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KR101464842B1 - ＥＢ 바이러스에 의해 유도된 종양에 대한 융합 폴리펩티드 및 콜리신 Ｉａ 돌연변이체 - Google Patents

ＥＢ 바이러스에 의해 유도된 종양에 대한 융합 폴리펩티드 및 콜리신 Ｉａ 돌연변이체 Download PDF

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KR101464842B1
KR101464842B1 KR1020127018638A KR20127018638A KR101464842B1 KR 101464842 B1 KR101464842 B1 KR 101464842B1 KR 1020127018638 A KR1020127018638 A KR 1020127018638A KR 20127018638 A KR20127018638 A KR 20127018638A KR 101464842 B1 KR101464842 B1 KR 101464842B1
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Abstract

본 발명은 항-EB 바이러스 항체 또는 모방항체와 이온 채널을 형성할 수 있는, E1, Ia, Ib, A, B, N 및 그들의 돌연변이체로부터 선택되는 콜리신을 함유하는, EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 융합 폴리펩티드를 제공한다. 본 발명은 또한 G11A, H22G, A26G, V31L및 H40D의 돌연변이를 함유하는, 콜리신 Ia 돌연변이체를 제공한다. 본 발명은 또한 융합 폴리펩티드의 유전자, 벡터, 그 제조방법 및 용도를 제공할 뿐만 아니라, 그 돌연변이체의 유전자 및 용도를 제공한다.

Description

ＥＢ 바이러스에 의해 유도된 종양에 대한 융합 폴리펩티드 및 콜리신 Ｉａ 돌연변이체 {FUSION POLYPEPTIDE AGAINST EB VIRUS-INDUCED TUMOR AND COLICIN Ia MUTANT}
본 발명은 항종양 약물 분야에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 EB (Epstein-Barr) 바이러스에 의해 유도된 종양에 대한 신규 폴리펩티드 및 그 응용과 제조방법에 관한 것이다.
항생제 연구분야에서 사람들은 꾸준히 동종이주인 세균 사이에 서로 살상하는 작업방식을 모방하여 신규 항생제를 개발하고, 자연계의 많은 세균독소들은 세균포막에 직접 이온 채널을 형성하여 살균하며, 그 기준 표본은 대장균이 분비하는 세균독소-콜리신이다. 그 중 콜리신 Ia는 1952년 자콥(Jacob)에 의해 발견되었으며, 여러 세대의 노력을 거쳐, 문헌 [1996년, Qiu et al. (Major transmemebrane movement associated with colicin Ia channel gating. J.Gen.Physiology, 107:313-328 (1996))]은 분자 수준에서 신규한 항생제의 설계 및 제조에 대한 이론적 토대를 제공하는, 인공지질 이중층 분자막에 형성된 이온 채널의 개폐시 콜리신 Ia의 막관통 입체 구조를 밝혀냈다. 아울러 콜리신 폴리펩티드가 백색연주구균 페로몬, 포도상구균 페로몬 등 신호 펩티드 분자에 연결되어 형성된 폴리펩티드 분자는 페로몬을 통해 타겟세균 세포를 인식하고 콜리신을 타겟세균 세포막에 인도하여 막관통 이온 채널을 형성시켜 세포내 내용물 유출로 살상한다.
악성종양은 인류 건강에 거대한 위협이다. 전세계에서 매년 악성종양에 의해 사망하는 환자가 약 700만 명에 이르고, 그 중 중국이 6분의 1을 차지하며 중국 내 사망의 2번째 원인에 해당한다. 그 발병 원인 및 메커니즘과 임상학적 발현이 명확하지 않기 때문에, 예방효과가 이상적이지 않다. 또한 기존 항종양 예방 약물은 종양치료에 있어서 중요한 역할을 하며 일부 종양에 일정한 치료 효과를 얻었으나, 여전히 종양세포 선택성이 약하고, 면역억제 및 유해반응이 많고 심각하며, 약제 내성 등 결함이 존재한다.
EB 바이러스에 의해 유도되는 아프리카 아동 악성림프육종, 호지킨(Hodgkin) 림프육종 및 비인두암세포의 표면은 모두 EB 바이러스에 특이적인 표면항원을 지니고 있어서, EB 바이러스 표면항원은 상기 종류의 종양세포의 특이적 표지물이라고 할 수 있다. EB 바이러스로 인한 종양 약물에 대하여 특허번호 ZL200410081446.8의 발명은 콜리신 및 EB 바이러스 표면항원을 식별하는 모방항체가 결합하여 형성된 항종양 폴리펩티드를 개시하였고, 이는 유기체 속에 있는 EB 바이러스에 의해 유도되는 암세포를 특이적으로 살상할 수 있고 정상세포에는 무해하며 살상력은 다른 항암약물의 몇 배를 가지므로 근래에 사용한 항종양 약물에 존재하는 약물 선택성이 약하고, 약제 내성이 발생하고, 암세포를 살상하는 동시에 정상 조직에 심각한 손상을 가져오는 등의 문제를 극복한다. 씨아오-칭 치우(Xiao-Qing Qiu) 등은 2007년 문헌에서 일련 구조의 모방항체와 콜리신이 구성한 항종양 폴리펩티드의 종양을 살상하는 능력을 비교하여 VHCDR1-VHFR2-VLCDR3 및 VLCDR1-VHFR2-VHCDR3 두 가지 구조의 모방항체와 콜리신이 구성한 항종양 폴리펩티드의 종양을 살상하는 능력이 비교적 우수하다는 것을 발견하였다 (문헌 [Xiao-Qing Qiu et al., 2007, Small antibody mimetics comprising two complementarity-determining regions and a framework region for tumor targeting，Nature Biotechnology 25, 921-929, 1 August 2007]). 이것은 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 폴리펩티드의 제조에 있어서 더 많은 모방항체 후보를 제공하였다.
그러나 상기 항종양 폴리펩티드 중 콜리신 폴리펩티드의 소수성 말단에 보다 쉽게 과민반응을 일으킬 수 있는 아미노산 잔기가 존재하기 때문에 대장균 폴리펩티드를 함유한 약물이 유기체의 비정상적인 면역반응을 유발할 수 있으며; 연구보고에 따르면, 많은 암환자는 그의 대사 메커니즘이 암세포 간섭을 받아 비정상적으로 되고 폴리펩티드 종류의 약물에 쉽게 과민반응을 일으켜 약물 치료를 받을 수 없는 상태가 되기 때문에, 콜리신 폴리펩티드에 많은 개선을 진행하여 보다 안전성이 있고 더 많은 환자들이 적응할 수 있는 항암약물을 만들어낼 필요가 있다.
본 발명은 상기 분야에 존재하는 결함에 의해 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 신규 폴리펩티드 및 그 용도와 제조 방법을 제공한다. EB 바이러스에 의해 유도되는 종양의 치료를 위해 높은 살상력, 고특이성, 알레르기 반응이 낮은 약물을 제공한다.
항-EB 바이러스 항체 폴리펩티드 또는 항-EB 바이러스 항체의 모방항체 폴리펩티드와 이온 채널을 형성할 수 있는 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드로부터의 조작가능한 연결에 의해 형성되며, 상기 이온 채널을 형성할 수 있는 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드는 야생형 콜리신 E1, Ia, Ib, A, B, N 또는 그 수성 채널 구조 도메인의 펩티드쇄에 대한 G11A, H22G, A26G, V31L 및 H40D의 아미노산 잔기의 돌연변이화에 의해 수득되고, 상기 항-EB 바이러스 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열이 ATCC HB-168 하이브리도마에 의해 분비된 항체 폴리펩티드와 동일한 것인, EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 신규 폴리펩티드에 관한 것이다.
상기 모방항체 폴리펩티드는 상기 항-EB 바이러스 항체의 중쇄의 CDR1 영역, 중쇄의 CDR1-CDR2의 연결 펩티드 세그먼트 및 경쇄의 CDR3이 연결된 펩티드이다.
상기 이온 채널을 형성할 수 있는 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드는 야생형 콜리신 Ia의 돌연변이화에 의해 수득된다.
상기 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 신규 폴리펩티드는 서열번호 29에 나타낸 아미노산 서열을 갖는다.
EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 신규 폴리펩티드를 코딩한 유전자이다. 상기 유전자는 서열번호 30에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
상기 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드이다.
상기 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 신규 폴리펩티드의 제조방법에 있어서, 상기 재조합 플라스미드를 발현시스템으로 형질변환시켜 발현시키는 단계 및 발현된 폴리펩티드를 단리 정제시키는 단계를 포함한다.
상기 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 신규 폴리펩티드를 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양의 치료 및 예방을 위한 약제 제조에 응용하는 것이 바람직하다.
콜리신 Ia의 알로스테릭 폴리펩티드의 아미노산 서열은 서열번호 24에 나타난다.
콜리신 Ia의 알로스테릭 폴리펩티드를 코딩하는 유전자이다.
상기 유전자의 폴리펩티드 약물 제조 응용에 있어서, 상기 유전자를 폴리펩티드를 유도하는 유전자와 조작가능하게 연결하고 발현 벡터로 클로닝하는 단계, 이어서 발현 벡터를 발현시스템으로 형질전환시키는 단계 및 발현된 폴리펩티드를 단리 정제시키는 단계를 포함한다.
본 발명이 제공한 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 신규 폴리펩티드는, 항-EB 바이러스의 항체 폴리펩티드 또는 항-EB 바이러스 항체의 모방항체 폴리펩티드와 이온 채널을 형성할 수 있는 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드로 구성된다. 야생형 콜리신 폴리펩티드 분자 중에 쉽게 과민반응을 일으킬 수 있는 아미노산잔기가 존재하기 때문에, 본 발명은 이온 채널 구조를 형성할 수 있는 콜리신 폴리펩티드 분자에서 소수성 세그먼트 부분의 쉽게 유기체의 과민반응을 일으킬 수 있는 아미노산잔기를 선택적으로 돌연변이화시켜, 본 발명의 바람직한 실시예와 같이 콜리신 Ia의 폴리펩티드 돌연변이 위치는 G11A, H22G, A26G, V31L 및 H40D이고, 실험 데이터에 의하면 콜리신 Ia 폴리펩티드 및 알로스테릭 Ia 폴리펩티드를 사용하여 각각 면역처리된 생쥐(mouse)에게 주입한 후, 알로스테릭 Ia 폴리펩티드를 주입한 생쥐는 콜리신 Ia 폴리펩티드를 주입한 생쥐보다 혈청 역가(titer)의 생산이 1-2 자릿수가 낮으므로, 면역 반응 수준이 비교적 낮다는 것을 밝히고 알로스테릭 폴리펩티드가 유기체의 과민반응을 저하시킨다는 것을 증명하고; 아울러 알로스테릭 폴리펩티드는 세포막에 막관통 이온 채널을 형성하는 기능을 여전히 보유하고, 실험에 의하면 본 발명의 재조합 폴리펩티드가 종양세포의 살상력에 영향이 미치지 않으므로 돌연변이화된 아미노산 잔기는 콜리신의 이온 채널을 형성하는 기능에 영향을 주지 않는다는 것을 증명한다. 본 발명이 제공하는 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 신규 폴리펩티드 중, 항-EB 바이러스의 항체 폴리펩티드 또는 항-EB 바이러스 항체의 모방항체 폴리펩티드는 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양세포 표면 특이적 항원인식을 통해 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드를 타겟 세포막에 인도하고, 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드의 막관통 이온 채널 구조 도메인 소수성 세그먼트를 종양 세포막에 삽입하고, 따라서 이온 채널이 형성되고 타겟 종양세포는 내용물 유출로 살상되며; 항-EB 바이러스 항체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 ATCC HB-168 하이브리도마에 의해 분비된 모노클론 항체의 폴리텝티드의 아미노산 서열을 참조하였다.
본 발명의 실시예에서, 바람직하게 상기 항-EB 바이러스 항체의 모방항체 폴리펩티드를 사용하여 조작가능하게 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드의 카르복시기 말단에 연결하여 분자량이 작은 본 발명의 항종양 폴리펩티드를 수득하고, 이러한 작은 분자의 모방 폴리펩티드는 오직 상기 항-EB 바이러스 항체 폴리펩티드의 VHCDR1 영역, VLCDR3 영역만을 포함하며，VHCDR1-VHCDR2 연결 펩티드와 경쇄 VLCDR3 영역이 연결된 펩티드 VHCDR1-VHFR2-VLCDR3은 서열번호 25에 나타낸 것과 같은 아미노산 서열의 항종양 신규 폴리펩티드 1의 모방항체를 얻으며, 모방항체는 30개 이하의 아미노산 밖에 포함하지 않으며 분자량은 천연항체 150개의 아미노산보다 훨씬 적고, 따라서 항원 식별능력 요구에 달성되었으며 또한 항종양 폴리펩티드 분자량이 대폭 감소되어 본 발명의 항종양 폴리펩티드의 조직에서의 관통 능력을 개선하는데 있어서 유리하다.
본 발명의 또 하나의 목적은 본 발명의 상기 항종양 폴리펩티드를 코딩한 유전자 서열을 제공하는 것이다. 본 발명의 항종양 폴리펩티드 유전자는, 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드 유전자를 코딩하고 항-EB 바이러스의 항체 폴리펩티드 유전자 또는 그 모방항체 폴리펩티드 유전자를 코딩하여 조작가능하게 연결하여 형성되며, 그 중 콜리신 폴리펩티드 및 항-EB 바이러스 항체의 유전자 서열은 이미 알고 있는 바이며 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드의 유전자는 콜리신 폴리펩티드 유전자의 대응하는 코돈에 점돌연변이를 일으켜 얻은 것으로써 다음과 같다: G11A, H22G, A26G, V31L 및 H40D. 코돈의 합병성에 의해 이 분야의 기술자는 아미노산 서열을 변경하지 않은 전제하에 본 발명의 상기 항종양 폴리펩티드의 뉴클레오티드 서열 코딩에 대하여 조정할 수 있다.
본 발명의 상기 재조합 플라스미드는, 야생형 콜리신 유전자를 로딩(loading)한 원시 벡터를 이중가닥 뉴클레오티드 점돌연변이화시키고, 타겟 변이 위치에 돌연변이화된 코돈을 삽입하여 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드의 유전자를 함유한 돌연변이 벡터를 획득한 것을 지칭한다. 동일한 점돌연변이 기술로 항-EB 바이러스 항체의 모방항체를 코딩하는 유전자를 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드 유전자의 카르복시 말단에 삽입하여 본 발명의 재조합 플라스미드를 얻는다. 콜리신 Ia 및 면역 단백질의 유전자를 로딩하는 원시 벡터 pSELECTTM-1은 프로메가(Promega)사에서 구입하고, 점돌연변이의 공정은 스트레이트젠(Strategene)사의 키트 설명서에 따른다. 본 발명은 점돌연변이에 의하여 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드를 제조하는 것에 관한 것으로, 그 중 5개의 코돈이 점돌연변이화되고, 이에 5쌍의 프라이머 서열 (서열번호 1-10)이 설계되었고; 본 발명의 실시예에서, 모방항체 유전자에 대하여 6쌍의 프라이머 서열 (서열번호 11-22)이 설계되었다.
본 발명은 또한 본 발명에 기재된 항종양 폴리펩티드의 제조방법을 제공하며, 이는 상기에서 수득한 플라스미드를 대장균 BL21 (DE3) 생산균에 감염시켜 양성 클론을 선별해내고 양성 클론이 발현된 단백질을 분리하여 본 발명의 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 신규 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
본 발명이 제공하는 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 신규 폴리펩티드는 EB 바이러스에 의해 유도되는 종양의 치료 또는 예방을 위한 약물의 제조에 응용될 수 있다. 아울러 본 발명에서 수득한 신규 항생제의 폴리펩티드를 약학적으로 허용되는 캐리어, 부형제 또는 선택가능한 기타 성분에 첨가함으로써 임상학적으로 적합한 약학 조성물을 제조할 수 있다.
