KR101462454B1

KR101462454B1 - 펩티드의 티오에스테르 화합물의 제조 방법

Info

Publication number: KR101462454B1
Application number: KR1020087025264A
Authority: KR
Inventors: 야스히로 가지하라; 나오키 야마모토; 유리 남부; 카즈히로 후카에; 히로아키 아사이
Original assignee: 가부시키가이샤 도우사 고가쿠 겐큐쇼
Priority date: 2006-03-29
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2014-11-17
Anticipated expiration: 2027-03-28
Also published as: EP2000474B1; TWI450905B; CA2647867A1; EP2000474A4; US20090137780A1; CA2647867C; KR20090007709A; EP2000474A1; AU2007232742A1; WO2007114454A1; TW201109347A; TW200806686A; DK2000474T3; TWI353989B; SG170022A1; JP5328345B2; JPWO2007114454A1; CN101437836B; US8058394B2; CN101437836A

Abstract

본원은 하기 (A) 내지 (C)의 단계를 포함하는 펩티드 티오에스테르 화합물의 제조 방법을 기술한다:

(A) 화학식 1의 연결기로 수식된 수지를 고상으로 사용하여 고상 합성법으로 펩티드를 형성시키고,

(B) 묽은 염산, 묽은 황산 및 초산으로 이루어진 그룹으로부터 1종 이상 선택된 산으로 고상과 펩티드의 결합을 절단하여, C 말단에 카르복실기를 갖는 펩티드를 제조하고,

(C) 생성된 펩티드를 축합제의 존재 하에서 티올 화합물과 -100 내지 0℃에서 반응시켜 펩티드의 티오에스테르 화합물을 제조한다.

[화학식 1]

상기 식에서, R¹은 C_1-4 알킬기를 나타내고, R²는 수소 원자 또는 C_1-4 알콕시기를 나타내며, n는 1 내지 4의 정수를 나타낸다.

티오에스테르, 펩티드, 연결기, 시스테인,고상 합성법, N 말단 아미노산

Description

펩티드의 티오에스테르 화합물의 제조 방법{Method for production of peptide thioester compound}

본 발명은, 펩티드의 티오에스테르 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.

생체내에 존재하는 단백질의 상당수는, 당쇄를 갖는 당단백질이다. 당단백질 중의 당쇄는 단백질의 3차원 구조의 유지나 용해성의 조절, 프로테아제 내성의 부가 등의 기능을 담당하고 있다. 최근에 와서, 당단백질 중의 당쇄가, 수정이나 분화, 시그널 전달, 암(癌)화, 단백질의 세포내 수송이나 생리 활성의 조절 등의 생명 현상에 관여하는 것이 밝혀지고 있다. 이와 같이, 단백질에 결합한 당쇄는 여러가지 생리 기능에 중요한 역할을 하고 있다. 그러나, 당해 당쇄의 구조는 다양하고, 그 종류가 방대하기 때문에, 어느 구조의 당쇄가 생명 현상에 관여하고 있는지를 특정하는 것은 극히 곤란한 상황이다. 이러한 기능의 해명을 위해서도, 단일 구조의 당쇄를 가진 당단백질, 당펩티드의 합성이 필요 불가결하다. 현재로서는, 생물학적 방법에서는 단백질 발현을 사용해 당단백질을 발현시키는 것이 가능하지만, 균일한 구조의 당쇄를 가진 당단백질을 얻는 것은 어렵다. 이 때문에, 근 래에 와서는 단일 구조의 당쇄를 갖는 당펩티드, 당단백질을 화확적으로 정밀 합성하는 것이 검토되고 있다.

본 발명자 등은, 원료가 될 수 있는 2 분기(分岐) 복합형 당쇄를 계란보다 효소법과 화학법을 조합하여 대량으로 제조하는 방법(특허 문헌 1), 또한 복합형 당쇄를 펩티드의 고상 합성법을 응용하여 시아릴당쇄펩티드를 합성하는 방법(특허 문헌 2)을 확립하였다. 당펩티드를 고분자화할 수 있다면, 단일 구조의 당쇄를 갖는 대형의 당단백질을 합성하는 것이 가능해진다.

펩티드를 고분자화하는 방법으로서는, 현재, N 말단의 아미노산이 시스테인(Cys)인 펩티드 fragment와 C 말단에 티오에스테르를 갖는 펩티드를 커플링시키는 Natiｖe　chemical　ligation법(비특허 문헌 1)이 가장 효과적이라고 생각되고 있다.

펩티드의 합성 방법으로서는, 불용성 수지 담체에 N 말단이 보호된 아미노산을 고정화시키고, 아미노산의 보호기를 탈보호한 후에 순차적으로 펩티드 쇠사슬을 신장시켜 가는 고상 합성법이 일반적으로 사용된다. C 말단에 티오에스테르를 가진 펩티드를 제조하는 방법으로서는, 고상으로부터 펩티드를 자를 때에 티오에스테르화를 실시하는 방법, 고상으로부터 펩티드를 자른 후에 펩티드의 C 말단 카르복실기를 티오에스테르화하는 방법 등을 들 수 있다.

고상으로부터 펩티드를 자를 때에 티오에스테르화하는 방법으로서는, 예를 들면 고상 수지에 Safety　Catch　Linker를 사용해 펩티드를 제조해, 티올 화합물을 작용시키는 방법이 알려져 있다(비특허 문헌 1 및 2). 그러나, 1번째의 아미노 산을 수지에 고정화할 때의 축합 효율이 나쁜 점이나, 이의 축합시에 약간의 아미노산이 라세미화되는 점, 티올 화합물에 의해 에스테르화의 반응성이 떨어지는 등의 많은 문제를 가지고 있다. 또한, 당펩티드의 당쇄 수산기가 보호되어 있지 않은 경우에는, Safety　Catch　Linker의 활성화를 위해 행해지는 알킬화가, 용이하게 당수산기도 알킬화시켜, 탈알킬화 처리를 실시하지 않으면 안되며, 조건에 따라서는 당쇄 결합 등에 영향을 주어, 수득되는 당펩티드의 균일한 당쇄 구조를 확보할 수 없다. 이러한 문제를 해소하기 위해, 미리 당쇄 수산기를 보호하는 것이 제안되고 있지만, 보호, 탈보호의 공정이 추가되므로, 효율적인 방법이라고는 할 수 없다.

고상 수지로부터 펩티드를 자르는 경우, 통상적으로 95% 트리플루오르초산이나 플루오르화수소 등의 강산을 사용한다. 그러나, 이러한 강산의 사용은 펩티드 측쇄의 탈보호나 당펩티드의 당쇄 결합의 절단을 수반한다. 이 때문에 약산을 사용하여 탈보호하지 않게 고상 수지로부터 펩티드를 자르는 방법으로서, 트리틸 수지를 고상으로 하여, 절단에 초산을 사용하는 방법(비특허 문헌 3, 4 및 5) 또는 4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산으로 수식한 수지(HMPB 레진)를 고상으로 하여, 절단에 1% 트리플루오르초산(TFA)을 사용하는 방법이 보고되고 있다(비특허 문헌 6). 그러나, 트리틸 수지를 사용한 방법에서는, 수산기를 보호하고 있지 않는 당펩티드를 제조할 수 없다. 한편, HMPB 레진을 고상으로서 사용하여, 당펩티드를 제작하는 경우에는, 1% TFA로는 절단하지 못하고, 10% TFA를 사용했을 경우에는, 펩티드 측쇄의 보호기도 일부 탈보호된다. 펩티드의 티오에스테르화를 행하는 경우에는, 특히 N 말단 시스테인 티올기의 보호가 자기 축합을 방지하기 위해 필수이지만, 절단시의 탈보호는 다음 반응에 치명적인 결과를 초래하게 된다. 따라서, 이들 방법은 C 말단에 티오에스테르를 갖는 펩티드의 제조 원료가 되는 카르복실기를 갖는 펩티드의 제조 방법으로 충분한 방법이라고는 할 수 없다.

