KR101505412B1

KR101505412B1 - 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴의 제조방법

Info

Publication number: KR101505412B1
Application number: KR1020080098548A
Authority: KR
Inventors: 아우로 로베르토 타글리아니; 가브리엘 과스타렉네임; 지오반니 포글리아토; 리카르도 몽구찌
Original assignee: 에이씨에스 도브파 에스. 피. 에이.
Priority date: 2007-10-09
Filing date: 2008-10-08
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2028-10-08
Also published as: US8067195B2; CN101418331B; EP2048240A2; CN101418331A; EP2048240A3; ITMI20071951A1; US20090093032A1; KR20090036515A

Abstract

수중에서 수행되고 효소에 의해 촉매처리되는 가수분해 공정에 의한 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴의 제조방법에 관한 것이다. 세폭시틴은 공지된 방법에 의해 당해 화합물로부터 수득될 수 있다.

효소, 촉매처리, 가수분해 공정, 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴, 세폭시틴, 세팔로스포라닉 환, β-락탐 항생제, 아세틸 가수분해(hydrolasic) 활성

Description

7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴의 제조방법{Process for producing 7-methoxy-3-desacetylcefalotin}

본 발명은 생체 촉매를 사용한 혁신적인 공정에 따라 세폭시틴 합성 중간체인 화학식 I의 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴의 제조방법에 관한 것이다.

[화학식 I]

세폭시틴은 세팔로스포라닉 환의 7위치에서 메톡시 그룹의 존재를 특징으로 하는 세팔로마이신, 즉, β-락탐 항생제의 부류에 속한다.

이러한 항생제는 카복실 및/또는 아미노 그룹 상에 상이한 보호 그룹을 사용하여 다양한 데스아세틸화 중간체를 다양한 작용 제제로 카바모일화함을 포함하는 상이한 합성 경로를 예시하는 미국 특허 제4,297,488호에 기재되어 있다. 또한, 상기 특허에는 수득된 생성물의 품질에 대한 주석(comment) 없이 매우 느린 반응시간(6 내지 15시간)으로, 감귤류 껍질로부터의 아세틸-에스테라제를 사용하여 이들 유도체의 몇몇을 제조하기 위한 효소적 가수분해 통로를 기재하고 있다. 탈보호 및 효소적 가수분해를 수행하여 카복실산 형태의 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴을 수득하는 p-니트로벤질 에스테르와 같은 보호된 중간체를 사용하는 유사한 공정은 또한 문헌[참조: Tetrahedron Lett 46, 4653-6 (1973)]에서 동일한 저자에 의해 언급되어 있다. 이어서, 당해 생성물은 클로로설포닐 이소시아네이트로 처리하여 세폭시틴을 수득한다.

현대 화학에서 산업적인 규모로 일반적으로 사용되는 합성 경로는 원 재료로서 7-ACA(7-아미노세팔로스포라닉 산)를 사용하여 광학적으로 순수한 세폭시틴을 제조하며, 바람직하게는 다음 순서로 수행되는 4개의 주요 단계를 포함한다:

1. 7위치에서 아미노 그룹의 아실화

2. 7α위치에서 메톡시 그룹의 도입

3. 3위치에서 아세틸 그룹의 제거

4. 이전의 단계에서 수득된 3위치에서의 하이드록실 그룹의 카바모일화.

단계 1은 세팔로스포린인 세팔로틴의 합성에 상응한다. 이는 메톡실화에 의 해 상응하는 세팔로마이신으로 변형시켜 중간체 II를 수득한 다음(단계 2), 데스아세틸화하여 화학식 I의 화합물을 수득한다.

[화학식 II]

다른 순서가 가능하기는 하지만, 상기에 언급된 것은 원 재료의 절약을 가능하게 하면서, 아미노 그룹 또는 카복실 그룹에 대한 보호 그룹을 사용하지 않으며, 따라서 필요한 조작의 수를 최소화할 수 있게 하므로 유리하다.

예를 들면, 국제 공개공보 제WO 2004/083217 A1호(제6면)에는 -45℃로 냉각시키면서 중간체 II를 물-메탄올 혼합물 속에서 수산화나트륨으로 비누화하는 공정이 기재되어 있는데; 이러한 온도는 가수분해의 전 기간 동안에 유지되며, 염기를 산으로 중성화한 후 반응의 종료시에만 승온될 수 있다.

이어서, 당해 화학식 I의 화합물은 적당한 온도에서 증류에 의해 메탄올을 제거한 후 벤자틴 염으로서 분리된다; 따라서, 이는 1) 메탄올의 사용은 당해 반응에 대한 매우 낮은 온도에 도달할 필요성에 의해 정당화되며, 2) 생성물을 분리시키기 전에 용매를 제거하는 것이 필수적이라는 것이 명백하다.

대안으로, 당해 생성물은 제EP 1 748 049 A2호에 기재된 바와 같이 산성화에 의해 해리되지 않은 형태로, 또는 염기성 염, 예를 들면, 테트라부틸암모늄으로서 용매 속에서 추출될 수 있다.