본 발명은 또한 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드의 아미노산 서열 및 유전자 서열을 제공하며, 상기 알로스테릭 폴리펩티드는 본 발명에 사용될 뿐만 아니라 기타 타겟팅 폴리펩티드와 항체 폴리펩티드를 구성하는데 사용될 수 있고, 본 발명 실시예 3의 실험 테이터는 한편으로 상기 알로스테릭 폴리펩티드를 함유한 폴리펩티드 약물이 낮은 항원성을 구비함을 증명하는 동시에 상기 알로스테릭 폴리펩티드와 기타 타겟팅 폴리펩티드로 구성된 항체 폴리펩티드가 살균능력을 구비하였음을 증명하며, 그 제조 방법은 이 분야에서의 통상적인 실험방법으로도 수행할 수 있다.
본 발명이 제공한 항종양 신규 폴리펩티드는 특허번호 ZL200410081446.8의 특허에 개시된 항종양 폴리펩티드의 장점, 즉 높은 특이적 타겟팅, 정상 세포의 안전성, 및 약제 내성이 쉽게 나타나지 않는 등의 장점을 구비하고, 아울러 본 발명의 항종양 폴리펩티드는 콜리신 폴리펩티드 중 쉽게 과민반응을 보이는 아미노산 잔기에 대해 돌연변이화시키는 것을 통해 상기 알로스테릭 폴리펩티드를 함유한 항종양 폴리펩티드의 면역원성을 감소, 즉 과민반응이 나타나는 가능성을 감소시킬 수 있고, 상기 종류의 폴리펩티드의 약물 사용 안전성 및 종양을 소멸시키는 기존의 효과를 개선하고, 기타 콜리신 폴리펩티드를 함유한 약물의 개선을 위한 참조를 제공한다.
도 1은 모방항체 폴리펩티드 VHCDR1-VHFR2-VLCDR3의 유전자 및 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pCHCEB11 구조의 개략도이다.
도 2는 모방항체 폴리펩티드 VHCDR1-VHFR2-(Rev) VLCDR3의 유전자 및 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pCHCEB22 구조의 개략도이다.
도 3은 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드의 과민반응을 보여주는 효과실험 1이다.
(A) 쿤밍 쥐 (Kunming mice)에 치사량의 메티실린 내성 황색포도상구균 (ATCCBAA 42)을 복강주사한다. 임의의 군으로 나누면 다음과 같다: (1) 대조군, (2) 암피실린군, (3) 항황색포도상구균 폴리펩티드 (ZL 01128836.1) 군, (4) 항황색포도상구균 폴리펩티드 1군.
(B) 14일 후 다시 한 무리의 쿤밍 쥐를 대조군 및 암피실린군으로 나누고, 항황색포도상구균 폴리펩티드군 및 항황색포도상구균 폴리펩티드 1군에서 생존한 쥐를 항황색포도상구균 폴리펩티드군 및 항황색포도상구균 폴리펩티드 1군으로 하여 상기 실험을 중복한다.
(C) 41일 후 다시 한 무리의 쿤밍 쥐를 (1) 대조군, (2) 레보플록사신 (Levofloxacin)군, 및 (3) 세프트리아손 나트륨 (Ceftriaxone sodium)군으로 하고, (4) 항황색포도상구균 폴리펩티드군 및 (5) 항황색포도상구균 폴리펩티드 1군에서 생존한 쥐를 항녹농균 폴리펩티드 2군 및 항녹농균 폴리펩티드 1군으로 한다.
도 4는 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드의 낮은 과민반응을 보여주는 효과실험 2이다.
(A) 항황색포도상구균 폴리펩티드/항녹농균 폴리펩티드 2군의 혈청은 1:50,000 역가이고,
(B) 항황색포도상구균 폴리펩티드 1군/항녹농균 폴리펩티드 1군의 혈청은 1:50,000 역가이다.
(1) 제1주, (2) 제2주, 및 (3) 제7주의 혈청이고, (4) 음성대조이다.
도 5는 항종양 신규 폴리펩티드의 EB 바이러스에 의해 유도되는 악성림프육종 (버킷림프종(Burkitt's lymphoma))에 대한 체외 살상 효과 비교도이다.
(A) 대조군, (B) 항종양 신규 폴리펩티드 1로 처리된 군, 및 (C) 항종양 신규 폴리펩티드 2로 처리된 군.
도 6은 항종양 신규 폴리펩티드의 EB 바이러스에 의해 유도되는 버킷 악성림프육종 세포 및 기타 종양세포에 대한 체외 살상 작용이다.
(A) EB 바이러스 양성의 버킷 악성림프육종 세포
(B) EB 바이러스 음성의 버킷 악성림프육종 세포
(C) EB 바이러스 양성의 에이즈（AIDS）환자로부터의 악성림프육종 세포.
(1）대조군, 및 (2) 항종양 신규 폴리펩티드 1로 처리된 군.
도 7은 항종양 신규 폴리펩티드의 EB 바이러스에 의해 유도되는 버킷 악성림프육종 세포를 누드 마우스(nude mouse) 체내에 이식하여 생장시킨 실체종양에 대한 살상 작용이다.
(A) 대조군.
(B) 항종양 신규 폴리펩티드 1로 처리된 군은 SCID 면역 결핍 쥐의 양 겨드랑이에 버킷 악성림프육종 세포를 모두 접종한다. 좌측의 화살표는 EB 바이러스 음성 림프육종이고 우측의 화살표는 EB 바이러스 양성 림프육종이다.
도 8은 항종양 신규 폴리펩티드의 EB 바이러스에 의해 유도되는 버킷 악성림프육종 세포를 누드 마우스 체내에 이식하여 생장시킨 실체종양에 대한 살상작용이다.
(A) 대조 쥐의 EB 바이러스 음성 림프육종의 절편, (B) 대조 쥐의 EB 바이러스 양성 림프육종의 절편, (C) 항종양 신규 폴리펩티드 1로 처리된 쥐의 EB 바이러스 음성 림프육종의 절편, 및 (D) 항종양 신규 폴리펩티드 1로 처리된 쥐의 EB 바이러스 양성 림프육종의 절편.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 최선의 실시예에 대한 서술을 통해 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명이 이용한 원시 플라스미드: pSELECTTM-1은 프로메가사에서 구입하였다.
생산균: 대장균 BL-21(DE3) 생산균은 노바젠(Novagen)사에서 구입하였다.
실시예 1. 돌연변이 콜리신 Ia를 코딩한 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드의 구축.
원시 플라스미드는 콜리신 폴리펩티드 Ia 및 면역 단백질 유전자를 로딩한 pSELECTTM-1 플라스미드 (8.3 kb)(프로메가사에서 구입)이고, 이중가닥 올리고뉴클레오티드 점돌연변이 기술 (퀵체인지(QuickChange)TM 키트，스트레이트젠사)에 의해, 돌연변이화된 아미노산을 코딩한 유전자, 예컨대 서열번호１-10에 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머 서열과 야생형 콜리신 Ia 유전자를 조작가능하게 연결하고, 서열번호 23에 나타낸 것과 같은 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드를 코딩한 유전자를 수득하며 아울러 돌연변이 플라스미드도 얻고; 또 모방항체를 코딩한 유전자 서열번호 26 또는 서열번호 28을 돌연변이 플라스미드 속의 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드의 유전자 I626 위치의 코돈에 삽입한 후, EB 바이러스에 의해 유도되는 종양에 대한 신규의 폴리펩티드의 두 가지 재조합 플라스미드 pCHCEB11 (도 1에 나타냄)및 pCHCEB22 (도 2에 나타냄)를 제조하고, 재조합 플라스미드 중의 코딩한 항-EB 바이러스 항체의 모방항체의 유전자를 제조하기 위해 설계한 6 조의 올리고뉴클레오티드의 프라이머 서열은 서열번호 11-22에 나타낸 것과 같다. 재조합 플라스미드를 대장균 BL21(DE3) 생산균 (노바젠사에서 구매)에 전염시켜 폴리펩티드를 제조하여, 서열표에 나타낸 것과 같이 서열번호 29 (이하, "항종양 신규 폴리펩티드 1"이라 한다）및 서열번호 31 (이하, "항종양 신규 폴리펩티드 2"라 한다)을 수득한다.
