KR101410897B1

KR101410897B1 - 리포산-ｐｅｇ-펩티드 유도체, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 미백 또는 주름개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR101410897B1
Application number: KR1020120056060A
Authority: KR
Inventors: 채규윤; 이범철; 김보미; 이덕희; 록치충
Original assignee: 이스켐주식회사
Priority date: 2012-05-25
Filing date: 2012-05-25
Publication date: 2014-07-16
Anticipated expiration: 2032-05-25
Also published as: KR20130132681A

Abstract

본 발명은 리포산-PEG-펩티드 유도체, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 미백 또는 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체는 세포독성이 거의 없어 안전하며, 티로시나아제 억제활성, 멜라닌 생성 억제활성, MMP-1 억제활성 및 콜라겐의 생합성 촉진활성이 우수하게 나타나므로, 미백 또는 주름개선용 화장료 조성물의 원료로 매우 유용하게 사용할 수 있다.

Description

리포산-ＰＥＧ-펩티드 유도체, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 미백 또는 주름개선용 화장료 조성물 {Lipoic acid PEGylated peptide derivative, method for preparing the same, and cosmetic compostion comprising the same for whitening or improving wrinkle}

본 발명은 리포산-PEG-펩티드 유도체, 이의 제조방법, 및 상기 리포산-PEG-펩티드 유도체를 포함하는 미백 또는 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

세포외기질(extracelluar matrix)은 많은 조직, 특히 피부의 구조적인 근간을 이루며, 이는 피부학 및 미용의학적 적용의 주요 대상이기도 하다. 콜라겐 및 콜라겐 섬유를 포함하는 세포외기질 단백질들은 상처치유과정에 있어서 세포의 유주(migration), 증식 및 유전자 조절에 있어서 중추적인 역할을 한다. 콜라겐은 사람에게서 가장 풍부한 결합조직이고, 콜라겐 섬유는 피부와 같은 기관(organ)이 잘 조직화되어 형성될 수 있도록 탄성력과 장력을 제공한다. 따라서, 콜라겐의 소실 또는 손상과 같은 세포외기질성분의 감소 및 글리코사미노글리칸(GAGs, glycosaminoglycan)의 과도한 축적은 노화에 따라 피부에 주름이 생기게 하는 것으로 알려져 있다. 이러한 특성에 착안하여 연구자들은 노화된 피부 상태를 향상시키고자 노화 과정에서의 콜라겐의 중요성, 및 세포외기질의 생합성을 자극하는 기능을 하는 많은 제품과 화학적 화합물에 중점을 두어 연구해왔다. 특히, 어떤 올리고펩티드는 인체뿐 만 아니라, 피부 내에서 호르몬, 신경전달물질 또는 신경조절물질과 같은 생활성있는 메신저로서 중요한 기능을 수행하기도 하고, 일부 화장의약 펩티드(cosmeceutical peptide)는 치료용 또는 미용의학용으로, 항노화 또는 보습 특성과 같은 피부생리활성을 향상시키고자 개발되어 왔다. 예를 들어 Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly(VGVAPG)의 헥사펩티드는 사람의 피부의 섬유아세포의 생산을 자극하면서, 동시에 엘라스틴의 발현을 하향조절하고, Tyr-Tyr-Arg-Ala-Asp-Asp-Ala(YYRADDA) 펩티드 서열은, 제1형 프로콜라겐으로부터 C-프로펩티드를 분리하는 효소인 프로콜라겐-C-프로테이나아제(procollagen-C-proteinase)를 억제하여 콜라겐의 분해를 감소시킨다. 또한, Lys-Thr-Thr-Lys-Ser(KTTKS), Glu-Glu-Met-Glu-Arg-Arg(EEMQRR), 및 트리펩티드 Gly-His-Lys(GHK)는, 인간의 피부에 존재하는 콜라겐의 주된 형태인 제1형 콜라겐의 전구형(proform)에 존재하는 아민-산 서열에 기초하여 설계되었다. 상기 펩티드들은 섬유아세포에 의한 콜라겐의 신생을 자극할 수 있다. 한편, 피부는 신체를 외부의 유해한 환경으로부터 방어하는 물리적, 화학적 방어벽으로서 기능하기 때문에, 전형적인 펩티드들은 효소에 의해 분해되어, 순환 반감기(circulating half-life)가 수 분 내지 수 시간에 불과하고, 그 밖의 다른 내인성 요소들로 인하여 생체 내(in vivo)의 생물학적 이용가능성이 상대적으로 낮다는 문제점이 있다.

