KR101491770B1

KR101491770B1 - 유기용매 하에서 안정성이 높은 신규 만난분해 유전자 ｅｍ17과 이의 형질전환 균주로부터 생산된 재조합 만난분해 효소

Info

Publication number: KR101491770B1
Application number: KR20130004378A
Authority: KR
Inventors: 이창묵; 윤상홍; 구본성; 이영석
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2013-01-15
Filing date: 2013-01-15
Publication date: 2015-02-13
Anticipated expiration: 2033-01-15
Also published as: KR20140092079A

Abstract

본 발명은 음식물 쓰레기를 효과적으로 분해하는 동애등에(Blacksoldier fly: BSF) 유충에서 인공배양이 불가능한 장 내 미생물 유래의 신규 만난분해효소 유전자 EM17, 상기 유전자를 포함하는 재조합 백터, 상기 재조합 백터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.
본 발명의 EM17의 만난분해효소는 대장균에서 발현되어 높은 유기용매 농도, 높은 금속이온 및 폭넓은 산, 염기 농도에서도 분해 능력을 발휘하므로 헤미셀룰로오스 바이오 매스 재활용 공정에서 불필요한 정제단계를 줄일 수 있다. 또한, 다양한 가수분해 기능을 가지므로 식품, 동물사료, 커피추출, 제지. 펄프 산업, 올리고당 합성 등에 이용될 수 있다.

Description

유기용매 하에서 안정성이 높은 신규 만난분해 유전자 ＥＭ17과 이의 형질전환 균주로부터 생산된 재조합 만난분해 효소{An organic solvent-tolerant endo-1,4-β-mannanase gene EM17 and recombination mannannase from transformed strain using thereof}

본 발명은 동애등에(Black soldier fly: BSF) 유충에서 인공배양이 불가능한 장 내 미생물 유래의 신규 만난분해효소 유전자 EM17, 상기 유전자를 포함하는 재조합 백터, 상기 재조합 백터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

식물의 세포벽은 주로 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스나 펙틴 등의 다당류, 효모는 글루칸, 만난-단백질 복합체와 키틴, 곰팡이는 글루칸, 셀룰로오스, 키틴, 키토산 등으로 이루어지고 있다. 그래서 이들을 분해하는 베타-글루카나아제(베타-glucanase), 만나아제(mannase), 키티나아제(chitinase), 프로테아제(protease) 등의 활성을 갖는 효소를 세포벽 용해효소라고 부른다. 만나아제는 베타-D-만노시드를 비환원 말단에서 가수분해하여 만노오스를 유리하는 엑소형 효소이다. 베타-만노시다제는 종래, 베타-D-만난(mannan)의 비환원 말단으로부터 만노스(mannose) 단위로 가수분해되는 효소로서 알려져 있다. 분자 내에 베타-만노시도 결합을 가지는 저분자, 베타-D-만난(mannan), 글루코만난(glucomannan), 갈락토 만난(galacto mannan), 갈락토 글루코만난(galacto glucomannan))에 작용하고, 비환원 말단 부위로부터 순차적으로 가수분해하여 만노스(mannose)를 생성한다. 이는 동물, 식물, 미생물에서 발견되고 있다. Aspergillus niger 유래의 효소는 최적 pH 3.5, 분자량은 130,000으로 폴리펩티드 사슬의 80%는 베타-sheat 구조를 갖는다.

한편, 헤미셀룰로오스의 복합구조특성으로 인하여 통상적인 분리가 가능한 미생물이나 곰팡이 자체를 직접 이용하거나, 일부 알려진 유전자를 대장균에서 만난분해 효소를 이종발현하여 이용하였으나, 이는 정제법이 복잡하여 실용화하기에는 한계가 있다.

JP 4241964

본 발명은 난배양 미생물유래 메타게놈 유전자은행으로부터 과일이나 종자 같은 유연 식물에 존재하는 주요 구성성분인 고분자 헤미셀룰로오스의 β-1,4-glucomannan과 β-1,4-galctomannan의 만난(mannan)을 분해하는 신규 효소 유전자를 분리하고 이를 대량 발현하는 신종 균주를 개발하여 고분자 헤미셀룰로오스를 효율적으로 저분자 만노즈(mannose)를 변화시키는데 이용하고자 한다.

