KR101402753B1 - 불미나리 추출물 및 발효추출물을 함유하는 피부 화장료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 불미나리(Field Waterdrop) 추출물 및 발효추출물을 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 불미나리를 이용한 불미나리 추출물 및 고초균, 유산균, 효모 중l 에서 선택된 1종 이상의 균주를 접종하여 얻은 발효액을 함유한 불미나리 발효추출물을 특징으로 하는 피부보습, 피부탄력 강화, 미백 및 주름개선 효과가 우수한 피부외용제 조성물에 관한 것이다.
(색 인 어)
불미나리 추출물, 불미나리 발효추출물, 보습, 탄력강화, 미백, 주름개선 화장료

Description

불미나리 추출물 및 발효추출물을 함유하는 피부 화장료{Cosmetic composition from field waterdrop extract and its fermentation}

본 발명은 불미나리 추출물 및 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 피부보습, 피부탄력 강화, 미백 및 주름개선 효과가 우수한 피부외용제 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부에서부터 순서대로 크게 표피, 진피, 피하지방 조직의 3개 층으로 구분되며, 피부의 구조를 보면 바깥쪽의 표피(Epidermis)는 중층편 평상피로 각화(Keratinizing) 상태이고, 안쪽의 진피(Dermis)는 치밀 결합조직이며, 진피 안쪽에는 피하조직(Subcutaneous tissue 또는 Hypodermis)으로 피부를 안쪽 기관에 고정 시키는 역할을 한다. 이 중 표피는 3개층 중에서 가장 얇은 층으로 피부의 보습 및 보호를 담당하는 중요한 기능을 하고, 피부미용에서도 밀접한 관련을 갖고 있어 많은 연구가 진행되고 있다. 표피층 중 최외각층을 구성하는 각질층의 성분은 케라틴 50중량%, 지방 20중량%, 수용액 23중량%, 수분 7중량%로, 각질층의 수분 함유상태에 따라 각질층의 두께가 다르고, 수분양이 적어지면 각질 양이 두꺼워져 피부결이 거칠어지며, 각질층의 탄력성 유지를 위해서는 10% 이상의 수분함유가 필수적인 것으로 알려져 있다. 또한 표피는 연령, 성별, 구체적 부위, 지속적인 환경자극, 스트레스의 증가 등 외부 자극 누적으로 인해 그 기능이나 구조에도 변화를 일으키게 되며, 이러한 변화를 통해 피부 염증, 노화 등의 반응이 진행되고 피부 보호막으로서의 기능이 저하된다.

최근 다양한 피부염이 증가하고 있는데 그 중에서도 피부건조에 의한 트러블 증상이 두드러진다. 건조에 의해 발생한 피부염은 피부의 탈각질화 증세만 나타나는 것이 아니라 염증성 피부병변을 동반하는 경우도 있기 때문에, 화장품 분야에는 피부트러블을 개선하기 위해 보습성분을 가진 천연 추출물을 사용하고 있으나, 기존 출시된 천연소재의 안전성 및 이를 이용한 화장품 제형 등의 한계점을 극복하는데 있어서 아직 부족하며, 이에 대한 연구 또한 미약한 실정이다. 또한, 천연 추출물을 얻기 위해서는 장시간이 소요되는 등의 문제점이 있어 실용성이 극히 낮은 단점이 있다. 반면에, 발효액 추출물은 다른 어떠한 용매를 사용하지 않고 발효숙성과정을 통해 천연소재가 함유하고 있는 당류를 알코올로 변화시키고, 천연소재 속에 들어있는 플라보노이드, 비타민C, 비타민P, 아미노산, 카테킨 등의 유효성분에 대한 추출효율을 높임으로써, 천연소재의 효능을 높이고, 피부 안전성 문제를 해결할 수 있다. 또한, 고초균, 유산균 및 효모 등의 발효공정을 통해 고분자 물질을 흡수가 용이한 저분자 물질로의 전환, 불안정하거나 불활성 형태에서 활성 형태로 전환되는 과정에서 천연소재의 효능을 극대화 시키며, 이에 따라 우수한 피부 보습 효과를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 추출된 이후에 발생될 수 있는 자극적이거나 독성이 나타날 수 있는 천연소재를 안정화 시키거나 독성을 줄임으로써, 효과적으로 안정한 유도체로 전환시킬 수 있다.