펩티드의 티오에스테르체는, 측쇄가 보호된 펩티드를 알킬 티올과 반응시켜 제조할 수 있지만, C 말단의 아미노산이 라세미화하는 문제가 있다. 라세미화를 피하기 위해, C 말단의 아미노산을 글리신으로 치환하는 방법(비특허 문헌 7), 디클로로메탄(DCM) 중, 축합제로서 벤조트리아졸-1-일옥시-트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP)/디이소프로필에틸아민(DIPEA)을 사용하는 방법(비특허 문헌 8), 테트라하이드로푸란(THF) 중, 축합제로서 2-(1H-벤조트리아졸-1-일) -1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트(HBTU)/DIPEA를 사용하는 방법(비특허 문헌 9)이 보고되고 있다. 그러나, C 말단 아미노산을 글리신으로 치환하는 방법은, 제조되는 펩티드가 스스로 제한된다. 또한, 보호기로 보호되어 있지 않은 수산기를 갖는 당펩티드를 DCM나 THF와 같은 용매에 용해시키지 못해 용매의 변경을 피할 수 없게 되며, C 말단 아미노산의 라세미화 문제가 다시 생긴다.

[특허 문헌 1] WO　03/008431호 공보

[특허 문헌 2] WO　2004/005330호 공보

[비특허 문헌 1] J.Am.Chem.Soc.,　121, 11369-11374(1999)

[비특허 문헌 2] Angew.Chem.Int.Ed.,　44, 1650-1654(2005)

[비특허 문헌 3] Tetrahedron　Lett.,　38, 6237-6240(1997)

[비특허 문헌 4] Tetrahedron　Lett.,　44, 3551-3554(2003)

[비특허 문헌 5] J.Am.Chem.Soc.,　123, 3885-3891(2001)

[비특허 문헌 6] Tetrahedoron,　49, 9307-9320(1993)

[비특허 문헌 7] Tetrahedron　Lett.,　38, 6237-6240(1997)

[비특허 문헌 8] Tetrahedron　Lett.,　44, 3551-3554(2003)

[비특허 문헌 9] J.Am.Chem.Soc.,　123, 3885-3891(2001)

본 발명의 목적은, 당쇄를 갖지 않는 펩티드는 물론, 당쇄, 특히 수산기가 보호되어 있지 않은 당쇄를 갖는 당펩티드에서도 적용 가능한, 펩티드 측쇄의 보호기가 유지된 C 말단에 카르복실기를 갖는 펩티드의 제조 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 목적은, 당쇄를 갖지 않는 펩티드는 물론, 당쇄, 특히 수산기가 보호되어 있지 않은 당쇄를 갖는 당펩티드에서도 적용 가능한, 라세미체의 생성을 억제시킨, 펩티드의 티오에스테르 화합물을 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

발명의 개시

본 발명은 이하의 발명과 관련된다.

(B) 묽은 염산, 묽은 황산, 포름산 및 초산으로 이루어진 그룹으로부터 1종 이상 선택된 산에 의해 고상과 펩티드의 결합을 절단하여, C 말단에 카르복실기를 갖는 펩티드를 제조하고,

(C) 용매 중, 축합제의 존재 하에서 티올 화합물을 -100 내지 0℃에서 반응시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 펩티드의 티오에스테르 화합물의 제조 방법.

본 발명자 등은, 특정의 고상 수지를 사용하여, 특정 조건에서 생성된 펩티드를 당해 고상 수지로부터 절단함으로써, 당쇄 구조에 영향을 주지 않으면서 측쇄 보호기를 유지한 C 말단에 카르복실기를 갖는 펩티드를 제조할 수 있음을 밝혀내었다.

더욱이, 수득된 펩티드의 C 말단 카르복실기에 티올 화합물을 특정 축합제의 존재하에서 저온으로 작용시킴으로써 펩티드의 C 말단의 라세미화가 억제된 펩티드의 티오에스테르 화합물을 제조할 수 있음을 밝혀내었다.

본 발명의 펩티드의 티오에스테르 화합물의 제조 방법은, (A) 화학식 1로 표현되는 연결기로 수식된 수지를 고상으로 사용한 고상 합성법으로 펩티드를 형성시키고, (B) 묽은 염산, 묽은 황산, 포름산 및 초산으로 이루어진 그룹으로부터 1종 이상 선택된 산으로 고상과 펩티드의 결합을 절단하여, C 말단에 카르복실기를 갖 는 펩티드를 제조하고, (C) 용매 중, 축합제의 존재 하에서 티올 화합물을 -100 내지 0℃에서 반응시키는 공정으로 이루어진다.

공정(A)：펩티드의 형성

본 공정에 있어서, 화학식 1로 표현되는 연결기로 수식된 수지(레진)을 사용한다.

[화학식 1]

C_1-4 알킬기로는, 메틸기, 에틸기, n-프로필기, 이소프로필기, n-부틸기, 이소부틸기, sec-부틸기, tert-부틸기 등의 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소수 1 내지 4의 알킬기를 나타낸다.

C_1-4 알콕시기로는, 메톡시기, 에톡시기, n-프로폭시기, 이소프로폭시기, n-부톡시기, 이소부톡시기, sec-부톡시기, tert-부톡시기 등의 직쇄상 또는 분지쇄상의 탄소수 1 내지 4의 알콕시기를 나타낸다.

화학식 1의 연결기로 수식된 수지는, 시판되고 있는 것이나 종래 공지된 수 지일 수 있으며, 예를 들면 HMPB-BHA 수지(4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산-벤즈히드릴아민), HMPB-MBHA 수지(4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산-메틸벤즈히드릴아민) 등을 들 수 있지만, 당펩티드의 제조에 있어서, 아미노-PEGA 레진(제조원: 노바 바이오 화학사)의 아미노기와, 화학식 2로 표시된 카르본산 화합물의 카르복실기를, 종래 공지된 아미드화 반응에 따라 탈수 축합제의 존재 하에서 반응시킴으로써 수득된 팽윤성이 뛰어난 수지를 사용할 수 있다. 여기서 PEGA 레진으로는 비스아크릴아미드프롭-1-일폴리에틸렌글리콜을 나타낸다.

상기 식에서, R¹, R² 및 n는 상기한 바와 같다.

수득되는 화학식 1의 연결기를 갖는 수지 중에서도, R¹이 메틸기, R²가 수소 원자 또는 C_1-4 알킬기인 수지가 바람직하고, 더욱이 R¹이 메틸기, R²가 수소 원자 또는 C_1-4 알킬기, n이 2 내지 4인 수지가 바람직하고, R¹이 메틸기, R²가 수소 원자 또는 C_1-4 알킬기, n이 3인 수지가 특히 바람직하다.

구체적으로는, 예를 들면 화학식 3의 수지가 특히 바람직하다.

상기 식에서, R²는 상기한 바와 같다.

상기 화학식 1의 연결기로 수식된 수지를 고상으로 사용하여 펩티드를 제조한다.

예를 들면, 이하의 (a) 내지 (e)의 공정을 들 수 있다.

(a) 화학식 1의 연결기로 수식된 수지에서 화학식 1의 연결기 일부의 수산기와, 보호기에 의해 아미노기가 보호된 아미노산의 카르복시기를 에스테르화 반응시키고,

(b) 아미노기의 보호기를 탈보호시켜, 보호되어 있지 않은 아미노기를 형성시키고,

(c) 당해 보호되지 않은 아미노기와, 아미노기가 보호된 아미노산의 카르복실기를 아미드화 반응시키고,

(d) 상기 보호기를 탈보호시켜, 보호되어 있지 않은 아미노기를 형성시키고,

(e) 상기 (c) 및 (d)의 공정을 1회 이상 반복하여 펩티드를 형성한다.

아미노산으로서는 모든 아미노산을 사용할 수 있으며, 예를 들면 세린(Ser), 아스파라긴(Asn), 바린(Val), 류신(Leu), 이소류신(Ile), 알라닌(Ala), 티로신(Tyr), 글리신(Gly), 리신(Lys), 아르기닌(Arg), 히스티딘(His), 아스파라긴 산(Asp), 글루타민산(Glu), 글루타민(Gln), 스레오닌(Thr), 시스테인(Cys), 메티오닌(Met), 페닐알라닌(Phe), 트립토판(Trp), 프롤린(Pro)을 들 수 있다.

보호기로서는, 예를 들면 9-플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc)기 또는 t-부틸옥시카보닐(Boc)기, 아릴옥시카보네이트(Alloc)기 등의 카보네이트 함유기, 아세틸(Ac)기 등의 아실기, 아릴기, 벤질기 등의 보호기 등을 들 수 있다. 보호기의 도입, 예를 들면 Fmoc기의 도입은, 9-플루오레닐메틸-N-석시니미딜카보네이트와 탄산수소나트륨을 첨가하고 반응을 진행시킴으로써 도입될 수 있다. 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 1 내지 5시간 정도 실시하는 것이 좋다.

