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KR101472789B1 - 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자 - Google Patents

저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자 Download PDF

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KR101472789B1
KR101472789B1 KR1020120049560A KR20120049560A KR101472789B1 KR 101472789 B1 KR101472789 B1 KR 101472789B1 KR 1020120049560 A KR1020120049560 A KR 1020120049560A KR 20120049560 A KR20120049560 A KR 20120049560A KR 101472789 B1 KR101472789 B1 KR 101472789B1
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Abstract

본 발명은 저준위 전리방사선에 민감한 유전자의 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암 유발된 AKR/J 생쥐와 정상의 ICR 생쥐에 저준위 전리방사선을 조사하고, 여기서 흉선을 채취하며, 상기 흉선에 대하여 마이크로어레이를 수행하여 면역 및 세포사멸 유전자를 분류하고, 상기 유전자를 증폭하고 발현량을 측정함으로써 암 유발 개체에서 발굴하고 정상 개체에서 검증되는 흉선암 억제에 관여하는 저준위 전리방사선에 민감한 유전자의 검출 방법을 제공한다. 이와 같은 구성의 본 발명은 교란 변수의 개입을 방지하여 방사선에 특이하게 반응하는 유전자를 정확하게 검출할 수 있는 효과가 있다.

Description

저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자{Detection Method of Sensitive Genes for Low-Dose-Rate Radiation and Genes Detected by This Method}
본 발명은 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자에 관한 것으로서, 상세하게는 암 유발 생쥐 및 정상 생쥐에 저준위 전리방사선을 조사하여 흉선으로부터 정상 생쥐와 암 유발 생쥐에서 공통적으로 특이하게 관찰되는 면역과 세포사멸 관련 유전자를 분류하는 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법에 관한 것이다.
산업 및 의료적 방사선의 활용증가와 더불어 인체영향에 대한 연구가 다양하게 이루어지고 있으며, 주로 방사선 조사를 이용한 암치료에 관심 대상이다. 고선량 전리방사선은 DNA 손상, 유전적 변형, 암을 포함한 질병을 일으키지만, 200 mGy 이하 선량과 6 mGy/시간 이하의 선량률 방사선은 면역반응을 활성화시켜 암발생을 억제한다고 알려져 있다.
일반적으로, 방사선과 암 발생과의 상관성, 특히 유전자 반응에 대한 연구가 수행되어 왔으나, 그 결과의 신뢰성을 저해하는 교란변수가 많이 개입되어 있었다. 그러나, 지금까지 대부분의 연구는 유전자 일부를 변형하였거나 암세포주를 이용하여서 신체를 구성하는 세포, 조직, 장기 그리고 신체단계에서 관찰되는 다양한 반응을 설명할 수 없었다. 즉, 일반 마우스를 이용하여 유전자 반응을 평가하였기 때문에 발현 유전자가 다양하였을 뿐만 아니라 암 발생이 특정 장기에 한정되지 않았기 때문에 유전자 반응을 해석하기 어려운 문제점이 있었다.
종래 암 연구를 위하여 세포를 이용하는 방법은, 유전자를 변경하거나 암 발생에서 중요한 p53이 결여된 암 세포에 방사선을 조사하였기 때문에 정상 세포의 반응과는 근본적으로 달라 그 결과를 개체에 적용할 수 없는 문제점이 있었으며, 이런 단점을 보완하기 위하여, 인간과 유전자가 95% 이상 유사한 생쥐를 이용하여 방사선에 대한 암 발생연구를 수행하고 있다. 그러나, 일반 생쥐는 자연암 발생률이 매우 낮아 다양한 암 연구용 모델 생쥐가 이용되고 있다.
종래의 연구내용은 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 민감한 유전자를 발굴하기 위해 다양한 방법을 이용하였다. 하지만 본 발명에서 제시한 유전자들은 기존에 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 대해 민감한 유전자라고 알려진 적이 없다.