이를 위해 본 발명은 동애등애 장 내 미생물 유래의 신규 만난분해효소 유전자 EM17, 상기 유전자를 포함하는 재조합 백터, 상기 재조합 백터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명은 서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 만난분해효소 EM17 유전자 및 서열번호 2의 아미노산서열로 표시되는 만난분해효소 EM17 단백질에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 백터에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 백터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 만난분해 효소의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 재조합 EM17 만난분해효소는 다양한 헤미셀룰로오스 구성성분에 대하여 endo-β-linked mannoside 가수분해 효소인 mannanase의 특성을 가지고 있으므로 고분자 헤미셀룰로오스 분해의 전처리 단계에 사용하기 유용하다. 특히 대장균에서 발현되어 높은 유기용매 농도에서도 활성을 완전하게 유지할 수 있고, 폭넓은 산, 염기 농도에서도 60% 이상의 분해 능력을 발휘하므로 헤미셀룰로오스 바이오매스 재활용에서 알칼리 분해와 다량의 유기용매를 사용하는 공정에서 불필요한 정제단계를 줄일 수 있다. 또한, 고분자 당에 대한 효과적인 가수분해 기능을 이용하여 식품, 동물사료, 커피추출, 제지.펄프 산업, 올리고당 합성 등에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 동애등에 유충 장 내 난배양 미생물에서 분리한 신규 만난분해 효소 유전자 1,371bp로부터 코딩되는 456개 아미노산으로 구성된 단백질 염기서열 분석에 관한 것이다. (A)는 Gram-positive 미생물에서 유래한 N-terminal signal peptide(붉은 색)를 제외한 402개 단백질 아미노산 서열(1,206bp 유전자) “EM17”에 관한 것이다. (B)는 EM17의 아미노산 염기서열을 사용하여 domain 분석을 한 결과에 관한 것이다.
도 2는 신규한 만난 분해효소 EM17단백질 아미노산 서열의 비교 계통분석도에 관한 것이다. 각 branch에 있는 숫자는 Bootstrap 분석치(1,000 resampling)이다(Bar; 0.1 substitutions per amino acid position).
도 3은 신규한 만난 분해효소 EM17의 대장균 BL21(DE3)에서의 이종 대량발현에 관한 것이다(Lane 1, Induction 하기 전의 대장균 조단백질; Lane 2, EM17을 과대 발현한 대장균 조단백질; Lane 3, Soluble fraction; Lane 4, 정제된 EM17 단백질; M은 단백질 size marker).
도 4는 정제된 만난 분해효소 EM17단백질을 이용한 생화학적 최적 활성온도(A)와 최적 활성 pH(C)를 나타내는 것이다. 또한 EM17 단백질의 주어진 온도에서의 시간별 잔류활성(B)과 주어진 pH에서의 4℃, 15시간 후의 잔류활성(D)에 관한 것이다.
도 5는 정제된 만난 분해효소 EM17의 유기용매(A), 계면활성제(B), 금속이온(C)에 의한 기능억제(inhibition)에 관한 것이다.
도 6은 정제된 만난 분해효소 EM17 단백질을 이용한 만난분해 기능을 기질별로 확인한 결과를 나타낸다.

본 발명은 음식물 쓰레기 처리에 탁월한 기능을 발휘하는 동애등에(Hermetia illucens) 유충 장내의 난배양 미생물로부터 β-1,4-glucomannan과 β-1,4-galctomannan 결합으로 구성된 식물성 고분자 헤미셀룰로오스를 분해하는 만난(mannan)분해 신규 효소 유전자 및 이를 대량 발현하는 균주로 고분자 헤미셀룰로오스를 효율적으로 저분자 만노즈(mannose)로 변화시키는 것이다.

본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 만난분해효소 EM17 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다. 본 발명의 유전자는 만난분해효소 EM17 단백질을 코딩하는 게놈 DNA와 cDNA를 모두 포함한다. 본 발명의 유전자는 서열번호 1로 표시되는 핵산서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 동애등에 유충에서 인공 배양이 불가능한 장내 미생물 유래 메타게놈 은행을 구축하고, 이로부터 본 발명의 고속선발 시스템을 이용하여 셀룰로오스 기질을 분해하는 신규 클론을 선발하였다. 당 클론을 포함하는 난배양 미생물 유래 유전자 염기서열을 분석하여 1,371bp의 ORF 부위가 헤미셀룰로오스를 분해하는 신규한 유전자임을 발견하였다. 이 ORF 부위에서 단백질 targeting에 관여하는 54개 N-terminal 아미노산을 제거한 1,206bp 유전자, 402 아미노산을 EM17로 명명하였다.

또한, 상기 핵산서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로 상기 유전자는 서열번호 1의 핵산서열과 각각 70%이상, 80%이상, 90% 이상, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 핵산서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 만난분해효소 EM17 단백질을 제공한다. 상기 동애등에 장 내 미생물 유래의 만난분해효소 EM17 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 본 발명에 따른 만난분해효소 EM17 단백질의 범위는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다.

상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 50%이상, 70%이상, 90% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 생물체 내에서 가수분해능이 우수한 만난분해효소의 활성을 의미한다.