본 발명의 불미나리(학명: Oenanthe Javanica D.C)는 산형과에 속하는 다년생 초본으로 말레이시아, 필리핀, 타이완 등의 동남아 지역으로부터 한국, 중국, 시베리아 등의 일부 온대 북부 지역까지 널리 분포되어 있으며, 땅을 기는 가지줄기를 가지고 있고 줄기는 굵은 능선이 있어 30cm 내외의 높이로 곧게 자라며 털이 없고 가을철에 가지의 마디에서 뿌리가 내려 번식한다. 7~8월에 줄기의 끝에 가까운 잎겨드랑이의 반대쪽으로부터 꽃대가 자라나 작은 꽃이 총상화서로 피고, 열매는 작은 타원형으로 맺는다. 일반 물미나리는 습지에서 자생하지만, 불미나리는 밭에서 자생한다. 일반적인 불미나리는 돌미나리와 같이 유기질비료가 충분한 점토질에서 담수상태가 아닌 충분한 수분공급, 수온유지 및 일조량이 조절된 조건에서 잘 자라지만, 개량 불미나리는 거의 야생에 가까운 재배방법으로써 종묘재법, 물 공급에 의한 수온조절, 일조량조절 등 독특한 방법으로 재배되어 맛과 향기가 좋은 특징이 있다.

우리나라 전역에서 자생하는 불미나리는 기원전 480년의 여씨춘추(呂氏春秋)에도 그 기록이 존재할 정도로 오랜 세월동안 인류의 음식사와 함께 해왔다. 달고 독성이 없어 예로부터 여러 가지 요리에 독특한 향기와 맛을 더해 주는 재료로 사용해 왔고, 비타민 A, 비타민C와 칼슘, 철분 등 비타민, 무기질이 풍부한 대표적인 알칼리성 식품으로서 미나리강회, 미나리무침, 미나리김치, 보리 미나리전, 미나리생채, 미나리튀김, 각 종 매운탕 등 일상에서 많이 사용되고 있다.

불미나리는 식품뿐만 아니라 약초로서도 그 효능을 인정받고 있다. 예로부터 불미나리는 민간요법으로 요긴하게 사용되어왔다. 토사곽란이나 오줌소태에 달여 먹거나 즙을 내 마셨고, 땀띠가 심할 때는 즙을 내 환부에 발랐으며, 목 아플 때 즙에 꿀을 넣어 달여 마시기도 했다. 한방에서는 불미나리를 수근(水芹) 혹은 수영(水英)이라 부르며, 주로 잎과 줄기를 약재로 사용한다. 고열로 가슴이 답답하고 갈증이 심한 증세에 효과적이고, 이뇨작용으로 부기를 빼주며, 특히 가래를 삭이고 기관지와 폐를 보호하는 효능이 있어 황사가 나타날 때면 훌륭한 먹을거리로 대접받는다.

동의보감에 의하면 불미나리는 갈증을 풀어 주고 머리를 맑게 해주며, 주독을 제거할 뿐 아니라 대장과 소장을 원활하게 해주어 신진대사를 촉진시켜준다. 본초습유에는 미나리 생즙은 어린아이들의 고열을 내려 주고, 항상 머리가 묵직하거나 부스럼이 나는 두풍열(頭風熱)을 치료한다고 기록되어 있다. 조선 세종시대에 간행된 본초 서적인 향약집성방(鄕藥集成方)에 따르면, 불미나리는 성미(性味)가 감(甘), 신(辛), 량(凉)하여 열을 내리고 부기를 가라앉히는 작용을 하기 때문에 여름철 구갈, 황달, 부종, 대하(帶下)등의 병에 쓸 수 있다고 했다. 동의보감(東醫寶鑑)에는 미나리가 대소장(大小腸)을 잘 통하게 하고, 황달, 부인병, 음주 후의 두통이나 구토에 효과적이며, 김치를 담궈 먹거나, 삶아서 혹은 날로 먹으면 좋다고 기록되어 있다. 실제로 불미나리는 현대 약리학적으로 쌀을 주식으로 하는 우리나라 사람들에게 생길 수 있는 혈액의 산성화를 막아주는 역할을 하며, 정신을 맑게 하고 혈액을 보호하는 한편, 심한 갈증을 없애고 열을 깨끗이 내려주기도 한다. 뿐만 아니라, 최근 수년간 중금속 해독 및 수질정화기능이 과학적으로 입증되면서 하수처리장이나 축산 폐수장의 수질정화물질로 보급되고 있으며, 가래를 삭히는 효과가 있어 매연이나 먼지가 많은 곳에서 일하는 사람의 기관지와 폐를 보호하는데 사용되고 있다. 이 외에도, 섬유질이 풍부하기 때문에 식물성 섬유가 창자의 내벽을 자극하여 장의 운동을 촉진시켜 변비에 효험이 있고, 칼로리가 거의 없어 다이어트 식품으로도 좋다. 최근에는 혈압을 내리는 약효도 인정받고 있으며, 심장병, 류머티스, 신경통, 식욕증진 등에도 효과적이다.