본원발명의 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 대해 민감한 유전자 프로파일 발굴에 선행되었던 기술은 다음과 같다.
① 인간 유선 상피세포에서 유전자 탐지방법을 이용하여 방사선에 민감한 유전자를 발굴하였다 (Malone J, Ullrich R (2007) Radiat Res 167: 176-1847).
② 방사선을 조사한 인간 림프구에서 초기 방사선에 민감한 유전자들을 마이크로어레이와 정량적 핵산증폭법을 이용하여 발견했다 (Turtoi A et. al. (2008) Int J Radiat Biol 84: 375-387).
③ 1-7 Gy을 조사한 수컷 BALB/c 생쥐에서 혈액 단백질 분석을 통해서 생물학적 선량 표지인자를 발굴하였다 (Ossetrova NI, Blakely WF (2009) Int J Radiat Biol 85: 837-850).
④ 생물학적 네트워크를 대표하는 500개 유전자에 대한 선형회귀분석을 통해서 c-Jun, HDAC1, RELA (NFKB의 p65 subunit), PKC-beta, SUMO-1, c-Abl, STAT1, AR, CDK1, IRF1가 포함된 10개 허브 유전자 네트워크가 확인되었다 (Eschrich S et. al. (2009) Int J Radiat Oncol Biol Phys 75: 497-505).
⑤ 277개 인간 림프구 세포주에서 방사선 반응을 예측할 수 있는 단일 염기변이 표지인자를 발굴하였다 (Niu N et. al. (2010) Genome Res 20: 1482-1492).
⑥ 최근 연구에서는 인간의 표피조직을 모방한 3차원 조직모델인 EPI-200 조직을 이용하여 방사선 조사 반응에 새로운 견해를 제공하였다 (Mezentsev A, Amundson SA (2011) Radiat Res 175: 677-688).
⑦ 방사선 노출과 독성을 측정하는데 RNA 기반 발현 분석법을 생물학적 선량평가 도구로 이용하였다 (Pogosova-Agadjanyan EL et. al. (2011) Radiat Res 175: 172-184).
⑧ 다중 정량적 핵산증폭법과 특정 유전자 발현 분석법을 이용하여 인간 림프구와 백혈구에서 방사선에 민감한 유전자를 발굴하였다 (Kabacik S et. al. (2011) Int J Radiat Biol 87: 115-129).
이에, 본 발명자들은 저준위 전리방사선에 대해 민감하게 반응하는 유전자를 찾고자 노력하던중, 면역 (Ighg, Saa2, Defb6, Reg3g, Tac2 및 Igh-VJ558)과 세포사멸 (Klk1b27)에 중요한 7개의 유전자의 기능을 분석하고, 상기 7개 유전자에 대한 보고가 없음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 저준위 전리방사선에 민감한 유전자의 검출 방법 및 상기 방법으로 검출된 유전자를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 ⅰ) 암 유발된 AKR/J 생쥐와 정상의 ICR 생쥐에 저준위 전리방사선을 조사하는 단계; ⅱ) 상기 AKR/J 생쥐와 ICR 생쥐로부터 흉선을 채취하는 단계; ⅲ) 상기 흉선에 대하여 마이크로어레이를 수행하는 단계; ⅳ) 상기 마이크로어레이로부터 벤다이어그램 분석을 통하여 면역 또는 세포사멸과 관련된 유전자를 분류하는 단계; 및 ⅴ) 상기 유전자를 증폭하고 발현량을 측정하는 단계;를 포함하며, 암 유발 개체에서 발굴하고 정상개체에서 검증되고 흉선암 억제에 관여하는 저준위 전리방사선에 민감한 유전자의 검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 흉선암 억제에 관여하는 XM_001472541.1, Saa2(NM_011314), Reg3g(NM_011260), Defb6(NM_054074), Tac2(NM_009312) 및 Igh-VJ558(NM_001474025)로 이루어진 군중에서 선택된 면역 유전자 또는 Klk1b27(NM_020268) 세포사멸 유전자를 포함하는 흉선암 억제 진단용 