이중가닥 올리고뉴클레오티드 점돌연변이화 절차는 스트레이트젠 퀵체인지 점돌연변이 키트 (카탈로그 제200518호) 키트에 따라 진행한다.
1. 점돌연변이 반응물 준비:
5 ul 10X 완충액
2 ul (10 ng) 야생형 콜리신 알로스테릭 폴리펩티드와 면역성 단백질 유전자를 로딩한 원시 플라스미드 pSELECTTM-1.
1.25 ul (125 ng)로 설계된 5'-3' 올리고뉴클레오티드 프라이머
1.25 ul (125 ng)로 설계된 3'-5' 올리고뉴클레오티드 프라이머
1 ul dNTP
2차 증류수 (double distilled water) 50 ul
1 ul pfu
(플라스미드, 프라이머 및 2차 증류수를 제외한 모든 시약은 키트에 준비된 시약이다).
2. PCR 증폭 진행
증폭조건: 변성 95 ℃, 35초, 어닐링 53 ℃, 70초, 연장 68 ℃, 17분, 총 20회 순환;
3. 엔도뉴클레아제 Dpn 11 ul를 첨가하여 모체 DNA쇄를 소화시켜 (37 ℃, 1시간)，1 ul 반응물과 XL1-Blue 감응세포 (competent cell) 50 ul를 취하여 30분 동안 얼음에서 인큐베이션하고, 45초 동안 42 ℃에서 열충격시킨 후, 다시 2분 동안 얼음에 방치한다.
4. NZY 배양 배지 0.5 ml를 첨가하고, 220 rpm, 37 ℃에서 1시간 동안 교반하고, 평판화된 반응물 50-100 ul를 취한다 (LB 배지에 1％ 한천 및 50 ug/ml 암피실린을 더함，37 ℃에서 밤새 진행).
5. 18시간 후 세균을 선별하여 플라스미드를 추출한 후 서열을 측정하여 돌연변이화가 성공하였는지 확인한다.
6. 여러 점돌연변이를 완성하여 최종 수득한 재조합 플라스미드 50 ng 및 제조된 대장균 BL-21(DE3) 생산균 감응세포 40 ul를 5분 동안 얼음에서 인큐베이션하고，30초 동안 42 ℃에서 열충격시킨 후，다시 2분 동안 얼음에 방치하여 노바젠사의 SOC 배양액 160 ul을 첨가하고, 1시간 동안 220 rpm, 37 ℃에서 교반하여 평판화하고 (LB 배지에 1％ 한천, 및 50 ug/ml 암피실린을 더함) 37 ℃에서 밤새 진행한다.
7. 4-5 시간 동안 30 ℃, 8-16 리터 배지에서, 모노클론 군체를 증폭시키기 위해 선별하고, 30분 동안 250 rpm, 42 ℃에서, 2시간 동안 250 rpm, 37 ℃에서 열충격시키고; 20분 동안 4 ℃, 6000g에서 균체를 원심침전시킨다. 4 ℃, 50mM 보레이트 완충액 (2mM EDTA + 2mM DTT) 및 50-80ml 균체 서스펜션을 취하여 0.2M PMSF 250 밀리리터를 첨가한 후, 초음파분쇄처리 (4 ℃, 400W, 2분)를 진행하고, 분쇄된 균체 (4 ℃，75,000g，90분)를 고속 원심침전시킨 후 상청을 취하여 스트레토마이신 술페이트 500만 단위에 첨가하여 DNA를 침전시키고, 10분 동안 15000g, 4 ℃에서 원심침전시킨 후，상기 상청을 분자량 15,000의 투석주머니에 넣어 4 ℃, 50 mM 보레이트 완충액 4 리터에서 밤새 투석하고, 다시 10분 동안 15000g, 4 ℃에서 원심침전하여, 상청 시료를 취하여 CM 이온교환칼럼에 넣고, 0.1-0.3 M NaCl + 50 mM 보레이트 완충액 구배로 용리하여 재조합 항종양 폴리펩티드를 얻을 수 있다.
점돌연변이하도록 설계된 프라이머 서열은 하기와 같다:
서열번호 1 콜리신 유전자 중 G11A를 돌연변이하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-3'
cgt att aca aat ccc GCA gca gaa tcg ctg ggg
서열번호 2 콜리신 유전자 중 G11A를 돌연변이하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 3'-5'
ccc cag cga ttc tgc TGC ggg att tgt aat acg
서열번호 3 콜리신 유전자 중 H22G를 돌연변이하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-3'
gat tca gat ggc GGT aaa tta tgg gtg
서열번호 4 콜리신 유전자 중 H22G를 돌연변이하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 3'-5'
cac cca taa ttt ACC gcc atc tga atc
서열번호 5 콜리신 유전자 중 A26G를 돌연변이하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-3'
gaaa ttatgGGTgt tgatatttat
서열번호 6 콜리신 유전자 중 A26G를 돌연변이하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 3'-5'
ataaatatacaacACCcataatttc
서열번호 7 콜리신 유전자 중 V31L를 돌연변이하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-3'
gt tgatatttat CTC aaccctc cacgtgtc
서열번호 8 콜리신 유전자 중 V31L를 돌연변이하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 3'-5'
gacacgtggagggttGAGataaatatcaac
서열번호 9 콜리신 유전자 중 H40D를 돌연변이하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 5'-3'
cgtgtcga tgtctttGATggtaccccgc ctgcat
서열번호 10 콜리신 유전자 중 H40D를 돌연변이하도록 설계된 올리고뉴클레오티드 프라이머 3'-5'
atgcaggcggggtaccATCaaagacatcgacacg
서열번호 11 재조합 플라스미드 pCHCEB11 중 VHCDR1유전자 프라이머 3'-5'
gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGTCAGtaa ata aaa tat aag aca ggc
서열번호 12 재조합 플라스미드 pCHCEB11 중 VHCDR1 유전자 프라이머 3'-5'
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt att cgc
서열번호 13 재조합 플라스미드 pCHCEB11 중 VHFR2 유전자 프라이머 5'-3'
ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ata aaa tat aag aca ggc
서열번호 14 재조합 플라스미드 pCHCEB11 중 VHFR2 유전자 프라이머 3'-5'
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg cac cca atg cat acc
서열번호 15 재조합 플라스미드 pCHCEB11 중 (Rev) VlCDR3 유전자 프라이머 5'-3'
aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc ACC TAC CCC TAC TCC TAC GGT CAG GGT taa ata aaa tat aag aca ggc
서열번호 16 재조합 플라스미드 pCHCEB11 중 (Rev) VLCDR3 유전자 프라이머 3'-5'
gcc tgt ctt ata ttt tat tta ACC CTG ACC GTA GGA GTA GGG GGT ggc cac cca ctc cag acc ttt
서열번호 17 재조합 플라스미드 pCHCEB22 중 VHCDR1 유전자 프라이머 5'-3'
gcg aat aag ttc tgg ggt att TCC TTC GGT ATG CAT TGG GTG CGT CAG taa ata aaa tat aag aca ggc
서열번호 18 재조합 플라스미드 pCHCEB22 중 VHCDR1 유전자 프라이머 3'-5'
gcc tgt ctt ata ttt tat tta CTG ACG CAC CCA ATG CAT ACC GAA GGA aat acc cca gaa ctt att cgc
서열번호 19 재조합 플라스미드 pCHCEB22 중 VHFR2 유전자 프라이머 5'-3'
ggt atg cat tgg gtg cgt cag GCC CCC GAG AAA GGT CTG GAG TGG GTG GCC taa ataaaa tat aag aca ggc
서열번호 20 재조합 플라스미드 pCHCEB22 중 VHFR2 유전자 프라이머 3'-5'
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGC CAC CCA CTC CAG ACCT TTT CTC GGG GGC ctg acg cac cca atg cat acc
서열번호 21 재조합 플라스미드 pCHCEB22 중 VLCDR3 유전자 프라이머 5'-3'
aaa ggt ctg gag tgg gtg gcc GGT CAG GGT TAC TCC TAC CCC TAC ACC taa ata aaa tat aag aca ggc
서열번호 22 재조합 플라스미드 pCHCEB22 중 VLCDR3 유전자 프라이머 3'-5'
gcc tgt ctt ata ttt tat tta GGT GTA GGG GTA GGA GTA ACC CTG ACC ggc cac cca ctc cag acc ttt
실시예 2. 재조합 플라스미드 pCHCEB11, pCHCEB22에 의해 제조된 항종양 신규 폴리펩티드 면역효과의 관찰.