또한, 본 발명은 동애등에 장 내 미생물 유래의 만난분해효소 EM17 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다. 상기 재조합 벡터는 대장균 발현 벡터 또는 효모 발현 벡터일 수 있으나, 이제 제한되지 않는다. 대장균 발현 벡터로는 pET21a 벡터를 예로 들 수 있으며, 효모 발현 벡터로는 pKBN-IFN벡터를 예로 들 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명은 EM17 유전자를 단백질 발현벡터인 pET21b에 클로닝하여 재조합 벡터 pEM17을 제조하였다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내로 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동 가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다.

본 발명의 유전자는 전형적으로 클로닝 또는 단백질발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한，본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드(예를 들면，pSC101，ColE1，pBR322，pUC8/9，pHC79，pGEX 시리즈，pET 시리즈 및 pUC19 등)，파지(예를 들면，λgt4.λB，λ-Charon 및 M13 등) 또는 바이러스(예를 들면，SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다. 한편，본 발명의 유전자가 식물에 최적화된 코돈으로 전환하여, 식물 세포를 숙주로 하는 경우에는 당 업계에서 통용적으로 사용되는 벡터(예를 들면, pBI vectors, pCAMBIA vectors, pSB vectors)를 조작하여 제작될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기 형질전환체는 국립농업과학원 농업유전자원센터에 2012년 11월 12일자로 기탁된 수탁번호 KACC95124P인 균주일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당 업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 예를 들면 E. coli JM109， E. coli BL21， E. coli RR1， E. coli LE392， E. coli B， E. coli X 1776， E. coli W3110， 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)， 바실러스 츄런겐시스(Bacillus thuringiensis) 와 같은 바실러스 속 균주， 그리고 살모낼라 티피무리움(Samonella typhimurium)， 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다. 상기 숙주세포는 바람직하게는 대장균이다.

또한，본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서 효모，곤충세포，사람세포(예컨대，CHO(Chinese hamster ovary) 세포주，W138， BHK，COS-7，293，HepG2，3T3，RIN 및 MDCK 세포주) 식물세포 등이 이용될 수 있으며， 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyce cerevisiae)일 수 있다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은， 숙주 세포가 원핵 세포인 경우，CaCl₂방법(Cohen，S.N. et al.，Proc. Natl. Acac. Sci. USA，9:2110-2114(1973)), 하나한 방법(Hanahan，D.，J. Mol. Biol.，166:557580(1983)) 및 전기천공 방법(Dower，W.J. et al.，Nucleic. Acids Res.，16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한，숙주세포가 진핵세포인 경우에는，미세주입법(Capecchi，M.R.，Cell，22:479(1980))，칼슘 포스페이트 침전법(Graham，F.L. et al.，Virology，52:456(1973))，전기천공법(Neumann，E. et al.，EMBO J.， 1:841(1982))，리포좀-매개 형질감염법(Wong，T.K. et al.，Gene，10:87(1980))，DEAE-텍스트란 처리법(Gopal，Mol. Cell Biol.，5:1188-1190(1985))，및 유전자 밤바드먼트(Yang et al.，Proc.Natl. Acad. Sci.，87.9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 이용하여 재조합 만난분해 효소를 생산할 수 있다. 보다 구체적으로

(a) 상기 형질전환체를 배양하는 단계;

(b) 상기 배양된 형질전환체로부터 만난분해효소를 생산하는 단계; 및

(c) 상기 생산된 만난분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 만난분해 효소의 제조방법에 관한 것이다.

상기 (a)의 배양은 형질전환체를 공지된 기술을 이용하여 재조합 단백질의 생산에 적합한 배지에서 배양할 수 있다. 예를 들어，세포들은 적합한 배지와 단백질이 발현 또는 분리되는 것을 허용하는 조건 하에 실시된 실험실 또는 산업용 발효기에서 소규모 또는 대규모 발효，쉐이크 플라스크 배양에 의해서 배양될 수 있다. 배양은 공지기술을 사용하여 탄소，질소원 및 무기염을 포함하는 적합한 배지에서 일어난다. 적합한 배지는 상업적으로 입수하거나 예를 들면，American Type Culture Collection의 카탈로그와 같은 간행물에 기재된 성분 및 조성비에 따라 제조할 수 있다.

