피싱 시간 적정에 의한 테더링 DNA 구성
상기 실시된 실험을 테더링 DNA를 갖고 반복하였다. 피싱 시간의 적정이 삼원 복합체 발생건에 대한 DNA 단독 발생건의 비를 재현하기 위해 실시되었는데 테더링되지 않은 DNA 실험에서의 것과 비교할 수 있다. 이 정보는 시스 웰 성분들의 대표적인 샘플링을 유지하기 위한 피싱 시간에 한계치를 설정하는데 도움이 된다. 실험들은 DNA/KF/dNTP 삼원 복합체뿐만 아니라 DNA 단독의 경우에서도 실행되며; 각 기질은 포화수준의 양이 사용된다.
실시예 XXXII: 피싱 적정 실험
KF 및 dGTP의 적정이 수행된다. 장기 발생건들의 비율이 KF 및 dGTP 농도의 함수로 기록된다. 실험은 상기와 동일한 높은 포획 전압으로 실시된다. KF 및 dGTP에 대하여 Benner 등((2007), Nature Methods에 제출됨)의 보충자료에서와 같이 동일한 농도 간격이 사용된다:(KF=[0, 0.25, 0.5, 1.0, 2.0, 2.0, 2.0, 2.0, 2.0, 2.0, 2.0, 2.0]μM; dGTP=[0, 0, 0, 0, 0, 2.5, 7.5, 15, 30, 60, 120, 200]μM). DNA 폴리머레이즈 결합의 서열 특이적인 검출은 나노포어에 기초한 상태 기계를 사용하여 이루어진다.
실시예 XXXIII: 다른 효소 연구
FPGA/FSM 나노포어 시스템은 또한 다른 효소 연구를 위해 사용될 수 있다. DNA/효소 복합체의 포획시의 전압을 인가하면 전압력 분광기를 사용하여 결합 에너지 조망을 계산하는 데이터를 산출할 수 있다. 또한, 포어와 DNA의 상호작용도 인가된 전압의 피드백 제어를 사용하여 밝혀질 수 있다. 효소 촉매작용의 조절은 포어를 차지하는 DNA에 장력을 적용하여 효소작용이 진행되는 힘을 저지함으로써 달성될 수 있다.
실시예 XXXIV: 게놈 DNA의 분리
환자로부터 폐 카테터를 이용하여 혈액 샘플(2-3ml)을 채취하여 사용전까지 -80℃에서 EDTA가 함유된 튜브 내에 보관되었다. 게놈 DNA는 혈액 샘플로부터 제조업자의 매뉴얼에 따라 DNA 분리 키트(PUREGENE, Gentra Systems, Minneapolis MN)를 사용하여 추출된다. DNA 순도는 Beckman 분광 광도계를 사용하여 260㎚ 및 280 ㎚에서의 흡광도의 비(빛 투과 경로 1㎝; A260/A280)로 측정된다.
실시예 XXXV : SNP 의 동정
환자의 DNA 샘플로부터 유전자 영역을 상기 영역에 대해 특이적으로 설계된 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭된다. 상술한 방법들을 사용하여 상기 PCR 수득물을 서열분석한다. 추적된 서열 내에 동정된 SNP들을 Phred/Phrap/Consed 소프트웨어를 사용하여 확인하고 NCBI SNP 데이터뱅크 내에 축적된 공지의 SNP들과 비교한다.
실시예 XXXVI: cDNA 라이브러리 구축
포유동물 조직으로부터 분리된 RNA를 사용하여 cDNA 라이브러리를 구축한다. 상기 동결된 조직을 구아니듐 아이소싸이오시아네이트 용액 내에서 POLYTRON 호모게나이저(Brinkmann Instruments, Westbury N.J.)를 사용하여 균일화하고 세포용해한다. 세포용해물을 L8-70M 초원심분리기(Beckman Coulter, Fullerton Calif.) 내에서 SW28 로터를 사용하여 실온에서 25,000rpm으로 18시간동안 5.7M CsCl 용액상에 넣고 원심분리한다. RNA를 pH4.7의 페놀산으로 추출하고, 0.3M 소듐 아세테이트 및 2.5배 부피의 에탄올을 사용하여 침전시키며, RNA 분해효소가 없는 물에 재현탁시키고, 37℃에서 DNA 분해효소로 처리하는데, RNA 추출 및 침전 과정을 상기와 같이 반복한다. mRNA를 OLIGOTEX 키트(Qiagen, Chatsworth Calif.)로 분리하여 cDNA 라이브러리를 구축하는데 사용된다.
mRNA는 SUPERSCRIPT 플라스미드 시스템(Invitrogen) 내의 권장 프로토콜을 따라 취급된다. cDNA는 SEPHAROSE CL4B 컬럼(APB) 상에서 분리되며, 400bp를 초과하는 cDNA들이 발현 플라스미드 내로 라이게이션된다. 그 후, 상기 플라스미드는 DH5aa 컴피턴트 셀(competent cell) 내로 형질전환된다.
실시예 XXXVII: cDNA의 제조 및 서열분석
MICROLAB 2200(Hamilton, Reno NV) 및 DNA ENGINE thermal cycler(MJ Research)를 조합하여 cDNA를 제조하고, PRISM 377 또는 373 DNA 서열분석 시스템(ABI)을 사용하여 Sanger 및 Coulson의 방법(1975; J.Mol.Biol. 94:441-448)으로 서열분석한다. 표준 기술을 사용하여 리딩 프레임(reading frame)이 결정된다.
서열목록의 뉴클레오타이드 서열 및/또는 아미노산 서열은 GenBank, SwissProt, BLOCKS 및 Pima II 데이터베이스 내의 서열 문의에 사용된다. BLAST는 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열 양쪽을 정렬해주며 서열 유사성을 판정한다. 정렬의 국소적인 속성으로 인해 BLAST는 원핵생물(박테리아) 또는 진핵생물(동물, 진균 또는 식물) 기원일 수 있는 유사체의 정확한 매치를 판정하거나 동정하는데 사용된다. Smith 등(1992; Protein Engineering 5:35-51)의 방법과 같은 다른 알고리즘도 1차 서열 패턴과 2차 구조 갭 페널티를 다루는 경우에 사용될 수 있다. 본원에 개시된 서열은 최소 49개의 뉴클레오타이드 길이를 가지며 12% 미만의 미확인된 염기들을 가진다(이 경우, A, C, G 또는 T 대신에 N이 기록된다).
상기 BLAST 접근법은 질의된 서열과 데이터베이스 서열 사이의 일치관계를 탐색한다. BLAST는 발견된 일치관계의 통계적 중요도를 평가하며 사용자가 선택한 중요도의 한계치를 충족하는 일치 서열만 나타낸다. 본 적용에서 한계치는 뉴클레 오타이드에 대해서는 10-25이며 펩타이드에 대해서는 10-10으로 설정된다.
실시예 XXXVIII: cDNA의 확장
cDNA는 cDNA 클론 및 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 확장된다. 하나의 프라이머는 공지의 단편의 5' 확장을 개시하고, 다른 하나는 공지의 단편의 3' 확장을 개시하도록 합성된다. 개시 프라이머는 길이가 22 내지 30 뉴클레오타이드, GC 함량이 약 50% 이상, 타겟 서열과는 약 68℃ 내지 72℃의 온도에서 어닐링하도록 프라이머 분석 소프트웨어를 사용하여 고안된다. 헤어핀 구조 및 프라이머-프라이머 이합체화 반응이 일어나는 뉴클레오타이드 신장은 회피된다.
선택된 cDNA 라이브러리는 서열을 확장하는 주형으로 사용된다. 확장이 1회 이상 일어날 경우에는, 추가 또는 네스티드 세트 프라이머가 고안된다. 바람직한 라이브러리는 보다 큰 cDNA를 포함하도록 선택된 크기를 가지며 유전자의 5' 또는 상류 영역을 갖는 서열들을 보다 많이 함유하도록 임의 준비되어진다. 게놈 라이브러리는 5' 프로모터 결합 영역 내로 확장하는 조절 요소들을 수득하는데 사용될 수 있다.
고충실도 증폭은 미국특허 제5,932,451호에 제시된 것과 같은 방법을 사용하는 PCR에 의해 수득된다. PCR은 DNA ENGINE thermal cycler(MJ Research)를 사용하여 96웰 플레이트에서 이루어진다. 반응 혼합물은 DNA 주형, 200nmol의 각 프라이머, Mg2+, (NH4)2SO4 및 b-머캅토에탄올을 포함하는 반응 완충액, Taq DNA 폴리머레이즈(APB), ELONGASE 효소(Invitrogen) 및 Pfu DNA 폴리머레이즈(Stratagene)를 포 함하며, PCR은 하기 조건으로 실시된다. 사이클의 조건은 1: 94℃, 3분; 2: 94℃, 15초; 3: 60℃, 1분; 4: 68℃, 2분; 5: 2, 3 및 4단계를 20회 반복; 6: 68℃, 5분; 및 7: 4℃에 보관. 대안적으로, 프라이머쌍 T7 및 SK+(Stratagene)에 대한 조건들은 하기와 같다: 1: 94℃, 3분; 2: 94℃, 15초; 3: 57℃, 1분; 4: 68℃, 2분; 5: 2, 3 및 4단계를 20회 반복; 6: 68℃, 5분; 및 7: 4℃에 보관.
각 웰 내의 DNA 농도는 100ml의 PICOGREEN 정량 제제(1x TE 내의 0.25% 반응제, v/v; Molecular Probes) 및 0.5ml의 희석되지 않은 PCR 수득물을 불투명한 형광기 플레이트(Corning Life Sciences, Acton MA)의 각 웰 내에 분주하여 상기 DNA를 반응제제에 결합시킴으로써 결정된다. 상기 플레이트는 Fluoroskan II(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)로 스캔되어 샘플의 형광이 측정되고 DNA 농도가 정량된다. 반응 혼합물의 5ml 내지 10ml 분주액은 1% 아가로스 미니젤 상에서 전기영동에 의해 분석되어 서열을 확장하는 반응의 성공여부가 판정된다.
