KR101446526B1 - 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치 - Google Patents
마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치 Download PDFInfo
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Abstract
마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치로서, 상기 세포배양검사 장치는 복수의 정렬된 마이크로플루이딕 웰 유닛들의 어레이 구조를 가지며, 상기 마이크로플루이딕 웰 유닛은 제1 유체를 주입하기 위한 주입부, 제2 유체를 수용하기 위한 수용부, 상기 제1 유체가 흐르는 미세유체 채널 및 상기 제1 유체의 주입을 용이하게 하기 위한 공기 배출부를 포함하는 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치가 제공된다.
Description
본 명세서에 개시된 기술은 일반적으로 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치에 관한 것이다.
일반적으로 세포의 약물에 대한 반응을 관찰하기 위해서는 멀티-웰 플레이트(multi-well plate)에 세포를 넣은 다음 액체 상태의 약물을 주입하여 시간에 따른 세포의 변화를 광학 측정 장비를 이용해서 관측하여 통계적인 결과를 얻는 방식이 사용된다. 고체 배지에서의 항생제 감수성 검사의 경우, 한천 배지에 균을 뿌리고 항생제를 흡수시킨 종이를 올린 다음 균의 성장을 관찰하는 KB-테스트 방법이 있다. 액체 배지에서의 microdilution test일 경우 항생제 감수성 시험을 위해 VITEK2, Microscan, Phoenix 등의 다수의 자동화 장비가 개발되었으며, 이러한 장비를 사용하여 항생제를 밀리미터 크기의 웰에 넣은 뒤에 균을 액체 배지와 함께 주입하여서 균의 성장을 탁도를 통해 통계학적으로 관측하여 결정할 수 있다.
기존에 서로 다른 약물에 대한 세포의 반응 검사를 수행할 때 세포를 액체 또는 고체 배지에 넣고 검사하고자 하는 약물을 액체 배지와 섞거나 또는 고체 배지 위에 약물을 흡수시킨 종이 디스크를 올려 세포와 반응시킨 다음 세포의 약물에 대한 성장반응을 혼탁도(흡광도)로 측정하여 약물에 대한 반응을 측정한다. 그러나 이러한 방식은 개별 세포의 변화보다 통계학적인 정보를 수집하는 방법이고 통계학적인 결과를 얻기 위해서 세포 수가 어느 정도(보통 1ml 당 백만 개체) 이상 자라야 하기 때문에 배양 시간이 오래 걸린다(보통 16~24시간). 이 경우 약물에 대한 개별 세포에서 발생하는 변화의 관측과 운동성이 있는 개별 세포의 실시간 관측은 불가능하다. 또한 약물을 주입하는 방법에 있어서 개별 약물에 대해서 개별적으로 주입하는 과정이 필요하여 많은 수의 약물을 검사하는데 시간과 노력이 많이 요구된다. 그리고 고체 배지에서의 항생제 감수성 검사의 경우 KB-test는 약물을 올릴 수 있는 개수가 한정되어서 기본 수십 가지의 항생제의 감수성 검사를 위해서 많은 수의 한천배지 플레이트가 필요하다. 그리고 이런 검사시간을 최소화한 자동화 장비인 VITEK 시스템인 경우에도 마찬가지로 균의 탁도가 일정 수준 이상 증가해야 하기 때문에 비교적 오랜 시간(12시간 정도)이 소요되는 한계가 있다. 또한 기존 방법은 테스트 환경이 인체 내 환경과 다르므로 실제로 인체 내 일어나는 현상과 많은 차이점이 있을 수 있다(Gregory G. Anderson, et al.(2003), "Intracellular Bacterial Biofilm-Like Pods in Urinary Tract Infections", Science 301, 105; Gallo et al.(2011), "Demonstration of Bacillus cereus in Orthopaedic-Implant-Related Infection with Use of a Multi-Primer Polymerase Chain Reaction-Mass Spectrometric Assay.", J Bone Joint Surg Am, 93).
따라서 종래 기술보다 정확하고 신속한 항생제 감수성 검사 기술의 개발이 요구된다.
본 발명의 일 측면에 따르면, 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치로서, 상기 세포배양검사 장치는 복수의 정렬된 마이크로플루이딕 웰 유닛들의 어레이 구조를 가지며, 상기 마이크로플루이딕 웰 유닛은 제1 유체를 주입하기 위한 주입부, 제2 유체를 수용하기 위한 수용부, 상기 제1 유체가 흐르는 미세유체 채널 및 상기 제1 유체의 주입을 용이하게 하기 위한 공기 배출부를 포함하되, 상기 미세유체 채널은 상기 제1 유체가 흘러 상기 미세유체 채널 내부를 채우도록 상기 주입부 및 상기 공기 배출부와 연통되고, 상기 수용부는 상기 제2 유체를 투입하고 상기 제2 유체를 보유하기 위한 웰 형태를 가지며, 상기 제1 유체와 상기 제2 유체가 서로 만나 계면을 형성할 수 있도록 상기 수용부의 하단 측면의 일부분이 상기 미세유체 채널의 측면의 일부분과 연통되어 이루어진 모세관 밸브를 구비한 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치가 제공된다.
일 구현예에 따르면, 상기 마이크로플루이딕 웰 유닛의 규격이 상용 멀티-웰플레이트의 각 웰의 규격에 상당할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 각 웰들이 1x1, 1x2, 1x4, 2x4, 4x6, 12x8, 24x16 또는 48x32의 웰 배열을 가질 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 미세유체 채널이 상기 수용부 주위를 둘러싸며 배치되어 상기 마이크로플루이딕 웰 유닛이 사각형 구조를 가질 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상기 모세관 밸브는 상기 제1 유체의 주입시 상기 수용부로 유입되지 않도록 두께와 너비가 정해질 수 있다.