세폭시틴은 상기의 특허에서 언급한 바와 같이 이소시아네이트 그룹의 카바모일화에 의해, 또는, 예를 들면, 미국 특허 제4,292,427호에 기재된 바와 같이 그 밖의 이소시아네이트를 사용하여 화학식 I의 화합물로부터 수득될 수 있다.

β-락탐 구조의 불안정성 및 매우 염기성인 조건하에 조작할 필요성이 부여되는 모든 경우, 화학식 II의 화합물을 수득하기 위한 화학식 I의 화합물의 데스아세틸화는 생성물 분해를 억제하기 위한 매우 낮은 온도에서 수행되고; 결과적으로, 유기 용매는 용액의 빙점을 낮추는 데 사용된다.

따라서, 수천 ℓ의 용액을 냉각기 또는 냉매(예: 액체 질소)를 사용함으로써 반응의 전 기간 동안에 유지하고자 하는 -45℃의 온도로 냉각시킬 것을 요하는 방법이 존재하는데; 이는 상당한 에너지 비용을 야기한다. 이어서, 당해 용매는 (용액의 가열과 진공 펌프 및 콘덴서 냉각의 조작을 위한) 추가의 상당한 에너지 소모하에 +30/+40℃로 가열함으로써 진공하에 증류시켜 제거된다.

메탄올과 같은 용매의 사용은 적합하게 제거되어야 하는 용매 인화성으로 인한 위험성, 가능한 조작자 중독, 환경으로의 증기 방출 및 메탄올 함유 수성 유출물의 생성으로 인한 단점을 수반하는 것이 고려되어야 한다.

따라서, 주위 온도에서 단지 수중에서 수행하는 가수분해와 같은 보다 환경 친화성 경로가 매우 바람직하다. 이러한 가수분해를 합리적인 시간내에 수행하고 생성물 분해를 피하기 위해, 촉매, 예를 들면, 효소가 요구된다.

세팔로스포린(화학식 II의 화합물에서와 같은 세팔로마이신은 아님)의 효소적 데스아세틸화는 꽤 오랫 동안 공지되어 왔으며 다양한 기원의 효소를 사용하는 것이 언급되어 왔다.

예를 들면, 밀 배아로부터의 아세틸 에스테라제는 문헌[참조: Gilbert et al., GB1121308 (Glaxo, 1964)]에 기재되었으며, 감귤류 껍질에 존재하는 효소는 문헌[참조: Jeffery et al., Biochem. J. 81, pages 591-6 (1961)]에 기재되었다.

상기 언급된 미국 특허 제4,297,488호에는 감귤류로부터의 아세틸 에스테라제에 의해 촉매처리된 다양한 세폭시틴 합성 중간체의 효소적 가수분해가 기술되어 있으나; 당해 문헌에 기재된 방법은 촉매의 불량한 성능 때문에 산업적인 규모로 적용되지 않는다. 이는 매우 긴 반응 시간(6 내지 15시간으로 기재됨)을 포함하는 낮은 특이 활성의 효소이며, 계절 변화에 따라 재생 가능성이 불량한 공급원으로부터 유도되므로 제조하기 어렵다. 더욱이, 이는 가용성 형태로 적용되며, 재순환되지 않으며, 효소의 정제 또는 고정화의 어느 것도 기재되어 있지 않다. 수득된 아세틸 유도체의 수율 또는 이의 품질의 어느 것도 기재되어 있지 않다.

아크레모늄 크리소게눔(Acremonium chrysogenum)(또는 세팔로스포리움 아크레모늄) 및 스트렙토마이세스 클라불리게루스(Streptomyces clavuligerus)에서 세팔로스포린 C의 생체 합성 경로에 관여하는 효소로부터 출발하여, 세팔로스포린에 대한 그 밖의 효소 활성이 밝혀졌으며; 이들은 발효 부산물인 데스아세틸 세팔로스포린 C의 형성을 유도하는 바람직하지 않은 효소적 활성으로서 간주된다. 노카디 아 락타모두란스( Nocardia lactamodurans ) 및 스트렙토마이세스 클라불리게루스에서 세팔로마이신의 생체 합성이 세팔로마이신에 대한 아세틸 그룹의 가수분해를 포함하지 않음을 주지해야 하며[참조: P. Liras, Antonie van Leeuwenhoek 75, 1999, pages 109-24]; 따라서, 세팔로마이신에 대한 아세틸 에스테라제 활성은 공지되어 있지 않으며, 심지어 세팔로마이신 생성 미생물에서의 활성도 공지되지 않았다.