한편, 리포산(LA, lipoic acid)은 동물과 식물에 다양하게 존재하며, 주로 미토콘드리아 내의 효소 반응에서 조효소로 작용한다. 옥타논산(octanoic acid)이 리포산의 C-8 지방산 사슬의 전구체가 되며, 시트테인(cyteine)이 황의 공급원이 되어 리포산의 생합성이 일어난다고 알려져 있다. 리포산과 리포산이 환원된 형태인 DHLA(dihydrolipoic acid)는 항산화제로 잘 알려져 있으며, 비타민 C, E, 및 글루타치온을 보호하여 효과를 증진시키고, NF-kB를 억제하여 항염증제로써 자외선에 의한 조직손상을 줄일 뿐만 아니라, 손상된 콜라겐 섬유만을 제거하는 분해효소의 생성을 촉진하는 기능을 한다. 또한 자외선에 의한 티로시나아제 활성을 억제하여 멜라닌 형성을 조절한다고 알려져 있다. 그러나 반응성이 큰 -SH(sulfhydryl)기 함유 화합물의 특성상 산화되어 이황화물을 만들기 때문에 용해도가 감소하고 변색, 분해 등 안정성에 문제가 있다고 알려져 있다. 또한, 에탄올에는 용해되나, 물에는 용해도가 낮아 화장품의 제형화에 문제가 있다. 이를 개선하기 위해 비타민 C 및 E와 혼합하는 것이 장시간 안정하게 저장할 수 있는 방법이라는 결과가 제안되기도 하였으나, 이러한 방법만으로는 리포산의 안정성 개선에 많은 한계가 있고, 냄새, 제형, 안정성, 효능 효과의 감소 등으로 인하여 피부 외용제로의 응용에 한계가 있었다.

따라서, 리포산의 문제점인 용해도 및 세포독성을 해결하고, 리포산과 기능성 펩티드의 화학적 안정성을 향상시켜 미백 및 주름개선에 우수한 효능이 있는 화장료 조성물에 관한 기술개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 리포산(LA, Lipoic acid)과 펩티드의 기능성을 유지하면서도 용해도, 화학적 안정성 및 독성을 개선시키는 방법에 대해 연구하던 중, 리포산과 기능성 펩티드를 PEG에 결합시켜 제조된 리포산-PEG-펩티드 유도체가 세포독성이 거의 없어 안전하며, 티로시나아제 활성 억제효과, 멜라닌 생성 저해효과, MMP-1(matrix metalloproteinase)의 발현 억제효과 및 콜라겐의 생합성 촉진효과가 우수하게 나타남을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 리포산-PEG-펩티드 유도체 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 리포산-PEG-펩티드 유도체를 포함하는 미백 또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 리포산-PEG-펩티드 유도체 및 이의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 리포산-PEG-펩티드 유도체를 포함하는 미백 또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체는, 세포독성이 거의 없어 안전하며, 티로시나아제 억제활성, 멜라닌 생성 억제활성, MMP-1 억제활성 및 콜라겐의 생합성 촉진활성이 우수하게 나타나므로, 미백 또는 주름개선용 화장료 조성물의 원료로 매우 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명의 리포산, PEG(polyethylene glycol) 및 펩티드의 결합을 모식적으로 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 리포산-펩티드 유도체(LA-KTTKS)의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS)가 인간 피부 섬유아세포의 세포 독성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체가 티로시나아제 억제활성(a)과 멜라닌 색소 생성 억제활성(b)에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체가 UVA에 의해 유도된 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현을 억제하는 정도를 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체가 콜라겐 생합성에 미치는 영향을 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS, PEGylated lipoic acid-peptide conjugate)를 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, n은 1~1000의 정수이다.

또한, 본 발명은 하기의 반응식 1로 나타낸 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS, PEGylated lipoic acid-peptide conjugate, 1)의 제조방법을 제공한다.