상기 정제한 재조합 만난분해 효소는 다양한 유기용매(10%, v/v)에서도 활성을 완전하게 유지할 수 있고, 폭넓은 pH 범위(pH 5~9.5)에서도 60%이상의 활성을 유지할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 >

1. 동애등에 메타게놈 은행 구축

동애등에의 유충은 국립농업과학원 곤충산업과에서 분양받았다. 1,000여 마리 이상 유충으로부터 유충을 고정한 뒤 핀셋으로 장을 분리하였다. 분리한 장에서 장내 미생물을 분리하기 위하여 조직을 막자 사발에서 적절하게 파쇄한 뒤 percoll gradient 방식을 통하여 미생물을 분리하였다(Current Protocols in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratories Ed.). 분리한 동애등에 유충 장내 미생물로부터 메타게놈 라이브러리를 제작하기 위하여, 분리 정제한 전체 DNA를 1% Low-melting-point agarose gel에 CHEF DR-III전기영동 장치(Biorad사)에 6V/cm로 14℃, 120° 각도로 11초간 ramping 하여 13시간 전기영동하고 SybrGreen Gold Dye로 염색한 후 UV illuminator 상에서 확인하고 40 kb 이상의 DNA를 포함하는 agarose block 만을 자른 다음 agarase 효소를 넣어 1시간 동안 반응시킨 후 70℃에서 10분간 agarase를 비활성화 시켰다. 여기에 에탄올로 침전, 세척하여 순수한 DNA를 분리하여 준비하였다. Fosmid library 제작은 정제한 장내 미생물 DNA 25 μl (5 μg)에 5 unit의 T4 polymerase (Takara Co.)와 2 unit T4 polynucleotide kinase (Takara Co.) 그리고 6 units의 Klenow fragment (Takara Co.)를 가한 후 반응액량을 50 μl로 조절한 후 37℃에서 30분간 반응시켜 DNA 말단을 평활화하여 제작하였다. 반응이 끝난 후 동량의 phenol/chloroform/isoamylalcohol (25:24:1,v/v/v)을 첨가하여 섞은 다음 10분간 원심분리하고 상등액을 모아서 동량의 chloroform/isoamylalchohol (24:1, v/v)을 첨가하여 혼합한 후에 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액 만을 취하고 2.5배의 100% ethanol을 넣어 1시간 동안 상온에서 방치한 다음 원심분리하여 상등액은 버리고 70% 에탄올로 DNA를 세척하여 DNA를 준비하였다. EpiFOS fosmid vector (pCC1/2, Epicentre, USA)에 end-repaired DNA를 첨가하여 16℃에서 16시간 ligation 반응시켰다.

In vitro packaging을 위해 16℃에서 16시간 반응한 시료들을 70℃에서 10분간 열처리하여 ligase 효소를 불활성화시켰다. Ligation한 반응액 7.5 μl에 MAX lambda packaging extracts kit (Epicentre, USA)의 extracts 25 μl를 넣어 pipette을 사용해 공기방울이 생기지 않게 조심스레 섞어 준 다음 30℃에서 1시간 30분간 반응시켰다. 여기에 다시 extracts 25 μl를 넣어 pipette을 사용해 공기방울이 생기지 않게 조심스레 섞어 준 다음 30℃에서 1시간 30분간 반응시켜 in vitro packaging을 수행하였다. SM 완충용액을 1 ml 첨가하여 위아래로 잘 섞어 준 다음 여기에 25 μl의 chloroform을 넣어 다시 packaging 되지 않은 물질들을 불활성화 시켰다. 원심분리를 조심스럽게 하여 정치한 다음 4℃에 보관하였고 상등액을 대장균에 형질전환하여 library로 사용하였다. 대장균에 클로닝된 유전자 형태로 구축한 메타게놈 유전자은행은 LB-Chloramphenicol-glycerol 배지를 기본배지로 하여 384-well plate에 개별 클론으로 접종하여 메타게놈 유전자은행을 작성하고 -70℃에 장기 보존하였다.

2. 만난 분해활성을 가진 EM17 효소단백질 아미노산서열 분석

만난 분해효소를 발현하는 메타게놈 클론을 검증하기 위하여 값싼 셀룰로오스 배지를 이용하여 1차 대량 스크리닝을 하였다. 셀룰로오스를 분해하는 메타게놈 클론을 검정을 위하여 0.1% NaCl, 0.1% Bacto-tryptone, 0.05% Bacto-yeast extract가 함유된 기초배지에 1% Carboxymethyl cellulose(CMC, Sigma Co. USA)과 항생제 chloramphenicol(20μg/ml)을 첨가한 평판 배지에 replica pin을 이용하여 각 개별 메타게놈 균주를 접종 후 28℃에서 5일간 배양하였다. 배양이 종료된 평판배지를 Congo Red 염색시약을 이용하여 상온에서 5분간 충분히 염색한 뒤, 멸균수로 세척하여 균체 주위에 노란색의 환이 형성되는 것의 유무로 셀룰로오스 분해 효소 생산능력을 검정하였다. 셀룰로오스 배지에서 분해활성을 보인 Fosmid shot-gun 클론을 random sequencing하여 이로부터 전체 1,371bp insert size의 염기서열을 확보하였다. 이를 아미노산서열로 translation한 뒤 그 가운데 Gram-positive 미생물에서 유래한 signal peptide 서열이 N-termnial 54개 아미노산에 존재하는 것을 확인하였다(붉은색). 이 부위를 제거한 1,206bp에 해당하는 402 아미노산 서열이 만난분해효소 기능을 가진 것으로 추정하였다. 이 402개 아미노산을 “EM17(수탁번호: KACC95124P)”로 명명하였다. EM17에서 유래한 단백질의 크기는 45.3kDa이며 pI는 5.4로 추정되었다(도 1(A) 참조).