7-ACA 또는 세팔로스포린 C에 대한 아세틸 그룹의 효소 촉매처리된 가수분해는 기재되어 있으나, 세팔로마이신에 대한 아세틸 그룹의 효소 촉매처리된 가수분해는 기재되지 않았고; 특히:

1) 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)[참조: Abbott and Fukuda, Antimicrob Agents Chemother 8, 3, pages 282-8, 1975 and Appl Microbiol, 30, 3, pages 413-8 1975]에 의해 생성된 에스테라제는 7-ACA를 3-데스아세틸-7-ACA로 가수분해하기 위해 고정화된 형태로 사용된다. 효소는 충분히 활성이고 안정하지만 고정화 지지체로부터 분리되는 경향이 있다. 그 밖의 발명자[참조: Takimoto et al., Appl Microbiol Technol 65, pages 263-7, 2004]는 재조합체 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서 이러한 효소의 발효, 이의 정제, 고체 지지체상의 고정화 및 3-데스아세틸-7-ACA를 제조하기 위한 이의 용도를 기재하고 있다.

2) 문헌[참조: Politino et al., Appl Environm Microbiol 63, 12, pages 4807-11, 1997]에 기재된 로도스포리듐 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides)는 7-ACA에 대한 효소 활성을 생성하는데, 이는 비발효 생물자원(휴지기 세포)의 형태로 및 분리되고 정제된 효소로서 당해 반응에서 촉매로서 사용될 수 있다. 그러나, 세팔로틴에 대한 당해 효소에 의해 명시된 가수분해적 활성은 낮은데, 7-ACA에 대한 가수분해적 활성은 단지 35%이며; 세팔로마이신에 대한 가수분해는 기재되지 않았다. 동일한 효소는 또한 문헌[참조: Chiang et al., US 2002/0048781BMS, 2002]에 의해 사용되는데, 이는 재조합 아크레모늄 크리소게눔의 균주를 기재하며, 로도스포리듐으로부터의 아세틸 에스테라제를 발현할 수 있으며, 발효 브로스(broth) 속에서 직접 데스아세틸세팔로스포린 C를 생성하는 데 사용된다.

3) 또 다른 아세틸 에스테라제는 문헌[참조: Venturi et al., Appl Environ Microbiol 64, 2, pages 789-92, 1998]에 기재되는데, 이는 크실란의 분해와 관련된 효소이며 7-ACA 및 세팔로스포린 C에 대한 활성을 나타내는 바실러스 푸밀러스( Bacillus pumilus)에 의해 생성된 크실란(xylan) 에스테라제이며; 다른 공보는 콜라이에서 동일한 효소의 발현을 기재한다. 세팔로마이신에 대한 활성은 기재되지 않았다.

따라서, 세팔로마이신의 아세틸 그룹의 효소적 가수분해는 당해 분야의 양태에서 산업적인 규모로 적용되지 않았으며; 더욱이, 세팔로스포린에서의 유사한 반응에 대한 이용 가능한 광범위한 문헌에도 불구하고, 세팔로마이신에 대해 사용하기에 충분히 활성이고 안정한 효소는 기재되지 않았다.

본 발명의 하나의 국면은 화학식 II의 화합물의 아세틸 그룹을 가수분해시켜 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 가수분해가 -10℃ 내지 +45℃(바람직하게는 0℃ 내지 +20℃)의 온도 및 pH 5 내지 9(바람직하게는 6 내지 8)에서 아세틸-가수분해 활성(acetyl-hydrolasic activity)을 갖는 하나 이상의 효소로 이루어진 생체 촉매의 존재하에 수중에서 수행되고, 마지막으로 상기 효소를 공지된 방법으로 반응 매질로부터 분리시킴을 특징으로 하는, 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법이다.

삭제

특히, 이러한 생체 촉매는 로도스포리듐 토룰로이데스, 바실러스 푸밀러스, 에스케리키아 콜라이( Escherichia coli ), 아크레모늄 크리소게눔 및 스트렙토마이세스 클라불리게루스로 이루어진 그룹으로부터 선택된 미생물로부터 수득될 수 있으며, 고체 지지체상에 고정화되거나 유리 단백질의 형태로 존재할 수 있거나, 미생물 세포 자체로 이루어질 수 있다. 반응의 종료시에, 생체 촉매는 분리되고 재사용될 수 있는 반면, 화학식 I의 화합물은 유기 염기의 염으로서 침전에 의해 또는 용매 속에서 추출에 의해 수용액으로부터 분리될 수 있다. 바람직하게는, 상기의 유기 염기가 벤자틴 및 이의 염으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것으로 밝혀졌다.

당해 분야의 양태와 비교하여, 신규한 방법은 다음과 같이 요약될 수 있는 다양한 이점을 나타낸다:

- 유해한 용매(예: 메탄올) 및 강한 부식성 용액(예: 수산화나트륨)의 사용을 피함으로써 보다 큰 작업 안전성,

- 주위 온도에서 작업하여 이러한 경우에 일반적으로 사용되는 저온(예: -45℃ 미만)에 도달하고 유지하기에 필요한 상당한 에너지 소모를 피함에 의한 상당한 에너지 절약 및

- 상당한 시간을 요하는 작업 단계인, 진공 하에서의 용매 증류를 피함에 의 한 보다 큰 공정 생산성.