[반응식 1]

상기 반응식 1에서 (i)은 DIC, HOBt, DCM/DMF 이고, (ii)는 TFA/EDT/TIS/H₂O이며, n은 1~1000의 정수이다.

상기 반응식 1로 나타낸 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS, PEGylated lipoic acid-peptide conjugate, 1)의 제조방법은 (a) 2-클로로트리틸 클로라이드 수지와 Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl), Boc(N-tert -butyloxycarbonyl) 및 t-Bu(tert-butyl) 보호기로 보호된 아미노산(serine-lysine-threonine-threonine-lysine)을 순차적으로 반응시켜 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계; (b) 화학식 5의 화합물을 LAP(PEGylated lipoic acid)와 반응시켜 화학식 6의 화합물을 제조하는 단계; 및 (c) 화학식 6의 화합물의 측쇄 보호기를 탈보호시키고, 고체상 수지를 분리하여 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계; 를 포함한다.

상기 반응식 1의 수지(resin)에 결합된 선형 펜타펩티드 KTTKS는, Fmoc-serine으로 미리 로딩된 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(2-chlorotrityl chloride resin)을 이용하여 고체-상 펩티드 합성법(SPPS, solid-phase peptide synthesis)에 의해 제조된다. 본 발명의 제조방법에서 상기 Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl) 보호기는 N-말단 아미노기를 일시적으로 보호하는데 사용되고, 상기 Boc(N-tert -butyloxycarbonyl) 보호기 및 상기 t-Bu(tert-butyl) 보호기는 측쇄(-NH₂기 및 -OH기)의 보호에 사용된다. 보호된 아미노산 간의 결합은 HBTU/HOBt(O-Benzotriazole-N,N,N',N'-tetramethyl-uronium-hexafluoro-phosphate/N-Hydroxybenzotriazole) 시약용액을 사용하여 수행되고, 20 % 피페리딘/DMF(piperidine/dimethylformamide)은 Fmoc 보호기를 제거하는데 사용된다. 수지(resin)에 결합된 펩티드는 DCM(dichloromethane) 및 DMF의 혼합용액으로 세척된 후, DIC(N,N′-diisopropylcarbodiimide) 및 HOBt 를 이용하여 리포산 또는 리포산-PEG 에스터에 결합시킨다. 제조된 리포산-펩티드 중합체(화학식 6)는 표준 분리용 TFA/EDT/TIS/H₂O의 혼합용액에 정치되어 펩티드 측쇄 보호기를 제거하고 고체상 수지(resin)로부터 분리해낸다. 또한, 상기 분리된 수지는 여과기로 여과한 후, 여과기를 투과한 여액은 에테르를 첨가하여 침전시킨 후, 원심분리한 다음, 이를 에테르로 세척하여 건조한다. 건조된 건조물은 TFA를 포함하는 아세토니트릴을 등용매로 이용한 RP-HPLC(reverse phase-high performance liquid chromatography)를 수행하여 화학식 1의 리포산-PEG-펩티드 중합체를 분리한다.

상기 반응식 1에서 수용성 리포산-PEG(LAP, PEGylated Lipoic acid, 4)의 제조방법은 하기의 반응식 2로 나타낸다.

[반응식 2]

상기 반응식 2에서 (i)은 t-BuOK/BrCH₂CO₂Et, H₂O/NaOH 이고, (ii)는 EDC, DMAP, DCM이며, n은 1~1000의 정수이다.