지용성 보호기로 아미노기를 보호한 아미노산으로는, 상기의 아미노산의 아미노기에 상기의 방법 또는 공지된 방법에 의해 지용성 보호기를 도입시켜 제조할 수 있으며, 시판되는 것을 사용할 수도 있다. 예를 들면, Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산으로서는 Fmoc-Ser, Fmoc-Asn, Fmoc-Val, Fmoc-Leu, Fmoc-Ile, Fmoc-AIa, Fmoc-Tyr, Fmoc-Gly, Fmoc-Lys, Fmoc-Arg, Fmoc-His, Fmoc-Asp, Fmoc-Glu, Fmoc-Gln, Fmoc-Thr, Fmoc-Cys, Fmoc-Met, Fmoc-Phe, Fmoc-Trp 및 Fmoc-Pro을 들 수 있다.

최후에 도입되는 아미노산으로서 시스테인(Cys)을 선택하는 경우, N 말단에 시스테인을 갖는 펩티드를 제조할 수 있어, Natiｖe　Chemical　Ligation에 있어서 펩티드의 티올에스테르 화합물과 커플링시키는 fragment로 사용할 수 있다.

아미노산에 당쇄가 결합한 당쇄아미노산을 사용함으로써, 당쇄아미노산을 펩티드 쇄의 임의 위치에 도입시킨 당펩티드를 제조할 수 있다.

사용되는 당쇄아미노산으로는, 임의 개수의 당잔기를 갖는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 만노스를 많이 함유한 고만노스, 당쇄의 비환원 말단에 시알산이나 갈락토오스잔기를 갖는 복합형 당쇄(도 1), 고만노스 구조와 복합형 당쇄가 섞인 혼성형 당쇄, 아스파라긴의 측쇄의 아미드기와 N 글리코실화된 N 결합형 당쇄, 세린, 스레오닌의 측쇄 알코올이 글리코실화된 O 결합형 당쇄 등을 들 수 있다. 구체적으로는, WO03/008431호 공보에 기재된 당쇄 아스파라긴을 들 수 있다. 그 중에서도 디시알로당쇄아스파라긴 또는 모노시알로당쇄아스파라긴이 바람직하고, 예를 들면, 식 (4)의 시알산의 카르복실기가 벤질기 등의 보호기에 의해 보호된 당쇄가 특히 바람직하다. 이러한 디시알로당쇄아스파라긴 또는 모노시알로당쇄아스파라긴이 결합한 당펩티드는 바람직한 당펩티드이다.

수지의 연결기 부의 수산기와, 상기 보호된 아미노기를 갖는 아미노산의 카르복실기의 에스테르화 반응은, 예를 들면 1-메틸렌설포닐-3-니트로-1,2,4-트리아졸(MSNT), DCC, 디이소프로필카보디이미드(DIPCDI) 등의 탈수 축합제를 사용하여 실시할 수 있으며, 예를 들면 고상 컬럼에 레진을 넣어 용매로 세정하고, 후에 아미노산의 용매 용액을 첨가하여 실시하는 것이 바람직하다.

세정용 용매로는, 예를 들면 DMF, 2-프로판올, DCM 등을 들 수 있다. 아미노산을 용해하는 용매로는, 예를 들면 DMSO, DMF, DCM 등을 들 수 있다. 반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10분 내지 30시간 정도, 바람직하게는 15분 내지 24시간 정도 실시하는 것이 좋다.

이 때 고상상의 미반응된 수산기를 무수 초산 등을 사용해 아세틸화하여 캡핑하는 것도 가능하다.

아미노기의 보호기의 탈보호는, 산 또는 염기로 처리하여 실시할 수 있으며, 예를 들면 보호기가 Fmoc기인 경우, 피페리딘, 모폴린 등의 염기를 사용할 수 있다. 이 때, 용매의 존재 하에 실시하는 것이 바람직하고, 용매의 예로 DMSO, DMF, 메탄올 등을 들 수 있다.

보호되어 있지 않은 아미노기와, 아미노기가 보호된 임의의 아미노산의 카복실기를 아미드화하는 반응은, 활성화제 및 용매의 존재 하에서 실시하는 것이 바람직하다.

활성화제로는, 예를 들면, 디시클로헥실카보디이미드(DCC), 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드·염산염(WSC/HCl), 디페닐포스포릴아지드(DPPA), 카보닐디이미다졸(CDI), 디에틸시아노포스포네이트(DEPC), 디이소프로필카보디이미드(DIPCI), 벤조트리아졸-1-일옥시-트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트(PyBOP), 1-하이드록시벤조트리아졸(HOBt), 하이드록시석신이미드(HOSu), 디메틸 아미노피리딘(DMAP), 1-하이드록시-7-아자벤조트리아졸(HOAt), 하이드록시프탈이미드(HOPht), 펜타플루오로페놀(Pfp-OH), 2-(1H-벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로설페이트(HBTU), O-(7-아자벤조트리아졸-1-일)-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스포네이트(HATU), O-벤조트리아졸-1-일-1,1,3,3-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트(TBTU), 3,4-디하이드로-3-하이드록시-4-옥사-1,2,3-벤조트리아진(Dhbt) 등을 들 수 있다.

용매로는 예를 들어 디메틸설폭시드(DMSO), N,N-디메틸포름아미드(DMF), 디클로로메탄(DCM) 등을 들 수 있다.

활성화제의 사용량은, 화학식 2의 카르본산 화합물에 대해, 0.1 내지 20 당량, 바람직하게는 0.5 내지 10 당량, 한층 더 바람직하게는, 0.8 내지 5 당량으로 하는 것이 바람직하다. 반응은 용매 중에서 실시할 수 있으며, 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 10 내지 30시간 정도, 바람직하게는 15분 내지 24시간 정도 실시하는 것이 좋다. 또한, 고상 합성용 컬럼 중에서 반응을 실시함으로써, 그대로 후의 고상 합성에 사용할 수 있어 바람직하다.

보호기의 이탈은, 상기한 바와 같이 실시할 수 있다.

공정(B)：펩티드의 절단

수지(레진)로부터 펩티드쇄를 절단하려면 산으로 처리하는 것이 바람직하다.사용되는 산으로는, 묽은 염산, 묽은 황산 등의 광산류, 포름산, 초산 등의 카르본 산류를 들 수 있다. 묽은 염산 또는 묽은 황산으로서는, 0.01 내지 2 규정 정도, 바람직하게는 0.05 내지 1 규정 정도의 염산 또는 황산의 수용액을 들 수 있다. 이러한 산 중에서도 초산이 바람직하다. 산의 사용량으로서는, 펩티드 1 당량에 대해서 1 당량 이상이면 특별하게 제한되지 않고, 예를 들면, 1 내지 10000 당량 정도, 바람직하게는 10 내지 1000 당량 정도이면 좋다.

본 반응은 알코올 존재 하에서 실시하는 것이 바람직하고, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 프로판올 등의 저급 알코올, 트리플루오르에탄올(TFE), 트리클로로에탄올 등의 할로게노알코올을 들 수 있다. 이러한 알코올 중에서도, 메탄올, 트리플루오르에탄올이 바람직하고, 트리플루오르에탄올이 특히 바람직하다. 알코올의 사용 비율은, 산 1 용량에 대해 알코올 0.1 내지 2 용량, 바람직하게는 0.5 내지 1.5 용량, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 1.2 용량이면 좋다.

또한, 본 반응은 필요에 따라, DCM, DMF, DMSO 등의 유기용매를 사용할 수 있다.

용매의 사용량은 특별하게 제한되지 않고, 산 1 용량에 대해 0.1 내지 100 용량 정도이면 좋다.

반응은 0 내지 50℃, 바람직하게는 실온에서, 약 1 내지 30시간 정도 실시하는 것이 좋다.

이상과 같이 함으로써, C 말단에 카르복실기를 갖는 펩티드를 얻을 수 있다.