현재까지 공지된 과정에 의해 수득 가능한 것과 동일하거나 이보다 우수한 품질의 생성물이 수득된다.

상세한 설명

우수한 품질 및 저가의 시판 원 재료인 세팔로틴으로부터 출발하여, 중간체 II가 제조될 수 있으며; 동일한 세팔로틴은 공지된 방법에 의해, 7-ACA로부터 제조될 수 있다. 메톡실화 반응은 매우 낮은 온도에서 수행되며 염소화제 및 나트륨 메톡사이드를 사용하며 공지된 방법에 의해 작동된다. 반응의 종료시, 화학식 II의 화합물은 알칼리 금속 또는 유기 염기의 염으로서 분리될 수 있거나, 카복실레이트의 형태로 수중에서 추출될 수 있다.

편리한 합성 경로는 국제 공개공보 제WO 2004/083217호의 실시예 1, 단계 i에 기재되어 있다.

효소적 데스아세틸화의 경우, 다양한 촉매가 사용되며, 공지된 방법에 의해 또는 다음 실시예에 기재된 바와 같이 제조된다.

반응 생성물(화학식 I의 화합물)은 국제 공개공보 제WO 2004/083217호에 기재된 바와 같이 벤자틴 염으로서 분리될 수 있거나, EP 1 748 049 A2에 기재된 과 정에 따라 a) 해리되지 않은 형태의 산으로서, 또는 b) 테트라부틸암모늄 염으로서 유기 용매에서 추출될 수 있다.

세폭시틴은 공지된 방법으로 작동시키면서 클로로설포닐 이소시아네이트와의 반응에 의해 화학식 I의 화합물로부터 수득되어 약물로서 사용하기에 적합한 우수한 품질의 생성물을 수득하였다.

당해 공정은 다음 실시예에서 예시되지만, 이는 비제한적인 것으로서 간주된다.

실시예 1

7- 메톡시 -3- 데스아세틸세팔로틴의 화학 합성

공지된 과정에 의해 제조되고 산으로서 약 69%의 역가(titre)를 갖는 사이클로헥실아민 염 형태의 7-메톡시 세팔로틴(용액 A) 300g(약 500mmol과 동일함)을 물 1.0ℓ 및 메탄올 1.15ℓ의 혼합물에 첨가한다. 당해 혼합물을 -37℃로 냉각시킨다.

별도로, 물 300㎖ 중의 수중 30% 수산화나트륨 160g의 용액을 제조하고, +5℃로 냉각시키고, 첨가를 완료한 후 약 1시간 동안 -45/-35℃의 온도를 유지시키면서 용액 A에 서서히 부어 넣는다. 반응 동력학은 HPLC 분석에 의해 모니터링되고: 잔류하는 7-메톡시 세팔로틴이 0.7g/ℓ 미만인 경우, 당해 반응은 온도를 -5℃ 내에서 유지하면서 80% 아세트산 90g을 첨가함으로써 중단된다. 중성이어야 하는 pH를 모니터링하고, 필요한 경우, 6.8 내지 7.0으로 교정한다. 당해 혼합물을 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 약 100g/ℓ의 농도가 수득될 때까지 +30/+35℃로 가열함으로써 진공하에 증류시키고, 이어서 탄소를 사용한 탈색이 적용된다. 용적을 약 1.9ℓ로 희석시켜 약 80g/ℓ의 농도를 수득한 다음, 에틸 아세테이트 300㎖ 및 벤자틴 디아세테이트 130g을 첨가하고, 약간의 고체 생성물을 첨가하여 침전을 유도한다. 당해 혼합물을 0/+5℃로 냉각시키고, 온도를 10g/ℓ 미만의 모액 중의 생성물 농도가 달성될 때까지 유지시키고, 이어서 부흐너 깔때기(Buchner funnel)를 통해 여과한다. 고체를 물로 세척한 다음, 에틸 아세테이트로 세척하고, 이어서 이를 에틸 아세테이트 85%/아세톤 15% 혼합물에서 짓이겨서(mashed) 무수 생성물을 수득한다.

산으로서 약 70%의 역가를 갖는 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 벤자틴 염 약 208g(380mmol과 동일함)을 몰 수율 76%로 수득한다.

실시예 2

로도스포리듐 토룰로이데스 생물 자원을 사용한 7- 메톡시 -3- 데스아세틸세팔로틴의 효소적 가수분해

생성된 아세틸 에스테라제의 양을 모니터링하기 위해 전체 브로스 샘플을 회수하면서 로도스포리듐 토룰로이데스 ATCC 10657을 문헌에 기재된 바와 같이 접종으로부터 72시간 동안 플라스크 또는 발효기에서 성장시킨다. 효소적 활성은 1분당 전환된 기질의 마이크로몰(μmol)과 동등한 국제 유닛(IU)으로 나타내고, 7-ACA(수중 20g/ℓ)의 가수분해에 의해 측정되며; 당해 반응은 +25℃에서 온도 조절되고 자동 적정(pH-stat, Crison Instruments SA, Barcelona, Spain)에 의해 0.1M NaOH를 첨가함으로써 6.5에서 pH-조절된다. 성장 브로스를 15분 동안 10000r.p.m.에서 원심분리하고, 펠렛을 인산염 완충제에서 재현탁시키고, 다시 원심분리하여 1g당 약 6 내지 10IU의 특이한 활성을 갖는 습윤 세포의 페이스트를 수득한다.