불미나리에 관한 연구 및 특허에 있어서, 재배방법에 따른 항세균 활성 및 성분특성 연구, 액상입욕조성물, 여성 청결제 조성물, 엑기스의 제조방법, 간세포 보호 및 간손상 예방 효능에 대한 기능성 건강지향식품 관련 연구가 유일하며, 현재까지 불미나리를 이용한 화장료 조성물에 관한 연구는 전무하다. 이에 본 발명은 불미나리 이용한 불미나리 추출물 및 발효추출물을 함유하는 피부보습, 피부탄력 강화, 미백 및 주름개선 효과가 우수한 피부외용제 조성물을 개발하게 되었다.
[선행기술문헌]
한국 공개특허공보 제10-2011-0108687호, 2011년 10월 06일 공개
오마이뉴스 인터넷 기사(붉은색 줄기, ‘불미나리’를 아시나요. http://www.ohmynews.com/NWS_Web/Articleview/article_print.aspx?cntn_cd=A0000423197) 2007년 07월 19일 공개
네이버 블로그 게시물([아쿠아틱 페이스로션/꿈녀] 이든화장품 내 남자의 피부 주름 개선 기능성 화장품 피플&스킨맨 아쿠아틱 페이셜 로션 http://blog.naver.com/y6248/40156953154) 2012년 04월 15일 공개
한국 공개특허공보 제10-2009-0034241호 2009년 04월 07일 공개

본 발명은 불미나리 추출물 및 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것으로서, 불미나리 추출물 및 고초군, 유산균, 효모 중에서 선택된 1종 이상의 균주를 접종하여 얻은 발효액을 함유한 불미나리 발효추출물을 함유하는 피부보습, 피부탄력 강화, 미백 및 주름개선 효과가 우수한 피부외용제 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 불미나리 추출물 및 발효공정을 통한 불미나리 발효추출물을 함유한 피부보습, 피부탄력 강화, 미백 및 주름개선 효과가 우수한 피부외용제 조성물을 제공함을 목적으로 한다.

보다 상세하게는, 본 발명에서 사용된 불미나리의 전초를 물로 수세하고, 건조기를 이용하여 건조시킨 후 분말화하여 추출공정에 들어간다. 불미나리 건조 중량의 10배 양의 증류수를 가하여 잘 섞어준 후, 80℃에서 3시간 가온 환류 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 추출하였다.

발효방법은 고초균, 유산균, 효모를 이용하여 불미나리 추출물을 혼합 발효시키는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다. 배양액을 pH 4.0-5.0 내지 5.0-7.0 로 조정하고, 미리 배양된 고초균, 유산균, 효모를 각각 10⁷-10⁸ CFU/mL 농도가 되도록 첨가한 후, 30℃ 내지 50℃ 온도에서 20시간 내지 110시간 배양하였다. 얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨다. 발효를 종료하기 위해 80℃에서 15분간 열을 가하여 고초균, 유산균, 효모의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다. 상기 방법으로 얻어진 발효물은 숙성하는 단계를 거칠 수 있으며, 이로부터 얻은 발효물 또는 그 발효물을 다시 일부 또는 전부 감압농축 및 동결건조하여 얻은 농축물, 또는 발효물 및 농축액 중에 함유되고 있는 주 효과를 발휘하는 화학물질 그 자체를 포함한다.

본 발명에 따른 화장료 조성물은 상기 추출물 및 발효추출물 외에 본 발명이 목적으로 하는 주된 효과를 손상시키지 않고 주된 효과에 상승효과를 포함하여 상품적 우수성을 줄 수 있는 다른 성분 등을 함유하는 것도 무방하다. 상기 불미나리 추출물 및 발효추출물은 조성물 전체에 대하여 동결건조 중량 기준 0.01 내지 100 중량%로 조성물에 존재할 수 있다.

만약 상기 불미나리 추출물 및 발효추출물이 나노캡슐, 마이크로캡슐, 나노좀 등의 제형으로 용액 또는 파우더 형태로 존재한다면 당업자는 상기 농도 범위 내에서 본 발명에 따른 조성물 내에 이 용액 또는 파우더의 양을 조절할 수 있을 것이다. 상기한 바와 같이 피부보습, 피부탄력 강화, 미백 및 주름 개선 효과를 갖는 조성물로 가공 처리된 화장품, 식품, 의약품 등에 제공된다.