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기에 따른 마커를 포함하는 흉선암 억제 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기에 따른 마커를 포함하는 흉선암 진단용 마이크로 어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 사람을 제외한 흉선암을 갖는 포유동물에 방사선을 조사하는 단계; ⅱ) 상기 방사선이 조사된 포유동물로부터 적출한 흉선 조직과 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 ⅲ) 상기 흉선 조직으로부터 흉선암 억제에 관여하는 유전자인 XM_001472541.1, Saa2(NM_011314), Reg3g(NM_011260), Defb6(NM_054074), Tac2(NM_009312) 및 Igh-VJ558(NM_001474025)로 이루어진 군중에서 선택된 면역 유전자 또는 Klk1b27(NM_020268) 세포사멸 유전자의 발현변화를 측정하는 단계를 포함하는 흉선암을 치료하거나 억제하는 유전자의 검출방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따르면 면역반응에 관여하는 것으로 알려진 Ighg와 Igh-VJ558은 저준위 전리방사선 조사에 의해 활성화되었다. 저준위 전리방사선 조사는 흉선암 발생과정에서 면역반응을 활성화시킬 수 있음을 보여준다.
또한, Saa2는 지방세포에서 시스템 염증반응과 유리 지방산 생산에 관여하는 것으로 분석되었다 (Lopez-Nieva P et. al. (2004) Carcinogenesis 25: 1299-1304). 아울러, Reg3g는 염증반응에 관여하는 것으로 분석되었음 (Beverly LJ, Felsher DW (2005) Cancer Res 65: 7159-7168). 그리고, Defb6는 비뇨생식기관의 면역반응에 관여하는 것으로 분석되었음 (Yamaguchi Y et. al. (2002) J Immunol 169: 2516-2523).
또한, 신경세포와 무신경세포에서 Tac2는 주로 관찰되며 수컷에서 성선자극호르몬합성에 관여한다고 분석되었다 (Corander MP et. al. (2010) J Neuroendocrinol 22:181-187). 아울러, Klk1b27는 serine protease로 분석되었다. 리엑톰에 따르면 인슐린 성장 호르몬 단백질결합에 관여하는 것으로 분석되었다 (REACTOME: 1494374).
방사선에 대한 인체영향 가운데 암 발생 연구가 많이 수행되어 왔으나, 암세포 혹은 유전자가 변형된 세포주나 일반 생쥐를 이용하였기 때문에 다양한 신체반응 (유전자 반응)을 설명하기 어려웠다. 특히, 개체 차원에서 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 대한 민감한 유전자 프로파일을 발굴하고 기능을 설명한 적이 없다. 본 발명에서는 1) 정상적인 ICR 생쥐와 흉선암 발병하는 AKR/J 생쥐를 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 조사 (암 발생 자극인자)한 후, 흉선에서 특이하게 발현하는 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 프로파일을 발굴하고 기능을 분석한 후, 2) 흉선암 발생단계를 진단할 수 있는 유전자 프로파일 구성의 요소로 사용하고자 하였다.
본 발명은 ⅰ) 암 유발된 AKR/J 생쥐와 정상의 ICR 생쥐에 저준위 전리방사선을 조사하는 단계; ⅱ) 상기 AKR/J 생쥐와 ICR 생쥐로부터 흉선을 채취하는 단계; ⅲ) 상기 흉선에 대하여 마이크로어레이를 수행하는 단계; ⅳ) 상기 마이크로어레이로부터 벤다이어그램 분석을 통하여 면역 또는 세포사멸과 관련된 유전자를 분류하는 단계; 및 ⅴ) 상기 유전자를 증폭하고 발현량을 측정하는 단계;를 포함하며, 암 유발 개체에서 발굴하고 정상개체에서 검증되고 흉선암 억제에 관여하는 저준위 전리방사선에 민감한 유전자의 검출 방법을 제공한다.