3N 수산화암모늄을 사용하여 pH를 7.0으로 보정하면서 7-메톡시 세팔로틴 사이클로헥실아민 염 40.8g을 물 약 250㎖에 용해시킨다. 적정기를 설치하여 pH 7.0으로 유지시키고, 온도를 +20℃에서 조절한 다음, 로도스포리듐 세포 페이스트 50g을 첨가한다. 약 1시간 30분 후, 반응을 완결하고, 세포를 원심분리에 의해 분리시켜 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 용액 약 340㎖를 수득하고, 이를 탄소로 탈색시키고, 종이를 통해 여과한다. 에틸 아세테이트 55㎖ 및 벤자틴 디아세테이트 17.7g을 첨가하고, 생성물을 실시예 1에서 기재한 바와 같이 분리시킨다.

산으로서 약 70%의 역가를 갖는 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 벤자틴 염 28g(51mmol과 동일함)을 몰 수율 77%로 수득한다.

로도스포리듐 세포는 다양한 가수분해 사이클에 재사용될 수 있다.

실시예 3

로도스포리듐 토룰로이데스로부터의 아세틸-에스테라제를 사용한 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴의 효소적 가수분해

실시예 1에 기재된 바와 같이 수득한 로도스포리듐 토룰로이데스 생물 자원을 EDTA(에틸렌디아미노테트라아세트산)로 처리함에 의해 용해시켜 아세틸 에스테라제 활성을 갖는 수용액을 수득하고, 이를 문헌[참조: Politino et al ., Appl . Environ. Microbiol . 63, 12, pagg. 4807-11, 1997]에 공지된 과정에 따라 카복시메틸 세파로즈(Sepharose)를 사용하여 크로마토그라피에 의해 정제한다.

실시예 1에서와 같이 제조된 7-메톡시-세팔로틴 벤자틴 염 870g을 용해시키고, pH를 7.0으로 보정한 다음, 용적을 총 6000㎖로 희석시킨 다음, 아세틸 에스테라제 용액 200㎖를 첨가하고, pH를 3N 수산화암모늄을 사용하여 자동 적정에 의해 7에서 유지시킨다. 반응의 종료시에, 효소를 나노맥스(Nanomax) 막 및 10000Da 컷-오프(cut-off)가 구비된 밀리포어 프로스케일(Millipore ProScale) 장치를 사용하여 한외여과(ultrafiltration)에 의해 생성물로부터 분리시킨다. 삼투물로부터의 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 용액 약 5ℓ를 수득하고, 이를 실시예 1에 기재된 바와 같이 분리시키며, 효소를 함유하는 농축물은 다음 가수분해 사이클에 재사용된다. 화학식 I의 화합물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 분리시킨다.

실시예 4

재조합 에스케리키아 콜라이 생물 자원을 사용한 7- 메톡시 -3- 데스아세틸세팔로틴의 효소적 가수분해

바실러스 푸밀러스로부터의 아세틸 크실란 에스테라제 효소를 문헌[참조: Venturi et al., Microbiology 146, pages 1585-91, 2000]에 기재된 과정에 의해 수득한 재조합 에스케리키아 콜라이에서 발현시켰다.

7-메톡시-세팔로틴을 촉매로서 에스케리키아 콜라이 생물 자원 340g을 사용하여 실시예 3에 기재된 바와 같이 가수분해시키고; 반응의 종료시에, 7-메톡시-3- 데스아세틸세팔로틴 용액을 한외여과하여 분리시키고, 당해 생성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 벤자틴 염의 형태로 분리시켰다.

한외여과 농축물(retentate)은 부분적으로 용해된 콜라이 세포 및 유리 효소의 현탁액이며, 이는 후속적인 사이클에서 재사용될 수 있다.

실시예 5

에폭시 수지상에 고정화된 아세틸- 에스테라제를 사용한 7- 메톡시 -3- 데스아세틸세팔로틴의 효소적 가수분해

실시예 4에 기재된 재조합 콜라이에서 제조된 크실란 에스테라제를 1000bar에서 세포 파쇄기(Constant Systems Ltd.)를 사용하여 세포를 파괴함으로써 부분적으로 정제한 다음, 30분 동안 20000r.p.m.에서 원심분리하였다. 이렇게 하여 수득한 상청액을 10KDa 막의 프로스케일 밀리포어 장치를 사용하여 한외여과에 의해 투석시킨 다음, 문헌[참조: Venturi et al., Microbiology 146, pages 1585-91, 2000]에 기재된 바와 같이 세파로즈 Q 패스트 플로우(Fast Flow) 수지상에 크로마토그라피한다.