확장된 클론은 제염되고 농축되어 384 웰 플레이트로 이송되며, CviJI 콜레라 바이러스 엔도뉴클레이즈(Molecular Biology Research, Madison Wis)로 처리되고 pUC18 벡터(APB) 내로 재-라이게이션 되기전에 음파분쇄되거나 절단된다. 샷건 서열에 대해서는, 제한효소 처리된 뉴클레오타이드 서열을 낮은 농도(0.6% 내지 0.8%)의 아가로스 젤 상에서 분리하여, 단편들을 잘라내고, 상기 아가는 AGARACE 효소(Promega)로 제한 처리된다. 확장된 클론은 T4 DNA 라이게이즈(New England Biolabs)를 사용하여 pUC18 벡터(APB) 내로 재-라이게이션되며, 제한부위 오버행을 채우기 위해 Pfu DNA 폴리머레이즈(Stratagene)를 처리하여 E.coli 컴피턴트 셀 내 로 트랜스펙션한다. 형질전환된 세포를 항생제가 포함된 배지상에서 선별하고, 각 콜로니들을 취해 384 웰 플레이트 내에서 LB/2X 카베니실린 액체 배지로 37℃에서 밤새 배양한다.
상기 세포들을 세포용해하고, DNA를 프라이머, Taq DNA 폴리머레이즈(APB) 및 Pfu DNA 폴리머레이즈(Stratagene)를 사용하여 하기 조건으로 증폭시킨다: 1: 94℃, 3분; 2: 94℃, 15초; 3: 60℃, 1분; 4: 72℃, 2분; 5: 2, 3 및 4단계를 29회 반복; 6: 72℃, 5분; 및 7: 4℃에 보관. DNA는 상술한 바와 같은 PICOGREEN 정량 제제(Molecular Probes)를 사용하여 정량된다. 낮은 DNA 복구율을 갖는 샘플은 상술한 조건들을 사용하여 재증폭한다. 샘플들을 20% 다이메틸설폭사이드(DMSO; 1:2, v/v)로 희석하고, DYENAMIC energy 트랜스퍼 시퀀싱 프라이머 및 DYENAMIC DIRECT 사이클 시퀀싱 키트(APB) 또는 PRISM BIGDYE terminator 시퀀싱 키트(ABI)를 사용하여 서열분석한다.
실시예 XXXIX: 폴리뉴클레오타이드의 확장
폴리뉴클레오타이드를 조립하는데 사용되는 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 cDNA 클론을 확장함으로써 생성된다. 하나의 프라이머는 공지 단편의 5' 확장을 개시하고, 다른 하나는 3' 확장을 개시하도록 합성된다. 개시 프라이머는 길이가 22 내지 30 뉴클레오타이드, GC 함량이 약 50%, 타겟 서열과는 약 55℃ 내지 68℃의 온도에서 어닐링하도록 OLIGO 4.06 프라이머 분석 소프트웨어(National Biosciences)를 사용하여 고안된다. 헤어핀 구조 및 프라이머-프라이머 이합체화 반응이 일어나는 뉴클레오타이드 신장은 회피된다. 선택된 인간 cDNA 라이브러리는 분자를 확장하는데 사용된다. 하나 이상의 확장이 필요한 경우, 추가 또는 네스티드 세트 프라이머가 고안된다.
고충실도 증폭은 DNA ENGINE thermal cycler(MJ Research)를 사용하여 96웰 플레이트 내에서 PCR을 수행함으로써 수득된다. 반응 혼합물은 DNA 주형, 200nmol의 각 프라이머, Mg2+, (NH4)2SO4 및 b-머캅토에탄올을 포함하는 반응 완충액, Taq DNA 폴리머레이즈(Amersham Pharmacia Biotech), ELONGASE 효소(Life Technologies) 및 Pfu DNA 폴리머레이즈(Stratagene)를 포함하며, 플라스미드로부터 선택된 프라이머 쌍에 대하여 하기 조건으로 PCR을 실시한다: 단계 1: 94℃, 3분; 단계 2: 94℃, 15초; 단계 3: 60℃, 1분; 단계 4: 68℃, 2분; 단계 5: 단계 2, 3 및 4를 20회 반복; 단계 6: 68℃, 5분; 및 단계 7: 4℃에 보관. 대안적으로, 프라이머쌍 T7 및 SK+(Stratagene)에 대한 조건들은 하기와 같다: 단계 1: 94℃, 3분; 단계 2: 94℃, 15초; 단계 3: 57℃, 1분; 단계 4: 68℃, 2분; 단계 5: 단계 2, 3 및 4를 20회 반복; 단계 6: 68℃, 5분; 및 단계 7: 4℃에 보관.
각 웰 내의 DNA 농도는 1X TE 내에 용해된 100ml의 PICOGREEN 정량 제제(0.25%(v/v); Molecular Probes) 및 0.5ml의 희석되지 않은 PCR 수득물을 불투명한 형광기 플레이트(Corning Costar, Acton Mass.)의 각 웰 내에 분주하여 상기 DNA를 반응제제에 결합시킴으로써 결정된다. 상기 플레이트는 Fluoroskan II(Labsystems Oy, Helsinki, Finland)로 스캔되어 샘플의 형광이 측정되고 DNA 농도가 정량된다. 반응 혼합물의 5ml 내지 10ml 분주액은 1% 아가로스 미니젤 상에서 전기영동에 의해 분석되어 서열을 확장하는 반응의 성공여부가 판정된다.
확장된 서열은 제염되고 농축되어 384 웰 플레이트로 이송되며, CviJI 콜레라 바이러스 엔도뉴클레이즈(Molecular Biology Research, Madison Wis.)로 처리되고 pUC18 벡터(Amersham Pharmacia Biotech.) 내로 재-라이게이션 되기전에 음파분쇄되거나 절단된다. 샷건 서열에 대해서는, 제한효소 처리된 단편을 약 0.6% 내지 0.8%의 아가로스 젤 상에서 분리하여, UV광 하에서 보여지는 단편들을 잘라내고, 상기 아가는 AGARACE(Promega)로 제거/제한 처리된다. 확장된 단편은 T4 DNA 라이게이즈(New England Biolabs)를 사용하여 pUC18 벡터(Amersham Pharmacia Biotech) 내로 재-라이게이션되며, 제한부위 오버행을 채우기 위해 Pfu DNA 폴리머레이즈(Stratagene)를 처리하여 E.coli 컴피턴트 셀 내로 형질전환한다. 형질전환된 세포를 항생제가 포함된 배지상에서 선별하고, 각 콜로니들을 취해 384 웰 플레이트 내에서 LB/2X 카베니실린 액체 배지로 37℃에서 밤새 배양한다.
상기 세포들을 세포용해하고, DNA를 Taq DNA 폴리머레이즈(Amersham Pharmacia Biotech) 및 Pfu DNA 폴리머레이즈(Stratagene)를 사용하여 하기 조건으로 증폭시킨다: 단계 1: 94℃, 3분; 단계 2: 94℃, 15초; 단계 3: 60℃, 1분; 단계 4: 72℃, 2분; 단계 5: 단계 2, 3 및 4를 29회 반복; 단계 6: 72℃, 5분; 및 단계 7: 4℃에 보관. DNA는 상술한 바와 같은 PICOGREEN 제제(Molecular Probes)를 사용하여 정량된다. 낮은 DNA 복구율을 갖는 샘플은 상술한 조건들을 사용하여 재증폭한다. 샘플들을 20% 다이메틸설폭사이드(1:2, v/v)로 희석하고, DYENAMIC energy 트랜스퍼 시퀀싱 프라이머 및 DYENAMIC DIRECT 키트(Amersham Pharmacia Biotech) 또는 ABI PRISM BIGDYE terminator 사이클 시퀀싱 반응 준비 키트(PE Biosystems)를 사용하여 서열분석한다.
이와 같은 방법으로, SEQ ID NOs: 1-163의 폴리뉴클레오타이드가 상술한 절차, 외부 확장을 위해 고안된 올리고뉴클레오타이드 및 게놈 DNA 라이브러리를 사용하여 조절 서열을 수득하는데 이용된다.
실시예 XL: 프로브의 표지 및 혼성화 분석
핵산을 생물학적 공급원으로부터 분리하고 기질을 하기 방법들 중 하나에 의한 표준 혼성화 프로토콜에 적용한다. 타겟 핵산, 게놈 DNA의 제한효소 처리된 단편들의 혼합물을 1x TAE[트리아세테이트-에틸렌다이아민테트라아세트산(EDTA)] 전개용 완충액으로 0.7% 아가로스 젤을 통해 전기영동으로 분리한 후, 20X 살린소듐사이트레이트(SSC)를 사용하여 모세관 이동에 의해 나일론 멤브레인으로 옮긴다. 대안적으로, 타겟 핵산을 각각 벡터로 라이게이션하고 이를 박테리아 숙주 세포에 삽입하여 라이브러리를 형성한다. 타겟 핵산은 하기 방법들 중 하나에 의해 기판 상에 정렬된다. 첫째 방법에서는, 각각의 클론을 포함하는 박테리아 세포가 자동적으로 선택되어 나일론 멤브레인 상에 정렬되는 것이다. 상기 멤브레인은 박테리아 성장 배지이면서 카베니실린을 포함하는 LB 아가 상에 놓여지며, 37℃에서 16시간 배양된다. 박테리아 콜로니들은 변성되고 중화되며 프로티네이즈 K에 의해 제한효소 처리된다. 나일론 멤브레인은 STRATALINKER UV-crosslinker(Stratagene) 내의 UV 발광에 노출되어 DNA와 상기 멤브레인이 가교결합하게 된다.