본 발명의 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법에 있어서, 상기 저준위 전리방사선은 감마선(Cs-137)을 0.7 mGy/시간의 세기로 최종 1.7 Gy의 방사선량으로 조사하는 것이 바람직하고, 본원발명의 상기 방법은 흉선암 진단용 키트의 제작, 암 환자의 암 진행 및 치료 정도의 평가, 산업 및 의료종사자의 방사선 피폭과 발암과의 상관성 평가, 방사선과 암 발생 인과관계 평가, 방사선 피폭에 대한 생물학적 선량평가 또는 저준위 전리방사선에 의한 흉선암 발생 및 진행도 평가의 지표로 활용되는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법에 있어서, 상기 암은 흉선암인 것이 바람직하며, 이때 상기 ⅱ) 단계의 흉선의 채취는 암으로 인하여 폐사가 시작되는 시점에서 이루어지는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법에 있어서, 상기 면역 유전자는 XM_001472541.1, Saa2(NM_011314), Reg3g(NM_011260), Defb6(NM_054074), Tac2(NM_009312) 및 Igh-VJ558(NM_001474025)로 이루어진 군중에서 선택되고, 세포사멸 유전자는 Klk1b27(NM_020268)인 것이 바람지가고, 이때 상기 XM_001472541.1 유전자는 서열번호 1 및 2로 기재되는 프라이머, Saa2(NM_011314) 유전자는 서열번호 3 및 4로 기재되는 프라이머, Reg3g(NM_011260) 유전자는 서열번호 5 및 6으로 기재되는 프라이머, Defb6(NM_054074) 유전자는 서열번호 7 및 8로 기재되는 프라이머, Tac2(NM_009312) 유전자는 서열번호 9 및 10으로 기재되는 프라이머, Igh-VJ558(NM_001474025) 유전자는 서열번호 11 및 12로 기재되는 프라이머, 그리고, Klk1b27(NM_020268) 유전자는 서열번호 13 및 14로 기재되는 프라이머로 증폭되는 것이 보다 바람직하다.
상기 단계 ⅳ) 상기 마이크로어레이로부터 관련 유전자의 분류는, 방사선 조사 전의 암 유발 개체에 비해 방사선 조사 후의 암 유발 개체에서 과발현된 유전자를 마이크로어레이에 의해 검출한 후, 유전자의 기능 검색을 통해 상기 과발현 된 유전자의 정체를 밝혀내는 것을 특징으로 한다. 마이크로어레이 분석은 하기 실시 예에서 자세히 설명하고 있으며, 서열번호 1번 ∼ 14번 프라이머를 이용하여 검증하였으며, 유전자의 기능 검색은 하기 실시 예에서 BioCarta (http://www.biocarta.com/), GenMAPP (http://www.genmapp.org/), 생물정보 데이터 베이스 DAVID(http://apps1.niaid.nih.gov/david/)와 Pubmed 데이터 베이스(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 실시하였으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용하는 "저준위 전리방사선에 민감한 유전자"란 방사선을 조사하기 전의 암 유발 개체와 비교하여 방사선을 조사한 후의 암 유발 개체에서 차별적으로 과발현되는 유전자를 지칭한다. 즉 암 유발 개체에서 방사선 자극에 의해 발현 패턴의 변화가 유도되는 유전자를 의미하며, 특정한 암과 관련이 있는 타겟 유전자, 즉 종양 형성 유전자 또는 종양 억제 유전자일 수 있다. 이러한 암 특이적인 유전자를 검출해냄으로써 암 환자에 대한 방사선 치료의 분자적 기전을 확립하여 방사선 치료 효과 증대에 기여할 수 있을 뿐만 아니라, 새로운 종양 형성 또는 종양 억제 유전자를 발굴하여 이들의 발현을 조절함으로써 분자생물학적 수준에서의 암 치료제 또는 치료 방법의 개발을 위한 기반을 마련할 수 있다.