본 발명의 다른 측면에 따르면, 마이크로플루이딕 웰 유닛들이 복수로 정렬되어 형성된 어레이 구조를 가지는 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석 방법이 제공된다. 상기 마이크로플루이딕 웰 유닛은 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액을 주입하기 위한 주입부; 생리활성물질을 수용하기 위한 수용부; 상기 주입부와 연통되며 상기 액상 매질이 흐르기 위한 미세유체 채널; 상기 미세유체 채널의 하단 측면의 일부분과 상기 수용부의 측면의 일부분이 연통되어 형성된 모세관 밸브;를 포함한다. 상기 세포의 분석 방법은 (a) 상기 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액을 상기 주입부에 주입하여 상기 미세유체 채널 내부를 채우고, 상기 혼합용액을 고화하여 고체 박막을 형성하는 단계; (b) 상기 생리활성물질을 상기 수용부에 투입하고, 상기 모세관 밸브를 통하여 상기 생리활성물질을 상기 고체 박막에 확산시키는 단계; 및 (c) 상기 혼합용액과 상기 생리활성물질이 서로 만나 형성된 계면에서 일어나는 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하는 단계;를 포함하는 세포의 분석 방법을 포함한다.
일 구현예에 따르면, 상기 (a) 단계는 (a-1) 상기 생물학적 물질을 함유한 용액을 상기 주입부에 주입하여, 상기 미세유체 채널의 일부를 채우는 단계; 및 (a-2) 상기 고형화제를 함유한 액상 매질을 상기 주입부에 추가로 주입하여 상기 액상 매질이 층류를 형성하도록 하며 상기 미세유체 채널 내부를 채움으로써, 상기 미세유체 채널의 상부 및 하부 벽면 쪽에 상기 생물학적 물질의 단일층을 형성하도록 하는 단계를 포함할 수 있다.
일 구현예에 따르면, 상술한 세포의 분석 방법은 (d) 상기 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치를 나타낸다.
도 3은 마이크로플루이딕 웰 유닛의 단면을 나타낸다.
도 4는 96 웰 칩 디자인을 갖는 세포배양검사 장치를 이용하여 이미징을 하는 과정을 나타내는 개념도이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 나타낸다.
도 6은 MAC 칩을 이용하여 E. Faecalis 균주에 대한 페니실린 항생제의 MIC 값을 신속하게 결정할 수 있음을 나타낸 실험결과 사진이다.
도 7은 MAC 칩을 이용하여 항생제에 반응하는 바이오필름 형상을 연구하는 일 구현예를 나타낸 사진이다.
도 8은 아가로즈와 균액을 혼합한 상태에서 아가로즈 안에 있는 그람 음성균이 베타 락탐 항생제 상태에서 균이 자라는 형태를 농도 별로 구분한 것을 나타낸다.
도 9는 도 8에 나타난 현상을 좀더 자세히 설명한 그림이다.
도 10은 도 9에서 설명한 현상을 E.coli 균주에서 베타락탐 항생제에서 나타나는 것을 나타낸 예시이다.
도 11은 박테리아 단일층 이미징을 위해 미세유체 채널 내에 원료를 도입하는 방식을 나타낸다.
도 12는 균을 단일층으로 형성을 시킨 상태에서 항생제 농도 별로 균이 자라는 형태를 관찰한 이미지이다.
도 13은 P. aeruginosa 균주가 베타 락탐 항생제인 aztreonam 상태에서 MIC 이하에서와 이상에서 균의 성장을 나타내는 그림이다.
도 14 및 도 15는 항생제 없이 두 균주가 모두 자랄 경우나 두 개의 균이 모두 항생제에 내성을 나타낼 때 균의 이미지로 중복감염 측정이 가능함을 보인 광학현미경 이미지이다.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 포유류 3D 세포 배양을 하는 과정을 나타낸다.
도 17은 MAC 칩을 이용한 단일 세포 모폴로지 분석(SCMA)으로 4가지 임상균주에 대한 MIC 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 마이크로플루이딕 웰 유닛의 단면을 나타낸다.
도 4는 96 웰 칩 디자인을 갖는 세포배양검사 장치를 이용하여 이미징을 하는 과정을 나타내는 개념도이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 나타낸다.
도 6은 MAC 칩을 이용하여 E. Faecalis 균주에 대한 페니실린 항생제의 MIC 값을 신속하게 결정할 수 있음을 나타낸 실험결과 사진이다.
도 7은 MAC 칩을 이용하여 항생제에 반응하는 바이오필름 형상을 연구하는 일 구현예를 나타낸 사진이다.
도 8은 아가로즈와 균액을 혼합한 상태에서 아가로즈 안에 있는 그람 음성균이 베타 락탐 항생제 상태에서 균이 자라는 형태를 농도 별로 구분한 것을 나타낸다.
도 9는 도 8에 나타난 현상을 좀더 자세히 설명한 그림이다.
도 10은 도 9에서 설명한 현상을 E.coli 균주에서 베타락탐 항생제에서 나타나는 것을 나타낸 예시이다.
도 11은 박테리아 단일층 이미징을 위해 미세유체 채널 내에 원료를 도입하는 방식을 나타낸다.
도 12는 균을 단일층으로 형성을 시킨 상태에서 항생제 농도 별로 균이 자라는 형태를 관찰한 이미지이다.
도 13은 P. aeruginosa 균주가 베타 락탐 항생제인 aztreonam 상태에서 MIC 이하에서와 이상에서 균의 성장을 나타내는 그림이다.
도 14 및 도 15는 항생제 없이 두 균주가 모두 자랄 경우나 두 개의 균이 모두 항생제에 내성을 나타낼 때 균의 이미지로 중복감염 측정이 가능함을 보인 광학현미경 이미지이다.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 포유류 3D 세포 배양을 하는 과정을 나타낸다.
도 17은 MAC 칩을 이용한 단일 세포 모폴로지 분석(SCMA)으로 4가지 임상균주에 대한 MIC 측정 결과를 나타낸 것이다.