EM17 아미노산 염기서열을 사용하여 domain 분석을 한 결과, 잘 알려진 β-mannanase domain이 존재하는 것으로 나타났다. EM17 염기서열을 대상으로 GenBank에 알려진 아미노산 서열과의 상동성 비교를 BalstX 알고리즘을 통하여 수행하였다. 가장 높은 homology는 Anaerophaga thermohalophila에서 유래한 endo-1,4-β-mannosidase로 maximum identity 46%, E-value 3e-139를 보였다(도 1(B) 참조).

3. EM17 의 endo -1,4-β- mannanase 계통 분석

도 2는 만난 분해효소 EM17과 BlastP 검색에서 유의성을 가진 것으로 보인 mannosidase 계열 효소들과의 계통분석도이다. Mega4 program (www.megasoftware.net)을 사용하여, BlastP 검색으로 가장 유사도가 높은 17개 만난분해효소 아미노산 서열을 선택하여 EM17 ORF와 multiple-amino acid-alignment를 수행하고 그 결과를 바탕으로 계통분석을 수행하였다. Clustal-W 알고리즘으로 multiple-alignment 한 뒤, Neighbor-Joining 알고리즘을 사용하였고 Bootstrap parameter는 1,000 replication, Random seed 44087을 사용하였다 (Bootstrap value ≥50). 분석에 사용된 각 만난분해 효소 유전자가 유래한 균과 GenBank ID를 보였다. 그 결과, EM17은 β-mannanase domain도메인을 가진 알려진 통상의 만난 분해 효소들과 달리 계통상 새로운 것으로 보이나, 주로 장내 혐기성 세균인 Bacteroides sp.와 클러스터를 형성하는 것을 알 수 있었다. 따라서 EM17이 Anaerophaga sp.와 단백질 아미노산 서열상 유사하나 아직까지 알려지지 않은 난배양 미생물에서 유래한 신규한 만난 분해효소임을 보여주었다.

4. EM17 의 대장균 이종 과대 발현

도 3은 만난 분해효소 EM17의 대장균에서의 이종 대량발현을 나타내는 것으로서, EM17의 ORF를 발현벡터 pET21b에 클로닝하여 IPTG 0.5mM로 20℃에서 overnight induction 하였다. PCR 반응에 사용한 primer 서열은 5'-tcgagctccgtcgacgcggataactctatcaggtt-3'(35-mer)와 5'-gtggtggtgctcgagttttagtgaaggcatctgat-3'(35-mer) 이다. 클로닝에는 Sal I과 Xho I 제한효소를 사용하였다(밑줄 표시함). 이 단백질을 분리정제 하기 위하여 EM17로 형질전환된 대장균의 50mL 배양액을 원심분리를 통해 세포만을 수득하였고, 이를 5ml lysis buffer(50mM HEPES (pH7.0), 300mM NaCl, 0mM Imidazole)에 재현탁한 후 초음파 파쇄기를 이용하여 세포를 파쇄하였다. 파쇄한 세포를 15,000rpm에서 15분간 원심 분리한 뒤 상층액을 수득하여, 만난 분해효소 분리에 필요한 조효소액으로 이용하였다. 상기의 방법으로 확보한 조효소액에서 EM17 단백질은 아미노산 C-terminal에 임의로 붙여준 6XHis-Tag을 사용하여 TALON Metal affinity resin resin(Clontech U.S.A) 과 섞어 주어 column에 packing 하였다. 조효소의 resin에 결합 후, 5 volume의 lysis buffer(50mM HEPES (pH7.0), 300mM NaCl, 0mM Imidazole)과 10 volume의 washing buffer(50mM HEPES(pH7.0), 300mM NaCl, 10mM Imidazole)로 차례로 씻어 준 다음 EM17 단백질을 5 volume의 elutioin buffer (50mM HEPES(pH7.0), 300mM NaCl, 150mM Imidazole)로 통상의 알려진 방법으로 순수 분리하였다(Qiagen Clontech U.S.A). 단백질의 농축과 imidazole dialysis는 분자량 30kDa 이상을 농축할 수 있는 YM30 membrane(Amicon Ultra, Millipore Co.)을 이용한 한회여과를 통하여 농축하였다. 최종 정제된 단백질은 SDS-PAGE 전기영동으로 단백질의 상태를 점검하였다. 그 결과 46kDa의 EM17의 단백질이 과다 발현된 것을 확인하였다.