부분적으로 정제된 효소를 한외여과에 의해 농축시키고, pH 8.0에서 1.2M K₂HPO₄ 용액 10용적을 사용하여 희석시킨 다음, 수지 1g당 120IU의 하중하에 에폭시 수지 세파비즈(Sepabeads) EC-EP(Diaion SpA, Mitsubishi)상에 고정화하였다. 수지 현탁액을 48시간 동안 교반한 다음, 부흐너 깔때기를 통해 여과하고, 물 10용적(수지 1g당 10㎖)으로 세척하고; 1g당 약 70IU의 활성을 갖는 고체 촉매를 수득 한다.

7-메톡시-세팔로틴 사이클로헥실아민 염 100g을 450㎖의 전체 용적으로 물에 용해시키고, 3N 수산화암모늄을 사용하여 자동 적정함으로써 pH 상수를 7에서 유지시키면서 고정화된 효소 66g을 촉매로서 사용하여 가수분해를 수행한다.

2.5시간 후, 반응을 종결시키고, 효소를 소결된 유리 깔때기를 통해 여과하고, 벤자틴 디아세테이트 50g을 첨가하고 실시예 1에 기재된 바와 같이 작동시킴으로써 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴을 분리시킨다.

7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 산으로서 역가 70.8%의 생성물 69.6g을 78%의 몰 수율로 수득한다.

촉매는 다수의 반응 사이클에 재사용될 수 있다.

실시예 6

아미노 수지상에 고정화된 아세틸- 에스테라제를 사용한 7- 메톡시 -3- 데스아세틸세팔로틴의 효소적 가수분해

실시예 4에 기재된 바와 같은 재조합 콜라이에서 제조된 바실러스 푸밀러스로부터의 아세틸 에스테라제 효소를 실시예 5에 기재된 바와 같이 정제한다.

세파비즈 EC-HA 수지(Diaion) 100g을 물로 충분히 세척한 다음, pH 7에서 0.2M 인산염 완충제 100㎖에서 현탁시킨다. 수중 25% 글루타르알데히드 용액 170㎖를 첨가하고, 16시간 동안 교반하에 정치시킨 다음, 정제된 효소 용액을 총 12000IU에 첨가한다. 3시간 후, 혼합물을 부흐너 깔때기를 통해 여과하고, 물로 충분히 세척한다. 활성 55IU/g을 갖는 촉매를 수득한다.

고정화된 아세틸-에스테라제 84g을 사용하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 가수분해를 수행한다. 반응 3시간 후, 효소를 여과제거하고, 벤자틴 염을 실시예 1에 기재한 바와 같이 침전시킨다. 수득한 생성물을 이소프로판올 4용적(중량/용적)에 현탁시킨 다음, 여과하여 역가 70.5%의 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 벤자틴 염 68g(몰 수율 76%와 동일함)을 수득한다.

촉매는 다수의 반응 사이클에 재사용될 수 있다.

실시예 7

글리옥실 수지상에 고정화된 아세틸- 에스테라제를 사용한 7- 메톡시 -3- 데스아세틸세팔로틴의 효소적 가수분해

세파비즈 EC-HA 수지(Diaion) 100g을 물로 충분히 세척하고, 0.05M 나트륨 메타페리오데이트 용액 800㎖를 첨가하고; 1.5시간 후, 물로 충분히 세척하면서 혼합물을 부흐너 깔때기를 통해 여과한다. 수지를 pH 10에서 50mM 바이카보네이트 완충제 700㎖에 현탁시킨 다음, 실시예 5에 기재된 바와 같이 정제된 효소 12000IU를 첨가한다.

1시간 후, 수중 1mg/㎖ 수소화붕소나트륨 용액 1400㎖를 첨가하고, 30분 동안 반응하기 위해 정치시킨 다음, 물로 충분히 세척하면서 다공성 배플을 통해 여과한다. 활성 38IU/g을 갖는 촉매를 수득한다.

실시예 5에 기재된 바와 같이 가수분해 반응을 수행하고; 3.5시간 후, 반응 을 중단하고, 생성물을 분리시킨다. 역가 70%의 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 벤자틴 염 65g(몰 수율 73%와 동일함)을 수득한다.

촉매는 다수의 반응 사이클에 재사용될 수 있다.

실시예 8

메틸렌 용액으로부터의 7- 메톡시 -세팔로틴의 효소적 가수분해

세팔로틴 메톡실화 반응을 국제 공개공보 제WO 2004/083217 A1호에 기재된 바와 같이 메틸렌 클로라이드 및 메탄올 중 N-클로로-석신이미드 및 나트륨 메틸레이트를 사용하여 수행하고; 수용액으로 세척한 후, 메틸렌 클로라이드 중 7-메톡시-세팔로틴 산의 용액 82g/ℓ를 수득한다.