이하, 첨부한 도면들을 참조하여, 본 발명의 구현예들을 보다 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 구현예들에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 단지, 여기서 소개되는 구현예들은 개시된 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다. 도면에서 각 장치의 구성요소를 명확하게 표현하기 위하여 상기 구성요소의 폭이나 두께 등의 크기를 다소 확대하여 나타내었다. 전체적으로 도면 설명시 관찰자 시점에서 설명하였고, 일 요소가 다른 요소 위에 위치하는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 일 요소가 다른 요소 위에 바로 위치하거나 또는 그들 요소들 사이에 추가적인 요소가 개재될 수 있다는 의미를 모두 포함한다. 또한, 해당 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명의 사상을 다양한 다른 형태로 구현할 수 있을 것이다. 그리고, 복수의 도면들 상에서 동일 부호는 실질적으로 서로 동일한 요소를 지칭한다.
한편, 본 발명에서 서술되는 용어의 의미는 다음과 같이 이해되어야 할 것이다. “제1 ” 또는“제2 ” 등의 용어는 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하기 위한 것으로 이들 용어들에 의해 권리범위가 한정되어서는 아니 된다. 예를 들어, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소도 제1 구성요소로 명명될 수 있다.
또, 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한 복수의 표현을 포함하는 것으로 이해되어야 하고, “포함하다” 또는 “가지다”등의 용어는 기술되는 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 또, 방법 또는 제조 방법을 수행함에 있어서, 상기 방법을 이루는 각 과정들은 문맥상 명백하게 특정 순서를 기재하지 않은 이상 명기된 순서와 다르게 일어날 수 있다. 즉, 각 과정들은 명기된 순서와 동일하게 일어날 수도 있고 실질적으로 동시에 수행될 수도 있으며 반대의 순서대로 수행될 수도 있다.
도 1 및 도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치를 나타낸다. 도 1은 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치를 위에서 본 사시도이고, 도 2는 아래에서 본 사시도이다.
도 1을 참조하면, 세포배양검사 장치(100)의 윗 부분은 제1 유체 및 제2 유체가 도입되도록 주입부(120), 수용부(130) 및 공기 배출부(150)가 외부에 개방된 구조를 갖는다. 도 2를 참조하면, 세포배양검사 장치(100)의 아래 부분은 윗 부분과 달리 상기 제1 유체 및 상기 제2 유체를 수용하도록 외부로부터 밀폐된 구조를 갖는다.
도 1 및 도 2를 참조하면, 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치(100)는 복수의 정렬된 마이크로플루이딕 웰 유닛들(110)의 어레이 구조를 가진다. 마이크로플루이딕 웰 유닛(110)은 제1 유체를 주입하기 위한 주입부(120), 제2 유체를 수용하기 위한 수용부(130), 상기 제1 유체가 흐르는 미세유체 채널(140) 및 상기 제1 유체의 주입을 용이하게 하기 위한 공기 배출부(150)를 포함한다. 상기 마이크로플루이딕 웰 유닛(110)이 다수 정렬되어 전체적으로 상용 멀티-웰 플레이트와 유사한 규격을 가질 수 있다. 바람직하게는 마이크로플루이딕 웰 유닛(110)의 중심이 상용 멀티-웰의 중심과 일치한다.
화학적, 생화학적, 및/또는 생물학적 분석에 있어서 멀티-웰 플레이트는 다수의 샘플을 처리하고 분석하기 위한 표준 도구이다. 멀티-웰 플레이트는 다양한 형태, 크기 및 모양을 취할 수 있는데, 일반적으로 표준 크기 및 모양으로 만들어지고, 웰들의 표준 배열을 가진다. 웰들의 표준 배열은 96-웰 플레이트(12x8의 웰 배열), 384-웰 플레이트(24x16의 웰 배열), 및 1536-웰 플레이트(48x32의 웰 배열)에서 발견되는 것을 포함하며, 기타 다양한 방식의 상용 멀티-웰 플레이트가 있다.
세포배양검사 장치(100)가 상용 멀티-웰 플레이트와 유사한 규격을 가짐으로써 종래의 다양한 생물학적 분석 기술과 용이하게 호환될 수 있다.
상기 제1 유체 및 상기 제2 유체는 통상적으로 물을 80중량% 또는 90중량% 이상을 분산매 또는 용매로서 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 제1 유체는 고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합 용액일 수 있다. 또한 예를 들어, 상기 제2 유체는 생리활성물질을 함유한 수용액일 수 있다. 상기 제1 유체는 세포배양검사 장치(100)의 윗 부분에 위치하며 외부에 오픈되어 있는 주입부(120)를 통해 주입되고, 상기 제2 유체는 마찬가지로 수용부(150)의 윗 쪽 개구부를 통해 주입되며, 특별한 펌프 장치를 사용하거나 피펫팅을 통해 도입될 수 있다.
수용부(150)는 상기 제2 유체를 투입하고 상기 제2 유체를 보유하기에 충분한 크기의 공간을 가지는 웰 형태를 가진다. 상기 웰의 부피는 특별히 제한되지 않지만 제2 유체를 주입한 후 장시간 동안 반응을 관찰하기 위해 충분한 크기를 가질 수 있으며, 바람직하게는 100㎕ 내지 2000㎕일 수 있다.
미세유체 채널(140)은 상기 제1 유체가 흘러 미세유체 채널(140) 내부를 채우도록 주입부(120) 및 공기 배출부(150)와 연통된다. 통상 미세유체 채널(140)은 너비가 예를 들어 수백 ㎛ 내지 수 mm 수준이고, 깊이( 또는 두께)가 수백 ㎛ 수준으로 추후 이미징이 용이하고 모세관 현상에 의해 상기 제1 유체가 미세유체 채널(140) 내부를 채울 수 있는 규격을 갖는다. 상기 제1 유체가 고형화제를 함유한 액상 매질일 경우 일정 시간 후 겔화될 수 있다. 그 결과 미세유체 채널(140) 내부를 채우는 고체 박막이 형성될 수 있다.
한편 상기 제1 유체와 상기 제2 유체가 서로 만나 계면을 형성할 수 있도록 수용부(150)의 하단 측면의 일부분이 미세유체 채널(140)의 측면의 일부분과 연통된다.