실시예 1에서 수득한 재조합 플라스미드 pCHCEB11, 및 pCHCEB22로부터 제조하여 얻은 항종양 신규 폴리펩티드 1, 항종양 신규 폴리펩티드 2, 발명자 소유의 이전 발명 (ZL200410081446.8) 중의 항종양 폴리펩티드 1 및 항종양 폴리펩티드 2를 각각 취하여 생쥐를 면역처리한다. 상기 각 단백질과 애주번트(Adjuvant)를 혼합한 후, 기초량 및 추가량은 한 마리당 50 μg (0.5 ml) 1회의 복강주사이며, 2주 간격으로 5회의 면역주사를 진행한다. ELISA 간접방법으로 생쥐 혈청 역가를 측정하고, 본 발명이 제조한 항종양 신규 폴리펩티드 1 및 2의 면역처리된 생쥐 혈청 역가는 10-3 내지 10-4이고 항종양 폴리펩티드 1 및 항종양 폴리펩티드 2의 면역처리된 생쥐 혈청 역가는 10-4 내지 10-5이다.
이로부터 본 발명의 항종양 신규 폴리펩티드가 숙주 과민반응을 초래할 가능성은 야생형 콜리신 Ia를 함유한 항종양 폴리펩티드가 숙주 과민반응을 초래할 가능성보다 1 내지 2 자릿수 더 낮다.
실시예 3. 항종양 신규 폴리펩티드를 구성하는 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드의 낮은 과민효과 실험.
실시예 1 중 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드 (수성 채널 구조 도메인의 펩티드쇄 중 아미노산 잔기 G11A, H22G, A26G, V31L 및 H40D를 돌연변이화함)의 돌연변이화된 플라스미드를 취하여, 그 아미노기 말단 또는 카르복시기 말단에 황색포도상구균 페로몬 AgrD1 (YSTCDFIM)을 조작가능하게 연결하여 두 개의 항균 폴리펩티드를 제조한다. AgrD1를 알로스테릭 콜리신 Ia 카르복시기 말단에 연결하여 제조한 폴리펩티드를 항황색포도상구균 폴리펩티드 1이라 명하고, AgrD1를 알로스테릭 콜리신 Ia 아미노기 말단에 연결하여 제조한 폴리펩티드를 항녹농균 폴리펩티드 1이라 명한다. 야생형 콜리신 Ia의 플라스미드를 취하여 그 중의 아미노기 말단에 황색포도상구균 페로몬 AgrD1을 연결하여 항녹농균 폴리펩티드 2를 제조한다.
실험 1: 쿤밍 쥐 한 무리에 치사량의 메티실린 내성 황색포도상구균 (ATCC BAA42) 복강주사하고, 임의로 군을 나눠 (1) 대조군, (2) 암피실린군, (3) 항황색포도상구균 폴리펩티드군, 및 (4) 항황색포도상구균 폴리펩티드 1군으로 하였다. 각 군의 생쥐는 각 10마리씩 균일하게 한다.
처리방법:
치사량의 메티실린 내성 황색포도상구균（ATCC BAA42）을 복강에 주입한 1시간 후, 대조군: 0.5 밀리리터 0.3 M NaCl + 50 mM 보레이트 완충액을 1회 꼬리 정맥에 주입;
암피실린군: 2.5 mg/kg 암피실린을 1회 꼬리 정맥에 주입;
항황색포도상구균 폴리펩티드군: 발명자 소유 (ZL 01128836.1)의 항황색포도상구균 폴리펩티드 6 mg/kg를 1회 꼬리 정맥에 주입;
항황색포도상구균 폴리펩티드 1군: 항황색포도상구균 폴리펩티드 1의 6 mg/kg를 1회 꼬리 정맥에 주입하였다.
결과: 대조군 및 암피실린군의 쥐는 2일 내에 전부 사망하였고 항황색포도상구균 폴리펩티드군 및 항황색포도상구균 폴리펩티드 1군의 쥐 중 85％가 생존하였다.
실험 2: 실험 1의 14일 후, 쿤밍 쥐 한 무리를 대조군 및 암피실린군으로 나누고, 항황색포도상구균 폴리펩티드군 및 항황색포도상구균 폴리펩티드 1군에서 생존한 쥐를 항황색포도상구균 폴리펩티드군 및 항황색포도상구균 폴리펩티드 1군으로 나누어 상기 실험을 반복하였다. 대조군과 암피실린군의 쥐는 2일 내에 전부 사망하였다. 항황색포도상구균 폴리펩티드군은 쥐의 75％가 생존하였고 항황색포도상구균 폴리펩티드 1군은 쥐의 90％가 생존하였다.
실험 3: 실험 1의 41일 후, 또 쿤밍 쥐 한 무리를 대조군, 레보플록사신군 및 세프트리아손 나트륨군으로 나누고, 항황색포도상구균 폴리펩티드군 및 항황색포도상구균 폴리펩티드 1군의 생존한 쥐를 항녹농균 폴리펩티드 2군 및 항녹농균 폴리펩티드 1군으로 나누었다.
치사량의 다중약물 내성 농녹균 (사천대학 화서병원 실험 의학계 임상분리주 13578)을 생쥐의 복강에 주입하고 1시간 후,
대조군: 0.3 M NaCl + 50 Mm 보레이트 완충액 0.5 밀리리터를 1회 꼬리 정맥에 주입;
레보플록사신군: 레보플록사신 5 mg/kg를 1회 꼬리 정맥에 주입;
세프트리아손 나트륨군: 세프트리아손 나트륨 30 mg/kg를 1회 꼬리 정맥에 주입;
항녹농균 폴리펩티드 2군: 녹농균 폴리펩티드 28 mg/kg를 1회 꼬리 정맥에 주입;
항녹농균 폴리펩티드 1군: 항녹농균 폴리펩티드 18 mg/kg를 1회 꼬리 정맥에 주입하였다. 대조군 및 레보플록사신군의 쥐는 1일 내에 전부 사망하였다. 세프트리아손 나트륨군은 쥐의 25％가 생존하였다. 항녹농균 폴리펩티드 2군은 쥐의 60％가 생존하였다. 항녹농균 폴리펩티드 1군의 쥐는 모두 생존하여 알로스테릭 폴리펩티드의 살상 효용에 대한 숙주 항체의 간섭은 야생형 폴리텝티드의 살상 효용에 대한 것보다 더 낮다.
첨부된 도 3을 참조한다.
실험 제1주, 제2주 및 제7주에, 각각 상기 항황색포도상구균 폴리펩티드/항녹농균 폴리펩티드 2군 및 항황색포도상구균 폴리펩티드 1/항녹농균 폴리펩티드 1군에서 생존한 쥐의 혈청을 ELISA의 간접방법으로 분석하여 혈액 내 항체를 검출하였다. 그리고 효소 라벨 플레이트의 웰(well)에 야생형 콜리신 Ia 및 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드를 100 ng/웰로 각각 코팅하고, 제1항체는 각각 항황색포도상구균 폴리펩티드/항녹농균 폴리펩티드 2군 및 항황색포도상구균 폴리펩티드 1/항녹농균 폴리펩티드 1군에서 생존한 쥐의 혈청이고, 제2항체는 염소 항 생쥐 표식항체로, 음성대조의 제1항체는 5％ 우유-PBS이다. 1:50,000 역가로 얻는 결과는 하기와 같다 (첨부된 도 4 참조):
Figure 112012056805955-pct00001
이로부터 본 발명에서 제조한 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드가 숙주 과민반응을 초래할 가능성은 야생형 콜리신 Ia가 숙주 과민반응을 초래하는 가능성보다 낮다.
실시예 4. 항종양 신규 폴리펩티드의 EB 바이러스에 인한 악성림프육종 (버킷림프종)에 대한 체외 살상력의 효과.