둘째 방법에서는, 삽입 유전자의 좌우에 있는 벡터 서열과 상보적인 프라이 머를 사용하여 30 사이클의 PCR을 수행함으로써 박테리아 벡터로부터 타겟 핵산을 증폭하는 것이다. 증폭된 타겟 핵산은 SEPHACRYL-400 비드(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 정제된다. 정제된 타겟 핵산은 유리 현미경 슬라이드(Corning Science Products, Corning NY) 상에 자동적으로 배열된다. 상기 슬라이드는 미리 0.05% 아미노프로필실레인(Sigma-Aldrich, St. Louis Mo.)으로 코팅하고 110℃에서 경화된 것이다. 상기 배열된 유리 슬라이드(마이크로어레이)를 STRATALINKER UV-crosslinker(Stratagene) 내의 UV 발광에 노출시킨다.
cDNA 프로브는 mRNA 주형으로부터 제조된다. 5㎍의 mRNA과 1mg의 랜덤 프라이머(Life Technologies)를 혼합하고, 70℃에서 10분간 배양한 후, 동결건조한다. 상기 동결건조된 샘플을 dNTP 믹스, [a-32P]dCTP, 다이싸이오쓰레이톨 및 MMLV 역전사효소(Stratagene)를 포함하는 1X 제1 스트랜드 완충액(cDNA Synthesis systems; Life Technologies) 50ml에 넣어 잘 섞어준 후, 42℃에서 1-2 시간 배양한다. 배양 후, 상기 프로브를 42ml dH2O로 희석하고 95℃로 3분간 가열한 후 얼음상에서 냉각시킨다. 프로브 내의 mRNA는 알칼리성 분해에 의해 제거된다. 상기 프로브는 중화되고, 분해된 mRNA 및 포함되지 않은 뉴클레오타이드는 PROBEQUANT G-50 MicroColumn(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 제거된다. 프로브는 방사성 뉴클레오타이드, [32P]dCTP 대신에 형광 마커, Cy3-dCTP 또는 Cy5-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech)로 표지될 수 있다.
혼성화는 0.5M 소듐 포스페이트(pH7.2), 7% SDS 및 1mM EDTA를 포함하는 혼 성화 완충액 내에서 65℃의 온도로 수행된다. 기질이 65℃에서 최소 2시간 혼성화 완충액 내에서 배양된 후, 상기 완충액은 프로브를 포함하는 10ml의 신규 완충액으로 교체된다. 65℃에서 18시간 배양한 후, 혼성화 완충액을 제거하고, 기질을 스트린전트 조건이 점점 증가되도록 하여 순차적으로 세척하는데, 상기 조건은 65℃에서 최대 40mM 소듐 포스페이트, 1% SDS, 1mM EDTA까지이다. 멤브레인 상에서 혼성화되고 방사능 표지된 프로브에 의해 수득된 신호를 검출하기 위하여, 상기 기질을 PHOSPHORIMAGER cassette(Amersham Pharmacia Biotech)에 노출시키고, 이미지를 IMAGEQUANT 데이터 분석 소프트웨어(Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 분석한다. 마이크로어레이 상에 혼성화된 형광표지의 프로브에 의해 수득된 신호를 검출하기 위해서는, 상기 기질을 공초점 레이저 현미경으로 조사하며, 상기 이미지들은 유전자 발현 분석 소프트웨어에 의하여 수집되고 분석된다.
실시예 XLI: 상보적인 폴리뉴클레오타이드
폴리뉴클레오타이드에 상보적인 분자 또는 그의 단편이 유전자 발현을 검출하고, 감소시키거나 저해하는데 사용된다. 약 15 내지 약 30개의 염기쌍을 포함하는 올리고뉴클레오타이드의 용도를 기술하였지만, 더 크거나 더 작은 단편들 또는 그들의 유도체들(예: 펩타이드 핵산, PNAs)에 있어서도 동일한 절차가 사용된다. 올리고뉴클레오타이드는 OLIGO 4.06 프라이머 분석 소프트웨어(National Biosciences) 및 SEQ ID NOs: 1-163을 사용하여 고안된다. 프로모터에 전사인자가 결합되지 못하게 하는 방법으로 전사를 억제하기 위하여, 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 가장 고유한 5' 서열에 결합되도록 고안되는데, 오픈 리딩 프레임의 개시 코돈 전 약 500 내지 10 뉴클레오타이드 사이의 위치에 결합되도록 하는 것이 가장 바람직하다. 해독을 억제하기 위하여서는, 포유동물의 단백질을 인코딩하는 mRNA에 대한 라이보좀의 결합을 억제하도록 상보적인 올리고뉴클레오타이드가 고안된다.
실시예 XLII: 특이적 항체의 생산
폴리뉴클레오타이드 및 그의 결합 단백질의 복합체를 포함하는 컨쥬게이트가 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동에 의해 정제되고 쥐나 토끼를 면역시키는데 사용된다. 항체들은 하기와 같은 방법으로 생산된다. 토끼는 완전 프로인트 보조액 내의 복합체로 면역된다. 그 후 일정한 간격으로 불완전 프로인트 보조액을 사용하여 면역이 반복된다. 쥐의 경우 최소 7주, 토끼의 경우 최소 12주가 지난 후, 항혈청을 수집하여 항펩타이드 활성을 시험한다. 시험은 플라스틱 지지체에 펩타이드를 결합시키는 단계, 1% 소혈청 알부민으로 차단하는 단계, 토끼 항혈청과 반응시키는 단계, 세척 단계 및 방사성 요오드화된 염소 항-토끼 IgG와 반응시키는 단계를 포함한다. 당해분야에 잘 알려진 방법들이 항체 적정 및 복합체 형성량을 판정하는데 사용된다.
실시예 XLIII: 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 컨쥬게이트와의 특이적 결합을 하는 분자들의 선별
폴리뉴클레오타이드 또는 그의 단편들이 32P-dCTP, Cy3-dCTP 또는 Cy5-dCTP(Amersham Pharmacia Biotech) 또는 BIODIPY나 FITC(Molecular Probes, Eugene OR)에 의해 각각 표지된다. 이와 유사하게, 폴리뉴클레오타이드 및 그의 결합 단백 질의 복합체를 포함하는 컨쥬게이트가 방사성 뉴클레오타이드 또는 형광 프로브에 의해 표지될 수 있다. 기판 상에 미리 배열된 후보 분자들 또는 화합물들의 라이브러리는 표지된 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질의 존재하에서 배양된다. 폴리뉴클레오타이드 또는 아미노산 분자들을 위한 조건 하에서의 배양이 끝난 후, 기판은 세척되며, 기판 상의 어느 위치가 표지를 함유한다면, 이는 특이적 결합이나 복합체 형성이 확인됨을 나타내고, 리간드가 식별된다. 다양한 농도의 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질을 사용하여 수득된 데이터는 표지된 폴리뉴클레오타이드 또는 단백질 및 결합된 분자 사이의 친화력을 계산하는데 사용된다.
당업자는 상술한 구현예들의 다양한 적용물 및 변형물을 본 발명의 범주 및 정신으로부터 벗어남 없이 구성할 수 있음을 이해할 것이다. 당해분야의 숙련자에 의해 본원에 기술된 본 발명의 상세한 설명의 관점에서 당해분야에 알려진 다른 적절한 기술 및 방법들이 수많은 구체적인 형태로 적용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 본원에 구체적으로 기술된 것 외에도 실행될 수 있음을 이해하여야 한다. 상술한 설명은 예시를 위한 것이지 본 발명을 한정하려는 의도에서 이루어진 것이 아니다. 상술한 설명의 재검토 토대 위에서, 많은 다른 구현예들이 당업자에게 자명해질 것이다. 그러므로, 본 발명의 범주는 첨부된 청구항과 관련하여 이러한 청구항들의 가치가 부여되는 등가물들의 전 범주를 함께 고려하여 결정되어야 한다.

Claims (68)

  1. 부분적으로 이중-가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체에 대한 효소의 활성을 제어하는 방법으로서,
    (a) 2개의 분리되고 인접해 있는 매질의 풀(pool)과 상기 2개의 풀 사이의 경계면(interface)을 제공하는 단계로서, 상기 경계면은 한번에 하나의 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드만이 한쪽 풀에서 다른 쪽 풀로 통과되도록 크기가 정해진 채널을 갖는 단계;
    (b) 상기 2개의 풀 중 하나에 제1 폴리뉴클레오타이드 및 제2 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 부분적으로 이중-가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체 및 차단 프라이머를 제공하는 단계로서, 상기 차단 프라이머의 일부분은 상기 제2 폴리뉴클레오타이드와 반응하지 않는(incompatible) 것인, 상기 폴리뉴클레오타이드 복합체 및 차단 프라이머를 제공하는 단계;
    (c) 상기 부분적으로 이중-가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체와 동일한 풀에 상기 부분적으로 이중-가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체에 대해서 결합 활성을 지니는 효소를 제공하는 단계로서, 상기 차단 프라이머가 상기 부분적으로 이중-가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체에 대한 효소의 활성을 방지하는 것인, 상기 효소를 제공하는 단계;
    (d) 상기 2개의 풀 사이에 전위차를 인가함으로써 제1 극성을 형성하는 단계; 및
    상기 차단 프라이머를 제거함으로써, 상기 부분적으로 이중-가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체에 대한 효소의 활성을 제어하는 단계를 포함하는, 효소의 활성제어방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 2개의 풀 사이의 전류를 측정하는 단계; 및 제1 극성이 유도된 시기에 수득된 전류값과, 후속 시기에 수득된 전류값을 비교하는 단계를 추가로 포함하는, 효소의 활성제어방법.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 반응하지 않는 상기 차단 프라이머의 부분이 펩타이드 핵산, 2'-O-메틸기, 형광 화합물, 뉴클레오타이드 유도체 및 뉴클레오타이드 아이소머로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 효소의 활성제어방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 효소는 DNA 폴리머레이즈, RNA 폴리머레이즈, 엔도뉴클레이즈, 엑소뉴클레이즈, DNA 라이게이즈, DNA 분해효소(DNase), 우라실-DNA 글라이코시데이즈, 카이네이즈(kinase), 포스파테이즈, 메틸레이즈, 아세틸레이즈 및 라이보좀(ribosome)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 효소의 활성제어방법.