바람직하게는 세포배양검사 장치(100)의 몸체는 내부에서 일어나는 현상을 용이하게 관찰할 수 있도록 투명 재질로 이루어질 수 있다. 바람직하게는 상기 투명 재질은 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리메타크릴레이트, 폴리카보네이트와 같은 고분자 수지일 수 있다. 세포배양검사 장치(100)는 고분자 수지를 사출하는 방식으로 제조될 수 있다.
도 3은 마이크로플루이딕 웰 유닛의 단면을 나타낸다. 도 3을 참조하면, 마이크로플루이딕 웰 유닛(110)은 상용 멀티-웰플레이트의 각 웰의 규격과 유사하게 전체적으로 사각형에 가까운 구조, 예를 들어 정사각형 구조를 가진다. 미세유체 채널(140)은 수용부(130)의 주위를 둘러싸며 가급적 긴 채널 구조를 갖는다. 그 결과 주입할 수 있는 양이 증가하는 장점이 있어서 샘플을 다루기에 용이하다. 미세유체 채널(140)의 말단은 막혀 있지만, 주입부(120)를 통해 들어온 제1 유체가 흘러서 미세유체 채널(140) 내부를 용이하게 채우도록 미세유체 채널(140)이 공기 배출부(150)와 연통된다. 상기 제1 유체는 아가로즈와 같은 고형화제를 함유한 액상 매질일 수 있다. 상기 액상 매질에는 박테리아와 같은 생물학적 물질이 포함될 수 있다. 상기 제1 유체는 모세관 현상에 의해 미세유체 채널(140)을 채우게 되는데, 이때 미세유체 채널(140)과 수용부(130)와 연통되는 부분, 즉 모세관 밸브(160)의 존재에 의해 상기 제1 유체는 수용부(130) 쪽으로는 유입되지 않으면서 상기 제1 유체가 상기 제2 유체와 계면을 형성하도록 한다. 즉 모세관 밸브(160)의 두께와 너비는 모세관 현상을 유지하도록 제어되며, 통상 100 내지 500㎛의 두께, 500㎛ 내지 2mm의 너비를 가진다. 모세관 밸브(160)가 상기 범위의 두께와 너비를 가질 경우 상기 제1 유체가 수용부(130) 쪽으로 넘치지 않고 미세유체 채널(140)을 채우게 된다. 한편 미세유체 채널(140)의 말단 쪽에는 공기 배출부(150)가 위치하며 공기 배출부(150)는 미세유체 채널(140)의 상부 벽과 연통되어 대기에 노출됨으로써 상기 제1 유체가 미세유체 채널(140)을 채움에 따라 미세유체 채널(140) 내부의 공기가 대기로 배출되도록 하는 역할을 한다.
도 4는 96 웰 칩 디자인을 갖는 세포배양검사 장치를 이용하여 이미징을 하는 과정을 나타내는 개념도이다. 몇몇 구현예에서 제1 유체로서 아가로즈 용액을 미세유체 채널에 도입하는 경우가 많으므로 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 미세유체 아가로즈 채널(Microfluidic agarose channel, MAC) 칩으로도 명명할 수 있다.
도 4를 참조하면, 박테리아(bacteria)를 함유한 아가로즈 용액이 세포배양검사 장치의 주입부를 통해 도입되어 미세유체 채널을 채운다. 이후 아가로즈 용액이 겔화되고, 수용부를 통해 항생제(antibiotics) 용액이 도입되면, 항생제가 미세유체 채널과 수용부 사이의 연통된 부분을 통해 겔화 아가로즈/항생제 용액의 계면을 형성한다. 다음 계면을 관통하여 항생제가 겔화 아가로즈 쪽으로 확산이 되면서 박테리아와 만나게 된다. 전체적으로 겔화 아가로즈는 고체 박막을 형성하므로, 박테리아는 고정되고 이때 박테리아의 반응성을 단일 세포(single cell) 단위로 이미징 시스템을 통해 관찰할 수 있다. 더욱 자세한 내용은 후술하기로 한다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 항생제 감수성 검사를 하는 과정을 나타낸다.
먼저 고형화제(gelling agent)를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질(biological agent)의 혼합 용액을 만든다.
상기 액상 매질은 약 95% 이상의 물을 포함할 수 있으며 고형화제의 존재에 의해 고체화될 수 있다. 고형화제의 예로 한천(agar), 아가로즈(agarose), 젤라틴(gelatin), 알기네이트(alginate), 콜라겐(collagen), 피브린(fibrin) 등을 들 수 있다. 바람직하게는 한천 또는 아가로즈가 사용될 수 있다. 일 예로 액상 매질 내에는 한천이 0.5 내지 4 중량%가 사용될 수 있다. 통상적으로 액상 매질은 영양성분을 필요로 하지 않지만, 몇몇 예에 있어 영양성분을 포함할 수도 있다.
상기 생물학적 물질은 바이러스, 박테리아, 균류, 조류, 원생동물, 기생 병원균, 사람 또는 포유류의 세포 및 바이오필름 등을 포함한다. 상기 생물학적 물질은 액상 또는 고상의 배지 내에서 성장할 수 있고 외부 생리활성물질의 종류 및 농도에 따라 성장에 영향을 받을 수 있다. 상기 혼합 용액 내에서의 상기 생물학적 물질의 밀도는 102 내지 1010 cells/ml, 바람직하게는 104 내지 1010 cells/ml, 더 바람직하게는 105 내지 109 cells/ml 일 수 있다. 상기 범위 미만에서는 생물학적 물질의 위치를 파악하기 어려울 수 있고 상기 범위 초과에서는 개별적인 생물학적 물질의 상태를 파악하기 어려울 수 있다.
그리고 주입부(inlet)를 통해 예를 들어 10-12㎕의 혼합 용액을 주입하면, 균이 들어 있는 아가로즈가 채널을 따라 이동하게 된다. 혼합 용액이 채널을 채움에 따라 공기 배출부를 통해 공기가 빠져나가면서 용이하게 혼입 용액이 채널 내에 도입될 수 있다.
상기 혼합 용액을 고화시켜 상기 생물학적 물질이 고정된 고체 박막을 형성한다. 높은 온도에서 액상 매질의 온도가 내려감에 따라 매질이 고화됨으로써 상기 생물학적 물질의 움직임이 저하된다. 상기 고정에 의하여 운동성이 있는 상기 생물학적 물질을 계속해서 용이하게 관찰할 수 있다.