공정(C)：펩티드의 티오에스테르 화합물의 제조

수득된 펩티드(원료 펩티드)를 용매 중에서 축합제의 존재 하 티올 화합물과 작용시킴으로써 C 말단이 티오에스테르인 펩티드를 제조할 수 있다. 티올 화합물로서는, 페닐환의 임의의 위치에, 임의의 개수의 불소, 염소, 브롬, 요오드 등의 할로겐 원자, 메틸기, 에틸기 등의 탄소수 1 내지 4의 저급 알킬기, 메톡시기, 에톡시기 등의 탄소수 1 내지 4의 알콕시기, 니트로기 등의 치환기를 함유할 수 있는, 벤질메르캅탄류, 메탄티올, 에탄티올 등의 저급 알칸티올류 등을 들 수 있다. 이러한 티올 화합물 중에서도 벤질메르캅탄이 특히 바람직하다.

티올 화합물의 사용량으로서는, 원료 펩티드 1 당량에 대해 1 내지 100 당량, 바람직하게는 10 내지 80 당량, 더욱 바람직하게는 20 내지 50 당량이면 좋다. 특히, 펩티드의 C 말단의 라세미화를 억제하기 위해서는, 과량을 사용하는 것이 바람직하고, 30 당량 정도 이상으로 하는 것이 바람직하다.

사용되는 용매로는, 예를 들면 THF, DCM, DMSO, DMF 등을 들 수 있으며, 이들 중에서도 DMF가 바람직하다.

축합제로서는, HOBt/DIPCI 또는 PyBOP/DIPEA 등을 들 수 있으며, PyBOP/DIPEA가 바람직하다.

HOBt/DIPCI의 사용 비율은, HOBt 1 당량에 대해 DIPCI를 0.1 내지 10 당량, 바람직하게는 0.5 내지 5 당량, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 1.2 당량이면 좋다.

PyBOP/DIPEA의 사용 비율은 PyBOP 1 당량에 대해 DIPEA를 0.1 내지 10 당량, 바람직하게는 0.5 내지 5 당량, 더욱 바람직하게는 0.8 내지 1.2 당량이면 좋다.

HOBt의 사용 비율은, 원료 펩티드 1 당량에 대해, 1 내지 20 당량, 바람직하게는 3 내지 15 당량, 더욱 바람직하게는 8 내지 12 당량이면 좋다.

PyBOP의 사용 비율은, 원료 펩티드 1 당량에 대해서, 1 내지 10 당량, 바람직하게는 2 내지 8 당량, 더욱 바람직하게는 3 내지 6 당량이면 좋다.

본 반응에 있어서, 몰리큘러시브(molecular seives) 등의 탈수제를 사용하는 것이 바람직하다.

펩티드는 원료 펩티드의 C 말단 카르본산이 활성화된 시점에서 라세미화된다. 이 때문에, 반응은, 원료 펩티드와 티올 화합물을 혼합한 후, 축합제를 첨가하여 실시하는 것이 바람직하다. 반응 온도는 -100 내지 0℃, 바람직하게는 -80 내지 -10℃이면 좋고, 30분 내지 2시간 정도 실시하면 좋다.

본 발명에 있어서, 수득되는 펩티드의 라세미체화 비율은 억제되며, 통상 라세미체화 비율은 6% 이하, 바람직하게는 4% 이하, 더욱 바람직하게는 2% 이하, 특히 바람직하게는 0 내지 1%이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

이하에 실시예를 들어 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

사용된 Fmoc화된 아미노산은 공지되어 있으며, 시판품이나 아미노산에 Fmoc기를 도입시켜 용이하게 제조할 수 있다.

또한, Fmoc-Ala, Fmoc-Asn, Fmoc-Gly, Fmoc-Leu, Fmoc-Met, Fmoc-Phe, Fmoc-Pro, Fmoc-Val은 각 아미노산의 아미노기가 Fmoc기로 보호되어 있음을 의미한다.

Boc-Cys(Acm)는 시스테인의 아미노기가 Boc기로 보호되고 티올이 아세트아미드메틸기로 보호되어 있음을 의미한다. Fmoc-Arg(Pbf)는, 아르기닌의

위치 아 미노기가 Fmoc기로 보호된 N^G-(2,2,4,6,7-펜타메틸하이드로벤조푸란-5-설포닐)아르기닌을 의미한다. Fmoc-Asp(OtBu) 및 Fmoc-Glu(OtBu)은 각 아미노산의 아미노기가 Fmoc기로 보호되고, 아스파라긴산의 β위치 및 글루타민산의 γ위치의 카르복실기가 tert-부틸기로 보호되어 있음을 의미한다. Fmoc-Cys(trt)은, 시스테인의 아미노기가 Fmoc기로 보호되고 티올이 트리틸기로 보호됨을 의미한다. Fmoc-Lys(Boc)는, 리신의

위치 아미노기가 Fmoc기로 보호되고 ε 위치 아미노기가 Boc기로 보호되어 있음을 의미한다. Fmoc-Ser(tBu), Fmoc-Tyr(tBu) 및 Fmoc-Thr(tBu)은, 각 아미노산의 아미노기가 Fmoc기로 보호되고 수산기가 트리틸기로 보호되어 있음을 의미한다. Boc-Leu 및 (Boc)Leu는, 류신의 아미노기가 Boc기로 보호되어 있음을 의미한다. (Boc)Lys(Boc)는, 리신의

위치와 ε위치의 아미노기가 Boc기로 보호되어 있음을 의미하며, Lys(Boc)는 리신의 ε위치의 아미노기가 Boc기로 보호되어 있음을 의미한다. Boc-Cys(Thz)은 N-t－Boc-1,3－티아졸리딘-4-카르본산을 의미한다. Thr(tBu), Tyr(tBu) 및 Ser(tBu)는 각 아미노산의 수산기가 tert-부틸기로 보호되어 있음을 의미한다. His(trt)는 이미다졸 질소가, Cys(trt)는 시스테인의 티올기가, 및 Gln(trt)는 글루타민의 아미드 질소가 트리틸기로 보호되어 있음을 의미한다. Asp(OtBu) 및 Glu(OtBu)는, 아스파라긴산 β위치 및 글루타민산 γ위치의 카르복실기가 tert-부틸기로 보호되어 있음을 의미한다. Cys(Thz)는 1,3－티아졸리딘-4-카보닐을 의미한다. Arg(Pbf)은, N^G-(2,2,4,6,7-펜타메틸디하이드로벤조프란-5-설포닐)아르기닌을 의미한다.

이러한 보호기의 도입은 종래 공지된 방법을 사용하거나, 보호기가 도입된 시판품을 사용할 수 있다. 또한, Ph는 페닐기를 나타내며, Bn는 벤질기를 나타낸다.

¹H-NMR는 Bruker의 AVANCE　400　(400 MHz와 표기)으로 측정하였다.

ESI　mass 측정기는 Bruker　Daltonics 사의 Esquire3000　plus를, MALDI　mass 측정기는 Bruker　Daltonics 사의 Autoflex를, 매트릭스에는 디하이드록시벤조산을 사용하였다.

실시예 1

고상 합성용 컬럼에 아미노-PEGA　레진(1 g, 50μmol)을 주입하고, DCM, DMF로 충분히 세정한 후, DMF로 충분히 팽윤시켰다. 4-하이드록시메틸-3-메톡시페녹시부티르산(HMPB)(30.1 mg, 0.13 mmol), TBTU(40.1 mg, 0.13 mmol), N-에틸모폴린(15.8μl, 0.13 mmol)을 DMF(1 ml)에 용해시키고 컬럼에 넣어 실온에서 2시간 교반하였다. 수지를 DMF 및 DCM로 충분히 세정하여, HMPB-PEGA　수지를 수득하고, 이를 고상 합성의 고상으로서 사용하였다.

Fmoc-Phe(96.8 mg, 0.25 mmol)와 MSNT(74 mg, 0.25 mmol), N-메틸이미다졸(15μl, 0.19 mmol)를 DCM(1 ml)에 용해시키고, 고상 합성용 컬럼에 넣어 실온에서 2시간 교반하였다. 교반 후, 수지를 DCM, DMF를 사용하여 세정하였다. Fmoc기를 20분 동안 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ml)을 사용해 탈보호시켰다. DMF로 세정하고, 이후의 펩티드쇄의 신장은 이하에 기술된 방법을 사용하여, 순차적으로 아미노 산을 축합시켰다.

Fmoc기로 아미노기를 보호한 아미노산과 HOBt(33.8 mg, 0.25 mmol), DIPCI(38μl, 0.25 mmol)를 DMF(1 ml)에 용해시켜 15분간 활성화시킨 후, 고상 합성용 컬럼에 주입하였다. 실온에서 1시간 반 동안 교반한 후, Fmoc기를 20분 동안 20% 피페리딘/DMF 용액(1 ml)을 사용하여 탈보호시켰다. 당해 조작을 반복하여, 아미노산을 순차적으로 축합시켰다.