먼저, 이전에 발표된 방법(K.Y. Chai et al., 2011)을 변형한 방법으로 카복시기를 PEG에 도입한다(3). 카복시기를 PEG에 도입시키는 반응을 수행하면, α-히드록실-ω-카복실 PEG, 디카복시화 PEG, 및 반응하지 않은 PEG가 생성된다. 다음으로, α-히드록실-ω-카복실 PEG (HO-PEG-COOH)를 DEAE-Sephadex를 이용하여 이온 교환 크로마토그래피로 정제한 후, 촉매적 양의 DMAP(4-(dimethylamino)pyridine)를 첨가하여EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide)-매개 에스테르화 반응으로 리포산을 결합한다. 상기 DMAP는 리포산과 중합반응을 할 수 있도록 말단에 히드록시기를 가지며, 부산물의 생성을 억제하는 한편, 카복시기를 제공하여 펜타펩타이드 성분과 중합될 수 있도록 한다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 리포산-PEG-펩티드 유도체를 포함하는, 미백 또는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS, PEGylated lipoic acid-peptide conjugate)는 피부세포에 대한 독성이 낮고, 티로시나아제 억제 활성 및 멜라닌 생성 억제 활성이 높아 피부 미백효과가 우수하며, MMP-1((matrix metalloproteinase-1) 발현 억제 활성 및 콜라겐 생합성 유도능력이 뛰어나므로 주름개선 효과가 우수하다. 또한, PEG(poly ethylene glycol)를 리포산(LA, lipoic acid)에 결합시킴으로써 리포산의 용해도 및 화학적 안정성이 향상되는 효과가 있다 따라서, 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체는 미백 또는 주름개선에 효과가 있는 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 티로시나아제는 티로신을 히드록시화하여 DOPA(dihydroxyphenylalanine)를 형성하고, 더 산화되어 도파퀴논을 형성하는 효소로서 구리를 포함하는 금속 효소이다. 티로신과 페놀류의 산소에 의한 산화반응을 촉매하며, 버섯, 감자, 사과를 비롯한 여러 식물과 동물조직에 존재한다고 한다. 티로신을 히드록시화하여 DOPA를 생성하는 반응은 흑갈색의 색소인 멜라닌 합성의 첫 단계이므로, 피부의 명암과 관계가 있으며, 유전적으로 이 효소가 결손되면 동물조직 내에 멜라닌이 결핍되어 백자증이 된다.

본 발명의 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)은 사이질(interstitial) 콜라게나아제라고도 하며, 인간의 섬유아세포가 UV에 조사되면, 수시간 내에 세포 내에서 과발현되는 것으로 알려져 있다. MMP-1은 피부의 세포외기질, 즉 제1형 및 제3형 콜라겐의 분해와 관련된 핵심조절자로 여겨지며, 태양빛 스트레스에 의한 노화 과정에서 중요한 역할을 수행하여, 콜라겐의 결핍은 결국 주름의 형성으로 이어진다는 것이 보고되었다. 따라서, MMP-1과 같은 주요 콜라겐-분해 효소를 억제하는 것은 유용한 항-노화용 제제수단이 될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 상기 리포산-PEG-펩티드 유도체 외에도 필요에 따라 물, 생리식염수, 글리세롤, 계면활성제, 보습제, 증점제, 킬레이트제, 색소 등 화장료용 부형제와 혼합되어 제조될 수 있으며, 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 리포산-PEG-펩티드 유도체를 포함하는 스킨로션, 스킨 소프트너, 스킨 토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 형태로 제조될 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 리포산-PEG-펩티드 유도체의 함량은 미백 또는 주름개선 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면, 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10 중량%로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01~1 중량%로 함유될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 본 발명의 리포산- PEG -펩티드 유도체( LAP - KTTKS )의 제조

1. 보호된 KTTKS -수지 중합체(5)의 제조

반응 용기에 2-클로로트리틸 클로라이드 수지(2-chlorotrityl chloride resin) (34mg, 50μmol)을 넣고, DCM 2ml를 넣어 2-3분간 교반하였다. 용매 제거 후 Fmoc으로 보호된 serine (Fmoc-Ser(tBu)-OH : S, 100 μmol)를 DMF 1.5ml와 DIPEA (34 ㎕, 200 μmol)에 녹인 후, 반응 용기에 넣어 2-클로로트리틸 클로라이드 수지와 함께 2~4 시간 동안 교반하였다. 용매 제거 후, DCM으로 5회에 걸쳐 세척한 후 소량을 취하여 Capacity를 측정하였다. 반응 용기에 들어 있는 반응물을 캡핑(capping)하기 위하여, DCM/MeOH/DIPEA (17/2/1, (v/v))을 반응 용기에 넣고 15분 동안 2회 반복 하고, DCM으로 3회 이상 세척 하였다. 캡핑한 반응물에 DMF 용매의 20 % 피페리딘(Piperidine)을 넣고 10 분 동안 2회 반응 후, 피페리딘이 남아 있지 않도록 DCM을 사용하여 충분히 세척하였다. 용매 제거 후, Fmoc으로 보호된 lysine( Fmoc-Lys(boc)-OH ; K, 100 μmol)을 DIPEA와 HOBt (14mg, 100 μmol), HBTU(38mg, 100 μmol)와 함께 DMF 1.5ml에 녹여 반응 용기에 넣어 2~4시간 동안 교반 후, 용매를 제거하였다. DCM으로 3회 이상 세척 후, Kaiser 실험을 통하여 유리 아민을 확인하였다. 이어서 Fmoc으로 보호된 threonine(Fmoc-Thr(tBu)-OH : T, 100 μmol), threonine (Fmoc-Thr(tBu)-OH : T, 100 μmol), lysine(Fmoc-Lys(boc)-OH : K, 100 μmol)을 반응 시켜 노란색 고체 상태의 보호된 lysine-threonine-threonine-lysine-serine(KTTKS)- 중합체를 0.4g 얻었다.