상기 세포배양검사 장치는 바람직하게는 광학 이미징을 위해 투명 재질로 이루어질 수 있다. 상기 세포배양검사 장치의 미세유체 채널은 액상 매질이 도포되어 고화되어 고체 박막이 형성될 수 있다. 상기 주입부를 통해 상기 액상 매질이 투입되고 고화 과정을 거치는데, 상기 미세유체 채널의 깊이에 따라 고체 박막의 두께가 결정될 수 있다. 상기 미세유체 채널의 깊이는 1㎛ 내지 5mm, 또는 1㎛ 내지 3mm, 또는 1㎛ 내지 2mm, 또는 1㎛ 내지 1.5mm, 또는 1㎛ 내지 1mm, 또는 1㎛ 내지 800㎛, 또는 1㎛ 내지 500㎛, 1㎛ 내지 100㎛, 또는 10㎛ 내지 3mm, 또는 100㎛ 내지 500㎛, 또는 10㎛ 내지 1mm, 또는 100㎛ 내지 1mm, 또는 200㎛ 내지 1mm, 또는 500㎛ 내지 1mm, 100㎛ 내지 500㎛ 중 어느 하나의 범위일 수 있다. 바람직하게는 상기 미세유체 채널의 깊이는 100㎛ 내지 500㎛이다.
한편, 상기 미세유체 채널의 너비는 이미지 영역의 크기를 고려할 때, 100㎛ 내지 5mm, 또는 300㎛ 내지 5mm, 또는 500㎛ 내지 3mm, 또는 1mm 내지 3mm일 수 있다. 바람직하게는 상기 미세유체 채널의 너비는 1mm 내지 3mm이다.
상기 미세유체 채널의 형상이나 길이는 특별히 제한되지 않지만 상기 규격과 너비를 유지하면서 가능한한 많은 양의 혼합 용액(고형화 물질 및 생물학적 물질을 함유한 액상 매질)이 도입될 수 있는 것이 항생제와의 반응을 정확하게 제어하는 데 용이하다. 바람직하게는 마이크로플루이딕 웰 유닛이 상용 멀티-웰의 단일 웰 크기에 상당하는 규격을 가지면서 가급적 긴 채널을 갖도록 상기 미세유체 채널이 상기 수용부 주위를 둘러싼 형태를 가질 수 있다.
상기 고체 박막의 두께와 너비는 상기 미세유체 채널의 깊이와 너비에 따라 정해진다. 본 명세서에서 "박막"이라 함은 상기 생물학적 물질을 고정하여 단일 세포 단위로 관찰할 수 있을 정도면 두께가 특별히 제한되지 않으나, 대체로 1㎛ 내지 5mm, 또는 1㎛ 내지 3mm, 또는 1㎛ 내지 2mm, 또는 1㎛ 내지 1.5mm, 또는 1㎛ 내지 1mm, 또는 1㎛ 내지 800㎛, 또는 1㎛ 내지 500㎛, 1㎛ 내지 100㎛, 또는 10㎛ 내지 3mm, 또는 100㎛ 내지 500㎛ 또는 10㎛ 내지 1mm, 또는 100㎛ 내지 1mm, 또는 200㎛ 내지 1mm, 또는 500㎛ 내지 1mm 중 어느 하나의 범위를 갖는 얇은 층을 의미한다. 여기서 고체 박막의 두께는 관찰하고자 하는 고체 박막 면에 대한 수직방향의 크기에 해당할 수 있다. 고체 박막은 상술한 범위의 두께를 가지므로 내부에 고정된 생물학적 물질을 개별 세포(single cell) 단위로 관찰할 수 있다.
다음 생리활성물질을 수용부의 개구부를 통해 수용부 내에 도입하여, 상기 생리활성물질이 상기 고체 박막 내부로 확산되도록 한다. 본 명세서에서 상기 생리활성물질은 항생제, 항암제, 면역억제제와 같은 약물, 영양성분, 세포분비물, 신호전달물질, 바이러스, 세포, micro RNA, 단백질, 항원, 항체, DNA 등 중 어느 하나를 포함할 수 있다. 상기 수용부는 충분한 양의 생리활성 물질을 담기 위해 예를 들어 각각 약 3mm 내지 15 mm 크기의 직경과 높이를 가지는 것이 좋다. 그리하여 한번의 원료 주입 후 장시간 동안 반응을 유지하면서 관찰함이 용이하다.
다음 상기 생리활성물질에 대한 상기 생물학적 물질의 반응을 관찰한다. 상기 생물학적 물질이 상기 고체 박막에 고정됨으로써 2차원적으로 분포하게 되어 결과적으로 단일 세포 단위로 관찰이 가능하다. 일반적으로 개별 세포의 성장변화는 수십 분(보통 30분) 이내에 관찰이 가능하기 때문에 생물학적 물질에 대한 생리활성물질의 영향을 기존 방식에 비해 정확하고 빠르게 확인할 수 있다. 예를 들어 박테리아 세포에 대해서 생리활성 검사를 수행할 경우 3~4시간 이내에 검사를 끝낼 수 있다. 본 명세서에서 이러한 빠른 생리활성 검사 방법을 단일 세포 모폴로지 분석(single-cell morphological analysis, SCMA)라고 칭하기로 한다. 상술한 MAC 시스템을 이용하면 다양한 항생제 조건 하에서 단일 세포 모폴로지의 변화를 시간 경과 이미징(time-lapse imaging)으로 관찰할 수 있다.