Fmoc기로 아미노기가 보호된 아미노산으로, Fmoc-Tyr(tBu)(114.9 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Asn(88.6 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Ala(77.8 mg, 0.25 mmol), Fmoc-His(trt)(154.9 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Ser(tBu)(95.9 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Asp(OtBu)(102.9 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Leu(88.4 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Val(84.9 mg, 0.25 mmol)를 사용하여 고상 수지에 Phe-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Asn-Ala-His(trt)- Ser(tBu)-His(trt)-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Tyr(tBu)-Leu-Phe-Phe-Ser(tBu)-Val-Ser (tBu)-Asn의 19개의 잔기 펩티드를 형성시켰다.

DCM 및 DMF를 사용하여 세정한 후, 19개 잔기의 펩티드 2μmol 상당의 수지를 에펜튜브로 옮겼다.

하기 식 (5)의 당쇄 아스파라긴의 디벤질체(10 mg, 3.6μmol)와 DEPBT(2 mg, 6μmol)를 DMF(0.12 ml)에 용해시켜, 에펜튜브에 넣었다.

(5)

DIPEA(0.68μl, 4μmol)를 첨가하고 실온에서 18시간 동안 교반하였다. DMF로 세정한 후에, 20% 피페리딘을 사용하여 Fmoc-기를 탈보호하고, 고상 수지에 Phe-Tyr(tBu)-Tyr(tBu)-Asn-Ala-His(trt)-Ser(tBu)-His(trt)-Asp(OtBu)-Leu-Asn-Ty r(tBu)-Leu-Phe-Phe-Ser(tBu)-Val-Ser(tBu)-Asn-Asn (올리고삭카라이드 쇄)의 20개의 잔기 펩티드(6)를 형성시켰다.

(6)

실시예 2

실시예 1에서 수득된 20개의 잔기 펩티드를 형성한 수지를 일부 고상 합성용 컬럼에 주입하고, 초산：DCM：메탄올(=5：4：1)을 수지가 충분히 잠길 정도로 첨가하고, 3시간 동안 실온에서 교반하였다. 수지를 여과시켜 제거하고, 반응 용액을 감압 하에서 농축하였다. 수득된 잔사를 HPLC(Cadenza　column　　C18　75×4.6mm　전개용매 A：0.1% TFA 수용액　B：0.1% TFA　아세트니트릴：물=90：10　경사 A： B=60：40 →0：100　15분 유속 0.1ml/분)로 정제하여, 20개 잔기의 펩티드(7)를 수득하였다.

수득된 펩티드는 C 말단에 카르복실기를 가져, 측쇄 보호기가 유지되었다.

ESI-MS：　Calcd　for　C₂₇₉H₃₈₂N₃₄O₉₄：

［M＋3H]³⁺　1906.3,　found.1905.8

(7)

실시예 3

실시예 2에서 사용하였던 초산：DCM：메탄올 및 반응 시간을, 초산：TFE：DMC(=2：2：6)로 2시간, 또는 초산：TFE(=1：1)로 27시간으로 변경해 반응시켰다.

어느쪽에서든 20개의 잔기 펩티드(7)를 얻을 수 있었다.

다만, 초산：TFE：DMC로의 조건은, 초산：DCM：메탄올의 조건과 비교해 약 5배, 또한 초산：TFE의 조건은 초산：DCM：메탄올의 조건과 비교해 약 8배의 수율을 나타내었다.

실시예 4

실시예 1과 같게 하여 HMPB-PEGA　레진(25μmol)을 수득하여 고상 합성의 고상으로서 사용하고, 아미노산을 축합시켜 펩티드를 형성하였다. 아미노산의 축합은 실시예 1과 같게 행하였다. 제1의 아미노산으로서 Fmoc-Ala(38.9 mg, 0.13 mmol)를 사용하여 MSNT(37 mg, 0.13 mmol), N-메틸이미다졸(7.5μl, 94μmol), DCM(0.5 ml)에 의해서 축합시켰다.

이 후에 아미노기를 보호한 아미노산을 HOBt(16.9 mg, 0.13 mmol), DIPCI(19.2μl, 0.13 mmol), DMF(0.5 ml)에 의해서 순차적으로 축합시켰다. 아미노기를 보호한 아미노산으로서 Fmoc-Gln(46.1 mg, 0.13 mmol), Fmoc-Thr(tBu)(49.7 mg, 0.13 mmol), Fmoc-Ile(44.2 mg, 0.13 mmol), Fmoc-Val(42.4 mg, 0.13 mmol), Fmoc-Ser(tBu)(47.9 mg, 0.13 mmol)를 사용해 순차적으로 축합시켰다.

펩티드 신장 후, 수지 2μmol에 대해서 식 (5)의 당쇄아스파라긴의 디벤질체(10 mg, 3.6μmol)와 DEPBT(2 mg, 6μmol), DIPEA(0.68μl, 4μmol), DMF(0.12 ml)를 사용하였다. 이 후에, Boc-Cys(Acm)(2.9 mg, 10μmol)를 HOBt(1.36 mg, 10μmol), DIPCI(1.54μl, 10μmol), DMF(0.25 ml)에 의해서 축합하였다.

수지에 AcOH：TFE=1：1(1 ml)을 첨가하고, 실온에서 14시간 동안 반응시켰 다. 수지를 여과시켜 제거하고, 반응 용액을 농축시켰다. HPLC(Cadenza　column C18　75×4.6mm　전개 용매 A：0.1% TFA 수용액　B：0.1% TFA/아세트니트릴：물=90：10　경사 A：B=60：40→0:100　15분 유속 0.1ml/분)로 정제하여 측쇄 보호된 9개잔기 펩티드(8)를 수득하였다.

ESIMS：　Calcd　for　C₁₅₅H₂₄₉N₁₈O₇₉S：［M＋2H]²⁺　1830.3,　found.　1831.0.

(8)

실시예 5

실시예 4에서 제조한 9개 잔기 펩티드(8)(2 mg, 0.55μmol)와 몰리큘러시브(MS) 4A(10 mg), 벤질메르캅탄(2μl, 16.4μmol)을 DMF 용매 중(85μl) 아르곤 기류하 -20℃에서 1시간 동안 교반한 후, PyBOP(1.4 mg, 2.7μmol), DIPEA(0.46μl, 2.7μmol)를 첨가하여 4시간 동안 교반하였다. 이 후, 반응 용액에 디에틸 에테르(5 ml)를 첨가하여 화합물을 침전시키고, 여과 후 침전물을 아세트니트릴 50% 수용액으로 회수하였다. 이것을 동결건조하여 수득된 동결건조품에 95% TFA 수용액을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응 용액을 농축한 후에, 50% 아세트니트릴 수용액에 용해시켜 동결건조하였다. 동결건조품을 HPLC(Cadenza　column　C18　75×4.6mm　전개 용매 A：0.1% TFA 수용액　B：0.1% TFA　아세트니트릴：물=90：10　경사 A：B=95：5→25：75　15분 유속 0.1ml/분)로 정제하여, 식 (9)의, C 말단이 벤질 티오에스테르인 펩티드(NH₂-Cys(Acm)-Asn(디시알로올리고)-Thr-Ser-Val-Ile-Thr-Gln-Ala-COSBn)를 제조하였다.