EB 바이러스 양성 및 음성 세포 균주: 미국 ATCC 표준 세포 균주이다.
세포배양: 소생된 Raji 세포 서스펜션 0.1 ml를 3 ml 1640 액체 배지 (10％ 혈청 첨가함)가 포함된 배양 접시에 천천히 첨가하고 (희석율, 1:30) 균일하게 혼합하여, 37℃의 CO2 인큐베이터에 넣어 배양하였다. 실험에 사용하는 한 균주인 EB 바이러스 양성 세포 균주는: ATCC CCL-86 (전세계 세포 배양실에 사용하는 표준 버킷 악성림프육종 세포 및 Raji 세포는 1963년에 12세 아프리카 남성 어린이의 몸에서 분리한 것이다)이다.
실험 대상 세포는 모두 3군이고, 제1군은 항종양 폴리펩티드가 없는 보존액 (10mMPB + 0.2M NaCl 포스페이트 완충액 (pH 7.4))이 첨가된, 블랭크(blank) 군이다.
제2군은 200 μg/ml의 항종양 신규 폴리펩티드 1 (플라스미드가 pCHCEB11이고 보존액은 10mMPB + 0.2M NaCl 포스페이트 완충액 (pH 7.4)이다)이 첨가된다.
제3군은 200 μg/ml의 항종양 폴리펩티드 2 (플라스미드가 pCHCEB22이고 보존액은 10mMPB + 0.2M NaCl 포스페이트 완충액 (pH 7.4)이다)가 첨가된다.
세포를 24시간 배양한 후, 상기 각 군의 처리 시약을 배양 접시에 각각 담고 또 처리 시약 첨가로부터 72시간 후, 100 uMol 요드화프로피디움（Propidium Iodide, PI）20 ul을 첨가하고, 10분 후 형광 현미경에 놓고 관찰하였다. 결과는 블랭크군 세포의 생장이 양호함을 보여주고, 항종양 신규 폴리펩티드 1군에서만 대부분 세포는 PI에 의해 붉은색으로 염색되었고, 이러한 세포막은 이미 항종양 폴리펩티드에 의해 살상되고 종양 세포의 죽음을 초래함을 보여준다. 세포 사망수 비교시, 두 종류의 항종양 신규 폴리펩티드 중 항종양 신규 폴리펩티드 2의 효과가 비교적 낮았다. 첨부된 도 5를 참조한다.
실시예 5. 항종양 신규 폴리펩티드의 EB 바이러스로 인한 버킷 악성림프육종 세포 및 기타 종양 세포에 대한 체외 살상 작용의 다종 형광 염색 관찰.
세포 배양조건은 실시예 2와 동일하다. 실험에 하기와 같은 3개의 세포 균주를 사용하였다: EB 바이러스 양성 세포 균주: ATCC CCL-86 (Raji 세포, 버킷 악성 림프육종 세포); ATCC CRL-2230 (에이즈에 감염된 46세 남성으로부터 분리한 악성림프육종 세포균주임, EB 바이러스 및 카포시(Kaposi) 육종 바이러스 (HHV8)는 모두 양성임); 및 EB 바이러스 음성 세포주: ATCC CRL-1648 (CA-46, 미국형 버킷 악성 림프육종 환자의 복수로부터 분리한 세포).
각 균주의 세포를 2개의 실험군으로 나누었다. 제1군은 항종양 신규 폴리펩티드 블랭크 보존액 (10mMPB + 0.2M NaCl 포스페이트 완충액 (pH 7.4))을 첨가한 것이고, 제2군은 200μg/ml 항종양 신규 폴리펩티드 1 (플라스미드 pCHCEB11)을 첨가한 것이며, 상기 보존액은 10mMPB + 0.2M NaCl 포스페이트 완충액 (pH 7.4)이다.
세포를 24시간 배양한 후, 상기 각 군의 처리 시약을 배양접시에 각각 담고 처리 시약 첨가로부터 72시간 후, 두 종류의 형광 연료: 50 uMol FITC 20ul 및 50 uMol 로다민(Rodamin)-123 20ul를 각각 첨가한다. 10분 후 올림푸스(Olympus) IX-71 형광 현미경에 놓고 관찰하였다.
결과는 EB 바이러스 음성 종양 세포의 균주는 항종양 신규 폴리펩티드 1로 처리된 후에도 잘 생장하지만, EB 바이러스 양성 종양 세포의 균주는 항종양 신규 폴리펩티드 1로 처리된 후에 대다수 세포가 미토콘드리아 및 세포핵구조를 감추는 현상이 나타나고 현저하게 팽창하거나 괴사하여 세포가 거의 전부 사망하였음을 보여준다. 보이는 것처럼, 다중 형광 염색 결과는 실시예 4의 요드화프로피디움 (Propidium Iodide) 염색의 결과에 비하여, 더 명확하게 EB 바이러스 양성 종양세포에 대한 항종양 신규 폴리펩티드 1의 강력한 살상 작용을 보여준다. 첨부된 도 6을 참조한다.
EB 바이러스 음성 종양세포가 잘 성장하는 것은, 항종양 신규 폴리펩티드가 세포막에 EB 바이러스 표면항원이 없는 세포를 공격하지 않는다는 것을 의미한다. 이것은 본 발명의 항종양 신규 폴리펩티드의 이상적인 타겟 특이성과 안전성을 시사한다.
실시예 6. 항종양 신규 폴리펩티드의 EB 바이러스로 인한 버킷 악성림프육종 세포를 누드 마우스 체내에 이식하여 생장시킨 실체종양에 대한 살상작용.
SCID 면역 결핍의 생쥐는 중국과학원 상해 실험동물센터에서 구입하였고 쥐의 사육은 표준사육 요구사항을 따르며, 물, 풀 및 사료는 모두 고온 또는 자외선으로 살균하였다. 상대적으로 무균한 조건하에 1주 동안 사육하고 이상이 없으면 접종실험을 진행한다.
지수 생장기의 Raji (ATCC CCL-86) 및 1648 (ATCC CRL-1648) 세포 서스펜션 50 밀리리터를 원심분리 튜브에 수집하고 4 ℃에서 원심분리를 진행하고 상청을 버린 후, 1640 액체 배지 (송아지 혈청 첨가)를 사용하여 세포가 1.0×107 세포/ml로 되도록 재현탁시켰다. 쥐의 좌측 겨드랑이 피하에 Raji 세포 서스펜션 0.1 ml를 주입하고 쥐의 우측 겨드랑이 피하에 1648 세포 서스펜션 0.1 ml를 주입하였다.
세포를 주입한 3-4일 후, 종양은 약 2×2 mm로 성장하였다. 종양 보유 누드 마우스를 임의로 나누면 하기와 같다:
(A군) 항종양 폴리펩티드 블랭크 보존액 (10mM PBS + 0.2M NaCl 포스페이트 완충액 (pH 7.4))의 대조군;
(B군) 항종양 신규 폴리펩티드 1 (플라스미드가 pCHCEB11임) 치료군으로서, 연속하여 20일 동안 300μg/쥐 (25그램으로 계산)/일로 함.
각 군의 10마리의 종양 보유 쥐에게 연속하여 20일 동안, 매일 2회, 1회에 0.5 ml씩 약을 주는 방식으로 복강주사하였다. 매일 쥐의 활동상황을 관찰하고 기록하며 격일로 정밀하게 종양의 크기를 측정하고 촬영하였다.
결과 (도 7 참조)를 보면, B군인 항종양 신규 폴리펩티드군 쥐의 종양 성장은 분명하게 억제되었고 그 중 7마리 쥐의 종양 덩어리가 사라지고 남은 3마리 쥐의 종양 덩어리는 대조군의 것보다 선명히 작아졌다. 항종양 신규 폴리펩티드는 쥐 체내에서 효과적으로 EB 바이러스 양성 림프육종세포로 인한 실체 종양 덩어리의 생장을 억제하였다. 그러나, 동일한 쥐 체내에 접종한 EB 바이러스 음성 림프육종세포로 인한 실체 종양 덩어리에는 억제작용이 미치지 못하였다.