2. 리포산과 폴리에틸린글리콜의 결합체( LAP , PEGylated lipoic acid , 4)의 제조

둥근바닥 플라스크에 리포산(0.006 mmol)과 DCM 12ml를 넣고 교반하였다. 리포산이 완전히 다 녹은 후에 계속 교반 하면서 EDC(N-(3-Dimethylamino propyl)-N`-ethylcabodiimide hydrochloride, 0.0059 mmol)를 2~3번으로 나눠서 넣어 주고, 질소 풍선을 만들어서 반응 용기에 꽂아 질소 보호한 상태로 DMAP(4-(dimethyl amino pyridine, 0.00016 mmol)를 넣고 교반하였다. 다른 반응 용기에 한쪽 말단이 카르복시기로 산화된 PEG (HO-PEG-COOH : 0.005 mmol)와 DCM 12ml를 넣고 녹였다. 한쪽 말단이 산화된 PEG가 투명하게 다 녹으면, 리포산이 녹아 있는 반응 용기에 산화된 PEG 를 녹인 용액을 교반하면서 넣어 주었다. 얼음욕조 조건에서 1시간 동안 교반하면서 반응시킨 후, 얼음욕조를 제거하고 실온에서 24 시간 동안 추가로 더 반응시켰다. 반응이 완결되면 반응물을 분별 깔대기에 옮겨 담고, 증류수를 이용하여 세척한 후 DCM 층만 분리하여 다시 증류수로 세척 과정을 5회 반복하였다. 분리된 DCM 층에 탈수제인 MgSO₄를 가하여 잔여 수분을 제거하고 여과한 후, 여과액은 감압 농축하여 옅은 노란색 빛을 띠는 고체상의 표제 물질을 얻었다.

3. 화학식 1의 리포산- PEG -펩티드 유도체( LAP - KTTKS )의 제조

고체상 수지에 부착되어 있는 펩타이드 (0.8mmol)를 둥근바닥 플라스크에 넣고, 여기에 DCM과 DMF (4:1, (v/v))의 혼합 용액과 LAP (1.6mmol), DIC (3.2mmol) 및 HOBt (3.2mmol)를 넣은 후 교반하였다. 4시간 이후부터 교반하는 중간에 소량의 반응물을 취하여 Kaiser test를 하는데, Kaiser test 음성 반응이 나올 때 까지 계속 교반하면서 실온에서 반응시켰다. 반응시간은 대략 24시간 정도 걸린다. 반응이 끝나면 여과지에 여과시키고, DCM과 DMF를 이용하여 5회 정도 세척 후, 레진에 부착된 반응물을 수거하여 건조시킨 후, 건조된 반응물은 다시 분리(Cleavage)반응을 시켰다. 분리용액(cleavage solution)은 TFA/EDT/TIS/H₂O(trifluoroacetic/1,2-ethanedithiol/triisopropylsilane/H₂O)를 9.5: 0.2: 0.1: 0.2의 부피비로 혼합하여 만들고, 건조된 반응물 0.1g 당 분리용액 1ml를 더하여 3시간 동안 실온에서 반응시켜 펩타이드의 보호기와 고체상 수지를 제거하였다. 여과지를 이용하여 제거된 수지와 보호기를 걸러내고, 여과액을 모아서 차가운 에틸에테르(ethyl ether)에 침전시키고, 원심분리하여 침전물만 얻었다. 얻어진 침전물에 차가운 에틸에테르를 가하고 원심 분리하여 침전물을 회수 하는 과정을 5회 이상 반복하여 더 이상 분리용액의 냄새가 나지 않을 때 까지 세척하였다. 세척 과정이 끝나면, 감압진공 하에 농축하여 고체 상태의 표제화합물을 얻었다(LAP-KTTKS, PEGylated lipoic acid-peptide conjugate, 1, 880 mg, 49%).