  6. 제1항에 있어서, 효소 활성을 촉발하는 적어도 하나의 반응제(reagent)를 제공하는 단계; 및 상기 반응제를 상기 부분적으로 이중-가닥인 폴리뉴클레오타이드 복합체와 상기 효소를 포함하는 풀에 도입하는 단계를 추가로 포함하는, 효소의 활성제어방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 반응제는 데옥시리보뉴클레오타이드 및 보조인자로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 효소의 활성제어방법.
  8. 제7항에 있어서, 상기 데옥시리보뉴클레오타이드는 상기 보조인자를 도입하기 전에 상기 풀에 도입되는 것인, 효소의 활성제어방법.
  9. 제7항에 있어서, 상기 보조인자는 Mg2+, Mn2+, Ca2+, ATP, NAD+, NADP+ 및 S-아데노실메싸이오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 효소의 활성제어방법.
  10. 제1항에 있어서, 상기 매질은 전기 전도성을 갖는 것인, 효소의 활성제어방법.
  11. 제10항에 있어서, 상기 매질은 수용액인 것인, 효소의 활성제어방법.
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  61. 폴리뉴클레오타이드의 분석을 수행하기 위한 장치로서,
    (a) 단일-가닥 폴리뉴클레오타이드의 통과를 허용하는 크기와 형상으로 된 포어를 지니는 박막으로서, 상기 포어가 매질의 제1 풀과 매질의 제2풀을 연결하고, 분석될 폴리뉴클레오타이드가 상기 제1 풀에 존재하는 것인, 상기 박막;
    (b) 상기 폴리뉴클레오타이드에 대한 결합 활성을 지니는 효소, 및 상기 효소와 상기 폴리뉴클레오타이드 사이의 상호작용을 억제하는 차단 올리고머(blocking oligomer) 및 ;
    (c) 상기 제1 풀과 상기 제2 풀 사이에 전기장을 인가하는 전압 공급장치(voltage source); 및
    (d) 상기 포어를 통해서 상기 폴리뉴클레오타이드의 위치 이동 동안 상기 포어의 수송 특성을 검출하고 상기 폴리뉴클레오타이드의 특성을 결정하기 위한 검출 시스템을 포함하되,
    상기 효소와 상기 폴리뉴클레오타이드는 상기 제1 풀에 존재하는 것인, 폴리뉴클레오타이드의 분석 수행 장치.
  62. 제61항에 있어서, 상기 제1 풀과 상기 제2 풀 사이에, 소수성 영역과 친수성 영역을 지니는 화합물을 포함하는 박막을 더 포함하는, 폴리뉴클레오타이드의 분석 수행 장치.
  63. 제61항에 있어서, 상기 차단 올리고머는 스트린전트 조건(stringent condition) 하에 서열분석될 상기 폴리뉴클레오타이드에 결합되는 것인, 폴리뉴클레오타이드의 분석 수행 장치.
  64. 제61항에 있어서, 상기 효소는 DNA 폴리머레이즈, RNA 폴리머레이즈, 엔도뉴클레이즈, 엑소뉴클레이즈, DNA 라이게이즈, DNA 분해효소, 우라실-DNA 글라이코시데이즈, 토포아이소머레이즈(topoisomerase), 텔로머레이즈(telomerase), DNA-수복 효소(DNA-repair enzyme); DNA-취급 효소(DNA-handling enzyme), 헬리케이즈(helicase), 프리마제(primase), 자이레이즈(gyrase), 카이네이즈, 포스파테이즈, 메틸레이즈, 아세틸레이즈, 히스톤, 전사 인자 및 라이보좀으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인, 폴리뉴클레오타이드의 분석 수행 장치.
  65. 제64항에 있어서, 상기 차단 올리고머는 차단 잔기(blocking moiety)를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드의 분석 수행 장치.
  66. 제65항에 있어서, 상기 차단 올리고머는 듀플렉스 구조를 포함하는 것인, 폴리뉴클레오타이드의 분석 수행 장치.
  67. 제61항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드의 상기 특성은 해당 폴리뉴클레오타이드의 일치성, 상기 폴리뉴클레오타이드의 서열, 상기 폴리뉴클레오타이드 중의 뉴클레오타이드의 개수, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 이중-가닥 부분의 3' 말단에서의 염기 동일성 중 하나인 것인, 폴리뉴클레오타이드의 분석 수행 장치.
  68. 제61항에 있어서, 상기 포어는 생물학적 나노포어인 것인, 폴리뉴클레오타이드의 분석 수행 장치.
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US (16) US20110005918A1 (ko)
EP (2) EP2156179B1 (ko)
JP (3) JP5646987B2 (ko)
KR (1) KR101521990B1 (ko)
CN (1) CN101680873B (ko)
AU (1) AU2008236694B2 (ko)
CA (1) CA2684801C (ko)
IL (1) IL201303A0 (ko)
WO (1) WO2008124107A1 (ko)

Families Citing this family (246)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006028508A2 (en) * 2004-03-23 2006-03-16 President And Fellows Of Harvard College Methods and apparatus for characterizing polynucleotides
GB0523282D0 (en) 2005-11-15 2005-12-21 Isis Innovation Methods using pores
WO2007146158A1 (en) * 2006-06-07 2007-12-21 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Dna sequencing by nanopore using modified nucleotides
AU2008217579A1 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Oxford Nanopore Technologies Limited Formation of lipid bilayers
US20110005918A1 (en) 2007-04-04 2011-01-13 Akeson Mark A Compositions, devices, systems, and methods for using a nanopore
WO2009020682A2 (en) 2007-05-08 2009-02-12 The Trustees Of Boston University Chemical functionalization of solid-state nanopores and nanopore arrays and applications thereof
AU2008307485A1 (en) * 2007-10-02 2009-04-09 President And Fellows Of Harvard College Capture, recapture, and trapping of molecules with a nanopore
GB2453377A (en) 2007-10-05 2009-04-08 Isis Innovation Transmembrane protein pores and molecular adapters therefore.
GB0724736D0 (en) * 2007-12-19 2008-01-30 Oxford Nanolabs Ltd Formation of layers of amphiphilic molecules
US9447152B2 (en) 2008-07-07 2016-09-20 Oxford Nanopore Technologies Limited Base-detecting pore
WO2010004265A1 (en) 2008-07-07 2010-01-14 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme-pore constructs
US10759824B2 (en) 2008-09-03 2020-09-01 Quantumdx Group Limited Design, synthesis and use of synthetic nucleotides comprising charge mass tags
EP2321429B1 (en) * 2008-09-03 2016-08-17 Quantumdx Group Limited Methods and kits for nucleic acid sequencing
GB0820927D0 (en) 2008-11-14 2008-12-24 Isis Innovation Method
US20100148126A1 (en) * 2008-11-26 2010-06-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Genomic sequencing using modified protein pores and ionic liquids
CN102369298B (zh) 2009-01-30 2017-03-22 牛津纳米孔技术有限公司 跨膜测序中用于核酸构建体的衔接体
CA2750874A1 (en) * 2009-01-30 2010-08-05 Oxford Nanopore Technologies Limited Hybridization linkers
GB0905140D0 (en) 2009-03-25 2009-05-06 Isis Innovation Method
US8926904B2 (en) * 2009-05-12 2015-01-06 Daniel Wai-Cheong So Method and apparatus for the analysis and identification of molecules
AU2010301128B2 (en) 2009-09-30 2014-09-18 Quantapore, Inc. Ultrafast sequencing of biological polymers using a labeled nanopore
KR101814056B1 (ko) 2009-12-01 2018-01-02 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 리미티드 생화학적 분석 기구
US8324914B2 (en) 2010-02-08 2012-12-04 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for characterizing a molecule
US20110192723A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for manipulating a molecule in a nanopore
US9605307B2 (en) 2010-02-08 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for forming a nanopore in a lipid bilayer
US9678055B2 (en) 2010-02-08 2017-06-13 Genia Technologies, Inc. Methods for forming a nanopore in a lipid bilayer
WO2011097028A1 (en) * 2010-02-08 2011-08-11 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for manipulating a molecule in a nanopore
US20120052188A1 (en) 2010-02-08 2012-03-01 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for assembling a lipid bilayer on a substantially planar solid surface
US9121823B2 (en) * 2010-02-19 2015-09-01 The Trustees Of The University Of Pennsylvania High-resolution analysis devices and related methods
DK2539465T3 (da) 2010-02-23 2024-03-11 Univ Washington Analytsekventering med nanoporer
US9005425B2 (en) * 2010-03-05 2015-04-14 University Of Utah Research Foundation Detection of nucleic acid lesions and adducts using nanopores
JP5764296B2 (ja) * 2010-03-31 2015-08-19 株式会社日立ハイテクノロジーズ 生体ポリマーの特性解析法
CN103154729B (zh) 2010-06-08 2015-01-07 哈佛大学校长及研究员协会 具有由石墨烯支持的人工脂质膜的纳米孔装置
EP3190193A1 (en) 2010-07-14 2017-07-12 The Curators Of The University Of Missouri Nanopore-facilitated single molecule detection of nucleic acids
EP2614156B1 (en) 2010-09-07 2018-08-01 The Regents of The University of California Control of dna movement in a nanopore at one nucleotide precision by a processive enzyme
US9562809B2 (en) 2010-09-29 2017-02-07 Hitachi High-Technologies Corporation Biopolymer optical analysis device and method
WO2012043109A1 (ja) * 2010-09-30 2012-04-05 Jsr株式会社 マイクロアレイ用等の細孔板の製造方法、前記方法に用いられる感光性組成物、マイクロアレイ用等の細孔板およびマイクロアレイ用基板
CN103282518B (zh) 2010-12-17 2016-11-16 纽约哥伦比亚大学理事会 使用经修饰的核苷酸和纳米孔检测的dna边合成边测序
US8845880B2 (en) 2010-12-22 2014-09-30 Genia Technologies, Inc. Nanopore-based single DNA molecule characterization, identification and isolation using speed bumps
US9581563B2 (en) 2011-01-24 2017-02-28 Genia Technologies, Inc. System for communicating information from an array of sensors
US9110478B2 (en) 2011-01-27 2015-08-18 Genia Technologies, Inc. Temperature regulation of measurement arrays
CN103460040B (zh) 2011-02-11 2016-08-17 牛津纳米孔技术有限公司 突变型孔
BR112013030529B1 (pt) 2011-05-27 2023-03-07 Oxford Nanopore Technologies Plc Método para determinar a presença, ausência ou características de um analito, método e aparelho para sequenciamento de um analito que é um polinucleotídeo alvo, e, kit
US20140248608A1 (en) * 2011-06-24 2014-09-04 Electronic Biosciences, Inc. Methods for characterizing a device component based on a contrast signal to noise ratio
US10228347B2 (en) 2011-06-24 2019-03-12 Electronic Biosciences, Inc. High contrast signal to noise ratio device components