실시예 7. 체내 실체종양을 소멸하는 실험의 병리관찰.
종양의 병리조직학적 관찰: 실시예 6의 실험 종료 후, 생쥐를 죽이고 종양을 채취하여 10％ 포르말린에 고정하고, 파라핀 절편을 HE 염색하여 일반 현미경으로 관찰하였다.
현미경 관찰을 통하여, 대조군 쥐의 실체 종양의 증식이 활발하고, 항종양 신규 폴리펩티드군 쥐의 EB 바이러스 양성 실체 종양세포는 현저하게 감소되고, 표본 중의 축소된 종양세포단은 거의 괴사한 종양세포이며 주변에 대량의 림프 세포가 침입함을 볼 수 있었다. 병리조직학적 결과는 20일 처리기간 중 항종양 신규 폴리펩티드가 실체종양 중의 모든 종양세포를 거의 박멸하였음을 시사한다 (도 8D 참조).
SEQUENCE LISTING <110> Protein Design Lab, Ltd. <120> A novel polypeptide against tumor caused by EB virus and use and preparation method thereof. <130> PC09622/JJQ <160> 32 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer 5’-3’designed for mutation of G11A in gene of colicin <400> 1 cgtattacaa atcccgcagc agaatcgctg ggg 33 <210> 2 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer 3’-5’ designed for mutation of G11A in gene of colicin <400> 2 ccccagcgat tctgctgcgg gatttgtaat acg 33 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer 5’-3’ designed for mutation of H22G in gene of colicin <400> 3 gattcagatg gcggtaaatt atgggtg 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer 3’-5’ designed for mutation of H22G in gene of colicin <400> 4 cacccataat ttaccgccat ctgaatc 27 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer 5’-3’ designed for mutation of A26G in gene of colicin <400> 5 gaaattatgg gtgttgatat ttat 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer 3’-5’ designed for mutation of A26G in gene of colicin <400> 6 ataaatatac aacacccata atttc 25 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer 5’-3’ designed for mutation of V31L in gene of colicin <400> 7 gttgatattt atctcaaccc tccacgtgtc 30 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer 3’-5’ designed for mutation of V31L in gene of colicin <400> 8 gacacgtgga gggttgagat aaatatcaac 30 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer 5’-3’ designed for mutation of H40D in gene of colicin <400> 9 cgtgtcgatg tctttgatgg taccccgcct gcat 34 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide primer 3’-5’ designed for 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plasmid pCHCEB22 <400> 19 ggtatgcatt gggtgcgtca ggcccccgag aaaggtctgg agtgggtggc ctaaataaaa 60 tataagacag gc 72 <210> 20 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3’-5’ for gene of VHFR2 in recombination plasmid pCHCEB22 <400> 20 gcctgtctta tattttattt aggccaccca ctccagacct tttctcgggg gcctgacgca 60 cccaatgcat acc 73 <210> 21 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 5’-3’ for gene of VLCDR3 in recombination plasmid pCHCEB22 <400> 21 aaaggtctgg agtgggtggc cggtcagggt tactcctacc cctacaccta aataaaatat 60 aagacaggc 69 <210> 22 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3’-5’ for gene of VLCDR3 in recombination plasmid pCHCEB22 <400> 22 gcctgtctta tattttattt aggtgtaggg gtaggagtaa ccctgaccgg ccacccactc 60 cagaccttt 69 <210> 23 <211> 1878 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The gene encoding the mutant polypeptide of colicin Ia <400> 23 atgtctgacc ctgtacgtat tacaaatccc gcagcagaat cgctggggta tgattcagat 60 ggcggtgaaa 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Ala Glu Ser Leu Gly Tyr Asp Ser Asp Gly Gly Glu Ile Met Gly Val Asp Ile Tyr Leu Asn Pro Pro Arg Val Asp Val Phe Asp Gly Thr Pro Pro Ala Trp Ser Ser Phe Gly Asn Lys Thr Ile Trp Gly Gly Asn Glu Trp Val Asp Asp Ser Pro Thr Arg Ser Asp Ile Glu Lys Arg Asp Lys Glu Ile Thr Ala Tyr Lys Asn Thr Leu Ser Ala Gln Gln Lys Glu Asn Glu Asn Lys Arg Thr Glu Ala Gly Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Ala Ala Arg Glu Lys Asp Glu Asn Thr Leu Lys Thr Leu Arg Ala Gly Asn Ala Asp Ala Ala Asp Ile Thr Arg Gln Glu Phe Arg Leu Leu Gln Ala Glu Leu Arg Glu Tyr Gly Phe Arg Thr Glu Ile Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Arg Leu His Thr Glu Ser Arg Met Leu Phe Ala Asp Ala Asp Ser Leu Arg Ile Ser Pro Arg Glu Ala Arg Ser Leu Ile Glu Gln Ala Glu Lys Arg Gln Lys Asp Ala Gln Asn Ala Asp Lys Lys Ala Ala Asp Met Leu Ala Glu Tyr Glu Arg Arg Lys Gly Ile Leu Asp Thr Arg Leu Ser Glu Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ala Gln Gln Ala Arg Leu Leu Gly Gln Gln Thr Arg Asn Asp Arg Ala Ile Ser Glu Ala Arg Asn Lys Leu Ser Ser Val Thr 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cggaatccgg tggtgacaga ggatgtggaa 1080 ggtgacaaga aaatttataa tgctgaagtt gctgaatggg ataagttacg gcaaagattg 1140 cttgatgcca gaaataaaat cacctctgct gaatctgcgg taaattcggc gagaaataac 1200 ctcagtgcca gaacaaatga gcaaaagcat gcaaatgacg ctcttaatgc cctgttgaag 1260 gaaaaagaga atatacgtaa ccagctttcc ggcatcaatc agaagatagc ggaagagaaa 1320 agaaaacagg atgaactgaa ggcaacgaaa gacgcaatta atttcacaac agagttcctg 1380 aaatcagttt cagaaaaata tggtgcaaaa gctgagcagt tagccagaga gatggccggg 1440 caggctaaag ggaagaaaat acgtaatgtt gaagaggcat taaaaacgta tgaaaagtac 1500 cgggctgaca ttaacaaaaa aattaatgca aaagatcgtg cagcgattgc cgcagccctt 1560 gagtctgtga agctgtctga tatatcgtct aatctgaaca gattcagtcg gggactggga 1620 tatgcaggaa aatttacaag tcttgctgac tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg 1680 acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa acagaaacca tcatagcagg caatgccgca 1740 acggctcttg tggcactggt cttcagtatt cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg 1800 tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg 1860 aataagttct ggggtatttc cttcggtatg cattgggtgc gtcaggcccc cgagaaaggt 1920 ctggagtggg tggccggtca gggttactcc tacccctaca cc 1962 <210> 31 <211> 653 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> The amino