관찰을 위해 광학 측정장치가 사용될 수 있다. 상기 광학 측정장치는 CCD 또는 CMOS 카메라와 같은 이미지화 시스템을 포함할 수 있다. 상기 광학 측정장치는 또한 초점을 맞추고 빛을 이미지화하는 데 필요한 렌즈, 조명 및 빛 가이드 등을 포함할 수 있다. 또한 상기 광학 측정장치는 카메라에 의해 관찰된 이미지 데이터를 가공 및 분석하기 위한 이미지 처리 시스템을 포함할 수 있다. 상기 광학 측정장치는 검사 과정에 나타난 생물학적 물질의 성장변화를 빠른 속도로 기록하고 분석하여 검사 결과를 얻는다. 상기 미세유체 채널과 상기 수용부가 접하는 계면 주위가 이미징 영역이 되는데 상기 이미징 영역은 약 300㎛*300㎛ 내지 500㎛*500㎛의 크기를 가질 수 있다. 적어도 미세유체 채널은 상기 이미징 영역보다 큰 너비를 가진다.
결국, 생물학적 물질의 고정과 생리활성물질의 확산방식을 이용하는 상술한 검사 방법을 이용하면 약물 검사에 필요한 약물 및 세포의 양이 종래 기술에 비해 대폭 저감될 수 있고, 단일 세포의 성장변화를 빠른 속도로 추적할 수 있어 빠르면 2 시간 이내에 보통 3~4 시간에 빠른 약물 검사 결과를 얻을 수 있는 장점이 있다. 이는 현재까지 알려진 최고의 검사속도이다.
도 6은 MAC 칩을 이용하여 E. Faecalis 균주(strain)에 대한 페니실린 항생제(anibiotic)의 최소억제농도(MIC) 값을 신속하게 결정할 수 있음을 나타낸 실험결과 사진이다. 이 실험을 위해서 E. Faecalis 균액을 액상의 아가로즈에 섞은 뒤에 균일하게 혼합한 후에 칩에 주입하였다. 그리고 아가로즈가 상온에서 굳은 뒤에 액상으로 만든 페니실린(penicillin) 항생제를 항생제 웰 공간에 주입하였다. 그리고 나서 37℃ 배양기에 넣어서 배양(incubation)을 시키고 4시간 후에 그 결과를 관찰하였다.
도 6을 참조하면 0.5 내지 8 ㎍/ml 범위의 다양한 항생제 농도를 이용하여 감수성 검사를 한 결과 페니실린의 MIC가 2 ㎍/ml임을 4 시간 내에 얻을 수 있었다. 이는 MDT 테스트 (micro-dilution test) 결과(18시간 소요)보다 훨씬 빠른 속도임을 알 수 있다.
미세유체 채널을 사용함으로써 필요한 생물학적 물질과 생리활성물질의 양이 줄어들어 저렴한 비용으로 생리활성 검사를 할 수 있다. 또한 미세유체 채널 시스템을 이용하면 하나의 생물학적 물질에 대해 다양한 종류 및 농도의 생리활성물질에 대한 반응을 한번에 관찰할 수 있는 장점이 있다.
상술한 MAC 칩은 항생제 감수성 시험 뿐 아니라 바이오필름 어세이(biofilm assay)에도 매우 유용하게 활용할 수 있다. 바이오필름은 미생물이 감염되거나 부착된 부분에서 나타나며, 폴리머 기질로 감싸인 미생물에 의해 형성된 점액질의 미생물 복합체를 이루는 막이다. 바이오필름의 형성은 사람의 건강에도 중대한 영향을 끼칠 수 있다. 바이오필름에 의한 감염증으로 폐 감염증, 중이염, 치주염 등이 있다 그런데 바이오필름 내의 세균은 부유 상태보다 항생물질에 대한 내성이 1000배 이상이 되어 문제가 된다. 종래 바이오필름을 연구하기 위한 방법으로 플로우 셀 시스템(flow cell system)이나 웰 기반의 시스템(well based system) 등을 이용한 방법들이 있었으나 이들 어세이 시스템들은 바이오필름 형성을 위해 수일 간의 장시간이 요구되며, 관찰을 위해서는 염색을 해야하고, 콘포컬 현미경(confocal microscope)을 이용해야 하는 등의 어려운 면들이 있었다. 또한 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC)나 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정할 경우 추가적인 실험이 필요하다. 또한 이러한 시스템들은 크기가 매우 클 뿐 아니라, 바이오필름 형성 단계들(biofilm formation stages)을 분명하게 보여주지 못하고 박테리아 감염에 있어 체내(in vivo) 바이오필름 형성을 대표하지 못한다.
따라서 바이오필름의 형성과정과 항생제에 대한 반응성을 연구하기 위한 효율적인 시스템이 요구되며 본 발명의 일 구현예에 따른 MAC 칩은 훌륭한 대안이 될 수 있다.
도 7은 MAC 칩을 이용하여 항생제에 반응하는 바이오필름 형상을 연구하는 일 구현예를 나타낸 사진이다. 이 실험을 위해서 E. Faecalis 균액을 액상의 아가로즈에 섞은 뒤에 균일하게 혼합한 후에 칩에 주입하였다. 그리고 아가로즈가 상온에서 굳은 뒤에 액상으로 만든 penicillin 항생제를 MAC 칩의 수용부에 주입하였다. 그리고 나서 37℃ 배양기에 넣어서 배양을 시키고 4시간 후에 그 결과를 관찰하였다. 균은 아가로즈에 의해서 둘러 싸여 있기 때문에 고정이 되어 있다. 이 상태에서 균은 계속해서 분열하면서 균집단을 형성하여 바이오필름을 구성한다.
어떤 종류의 균은 특정 항생제에 대하여 MIC 이상의 농도에서 필라멘트로 자라는데 이 경우 균이 마치 분열하며 성장하는 것과 잘 구분이 되지 않아 MIC 결정에 어려움이 있을 수 있다.
도 8은 아가로즈와 균액을 혼합한 상태에서 아가로즈 안에 있는 그람 음성균이 베타 락탐 항생제 상태에서 균이 자라는 형태를 농도 별로 구분한 것을 나타낸다. 도 8을 참조하면, MIC 이상의 농도에서도 여전히 균이 자라는 것과 같은 형상을 관찰할 수 있다. 그러나 MDT 결과에서는 0.06 ㎍/ml에서 균의 성장이 억제되는 것이 관찰되었다.