5. 만난 분해효소 EM17 의 생화학적 특성분석

EM17의 최적 활성을 나타내는 온도를 측정하기 위해 정제된 EM17 단백질 0.05μg을 Na-phosphate 완충액(50mM, pH6.5, 200μl)하에서 10분 동안 locust bean gum (0.5%, w/v)과 반응하여 mannose 생성량을 DNS 방법으로 540nm에서 측정하였다. 그 결과 EM17은 55℃에서 최고의 활성을 나타내었다(도 4A 참조). 또한 EM17은 45℃ 이하에서 안정된 활성이 유지되었다(도 4B 참조).

최적 활성 pH를 확인하기 위해 각각 Na-acetate(pH5.0~6.0), Na-phosphate(pH6.0~7.0), HEPES(pH7.0~8.5), CHES(pH8.5~9.5) 완충액을 이용하여 locust bean gum (0.5%, w/v)의 분해 활성을 55℃에서 10min 동안 측정하였다(도 4C 참조). 그 결과, EM17 단백질은 pH6.5의 약한 산성에서 최적의 활성을 나타내었다. EM17 단백질의 pH 안정성을 측정하기 위해 상기 각각 서로 다른 pH 하에서 단백질을 4℃에서 15시간 동안 방치한 뒤, 상기 표준 assay - 정제된 EM17 단백질 0.05μg을 Na-phosphate 완충액(50mM, pH6.5, 200μl)하에서 55℃, 10분 동안 locust bean gum (0.5%, [w/v]) - 방식에 따라 분해 산물을 확인하였다. EM17 단백질은 pH 5~9 범위에서 60% 이상의 활성을 가진 안정된 특성을 보여주었다(도 4D참조).

6. 만난 분해효소 EM17 의 inhibition 확인 및 정제된 EM17 의 기질 특이성 분석

Inhibitor가 없는 정제된 EM17 단백질(0.025μg/μl) 2μl(최종 0.05μg)를 40℃에서 30분 동안 pre-incubation 한 뒤 Na-phosphate 완충액(50mM, pH6.5, 200μl)하에서 55℃, 10분 동안 locust bean gum(0.5%, w/v)과 반응하여 mannose 생성량을 DNS 방법으로 540nm에서 측정하였다. 이 값을 표준반응 100%로 하였다.

유기용매에 대한 효소의 안정성을 확인하기 위하여 서로 다른 유기용매(10%)에 0.025μg/μl의 EM17을 넣고 40℃에서 30 min 동안 pre-incubation 하였다. 여기에서 2μl(최종 0.05μg EM17 단백질)을 분주하여 0.5%의 locust bean gum을 기질로 상기 표준반응 후 생성된 mannose양을 서로 비교하였다. EM17은 유기용매에서 매우 높은 안정성을 보였다. 특히 물에 녹는 극성(polarity, LogP)을 가진 유기용매의 유효농도 10% 에서도 활성의 변화가 거의 없이 안정하였으며, acetonitrile에서도 비교군에 비하여 50%의 효소활성을 유지할 수 있었다. 유기용매의 농도를 10%에서 20%로 높여 상기 조건에서 잔류활성을 검출한 경우에도 EM17 단백질은 DMSO(100.90±0.98%), Methanol(86.20±3.28%), 2-propanol(66.57±3.49%), DMF(62.45±3.68%), Ethanol(43.67±2.49), Acetone(36.48±5.82%)의 순서로 활성이 유지되었다. 반면 물에 용해되지 않는 유기용매의 경우는 EM17의 활성이 유지되지 못했다. 이런 특징은 물을 기본용매로 사용하면서 동시에 유기용매를 공정과정에서 범용해야 하는 고분자 바이오매스 재활용 현장에서 매우 유리한 특성이다(도 5A).

계면활성제에 대한 안정성을 확인하기 위하여 각 20% ([v/w], [v/v]) 농도에서 40℃에서 30분 동안 pre-incubation 하였다. 이 후 상기 표준 반응에 따라 생성된 상대적인 mannose양을 비교하였다. EM17은 계면활성제에 대하여도 매우 안정된 특징을 보여준다. 유효농도 20%의 높은 non-ionic 계면활성제(Tween 20/40/80, Triton X-100)에서는 EM17의 활성에 변화가 없었다. 반면 양이온성(cationic) 계면활성제 (SDS, CTAB)에 노출될 경우에는 EM17의 활성이 사라졌다(도 5B).