본 발명의 불미나리 추출물 및 발효추출물은 피부외용제로서 그 제형에 있어서 특별히 한정되지 않으며, 유연화장수, 밀크로션, 영양크림, 마사지 크림, 에센스, 클렌징 폼, 클렌징 워터 또는 보디 오일 등의 기초 화장료 및 파운데이션, 립스틱 또는 메이크업 베이스 등의 색조 화장료 형태로 제조할 수 있다. 본 발명의 화장료를 세정제로 사용할 경우, 피부 세안제 및 목욕제를 제조할 수 있다.

이하 본 발명을 하기 위해 실시예와 비교예, 실험예 및 제형예를 통하여 상세하게 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위하여 제시된 것일 뿐, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서는 불미나리 추출물 및 발효추출물을 함유하는 조성물의 피부보습, 피부탄력 강화, 미백 및 주름개선 효과를 확인하였으며, 인체 피부 자극시험 등의 안전성 평가를 통해 본 발명의 목적을 달성하였다.

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 불미나리 추출물 및 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 불미나리 발효추출물의 발효방법은, 불미나리 추출물에 고초균, 유산균, 효모 중 1종 이상의 균주를 접종하여 단독 또는 혼합한 발효방법을 이용한다는 특징이 있다. 본 발명의 불미나리 추출물 및 발효추출물을 함유하는 화장료 조성물은 우수한 피부 보습성, 미백효과, 피부재생을 촉진하는 효소 저해 활성을 통한 피부탄력 강화, 피부 노화방지 및 주름개선 효과를 발휘한다.

<실시예1> 불미나리 발효추출물의 제조

불미나리 전초를 물로 수세하고, 건조기를 이용하여 건조시킨 후 분말화하여 추출공정에 들어간다. 불미나리 중량의 10배 양의 증류수를 가하여 잘 섞어준 후, 80℃에서 3시간 가온 환류 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 추출하였다.

얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨다. 배양액 pH를 4.0-5.0 내지 5.0-7.0 로 조정하고, 미리 배양된 고초균, 유산균, 효모를 각각 10⁷- 10⁸ CFU/mL 농도가 되도록 첨가한 후, 30℃ 내지 50℃ 온도에서 20시간 내지 110시간 배양하였다. 발효를 종료하기 위해 80℃에서 15분간 열을 가하여 고초균, 유산균, 효모의 기능상실을 유도하였다. 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다.

<비교예 1> 불미나리 추출물의 제조

대조군으로 사용된 불미나리 추출물은 발효 공정 없이 동일한 열수 추출 공정을 통해 수득하였고, 전처리 공정은 불미나리 발효추출물과 동일하다. 중량의 10배 양의 증류수를 가하여 잘 섞어준 후, 80℃에서 3시간 가온 환류 추출하여 상등액과 침전물을 분리하여 추출하였다. 얻어진 추출물을 상온까지 자연 냉각시킨 후, 원심분리기를 이용하여 침전물을 제거하고 상등액을 채취하거나, 여과된 상등액을 사용하였다.

<실험예 1> 피부보습도 측정(IMPEDANCE METER, SKICON-200 IBS 일본)

20~25세의 건강한 여성 20명을 대상으로 양측 아래팔(팔뚝) 상부에 상기 불미나리 추출물과 발효추출물을 각각 2씩 도포하였다. 측정시간은 20분 간격으로 2시간 동안 실시하여 피부전도 측정값으로 나타내었다. 이의 결과는 하기 표 1에 나타내었듯이 불미나리 추출물과 발효추출물 모두 보습력과 TEWL 수치 등에 있어서 상승효과를 나타냄을 알 수 있으며, 특히, 불미나리 발효추출물을 사용하였을 때 가장 양호한 결과를 얻을 수 있었다.

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불미나리 추출물과 발효추출물의 피부보습도 측정

시간	피부보습도
	불미나리 추출물	불미나리 발효추출물
도포전	65	68
20분 후	78	86
40분 후	84	88
1시간 후	89	90
1시간 20분 후	90	92
1시간 40분 후	91	94
2시간 후	90	95

<실험예 2> 항산화 활성측정

제조한 불미나리 추출물과 불미나리 발효추출물에 대하여 주름개선효과 검정시험으로 항산화효과를 알아보기 위하여 DPPH(2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl)를 이용한 라디칼 소거능과 XOD 저해활성을 사용하였다.