본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS)의 모식도는 도 1에 나타내었다.

본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체의 ¹H-NMR 스펙트럼은 하기에 나타내었으며, ¹³C-NMR 스펙트럼은 도 2에 나타내었다.

¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD): δ (ppm) 4.45-4.43 (m, 4H), 4.35-4.24 (m, 2H), 3.94-3.82 (m, 2H), 3.30 (m, 4H), 2.96-2.43 (m, 2H), 1.96-1.84 (m, 4H), 1.49-1.30 (m, 8H).

비교예 1. 화학식 2의 리포산-펩티드 유도체( LA - KTTKS )의 제조

상기 반응식 3에서 (i)은 DIC, HOBt, DCM/DMF이고, (ii)는 TFA/EDT/TIS/H₂O 이다.

상기 실시예 1의 3에서, LAP 대신 리포산을 사용한 것을 제외하고는 실시예 1의 3과 동일한 방법을 이용하여 화학식 2의 리포산 펩티드 유도체(LA-KTTKS, lipoic acid-peptide conjugate, 2, 340 mg, 58%)를 제조하였다.

리포산-펩티드 유도체(LA-KTTKS)의 ¹H-NMR 스펙트럼은 하기에 나타내었으며, ¹³C-NMR 스펙트럼은 도 3에 나타내었다.

¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD): δ (ppm) 4.46-4.43 (m, 4H), 4.35 (d, 2H, J=3.5 Hz), 4.29-4.25 (m, 2H), 3.93-3.88 (m, 2H), 3.64 (m, ~180H, PEG backbone), 3.30 (m, 4H), 2.97-2.92 (m, 2H), 1.90-1.72 (m, 4H), 1.52-1.21 (m, 8H).

실험예 1. 본 발명의 리포산- PEG -펩티드 유도체( LAP - KTTKS )의 세포독성 분석

인간 피부 섬유아세포 또는 마우스 흑색종 B16F10 세포를 한국 세포주 은행에서 구입하여, 10% 우태아혈청 (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA), 1% 페니실린-스트렙토마이신 (Gibco BRL, NY, USA) 및 0.2 μM 농도의 α-멜라닌 세포 자극 호르몬(α-MSH, α-melanocyte stimulating hormone, Sigma)을 첨가한 DMEM(Dulbecco's modified eagle's medium) 배지 내에서 37 °C, 가습된 5% CO₂ 대기 하에 배양하였다.

리포산 펩티드 중합체의 세포독성여부를 조사하기 위해 인간 피부 섬유아세포(HDF, human dermal fibroblast) 또는 B16F10 흑색종 세포를 다양한 농도의 샘플(대조군, LAP, LA-KTTKS, LAP-KTTKS, KTTKS)과 함께 48시간 동안 배양하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS)는 세포 생존율이 우수하게 나타났으나, 리포산-펩티드 유도체(LA-KTTKS)는 세포 생존율을 감소시키는 것으로 확인하였다. 이는 LA-KTTKS의 경우, PEG 링커를 사용하지 않았기 때문일 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS)는 세포독성이 거의 없어 안전함을 알 수 있다.

실험예 2. 미백효과 분석

1. 티로시나아제 억제 활성 분석( Tyrosinase inhibition assay )

티로시나아제 활성 억제정도는 L-DOPA를 기질로하여 분광광도계로 기존에 발표된 방법(H.Y.Chung et al., 2005)을 일부 변경하여 측정하였다. 0.1 mL의 버섯 티로시나아제 용액(625 U mL^?1), 0.9 mL 의 1/15 mM PBS(phosphate-buffered saline, 2.0 mM) 및 0.2mM의 샘플(대조군, LAP, LA-KTTKS, LAP-KTTKS, KTTKS) 0.1mL 로 구성된 각 반응혼합물은 25 °C 에서 10-15 분간 미리 배양하였다. 그 다음, 0.03%의 L-DOPA 용액을 첨가하여 반응시켰다. 그 다음, 475nm에서 마이크로 플레이트 리더기를 사용하여 반응물의 흡광도를 측정함으로써 티로시나아제 억제율(%)을 얻었다.