(9)

¹H NMR　(400 MHz, 295 K　in　D₂O, HOD=δ4.81)

7.53-7.33(m, 15 H, Ph×3),　5.37(d, 2 H, J=11.7 Hz, PhCH₂), 5.29(d, 2 H, J=11.6 Hz, PhCH₂),　5.11(s, 1H, Man4-H-1),　5.02(d, 1 H, GlcNAc1-H-1),　4.92(s, 1 H,　Man4'-H-1),　4.65-4.52(m, 3 H, GlcNAc2,5,5'-H-1),　2.91-2.78(m, 4 H, Asn-βCH₂, Cys-βCH₂),　2.67(dd, 2 H, NeuAc7,7'-H_3eq),　2.39-2.31(m, 2 H, Gln-

CH₃),　1.83(dd, 2 H, J=13.1, 13.1 Hz, NeuAc7,7'-H-3_ax),　1.38(d, 3 H, Ala-βCH₃),　1.20(d, 3 H, J=6.51 Hz, Thr-

CH₃),　1.17(d, 3 H, J=6.40 Hz, Thr-

CH₃),　0.95-0.80(m, 12 H, Val-

CH₃, Ile-

CH₃,· CH₃)

ESIMS：　Calcd　for　C₁₄₅H₂₂₃N₁₈O₇₆S：［M＋2H］²⁺　1749.8,　found.　1749.2

실시예 6

C 말단에 카르복실기를 갖는 펩티드 AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COOH를 종래 공지된 방법으로 제조하여, 원료로서 사용하였다. 당해 펩티드(0.5 mg, 1μmol)와 MS4A(10 mg), 벤질메르캅탄(3.7 mg, 30μmol)를 DMF 용매 중(0.14 ml) 아르곤 기류하 -20℃에서 1시간 동안 교반한 후, PyBOP(2.6 mg, 5μmol)와 DIPEA(0.85μl, 5μmol)를 첨가하고 17시간 동안 교반하였다. 이 후, 반응 용액에 디에틸에테르(5 ml)를 첨가하여 화합물을 침전시키고, 여과한 후에 침전물을 아세트니트릴 50% 수용액으로 회수하였다. 이것을 HPLC(Cadenza　column　C18　75×4.6mm　전개 용매 A：0.1% TFA 수용액　B：0.1% TFA　아세트니트릴：물=90：10　경사 A：B=70：30→40：60　15분 유속 0.1ml/분)로 정제하여, C 말단이 벤질 티오에스테르인 AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn를 수득하였다.

라세미체의 생성은 2% 이하였다.

ESIMS：　Calcd　for　C₃₀H₃₆N₆O₅S：　［M＋H］⁺　592.3,　found.　592.2

실시예 7

반응 온도를 0℃으로 하는 것 이외에는 실시예 6과 같이 조작하여 벤질 티오에스테르체 AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn를 수득하였다. 수득된 화합물의 매스 스펙트럼은 실시예 6의 것과 동일하였다. 라세미체의 생성은 6%였다.

실시예 8

펩티드 AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COOH(0.5 mg, 1μmol)와 MS4A(10 mg), HOBt(0.7 mg, 5μmol 또는 1.4 mg, 10μmol)를 DMF 용매 중(0.14 ml) 아르곤 기류하 0℃에서 1시간 동안 교반한 후, DIPCI(0.8μl, 5μmol 또는 1.6μl, 10μmol)와 벤질메르캅탄(3.7 mg, 30μmol)을 첨가하였다. 이하, 실시예 6과 같게 처리하여 벤질 티오에스테르체 AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn을 수득하였다. HOBt를 5 당량 사용했을 경우의 수율은 75%로, 10 당량으로의 수율은 98%였다. 수득된 화합물의 매스 스펙트럼은 실시예 6과 동일하였다. 라세미체의 생성은 각각 5%였다.

실시예 9

C 말단에 카르복실기를 갖는 펩티드 AcNH-Cys-Cys-Glu-His-COOH를 종래 공지된 방법으로 제조하여, 원료로 사용하였다. 당해 펩티드(0.5 mg, 1μmol)와 MS4A(10 mg), HOBt(1.4 mg, 10μmol)를 DMF 용매 중(0.14 ml) 아르곤 기류하 -20℃에서 1시간 동안 교반한 후, DIPCI(1.6μl, 10μmol)와 벤질메르캅탄(3.7 mg, 30μmol)을 첨가하여 반응시켰다. 이하, 실시예 6과 같게 처리하여 벤질 티오에스테르체 AcNH-Cys-Cys-Glu-His-COSBn를 얻었다.

라세미체의 생성은 2% 이하였다.

실시예 10

트리틸 클로라이드 레진(150μmol)을 고상 합성의 고상으로 사용하고, 순차적으로 아미노산을 축합시켜 펩티드를 형성하였다. 아미노산의 축합은 실시예 1과 동일하게 행하였다.

제1의 아미노산으로서 Fmoc-Leu(159.0 mg, 0.45 mmol)를 사용하여 DCM(0.9 ml) 및 DIEA(204.1μl, 1.2 mmol)에 의해 축합시켰다.

이 후에, 아미노기가 보호된 아미노산을 HOBt(101.3 mg, 0.75 mmol), DIPCI(115.4μl, 0.75 mmol), DMF(3 ml)에 의해 축합시켰다.

아미노기가 보호된 아미노산으로서 Fmoc-Pro(253.1 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Arg(Pbf)(486.6 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Tyr(tBu)(334.7 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Glu(OtBu)(319.2 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Met(278.6 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Thr(tBu)(298.1 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Cys(trt)(439.3 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Ala(233.5 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Pro(253.1 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Lys(Boc)(351.4 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Pro(253.1 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Tyr(tBu)(334.7 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Glu(OtBu)(319.2 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Ser(tBu)(287.6 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Cys(trt)(439.3 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Asp(OtBu)(308.6 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Val(254.6 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Ser(tBu)(287.6 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Val(254.6 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Ala(233.5 mg, 0.75 mmol), Fmoc-Ala(233.5 mg, 0.75 mmol), Boc-Leu(187 mg, 0.75 mmol)를 사용하여 순차적으로 축합시켰다.

수지에 AcOH：DCM：MeOH=5：4：1(1 ml)을 첨가하고 실온에서 3시간 동안 반 응시켰다. 반응 용액에 헥산을 첨가하였다. 이후 여과하여 수지를 제거하였다. 수지를 MeOH로 세정하고, 당해 용액을 농축하였다. 농축 잔사에 벤젠을 첨가하여 더욱 농축하여, 측쇄가 보호된 23개 잔기 펩티드((Boc)Leu-Ala-Ala-Val-Ser(tBu)-Val-Asp(OtBu)-Cys(trt)-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Ala-Cys(trt)-Thr(tBu)-Met-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-LeuCOOH)(10)를 수득하였다.

수득된 23개 잔기 펩티드(10)(39 mg, 10μmol)와 MS4A, 벤질메르캅탄(35.5μl, 300μmol)를 DMF 용매 중(1350μl) 아르곤 기류하 -20℃에서 1시간 동안 교반한 후, PyBOP(26 mg, 50μmol), DIPEA(8.5μl, 50μmol)를 첨가하고 2시간 동안 교반하였다. 이 후, 반응 용액에 디에틸에테르를 첨가하여 화합물을 침전시키고, 여과한 후에 침전물을 DMF로 회수하였다. 이것을 농축하고, 잔사에 95% TFA 수용액을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반 후 동결건조하였다.

동결건조품을 HPLC(Cadenza　column　C18　75×4.6mm　전개 용매 A：0.1% TFA 수용액　B：0.1% TFA　아세트니트릴：물=90：10　경사 A：B=80：20 → 40：60 15분 유속 1.0ml/분)로 정제하여, 식 (11)의, C 말단이 벤질 티오에스테르인 펩티드(Leu-Ala-Ala-Val-Ser-Val-Asp-Cys-Ser-Glu-Tyr-Pro-Lys-Pro-Ala-Cys-Thr-Met-Glu-Tyr-Arg-Pro-Leu-COSBn)를 제조하였다.

수량：20mg

라세미체의 생성율：2% 이하

ESIMS：　Calcd　for　C₁₁₈H₁₈₁N₂₇O₃₄S₄：［M＋2H］⁺²　1325.1,　found.　1325.3.

(11)

실시예 11

고상이 트리틸 레진(40μmol)인 26개 잔기 펩티드(Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Ala-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Val-Arg(Pbf)-Val-Thr(tBu)-Val-Leu-Arg(Pbf)-Gln(trt)-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Val-Thr(tBu)- Glu(OtBu)-Gly-CO-(트리틸 레진))(300 mg, 제조원: 노바 바이오 화학사)에, Cys(Thz)(46.7 mg, 0.2 mmol)를, HOBt(27.0 mg, 0.2 mmol), DIPCI(30.8μl, 0.2 mmol), DMF(1 ml)에 의해서 축합시켰다.