acid sequence 2 of the novel polypeptide against tumor caused by EB virus <400> 31 Ser Asp Pro Val Arg Ile Thr Asn Pro Ala Ala Glu Ser Leu Gly Tyr Asp Ser Asp Gly Gly Glu Ile Met Gly Val Asp Ile Tyr Leu Asn Pro Pro Arg Val Asp Val Phe Asp Gly Thr Pro Pro Ala Trp Ser Ser Phe Gly Asn Lys Thr Ile Trp Gly Gly Asn Glu Trp Val Asp Asp Ser Pro Thr Arg Ser Asp Ile Glu Lys Arg Asp Lys Glu Ile Thr Ala Tyr Lys Asn Thr Leu Ser Ala Gln Gln Lys Glu Asn Glu Asn Lys Arg Thr Glu Ala Gly Lys Arg Leu Ser Ala Ala Ile Ala Ala Arg Glu Lys Asp Glu Asn Thr Leu Lys Thr Leu Arg Ala Gly Asn Ala Asp Ala Ala Asp Ile Thr Arg Gln Glu Phe Arg Leu Leu Gln Ala Glu Leu Arg Glu Tyr Gly Phe Arg Thr Glu Ile Ala Gly Tyr Asp Ala Leu Arg Leu His Thr Glu Ser Arg Met Leu Phe Ala Asp Ala Asp Ser Leu Arg Ile Ser Pro Arg Glu Ala Arg Ser Leu Ile Glu Gln Ala Glu Lys Arg Gln Lys Asp Ala Gln Asn Ala Asp Lys Lys Ala Ala Asp Met Leu Ala Glu Tyr Glu Arg Arg Lys Gly Ile Leu Asp Thr Arg Leu Ser Glu Leu Glu Lys Asn Gly Gly Ala Ala Leu Ala Val Leu Asp Ala Gln Gln Ala Arg Leu Leu Gly Gln Gln Thr Arg Asn Asp Arg Ala Ile Ser Glu Ala Arg Asn Lys Leu Ser Ser Val Thr Glu Ser Leu Asn Thr Ala Arg Asn Ala Leu Thr Arg Ala Glu Gln Gln Leu Thr Gln Gln Lys Asn Thr Pro Asp Gly Lys Thr Ile Val Ser Pro Glu Lys Phe Pro Gly Arg Ser Ser Thr Asn His Ser Ile Val Val Ser Gly Asp Pro Arg Phe Ala Gly Thr Ile Lys Ile Thr Thr Ser Ala Val Ile Asp Asn Arg Ala Asn Leu Asn Tyr Leu Leu Ser His Ser Gly Leu Asp Tyr Lys Arg Asn Ile Leu Asn Asp Arg Asn Pro Val Val Thr Glu Asp Val Glu Gly Asp Lys Lys Ile Tyr Asn Ala Glu Val Ala Glu Trp Asp Lys Leu Arg Gln Arg Leu Leu Asp Ala Arg Asn Lys Ile Thr Ser Ala Glu Ser Ala Val Asn Ser Ala Arg Asn Asn Leu Ser Ala Arg Thr Asn Glu Gln Lys His Ala Asn Asp Ala Leu Asn Ala Leu Leu Lys Glu Lys Glu Asn Ile Arg Asn Gln Leu Ser Gly Ile Asn Gln Lys Ile Ala Glu Glu Lys Arg Lys Gln Asp Glu Leu Lys Ala Thr Lys Asp Ala Ile Asn Phe Thr Thr Glu Phe Leu Lys Ser Val Ser Glu Lys Tyr Gly Ala Lys Ala Glu Gln Leu Ala Arg Glu Met Ala Gly Gln Ala Lys Gly Lys Lys Ile Arg Asn Val Glu Glu Ala Leu Lys Thr Tyr Glu Lys Tyr Arg Ala Asp Ile Asn Lys Lys Ile Asn Ala Lys Asp Arg Ala Ala Ile Ala Ala Ala Leu Glu Ser Val Lys Leu Ser Asp Ile Ser Ser Asn Leu Asn Arg Phe Ser Arg Gly Leu Gly Tyr Ala Gly Lys Phe Thr Ser Leu Ala Asp Trp Ile Thr Glu Phe Gly Lys Ala Val Arg Thr Glu Asn Trp Arg Pro Leu Phe Val Lys Thr Glu Thr Ile Ile Ala Gly Asn Ala Ala Thr Ala Leu Val Ala Leu Val Phe Ser Ile Leu Thr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ile Gly Tyr Gly Leu Leu Met Ala Val Thr Gly Ala Leu Ile Asp Glu Ser Leu Val Glu Lys Ala Asn Lys Phe Trp Gly Ile Ser Phe Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Thr Tyr Pro Tyr Ser Tyr Gly Gln Gly <210> 32 <211> 1962 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> The nucleotide sequence encoding the amino acid sequence 2 of the novel polypeptide against tumor caused by EB virus <400> 32 atgtctgacc ctgtacgtat tacaaatccc gcagcagaat cgctggggta tgattcagat 60 ggcggtgaaa ttatgggtgt tgatatttat ctcaaccctc cacgtgtcga tgtctttgat 120 ggtaccccgc ctgcatggag ttccttcggg aacaaaacca tctggggcgg aaacgagtgg 180 gttgatgatt ccccaacccg aagtgatatc gaaaaaaggg acaaggaaat cacagcgtac 240 aaaaacacgc tcagcgcgca gcagaaagag aatgagaata agcgtactga agccggaaaa 300 cgcctctctg cggcgattgc tgcaagggaa aaagatgaaa acacactgaa aacactccgt 360 gccggaaacg cagatgccgc tgatattaca cgacaggagt tcagactcct gcaggcagag 420 ctgagagaat acggattccg tactgaaatc gccggatatg acgccctccg gctgcataca 480 gagagccgga tgctgtttgc tgatgctgat tctcttcgta tatctccccg ggaggccagg 540 tcgttaatcg aacaggctga aaaacggcag aaggatgcgc agaacgcaga caagaaggcc 600 gctgatatgc ttgctgaata cgagcgcaga aaaggtattc tggacacccg gttgtcagag 660 ctggaaaaaa atggcggggc agcccttgcc gttcttgatg cacaacaggc ccgtctgctc 720 gggcagcaga cacggaatga cagggccatt tcagaggccc ggaataaact cagttcagtg 780 acggaatcgc ttaacacggc 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tcttgctgac tggatcactg agtttggtaa ggctgtccgg 1680 acagagaact ggcgtcctct ttttgttaaa acagaaacca tcatagcagg caatgccgca 1740 acggctcttg tggcactggt cttcagtatt cttaccggaa gcgctttagg cattatcggg 1800 tatggtttac tgatggctgt caccggtgcg ctgattgatg aatcgcttgt ggaaaaagcg 1860 aataagttct ggggtatttc cttcggtatg cattgggtgc gtcaggcccc cgagaaaggt 1920 ctggagtggg tggccaccta cccctactcc tacggtcagg gt 1962

Claims (12)

  1. 항-EB 바이러스 항체의 모방항체의 폴리펩티드와 이온 채널을 형성할 수 있는 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드로부터의 조작가능한 연결에 의해 형성되며, 상기 이온 채널을 형성할 수 있는 콜리신 Ia 알로스테릭 폴리펩티드는 야생형 콜리신 Ia 또는 그 수성 채널 구조 도메인의 펩티드쇄에 대한 G11A, H22G, A26G, V31L 및 H40D의 아미노산 잔기의 돌연변이화에 의해 수득되고,
    상기 모방항체의 폴리펩티드가 상기 항-EB 바이러스 항체의 중쇄의 CDR1 영역, 중쇄의 CDR1-CDR2의 연결 펩티드 세그먼트 및 경쇄의 CDR3이 연결된 펩티드이고,
    아미노산 서열이 서열번호 29에 나타낸 것인, 항-EB 바이러스 유도 종양의 신규 폴리펩티드.
  2. 제1항에 기재된 항-EB 바이러스 유도 종양의 신규 폴리펩티드를 코딩하는 유전자.
  3. 제2항에 있어서, 뉴클레오티드 서열이 서열번호 30에 나타낸 것인 유전자.
  4. 제3항에 기재된 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드.
  5. 제4항에 기재된 재조합 플라스미드를 발현시스템으로 형질변환시켜 발현시키는 단계 및 발현된 폴리펩티드를 단리 정제시키는 단계를 포함하는, 제1항에 기재된 항-EB 바이러스 유도 종양의 신규 폴리펩티드의 제조 방법.
  6. 제1항에 기재된 항-EB 바이러스 유도 종양의 신규 폴리펩티드를 포함하는, EB 바이러스에 의해 유도되는 종양의 치료 및 예방을 위한 약제.
  7. 아미노산 서열이 서열번호 24에 나타낸 것인, 콜리신 Ia의 알로스테릭 폴리펩티드.
  8. 제7항에 기재된 콜리신 Ia의 알로스테릭 폴리펩티드를 코딩하는 유전자.
  9. 제8항에 기재된 유전자를 폴리펩티드를 유도하는 유전자와 조작가능하게 연결하고 발현 벡터로 클로닝하는 단계, 이어서 발현 벡터를 발현시스템으로 형질전환시키는 단계 및 발현된 폴리펩티드를 단리 정제시키는 단계를 포함하는, EB 바이러스에 의해 유도되는 종양의 치료 및 예방을 위한 약제의 제조 방법.
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