<2-1> DPPH를 이용한 라디칼 소거능 측정

500 uM DPPH (2.2-diphenyl-1-picryl hydrezyl) 용액을 에칠 알콜에 녹여 여과한 후 즉시 사용하였다. 제조된 DPPH 용액과 시료 용액을 1:1로 혼합하여 격렬하게 섞은 후, 상온 암소에 20 분간 방치하였다. Microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정한 후, 하기 수학식 1을 통해 DPPH 라디칼 제거율(%)을 산출하였다. 이때 라디칼을 제거하는 양성 대조군(positive control)으로 1 mM의 아스코르브산(ascorbic acid)을 사용하였다.

'수학식 1'

DPPH 라디칼 제거율(scavenging, %) = (A - B) / A x 100

상기 식에서, A는 공시험액에서 얻은 흡광도이고, B는 검액에서 얻은 흡광도임.

불미나리 추출물과 발효추출물의 항산화 활성

농도(%)	DPPH % inhibition
	불미나리 추출물	불미나리 발효추출물
0.05	40%	44%
0.1	56%	61%
1	89%	92%

<2-2> XOD(Xanthine oxidase) 저해활성 측정

XOD 저해활성측정은 Noro(Chen. Pharm. Bull., 31, 3984~3987, 1983)의 방법을 변형한 것으로, 잔틴/잔틴옥시다아제(xanthine/xanthine oxidase) 효소반응에 의한 활성산소 발생계를 이용하여 활성산소에 의한 니트로블루테트라졸리움(NBT, nitroblue tetrazolium)의 산화작용에 의한 흡광도 변화를 측정하였다. Na₂CO₃ 2.5g, EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid) 0.1g, 잔틴 0.2g, BSA(Bovine serum albumin) 0.1g, NBT 0.1g 및 시료 0.1g을 넣고 잘 혼합하여 30℃에서 15분간 정치하였다. 잔틴옥시다아제 0.2g을 넣고 30℃에서 15분간 반응시킨 후, 6mM CuCl₂를 넣어 반응을 정지시켰다. 그 후, 흡광도 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 시료용액 대신 정제수를 넣어 같은 방법으로 측정하였으며, 잔틴옥시다아제 용액 대신 정제수를 넣어서 추출 시료 및 대조군 개별에 대한 색 보정값을 얻었다. 하기 수학식 2를 이용하여 활성산소소거율을 수치화하여 하기 표 3에 계산값을 나타내었다. 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, 불미나리 추출물과 발효추출물 모두 우수한 항산화 효과를 보였다.

'수학식 2'

활성산소소거율(%) =100 - (각 추출물 시료의 흡광도) / (대조군의 흡광도) x 100

불미나리 추출물과 발효추출물의 항산화 활성

시험군	XOD % inhibition
	0.1%	1%
불미나리 추출물	36%	75%
불미나리 발효추출물	49%	84%
Ascorbic acid 1mM	67%

<실험예 3> 피부주름 개선 효과

<3-1> 콜라겐 생합성 평가

시료에 대한 Fibroblast 세포 내에서 새로 생성되는 collagen 양을 측정하기 위해 procollagen assay 를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 1중량% Antibiotic-Antimycotic (AA, Welgene, Korea)과 10중량% Fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37℃ , 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 2x10⁵ 농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 무혈청 배지를 처리하여 24시간 동안 starvation 시킨다. 24시간 후, 무혈청 배지를 제거하고 PBS로 세척한후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, 시료를 phenolred free DMEM 배지에 농도 별로 처리하여 50시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 50 uM 을 positive control 로, UV(+)군을 Negative control 로, 배지만 처리한 그룹을 control 로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 추출물 처리 후 50시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 Procollagen Type-I C-Peptide (PIP) EIA kit(Takara Bio Inc. MK101) 를 이용하여 콜라겐 양을 측정하였다. Antibody-POD conjugate solution 100ul를 각 well에 첨가하고, sample이나 standard를 20ul씩 넣은 뒤 잘 섞어서 실온에서 5시간 방치하였다. 반응이 끝나면 내용물을 제거한 뒤 PBS 400ul로 4번 세척하였다. 제거 후 기질용액 100ul를 첨가하여 실온에서 15분간 반응시킨 뒤 stop solution 100ul 첨가하여 부드럽게 섞어주었다, microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정한 후 표준 농도곡선을 작성하여 콜라겐 양을 산정하였다(표 4).