수지에 1% TFA/DCM 용액(1.0 ml)를 첨가하고 실온에서 2분 동안 반응시키고, 수지를 여과하여 제거하고, 반응 용액을 피리딘으로 중화하였다. 이 반응을 5회 반복하고, 반응 용액을 농축 후, 물을 첨가하고 측쇄의 보호된 펩티드를 침전시켰다. 침전물을 DMF 용액으로 회수하고, 농축하여, 측쇄 보호된 27개 잔기펩티드(Cys(Thz)-Glu(OtBu)-Tyr(tBu)-Ala-Ser(tBu)-Pro-Gly-Lys(Boc)-Ala-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Val-Arg(Pbf)-Val-Thr(tBu)-Val-Leu-Arg(Pbf)-Gln(trt)-Ala-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gln(trt)-Val-Thr(tBu)-Glu(OtBu)-Gly-COOH)(12)를 수득하였다.

수득된 27개 잔기 펩티드(12)(10μmol)와 MS4A(20 mg), 티오페놀(30.6μl, 300μmol)를 DMF 용매 중(1.36μl) 아르곤 기류하 -20℃에서 1시간 동안 교반한 후, PyBOP(8.6 mg, 50μmol), DIPEA(26.0μl, 50μmol)를 첨가하고 4시간 동안 교반하였다. 그 후, 반응 용액에 디에틸에테르를 첨가하고 화합물을 침전시키고, 여과한 후에 침전물을 DMF로 회수하였다. 이것을 농축하고 수득된 농축물에 95% TFA 수용액을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하여 제거하고, 반응 용액을 농축한 후에, 50% 아세트니트릴 수용액에 녹여 동결건조하였다. 동결건조품을 HPLC(Cadenza　column　　C18　75×4.6mm　전개 용매 A：0.1% TFA 수용액　B：0.1% TFA　아세트니트릴：물=90：10　경사 A：B=95：5→25：75　15분 유속 0.1ml/분)로 정제하여, 식 (13)의, C 말단이 페닐 티오에스테르인 펩티드(Cys(Thz)-Glu-Tyr-Ala-Ser-Pro-Gly-Lys-Ala-Thr-Glu-Val-Arg-Val-Thr-Val-Leu-Arg-Gln-Ala-Asp-Ser-Gln-Val-Thr-Glu-Gly-COSPh)를 제조하였다.

수량：5mg

라세미체의 생성율：1% 이하

ESIMS：　Calcd　for　C₁₂₈H₂₀₄N₃₆O₄₃S₂：［M＋2H］⁺²　1499.7,　found.　1499.8.

(13)

실시예 12

고상이 트리틸 레진(40μmol)인 17개 잔기 펩티드(Ala-Ala-Thr(tBu)- Tyr(tBu)-Met-Met-Gly-Asn-Glu(OtBu)-Leu-Thr(tBu)-Phe-Leu-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Gly-CO(트리틸 레진))(500 mg, 제조원: 노바 바이오 화학사)에, Cys(Thz)(46.7 mg, 0.2 mmol)를, HOBt(27.0 mg, 0.2 mmol), DIPCI(30.8μl, 0.2 mmol), DMF(1 ml)에 의해서 축합시켰다.

수지에 1% TFA/DCM 용액을 첨가하고 실온에서 2분간 반응시키고, 수지를 여과 후 제거하고, 반응 용액을 피리딘으로 중화하였다. 이 반응을 5회 반복하고, 반응 용액을 농축한 후, 물을 첨가하고 측쇄가 보호된 펩티드를 침전시켰다. 침전물을 DMF 용액으로 회수하고, 농축하여, 측쇄가 보호된 18개 잔기 펩티드(Cys(Thz)-Ala-Ala-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Met-Met-Gly-Asn-Glu(OtBu)-Leu-Thr(tBu)-Phe-Leu-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-GlyCOOH)(14)를 수득하였다.

수득된 18개 잔기 펩티드(14)(10μmol)와 MS4A(20 mg), 벤질메르캅탄(36.0μl, 300μmol)를 DMF 용매중(1.36μl) 아르곤 기류하 -20℃에서 1시간 교반한 후, PyBOP(8.6 mg, 50μmol), DIPEA(26.0μl, 50μmol)를 첨가하고 4시간 교반하였다. 그 후, 반응 용액에 디에틸에테르를 첨가하고 화합물을 침전시켜, 여과 한 후에 침전물을 DMF로 회수하였다. 이것을 농축하여 수득된 농축물에 95% TFA(에탄디티올(EDT)를 포함한다) 수용액을 첨가하고 실온에서 2시간 교반하였다.수지를 여과하여 제외시키고, 반응 용액을 농축한 후에, 50% 아세트니트릴 수용액에 녹여 동결건조하였다. 동결건조품을 HPLC(Cadenza　column　C18　75×4.6mm　전개 용매 A：0.1% TFA 수용액　B：0.1% TFA/아세트니트릴：물=90：10　경사 A：B=95：5→25：75　15분 유속 0.1ml/분)로 정제하여, 식(15)의, C 말단이 벤질 티오에스테르인 펩티드(Cys(Thz)-Ala-Ala-Thr-Tyr-Met-Met-Gly-Asn-Glu-Leu-Thr-Phe-Leu-Asp-Asp-Ser-Gly-COSBn)를 제조하였다.

수량：4mg

라세미체의 생성율：1% 이하

ESIMS：　Calcd　for　C₈₉H₁₂₉N₁₉O₂₉S₄：［M＋2H］⁺²　2056.8,　found.　2057.2.

(15)

실시예 13

고상이 트리틸 레진(20μmol)인 22개 잔기 펩티드((Boc)Lys(Boc)-Ala-Met-His(trt)-Val-Ala-Gln(trt)-Pro-Ala-Val-Val-Leu-Ala-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Ile-Ala-Ser(tBu)-Phe-Gly-CO(트리틸 레진))(250 mg, 제조원: 노바 바이오 화학사)에 1% TFA/DCM 용액을 첨가하고 실온에서 2분간 반응시키고, 수지를 여과하여 제외시킨 후, 반응 용액을 피리딘으로 중화하였다. 이 반응을 5회 반복하고, 반응 용액을 농축 후, 물을 첨가하고 측쇄의 보호된 펩티드를 침전시켰다. 침전물을 DMF 용액으로 회수하고, 농축하여, 측쇄가 보호된 22개 잔기 펩티드((Boc)Lys(Boc)-Ala-Met-His(trt)-Val-Ala-Gln(trt)-Pro-Ala-Val-Val-Leu-Ala- Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Gly-Ile-Ala-Ser(tBu)-Phe-GlyCOOH)(16)를 수득하였다.

ESIMS：　Calcd　for　C₁₇₀H₂₄₅N₂₉O₃₄S₂：［M＋2H］⁺²　1652.0,　found.　1651.6

수득된 22개 잔기 펩티드(16)(7.5 mg, 2.2μmol)와 MS4A(20.0 mg), 티오페놀(6.7μl, 11.0μmol)를 DMF 용매 중(300μl) 아르곤 기류하 -20℃에서 1시간 동안 교반한 후, PyBOP(5.7 mg, 66.0μmol), DIPEA(1.7μl, 11.0μmol)를 첨가하고 4시간 교반하였다. 그 후, 반응 용액에 디에틸에테르를 첨가하고 화합물을 침전시키고, 여과한 후에 침전물을 DMF로 회수하였다. 이것을 농축시켜 수득한 농축물에 95% TFA 수용액을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반하였다. 수지를 여과하여 제외시키고, 반응 용액을 농축한 후에, 50% 아세트니트릴 수용액에 녹여 동결건조하였다. 동결건조품을 HPLC(Cadenza　column　C18　75×4.6mm　전개 용매 A：0.1% TFA 수용액　B：0.1% TFA/아세트니트릴：물=90：10　경사 A：B=95：5→25：75　15분 유속 0.1ml/분)로 정제하여, 식 (17)의, C 말단이 페닐 티오에스테르인 펩티드(Lys-Ala-Met-His-Val-Ala-Gln-Pro-Ala-Val-Val-Leu-Ala-Ser-Ser-Arg-Gly-Ile-Ala-Ser-Phe-Gly-COSPh)를 제조하였다.

수량：2mg

라세미체의 생성율：1% 이하

ESIMS：　Calcd　for　C₁₀₃H₁₆₅N₂₉O₂₆S₂：［M＋2H］⁺²　1145.9,　found.　1145.7.

(17)

실시예 14

실시예 1과 동일하게 HMPB-PEGA　레진(50μmol)을 수득하여 고상 합성의 고상으로서 사용하고, 아미노산을 축합시켜 펩티드를 형성하였다. 아미노산의 축합은 실시예 1과 같게 행하였다.