금속이온에 대한 활성안정성을 확인하기 위하여 각 금속이온 1mM 존재 하에서 40℃에서 30분 동안 pre-incubation 하였다. 이 후 상기 표준 반응에 따라 생성된 상대적인 mannose양을 비교하였다. 금속이온에 대한 특성은 EM17이 산업현장에서 대량으로 발현시켜 사용하기 용이한 non-metalic 효소라는 사실을 보여준다. 유효농도 1mM 농도에서 테스트한 대부분의 금속이온 하에서도 효소의 활성은 거의 변화하지 않았다. 다만 기존에 알려진 대부분의 만난 분해효소와 같이 Fe³ ⁺, Cu² ⁺ 이온에 의해 EM17의 활성은 감소하였다. 수은(HgCl₂)에 의해서도 활성이 사라졌다. 이런 결과는 EM17이 만난 분해효소라는 간접적인 증거이기도 하다(도 5C).

도 6은 정제된 EM17의 기질 특이성에 관한 것이다. 각각 서로 다른 기질(0.5%, [w/v])을 사용하여 정제된 EM17 0.02μg을 Na-phosphate 완충액(50mM, pH6.5, 200μl)하에서 55℃, 10min. 동안 반응하여 mannose 생성량을 DNS 방법으로 540nm에서 측정하였다. 1 Unit은 1분간 1 μmol의 mannose를 생산하는 효소의 양으로 정의하였다. p-nitrophenol 계열의 기질에서는 0.1 mM 농도에서 표준분석 방법으로 반응하여 유리되는 p-nitrophenol을 405nm에서 흡광도 측정하였다.

EM17은 만노스(mannose)를 구성당으로 가진 고분자 기질인 Locust bean gum galactomannan, Konjac glucomannan, Guar gum galactomannan에서만 효소 활성을 나타내었다. 포도당(glucose)이 주요 구성성분인 전분(Soluble starch), carboxymethylcellulose, pNP-β-glucopyranoside에서는 활성을 보이지 않았다. 자일로스(xylose)가 주요 구성 당인 birchwood xylan, oat spelt xylan의 경우에도 활성이 나타나지 않았다. 이외에도 EM17은 galactose, D-galactouronic acid, maltotriose에 대하여도 활성이 없었다. 이는 EM17이 만노스 당을 구성성분으로 하는 기질에만 작용하는 만난(mannan) 특이적 분해효소라는 것을 보여준다. 반면, 만노스 당이 exo 형태로 결합된 pNP-β-mannopyranoside에는 활성을 가지지 않았다. 이런 결과를 종합하면 EM17은 만노스를 구성성분으로 한 만난을 특이적으로 분해하며 이 기질의 내부(endo-form)를 우선적으로 절단하는 endo-β-1,4-mannanase 효소임을 알 수 있다.