메틸렌 용액 500㎖를 10중량/용적% 탄산나트륨 수용액으로 적정하면서 물 약 300㎖로 추출하여 최종 pH 8.0을 수득하고; 상을 분리시키고, 메틸렌 상을 소량의 물로 세척하여 수성 109g/ℓ 생성물 용액 355㎖(추출 수율 94%와 동일함)를 수득한다. 수성 상을 +25℃에서 진공하에 증류시켜 용매 잔류물을 제거한다.

수성 상을 10중량/용적% 탄산나트륨 수용액으로 pH를 조절하면서 실시예 6에 기재된 효소 40g으로 가수분해시키고; 2시간 후, 반응을 중단한 다음, 생성물을 분리시킨다.

역가 70.8%의 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 벤자틴 염 33g을 수득한다. 촉매는 다수의 반응 사이클에 재사용될 수 있다.

실시예 9

중간체 분리 부재하에서의 세폭시틴의 합성

7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴을 실시예 8에 기재된 바와 같이 제조하여 농도 80g/ℓ의 수용액을 수득하고, 이를 탄소 2g으로 탈색시키고; 여과 후, 고체 NaCl을 포화될 때까지 첨가하고, 용액을 EP 1 748 049 A2호에 기재된 과정에 따라 메틸렌 클로라이드 중 테트라부틸암모늄 브로마이드 용액으로 추출한다. 카바모일화를 세폭시틴 산을 분리시키면서 클로로설포닐 이소시아네이트를 사용하여 테트라하이드로푸란에서 수행하고, 이를 동일한 문헌에 기재된 바와 같은 상응하는 나트륨 염으로 전환시킨다.

나트륨 세폭시틴 13g을 수득한다.

실시예 10

산 또는 나트륨 염으로서의 7- 메톡시 -3- 데스아세틸세팔로틴의 분리

반응을 실시예 6에 기재된 바와 같이 수행하고; 가수분해의 종료시, 촉매를 여과제거하고, 재사용한 다음, 수용액을 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴이 침전되기 시작할 때까지 산성화하고, 30분 동안 계속 침전시킨 다음, 염산을 pH 2.5으로 될 때까지 첨가하고, +4℃로 냉각시킨다. 혼합물을 부흐너 깔때기를 통해 여과하여 백색 고체로서 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴을 수득한다.

모액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 상을 분리시킨 다음, 나트륨 2-에틸헥사노에이트를 유기상에 첨가하여, 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 나트륨 염 침전 물을 수득한다.

실시예 11

수성 현탁액 중 7- 메톡시 -세팔로틴의 효소적 가수분해

7-메톡시 세팔로틴 사이클로헥실아민 염 130g을 물 300㎖에 현탁시킨 다음, 10중량/용적% 탄산나트륨 수용액을 pH 7로 되도록 첨가하고; 실시예 6에 기재된 바와 같이 제조한 고정화된 효소 100g을 첨가한 현탁액을 수득한다. 반응을 pH-stat 조건하에 온도를 +20℃에서 조절하면서 수행하고; 기질의 완전 용해는 가수분해가 수행됨에 따라 관찰된다. 이러한 과정을 0.5g/ℓ 미만의 7-메톡시-세팔로틴 잔류물이 수득될 때까지 계속하고, 이어서 촉매를 여과제거한 다음, 생성물을 실시예 1에 기재된 바와 같이 분리시킨다. 역가 70%의 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 벤자틴 염 98.3g을 몰 수율 85%로 수득한다.

실시예 12

7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴의 벤자틴 염의 고온 침전에 의한 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴의 분리

반응을 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행하되, 단, 물/에틸 아세테이트 혼합물을 +35℃로 가열한 후 벤자틴 디아세테이트를 첨가하고; 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 벤자틴 염의 침전의 유발시에 여과 전에 +4℃로 점진적으로 냉각시키면서 온도를 +30/35℃에서 약 30분 동안 유지시킨다. 몰 수율 약 85%를 수득한다.

실시예 13

7- 메톡시 -3- 데스아세틸세팔로틴을 침전시키기 위한 벤자틴의 용도

반응을 실시예 11에 기재된 바와 같이 수행하되, 단, 메탄올 10용적%를 수성 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 용액에 첨가한 다음, 에틸 아세테이트를 벤자틴 염기를 첨가하기 전에 +30/35℃로 가열하면서 첨가한다. 혼합물을 여과하기 전에 +4℃로 점진적으로 냉각시킨다. 몰 수율 약 85%를 수득한다.

유사한 결과는 메탄올 대신에 에탄올, 이소프로판올 또는 글리세린을 사용하여 수득된다.

실시예 14

온도의 함수로서의 아세틸 에스테라제 활성

pH 7에서 50mM 인산염 완충제(50㎖) 중 에틸 아세테이트(0.5㎖) 용액을 제조한 다음, 유리 비고정화된 단백질을 사용하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 제조된 에스케리키아 콜라이 중 재조합 바실러스 푸밀러스로부터의 아세틸 크실란 에스테라제 100㎕로 가수분해를 수행한다.