US20140235474A1 (en) 2011-06-24 2014-08-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non invasive assessment of a genetic variation
CA2843136C (en) 2011-07-25 2020-12-29 Oxford Nanopore Technologies Limited Hairpin loop method for double strand polynucleotide sequencing using transmembrane pores
WO2013019759A1 (en) * 2011-07-30 2013-02-07 The Regents Of The University Of California Enzymatic preparation of 10 base to 50 kb double-strand dna reagent for sequencing with a nanopore-polymerase sequencing device
US8652805B2 (en) 2011-08-15 2014-02-18 International Business Machines Corporation Trapping molecular segments in nano-gaps
WO2013041878A1 (en) * 2011-09-23 2013-03-28 Oxford Nanopore Technologies Limited Analysis of a polymer comprising polymer units
US10196681B2 (en) 2011-10-06 2019-02-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10424394B2 (en) 2011-10-06 2019-09-24 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US20140242588A1 (en) 2011-10-06 2014-08-28 Sequenom, Inc Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9984198B2 (en) 2011-10-06 2018-05-29 Sequenom, Inc. Reducing sequence read count error in assessment of complex genetic variations
US9367663B2 (en) 2011-10-06 2016-06-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US8688388B2 (en) 2011-10-11 2014-04-01 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9758823B2 (en) 2011-10-21 2017-09-12 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme method
WO2013067208A1 (en) * 2011-11-02 2013-05-10 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for determining genetic data
CN104126018B (zh) * 2011-12-29 2021-09-14 牛津纳米孔技术公司 酶方法
EP4148739A1 (en) 2012-01-20 2023-03-15 Sequenom, Inc. Diagnostic processes that factor experimental conditions
EP3415901A1 (en) * 2012-01-20 2018-12-19 Genia Technologies, Inc. Nanopore based molecular detection and sequencing
GB201202519D0 (en) 2012-02-13 2012-03-28 Oxford Nanopore Tech Ltd Apparatus for supporting an array of layers of amphiphilic molecules and method of forming an array of layers of amphiphilic molecules
JP6275052B2 (ja) * 2012-02-15 2018-02-07 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ リミテッド アプタマー法
BR112014020211A2 (pt) 2012-02-16 2017-07-04 Oxford Nanopore Tech Ltd métodos para analisar uma série ordenada por tempo de medições de um polímero, para estimar a presença, ausência ou quantidade de um polímero alvo, e para determinar uma alteração em um polímero, programa de computador, e, dispositivos de análise e de diagnóstico
KR102066758B1 (ko) * 2012-02-16 2020-02-11 더 리젠츠 오브 더 유니버시티 오브 캘리포니아 효소 매개 단백질 전위를 위한 나노기공 센서
CN104254619B (zh) * 2012-02-16 2018-08-24 吉尼亚科技公司 产生用于纳米孔传感器的双层的方法
US8986629B2 (en) 2012-02-27 2015-03-24 Genia Technologies, Inc. Sensor circuit for controlling, detecting, and measuring a molecular complex
US20140309878A1 (en) * 2013-04-15 2014-10-16 Flextronics Ap, Llc Providing gesture control of associated vehicle functions across vehicle zones
JP6456816B2 (ja) * 2012-04-09 2019-01-23 ザ・トラスティーズ・オブ・コランビア・ユニバーシティー・イン・ザ・シティー・オブ・ニューヨーク ナノ細孔の調製方法およびその使用
CN104350067A (zh) 2012-04-10 2015-02-11 牛津纳米孔技术公司 突变胞溶素孔
US10612083B2 (en) 2012-04-19 2020-04-07 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Methods and compositions for generating reference maps for nanopore-based polymer analysis
EP2846901B1 (en) * 2012-05-07 2017-03-29 The University of Ottawa Method for controlling the size of solid-state nanopores
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US10504613B2 (en) 2012-12-20 2019-12-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
WO2013185137A1 (en) 2012-06-08 2013-12-12 Pacific Biosciences Of California, Inc. Modified base detection with nanopore sequencing
WO2013188841A1 (en) 2012-06-15 2013-12-19 Genia Technologies, Inc. Chip set-up and high-accuracy nucleic acid sequencing
EP3674412A1 (en) * 2012-06-20 2020-07-01 The Trustees of Columbia University in the City of New York Nucleic acid sequencing by nanopore detection of tag molecules
US10497461B2 (en) 2012-06-22 2019-12-03 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2875154B1 (en) 2012-07-19 2017-08-23 Oxford Nanopore Technologies Limited SSB method for characterising a nucleic acid
CA2879261C (en) 2012-07-19 2022-12-06 Oxford Nanopore Technologies Limited Modified helicases
EP2895618B1 (en) 2012-09-14 2017-07-26 Oxford Nanopore Technologies Limited Sample preparation method
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
GB201313121D0 (en) 2013-07-23 2013-09-04 Oxford Nanopore Tech Ltd Array of volumes of polar medium
US9651539B2 (en) 2012-10-28 2017-05-16 Quantapore, Inc. Reducing background fluorescence in MEMS materials by low energy ion beam treatment
US9995728B2 (en) 2012-11-06 2018-06-12 Oxford Nanopore Technologies Ltd. Quadruplex method
US9605309B2 (en) 2012-11-09 2017-03-28 Genia Technologies, Inc. Nucleic acid sequencing using tags
GB201222928D0 (en) 2012-12-19 2013-01-30 Oxford Nanopore Tech Ltd Analysis of a polynucleotide
US10047129B2 (en) 2012-12-20 2018-08-14 Electronic Biosciences, Inc. Modified alpha hemolysin polypeptides and methods of use
US20130309666A1 (en) 2013-01-25 2013-11-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9759711B2 (en) 2013-02-05 2017-09-12 Genia Technologies, Inc. Nanopore arrays
JP2016507249A (ja) * 2013-02-20 2016-03-10 イブ バイオメディカル インコーポレイテッド ナノ構造ベースの核酸配列決定のための方法および組成物
GB201318465D0 (en) 2013-10-18 2013-12-04 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
AU2014224432B2 (en) 2013-03-08 2019-10-24 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme stalling method
GB201314695D0 (en) 2013-08-16 2013-10-02 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
WO2014144217A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Curators Of The University Of Missouri Encoded nanopore sensor for multiplex nucleic acids detection
WO2014144898A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Method for detecting multiple predetermined compounds in a sample
US10648026B2 (en) 2013-03-15 2020-05-12 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Raman cluster tagged molecules for biological imaging
GB201313477D0 (en) 2013-07-29 2013-09-11 Univ Leuven Kath Nanopore biosensors for detection of proteins and nucleic acids
FI2981921T3 (fi) 2013-04-03 2023-03-09 Sequenom Inc Menetelmiä ja prosesseja geneettisten variaatioiden ei-invasiiviseen arviointiin
US9250206B2 (en) * 2013-04-04 2016-02-02 International Business Machines Corporation Controlled translocation of macromolecules employing a funnel nanopore structure and a gel
US8950011B2 (en) * 2013-05-22 2015-02-03 International Business Machines Corporation Targeted sequencing of biomolecules by pulling through a liquid-liquid interface with an atomic force microscope
US9862997B2 (en) 2013-05-24 2018-01-09 Quantapore, Inc. Nanopore-based nucleic acid analysis with mixed FRET detection
IL300163B2 (en) 2013-05-24 2024-06-01 Sequenom Inc Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
LT3011051T (lt) 2013-06-21 2019-05-10 Sequenom, Inc. Genetinių variacijų neinvazinis vertinimo būdas
EP3014264A4 (en) 2013-06-25 2016-11-16 Two Pore Guys Inc QUANTIFICATION OF MULTIPLEXED BIOMARKERS BY NANOPORENT ANALYSIS OF BIOMARKER POLYMER COMPLEXES
ES2815099T3 (es) 2013-08-05 2021-03-29 Twist Bioscience Corp Genotecas sintetizadas de novo
JP6245664B2 (ja) * 2013-08-23 2017-12-13 株式会社右近工舎 表面増強ラマン散乱分光測定用基板及びそれを用いた装置
CN105814574B (zh) 2013-10-04 2019-04-26 塞昆纳姆股份有限公司 遗传变异的非侵入性评估的方法和过程
AU2014332241B2 (en) 2013-10-07 2021-04-29 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of chromosome alterations
US9551697B2 (en) 2013-10-17 2017-01-24 Genia Technologies, Inc. Non-faradaic, capacitively coupled measurement in a nanopore cell array
CN117947148A (zh) 2013-10-18 2024-04-30 牛津纳米孔科技公开有限公司 经修饰的酶
GB201406151D0 (en) 2014-04-04 2014-05-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
US9567630B2 (en) 2013-10-23 2017-02-14 Genia Technologies, Inc. Methods for forming lipid bilayers on biochips
EP3060918B1 (en) 2013-10-23 2019-09-18 Genia Technologies, Inc. High speed molecular sensing with nanopores