제1의 아미노산으로서 Fmoc-Phe(96.9 mg, 0.25 mmol)를 사용해 MSNT(74.0 mg, 0.25 mmol), N-메틸이미다졸(14.9μl, 187.5μmol), DCM(1 ml)에 의해서 축합시켰다.

이 후에, 아미노기가 보호된 아미노산을, HOBt(33.7 mg, 0.25 mmol), DIPCI(38.5μl, 0.25 mmol), DMF(1 ml)로 축합시켰다.

아미노기가 보호된 아미노산으로서 Fmoc-Asn(88.6 mg, 0.25 mmol), Fmoc- Cys(trt)(146.4 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Lys(Boc)(117.1 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Asn(88.6 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Gly(74.3 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Tyr(tBu)(114.9 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Thr(tBu)(99.4 mg, 0.25 mmol), Fmoc-Lys(Boc)(117.1 mg, 0.25 mmol)를 사용하여 고상 수지에 Phe-Asn-Cys(trt)-Lys(Boc)-Asn-Gly-Tyr(tBu) -Thr(tBu)-Lys(Boc)의 9개의 잔기 펩티드를 형성시켰다.

DCM 및 DMF를 사용해 세정한 후, 9개 잔기의 펩티드 3μmol에 상당하는 수지를 에펜튜브로 옮겼다.

하기 식 (18)의 당쇄 아스파라긴(12 mg, 6μmol)과 DEPBT(3 mg, 9μmol)를 DMF：DMSO=4：1(201μl)에 용해시켜, 에펜튜브에 넣었다.

(18)

　DIPEA(1.02μl, 6μmol)를 첨가하고 실온에서 20시간 교반하였다. DMF로 세정한 후에, 20% 피페리딘을 사용해 Fmoc-기를 탈보호하고, 고상 수지에 Phe-Asn-Cys(trt)-Lys(Boc)-Asn-Gly-Tyr(tBu)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Asn(올리고삭카라이드 쇄)의 10개 잔기 펩티드를 형성시켰다.

당해 10개 잔기 펩티드에, 상기한 바와 같이 HOBt, DIPCI, DMF로 아미노산을 더욱 축합시켰다.

아미노산으로서 Fmoc-Asp(1.7 mg, 0.015 mmol), Fmoc-Ser(tBu)(1.9 mg, 0.015 mmol), Fmoc-Gly(1.5 mg, 0.015 mmol), Boc-Cys(Thz)(1.7 mg, 0.015 mmol)를 사용해 순차적으로 축합시켰다.

수지에 AcOH：TFE=1：1(1 ml)을 첨가하고 실온에서 20시간 반응시켰다. 수지를 여과하여 제외시키고, 반응 용액을 농축하여, 측쇄가 보호된 14개 잔기 펩티드(Cys(Thz)-Gly-Ser(tBu)-Asp-Asn(올리고삭카라이드 쇄)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Asn-Lys(Boc)-Cys(trt)-Asn-PheCOOH)(19)를 수득하였다.

수득된 14개 잔기 펩티드(19)(11.7 mg, 3μmol)와 MS4A, 벤질메르캅탄(10.6μl, 90μmol)를 DMF 용매중(405μl) 아르곤 기류하 -20℃에서 1시간 교반한 후, PyBOP(7.8 mg, 15μmol), DIPEA(2.6μl, 15μmol)를 첨가하고 2시간 교반하였다. 그 후, 반응 용액에 디에틸에테르를 첨가하고 목적물을 침전물로서 석출시켰다. 당해 침전물을 여과에 의해 용액과 분리하고, 여과지에 남은 침전물을 아세트니트릴 50% 수용액에 용해시켜 회수하였다. 회수한 용액을 농축하고, 95% TFA 수용액을 첨가하고 실온에서 2시간 교반하였다. 그 후 동결건조하였다. 동결건조품을 HPLC(Cadenza　column　　C18　75×4.6mm　전개 용매 A：0.01% TFA 수용액　B：0.01% TFA/아세트니트릴：물=90：10　경사 A：B=80：20→40：60　15분 유속 1 ml/분)로 정제하고, 화학식 20의, C 말단이 벤질 티오에스테르인 펩티드(Cys(Thz) -Gly-Ser-Asp-Asn(올리고삭카라이드 쇄)Lys-Thr-Tyr-Gly-Asn-Lys-Cys-Asn-Phe- COSBn)를 제조하였다.

수량　3mg

라세미체의 생성은 2%이하였다.

ESIMS：　Calcd　for　C₁₃₃H₂₀₃N₂₃O₆₇S₃：［M＋2H］⁺²　1646.1,　found.　1646.4.

(20)

비교예 1

PyBOP를 DEPBT(1.5 mg, 5μmol) 또는 HBTU(1.9 mg, 5μmol)로 바꾼 이외는, 실시예 7과 동일하게 조작하여, 벤질 티오에스테르체 AcNH-His-Ala-Ala-Phe-COSBn를 수득하였다. DEPBT를 사용했을 경우의 수율은 10%, HBTU의 경우는 10% 미만이었다.

비교예 2

반응 온도를 30℃으로 한 이외는, 실시예 9와 동일하게 반응시켜 벤질 티오에스테르체 AcNH-Cys-Cys-Glu-His-COSBn을 얻었다.

라세미체의 생성은 40%였다.

[산업상사용가능성]

본 발명의 방법에 의하면, 당쇄를 갖지 않는 펩티드는 물론, 당쇄, 특히 수산기가 보호되어 있지 않은 당쇄를 갖는 당펩티드에 있어서도, 그 당쇄 구조에 영향을 주는 일 없이, 펩티드 측쇄의 보호기를 유지한 C 말단에 카르복실기를 갖는 펩티드를 제조하는 것이 가능하고, 더욱이 펩티드 C 말단의 라세미화가 거의 생기지 않는 티오에스테르 화합물을 제조할 수 있다.

수득된 펩티드의 티오에스테르 화합물을, N 말단의 아미노산이 Cys인 펩티드 fragment와 작용시킴으로써 고분자화할 수 있어 단일 구조의 당쇄를 갖는 대형의 당단백질의 제조도 가능해진다.

Claims

(A) 화학식 1의 연결기로 수식된 수지를 고상으로서 사용하여 고상 합성법으로 펩티드를 형성시키고,

(B) 묽은 염산, 묽은 황산, 포름산 및 초산으로 이루어진 그룹으로부터 1종 이상 선택된 산으로 고상과 펩티드의 결합을 절단하여, C 말단에 카르복실기를 갖는 펩티드를 제조하고,

(C) 용매 중, 1-하이드록시벤조트리아졸/디이소프로필카보디이미드 또는 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트/디이소프로필에틸아민의 존재 하에서 티올 화합물을 -20 내지 0℃에서 반응시킴을 포함함을 특징으로 하는, 펩티드의 티오에스테르 화합물의 제조 방법.

[화학식 1]

상기 식에서, R¹은 C_1-4 알킬기를 나타내고, R²는 수소 원자 또는 C_1-4 알콕시기를 나타내며, n는 1 내지 4의 정수를 나타낸다.
삭제
C 말단에 카르복실기를 갖는 펩티드를, -20℃ 내지 0℃에서 용매 중, 1-하이드록시벤조트리아졸/디이소프로필카보디이미드 또는 벤조트리아졸-1-일옥시-트리스피롤리디노포스포늄헥사플루오로포스페이트/디이소프로필에틸아민의 존재 하에서 티올 화합물과 반응시키는 것을 포함함을 특징으로 하는, 펩티드의 티오에스테르 화합물의 제조 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 펩티드의 N 말단 아미노산이 시스테인인, 제조 방법.
제4항에 있어서, 상기 시스테인의 티올기가 지용성 보호기로 보호된 펩티드인, 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 화학식 1의 연결기로 수식된 수지가, 아미노 PEGA 수지의 아미노기에 상기 화학식 1의 연결기가 결합한 수지인, 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 (B)의 공정을 알코올의 존재 하에서 수행함을 특징으로 하는, 제조 방법.
제7항에 있어서, 상기 알코올이 할로게노알코올인, 제조 방법.
제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 용매가, N,N-디메틸포름아미드, N-메틸피롤리돈으로 이루어진 그룹에서 1종 이상 선택되는, 제조 방법.
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제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 펩티드가 당펩티드인, 제조 방법.
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