또한, 본 발명은 흉선암 억제에 관여하는 XM_001472541.1, Saa2(NM_011314), Reg3g(NM_011260), Defb6(NM_054074), Tac2(NM_009312) 및 Igh-VJ558(NM_001474025)로 이루어진 군중에서 선택된 면역 유전자 또는 Klk1b27(NM_020268) 세포사멸 유전자를 포함하는 흉선암 억제 진단용 마커를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기에 따른 마커를 포함하는 흉선암 억제 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기에 따른 마커를 포함하는 흉선암 진단용 마이크로 어레이를 제공한다.
또한, 본 발명은 ⅰ) 사람을 제외한 흉선암을 갖는 포유동물에 방사선을 조사하는 단계; ⅱ) 상기 방사선이 조사된 포유동물로부터 적출한 흉선 조직과 시험물질을 접촉시키는 단계; 및 ⅲ) 상기 흉선 조직으로부터 흉선암 억제에 관여하는 유전자인 XM_001472541.1, Saa2(NM_011314), Reg3g(NM_011260), Defb6(NM_054074), Tac2(NM_009312) 및 Igh-VJ558(NM_001474025)로 이루어진 군중에서 선택된 면역 유전자 또는 Klk1b27(NM_020268) 세포사멸 유전자의 발현변화를 측정하는 단계를 포함하는 흉선암을 치료하거나 억제하는 유전자의 검출방법을 제공한다.
본 발명에서는 흉선암 연구모델인 AKR/J 생쥐와 정상적인 생쥐종인 ICR에 대하여 저준위 (0.7 mGy/시간) 감마선 (Cs-137)을 조사하고, AKR/J 생쥐가 흉선암으로 인하여 폐사가 시작되는 시점 (100일)에서 흉선을 채취하였다. 채취한 흉선에 대하여 마이크로어레이를 수행한 후 벤다이어그램 분석을 통하여 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 민감하게 반응을 보이는 면역 및 세포사멸 유전자를 분류하고, 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 민감하게 반응을 보이는 상기 유전자를 핵산증폭하고 발현량을 측정하였다.
그 결과, 본 발명을 통하여 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 민감하게 반응을 보이는 면역 (Ighg, Saa2, Defb6, Reg3g, Tac2 및 Igh-VJ558)과 세포사멸 (Klk1b27)에 중요한 7개의 유전자를 발굴하였으며, 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선은 흉선세포내의 면역 (Ighg, Saa2, Defb6, Reg3g, Tac2 및 Igh-VJ558)과 세포사멸에 관련된 유전자 (Klk1b27)를 활성화시켜서 흉선암을 억제하였다. 이와 같이, 본원발명은 관련 유전자의 기능을 알기 쉽게 제시하였으며, 흉선암으로 인하여 폐사가 관찰되는 100일째를 규정하여 흉선을 채취함으로써 저준위 전리방사선에 반응을 보이는 당대사 유전자 반응을 일관성 있게 관찰할 수 있게 하였다.
그러므로, 본 발명은 1) 흉선암 진단용 진단 키트 개발을 위한 유전자 프로파일, 2) 저준위 전리방사선 환경에서 생활하는 산업 및 의료종사자의 암 발생 인과관계 평가 지표, 3) 암환자의 암발생을 진단하고 치료대책을 세울 수 있는 정보용 유전자 프로파일, 4) 방사선 피폭과 흉선암 발생과의 인과관계를 구분할 수 있는 지표, 5) 저준위 전리방사선 피폭에 대한 생물학적 선량평가를 위한 새로운 유전자 지표로 폭 넓게 활용할 수 있음. 6) 전리방사선에 민감한 당대사 신호전달은 저준위 전리방사선 피폭에 대한 타겟 치료로 적용할 수 있다.