EP2886663A1 (en) * 2013-12-19 2015-06-24 Centre National de la Recherche Scientifique (CNRS) Nanopore sequencing using replicative polymerases and helicases
AU2015208919B9 (en) 2014-01-22 2021-04-01 Oxford Nanopore Technologies Limited Method for attaching one or more polynucleotide binding proteins to a target polynucleotide
GB201406155D0 (en) 2014-04-04 2014-05-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
WO2015126494A1 (en) 2014-02-19 2015-08-27 University Of Washington Nanopore-based analysis of protein characteristics
GB201403096D0 (en) 2014-02-21 2014-04-09 Oxford Nanopore Tech Ltd Sample preparation method
WO2015148402A1 (en) 2014-03-24 2015-10-01 The Trustees Of Columbia Univeristy In The City Of New York Chemical methods for producing tagged nucleotides
EP3126515B1 (en) 2014-04-04 2018-08-29 Oxford Nanopore Technologies Limited Method for characterising a double stranded nucleic acid using a nano-pore and anchor molecules at both ends of said nucleic acid
US10612084B2 (en) 2014-04-08 2020-04-07 International Business Machines Corporation Reduction of entropic barrier of polyelectrolyte molecules in a nanopore device with agarose gel
US10934581B2 (en) 2014-04-30 2021-03-02 International Business Machines Corporation Bow tie DNA compositions and methods
GB201417712D0 (en) 2014-10-07 2014-11-19 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
EP3137627A1 (en) 2014-05-02 2017-03-08 Oxford Nanopore Technologies Limited Method of improving the movement of a target polynucleotide with respect to a transmembrane pore
CA3221500A1 (en) 2014-06-03 2015-12-10 Illumina, Inc. Compositions, systems, and methods for detecting events using tethers anchored to or adjacent to nanopores
EP3760739A1 (en) 2014-07-30 2021-01-06 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10494665B2 (en) * 2014-08-20 2019-12-03 Huawei Yang Test kit and method for testing target nucleic acid in sample
CN119899249A (zh) 2014-09-01 2025-04-29 弗拉芒区生物技术研究所 突变csgg孔
US10282874B2 (en) * 2014-09-17 2019-05-07 Circonus, Inc. Efficient time-series histograms
EP3204511B1 (en) 2014-10-07 2021-07-28 Oxford Nanopore Technologies Limited Mutant pores
AU2015330841B2 (en) 2014-10-10 2019-08-15 Quantapore, Inc. Nanopore-based polymer analysis with mutually-quenching fluorescent labels
GB201418159D0 (en) 2014-10-14 2014-11-26 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
EP4397972A3 (en) 2014-10-16 2024-10-09 Oxford Nanopore Technologies PLC Alignment mapping estimation
GB201418469D0 (en) 2014-10-17 2014-12-03 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
CN113981055A (zh) 2014-10-17 2022-01-28 牛津纳米孔技术公司 纳米孔rna表征方法
GB201418512D0 (en) 2014-10-17 2014-12-03 Oxford Nanopore Tech Ltd Electrical device with detachable components
EP3209800B1 (en) 2014-10-24 2022-02-16 Quantapore, Inc. Efficient optical analysis of polymers using arrays of nanostructures
US10060903B2 (en) * 2014-11-05 2018-08-28 Genia Technologies, Inc. Exporting measurements of nanopore arrays
US9863904B2 (en) 2014-12-19 2018-01-09 Genia Technologies, Inc. Nanopore-based sequencing with varying voltage stimulus
US9557294B2 (en) * 2014-12-19 2017-01-31 Genia Technologies, Inc. Nanopore-based sequencing with varying voltage stimulus
WO2016106690A1 (en) * 2014-12-31 2016-07-07 Coyote Bioscience Co., Ltd. Detection of nucleic acid molecules using nanopores and complexing moieties
EP3253889A4 (en) 2015-02-02 2018-09-26 Two Pore Guys, Inc. Nanopore detection of target polynucleotides from sample background
US10669304B2 (en) 2015-02-04 2020-06-02 Twist Bioscience Corporation Methods and devices for de novo oligonucleic acid assembly
GB201502809D0 (en) 2015-02-19 2015-04-08 Oxford Nanopore Tech Ltd Mutant pore
GB201502810D0 (en) 2015-02-19 2015-04-08 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
EP3283887B1 (en) 2015-04-14 2021-07-21 Katholieke Universiteit Leuven Nanopores with internal protein adaptors
WO2016172377A1 (en) 2015-04-21 2016-10-27 Twist Bioscience Corporation Devices and methods for oligonucleic acid library synthesis
US20180363035A1 (en) * 2015-05-15 2018-12-20 Two Pore Guys, Inc. Methods and Compositions for Target Detection in a Nanopore Using a Labelled Polymer Scaffold
GB201508669D0 (en) 2015-05-20 2015-07-01 Oxford Nanopore Tech Ltd Methods and apparatus for forming apertures in a solid state membrane using dielectric breakdown
IL255758B (en) 2015-06-03 2022-07-01 Illumina Inc Compositions, systems, and methods for sequencing polynucleotides using tethers anchored to polymerases adjacent to nanopores
GB2557529A (en) 2015-09-18 2018-06-20 Twist Bioscience Corp Oligonucleic acid variant libraries and synthesis thereof
KR102794025B1 (ko) 2015-09-22 2025-04-09 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 합성을 위한 가요성 기판
US10126262B2 (en) 2015-09-24 2018-11-13 Genia Technologies, Inc. Differential output of analog memories storing nanopore measurement samples
US10102338B2 (en) * 2015-09-24 2018-10-16 Genia Technologies, Inc. Adaptive compression and modification of nanopore measurement data
EP3384077A4 (en) 2015-12-01 2019-05-08 Twist Bioscience Corporation FUNCTIONALIZED SURFACES AND THEIR PREPARATION
AU2016369071B2 (en) 2015-12-08 2022-05-19 Katholieke Universiteit Leuven Ku Leuven Research & Development Modified nanopores, compositions comprising the same, and uses thereof
EP3400444A4 (en) 2016-01-04 2019-10-16 QuantuMDx Group Limited DESIGN, SYNTHESIS AND USE OF SYNTHETIC NUCLEOTIDES COMPRISING SPECIFIC CHARGE LABELS
WO2017125565A1 (en) * 2016-01-21 2017-07-27 Genia Technologies, Inc. Nanopore sequencing complexes
US10859562B2 (en) 2016-02-29 2020-12-08 Iridia, Inc. Methods, compositions, and devices for information storage
US10438662B2 (en) 2016-02-29 2019-10-08 Iridia, Inc. Methods, compositions, and devices for information storage
US10640822B2 (en) * 2016-02-29 2020-05-05 Iridia, Inc. Systems and methods for writing, reading, and controlling data stored in a polymer
EP4019542A1 (en) 2016-03-02 2022-06-29 Oxford Nanopore Technologies plc Mutant pores
WO2017165675A1 (en) * 2016-03-24 2017-09-28 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Treatment of drug resistant proliferative diseases with telomerase mediated telomere altering compounds
US11486873B2 (en) * 2016-03-31 2022-11-01 Ontera Inc. Multipore determination of fractional abundance of polynucleotide sequences in a sample
EP4122949B1 (en) 2016-04-06 2024-06-05 Oxford Nanopore Technologies plc Mutant pore
US10883140B2 (en) * 2016-04-21 2021-01-05 President And Fellows Of Harvard College Method and system of nanopore-based information encoding
US10081879B2 (en) 2016-05-06 2018-09-25 Qualcomm Incorporated Method and apparatus for increasing a lifespan of nanopore-based DNA sensing devices
GB201609220D0 (en) 2016-05-25 2016-07-06 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
EP3464616B1 (en) * 2016-05-25 2022-05-04 Oxford Nanopore Technologies plc Method
US11124827B2 (en) * 2016-06-23 2021-09-21 Roche Sequencing Solutions, Inc. Period-to-period analysis of AC signals from nanopore sequencing
CN106198952A (zh) * 2016-07-01 2016-12-07 清华大学 一种抑制核酸分子对传感界面非特异性吸附的封闭方法
WO2018009346A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 Quantapore, Inc. Optically based nanopore sequencing
GB201611770D0 (en) 2016-07-06 2016-08-17 Oxford Nanopore Tech Microfluidic device
US11200963B2 (en) 2016-07-27 2021-12-14 Sequenom, Inc. Genetic copy number alteration classifications
KR102212257B1 (ko) 2016-08-22 2021-02-04 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 드 노보 합성된 핵산 라이브러리
US10417457B2 (en) 2016-09-21 2019-09-17 Twist Bioscience Corporation Nucleic acid based data storage
CN109564185A (zh) * 2016-10-24 2019-04-02 双孔人公司 样品中多核苷酸序列的分数丰度
CN106568831B (zh) * 2016-11-18 2019-07-23 武汉理工大学 一种用于检测磷酸肌醇的多孔膜材料及其制备与检测方法
GB201619930D0 (en) * 2016-11-24 2017-01-11 Oxford Nanopore Tech Apparatus and methods for controlling insertion of a membrane channel into a membrane
JP6653767B2 (ja) * 2016-12-09 2020-02-26 株式会社日立ハイテクノロジーズ ナノポア形成方法、ナノポア形成装置及び生体分子計測装置