결과는 도 5a에 나타내었다.

도 5a에 나타낸 바와 같이, LAP, LA-KTTKS, 및 LAP-KTTKS는 티로시나아제 활성을 각각 92.7%, 60.2% 및 78.4%까지 억제하였다. 따라서, 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS)는 LA-KTTKS보다 티로시나아제 억제활성이 우수함을 알 수 있다.

2. 멜라닌 색소 생성 억제 활성 분석

B16F10 세포는 0.2mM의 테스트 샘플(대조군, LAP, LA-KTTKS, LAP-KTTKS, KTTKS)로 처리된 후 72시간 동안 배양되었다. 배양된 세포는 계수한 다음, PBS로 세척한 후, 3000 rpm으로 5 분간 원심분리하여 수집하였다. 수집된 세포의 펠렛은 PBS로 세척한 후, 0.2 mL의 1 N NaOH 및 1 mL의 균질화 완충용액 (50 mM sodium phosphate, pH 6.8, 1 % Triton X-100, and 2 mM PMSF)으로 가용화(solubilization)하였다. 멜라닌의 흡광도는 405 nm 에서 모니터링되었고, 멜라닌의 양은 합성멜라닌(Sigma)을 이용하여 만든 표준곡선으로 측정되었다.

결과는 도 5b에 나타내었다.

도 5b에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS)와 LA-KTTKS는 멜라닌 색소 생성을 각각 56.3%, 46.1%로 억제하였다. 반면에, KTTKS는 멜라닌 색소의 합성을 7.5% 밖에 감소시키지 못하였다. 따라서, 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS)는 LA-KTTKS보다 멜라닌 색소 생성 억제활성이 우수함을 알 수 있다.

실험예 3. MMP -1 억제 활성 분석

본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체가 인간의 피부 섬유아세포 내에서 UV에 의해 유도된 MMP-1(matrix metalloproteinase-1)의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.

먼저, 섬유아세포를 PBS로 2회 세척하고, 샘플(대조군, LAP, LA-KTTKS, LAP-KTTKS, KTTKS)을 농도별(0.01, 0.05, 0.1, 0.25, 0.5 mM)로 처리하고, UV 챔버를 이용하여 UVA를 인간 피부 섬유아세포(HDF, Human Dermal Fibroblast)에 6.3 J/cm² 의 에너지 밀도로 40분간 조사(irradiation)하였다. UV 조사 72시간 후, 배양액 내 MMP-1 단백질 수준을 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)법으로 분석하였다. 항-MMP-1 단일클론항체를 첨가하고, 37°C 에서 60 분간 배양한 후, PBS에 현탁된 이차항체(알카라인 포스파타아제로 중합된 항-마우스 IgG)를 각각의 웰에 첨가하여 30분간 더 배양하였다. 배양액을 세척한 후, 분광광도계로 405 nm 에서 OD(optical density)값을 측정하였다.

결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS)는 LA-KTTKS보다 MMP-1 억제활성이 우수하게 나타남을 확인하였다.

실험예 4. 콜라겐 생합성량 분석( Collagen synthesis assay )

인간 피부 섬유아세포(HDF, human dermal fibroblast)를 사용하여 본 발명의 리포산-PEG-펩티드 유도체(LAP-KTTKS)가 콜라겐 합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

인간 피부 섬유아세포를 96-웰 플레이트 (5×10⁴ cells)에서 10% 우태아혈청을 포함한 DMEM 배지에서 배양한 후, 배지를 0.5mM의 테스트 샘플(대조군, LAP, LA-KTTKS, LAP-KTTKS, KTTKS)을 포함한 무혈청 배지로 교환하였다. 24시간 동안 배양한 후, 각 웰의 상층액을 수집하여 EIA(enzyme immunoassay) 키트(MK101, Takara, Japan)로 제1형 프로콜라겐을 측정하였다.