상기와 같이 구성되는 저준위 전리방사선에 민감한 유전자 검출 방법은, 흉선암 진단용 킷트를 제작하기 위한 저준위 전리방사선 민감성 지표 유전자 프로파일로 활용 가능하고. 암 환자의 암 진행 및 치료 정도를 평가할 수 있는 저준위 전리방사선 민감성 지표 유전자로 활용 가능하다. 또한 산업 및 의료종사자의 방사선 피폭과 발암과의 상관성을 평가할 수 있는 저준위 전리방사선 민감성 지표 유전자로 활용 가능하며, 방사선과 암 발생 인과관계를 평가할 수 있는 저준위 전리방사선 민감성 지표로 활용할 수 있다. 아울러, 방사선 피폭에 대한 생물학적 선량평가를 위한 새로운 지표로 활용할 수 있고, 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 의한 흉선암 억제효과를 평가하는 저준위 전리방사선 민감성 지표 유전자로 활용할 수 있다.
도 1은 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선이 흉선세포내의 면역 (Ighg, Saa2, Defb6, Reg3g, Tac2 및 Igh-VJ558)과 세포사멸에 관련 유전자 (Klk1b27)를 활성화시켜서 흉선암을 억제하음을 도식화하여 나타낸 것이다.
도 2는 AKR/J와 ICR 생쥐를 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 조사한 후 사육하면서, AKR/J 생쥐가 흉선암으로 폐사가 시작되는 시점 (100일)을 흉선을 채취하여 흉선 무게를 계측하고, 이것을 지표로 방사선에 민감한 유전자 반응을 분석한 그래프이다.
이하, 본 발명을 실시 예를 통해 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시 예는 본 발명을 설명하기 위한 것일 뿐, 하기 실시 예에 의하여 본 발명의 권리범위가 한정되는 것은 아니다.
<실시 예 1>
일본 SLC사에서 6주령의 흉선암 연구모델인 암컷 AKR/J 생쥐와 정상의 암컷 ICR 생쥐를 구입하였다. 감마선 발생장치 (IBL 147C, CIS bio international, France)를 이용하여 상기 AKR/J 생쥐에 저준위 전리방사선을 최종선량이 1.7 Gy에 도달하게 조사 (137Cs, 0.7 mGy/시간)하였다. 저준위 전리방사선 조사가 종료된 생쥐는 방사선이 차단된 무균 사육시설로 옮겨서 100일 동안 사육하면서 흉선암 발생을 관찰하였다. 유전자 분석을 위하여 동일한 실험조건에서 별도로 사육한 정상 생쥐(ICR 생쥐)를 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선 조사하고 100일 후에 채취한 흉선은 액체질소에 급속 냉동시킨 후 유전자 분석을 수행하였다.
<실시 예 2> 마이크로어레이 및 유전자 분석
상기 실시 예 1의 결과, 암 연구용 모델 생쥐(AKR/J 생쥐)를 이용하여 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 민감한 유전자를 발굴하였으며 정상적인 생쥐(ICR 생쥐)에서 증명하였다. 즉, 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선 조사된 AKR/J 생쥐와 ICR 생쥐의 흉선에서 특이하게 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선에 반응하는 유전자를 발굴하고 기능을 해석하였다. 벤다이어그램, 정량적 핵산증폭법 및 통계프로그램 SAS (ANOVA와 t-test)를 이용하여 분석하였다.
그 결과를 확인하기 위하여, 상기 유전자를 핵산 증폭하였다. 구체적으로, 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선 조사된 AKR/J와 ICR 생쥐에서 채취한 흉선을 마이크로어레이하고 저준위 전리방사선에 대하여 민감하게 반응을 보이는 유전자들에 대하여 발현량을 계측하기 위하여 하기 표 1에 기재된 프라이머를 이용하여 증폭하였다.