EA201991262A1 (ru) 2016-12-16 2020-04-07 Твист Байосайенс Корпорейшн Библиотеки вариантов иммунологического синапса и их синтез
US9932631B1 (en) 2017-09-11 2018-04-03 Omniome, Inc. Genotyping by polymerase binding
WO2018136117A1 (en) 2017-01-20 2018-07-26 Omniome, Inc. Allele-specific capture of nucleic acids
CA3050055C (en) 2017-01-24 2023-09-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for assessment of genetic variations
KR102723464B1 (ko) 2017-02-22 2024-10-28 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 핵산 기반 데이터 저장
CN110913865A (zh) 2017-03-15 2020-03-24 特韦斯特生物科学公司 免疫突触的变体文库及其合成
GB201707122D0 (en) 2017-05-04 2017-06-21 Oxford Nanopore Tech Ltd Pore
EP3404113A1 (en) * 2017-05-19 2018-11-21 Universidad del Pais Vasco Method for detecting protein-dna interaction
WO2018231864A1 (en) 2017-06-12 2018-12-20 Twist Bioscience Corporation Methods for seamless nucleic acid assembly
KR20250040758A (ko) 2017-06-12 2025-03-24 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 심리스 핵산 어셈블리를 위한 방법
RU2747714C1 (ru) 2017-06-20 2021-05-13 Иллюмина, Инк. Нанопоровые секвенаторы
EP3957990A1 (en) * 2017-06-29 2022-02-23 President and Fellows of Harvard College Deterministic stepping of polymers through a nanopore
CN110914290A (zh) 2017-06-30 2020-03-24 弗拉芒区生物技术研究所 新颖蛋白孔
CN107436317A (zh) * 2017-07-21 2017-12-05 河南金泰生物技术股份有限公司 一种利用纳米通道技术检测癌症的方法
US11407837B2 (en) 2017-09-11 2022-08-09 Twist Bioscience Corporation GPCR binding proteins and synthesis thereof
CN107727705B (zh) * 2017-09-28 2019-12-10 东南大学 一种酶反应检测纳米孔电学传感器
US10894242B2 (en) 2017-10-20 2021-01-19 Twist Bioscience Corporation Heated nanowells for polynucleotide synthesis
US10621746B2 (en) 2017-11-07 2020-04-14 Symbol Technologies, Llc Methods and apparatus for rapidly dimensioning an object
GB2568895B (en) 2017-11-29 2021-10-27 Oxford Nanopore Tech Ltd Microfluidic device
JP7038215B2 (ja) 2017-12-28 2022-03-17 エフ．ホフマン－ラ ロシュ アーゲー 交流信号によって駆動されるナノポアｄｎａ配列決定システム由来の不規則信号におけるノイズの測定および除去
GB2589159B (en) 2017-12-29 2023-04-05 Clear Labs Inc Nucleic acid sequencing apparatus
JP7191448B2 (ja) 2018-01-04 2022-12-19 ツイスト バイオサイエンス コーポレーション Ｄｎａベースのデジタル情報ストレージ
WO2019169114A1 (en) * 2018-03-01 2019-09-06 The Regents Of The University Of California Methods for determining bound and unbound regions in nucleic acid molecules and systems for practicing same
EA039806B1 (ru) * 2018-03-29 2022-03-16 Твист Байосайенс Корпорейшн Хранение цифровой информации на основе днк
CN108315212B (zh) * 2018-04-02 2023-11-10 通用生物(安徽)股份有限公司 384孔板引物转移装置
GB201807793D0 (en) 2018-05-14 2018-06-27 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
CA3100739A1 (en) 2018-05-18 2019-11-21 Twist Bioscience Corporation Polynucleotides, reagents, and methods for nucleic acid hybridization
WO2019226689A1 (en) 2018-05-22 2019-11-28 Axbio Inc. Methods, systems, and compositions for nucleic acid sequencing
EP3844506A4 (en) * 2018-08-28 2022-10-26 Nanjing University PROTEIN NANOPORES FOR ANALYTE IDENTIFICATION
GB201814369D0 (en) * 2018-09-04 2018-10-17 Oxford Nanopore Tech Ltd Method for determining a polymersequence
US12105079B2 (en) 2018-09-11 2024-10-01 Rijksuniversiteit Groningen Biological nanopores having tunable pore diameters and uses thereof as analytical tools
KR102560306B1 (ko) 2018-10-05 2023-07-26 삼성전자주식회사 혈압 추정 장치 및 방법
CN109541210B (zh) * 2018-11-13 2022-02-08 广东工业大学 一种多通道肿瘤标志物并行检测传感器及其使用方法
CN113166703A (zh) * 2018-11-21 2021-07-23 深圳华大生命科学研究院 核酸分子检测方法、检测装置和检测系统
CN119708086A (zh) 2018-12-26 2025-03-28 特韦斯特生物科学公司 高度准确的从头多核苷酸合成
KR20210143766A (ko) 2019-02-26 2021-11-29 트위스트 바이오사이언스 코포레이션 Glp1 수용체에 대한 변이체 핵산 라이브러리
US11492728B2 (en) 2019-02-26 2022-11-08 Twist Bioscience Corporation Variant nucleic acid libraries for antibody optimization
JP7492200B2 (ja) 2019-03-12 2024-05-29 オックスフォード ナノポール テクノロジーズ ピーエルシー ナノ細孔センシングデバイスと操作方法およびその成形方法
KR20220011639A (ko) * 2019-04-22 2022-01-28 온테라 인크. 샘플 내 폴리뉴클레오타이드 서열의 분포분율의 멀티포어 결정
US11926819B2 (en) 2019-05-28 2024-03-12 The Regents Of The University Of California Methods of adding polymers to ribonucleic acids
US12223643B2 (en) 2019-06-03 2025-02-11 Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute Machine-learning system for diagnosing disorders and diseases and determining drug responsiveness
EP3987019A4 (en) 2019-06-21 2023-04-19 Twist Bioscience Corporation Barcode-based nucleic acid sequence assembly
US11807909B1 (en) 2019-09-12 2023-11-07 Zymo Research Corporation Methods for species-level resolution of microorganisms
CN114364797B (zh) * 2019-09-18 2023-10-20 株式会社日立高新技术 生物分子分析方法
WO2021053744A1 (ja) * 2019-09-18 2021-03-25 株式会社日立ハイテク アダプター分子、当該アダプター分子と生体分子とが結合した生体分子－アダプター分子複合体、生体分子分析装置及び生体分子分析方法
CN115003697A (zh) 2019-09-23 2022-09-02 特韦斯特生物科学公司 Crth2的变异核酸文库
AU2020355027A1 (en) 2019-09-23 2022-04-21 Twist Bioscience Corporation Antibodies that bind CD3 Epsilon
CA3158106A1 (en) * 2019-11-15 2021-05-20 David MARASH Methods and systems for generating biological molecules
US11536708B2 (en) 2020-01-09 2022-12-27 Applied Materials, Inc. Methods to fabricate dual pore devices
CN111272612B (zh) * 2020-03-03 2022-01-28 西南石油大学 一种破乳剂的初筛方法
JP2021156712A (ja) * 2020-03-26 2021-10-07 株式会社アドバンテスト 微粒子測定システム、計測装置
US12222346B2 (en) 2020-04-01 2025-02-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Stable nanopores and nanopore arrays for ionic and other measurements
WO2021231920A1 (en) * 2020-05-15 2021-11-18 The Curators Of The University Of Missouri Nanopore unzipping-sequencing for dna data storage
JPWO2021240761A1 (ko) * 2020-05-29 2021-12-02
GB202009349D0 (en) * 2020-06-18 2020-08-05 Oxford Nanopore Tech Ltd Method
CN111705329B (zh) * 2020-07-31 2021-07-02 湖南科技学院 一种5-芳硫基尿嘧啶化合物的电化学合成方法
US11837302B1 (en) 2020-08-07 2023-12-05 Iridia, Inc. Systems and methods for writing and reading data stored in a polymer using nano-channels
US12351869B1 (en) 2020-11-19 2025-07-08 Digital Biotechnologies, Inc. Nucleic acid sequencing compositions and methods
CN118996004A (zh) * 2021-08-30 2024-11-22 四川大学 一种检测样本中目标核酸的存在的方法
CA3223744A1 (en) * 2021-09-22 2023-03-30 Jeffrey Mandell Sequencing polynucleotides using nanopores
CN118318049A (zh) 2021-09-28 2024-07-09 安序源有限公司 用于处理核酸样品的方法以及核酸样品的组合物
GB202202716D0 (en) 2022-02-28 2022-04-13 Oxford Nanopore Tech Plc Apparatus and methods for controlling insertion of a membrane channel into a membrane
WO2024091124A1 (en) 2022-10-28 2024-05-02 Rijksuniversiteit Groningen Nanopore-based analysis of proteins
GB202307486D0 (en) 2023-05-18 2023-07-05 Oxford Nanopore Tech Plc Method
WO2025019760A1 (en) * 2023-07-20 2025-01-23 Sapphiros Llc Polymer substrate conductive flow cell
WO2025120150A1 (en) 2023-12-08 2025-06-12 Oxford Nanopore Technologies Plc Methods and apparatus for forming apertures, methods and apparatus for unblocking apertures, methods of sensing molecular entities in apertures, and measurement systems

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060028508A1 (en) * 2004-08-05 2006-02-09 Zhenfang Chen Print head nozzle formation
US20060063171A1 (en) * 2004-03-23 2006-03-23 Mark Akeson Methods and apparatus for characterizing polynucleotides

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5605662A (en) * 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5846708A (en) * 1991-11-19 1998-12-08 Massachusetts Institiute Of Technology Optical and electrical methods and apparatus for molecule detection
US5593840A (en) * 1993-01-27 1997-01-14 Oncor, Inc. Amplification of nucleic acid sequences
AU6703994A (en) 1993-04-26 1994-11-21 E.I. Du Pont De Nemours And Company Durable methacrylic acid polymer stain-resists
WO1994025862A1 (en) * 1993-05-04 1994-11-10 Washington State University Research Foundation Biosensor substrate for mounting bilayer lipid membrane containing a receptor
JP3109359B2 (ja) 1993-12-24 2000-11-13 松下電器産業株式会社 密閉型スクロール圧縮機およびその組付け方法
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5795782A (en) 1995-03-17 1998-08-18 President & Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
US6362002B1 (en) 1995-03-17 2002-03-26 President And Fellows Of Harvard College Characterization of individual polymer molecules based on monomer-interface interactions