도 9는 도 8에 나타난 현상을 좀더 자세히 설명한 그림이다. 이 실험은 균과 아가로즈를 섞은 상태에서 항생제를 MIC 아래와 위의 값을 가지도록 농도를 조절해서 주입했을 때의 결과를 나타낸다. MIC 이상의 농도에서 필라멘트로 성장하는 것(도 9의 아래)이 MIC 아래 농도에서 분열하는 것(도 9의 위)과 유사하게 보이게 됨을 나타낸다. 도 10은 도 9에서 설명한 현상을 E.coli 균주에서 베타락탐 항생제에서 나타나는 것을 나타낸 예시이다. MIC 아래 농도에서 분열하는 것과 MIC 이상에서 필라멘트로 자라는 것이 구분이 되지 않아서 MIC 결정에 어려움이 있다. 따라서 이미징 영역 내에 박테리아의 단일층이 형성되는 구조를 만든다면 보다 정밀한 관찰이 가능하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면 단일 초점 단일층 관찰이 가능한 항생제 감수성 검사방법이 제공된다.
통상적으로 균과 아가로즈 함유 액상매질이 균일하게 섞인 혼합액을 미세유체 채널에 주입을 하면 확률적으로 일정 수의 균이 바닥에 존재하게 되어서 단일층을 형성할 수 있다. 보다 나은 단일층의 형성을 위해 바람직하게는 원료인 균과 아가로즈 함유 액상매질을 미세유체 채널에 순차적 주입하는 방식이 고려될 수 있다.
도 11은 박테리아 단일층 이미징을 위해 미세유체 채널 내에 원료를 도입하는 방식을 나타낸다. 도 11을 참조하면, 먼저 세포배양검사 장치의 주입부를 통해 미세유체 채널 내에 박테리아 배양액을 도입한다. 이때 바람직하게는 미세유체 채널의 일정 공간을 남겨두고 채널의 일부만을 채우는 것이 좋으며, 예를 들어 채널부피의 약 1/3 가량을 우선 채운다. 다음 아가로즈 함유 액상매질을 추가로 상기 미세유체 채널에 도입한다. 이때 빠른 속도로 아가로즈 함유 액상매질을 주입하면 액상매질이 층류를 형성하며 채널에 도입되며, 박테리아들은 채널의 벽면 쪽(너비 및 깊이를 고려할 때 주로 채널의 윗쪽 및 아래쪽 벽면)으로 몰리게 된다. 결국 박테리아들이 벽면 쪽에 단일 층에 가깝게 분포하게 될 수 있다.
도 12는 균을 단일층으로 형성을 시킨 상태에서 항생제 농도 별로 균이 자라는 형태를 관찰한 이미지이다. MIC 이하(control, 0.06 ㎍/mL)에서는 균이 분열을 하고 MIC 이상(0.5 ㎍/mL)에서 균이 필라멘트 형태로 길어지기만 하는 것을 확인 가능하여 MIC를 판단할 수 있다. 도 13은 P. aeruginosa 균주가 베타 락탐 항생제인 aztreonam 상태에서 MIC 이하(control, 0.06 ㎍/mL)에서와 MIC 이상(0.25, 0.5 ㎍/ml)에서 균의 성장을 나타내는 그림이다. 여기에서 MIC 이하에서는 분열이 생기면서 필라멘트 형태로 자라는 것을 볼 수 있고 MIC 이상에서는 필라멘트 형태로 길어지기만 하는 것을 나타낸다. 각 도면을 참조하면 단일층 이미징에서 균이 분열하는 것을 관찰하여서 MIC 판단을 할 수 있음을 알 수 있다.
상술한 바에 따르면, 세포 관찰에 있어서 단일 초점 단일 층(Single focus mono-layer) 관찰과 3D 입체 관찰이 모두 가능하다. 즉 고형화 물질과 박테리아 세포를 섞어서 채널에 주입하면 MAC 칩의 플레이트의 바닥과 아가로즈 계면에서는 단일층으로 세포를 관찰할 수 있게 되며, 나머지 부분에서는 3D 배양 방식으로 세포를 관찰할 수 있다.
한편, 하나의 주입부를 통해 박테리아 세포와 고형화 물질(아가로즈)를 순차적으로 넣는 방식을 사용하면 박테리아 단일 층을 형성하여 단일 초점으로 관찰할 수 있다.
또한 본 발명의 세포배양검사 장치를 이용하면 이미지를 이용한 중복감염(Double infection)이 가능하다.
도 14 및 도 15는 항생제 없이 두 균주가 모두 자랄 경우나 두 개의 균이 모두 항생제에 내성을 나타낼 때 균의 이미지로 중복감염 측정이 가능함을 보인 광학현미경 이미지이다.
실험 조건은 아래와 같다.
* 균주
- E. coli ATCC 25922 (막대기형의 균주)
- E. faecalis ATCC 29212 (구형의 균주)
* 항생제
- Gentamicin (농도 : 32 ㎍/mL)
2개 모두 susceptible range
- Erythromycin (농도 : 8 ㎍/mL)
E. faecalis ATCC 29212 만 susceptible
- Control
* 배양 시간 3시간
* 균주 농도
- McFarland 0.25
* 아가로즈 농도 2%
* 관측 조건 : 100배 배율의 렌즈
0시간 이미지에서는 균의 모양을 확인하기 어렵지만 4시간이 지난 후 균이 어느 정도 분열을 했을 때에서부터 균의 모양을 관측할 수 있다. 이 때 막대기형의 균과 구형의 균이 같이 있기 때문에 두 가지 균이 있었음을 확인할 수 있고 오염 유무도 확인할 수 있다.
도 16은 본 발명의 일 구현예에 따른 세포배양검사 장치를 이용하여 포유류 3D 세포 배양을 하는 과정을 나타낸다. 이 실험을 위해서 포유류 세포(mammalian cell)를 ECM(콜라겐, 마트리젤, 피브린, 아가로즈 등)과 섞은 뒤에 채널에 주입한다. 그리고 ECM이 굳은 뒤에 배지나 약물(drug)을 주입하면 세포는 배지의 공급을 받으며 자라게 되고 약물에 의해서 죽기도 한다. 균은 이러한 환경에서 3차원 성장을 하게 되어서 3D 배양이 가능하게 된다.