유전자번호 유전자이름 정방향(5' --> 3') 역방향(5' --> 3')
NM_001472541 Ighg GGGCTAGACCTGGATGATGT GCTGATGAAGATGGTGATGG
NM_011314 Saa2 AGCTGGCTGGAAAGATGGAGACAA TGTCCTCTGCCGAAGAATTCCTGA
NM_011260 Reg3g TCCTGTCCTCCATGATCAAA ACATCAGCATTGCTCCACTC
NM_054074 Defb6 TGGTGATGCTGTCTCCACTT CATGAACGCTGGCATGAG
NM_009312 Tac2 GGACTTATGGGCAAGAGGAA GGGATTATTTGAGGATGCCA
NM_001474025 Igh-VJ558 GAGAAATCCTGAGGGAGCTG AGGACGCTGGACACACTGTA
NM_020268 Klk1b27 TGTAGGAGAGACGGGTGGA TACCGTGGAGAACACCATCA
또한, AKR/J와 ICR 생쥐를 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선 조사한 후 사육하면서, AKR/J 생쥐가 흉선암으로 폐사가 시작되는 시점 (100일)에서 흉선을 채취하였다. 채취한 흉선을 마이크로어레이하고 저준위 전리방사선에 민감하게 반응을 보이는 유전자를 구분한 다음 핵산을 증폭하여 발현량을 측정하였다. 그 결과 저준위 전리방사선 조사된 생쥐에서는 면역 (Ighg, Saa2, Defb6, Reg3g, Tac2 및 Igh-VJ558)과 세포사멸에 관련된 유전자 (Klk1b27)가 저준위 전리방사선에 민감하게 반응하였다. 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.
마이크로어레이 정량적 핵산증폭법
유전자번호 유전자이름 ICR 생쥐 AKR/J 생쥐 ICR 생쥐 AKR/J 생쥐
NM_001472541 Ighg 17.2 2.2 42 ± 30* 12 ± 8.7
NM_011314 Saa2 1.1 0.7 116 ± 45 27 ± 21
NM_011260 Reg3g 0.9 0.9 1174 ± 959 11 ± 6.2
NM_054074 Defb6 1.3 0.6 47 ± 28 7.5 ± 4.6
NM_009312 Tac2 0.8 0.8 26 ± 10 6.9 ± 3.9
NM_001474025 Igh-VJ558 1.0 1.0 22 ± 17 6.8 ± 2.6
NM_020268 Klk1b27 0.6 2.5 1.9 ± 0.2 10 ± 3.6
*발현배수 ± 표준편차
또한, 도 1에 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선 조사로 인해 흉선세포내의 면역 (Ighg, Saa2, Defb6, Reg3g, Tac2 및 Igh-VJ558)과 세포사멸에 관련 유전자 (Klk1b27)를 활성화시켜서 흉선암을 억제하였다.
또한, 도 2는 AKR/J와 ICR 생쥐를 저준위 (0.7 mGy/시간) 전리방사선 조사한 후 사육하면서, AKR/J 생쥐가 흉선암으로 폐사가 시작되는 시점 (100일)을 규정하여 흉선을 채취하여 흉선 무게를 계측하고, 이것을 지표로 방사선에 민감한 유전자 반응을 분석하였다. 본 발명을 통하여 흉선암으로 인하여 폐사가 발생하는 암 발병 초기단계를 규정하여 흉선을 채취하고 무게를 비교함으로서 저준위 전리방사선에 대하여 민감하게 반응을 보이는 유전자를 항시 일관성 있게 측정할 수 있게 되었다.
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Claims (11)

  1. ⅰ) 흉선암 유발된 AKR/J 생쥐와 정상의 ICR 생쥐에 0.7 mGy/시간의 세기로 최종 1.7 Gy의 방사선량의 감마선(Cs-137)의 저준위 방사선을 조사하는 단계;
    ⅱ) 상기 AKR/J 생쥐와 ICR 생쥐로부터 흉선을 채취하는 단계;
    ⅲ) 상기 흉선에서 유전자를 분리하고 상기 유전자에 대한 마이크로어레이를 수행하는 단계;
    ⅳ) 상기 마이크로어레이로부터 벤다이어그램 분석을 통하여 XM_001472541.1, Saa2(NM_011314), Reg3g(NM_011260), Defb6(NM_054074), Tac2(NM_009312) 및 Igh-VJ558(NM_001474025)로 이루어진 군중에서 선택된 면역관련 유전자 및 Klk1b27(NM_020268)인 세포사멸과 관련된 유전자를 분류하는 단계; 및
    ⅴ) 상기 유전자를 증폭하고 발현량을 측정하는 단계;를 포함하며, 흉선암 유발 개체에서 발굴하고 정상 개체에서 검증되는 저준위 전리방사선에 민감한 유전자의 검출 방법.