JP3891620B2 (ja) * 1996-11-14 2007-03-14 株式会社アイシン・コスモス研究所 ヘアピン型構造の核酸プローブ分子、及び該核酸プローブ分子を利用した核酸検出方法
US5932451A (en) 1997-11-19 1999-08-03 Incyte Pharmaceuticals, Inc. Method for unbiased mRNA amplification
WO1999046598A1 (en) * 1998-03-10 1999-09-16 The Regents Of The University Of California Methods and tools for identifying compounds which modulate atherosclerosis by impacting ldl-proteoglycan binding
US6168920B1 (en) * 1998-08-10 2001-01-02 Incyte Genomics, Inc. Extracellular adhesive proteins
US6267872B1 (en) * 1998-11-06 2001-07-31 The Regents Of The University Of California Miniature support for thin films containing single channels or nanopores and methods for using same
CA2354076A1 (en) * 1998-12-11 2000-06-22 The Government Of The United States Represented By The Administrator Of The National Aeronautics And Space Administration (Nasa) Ferroelectric pump
US6197526B1 (en) * 1999-01-04 2001-03-06 Dyax Corp. Polypeptides for binding human factor VIII and fragments of human factor VIII
US6376186B1 (en) 1999-05-03 2002-04-23 Gen-Probe Incorporated Polynucleotide probes for detection and quantitation of staphylococcus
US6464842B1 (en) * 1999-06-22 2002-10-15 President And Fellows Of Harvard College Control of solid state dimensional features
EP1192103A1 (en) 1999-06-22 2002-04-03 President And Fellows of Harvard College Control of solid state dimensional features
DE60025739T2 (de) * 1999-09-07 2006-08-31 The Regents Of The University Of California, Oakland Verfahren um die anwesenheit von doppelsträngiger dns in einer probe nachzuweisen
US6916665B2 (en) 2000-02-11 2005-07-12 The Texas A&M University System Biosensor compositions and methods of use
US6248567B1 (en) * 2000-04-24 2001-06-19 Wisconsin Alumni Research Foundation Template-specific termination in a polymerase chain reaction
EP2320343A3 (en) 2000-09-28 2011-06-22 Wisconsin Alumni Research Foundation System and process for validating, aligning and reordering one or more genetic sequence maps using at least one ordered restriction map
US6632610B2 (en) 2000-10-12 2003-10-14 Gensat S.A. Methods of identification and isolation of polynucleotides containing nucleic acid differences
AU2002239284A1 (en) * 2000-11-27 2002-06-03 The Regents Of The University Of California Methods and devices for characterizing duplex nucleic acid molecules
US20050009004A1 (en) 2002-05-04 2005-01-13 Jia Xu Apparatus including ion transport detecting structures and methods of use
US20030104428A1 (en) * 2001-06-21 2003-06-05 President And Fellows Of Harvard College Method for characterization of nucleic acid molecules
US6972173B2 (en) 2002-03-14 2005-12-06 Intel Corporation Methods to increase nucleotide signals by raman scattering
EP1525213B1 (en) 2001-10-24 2012-06-27 National Jewish Health Three-dimensional structures of tall-1 and its cognate receptors and modified proteins and methods related thereto
US7005264B2 (en) 2002-05-20 2006-02-28 Intel Corporation Method and apparatus for nucleic acid sequencing and identification
US20040022764A1 (en) 2002-07-31 2004-02-05 Hanan Polansky Inhibition of microcompetition with a foreign polynucleotide as treatment of chronic disease
US6916627B2 (en) * 2002-11-27 2005-07-12 St. Jude Children's Research Hospital ATM kinase compositions and methods
US6870361B2 (en) 2002-12-21 2005-03-22 Agilent Technologies, Inc. System with nano-scale conductor and nano-opening
US7282130B2 (en) * 2003-01-31 2007-10-16 Agilent Technologies, Inc. Apparatus and method for control of biopolymer translocation through a nanopore
EP1601760A4 (en) * 2003-02-28 2009-08-19 Univ Brown NANOPORES, METHOD OF THEIR USE, METHOD FOR THE PRODUCTION THEREOF AND METHOD FOR CHARACTERIZING BIOMOLECULES USING THEREOF
US7501279B2 (en) 2003-04-03 2009-03-10 University Of Washington Microwell arrays with nanoholes
US7250115B2 (en) * 2003-06-12 2007-07-31 Agilent Technologies, Inc Nanopore with resonant tunneling electrodes
US20050136408A1 (en) * 2003-12-19 2005-06-23 May Tom-Moy Methods and systems for characterizing a polymer
US7462452B2 (en) 2004-04-30 2008-12-09 Pacific Biosciences Of California, Inc. Field-switch sequencing
US20070054276A1 (en) * 2004-08-12 2007-03-08 Sampson Jeffrey R Polynucleotide analysis and methods of using nanopores
WO2006020775A2 (en) 2004-08-13 2006-02-23 Harvard University An ultra high-throughput opti-nanopore dna readout platform
US20060073489A1 (en) * 2004-10-05 2006-04-06 Gangqiang Li Nanopore separation devices and methods of using same
GB0505971D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Isis Innovation Delivery of molecules to a lipid bilayer
EP2348300A3 (en) * 2005-04-06 2011-10-12 The President and Fellows of Harvard College Molecular characterization with carbon nanotube control
EP1721657A1 (en) * 2005-05-13 2006-11-15 SONY DEUTSCHLAND GmbH A method of fabricating a polymeric membrane having at least one pore
US20070048759A1 (en) 2005-06-10 2007-03-01 Dan Luo Detection of target molecules with labeled nucleic acid detection molecules
US20070048745A1 (en) * 2005-08-30 2007-03-01 Joyce Timothy H Systems and methods for partitioned nanopore analysis of polymers
US7835870B2 (en) 2005-11-01 2010-11-16 Georgia Institute Of Technology Methods and systems for evaluating the length of elongated elements
CA2631713A1 (en) 2005-12-02 2007-09-13 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Modulators of cdc2-like kinases (clks) and methods of use thereof
US7426117B2 (en) 2005-12-21 2008-09-16 Xerox Corporation Chip on a board
RU2009102155A (ru) * 2006-06-30 2010-08-10 Апплера Корпорейшн (Us) Способы анализирования связывающих взаимодействий
GB0625070D0 (en) 2006-12-15 2007-01-24 Imp Innovations Ltd Characterization of molecules
AU2008217579A1 (en) 2007-02-20 2008-08-28 Oxford Nanopore Technologies Limited Formation of lipid bilayers
US20110005918A1 (en) 2007-04-04 2011-01-13 Akeson Mark A Compositions, devices, systems, and methods for using a nanopore
EP2195648B1 (en) 2007-09-12 2019-05-08 President and Fellows of Harvard College High-resolution molecular graphene sensor comprising an aperture in the graphene layer
GB0724736D0 (en) 2007-12-19 2008-01-30 Oxford Nanolabs Ltd Formation of layers of amphiphilic molecules
WO2010004265A1 (en) 2008-07-07 2010-01-14 Oxford Nanopore Technologies Limited Enzyme-pore constructs
US9447152B2 (en) 2008-07-07 2016-09-20 Oxford Nanopore Technologies Limited Base-detecting pore
CN102099668B (zh) 2008-07-17 2013-05-01 皇家飞利浦电子股份有限公司 纳米孔装置和用于核酸分析的方法
US8486630B2 (en) 2008-11-07 2013-07-16 Industrial Technology Research Institute Methods for accurate sequence data and modified base position determination
GB0820927D0 (en) 2008-11-14 2008-12-24 Isis Innovation Method
CA2750874A1 (en) 2009-01-30 2010-08-05 Oxford Nanopore Technologies Limited Hybridization linkers
WO2010117470A2 (en) 2009-04-10 2010-10-14 Pacific Biosciences Of California, Inc. Nanopore sequencing devices and methods
KR20110138286A (ko) 2009-04-20 2011-12-26 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 리미티드 지질 이분자층 센서 어레이
KR101814056B1 (ko) 2009-12-01 2018-01-02 옥스포드 나노포어 테크놀로지즈 리미티드 생화학적 분석 기구
US8324914B2 (en) 2010-02-08 2012-12-04 Genia Technologies, Inc. Systems and methods for characterizing a molecule
EP2614156B1 (en) 2010-09-07 2018-08-01 The Regents of The University of California Control of dna movement in a nanopore at one nucleotide precision by a processive enzyme
WO2012173905A1 (en) 2011-06-16 2012-12-20 The Regents Of The Unversity Of California Salt-tolerant dna polymerases
RU2747714C1 (ru) 2017-06-20 2021-05-13 Иллюмина, Инк. Нанопоровые секвенаторы
CA3066469C (en) 2018-02-16 2022-06-21 Illumina, Inc. Device for sequencing

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060063171A1 (en) * 2004-03-23 2006-03-23 Mark Akeson Methods and apparatus for characterizing polynucleotides
US20060028508A1 (en) * 2004-08-05 2006-02-09 Zhenfang Chen Print head nozzle formation

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