표 4 에 나타난 바와 같이 추출물들의 자외선에 의한 자극에 의한 항주름 활성을 살펴본 결과, 불미나리 추출물과 발효추출물 모두 콜라겐 생합성량이 증가하였고, 그 중에서 불미나리 추출물보다 발효추출물로 처리하였을 때, 새로 생성되는 콜라겐양이 훨씬 더 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

불미나리 추출물과 발효추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 콜라겐 생합성

시험군	procollagen conc.(ug/ml)
	0.04%	0.2%
UV(+)	78
아스코르브산 25uM	104
불미나리 추출물	118	132
불미나리 발효추출물	124	140

<3-2> MMP-1 저해 평가

Collagen 을 분해하는 효소는 그 종류가 다양하며 가장 많이 알려져 있는 것이 collagen type I을 분해하는 MMP-1 (Matrix metalloproteinase I, collagenase)으로 이를 측정하기 위해 MMP-1 assay 를 실시하였다. 콜라겐 생성에 관여하는 세포주의 하나인 Fibroblast를 1중량% Antibiotic-Antimycotic (AA, Welgene, Korea)과 10중량% Fetal bovine serum (FBS, Welgene, Korea)을 포함한 Dulbecco's modified essential medium (DMEM, Welgene, Korea)을 이용하여 37℃, 5% CO₂ incubator에서 배양하였다. 2x10⁵ 농도의 Fibroblast 세포를 6 well plate에 접종하여 24시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 무혈청 배지를 처리하여 24시간 동안 starvation 시킨다. 24시간 후, 무혈청 배지를 제거하고 PBS로 세척한 후, UV 312nm 파장에서 12.5mJ로 조사하였다. 그 후, 시료를 phenolred free DMEM 배지에 농도 별로 처리하여 50시간 동안 추가 배양하였다. Ascorbic acid 50 uM 을 positive control 로, UV(+)군을 Negative control 로, 배지만 처리한 그룹을 control 로 사용하여 시료의 결과와 비교하였다. 추출물 처리 후 50시간 동안의 배양이 끝난 후 배지를 수거하였다. 수거한 배지는 MMP-1 측정 키트 (RPN 2610, Amersham Bioscience, UK) 를 이용하여 ELISA reader 로 450nm에서 흡광도를 측정하였다. Anti-MMP1 antibody로 코팅된 96 well plate에 buffer를 well 하나에 첨가하여 blank로 삼고, 배지 중에 유리된 샘플과 표준액 100ul를 각각의 well 에 넣는다, 실온에서 shaking 없이 3시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 3회 반복해서 세척 한 후 물기를 완전히 제거한다. 100ul peroxide conjugate를 첨가하고, 실온에서 shaking 없이 3시간 동안 반응시킨다. Washing buffer로 well을 가득 채워서 20~30분간 shaking 하면서 반응시킨다. 100ul 1M H₂SO₄로 반응을 중지시킨 후 microplate reader (Chromate, USA) 를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 비교하였다.

표 5 에 나타난 바와 같이 불미나리 추출물과 발효추출물의 자외선에 의한 자극에 의한 항주름 활성을 살펴본 결과, 불미나리 추출물에 비해 불미나리 발효추출물로 처리했을 때 MMP-1 활성이 더 많이 저해되었고, 이는 콜라겐 생합성 결과(표4)와 상응하는 양상을 보인다.

불미나리 추출물과 발효추출물의 자외선 자극에 의한 MMP-1 활성 저해도

시험군	MMP-1 (% of control)
	0.04%	0.2%
UV(+)	100
아스코르브산 50uM	72
불미나리 추출물	98	83
불미나리 발효추출물	91	79

<제형예 1> 크림 제조

크림 제조

원료명	중량%
불미나리 추출물 (또는) 불미나리 발효추출물	3.0
히아루론산	6.0
수상점증제	30.0
베타글루칸	4.0
항산화제	0.1
알부틴	3.0
아데노신	1.0
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	37.0

<실험예 4> 미백 효과 임상 시험

연구대상은 건강한 20-50대 성인 남녀 40명을 대상으로 피검자의 상박 부위에 직경 1.5의 구멍이 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5~2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하였다. 조사 후 시험물질 각 1.5중량%, 대조군으로 알부틴 1.5중량%, 용매(vehicle)만을 바르고, 한곳은 아무 것도 바르지 않고 12 주 동안 상태 변화를 관찰하였다. 1주 단위로 피부의 색깔을 색차계 CR2002(일본, 미놀타 사)로 측정하였다. 도포 개시시점과 완료시점에서의 피부색의 차이(L*)를 하기 수학식 4에 따라 계산하였고, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다. 미백효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 L*의 비교로 판정하는데, L* 값이 2 정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.50 정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