다양한 시험을 각각의 시험에 대해 반응의 처음 10분 동안 염기 첨가 속도를 기준으로 하여 효소 가수분해 활성을 계산하면서 온도 +10℃ 내지 +35℃에서 자동 적정에 의해 일정한 pH에서 수행한다.

활성은 에스테르 가수분해에 의해 방출된 양의 아세트산을 0.1N NaOH로 적정 함으로써 용액 1㎖당 국제 단위(IU)로 나타내고, 다음 수학식 1에 의해 계산된다:

IU = [평균 NaOH 소모량(㎖/min) × 100 × f]/샘플 용적(㎖)

위의 수학식 1에서,

f는 0.1N 소다 역가에 대한 보정 인자이고,

평균 소모량은 적정의 처음 10분 동안의 0.1N NaOH 소모량(㎖/min)이고,

샘플 용적은 아세틸 에스테라제 용액의 용적(㎖)이다.

반응 온도에 대해 나타낸 효소적 활성을 플로팅함으로써, 도 1에 나타낸 그래프를 수득한다.

유사한 결과는 실시예 5 내지 7에 기재된 바와 같이 수지상에 고정화된 단백질을 사용하여 수득된다.

실시예 15

pH 의 함수로서의 아세틸 에스테라제 활성

실시예 14에 기재된 과정을 따르되, +25℃에서 온도 조절된 용액을 사용하고, 5 내지 9의 값에서 자동 적정에 의해 pH를 일정하게 유지한다. 가수분해 활성은 실시예 14에 기재된 바와 같이 계산하되, 작동 pH에 대한 활성(IU/㎖)을 플로팅하여 도 2의 곡선을 수득한다.

실시예 16

pH 및 온도의 함수로서의 7- 메톡시 -세팔로틴의 가수분해 동력학

7-메톡시-세팔로틴 200g/ℓ 용액을 실시예 6에 기재된 바와 같이 에스케리키아 콜라이 중 재조합 바실러스 푸밀러스로부터의 아세틸 크실란 에스테라제를 사용하여 제조하고 가수분해하되, pH 5.0 내지 9.0 및 온도 -10 내지 +35℃에서 조작한다. 0℃ 이하의 온도의 경우, 글리세린 10용적%를 수용액에 첨가한다.

반응을 1g/ℓ 미만의 7-메톡시-세팔로틴 잔류물이 수득될 때까지 수행하여 종료시킨다.

도 3은 반응 동력학의 단지 일부를 나타낸다. 수득 가능한 생성물 수율 및 양은 반응 조건에 따라 가능한 생성물 분해에 의해 영향받는다.

실시예 17

고정화된 아세틸 에스테라제를 사용한 7- 메톡시 -세팔로틴의 가수분해

실시예 5에 과정된 과정을 수행하되, 실시예 5 내지 7에 기재된 수지상에 고정화된 아세틸 에스테라제를 사용하고 pH 5에서 +35℃에서 작동시킨다. 반응의 종료시에, 교반을 중지시키고, 촉매를 경사여과한 다음, 당해 용액을 흡입에 의해 분리시키고, 화학식 I의 화합물을 실시예 11에 기재된 바와 같이 분리시켜 역가 69%의 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴을 수득한다. pH 9에서 -10℃에서 작동시키고 글리세린 10%를 수용액에 첨가하면서 유사한 결과를 수득한다.

실시예 18

7- 메톡시 -3- 데스아세틸세팔로틴으로부터의 세폭시틴의 합성

실시예 1(샘플 A) 및 실시예 12(샘플 B)에 기재된 과정에 의해 수득된 7-메톡시-3-데스아세틸세팔로틴 벤자틴 염의 2개의 샘플을, 예를 들면, 국제 공개공보 제WO 2004/083217 A1호에 기재된 바와 같이 클로로설포닐 이소시아네이트와 반응함으로써 세폭시틴으로 전환시킨다. 동일한 몰 수율을 수득한다.

도 1은 반응 온도에 대해 나타낸 효소적 활성을 플로팅한 것이다.

도 2는 작동 pH에 대한 활성(IU/㎖)을 플로팅한 것이다.

도 3은 반응 동력학의 단지 일부를 나타낸다.

Claims

화학식 II의 화합물의 아세틸 그룹을 가수분해시켜, 90% 이상의 수율로 세폭시틴(cefoxitin) 합성의 중간체로서의 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법으로서, 상기 가수분해가 0℃ 내지 +20℃의 온도 및 7 내지 8의 pH에서 아세틸 가수분해(hydrolasic) 활성을 갖는 하나 이상의 효소로 이루어진 촉매의 존재하에 수중에서 수행되고, 상기 효소가 로도스포리듐 토룰로이데스(Rhodosporidium toruloides) 및 바실러스 푸밀러스(Bacillus pumilus)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 미생물로부터 수득되고, 산업적 생산 장비를 위한 고가의 냉각 시스템 및 부식성 시약(caustic reagent)을 사용하지 않는 것을 특징으로 하는, 화학식 I의 화합물을 제조하는 방법.

화학식 I

화학식 II
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