  2. 삭제
  3. 제 1항에 있어서, 상기 방법은 흉선암 진단용 키트의 제작, 암 환자의 암 진행 및 치료 정도의 평가, 산업 및 의료종사자의 방사선 피폭과 발암과의 상관성 평가, 방사선과 암 발생 인과관계 평가, 방사선 피폭에 대한 생물학적 선량평가 또는 저준위 전리방사선에 의한 흉선암 발생 및 진행도 평가의 지표로 활용되는 것을 특징으로 하는 저준위 전리방사선에 민감한 유전자의 검출 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서, 상기 ⅱ) 단계의 흉선의 채취는 암으로 인하여 폐사가 시작되는 시점에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 저준위 전리방사선에 민감한 유전자의 검출 방법.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 상기 XM_001472541.1 유전자는 서열번호 1 및 2로 기재되는 프라이머, Saa2(NM_011314) 유전자는 서열번호 3 및 4로 기재되는 프라이머, Reg3g(NM_011260) 유전자는 서열번호 5 및 6으로 기재되는 프라이머, Defb6(NM_054074) 유전자는 서열번호 7 및 8로 기재되는 프라이머, Tac2(NM_009312) 유전자는 서열번호 9 및 10으로 기재되는 프라이머, Igh-VJ558(NM_001474025) 유전자는 서열번호 11 및 12로 기재되는 프라이머, 그리고, Klk1b27(NM_020268) 유전자는 서열번호 13 및 14로 기재되는 프라이머로 증폭되는 것을 특징으로 하는 저준위 전리방사선에 민감한 유전자의 검출 방법.
  8. 삭제
  9. 흉선암 억제에 관여하는 XM_001472541.1, Saa2(NM_011314), Reg3g(NM_011260), Defb6(NM_054074), Tac2(NM_009312) 및 Igh-VJ558(NM_001474025)로 이루어진 군중에서 선택된 면역 유전자 또는 Klk1b27(NM_020268) 세포사멸 유전자를 포함하는 흉선암에 대한 진단용 마커를 포함하는 흉선암 진단용 키트.
  10. 흉선암 억제에 관여하는 XM_001472541.1, Saa2(NM_011314), Reg3g(NM_011260), Defb6(NM_054074), Tac2(NM_009312) 및 Igh-VJ558(NM_001474025)로 이루어진 군중에서 선택된 면역 유전자 또는 Klk1b27(NM_020268) 세포사멸 유전자를 포함하는 흉선암에 대한 진단용 마커를 포함하는 흉선암 진단용 마이크로 어레이.
  11. ⅰ) 사람을 제외한 흉선암을 갖는 포유동물에 방사선을 조사하는 단계;
    ⅱ) 상기 방사선이 조사된 포유동물로부터 적출한 흉선 조직과 시험물질을 접촉시키는 단계; 및
    ⅲ) 상기 흉선 조직으로부터 흉선암 억제에 관여하는 유전자인 XM_001472541.1, Saa2(NM_011314), Reg3g(NM_011260), Defb6(NM_054074), Tac2(NM_009312) 및 Igh-VJ558(NM_001474025)로 이루어진 군중에서 선택된 면역 유전자 또는 Klk1b27(NM_020268) 세포사멸 유전자의 발현변화를 측정하는 단계를 포함하는 흉선암을 치료하거나 억제하는 약물의 검색방법.
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