'수학식 3'

L* = 도포완료시점에서의 L* 값 - 도포개시 할 때 L* 값

피부에 대한 미백 효과

시험군	멜라닌 생성 억제율(%)
불미나리 추출물	1.53±0.15
불미나리 발효추출물	1.98±0.15
용매(Vehicle)	0.50±0.23
알부틴	1.50±0.15

상기 표 7의 결과로부터, 본 발명에 의한 불미나리 발효추출물은 불미나리 추출물 뿐만 아니라 양성대조군인 알부틴 보다 우수한 미백 효과를 보이는 것을 확인하였다.

<실험예 5> 피부 탄력 효과에 대한 측정

본 발명에 따른 화장품의 피부 탄력 효과에 대한 검사를 측정하기 위하여, 건강한 20-40대 성인 남녀 30명을 대상으로 하였다. 제형예 1에서 제조된 화장품을 이용하였으며, 시험 초기(baseline), 2주, 4주, 6주에 항온항습실(온도 20-25℃, 상대습도 35%)에서 피검자는 세안 후 1시간 동안 피부를 안정화한 다음, 측정을 수행하였다. 피부의 탄력도는 cutometer SEM 474(Courage+Khasaka, Germany)로 피부 왼쪽안면을 측정하였으며, 측정시 음압은 500 mbar, 흡입시간은 2sec, 반복 측정 횟수는 5회로 측정하여 평균 수치를 이용하였다.

피부 탄력성 측정

시험군	피부탄력도(%)
불미나리 추출물	38
불미나리 발효추출물	45

Cutometer SEM 474로 측정하여 피부탄력도를 측정한 결과, 불미나리 추출물과 발효추출물의 피부탄력도가 우수하였고, 그 중 불미나리 발효추출물의 피부탄력도가 좀 더 우수하다는 사실을 확인할 수 있었다.

<실험예 6> 인체 피부 자극시험 평가

본 발명에 따른 화장품의 안전도를 평가하기 위해 인체 피부 자극시험 평가를 실시하였다. 시험평가는 인체의 피부 1차 자극 시험으로서 첩포시험(팻치테스트)으로 판별하였다. 연구대상은 건강한 10~30대 피험자 30명을 대상으로 CTFA(The Cosmetic Toiletry and Frangrance Association, Safety testing guidelines) 가이드 라인에 따라 실시하였다. 제형예 1에서 제조된 화장액을 각각을 2g씩 적하 시킨 후, 시험 부위인 좌측 상완 내측에 첩포검사를 실시하였다. 첩포는 12시간 도포하며 첩포를 제거한 후는 마킹 펜(marking pen)으로 시험부위를 표시하며 12시간 간격으로 12시간, 24시간, 36시간, 48시간 후에 각 시험 부위의 염증 및 피부반응을 관찰하여 국제 접촉 피부염 연구회(International Contact Dermatitis Research Group; ICDRG)의 규정에 따라 판정하도록 하였다. 최종 판독 결과는 모두 음성반응을 보여 피부 안전성이 우수한 것으로 나타났다.

'수학식 4'

Grade x No. of respones)

피부반응도 = --------------------------------------------- x 100

3(Maximum. grad) x n(No. of total subjects)

피부 반응도에 따른 평가 기준(계산값)

시험물질 (Sample)	판정기준
	0.0~0.9	1.0~2.9	3.0~4.9	5.0이상
	무자극	경자극	중자극	강자극

피부 안전성 판독의 판정기준

반응	가중치	판정의 기준
-	0	무반응
±	0.5	희미한 홍반
+	1	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진 형성
++	2	뚜렷한 홍반, 구진 및 수포 형성
+++	3	대수포 형성

1차 자극 실험 결과, (-:무자극)

분류	불미나리 추출물	불미나리 발효추출물
적용 농도(%)	3%	3%
의양성 반응(±)	-	-
약양성 반응(+)	-	-
접촉성 피부염 유발확률(%)	0.00	0.00

화장료 조성물의 처방예

이하는, 각 화장품 제형에 있어서 불미나리 추출물 및 발효추출물을 함유하여 피부 내 활성 산소를 제거하고 피부미백, 피부탄력 강화, 미백 및 주름개선 효과를 갖는 제형으로서의 화장료 조성물의 처방예를 보여주며 처방은 다음과 같다.