결과는 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 리포산-펩티드 유도체(LAP-KTTKS)는 리포산-펩티드 유도체(LA-KTTKS)보다 콜라겐 생합성량이 증가함을 확인하였다.

하기에 본 발명의 화장료 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1 : 화장료 제제의 제조

1. 유연 화장수의 제조

성분	함량(중량%)
화학식 1의 리포산-PEG-펩티드 유도체 (LAP-KTTKS)	0.5
1,3-부틸렌글리콜	5.2
올레일알콜	1.5
에탄올	3.2
폴리소르베이트 20	3.2
벤조페논-9	2.0
카복실비닐폴리머	1.0
글리세린	3.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 유연 화장수의 제조방법에 따라 제조하였다.

2. 밀크로션의 제조

성분	함량(중량%)
화학식 1의 리포산-PEG-펩티드 유도체 (LAP-KTTKS)	0.6
글리세린	5.1
프로필렌글리콜	4.2
토코페릴아세테이트	3.0
유동파라핀	4.6
트리에탄올아민	1.0
스쿠알란	3.1
마카다미아너트오일	2.5
폴리소르베이트60	1.6
소르비탄세스퀴올리에이트	1.6
프로필파라벤	0.6
카복실비닐폴리머	1.5
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 밀크로션의 제조방법에 따라 제조하였다.

3. 영양크림의 제조

성분	함량(중량%)
화학식 1의 리포산-PEG-펩티드 유도체 (LAP-KTTKS)	1.0
글리세린	4.0
바셀린	3.5
트리에탄올아민	2.1
유동파라핀	5.3
스쿠알란	3.0
밀납	2.6
코토페릴아세테이트	5.4
폴리소르베이트60	3.2
카복실비닐폴리머	1.0
소르비탄세스퀴올리에이트	3.1
향	미량
방부제	미량
정제수	잔량
계	100

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 영양크림의 제조방법에 따라 제조하였다.

Claims

하기의 화학식 1로 표시되는 리포산-PEG-펩티드 중합체(LAP-KTTKS, PEGylated Lipoic acid-peptide conjugate):
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, n은 1~1000의 정수이다.
(a) 2-클로로트리틸 클로라이드 수지와 Fmoc(9-fluorenylmethyloxycarbonyl), Boc(N-tert-butyloxycarbonyl) 및 t-Bu(tert-butyl) 보호기로 보호된 아미노산(serine-lysine-threonine-threonine-lysine)을 순차적으로 반응시켜 화학식 5의 화합물을 제조하는 단계;
(b) 화학식 5의 화합물을 LAP(PEGylated lipoic acid)와 반응시켜 화학식 6의 화합물을 제조하는 단계; 및
(c) 화학식 6의 화합물의 측쇄 보호기를 탈보호시키고, 고체상 수지를 분리하여 화학식 1의 화합물을 제조하는 단계; 를 포함하며, 하기 반응식 1로 표시되는 화학식 1의 리포산-PEG-펩티드 중합체(LAP-KTTKS)의 제조방법:
[반응식 1]

상기 반응식 1에서
(i)은 DIC(N,N′-diisopropylcarbodiimide); HOBt(N-Hydroxybenzotriazole); DCM(dichloromethane) 및 DMF(dimethylformamide)의 혼합용액이고,
(ii)는 TFA(trifluoroacetic), EDT(1,2-ethanedithiol), TIS(triisopropylsilane) 및 H₂O의 혼합 용액이고,
SPPS는 solid-phase peptide synthesis이고, Fmoc은 9-fluorenylmethyloxycarbonyl이며,
n은 1~1000의 정수이다.
하기 화학식 1로 표시되는 리포산-PEG-펩티드 유도체를 포함하는 미백용 화장료 조성물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, n은 1~1000의 정수이다.
제3항에 있어서, 상기 화학식 1의 리포산-PEG-펩티드 유도체의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10중량%인 것을 특징으로 하는, 미백용 화장료 조성물.
하기 화학식 1로 표시되는 리포산-PEG-펩티드 유도체를 포함하는 주름개선용 화장료 조성물:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, n은 1~1000의 정수이다.
제5항에 있어서, 상기 화학식 1의 리포산-PEG-펩티드 유도체의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10중량%인 것을 특징으로 하는, 주름개선용 화장료 조성물.