도 17은 MAC 칩을 이용한 단일 세포 모폴로지 분석(SCMA)으로 4가지 임상균주에 대한 MIC 측정 결과를 나타낸 것이다. 인천 카톨릭 병원 진단의학과 이승옥 교수로부터 E.coli, E.faecalis, P.aeruginosa, S. aureus 등 4가지 균주 40여개의 환자 균주를 얻어 실험하였으며, 현미경 대물렌즈 배율은 60배로 하였다. (E. coli의 경우 40배) Mc=0.5에서 아가로즈와 섞은 다음 밑바닥에 형성된 단일 층을 관찰하였다. 그 결과 4시간 안에 MAC 칩을 이용하여 MIC를 얻을 수 있었다. 도 17을 참조하면, MAC 칩을 이용하여 측정한 MIC 값들이 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)로부터 제공받은 MIC 범위(즉, 품질 제어 범위; quality control range)와 잘 일치하는 것을 알 수 있다. 따라서 MAC칩을 이용한 단일 세포 모폴로지 분석은 매우 빠르고 정확한 AST 방법이라 할 수 있다.
이상에서는 다양한 도면 및 구현예들을 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야의 숙련된 당업자는 하기의 특허청구범위에 기재된 본 발명의 기술적 사상으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 명세서에 개시된 구현예들을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
Claims (13)
- 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치로서,
상기 세포배양검사 장치는 복수의 정렬된 마이크로플루이딕 웰 유닛들의 어레이 구조를 가지며, 상기 마이크로플루이딕 웰 유닛은 제1 유체를 주입하기 위한 주입부, 제2 유체를 수용하기 위한 수용부, 상기 제1 유체가 흐르는 미세유체 채널 및 상기 제1 유체의 주입을 용이하게 하기 위한 공기 배출부를 포함하되,
상기 미세유체 채널은 상기 제1 유체가 흘러 상기 미세유체 채널 내부를 채우도록 상기 주입부 및 상기 공기 배출부와 연통되고,
상기 수용부는 상기 제2 유체를 투입하고 상기 제2 유체를 보유하기 위한 웰 형태를 가지며,
상기 제1 유체와 상기 제2 유체가 서로 만나 계면을 형성할 수 있도록 상기 수용부의 하단 측면의 일부분이 상기 미세유체 채널의 측면의 일부분과 연통되어 이루어진 모세관 밸브를 구비한 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치. - 삭제
- 제1 항에 있어서,
상기 마이크로플루이딕 웰 유닛의 각 웰들이 1x1, 1x2, 1x4, 2x4, 4x6, 12x8, 24x16 또는 48x32의 웰 배열을 갖는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치. - 제1 항에 있어서,
상기 미세유체 채널이 상기 수용부 주위를 둘러싸며 배치되어 상기 마이크로플루이딕 웰 유닛이 사각형 구조를 갖는 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치. - 제1 항에 있어서,
상기 모세관 밸브는 상기 제1 유체의 주입시 상기 수용부로 유입되지 않도록 두께와 너비가 정해진 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치. - 삭제
- 제5 항에 있어서,
상기 모세관 밸브의 두께는 100 내지 500㎛이고, 너비는 500㎛ 내지 2mm인 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치. - 제1 항에 있어서,
상기 공기 배출부는 상기 미세유체 채널의 말단 쪽에 위치하며 상기 미세유체 채널의 상부 벽과 연통되어 대기에 노출된 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치. - 제1 항에 있어서,
상기 제1 유체는 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액이고, 상기 제2 유체는 생리활성 물질을 함유한 용액인 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치. - 제1 항에 있어서,
상기 세포배양검사 장치의 몸체가 투명 재질로 이루어진 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치. - 마이크로플루이딕 웰 유닛들이 복수로 정렬되어 형성된 어레이 구조를 가지는 마이크로플루이딕 멀티-웰 기반의 세포배양검사 장치를 이용한 세포의 분석 방법으로서,
상기 마이크로플루이딕 웰 유닛은 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액을 주입하기 위한 주입부; 생리활성물질을 수용하기 위한 수용부; 상기 주입부와 연통되며 상기 액상 매질이 흐르기 위한 미세유체 채널; 상기 미세유체 채널의 하단 측면의 일부분과 상기 수용부의 측면의 일부분이 연통되어 형성된 모세관 밸브;를 포함하며,
(a) 상기 고형화제를 함유한 액상 매질과 생물학적 물질의 혼합용액을 상기 주입부에 주입하여 상기 미세유체 채널 내부를 채우고, 상기 혼합용액을 고화하여 고체 박막을 형성하는 단계;
(b) 상기 생리활성물질을 상기 수용부에 투입하고, 상기 모세관 밸브를 통하여 상기 생리활성물질을 상기 고체 박막에 확산시키는 단계; 및
(c) 상기 혼합용액과 상기 생리활성물질이 서로 만나 형성된 계면에서 일어나는 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하는 단계;를 포함하는 세포의 분석 방법. - 제11 항에 있어서, 상기 (a) 단계는
(a-1) 상기 생물학적 물질을 함유한 용액을 상기 주입부에 주입하여, 상기 미세유체 채널의 일부를 채우는 단계; 및
(a-2) 상기 고형화제를 함유한 액상 매질을 상기 주입부에 추가로 주입하여 상기 액상 매질이 층류를 형성하도록 하며 상기 미세유체 채널 내부를 채움으로써, 상기 미세유체 채널의 상부 및 하부 벽면 쪽에 상기 생물학적 물질의 단일층을 형성하도록 하는 단계를 포함하는 세포의 분석 방법. - 제11 항에 있어서,
(d) 상기 생리활성물질에 대한 생물학적 물질의 변화를 단일 세포 단위로 관찰하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration, MIC) 또는 최소 바이오필름 박멸 농도(Minimum Biofilm Eradication Concentration, MBEC)를 측정하는 단계를 더 포함하는 세포의 분석 방법.
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