< 처방예 1> 에멀전 베이스 제조

에멀전 베이스 제조

원료명	중량%
불미나리 추출물 (또는) 불미나리 발효추출물	5.0
글리세린	3.0
디소듐이디티에이	0.05
폴리글리세릴-3-메틸글루코스 디스테아레이트	1.5
세테아릴알코올	0.8
카프릴릭/카프릭트리글리세라이드	7.0
폴리아크릴아마이드 & C13-14이소파라핀 & 라우레스-7	0.6
방부제	적량
정제수	to 100

< 처방예 2> 밀크로션 제조 (영양화장수)

밀크로션 제조

원료명	중량%
불미나리 추출물 (또는) 불미나리 발효추출물	1.0
스쿠알란	5.0
밀납	3.8
솔비탄세스퀴올레이트	1.5
유동파라핀	0.5
폴리솔베이트 60	1.5
부틸렌글리콜	3.2
카프릭트리글리세라이드	5.0
프로필렌글리콜	3.0
글리세린	3.0
카르복시비닐폴리머	0.1
트리에탄올아민	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

< 처방예 3> 에센스 제조

에센스 제조

원료명	중량%
불미나리 추출물 (또는) 불미나리 발효추출물	5.0
부틸렌글리콜	3.0
글리세린	3.0
알란토인	0.7
판테놀	0.2
EDTA-2Na	0.05
에탄올	5.0
트리에탄올아민	1.5
스쿠알란	2.0
밀납	2.0
폴리솔베이트60	3.0
카르복실비닐폴리머	1.0
솔비탄세스퀴올레이트	2.8
방부제, 색소, 향	적량
정제수	to 100

< 처방예 4> 맛사지크림 제조

맛사지크림 제조

원료명	중량%
불미나리 추출물 (또는) 불미나리 발효추출물	5.0
밀납	12.0
폴리솔베이트 60	2.0
PEG 60 경화피마자유	2.0
솔비탄세스퀴올레이트	1.0
유동파라핀	30.0
스쿠알란	5.0
카프릭트리글리세라이드	5.0
글리세린	5.0
부틸렌글리콜	3.5
프로필렌글리콜	3.5
트리에탄올아민	0.3
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

< 처방예 5> 바디클린져 제조

바디클린져 제조

원료명	중량%
불미나리 추출물 (또는) 불미나리 발효추출물	5.0
알킬에텔상산염 (30%)	30.0
알킬에텔설포석신산염 (30%)	15.0
알킬아미도베타인 (30%)	4.0
프로필렌글리콜	5.0
라우라미드디이에이	4.0
베타인	5.0
셀룰로스검	0.1
가수분해단백질	0.2
염화나트륨	미량
구연산	미량
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

< 처방예 6> 겔 제조

겔 제조

원료명	중량%
불미나리 추출물 (또는) 불미나리 발효추출물	2.0
에틸렌디아민초산나트륨	0.08
글리세린	5.0
카르복시비닐폴리머	0.7
에탄올	5.0
트리에탄올아민	0.5
PEG 60 경화피마자유	0.5
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	to 100

< 처방예 7> 아스트린젠트 스킨 제조

아스트린젠트 제조

원료명	중량%
불미나리 추출물 (또는) 불미나리 발효추출물	1.0
히아루론산	5.0
베타글루칸	3.0
알부틴	3.0
아데노신	1.0
항산화제	0.1
가용화제	0.3
에탄올	3
향료	적량
정제수	85

< 처방예 8> 아이크림 제조

아이크림 제조

원료명	중량%
불미나리 추출물 (또는) 불미나리 발효추출물	5.0
수상점증제	30.0
히아루론산	6.0
베타글루칸	4.0
알부틴	3.0
아데노신	1.0
항산화제	0.1
방부제, 색소, 향료	적량
정제수	35.0

Claims (9)

1. 삭제
2. 불미나리 추출물을 고초균, 유산균 및 효모로 발효시킨 불미나리 발효추출물을 함유한 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제 2 항에 있어서, 발효추출물의 건조 중량을 기준으로 조성물 전체에 대해 0.01 내지 100중량% 를 함유하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 삭제
5. 삭제
6. 삭제
7. 삭제
8. 제 2 항에 있어서, 유연 화장수, 영양 화장수(밀크로션), 겔, 영양크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 보디오일, 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스, 파운데이션, 립스틱으로 이루어진 색조화장료 제형 등의 색조 화장료 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부보습, 피부 탄력강화, 미백, 주름개선용 화장료 조성물.
   
   
9. 삭제