<110> Foundation of agri.tech. commercialization & Transfer <120> An organic solvent-tolerant endo-1,4-beta-mannanase gene EM17 and recombination mannannase from transformed strain using thereof <130> p120986 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1209 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EM17 <400> 1 gcggataact ctatcaggtt gattttcgac agggaagtaa ccgtagtaga cttgggtatg 60 gtaagcgtta ataatgccat catttcaggt tcatccattt cgggcgacac actaatcttt 120 acgctagacg ggatagacga aaaaactcag tatacattaa ccatagctaa aggggctata 180 aaaggagttc cggggctgct taatcaagaa gatatcactg tgtcattcaa tacgggtgaa 240 gcccctgctt taaccaaaac tctggttacg cccaatgctt cggctcaagc taagaacgta 300 tttaatttcc tgttggaaaa ctacagaaac aaaattatat cggggtctat ggccagagtg 360 aactggaata ccgatgaagc agacagggtt tacagatgga cagggaaata tccggctatc 420 aatactttcg actttgtaca tttatacgct tcgccagcca gttggatcga ttacagcaat 480 actacagtag ccgaaaactg gtggaacaac aaagggttgg tttcaattat gtggcattgg 540 aatgtaccta ttgagggcac ttcaaatttc ggtttctatt acacaggaaa aaacaatggc 600 gaaggtgaaa cctcttttga cattacaaaa gctgttcagg atggaactga tgaaaataaa 660 atcataaaag ccgatctaga caaagtggct actcacctat tggctctgca agcaaaaggc 720 atacctgtaa tatggcgacc attgcacgaa gccgcaggag gctggttctg gtggggagct 780 aaagatgcca attcgtataa agcactttgg atattgatgt tcgatacatt caaagccaaa 840 ggaatcaaca accttatctg ggtatggact accgaaacca atgacaatag ctggtatccg 900 ggagatgctt atgtagatat tatcggacgg gatatctaca ataaaaaaga tgccgctgcc 960 atttataaag aatacctcag catcagaaaa acatatccgg gcaaaatggt tactctcagc 1020 gaatgtggaa acgttgcgaa tatatcccaa cagtggagtg ccaatgccaa atggtcgtgg 1080 tatatgcctt ggtacgatta taatgcaact gacgaatcgg aacactccca tgcaactaaa 1140 gcattttgga ctgatgcttt tgcatctgat aaagtgataa ccagagatca gatgccttca 1200 ctaaaataa 1209 <210> 2 <211> 402 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EM17 <400> 2 Ala Asp Asn Ser Ile Arg Leu Ile Phe Asp Arg Glu Val Thr Val Val 1 5 10 15 Asp Leu Gly Met Val Ser Val Asn Asn Ala Ile Ile Ser Gly Ser Ser 20 25 30 Ile Ser Gly Asp Thr Leu Ile Phe Thr Leu Asp Gly Ile Asp Glu Lys 35 40 45 Thr Gln Tyr Thr Leu Thr Ile Ala Lys Gly Ala Ile Lys Gly Val Pro 50 55 60 Gly Leu Leu Asn Gln Glu Asp Ile Thr Val Ser Phe Asn Thr Gly Glu 65 70 75 80 Ala Pro Ala Leu Thr Lys Thr Leu Val Thr Pro Asn Ala Ser Ala Gln 85 90 95 Ala Lys Asn Val Phe Asn Phe Leu Leu Glu Asn Tyr Arg Asn Lys Ile 100 105 110 Ile Ser Gly Ser Met Ala Arg Val Asn Trp Asn Thr Asp Glu Ala Asp 115 120 125 Arg Val Tyr Arg Trp Thr Gly Lys Tyr Pro Ala Ile Asn Thr Phe Asp 130 135 140 Phe Val His Leu Tyr Ala Ser Pro Ala Ser Trp Ile Asp Tyr Ser Asn 145 150 155 160 Thr Thr Val Ala Glu Asn Trp Trp Asn Asn Lys Gly Leu Val Ser Ile 165 170 175 Met Trp His Trp Asn Val Pro Ile Glu Gly Thr Ser Asn Phe Gly Phe 180 185 190 Tyr Tyr Thr Gly Lys Asn Asn Gly Glu Gly Glu Thr Ser Phe Asp Ile 195 200 205 Thr Lys Ala Val Gln Asp Gly Thr Asp Glu Asn Lys Ile Ile Lys Ala 210 215 220 Asp Leu Asp Lys Val Ala Thr His Leu Leu Ala Leu Gln Ala Lys Gly 225 230 235 240 Ile Pro Val Ile Trp Arg Pro Leu His Glu Ala Ala Gly Gly Trp Phe 245 250 255 Trp Trp Gly Ala Lys Asp Ala Asn Ser Tyr Lys Ala Leu Trp Ile Leu 260 265 270 Met Phe Asp Thr Phe Lys Ala Lys Gly Ile Asn Asn Leu Ile Trp Val 275 280 285 Trp Thr Thr Glu Thr Asn Asp Asn Ser Trp Tyr Pro Gly Asp Ala Tyr 290 295 300 Val Asp Ile Ile Gly Arg Asp Ile Tyr Asn Lys Lys Asp Ala Ala Ala 305 310 315 320 Ile Tyr Lys Glu Tyr Leu Ser Ile Arg Lys Thr Tyr Pro Gly Lys Met 325 330 335 Val Thr Leu Ser Glu Cys Gly Asn Val Ala Asn Ile Ser Gln Gln Trp 340 345 350 Ser Ala Asn Ala Lys Trp Ser Trp Tyr Met Pro Trp Tyr Asp Tyr Asn 355 360 365 Ala Thr Asp Glu Ser Glu His Ser His Ala Thr Lys Ala Phe Trp Thr 370 375 380 Asp Ala Phe Ala Ser Asp Lys Val Ile Thr Arg Asp Gln Met Pro Ser 385 390 395 400 Leu Lys

Claims

서열번호 1의 핵산서열로 표시되는 만난분해효소 EM17 유전자.
서열번호 2의 아미노산서열로 표시되는 만난분해효소 EM17 단백질.
제 1항의 유전자를 포함하는 재조합 백터.
제 3항의 재조합 백터로 형질전환된 형질전환체.
제 4항에 있어서, 상기 형질전환체는 형질전환 되는 숙주세포를 대장균으로 하는 것을 특징으로 하는 형질전환체.
제5항에 있어서,
상기 형질전환체는 KACC 95124P균주인 것을 특징으로 하는 형질전환체.
(a) 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 형질전환체를 배양하는 단계;
(b) 상기 배양된 형질전환체로부터 만난분해효소를 생산하는 단계; 및
(c) 상기 생산된 만난분해효소를 회수하는 단계를 포함하는 만난분해 효소의 제조방법.